DD248596A1 - Verfahren zur isolierung von androsta-3,17-dionen aus rohextrakten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Androsta-3,17-dionen durch Abtrennung der 20-Hydroxymethylsteroide aus den Rohextrakten, wie sie beim mikrobiellen Abbau von Sterolen anfallen. Ziel der Erfindung ist die Reindarstellung von Androsta-3,17-dionen, insbesondere von 1,4-Androstadien-3,17-dion und 4-Androstem-3,17-dion, aus diesem Rohprodukt. Dazu wird der Rohextrakt, bestehend aus 1,4-Androstadien-3,17-dion, 4-Androsten-3,17-dion, (20S)-20-Hydroxymethyl-1,4-pregnadien-3-on und/oder (20S)-20-Hydroxymethyl-4-pregnen-3-on vorzugsweise in Azeton geloest und 45 Minuten bei 15C bis 20C mit einer Loesung von Chrom-VI-oxid in Schwefelsaeure und Wasser oxidiert. Nach beendeter Oxidation wird aus dem Extrakt durch Waschen mit Alkalicarbonat die aus den 20-Hydroxymethylsteroiden gebildete 20-Carboxy-pregnen-Verbindung abgetrennt. Nach dem Einengen des gewaschenen Extraktes werden 1,4-Androstadien-3,17-dion und/oder 4-Androsten-3,17-dion rein erhalten. Diese Verbindungen finden als Schluesselprodukte fuer die Herstellung von Steroidwirkstoffen Verwendung.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reindarstellung von Androsta-3,17-dionen, speziell von 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) und/oder 4-Androsten-3,17-dion (AD), aus Rohextrakten, wie sie im Ergebnis von mikrowellen Steroid-Transformationen erhalten werden. Androsta-3,17-dione, darunter ADD und AD, sind Schlüsselprodukte bei der Erzeugung hochwertiger Steroidwirkstoffe. Das Anwendungsgebiet der Erfindung liegt in der pharmazeutischen Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß bei bestimmten mikrobiellen Steroltransformationen als Rohextrakt der Fermentation Gemische anfallen, die neben den Zielprodukten ADD und/oder AD 20-Hydroxymethylsteroide, so vor allem (20S)-20-Hydroxymethylpregnan-Verbindungen wie (20S)-20-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder (20S)-20-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on, enthalten.

Letztere, die im Rohextrakt einen Anteil bis zu 20% ausmachen können, erschweren bzw. verhindern die Reindarstellung von ADD/AD.

Bekannt ist nach der Patentschrift JP-KTK 79-105 294 ferner, daß o. g.

(20S)-20-Hydroxymethylpregnan-Verbindungen aus derartigen ADD/AD-Rohextrakten entfernt werden können, indem sie mit Acetanhydrid in Pyridin und Benzen selektiv acetyliert werden, wobei mit einer anschließenden Kristallisation dann die Reindarstellung von ADD und/oder AD erreicht wird.

Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß mit ihm keine quantitative Abtrennung der 20-Hydroxymethylsteroide erreicht wird. So enthält in 91,6%iger Reinheit isoliertes ADD hier noch 1,9% (20S)-20-Hydroxymethyipregna-i,4-dien-3-on.

Bekannt ist seit 1946 schließlich eine von E. R. H. Jones (K. Bowden, J. M. Heilbron, E. R. H. Jones u.

B. C. J. Weedon, J. Chem. Soc, Jahrgang 1946, S. 39f.) ursprünglich für ungesättigte Carbinole entwickelte schonende Oxidationsmethode mit Chrom-VI-oxid in schwefelsaurer Lösung, die später auch auf dem Steroidgebiet zur Oxidation einer Vielzahl von ungesättigten Steroidalkoholen verwendet wurde.

Beispielsweise wurde die Jones-Oxidation von C. Djerassi 1956 erfolgreich bei der Oxidation von Pregnenolen zu 5-Pregnen-3,20-dion eingesetzt (C. Djerassi et al., J. Org. Chem. 21, 1956, S-. 1547f.). Bei den bisher bekannten Anwendungen der Jones-Oxidation auf dem Steroidgebiet handelt es sich jedoch ausschließlich um die jeweils präparative Darstellung von Ketonen oder Säuren aus den entsprechenden Alkoholen. Über die Anwendung dieser Methode zur Abtrennung von Steroiden aus Steroidgemischen und speziell aus mikrobiellen Rohextrakten ist bisher nichts bekarmt.

