CZ303007B6 - Chinazolinonový derivát, jeho použití a farmaceutický prípravek s jeho obsahem - Google Patents

Abstract

Chinazolinonový derivát obecného vzorce nebo jeho farmaceuticky prijatelná sul, kde izopropylová skupina je pripojena v R-konfiguraci; R.sub.1.n. je benzyl, chlorbenzyl, methylbenzyl, methoxybenzyl, kyanobenzyl nebo hydroxybenzylová skupina; R.sub.7.n. je halogen nebo kyano skupina; a R.sub.3 .n. je methylem a/nebo halogenem substituovaná fenylová skupina. Sloucenina je s výhodou ve forme R-izomeru.

Description

(57) Anotace:

Chi nazolinonový derivát obecného vzorce nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde izopropylová skupina je připojena v R-konfiguraci; R| je benzyl, chlorbenzyl, methylbenzyl, methoxybenzyl, kyanobenzyl nebo hydroxy benzylová skupina; R₇ je halogen nebo kyano skupina; a R₃ je methylem a/nebo halogenem substituovaná fenylová skupina. Sloučenina je s výhodou ve formě Rizomeru.

C7. 303007 B6

Chínazolinonový derivát, jeho použití a farmaceutický přípravek s jeho obsahem

Oblast techniky

Tento vynález se týká derivátů chinazolinonů, které působí jako inhibitory mitotického kinesinu KSP a jsou používané při léčbě buněčných proliferativních onemocnění Jako jsou např. rakovina, hyperplazie, restenóza, srdeční hypertrofie, poruchy imunity a zánět.

Dosavadní stav techniky

Deriváty chinazolinonů vzbudily zájem lékařské chemie počátkem padesátých let poté, co byla objasněna struktura chinazolinového alkaloidu, 3-[[3-keto-gama-(3-hydroxy-2-piperÍdyl)-propyl 1—4—chinazolonu, pocházejícího z asijských rostlin a známého pro své antimalarické vlastnosti. Další substituované chinazoliny byly syntetizovány při snaze o přípravu dalších antimalarických agens. Zvláštní význam měla syntézu derivátu 2-methyl-3-o-tolyM—(3//)-chinazolinonu. Tato sloučenina, známá jako metachualon, ačkoliv je neúčinná proti protozoa, byla shledána jako účinné hypnotikum.

Od představení metachualonu a objevení jeho hypnotických účinků začala být zkoumána farmaceutická aktivita chinazolinonů a odvozených sloučenin. Chinazolinony a jejich deriváty jsou známé pro své různorodé biologické vlastnosti zahrnující hypnotické, sedativní, analgetické, antikonvulzivní, antitusivní a protizánětlivé účinky.

Deriváty chinazolinonů, u kterých bylo popsáno specifické biologické použití, jsou popsány v americkém patentu US 5 147 875 popisujícím 2-(substituovaný fenyl)-4—oxo chinazoliny s bronchodilatačními účinky. Patenty US 3 723 432, US 3 740 442 a US 3 925 548 popisují třídu derivátů l-substituovaného-4-aryl-2(l//)-chinazolinonu a jejich použití jako protizánětlivé agens. Evropský patent EP 0 056 637 B1 popisuje třídu derivátů 4(3//)-chinazolinonu pro léčbu hypertenze. Evropský patent EP 0 884 319 Al popisuje farmaceutické kompozice derivátů chinazolin—4-onu používané pro léčbu neurodegenerativních, psychotropních a drogami a alkoholem indukovaných poruch centrálního a periferního nervového systému.

Chinazoliny jsou mezi vzrůstajícím počtem terapeutických agens používány pro léčbu buněčných proliferativních onemocnění včetně rakoviny. Například mezinárodní přihláška PCT WO 96/06 616 popisuje farmaceutickou kompozici zahrnující deriváty chinazolinonů, které ínhibují vaskulámí proliferaci buněk hladkého svalstva. Mezinárodní patentová přihláška PCT WO 96/19 224 popisuje ty samé deriváty chinazolinonů jako inhibitory proliferace mesengiálních buněk. Patenty US 4 981 856, US5 081 124 aUS5 280 027 popisují využití derivátů chinazolinonu pro inhibici thymidylátsyntázy, enzymu, který katalyzuje methylaci deoxyuridin-monofosfátu pro produkci thymidin-monofosfátu, který je potřebný pro syntézu DNA, Patenty US 5 747 498 a US 5 773 476 popisují využití derivátů chinazolinonů pro léčbu rakoviny, která je charakterizovaná nadměrnou nebo nevhodnou aktivitou receptoru tyrosinkinázy. Patent US 5 037 829 se zabývá (l//-azol-l-ylmethyl) kompozicemi na bázi substituovaného chinazolinu, které se využívají pro léčbu karcinomů epitelových buněk. Mezinárodní přihláška PCT WO 98/34 613 popisuje kompozici zahrnující deriváty chinazolinonů a jejich využití pro zmírnění neovaskularizace a pro léčbu zhoubných nádorů. Patent US 5 187 167 popisuje farmaceutické kompozice zahrnující deriváty chinazolin-4-onu, které vykazují proti nádorovou aktivitu.

Další terapeutická agens využívaná pro léčbu rakoviny jsou taxany a vinka-alkaloidy. Taxany a vinka-alkaloidy působí na mikrotubuly, které jsou přítomné v různých buněčných strukturách. Mikrotubuly jsou základním stavebním kamenem mitotického vřeténka. Mitotické vřeténko je odpovědné za distribuci replikovaných kopií genomu do každé ze dvou dceřiných buněk, které

- 1 CZ 303007 B6 jsou výsledkem buněčného dělení. Předpokládá se, že narušení mitotického vřeténka těmito léčivy bude mít za následek inhibici dělení rakovinných buněk a zapříčinění jejich zánik. Nicméně mikrotubuly tvoří jiné typy buněčných struktur včetně drah pro intracelulámí transport v nervových procesech. Jelikož tyto agens nepůsobí specificky na mitotické vřeténko, mají vedlejší účinky, které limitují jejich použitelnost.

Vylepšení specifity těchto agens užívaných pro léčbu rakoviny je velice žádoucí, a to z hlediska terapeutického využití v případě, že by byly omezeny vedlejší účinky spojené s aplikací těchto agens. Dramatická vylepšení léčby rakoviny jsou tradičně spojena s objevením terapeutických agens, která působí novými mechanismy. Příkladem jsou nikoli pouze taxany, ale také kamptoteciny, třída inhibitorů topoizomerázy I. Mitotické kinesiny jako nové protirakovinné agens jsou zajímavé z obou těchto hledisek.

Mitotické kinesiny jsou enzymy nezbytné pro shromáždění a fungování mitotického vřeténka, ale nejsou obvyklou součástí jiných mikrotubulamích struktur, jako např. v nervových procesech. Mitotické kinesiny hrají nezbytnou roli během všech fází mitózy. Tyto enzymy jsou „molekulárními motory“, které transformují energii uvolněnou hydrolýzou ATP na mechanickou sílu, která řídí směr pohybu buněčných komponent podél mikrotubulů. Katalytickou doménou dostačující pro tento úkol je kompaktní struktura přibližně 340 aminokyselin. Během mitózy kinesiny uspořádají mikrotubuly do bipolámí struktury, kterou je mitotické vřeténko. Kinesiny ovlivňují jak pohyb chromozomů podél vřeténka mikrotubulů, tak strukturální změny mitotického vřeténka spojené se specifickými fázemi mitózy. Experimentální perturbace funkce mitotického kinesinu má za následek malformaci nebo dysfunkci mitotického vřeténka často končící přerušením buněčného cyklu a smrtí buňky.

