DD251263A3

DD251263A3 - Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Dextranase mittels Aspergillus

Info

Publication number: DD251263A3
Authority: DD
Publication date: 1987-11-11

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Dextranase mittels Aspergillus. Das Enzym wird zur Kariesprophylaxe, zur Herstellung von Dextranen mit definiertem Molgewicht und in der Zuckerindustrie verwendet. Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines oekonomischen Verfahrens zur Herstellung von Dextranase mittels Vertretern der Gattung Aspergillus. Aufgabe der Erfindung ist es, mit Hilfe eines leistungsfaehigen Stammes ein Verfahren zur Herstellung von Dextranase mit hoher Ausbeute zu entwickeln. Erfindungsgemaess wird das dadurch erreicht, dass Asp. spec. D 100 - ZIMET 43783 unter bekannten Bedingungen fermentiert wird.

Description

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Aus der Literatur sind eine Reihe von Verfahren zur Gewinnung von Dextranase bekannt, bei denen die Enzymproduzenten Bakterien (US-PS 3787289) Hefen (DE-OS 1908225) oder Fungi (US-PS 3875009) sind.

In dem US-PS 3787289 wird die Herstellung von extrazellulärer Endodextranase mit Bacillus-Hochleistungsstämmen beschrieben, bei der Enzymaktivitäten zwischen <50biszu 1 500E/ml (Angaben in mg/ml · h) erhalten werden, wobei der Wert von 1500E/ml umgerechnet auf die von uns angegebene Einheitendefinition ca. 80E/ml entspricht.

Bisher sind noch keine Verfahren bekannt, bei denen mit Vertretern der Gattung Aspergillus hohe Ausbeuten erreicht wurden (DE-OS 1949719,JP-PS 122513, SU-PS 896069, US-PS 2972567).

In dem SU-UR 896069 ist ein Aspergillus insuetus als Dextranase-Produzent beschrieben, der eine Leistung von 0,7 E/ml Endodextranase bzw. 80 E/ml Exodextranase bringt (Angaben pro 10 Minuten). Bezogen auf die von uns angegebenen Einheiten entspricht das einer Leistung von 0,07 bzw. 8E/ml.

Weitere Aspergillus werden zur Dextranasegewinnung in US-PS 2716084 bzw. DE-PS 1 052639 genannt, wobei jedoch keine Enzymaktivitäten angegeben werden. Tsusu und Mitarbeiter berichten im J. Biol. Chemie 35 1971, No. 11, p. 1727-1732 von einem Aspergillus carneus, der offensichtlich auch in der Produktion zur Dextranasegewinnung verwendet wird. Dieser Pilz ist in der Lage, in einem jedoch für die Großproduktion nicht relevanten Medium, maximal 150 E/ml (umgerechnet auf vergleichbare Aktivitätsangaben) zu bilden. In Produktionsmedien werden nur 30 bis 50% dieser Enzymaktivität erreicht.

Industrielle Bedeutung für die Gewinnung von Dextranase haben jedoch hauptsächlich die Vertreter der Gattung Penicillium (US-PS 2742399, SU-PS 747889, SU-PS 459497).

Bei der Dextranaseherstellung mit Fusarium fusaroides gemäß US-PS 3875009 werden Enzymaktivitäten von 150 bis 250E/ml erhalten.

Ausführliche und (wie uns bekannt) die höchsten Angaben zur Enzymausbeute beim Einsatz von Penicillium zur Herstellung von Dextranase fanden wir bei Madhu und K. A. Parabhu „Enzyme Microb. Technol." 1984, vol. 6, May. Die von P. aculaetum maximal gebildete Enzymmenge wird mit 220 bis 230 E/ml angegeben.

Die Züchtung der Dextranasebildner erfolgt unter aeroben Bedingungen im Schüttelkolben oder Rührfermentor in Nährmedien, die organische C-und N-Quellen, Mineralsalze, Spurenelemente u.a. enthalten.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines ökonomischen Verfahrens zur Herstellung von Dextranase mittels Vertretern der Gattung Aspergillus.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, mit Hilfe eines leistungsfähigen Stammes ein Verfahren zur Herstellung von Dextranase mit hoher Ausbeute zu entwickeln.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß der Stamm Aspergillus spec. D100 (ZIMET 43783) zur Dextranasebildung eingesetzt wird.