Ziel der Erfindung

Die vorliegende Erfindung verfolgt das Ziel, Androsta-3,17-dione wie 1,4-Androstadien-3,17-dion (ADD) und/oder 4-Androsten-3,17-dion (AD) rein, d. h. frei von 20-Hydroxymethylsteroiden, herzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes, technologisch einfaches Verfahren zur Isolierung von Androsta-3,17-dionen wie ADD und/oder AD aus Rohextrakten, die insbesondere aus bestimmten mikrobiellen Steroltransformationen erhalten werden, anzugeben.

Es wurde zunächst gefunden, daß auch 20-Hydroxymethylsteroide, also Verbindungen aus der Klasse der Steroide mit einer primären Alkoholgruppe mit einer'(bzw. mehreren) Doppelbindung(en), mittels Oxidation mit Chrom-VI-oxid (CrO₃) nach Jones in die entsprechenden Steroidsäuren mit einer 20-Carboxylgruppe umgewandelt werden können.

Es wurde weiter gefunden, daß aus den öligen Rohextrakten, die im Ergebnis von mikrobiellen Steroltransformationen erhalten werden bzw. worden sind und in denen neben den Androsta-3,17-dionen, also den Zielprodukten, noch 20-Hydroxymethylsteroide wie (20S)-20-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on und/oder (20S)-20-Hydroxymethylpregn-4-en-3-on vorkommen, nach Anwendung einer Cr0₃-Oxidation nach Jones selektiv gerade nur die 20-Hydroxymethylsteroide, also die Beimengungen, in die entsprechenden Steroidsäuren umgewandelt werden.

Ausgehend von diesen Befunden wird die erfindungsgemäße Aufgabe in ihrem Grundzug dadurch gelöst, daß ein bei einer mikrobiellen Steroltransformation erhaltener Rohextrakt obiger Zusammensetzung und Konsistenz zunächst in der 8- bis 15fachen Menge eines aliphatischen Ketons gelöst wird. Dieser Lösung wird unter Durchmischung während eines Zeitraums von 10 Minuten bis 25 Minuten-bei Raumtemperatur kontinuierlich sogenannte Standard-Chromsäurelösung so zugegeben, daß in dem Reaktionsgemisch in Abhängigkeit von dem 20-Hydroxymethylsteroid-Gehalt (mit anderen Worten: in Abhängigkeit vom Gehalt an C₂₂-Alkoholen) schließlich 0,20 ml bis 0,85 ml Standard-Chromsäurelösung pro Gramm Rohextrakt enthalten sind.

Normierte Portionen von Standard-Chroms.äurelösung werden jeweils durch Lösen von 27,72 g CrO₃ in 33 ml konzentrierter H₂SO₄ und Auffüllen mit Wasser auf 100 ml gewonnen.

So hergestelltes Reaktionsgemisch wird für weitere 15 Minuten bis 35 Minuten bei Raumtemperatur durchmischt. Anschließend werden im Reaktionsgemisch gegebenenfalls noch vorhandene Restmengen von Standard-Chromsäurelösung durch Zugabe eines Reduktionsmittels wie Methanol oder Formaldehyd wirkungslos gemacht.

Nachdem die Oxidation auf diese Weise beendet worden ist, wird das erhaltene Reaktionsgemisch wie folgt aufgearbeitet: Nach Verdünnen des Gemisches mit Wasser auf das 1,5- bis 3fache Volumen wird zunächst das als Lösungsmittel eingesetzte aliphatische Keton auf an sich bekannte Weise abdestilliert.

(Lediglich bei kleinen Ansätzen kann auf diese Abdestillierung verzichtet werden; jedoch ist in diesem Fall dann eine Verdünnung des Gemisches mit der 10fachen Menge Wasser vorzusehen.) Das verbleibende wäßrige Reaktionsgemisch wird anschließend zwecks Isolierung der Androsta-3,17-dione wie ADD und/oder AD unter Einsatz eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise eines Ethers oder eines Esters, einer Extraktion unterworfen (Extraktion I).