Mezi identifikované mitotického kinesiny patří KSP. KSP náleží do vývojově zachované skupiny kinesinů, mikrotubulámích motorů, které směřují k plus konci a shromažďují se do bipolárních homotetramerů skládajících se z antiparalelních homodimerů. Během mitózy se KSP spojuje s mikrotubuly mitotického vřeténka. Mikroinjekce protilátky proti KSP vpravené do lidské buňky zabraňuje oddělení pólů vřeténka během prometafáze, což má za následek vznik monopolámího vřeténka a zapříčiňuje zastavení mitózy a vede k programovému usmrcení buňky. KSP a příbuzné kinesiny v dalších, jiných než lidských organismech, shlukují antiparalelní mikrotubuly a posouvají je naproti sobě, čímž se utvoří dva oddělené póly vřeténka. KSP může také ovlivňovat prodlužování a umístění mikrotubulů do pólů vřeténka v anafázi B.

Lidské KSP (také nazývané HsEg5)jsou popsány [Blangy, et al,, Cell, 83: 1159 až 69 (1995); Whitehead, et al., Arthritis Rheum., 39: 1635 až 42 (1996); Galgio et al., J. Cell. Biol., 135: 339 až 414 (1996); Blangy, et al., J. Biol. Chem., 272: 19418 až 24 (1997); Blangy, et al., Cell Motil Cytoskeleton, 40: 174 až 82 (1998); Whitehead a Rattner, J. Cell Sci., 111: 2551 až 61 (1998); Kaiser, et ak, JBC 274: 18925 až 31 (1999); GenBank vstupní čísla: X85137, NM004523 a U37426], a fragmenty KSP genu (TRIPS) jsou popsány [Lee, et al., Mol Endocrinol., 9: 243 až 54 (1995); GenBank vstupní číslo L40372]. Jsou známé xenopus KSP homologa (Eg5), stejně tak jako DrosophilaKLPól F/KRPÍ 30.

Mitotické kinesiny jsou zajímavé z hlediska objevení a rozvoje nových mitotických chemoterapeutik. Proto je předmětem tohoto vynálezu stanovit způsoby a kompozice použitelné pro inhibici KSP, mitotického kinesinu.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je chinazolinonový derivát obecného vzorce

-2CZ 303007 B6

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde izopropylová skupina je připojena v R-konftguraci; Ri je benzyl, chlorbenzyl, methylbenzyl, methoxy benzyl, kyanobenzyl nebo hydroxybenzylová skupina; R₇ je halogen nebo kyano skupina; a R? je methylem a/nebo halogenem substituovaná fenylová skupina.

Výhodným provedením je chinazolinonový derivát nebo jeho sůl ve formě optického R-izomeru. to

Podle jiného aspektu vynálezu je výhodný chinazolinonový derivát nebo jeho sůl, kde R_t je benzyl. Dalším výhodným provedením je chinazolinonový derivát nebo jeho sůl, kde R₇ je chlor.

Jiným výhodným provedením je chinazolinonový derivát nebo jeho sůl, kde R[ je benzyl; R₇ je is chlor; a R₃ je 4—methy Ifeny lová skupina. V rámci tohoto provedení je výhodné, když chinazolinonový derivát nebo jeho sůl je ve formě optického R-izomeru.

Jiným aspektem vynálezu je způsob in vitro inhibice KSP kinesinu, zahrnující kontakt KSP kinesinu s chinazolinonovým derivátem nebo jeho solí podle kteréhokoliv z předchozích nároků.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je chinazolinonový derivát nebo jeho sůl tak jak je výše definován, pro použití jako léčivý přípravek.

Jiným aspektem vynálezu je použití chinazolinonového derivátu nebo jeho soli ve formě optické25 ho R-izomeru jako léčivého přípravku.

Jiným aspektem vynálezu je použití chinazolinonového derivátu, tak, jak je výše definován, při výrobě léčivého přípravku pro ošetření buněčných proliferativních onemocnění.

Je výhodné, když pri výše uvedeném použití je uvedené onemocnění vybráno ze skupiny sestávající se z rakoviny, hyperplazie, restenózy, srdeční hypertrofie, imunitních poruch a zánětu. Zejména je vhodné když se použije chinazolinonový derivát nebo jeho sůl, kde R| je benzyl; R₇ je chlor; a R₃ je 4-methylfenylová skupina příp. ve formě optického R-izomeru pro ošetření rakoviny.

Dalším aspektem vynálezu je farmaceutický přípravek, obsahující chinazolinonový derivát nebo jeho sůl, tak, jak je výše definován a farmaceuticky přijatelný nosič.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje generické syntetické schéma přípravy kompozice podle předloženého vynálezu

Obrázek 2 znázorňuje syntetickou cestu přípravy inhibitorů KSP na bázi chinazolinonu.

-3CZ 303007 B6

Obrázek 3 znázorňuje reprezentativní chemické struktury inhibitorů KSP na bázi chinazolinonu. Obrázek 4 znázorňuje syntetickou cestu podstatně Čistých enantiomerů.

Obrázek 5 znázorňuje syntetické cesty ke karbamátům (5a), močovinám (5b) a amidům (5c).

Podrobný popis vynálezu

Předložený vynález je zaměřen na třídu nových sloučenin, jejichž základem je struktura jádra chinazolinonu, a kteréjsou modulátory mitotických kinesinů. Inhibicí nebo modulací mitotických kinesinů, nikoli však jiných kinesinů (např., transportních kinesinů), je dosaženo specifické inhibice buněčné proliferace. Předložený vynález je tedy zaměřen na nalezení odchylek ve funkci mitotického kinesinů, kteréjsou příčinou malformace nebo dysfunkce mitotického vřeténka, což má často za následek přerušení buněčného cyklu a smrt buňky. Způsoby inhibice lidského KSP kinesinů zahrnují spojení inhibitoru podle tohoto vynálezu s KSP kinesinem, zvláště pak lidskými KSP kinesiny, zahrnujícím fragmenty a varianty KSP. Může jít rovněž o inhibici ATP hydrolytické aktivity KSP kinesinů a/nebo aktivity tvorby mitotických vřetének tak, že mitotická vřeténka jsou porušena. Meiotická vřeténka mohou být také porušena.

Záměrem tohoto vynálezu je vyvinout inhibitory a modulátory mitotických kinesinů, zvláště pak KSP, za účelem léčby nemocí a poruch spojených s buněčnou proliferaci. Významné vylepšení v léčbě rakoviny, jednoho typu poruch buněčné proliferace, je tradičně spojeno s objevením terapeutických agens, které působí pomocí nových mechanismů. Příkladem jsou nejen taxany, což je třída agens, které pravděpodobně působí na tvorbu mikrotubulů, ale také kamptoteciny, třída inhibitorů topoizomerázy I. Kompozice a způsoby zde popsané se mohou lišit v selektivitě a jsou určeny pro léčbu nemocí spojených s proliferaci buněk, zahrnující kromě jiného rakovinu, hyperplazii, restenózu, srdeční hypertrofii, poruchy imunity a zánět.

Proto se tento vynález vztahuje na způsoby využívající amidy chinazolinonu obecného vzorce l:

kde:

substituent Ri je vybrán z atomu vodíku, alkylu, alkylarylu, alkyl heteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného alkylarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituenty R₂ a R/ jsou nezávisle vybrány z atomu vodíku, alkylu, oxaalkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu; nebo substituenty R₂ a R₂' spojeny dohromady vytvoří 3- až 7-členný kruh;

-4CZ 303007 B6 substituent R₃ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, oxaalkylheteroarylu, substituovaného oxaalkylheteroarylu, R_tjO- a R₁₅-NH-; substituent R4 je substituovaný alkyl;

substituenty R₅, R<, a R₈ jsou atom vodíku a substituent R? je halogen nebo kyanoskupina; a substituent R,₅ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli;

s výhradou spočívající v tom, že pokud substituent R₃ je R_t5-NH-, pak oba substituenty R₂ a R4 musí být jiné než atom vodíku a s další výhradou spočívající v tom, že substituent R₂ je izopropyl a/nebo substituent R4 je primární aminosubstituovaný Ci_₅ alkyl.