Charakteristik des Stammes

Makroskopisches Erscheinungsbild

Der Stamm wächst auf Czapek-Agar begrenzt mit einem Koloniedurchmesser von 50 bis 55mm und schwacher radialer Faltenbildung. Die Oberflächenstruktur ist samtig, mit weißem Abstand und starker Sporulation nach innen über blaugrün nach graugrün erscheinend.

Alte Kulturen zeigen eine dunkelgrüne bis dunkelgraue Färbung. Die stark sporulierenden zentralen Koloniebereiche werden von weißem Luftmycel überzogen, so daß eine leicht filzige Textur entsteht. Die Kolonieuntereite ist farblos bis leicht gelblich. Auf diesem Medium tritt bei 28°C mitzunehmendem Alter (> 10 Tage) eine intensive dunkelgrüne bis dunkelgraue Farbe der Sporen auf und die Kolonieoberfläche bekommt infolge weiterer Sporenbildung ein stärker pudriges Aussehen.

Mikroskopisches Bild

Das mikroskopische Bild ist durch das Vorhandensein von radialen und säulenförmigen Sporenköpfen sowie von zahlreichen Übergängen zwischen diesen Formen gekennzeichnet. Das Aussehen der Sporenköpfe schwankt in Abhängigkeit vom Medium und vom Alter des Stammes. 6 Tage alte Kulturen besitzen kurze glattwandige Sporenträger mit durchschnittlicher Länge (Fußzelle mit Vesikel) von 70 ,um (49-78μΐη) und 4,8μηι (4,0-5,5/ctm) Durchmesser.

Sie sind gewöhnlich farblos und werden am Luftmycel gebildet, häufig mit einem leichten Knick an der Fußzelle beginnend. Die Träger verbreitern sich im oberen Teil geringfügig bei Übergang in einen überwiegend flaschenförmigen apikalen Vesikel. Der farblose Vesikel, im Durchmesser 10,3/u.m, bildet nur in der oberen Hälfte bis der Oberfläche einreihig annähernd parallel zum Sporenträger stehende Sterigmen mit einer durchschnittlichen Länge von 5μ.ιτι. Die grünen Konidiosporen mit runder bis subgloboser Form besitzen überwiegend eine nahezu glatte bis delikat gerauhte Oberfläche und eine Größe von durchschnittlich 2,3μπ\ (1,5-3,0/um).

Bei älteren Kulturen (> 10 Tagen) vergrößert sich hauptsächlich der Vesikel und durch Verlängerung der Sporenketten die Länge des Sporenkopfes um den Faktor 2-3. Der Stamm weist keine deutliche Pigmentierung des Sporenträgers, der Vesikel und Sterigmen auf.

Physiologisch-, biochemische Eigenschaften

In Nährböden, die eine Dextranquelle enthalten, bildet der Stamm extrazelluläre Endodextranase. Er benötigt keine Wachstumsfaktoren (Biostiumulatoren) im Nährboden.

Im Ergebnis der morphologischen und biochemischen Eigenschaften des Stammes wurde er als zur Gattung Aspergillus gehörend identifiziert.

Dieser Stamm, mit seinen morphologischen und biochemischen Eigenschaften ist nicht in der Fachliteratur und in Patenten als Dextranaseproduzent beschrieben und unterscheidet sich von anderen Produzenten dieser Art durch wesentlich höhere Dextran asea ktivität.

Er bildet 80 bis 120E/ml (Bestimmung nach J.C.Janson und J.Porath, Methods in Enzymology, Vol. VIII, Academic Press New

Eine Dextranaseeinheit entspricht der Freisetzung von einem Mikromol Isomaltose von Dextran pro Minute bei 37⁰C und pH 6,0.

Als Substrat dient eine 2%igeDextranlösung (Dextran M 70, Charge T15/31983). Die in den Beispielen angegebenen Aktivitäten wurden nach o. g. Methode bestimmt. Diese Methode ist eine Standardmethode. Sie entspricht nicht den optimalen Bedingungen der nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Dextranase.