Der hierbei entstandene Extrakt wird dann (gegebenenfalls mehrere Male) mit Alkalikarbonat-Lösung gewaschen, d. h. einer erneuten Extraktion unterworfen. In Abhängigkeit von den zu verarbeitenden Volumina wird diese Extraktion entweder im Schütteltrichter oder im (Lösungsmittel-)Separator bzw. im Gegenstromextraktor durchgeführt. Durch diese Behandlung mit Alkalikarbonat-Lösung entstehen die Alkalisalze der entsprechenden, im Ergebnis der verfahrensgemäß zuvor herangezogenen Cr0₃-Oxidation entstandenen Steroidsäuren mit 20-Carboxylgruppen (bzw. 20-Carboxy-pregnen-Verbindungen oder C₂₂-Säuren), und diese Salze erweisen sich als wasserlöslich. Die aus der voranstehenden Extraktion

anfallende organische Phase wird auf an sich bekannte Weise zur Trockne gebracht, wobei als kristalliner Rückstand reines, d. h. 20-Hydroxymethylsteroid-freies, ADD/AD-Gemisch entsteht. Aus der nach dem Waschlauf (bzw. gegebenenfalls aus der nach den Waschläufen) vorliegenden wäßrigen Alkalikarbonat-Lösung lassen sich die verfahrensgemäß als Nebenprodukt entstandenen Steroidsäuren (C₂2-Säuren) schließlich noch wie folgt isolieren: Die Alkalikarbonat-Waschlösung wird mit einer gebräuchlichen anorganischen Säure (wie z. B. Salzsäure) oder organischen Säure (wie z. B. Essigsäure) auf pH 3 bis pH 4 angesäuert und anschließend unter Einsatz eines organischen Lösungsmittels, vorzugsweise eines Halogenkohlenwasserstoffes oder eines Esters, wiederum einer Extraktion unterworfen (Extraktion II). Die interessierenden C₂₂-Säuren sind dann in der resultierenden organischen Phase enthalten. Aus dieser werden sie auf an sich bekannte Weise durch Abdestillieren des organischen Lösungsmittels in Form eines kristallinen Rückstandes erhalten. Das erfindungsgemäße Verfahren wird nun vorteilhaft noch wie folgt ausgestaltet: Ein aus einer mikrobiellen Steroltransformation anfallender Rohextrakt, bestehend aus Androsta-3,17-dionen wie ADD und/oder AD sowie aus 20-Hydroxymethylsteroiden, wird in etwa der lOfachen Menge Azeton gelöst. Dieser Lösung wird unter Rühren innerhalb von 15 Minuten bei einer Temperatur von 15⁰C bis 20⁰C Standard-Chromsäurelösung gleichmäßig so zugetropft, daß in dem Reaktionsgemisch in Abhängigkeit von dem 20-Hydroxymethylsteroid-Gehalt des Rohextraktes vorzugsweise 0,50 ml bis 0,70 ml Standard-Chromsäurelösung pro Gramm Rohextrakt enthalten sind. In so hergestelltem Reaktionsgemisch wird bei einer Temperatur von 15°C bis 20⁰C unter Rühren für weitere 30 Minuten die Oxidationsreaktion unterhalten; anschließend werden eventuell noch vorhandene Restmengen der Staridard-Chromsäure durch Zugabe von etwa 30%iger Formaldehydlösung (100:1/v:v) zum Reaktionsgemisch unwirksam gemacht.

Die Aufarbeitung des derart behandelten Reaktionsgemisches wird nach seiner Verdünnung mit Wasser auf das doppelte Volumen mit der Abdestillierung des Azetons im Vakuum im Wasserbad von 5O⁰C eingeleitet. Das verbleibende wäßrige Reaktionsgemisch wird dann zwecks Isolierung von ADD und/oder AD mit einer volumengleichen Menge Ethyl- oder Butylacetat bzw. Diethylether der Extraktion I unterworfen, und der hierbei entstandene Extrakt wird seinerseits anschließend erneut extrahiert und zwar 3mal mit 0,05 m Na₂CO₃- bzw. K₂CO₃-Lösung (v:v/1:0,5...0,33). Aus der danach vorliegenden organischen Phase wird durch Trocknen und Einengen auf an sich bekannte Weise in Form eines kristallinen Rückstandes reines, d. h. 20-Hydroxymethylsteroid-freies, ADD/AD-Gemisch erhalten. Aus den nach den Waschläufen (im Anschluß an die Extraktion I) vorliegenden wäßrigen Na₂CO₃- bzw. K₂CO₃-Lösungen können die verfahrensgemäß als Nebenprodukt entstandenen Steroidsäuren (C₂₂-Säuren) gewünschtenfalls schließlich auch noch isoliert werden. Dazu werden diese Alkalikarbonat-Waschlösungen vorzugsweise mit Salzsäure auf pH 3 bis pH 4 angesäuert und dann 2- bis 3mal mit Chloroform bzw. mit Butylazetat (2:1/v:v) extrahiert (Extraktion II). Anschließende Abdestillieren des Lösungsmittels liefert dann gleichfalls in Form eines kristallinen Rückstandes die betreffenden C₂₂-Säuren, also zum Beispiel (20S)-20-Carboxy-1,4-pregna-dien-3-on. Die Vorteile der Erfindung werden darin gesehen, daß