Předložený vynález se také vztahuje na způsoby využívající amidy chinazolinu obecného vzorce 1:

kde:

substituent R] je vybrán z atomu vodíku, alkylu, alkylarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného alkylarylu a substituovaného alkylheteroarylu;

substituent R₂ je /-propyl, substituent R₂' je atom vodíku a stereogenní centrum, ke kterému jsou připojeny substituenty R₂ a R₂' má konfiguraci R;

substituent R₃ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu, substituovaného alkylheteroarylu, oxaalkylu, oxaalkylarylu, substituovaného oxaalkylarylu, oxaalkylheteroarylu, substituovaného oxaalkylheteroarylu, R_]5O- a R15-NH-;

substituent R4 je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroaryl u, substituovaného alkylheteroarylu a R_t6-alkylen-;

substituenty R₅, Ré a Rg jsou atom vodíku a substituent R₇ je halogen nebo kyanoskupina;

substituent R|₅ je vybrán z atomu vodíku, alkylu, arylu, alkylarylu, heteroarylů, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu, substituovaného alkylarylu, substituovaného heteroarylu a substituovaného alkylheteroarylu; a substituent Ri₆ je vybrán z alkoxyskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny, /V-heterocyklylu a substituovaného /V-heterocyklylu; nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli.

-5CZ 303007 B6

Všechny sloučeniny spadající do výše uvedené základní skupiny a jejich deriváty jsou použitelné jako inhibitory kinesinu. Ne všechny sloučeniny jsou nové. Zvláště pak určité močoviny (tzn. sloučeniny, kde substituent Ráje R₁₅NH) jsou popsány v patentu US 5 756 502 jako agens, které modifikují aktivitu cholecystokininu. Specifické výjimky v patentových nárocích odrážejí záměr přihlašovatele vyhnout se nárokování látky, která, ačkoli je funkční částí konceptu tohoto vynálezu, není patentovatelná, protože nemá co do činění s rozsahem tohoto vynálezu.

Definice

Termín „případný” nebo „případně“ znamená, že později popsaný případ nebo okolnost se mohou nebo nemusejí vyskytovat a dále termín zahrnuje případy, kdy uvedený případ nebo okolnost se vyskytují, a případy, kdy se nevyskytují. Například termín „případně substituovaný alkyl“ znamená buď „alkyl“, nebo „substituovaný alkyl“, jak je definován níže. Kterákoliv skupina obsahující jeden nebo více substituentů není určena k provedení jakékoliv substituce nebo substitučních forem (např, substituovaný alkyl zahrnuje případně substituované cykloalkylové skupiny, které jsou dále definovány, včetně případně substituovaných alkylových skupin, potenciálně ad infinitum), které jsou ze stérického hlediska neproveditelné a/nebo synteticky nereálné.

Alkyl zahrnuje lineární, rozvětvené nebo cyklické uhlovodíkové struktury a jejich kombinace. Termín nižší alkyl se vztahuje na alkylové skupiny mající 1 až 5 atomů uhlíku. Příklady nižší alkylových skupin zahrnují methyl, ethyl, propyl, izopropyl, butyl, s- a /-butyl, atd. Výhodné alkylové skupiny jsou ty, které mají 20 atomů uhlíku nebo méně. Výhodnější alkylové skupiny jsou ty, které mají 13 atomů uhlíku nebo méně. Cykloalkyl je podskupina alkylu a zahrnuje cyklické uhlovodíkové skupiny mající 3 až 13 atomů uhlíku. Příklady cykloalkylových skupin zahrnují c-propyl, c-butyl, c-pentyl, norbomyl, adamantyl, atd. V této přihlášce se alkyl vztahuje na alkanyl, jakož i na nenasycené alkenylové a alkynylové zbytky, a zahrnuje cyklohexyl methyl, vinyl, allyl, izoprenyl, atd. Termín alkylen se vztahuje na stejné zbytky jako alkyl, ale má dva body připojení. Příklady alkylenu zahrnují ethylen (-CH2CH2-), ethenylen (-CH=CH_), propylen -(CH2CH2CH2-), di methy Ipropy len, (^CH₂C(CH₃>2CH2-) a cyklohexylpropylen (-CH₂CH₂CH(C₆Hi3)-), Pokud je označen alkylový zbytek mající specifický počet uhlíků, zahrnuje termín veškeré geometrické izomery mající daný počet uhlíků, to znamená, že například „butyl“ zahrnuje n-butyl, sec-butyl, izobutyl a /-butyl a „propyl“ zahrnuje «-propyl a izopropyl (nebo „Z-propyl“).

Termíny alkoxyskupina nebo alkoxyl se vztahují na skupiny mající 1 až 8 atomů uhlíku lineárního, rozvětveného nebo cyklického uspořádání a jejich kombinace vázané přes atom kyslíku na základní struktuře. Příklady zahrnují skupiny methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, cyklopropyloxy, cyklohexyloxy atd. Nižší alkoxy skup iny se vztahují na skupinu mající jeden až čtyři atomy uhlíku.

Termín acyl se vztahuje na skupiny mající 1 až 8 atomů uhlíku lineárního, rozvětveného, cyklického uspořádání, nasycené, nenasycené a aromatické uhlovodíky a jejich kombinace vázané se základní strukturou přes karbonyl. Jeden nebo více atomů uhlíku acylového zbytku může být nahrazeno dusíkem, kyslíkem nebo sírou, pokud místem spojení k mateřské sloučenině zůstane karbonyl. Příklady zahrnují acetyl, benzoyl, propionyl, isobutyryl, /-butoxykarbonyl, benzyloxykarbonyl atd. Nižší acyl se vztahuje na skupiny mající jeden až čtyři atomy uhlíku.

Termín aryl a heteroaryl se vztahuje na 5-ti nebo 6-ti členný aromatický nebo heteroaromatický kruh obsahující 0 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z O, N, nebo S; bicyklický 9ti nebo 10-ti členný aromatický nebo heteroaromatický kruhový systém obsahující 0 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z O, N, nebo S; nebo tricyklický 13-ti nebo 14-ti členný aromatický nebo heteroaromatický kruhový systém obsahující 0 až 3 heteroatomy vybrané ze skupiny sestávající z O, N, nebo S. Aromatické 6-ti až 14-ti členné karbocyklické kruhy zahrnují, např. benzen, naftafen, indan, tetralin, a fluoren a 5-ti až 10-ti členné aromatické hete-6CZ 303007 B6 rocyklické kruhy zahrnují např. imidazol, pyridin, indol, thiofen, benzopyranon, thiazol, furan, benzimidazol, chinolin, isochinolin, chinoxalin, pyrimidin, pyrazin, tetrazol a pyrazol.

Termín alkylaryl se vztahuje na zbytek, ve kterém je arylová část vázaná na základní strukturu pomocí alkylenového zbytku. Příklady zahrnují benzyl, fenethyl, fenylvinyl, fenylallyl atd. Termín oxaalkyl a oxaaikylaryl se vztahují na alkylové a alkylarylové zbytky, ve kterých jeden nebo více methylenů bylo nahrazeno atomem kyslíku. Příklady oxaalkylových a oxaalkyl arylových zbytků zahrnují ethoxyethoxyethyl(3,6-dioxaoktyl), benzyloxymethyl a fenoxymethyl; obecně jsou do této skupiny počítány glykolethery, např. polyethylenglykol. Alkylheteroaryl se vztahuje na zbytek, ve kterém je heteroaryl vázán na základní strukturu pomocí alkylenového zbytku. Příklady zahrnují furany Imethy 1, pyridiny Imethy 1, pyrimidinylethyl atd.