Der erfindungsgemäß verwendete Pilzstamm wurde in der Hinterlegungsstelle im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der Akademie der Wissenschaften der DDR (ZlMET), Jena, unter der o. g. Nummer hinterlegt.

Der Stamm Asp. spec. D100 wurde aus einer Bodenprobe isoliert. Durch natürliche Auslese auf dextranhaltigen Nährböden wurden Varianten mit hoher Dextranaseaktivität gefunden.

Die Leistung des Stammes kann durch bekannte Maßnahmen zur Konservierung (z. B. Trocknung an inertem Trägermaterial) und Reaktivierung über lange Zeit auf hohem Aktivitätsniveau gehalten werden.

Die Kultivierung des Enzymbildners kann unter den bekannten Bedingungen und unter Anwendung von für pilzliche Dextranasebildner gebräuchlichen Kultivierungsmedien erfolgen.

Das Pilzmycel läßt sich leicht durch Filtration entfernen und die so erhaltene klare Kulturlösung kann nach bekannten Reinigungsverfahren weiterverarbeitet werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Mit je einem Schrägagarröhrchen 7 Tage alte Czapek-Dox-Kulturen des Stammes werden 15500 cm³ Schüttelkolben mit 200 cm³ Nährmedium (1,5% Dextran; 0,5% NaNO₃; 0,28% KH₂PO₄; 0,01 % NaCI; 0,04% KCI; 0,01 % FeSO₄ · 7H₂O; 0,03% MgSO₄ · 7H₂O) beimpft. Es erfolgt eine Kultivierung des Pilzes bei 30⁰C auf Rundschüttlern, die nach 120 Stunden abgebrochen wird. Zur Abtrennung der Biomasse wird die Kultursuspension aller Schüttelkolben über eine Porzellannutsche filtriert. Es werden so ca. 2700 ml Kulturfiltrat mit einer Gesamtaktivität von 350000E Dextranase erhalten. Die spezifische Aktivität der Dextranase beträgt 900 E/mg Eiweiß. Durch Einengen des Filtrates mittels Vakuumrotationsverdampfer oder Ultrafiltration und Salzfällungen des Enzyms kann ein Dextranasepräparat mit der spezifischen Aktivität von 1100 E/mg Eiweiß gewonnen werden. Die Aufarbeitungsverluste betragen ca. 20%.

Beispiel 2

Wie oben beschrieben werden drei 500 cm³ Rundkolben mit je 100cm³ Medium mit der Sporensuspension von je einem Agar,* chrägröhrchen beimpft. Nach 30stündiger Kultivierung dient diese Kultursus^ension als Inokulum für die Beimpfung eines Laborfermentors, der ein Bruttovolumen von 51 hat und mit 31 Nährmedium befüllt ist. Die Kultivierung im Fermentor erfolgt bei 30⁰C, einer Rührung von 200U/min und einem Lufteintrag von 0,25V/V/min.

Nach 68 Stunden Kultivierungszeit wird die Fermentation beendet. Die Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel 1.Es werden 2800 ml Kulturfiltrat mit einem Gehalt von 280000 E Dextranase erhalten.

Bei Bestimmung der Aktivität im Enzymoptimumsbereich (T 55 ⁰C und pH 4,7) werden ca. 3fach höhere Aktivitäten als angegeben gemessen, d. h., die Aktivitätsausbeuten liegen unter diesen Bestimmungsbedingungen bei 200 bis 400 E/ml. Das bedeutet, daß das vorliegende Verfahren durchaus dem Vergleich mit Dextranaseherstellungsverfahren mit Penicillium und Fusarium (vgl.

Darlegung zum Stand der Technik) standhalten kann.

Claims

Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Dextranase mittels Aspergillus unter bekannten Verfahrensbedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm Asp. spec. D100 — ZIMET 43783 verwendet wird.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Dextranase mittels Aspergillus.

Dextranasen sind Enzyme, welche die Spaltung von a-1,6-Bindungen in Oligo- und Polysaccharide katalysieren. Ihr Vorkommen ist in menschlichen und tierischen Organen sowie in Mikroorganismen beschrieben. Dextranasen werden vorrangig bei der Produktion von klinischem Dextran, bei der Kariesprophylaxe und in der Zuckerindustrie eingesetzt.