- mit ihrer Hilfe im technischen Maßstab die quantitative Abtrennung von bestimmten störenden Nebenprodukten aus ADD/AD-Gemischen auf der Basis der Cr0₃-Oxidation nach Jones gelingt und daß

- mit dem verfahrensgemäßen Wege darüber hinaus ein zeitunaufwendiges Verfahren zur Abtrennung solcher störenden Nebenprodukte verfügbar ist.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1.

8,33 g eines öligen Fermentationsrohextraktes bzw. -rohproduktes, enthaltend 50% ADD, 17,5% AD und 18% (20S)-20-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on, werden in 100 ml Azeton gelöst, und bei 18°C werden zu dieser Lösung unter Rühren innerhalb von 15 Minuten 5,25 ml Standard-Chromsäure-Lösung (27,72 g CrO₃ in 23 ml konzentrierter H₂SO₄, aufgefüllt mit H₂O auf 100 ml) gleichmäßig zugetropft. Nach weiterem 30minütigen Rühren wird das Reaktionsgemisch mit 1 ml 30%iger Formaldehydlösung versetzt, mit 1 I Wasser verdünnt und mit Ethylazetat extrahiert (Extraktion I). Der Ethylazetat-Extrakt wird 1 mal mit Wasser und 2mal mit Na₂CO₃-Lösung gewaschen. Nach Trocknen der organischen Phase über Na₂SO₄ und Einengen hinterbleiben 5,67 g eines kristallinen, 20-Hydroxymethylsteroid-freien Rückstandes von 70% ADD und 30% AD.

Die aus den Waschläufen (im Anschluß an die Extraktion I) hervorgegangenen wäßrigen Na₂CO₃-Lösungen werden anschließend vereinigt, im Gesamtvolumen mit 5 η HCI auf pH 3 angesäuert

und ihrerseits nun mit Chloroform (2:1/v:v) extrahiert (Extraktion II). Aus der organischen Phase dieser Extraktion wird nach Abdestillieren des Lösungsmittels seinerseits ein kristalliner Rückstand von 1,46 g (20S)-20-Carboxy-1 ,4-pregnadien-3-on erhalten.

Beispiel 2.

56 g eines öligen Fermentationsrohextraktes bzw. -rohproduktes, enthaltend 57% ADD, 24% AD und 18% (20S)-20-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on, werden in 670 ml Azeton gelöst, und zu dieser Lösung werden bei 17⁰C bis 18⁰C unter Rühren innerhalb von 15 Minuten 35 ml Standard-Chromsäurelösung gleichmäßig zugetropft. Nach insgesamt 45minütigem Rühren wird das Reaktionsgemisch mit 6,7 ml etwa 30%iger Formaldehydlösung versetzt und mit 670 ml Wasser verdünnt; anschließend wird das Azeton im Vakuum im Wasserbad von 5O⁰C abdestilliert.

Das verbleibende wäßrige Reaktionsgemisch wird sodann 3mal mit etwa 1 I Ether extrahiert (Extraktion I), und der Etherextrakt wird 3mal mit etwa 500 ml 0,05 m Na₂CO₃-Lösung ausgeschüttelt. Aus der verbleibenden organischen Phase werden nach Trocknen über Na₂SO₄ und nach Einengen 39,7 g eines kristallinen Rückstandes von 77% ADD und 22% AD erhalten.

Die aus den Waschläufen (im Anschluß an die Extraktion I) hervorgegangenen wäßrigen Na₂CO₃-Lösungen ihrerseits werden anschließend vereinigt, im Gesamtvolumen mit 5 η HCI auf pH 3 angesäuert und nun mit Chloroform (2:1/v:v) extrahiert (Extraktion II). Der Chloroformextrakt ergibt nach Abdestillieren des Lösungsmittels einen kristallinen Rückstand von 10,4 g (20S)-20-Carboxy-1,4-pregnadien-3-on.

Beispiel 3.