Termín heterocykl se vztahuje na cykloalkylový nebo arylový zbytek, ve kterém je jeden ze čtyř atomů uhlíku nahrazen heteroatomem jako je kyslík, dusík nebo síra. Příklady heterocyklu, které spadají do rozsahu tohoto vynálezu zahrnují imidazolin, pyrrolidin, pyrazol, pyrrol, indol, chinolin, isochinolin, tetrahydroisochinolin, benzofuran, benzodioxan, benzodioxol (běžně popisovaný jako methylendioxyfenyl, vyskytuje-li se jako substituent), tetrazol, morfolin, thiazol, pyridin, pyridazin, pyrimidin, thiofen, furan, oxazol, oxazolin, isoxazol, dioxan, tetrahydrofuran atd. Termín „Λ-heterocyklyl“ se vztahuje na heterocykl obsahující atom dusíku jako substituentový zbytek. Termín heterocyklyl zahrnuje heteroaryl, který je podskupinou heterocyklylu. Příklady Λ-heterocyk tylových zbytků zahrnují 4-morfolinyl, 4-thiomorfolinyl, 1-piperidinyl, 1-pyrrol idinyl, 3~th iazo lid inyl, piperazinyl a 4-(3,4-dihydrobenzoxazinyl). Příklady substituovaného heterocyklylu zahrnující 4-methy í-l -piperazinyl a 4—benzyl-l-piperidinyl.

Termín substituovaný alkyl, aryl a heteroaryl se vztahuje na alkyl, aryl nebo heteroaryl, kde jeden nebo více atomů vodíku jsou nahrazeny alkylem, halogenem, hydroxyskupinou, alkoxyskupinou, alkylendioxyskupinou (např. methy lendioxy skupinou), fluoralkylem, karboxy skupí nou (-COOH), karboalkoxyskupinou (tzn. acyloxyskupinou, -O(O)CR), karboxyalkylem (tzn. estery -C(O)OR), karboxamidoskupinou, sulfonamidoal kýlem, sulfonamidoarylem, aminokarbonylem, benzytoxykarbonylaminoskupinou (CBZ-amino), kyanoskupinou, karbonylem, nitroskupinou, primární, sekundární a terciární aminoskupinou (např. alkylaminoskupinou a dialkylaminoskupinou) a aminoalkylenem, alkylthioskupinou, alkyl sulfiny lem, alkyIsulfonylem, alkylsulfonamidoskupinou, arylthioskupinou, aryl sulfiny lem, ary Isulfony lem, amidinoskupinou, arylem (např. feny lem a benzylem), heteroarylem, heterocyklylem, fenoxyskupinou, benzyloxyskupinou nebo heteroaryloxy skupinou. Pro účely tohoto vynálezu substituovaný alkyl zahrnuje také oxaalkylové zbytky, tzn. alkylový zbytek, ve kterém je jeden nebo více atomů uhlíku nahrazeno kyslíkem. Termín substituovaný alkylaryl a substituovaný oxaaikylaryl se vztahuje na zbytky, ve kterých bud’jedna nebo obě alkylenové a arylové části jsou substituovány. Termín substituované alkylheteroarylové a substituované oxaalkylheteroarylové zbytky se vztahuje na zbytky, ve kterých buď jedna, nebo obě alkylenové a heteroaiylové části jsou substituovány. Dále by mělo být uvedeno, že určité polohy mohou obsahovat dvě nebo i tři substituční skupiny, R, R' a R” (např. dimethylaminoskupinu a trifluormethyl).

Termín halogen se vztahuje na fluor, chlor, brom nebo jod. Výhodné jsou fluor, chlor a brom. Dihalogenaryl, dihalogenalkyl, trihalogenaryl atd. se vztahují na aryl a alkyl substituovaný dvojicí halogenů, není však nutné, aby oba halogeny byty stejné; tedy 4_chlor-3-fluorfenyl spadá pod dihalogenaryly.

Většina sloučenin popsaných v tomto vynálezu obsahuje jedno nebo více asymetrických center (např. uhlík, na který jsou vázány substituenty R₂ a R2' ) a mohou se tedy vyskytovat ve formě enantiomerů, diastereoizomerů a ve stereoizomerických formách, které mohou být definovány pomocí termínů absolutní stereochemie, jako (R>- nebo (S)-. Tento vynález zahrnuje všechny tyto možné formy izomerů, včetně racemických směsí, opticky čistých forem a přechodných směsí. Opticky aktivní (R)~ a (S)-izomery mohou být připraveny použitím chirálních syntonů nebo chirálních činidel, nebo pomocí tradičních technik. Jestliže zde popsané sloučeniny obsahují

-7 CZ 303007 B6 olefinickou dvojnou vazbu nebo jiná centra geometrické asymetrie a není-li uvedeno jinak, míní se tím sloučeniny zahrnující oba E a Z geometrické izomery. Stejně tak jsou zahrnuty všechny tautomemí formy.

Je-li to požadováno, mohou být R- a S—izomery rozděleny metodami, které jsou odborníkům v oboru známé. Např. utvořením diastereoizomerických solí nebo komplexů, které mohou být separovány např. krystalizací; utvořením diastereoizomerických derivátů, které mohou být odděleny např. krystalizací, plynovou-kapalinovou nebo kapalinovou ehromatografií; selektivní reakcí jednoho enantiomeru s enantiomemě specifickým Činidlem, např. enzymatickou oxidací nebo redukcí, která je následována oddělením modifikovaných a nemodifikovaných enantiomeru; nebo plynovou-kapalinovou nebo kapalinovou ehromatografií v chirálním prostředí např, na chirálním nosiči jako silikagel s navázanými chirálními ligandy nebo v přítomnosti chirálního rozpouštědla. Zvláště výhodné je, když požadovaný enantiomer je převeden na jinou chemickou entitu jedním ze separačních postupů, které jsou popsány výše, a dalším krokem může být uvolněn požadovaný enantiomer. Alternativně mohou být jednotlivé enantiomery syntetizovány asymetrickou syntézou za použití opticky aktivních činidel, substrátů, katalyzátorů nebo rozpouštědel nebo převedením jednoho enantiomeru na jiný asymetrickou transformací. Příklad syntézy vycházející z opticky aktivní látky je zobrazen na obrázku 4,

V jednom provedení tohoto vynálezu, mohou být dva sousední substituenty R₂ spojeny dohromady a utvořit tak kruhovou strukturu. Spojená kruhová struktura může opět obsahovat heteroatomy a může být substituována jedním nebo více substituenty „R“. Mělo by se dále upozornit na to, že u cykloalkylu (tzn. nasycených kruhových struktur) může každá pozice obsahovat dvě substituující skupiny, substituent R a substituent R'.

Výhodná provedení

S ohledem na strukturu 1 je ve výhodném provedení tohoto vynálezu substituent Rj vybraný z atomu vodíku, alkylu, alkylarylu, alkylheteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného alkylarylu a substituovaného alkylheteroarylu.

Ve výhodnějším provedení tohoto vynálezu je substituent R| vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, benzylu a substituovaného benzylu.

V nejvýhodnějším provedení tohoto vynálezu je substituent Ri vybrán z atomu vodíku, ethylu, propylu, methoxyethylu, fenethylu, benzylu, chlorbenzylu, methyl benzylu, methoxybenzylu, kyanobenzylu, hydroxybenzylu, tetrahydrofuranyl methylu a (ethoxykarbonyl)ethylu.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je substituent R₂ vybrán z atomu vodíku, alkylu, cykloalkytu nebo substituovaného alkylu. Struktury obecného vzorce 1 mají potenciálně chirální centrum na atomu uhlíku, na který je vázán substituent R₂. Tedy poloha R₂ může obsahovat dvě substituční skupiny, substituent R? a substituent R₂'. Substituenty R₂ a R₂' mohou být stejné nebo odlišné; jsou-Π odlišné, kompozice je chirální. Jestliže substituenty R₂ a R₂ jsou odlišné, výhodná provedení tohoto vynálezu využívají pouze jednoduchý nevodíkový substituent R₂. Úmyslem tohoto vynálezu je použití čistých enantiomerů a směsí enantiomerů, zahrnující racemické směsi, ačkoli obecně bude výhodné použití v podstatě opticky čistého eutomeru, zejména R enantiomeru.

Ve výhodném provedení je substituent R₃ je vybrán ze alkylu, substituovaného alkylu, alkylarylu, heteroarylu, arylu, substituovaného arylu, substituovaného oxaalkylarylu, -O-R₁₅ a -NH-R_I5 a Ris je vybrán z alkylu, arylu a substituovaného arylu.

Ve výhodnějším provedení tohoto vynálezu je substituent R₂ je vybrán z atomu vodíku, nižšího alkylu a substituovaného nižšího alkylu, a substituent R₂' je atom vodíku. V nej výhodnějším provedení tohoto vynálezu je substituent R₂ vybrán z atomu vodíku, methylu, ethylu, propylu

-8CZ 303007 B6 (zejména i--propvlu), butylu (zejména /-butylu), methylthioethylu, aminobutylu, (CBZ)aminobutylu, cyklohexylmethylu, benzyloxy methylu, methyIsulfinylethylu, methylsulfinylmethylu, hydroxymethylu, benzylu a indolylmethylu. Zejména výhodný je R enantiomer, kde substituent R₂ je Z-propyl.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je substituent R₃, pokud substituent R₃ není -NHR₎₅, vybrán ze skupiny sestávající z alkylu majícího 1 až 13 atomů uhlíku; substituovaného nižšího alkylu; arylu, včetně fenylu, bifenylu a naftylu; substituovaného arylu, včetně fenylu substituovaného jedním nebo více halogeny, nižšími alkyly, nižšími alkoxyskupinami, nitroskupinami, kario boxyskupinami, methylendioxyskupinami nebo triťluormethyl; benzylu; fenoxymethylu; halogen fenoxymethylu; fenylvinylu; heteroarylu; heteroarylu substituovaného nižším alkylem; a benzyl oxymethyl.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je substituent R₃, pokud substituent R₃ není -NHR_I5, vybrán ze skupiny sestávající z ethylu, propylu, chlorpropylu, butoxyskupiny, heptylu, butylu, oktylu, tridekanyíu, (ethoxykarbonyl)ethylu, dimethylaminoethylu, dimethylaminomethylu, fenylu, naftylu, halogenfenylu, dihalogenfenylu, kyanofenylu, halogen(trifluormethyl)fenylu, chlorfenoxymethylu, methoxyfenylu, karboxyfenylu, ethylfenylu, tolylu, bifenylu, methylendioxyfenylu, methylsulfonylfenylu, methoxychlorfenylu, chlomaftylu, methylhalogenfenylu, tri fluormethy (fenylu, buty Ifeny lu, pentylfenylu, methy lennitrofenylu, fenoxymethylu, di methoxyfenylu, fenylvinylu, nitrochlorfenylu, nitrofenylu, dinitrofenylu, bis(trifluormethyl)fenylu, benzyloxy methylu, benzylu, furanylu, benzofuranylu, pyridinylu, indolylu, methylpyridinylu, chinolinyiu, pikolinylu, pyrazolyíu a imidazolylu.

Ve výhodnějším provedení je substituent R₎₅, pokud je substituent R₃ -NHRjs, vybrán z nižšího alkylu; cyklohexylu; fenylu; a fenylu substituovaného halogenem, nižším alkylem, nižší alkoxyskupinou nebo nižší alkylthioskupinou.

V nej výhodnějším provedení je substituent Ri₅, pokud je substituent R₃ -NHRi₅, isopropyl, butyl, cyklohexyl, fenyl, bromfenyl, dichlorfenyl, methoxyfenyl, ethylfenyl, tolyl, trifluormethyIfenyI nebo methy lthiofenyl.

Ve výhodném provedení je substituent R4 vybrán z alkylu, arylu, alkylarylu, alkyl heteroarylu, substituovaného alkylu, substituovaného arylu a substituentu -alkylen-R₁₆, a substituent Rió je vybrán z alkoxyskupiny, aminoskupiny, alkylaminoskupiny, dialkylaminoskupiny a ZV-heterocyklylu.

Ve výhodnějším provedení je substituent R4 vybrán z nižšího alkylu, substituovaného nižšího alkylu, cyklohexylu; fenylu substituovaného hydroxyskupinou, nižší alkoxy skupinou nebo nižším alkylem; benzylu; heteroarylmethylu; heteroarylethylu; heteroaryl propylu a -alkylen-R|₆, kde substituent R_!6 je aminoskupina, nižší alky lam inoskup ina, di(nižší alkyl)aminoskupina, nižší alkoxyskupina nebo V-heterocyklyl.

V nej výhodnějším provedení je substituent R4 vybrán z methylu, ethylu, propylu, butylu, cyklo45 hexylu, karboxyethylu, karboxymethylu, methoxyethylu, hydroxyethylu, hydroxypropylu, dimethylaminoethylu, dimethylaminopropylu, diethylaminoethylu, diethylaminopropylu, aminopropylu, methylaminopropylu, 2,2-dimethyl-3-(dimethylamino)propylu, 1 -cyklohexy 1-4—(diet hy lam i no)butylu, aminoethylu, aminobutylu, aminopentylu, aminohexylu, aminoethoxyethylu, isopropylaminopropylu, diisopropylaminoethylu, l-methyl-4-(diethylamino)butylu, (/-Boc)50 aminopropylu, hydroxyfenylu, benzylu, methoxyfenylu, methylmethoxyfenylu, dimethyl fenylu, tolylu, ethylfenylu, (oxopyrrolidinyl)propylu, (methoxykarbonyl)ethylu, benzylpiperidinylu, pyridinylethylu, pyridinylmethylu, morfoliny lethylu, morfolinylpropylu, piperidinylu, azetidinylmethylu, azetid i nyl propylu, pyrrolidinylethylu, pyrrolid inyl propylu, piperidinylmethylu, piperidinylethylu, imidazolyl propylu, imidazolylethylu, (ethy Ipyrro lidinyl)methylu, (methy Ipyrro lid i -9CZ 303007 B6 nyl)ethylu, (methylpiperidinyl)propylu, (methylpiperazinyl)propylu, furanylmethylu a indoly!ethylu.

Dále je výhodným provedením pro každého ze specifických substituentů: substituent Rs je atom vodíku; substituent Ró je atom vodíku; substituent R₇ je halogen nebo kyanoskupina; a substituent R₈je atom vodíku. Dále jsou výhodné sloučeniny, ve kterých pouze jeden ze substituentů R₅, Ró, R₇ a R₈ není atom vodíku, zejména substituent R₇Ve zvláště výhodné podskupině je substituent R! benzyl; substituent R₂ je vybrán z ethylu a propylu; substituent R/ je atom vodíku; substituent R-. je substituovaný fenyl; substituent R4 je (CH₂)_mOH, kde index m je dvě nebo tři, nebo -(CH₂)_pR|ó, kde p je jedna až tri a substituent R10 je aminoskupina, propylaminoskupina nebo azetidinyl; substituent R₅ je atom vodíku; substituent Ró je atom vodíku; substituent R₇ je halogen; substituent Rg je atom vodíku.