70 g eines öligen Fermentationsrohextraktes bzw. -rohproduktes, enthaltend 60% ADD, 9% AD und 17% (20S)-20-Hydroxymethylpregna-1,4-dien-3-on, werden in 780 ml bis 800 ml Azeton gelöst, und unter den Bedingungen von Beispiel 2 werden dieser Lösung 41 ml Standard-Chromsäurelösung kontinuierlich zugetropft. Nach insgesamt 45minütigem Rühren wird das Reaktionsgemisch mit 7,8 ml einer etwa 30%igen Formaldehydlösung versetzt und mit 780 ml bis 800 ml Wasser verdünnt; danach wird das Azeton wie in Beispiel 2 abdestilliert.

Das verbleibende wäßrige Reaktionsgemisch wird anschließend 3mal mit etwa dem gleichen Volumen Butylazetat extrahiert (Extraktion I); die dabei gegebenenfalls auftretende Emulsion wird im Separator getrennt. Der Butylazetat-Extrakt wird 3mal mit etwa 500 ml 0,05 m Na₂CO₃-Lösung ausgeschüttelt. Aus der verbleibenden organischen Phase werden nach Trocknen und Einengen 51· g eines kristallinen Rückstandes von 73% ADD und 11 % AD erhalten.

Die aus den Waschläufen (im Anschluß an die Extraktion I) hervorgegangenen wäßrigen Na₂CO₃-Lösungen ihrerseits werden nun noch vereinigt, im Gesamtvolumen mit 5 η HCI auf pH 3 angesäuert und 2- bis 3mal gleichfalls mit Butylazetat (2:1/v:v) extraniert (Extraktion II). Nach Einengen auf etwa 1/10 des Volumens kristallisieren 8,75 g (20S)-20-Carboxy-1,4-pregnadien-3-on aus. Weitere 1,5 g dieser Steroidsäure sind aus der Mutterlauge nach Einengen und Kristallisieren aus Benzen erhaltbar.

Claims (2)

1. Erfindungsanspruch:

   1. Verfahren zur Isolierung von Androsta-3,17-dionen aus Rohextrakten, welche insbesondere im Ergebnis bestimmter mikrobieller Steroltransformationen erhalten werden und in denen die Androsta-3,17-dione vor allem im Gemisch mit 20-Hydroxymethylsteroiden vorkommen, gekennzeichnet dadurch, daß

   - ein derartiger öliger Rohextrakt zunächst in der 8- bis 15fachen Menge eines aliphatischen Ketons gelöst wird und dieser Lösung bei Raumtemperatur während 10 Minuten bis 25 Minuten Standard-Chromsäurelösung so zugegeben wird, daß schließlich 0,20 ml bis 0,85 ml Standard-Chromsäurelösung pro Gramm Rohextrakt in der Lösung enthalten sind;

   - so hergestelltes Reaktionsgemisch für weitere 15 Minuten bis 35 Minuten bei Raumtemperatur durchmischt wird sowie anschließend gegebenenfalls noch vorhandene Mengen an Standard-Chromsäurelösung durch Zugabe eines Reduktionsmittels unwirksam gemacht werden; und

   - danach zur Aufarbeitung das erhaltene Reaktionsgemisch nach Verdünnen mit-Wasser auf das 1,5fache bis 3fache Volumen sowie nach Abdestillieren des aliphatischen Ketons mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise einem Ether oder einem Ester, extrahiert, der hierbei entstandene Extrakt mit Alkalikarbonat-Lösung gewaschen und aus der nach der Waschung verbleibenden organischen Phase als kristalliner Rückstand reines Androsta-3,17-dion bzw. reines Androsta-3,17-dion-Gemisch erhalten wird, indem diese zur Trockne gebracht wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß

   - als aliphatisches Keton Azeton eingesetzt,

   - die Standard-Chromsäurelösung-Konzentration aus dem Bereich von 0,50 bis 0,70 ml pro Gramm Rohextrakt gewählt,

   - als Reduktionsmittel etwa 30%ige Formaldehydlösung (100:1/v:v) herangezogen,

   - die Extraktion zur Aufarbeitung des erhaltenen Reaktionsgemisches mit Ethyl- oder Butylazetat bzw. Diethylether durchgeführt und

   - der hierbei gewonnene Extrakt mit 0,05 m Na₂CO₃- bzw. K₂CO₃-Lösung (1:0,5...0,33/v:v) gewaschen wird.