Vzhledem k výše uvedenému, obzvláště pak na základě dat z testů uvedených níže, jsou pro sloučeniny, farmaceutické přípravky, způsoby výroby a použití podle předloženého výhodné následující kombinace a obměny substituujících skupin (resp. podskupin, seřazeno podle zvyšující se priority):

1. Jakýkoliv z obecných vzorců 1, kde substituent R| je atom vodíku, nižší alkyl, substituovaný nižší alkyl, alkylaiyl nebo substituovaný alkylaryl (výhodně benzyl nebo substituovaný benzyl):

a. Zejména tam, kde stereogenní centrum, ke kterému jsou připojeny substituenty R₂ a R₂', má konfiguraci R, kde substituent R₂'je atom vodíku.

i. Obzvláště, kde substituent R₂ je nižší alkyl (výhodně ethyl, /-propyl, c—propyl nebo ζ-butyl).

1. Nejvýhodněji tam, kde substituent R₂ je /-propyl.

b. Zejména tam, kde substituent R4 je substituovaný alkyl, (výhodně primární, sekundární nebo terciární amino-substituovaný nižší alkyl).

i. Nejvýhodněji tam, kde substituent R4 je primární amino nižší alkyl.

c. Výhodně jsou substituenty R_s, Ró a R₈ atom vodíku.

i. Výhodněji substituent R₇ je halogen nebo kyanoskupina, zejména fluor nebo chlor a nejvýhodněji chlor.

d. V případě obecných vzorců 1, zejména tam, kde substituent R₃ je aryl (výhodně fenyl), substituovaný aryl (výhodně nižší alkyl- nebo nižší alkoxy-substituovaný fenyl), alkylaryl (výhodně benzyl a fenyl vinyl), alkylheteroaryl, oxaalkylaryl (výhodně fenoxy nižší alkyl), oxaalkylheteroaryl, substituovaný alkylaryl (výhodně substituovaný benzyl a substituovaný fenylvinyl), substituovaný alkylheteroaryl, substituovaný oxaalkylaryl (výhodně substituovaný fenoxy nižší alkyl) nebo substituovaný oxaalkylheteroaryl.

i. Nejvýhodněji tam, kde substituent R₃ je aryl, substituovaný aryl, nižší alkylaiyl nebo substituovaný nižší alkylaryl.

2. Jakýkoliv z obecných vzorců 1, kde stereogenní centrum, ke kterému jsou připojeny substituenty R₂ a R₂', má konfiguraci R, obzvláště tam, kde substituent R/ je atom vodíku;

a. Zejména tam, kde substituent R₂ je nižší alkyl (výhodně ethyl, /-propyl, c-propyl nebo /-butyl).

i. Nejvýhodněj i tam, kde substituent R₂ je /-propyl.

b. Zejména tam, kde substituent R4 je substituovaný alkyl, (výhodně primární, sekundární nebo terciární amino-substituovaný nižší alkyl).

- 10CZ 303007 B6

i. Nejvýhodněji tam, kde substituent Kje primární amino-nižší alkyl.

c. Zejména tam, kde substituenty Rs, K a Rg jsou atom vodíku.

i. Nej výhodněji tam, kde substituent R₇ je halogen (obzvláště chlor nebo fluor) nebo kyanoskupina.

1. Obzvláště tam, kde substituent R₇ je chlor.

3. Jakýkoliv z obecných vzorců 1, kde substituent R₇ je halogen (výhodně chlor nebo fluor) nebo kyanoskupina.

a. Zejména tam, kde substituenty R₅, R#> a R_s jsou atom vodíku, i. Nej výhodněji tam, kde substituent R₇ je chlor.

Nej výhod něj i pro sloučeniny, farmaceutické přípravky, způsoby výroby a použití podle předloženého vynálezu je obecný vzorec 1 zahrnující následující kombinace a obměny substituujících skupin (resp. podskupin, seřazeno podle zvyšující se priority):

1. Substituent Ri je alkylaryl nebo substituovaný alkylaryl (výhodně benzyl nebo substituovaný benzyl; nejvýhodněji benzyl).

a. Zejména tam, kde stereogenní centrum, ke kterému jsou připojeny substituenty R₂ a R₂', má konfiguraci R, kde substituent R₂' je atom vodíku.

i. Obzvláště tam, kde substituent R₂ je nižší alkyl (výhodně ethyl, /-propyl, c-propyl nebo Z-butyl),

1. Nej výhodněji tam, kde substituent R₂ je /-propyl.

b. Zejména tam, kde substituent R₃ je aryl (výhodně fenyl), substituovaný aryl (výhodně nižší alkyl- nižší alkoxy- a/nebo halogen-substituovaný fenyl), alkylaryl (výhodně benzyl a fenyl vinyl), alkylheteroaryl, oxaalkylaryl (výhodně fenoxy nižší alkyl), oxaalkylheteroaryl, substituovaný alkylaryl (výhodně substituovaný benzyl a substituovaný alkylaryl (výhodně substituovaný benzyl a substituovaný fenylvinyl), substituovaný alkylheteroaryl, substituovaný oxaalkylaryl (výhodně substituovaný fenoxy nižší alkyl) nebo substituovaný oxaalkylheteroaryl.

i. Obzvláště tam, kde substituent R₃ je aryl, substituovaný aryl, nižší alkylaryl, substituovaný nižší alkylaryl, oxa(nižši)alkylaryl.

1. Nejvýhodněji tam, kde substituent R₃ je methyl- a/nebo halogen-substituovaný fenyl.

c. Zejména tam, kde substituent R4 je substituovaný alkyl (výhodně primární, sekundární nebo terciární amino-substituovaný nižší alkyl).

i. Obzvláště tam, kde substituent R4 je primární amino-substituovaný nižší alkyl.

1. Nejvýhodněji tam, kde substituent R4 je 3-amino-«-propyI.

2. Nejvýhodněji tam, kde substituenty R₅, K a Rg jsou atom vodíku.

a. Zejména tam, kde substituent R₇ je halogen nebo kyanoskupina (nejvýhodnéji chlor).

2. Tam, kde stereogenní centrum, ke kterému jsou připojeny substituenty R₂ a R₂', má konfiguraci R (výhodně tam, kde substituent R2' je atom vodíku).

a. Zejména tam, kde substituent R₂ je nižší alkyl (výhodně ethyl, /-propyl, c-propyl nebo Z-butyl).

i. Nej výhodněji tam, kde substituent R₂ je /-propyl.

- 11 CZ 303007 Β6

b. Zejména tam, kde substituent R₃ je aryl (výhodně fenyl), substituovaný aryl (výhodně nižší alkyl—, nižší alkoxy— a/nebo halogen—substituovaný fenyl), alkylaryl (výhodně benzyl a fenylvinyl), alkyl heteroaryl, oxaalkylaiyl (výhodně fenoxy nižší alkyl), oxaalkylheteroaryl, substituovaný alkylaryl (výhodně substituovaný benzyl a substituovaný fenylvinyl), substituovaný alkyl heteroaryl, substituovaný oxaalkylaryl (výhodně substituovaný fenoxy nižší alkyl) nebo substituovaný oxaalkylheteroaryl.

i. Obzvláště tam, kde substituent R₃ je aryl, substituovaný aryl, nižší alkylaryl, substituovaný nižší alkylaryl, oxa (nižší) alkylaryl.

1, Nejvýhodtiěji tam, kde substituent R₃ je methyl- a/nebo halogen-substituovaný fenyl.

c. Zejména tam, kde substituent R4 je substituovaný alkyl (výhodně primární, sekundární nebo terciární amino-substituovaný nižší alkyl).

1. Obzvláště tam, kde substituent R4 je primární aminosubstituovaný nižší alkyl.

1. Nejvýhodněji tam, kde substituent R4 je 3-amino-zř-propyl.

2. Zejména tam, kde substituenty R₅, R^ a Rg jsou atom vodíku.

a. Zejména tam, kde substituent R₇ je halogen nebo kyanoskupina (nejvýhodněji chlor).

3. Substituent R₃ je aryl (výhodně fenyl), substituovaný aryl (výhodně nižší alkyl—, nižší alkoxy- a/nebo halogen-substituovaný fenyl), alkylaryl (výhodně benzyl a fenylvinyl), alkyl heteroaryl, oxaalkylaiyl (výhodně fenoxy nižší alkyl), oxaalkyl heteroaryl, substituovaný alkylaryl (výhodně substituovaný benzyl a substituovaný fenylvinyl), substituovaný alkylheteroaryl, substituovaný oxaalkylaryl (výhodně substituovaný fenoxy nižší alkyl) nebo substituovaný oxaalkylheteroaryl.

a. Zejména tam, kde substituent R₃ je aryl, substituovaný aryl, nižší alkylaryl, substituovaný nižší alkylaiyl, oxa(nižší)alkylaryl.

i. Nejvýhodněj i tam, kde substituent R₃ je methyl— a/nebo halogen-substituovaný fenyl.

b. Zejména tam, kde substituent R4 je substituovaný alkyl (výhodně primární, sekundární nebo terciární amino-substituovaný nižší alkyl).

i. Obzvláště tam, kde substituent R4 je primární aminosubstituovaný nižší alkyl.

1. Nej výhodněji tam, kde substituent R4 je 3-amino-«-propyl.

2. Zejména tam, kde substituenty Rj, R^ a Rg jsou atom vodíku.

a. Zejména tam, kde substituent R? je halogen nebo kyanoskupina (nejvýhodněji chlor).

4. Substituent R4 je substituovaný alkyl (výhodně primární, sekundární nebo terciární amino substituovaný nižší alkyl).

a. Obzvláště tam, kde substituent R4 je primární amino-substituovaný nižší alkyl, i. Nej výhodněji tam, kde substituent R4 je 3-amino-n-propyl.

1. Nejvýhodněj i tam, kde substituenty R₅, R^ a Rg jsou atom vodíku.

a. Zejména tam, kde substituent R? je halogen nebo kyanoskupina (nejvýhodněji chlor).

b.

i. Nej výhodněji tam, kde substituenty R5, R$ a Rg jsou atom vodíku.

1. Zejména tam, kde substituent R? je halogen nebo kyanoskupina (nejvýhodněj i chlor).

- 12 CZ 303007 B6

Obzvláště výhodné pro sloučeniny, farmaceutické přípravky, způsoby výroby a použití podle předloženého vynálezu je obecný vzorec 1, kde substituent R_t je alkylaryl nebo substituovaný alkylaryl (obzvláště benzyl nebo substituovaný benzyl), substituent R₂ je nižší alkyl (obzvláště ipropyl), substituent R/ je atom vodíku, substituent R₃ je substituovaný aryl (obzvláště methyl a/nebo halogen-substituovaný fenyl), substituent R4 je substituovaný alkyl (obzvláště 3-aminon-propyl), substituenty R₅, Ró a Rg jsou atom vodíku a substituent R₇ je halogen nebo kyanoskupina (obzvláště chlor), kde stereogenní centrum, ke kterému jsou připojeny substituenty R₂ a R₂\ má konfiguraci R.

Syntéza, testy a použití

Kompozice tohoto vynálezu naznačené níže jsou syntetizovány za použití známých technik. Např. jak je popsáno v Ager et ak, J. of Med. Chem., 20: 379 až 386 (1977), zde uvedené jako odkaz, chinazolinony mohou být získány kysele katalyzovanou kondenzací Λ-acylanthran i lových kyselin s aromatickými primárními aminy. Další postupy přípravy chinazolinonů jsou popsány v patentech US 5 783 577; US 5 922 866 a US 5 187 167, všechny jsou zde uvedeny jako odkazy.

Kompozice tohoto vynálezu mohou být připraveny způsobem, který je zobrazen na obrázcích 1, 2, 4 a 5.

Takto připravené kompozice tohoto vynálezu nacházejí využití v různých aplikacích. Mitóza může být upravována různými způsoby; to znamená, že může být ovlivněna jak zvyšováním, tak snižováním aktivity komponent mitotické dráhy. Jinak řečeno mitóza může být ovlivněna (např. narušena) narušením rovnováhy a také různými inhibiční mi nebo aktivačními komponentami. Podobnými způsoby může být upravována meióza.

Ve výhodném provedení jsou kompozice tohoto vynálezu používány pro modulaci tvorby mitotického vřeténka, tím že způsobují prodloužení buněčného cyklu zadržením v mitóze. Termín „modulace“ je zde použit ve smyslu upravení tvorby mitotického vřeténka, zahrnující zvýšení nebo snížení tvorby mitotického vřeténka. „Tvorbou mitotického vřeténka“ se v toto textu rozumí uspořádání mikrotubulů do bipolámí struktury mholickými kinesiny. „Dysfunkcí mitotického vřeténka“ se zde rozumí zastavení mitózy a utvoření monopolámího vřeténka.

Kompozice tohoto vynálezu jsou použitelné pro vazebné a/nebo modulační aktivity mitotického kinesinu, KSP. V výhodném provedení je KSP lidský KSP, ačkoliv KSP kinesiny z jiných organismů mohou být také použity. V tomto kontextu modulace znamená jak zvýšení, tak snížení oddělení pólů vřeténka způsobující malformace, tzn. roztažení pólů mitotického vřeténka, nebo dále také způsobující morfologické perturbace mitotického vřeténka. V rámci definovaného KSP jsou pro tyto účely také zahrnuty varianty a/nebo fragmenty KSP. Viz. americká patentová přihláška (číslo 09/428 156) „Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation a Methods of Diagnosing Cell Proliferation States“, podaná 27. října 1999, která je zde uvedena jako odkaz v celém svém rozsahu. Mimoto v tomto vynálezu mohou být použity další mitotické kinesiny. Nicméně kompozice tohoto vynálezu jsou specifické pro KSP.

Pro určení aktivity jsou obecně jak KSP, tak sloučeniny podle tohoto vynálezu nerozpustné vázány na nerozpustný nosič s izolovanými místy pro navázání vzorku (např. na mikrotitrační destičky, misky atd.). Nerozpustný nosič může být vyroben z jakékoli směsi, ke které se tato kompozice může vázat, je snadno oddělitelný od rozpustného materiálu a dále je také celkově kompatibilní s metodami testování. Povrch těchto nosičů může být hladký nebo pórovitý a nosiče mohou mít jakýkoliv vhodný tvar. Příklady vhodných nerozpustných nosičů zahrnují mikrotitrační destičky, misky, membrány a perličky, které jsou obvykle vyrobeny ze skla, plastu (např. polystyrenu), póly sacharidů, nylonu nebo nitrocelulózy, teflonu, atd. Mikrotitrační destičky a misky jsou obzvláště vhodné, protože může být současně provedeno mnoho testů ve velice malém množství Činidla a vzorku. Konkrétní způsob vázání kompozice není rozhodující v případě, zeje

- 13 CZ 303007 B6 slučitelný s činidly a metodami tohoto vynálezu, zachovává aktivitu kompozice a je nedifuzní. Výhodné způsoby navázání zahrnují použití protilátek (který stericky nebrání buď navázání ligandu, nebo aktivaci sekvence, když je protein navázaný na nosič), přímé navázání na „lepkavý“ iontový nosič, chemickou zesíťovanou vazbu, syntézu proteinu nebo agens přímo na povrchu atd. Následuje navázání proteinu nebo agens, přebytečný nenavázaný materiál je odstraněn omytím. Oblasti obsahující vzorek pak mohou být zablokovány pomocí inkubace s hovězím sérovým albuminem (BSA), kaseinem nebo jiným neškodným proteinem či jiným podílem.

Antimitotické agens tohoto vynálezu mohou být použity samotné pro modulaci aktivity mitotického kinesinu, zvláště KSP. V tomto provedení jsou mítotické agens tohoto vynálezu kombinovány s KSP a je měřena aktivita KSP. Aktivita kinesinu je pracovníkům v oboru známa a zahrnuje jednu nebo více aktivit kinesinu. Aktivity kinesinu zahrnují schopnost ovlivňovat ATP hydrolýzu; vazbu mikrotubulů; skluz a polymerizaci/depolymerizaci (účinky na dynamiku mikrotubulů); vazbu na další proteiny vřeténka; vazbu na proteiny účastnící se kontroly buněčného cyklu; fungování jakožto substrátu pro ostatní enzymy, jako jsou kináza a proteázy; specifické buněčné aktivity kinesinu jako je separace pólů vřeténka.

Způsoby na měření pohyblivosti jsou pracovníkům v oboru dobře známy. [Viz např., Halí, et al. (1996), Byophys, J,, 71: 3467 až 3476, Turner et al., 1996, Anal, Biochem. 242 (l): 20 až 5; Gittes et al., 1996, Biophys. J. 70 (1) : 418 až 29; Shirakawa et al., 1995, J. Exp. Biol 198: 1809 až 15; Winkelmann et al., 1995, Biophys. J. 68: 2444 až 53; Winkelmann et al., Biophys. J. 68: 72S]

Způsoby pro stanovení hydrolytické aktivity ATPázy známé ze stavu techniky mohou být rovněž použity. Výhodně se využívají způsoby založené na roztocích. Americká přihláška 09/314 464, podaná 18. května 1999, která je zde uvedena jako odkaz v celém svém rozsahu, tyto testy popisuje. Alternativně jsou používány konvenční způsoby. Například může být kvantifikováno uvolněni P, substituentu z kinesinu. V jednom z výhodných provedení využívá test hydrolytické aktivity ATPázy 0,3 M PCA (kyselina chloristá) a substituční látku melachitovou zeleň (8,27 mM molybdenan sodný, 0,33 mM oxalát malachitové zeleně a 0,8 mM Triton X-100). Při provedení testu se 10 μΙ reakční směsi utlumí v 90 μΐ ledové 0,3 M kyselině chloristé. Používají se fosfátové standardy, takže data mohou být převedena na mM uvolněného anorganického fosfátu. Jakmile jsou všechny reakce a standardy utlumeny kyselinou chloristou, přidá se např. do příslušných jamek mikrotitrační destičky 100 μί činidla malachitové zeleně. Směs se nechá vyvíjet 10 až 15 minut a destička je odečtena pri absorbanci 650 nm. Pokud jsou použity fosfátové standardy, mohou být hodnoty absorbance převedeny na mM Pi a porovnány v čase. Testy ATPázy používané v oboru zahrnují rovněž testy luciferázou.

ATPázová aktivita motoru domény kinesinu může být rovněž použita k testování účinku modulačních agens. V jednom provedení tohoto vynálezu jsou ATPázové testy kinesinu prováděny v nepřítomnosti mikrotubulů. Ve výše uvedených testech mohou být stanoveny různé typy modulačních agens. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je účinek modulačních agens nezávislý na koncentraci mikrotubulů a ATP. V dalším provedení tohoto vynálezu může být účinek činidel na ATPázu kinesinu snížen zvýšením koncentrace ATP, mikrotubulů nebo obou, V dalším provedení tohoto vynálezu je účinek tohoto modulačního agens zesílen zvýšením koncentrace ATP, mikrotubulů nebo obou.

Agens, které modulují biochemickou aktivitu KSP in vitro pak mohou být testovány in vivo. Způsoby pro in vivo sledování těchto činidel zahrnují testy rozdělení buněčného cyklu, životaschopnosti buněk nebo sledování přítomnosti, morfologie, aktivity, rozdělení nebo množství mitotických vřetének. Způsoby pro sledování rozdělení buněčného cyklu populace buněk například pomocí průtokové cytometrie jsou pracovníkům v oboru dobře známy. Stejně tak způsoby pro určení životnosti buněk. Viz například americká patentová přihláška „Methods of Screening for Moulators of Cell Proliferation a Methods of Diagnosing Cell Proliferation States“, podaná 22. října 1999, čísla 09/428 156, která je zde zahrnuta ve formě odkazu.

- 14CZ 303007 B6

Kromě výše popsaných testů jsou pracovníkům v oboru dobře známy rovněž mikroskopické způsoby pro testování tvorby vřeténka a malformací (viz např,, Whitehead a Rattner (1998), J. Cell. Sci. 11 1:2551 až 61; Galgio et al., (1996), J, Cell biol., 135: 399 až 414).

Kompozice tohoto vynálezu inhibují KSP kinesin. Jedním měřítkem inhibice je ICso, definované jako koncentrace kompozice, při které je aktivita KSP snížena o 50 %. Výhodné kompozice mají IC50 kolem l mM, přičemž výhodná provedení tohoto vynálezu mají IC₅₀ menší než 100 μΜ, přičemž výhodnější provedení tohoto vynálezu mají IC₅₀ nižší než 10 μΜ, zvláště výhodná provedení tohoto vynálezu mají IC₅₀ nižší než 1 μΜ, speciálně výhodná provedení tohoto vynálezu mají IC_5t) nižší než 100 nM, a nejvýhodnější provedení tohoto vynálezu mají IC₅₀ méně než 10 nM. Měření IC50 se provádí s použitím ATPázového testu.

Dalším měřítkem je inhibice K,. Pro sloučeniny s IC₅₀ nižším než 1 μΜ je Kj nebo K_d definováno jako disociační konstanta interakce chinazolinonu s KSP. Výhodné sloučeniny mají Kj nižší než 100 μΜ, přičemž výhodná provedení tohoto vynálezu mají K, nižší než 10 μΜ, zvláště výhodná provedení tohoto vynálezu mají K, nižší než 1 μΜ, speciálně výhodná provedení mají Kj nižší než 100 nM, a nej výhodnější provedení tohoto vynálezu mají Kj nižší než 10 nM. Stanovení Kj sloučeniny z IC50 je založené na třech předpokladech. První předpoklad, pouze jedna molekula sloučeniny se váže na tento enzym a nedochází k žádné součinnosti. Druhý předpoklad, koncentrace aktivního enzymu a testované sloučeniny jsou známé (tj. v případě nejsou žádná významná množství nečistot nebo inaktivních forem). Třetí předpoklad, enzymatická aktivita komplexu enzym-inhibitor je nulová. Tyto hodnoty (např. koncentrace sloučeniny) jsou dosazeny do rovnice:

I-

Kde V je sledovaná rychlost, V_max je rychlost volného enzymu, I_o je koncentrace inhibitoru, E_o je koncentrace enzymu a K_d je disociační konstanta komplexu enzym-inhibitor.

Dalším měřítkem inhibice je Gí₅o, definovaný jako koncentrace sloučeniny, která vede ke snížení rychlosti buněčného růstu o 50 %. Výhodné sloučeniny mají GI₅o nižší než 1 mM. Úroveň preference provedení je funkcí jejich GI50: ty, které mají GI50 nižší než 20 μΜ, jsou výhodnější; ty, které mají GI₅o 10 μΜ, jsou ještě více preferovány; ty, které mají GI_J0 menší než 1 μΜ, jsou opět výhodnější; ty, které mají GI50 100 nM, jsou ještě více preferovány; ty, které mají GI_S0 nižší než 10 nM, jsou ještě více preferovány. Měření GI50 je prováděno s použitím testu na proliferaci buněk.

Kompozice tohoto vynálezu jsou používány pro léčbu onemocnění proliferace buněk. Stavy nemocí, které lze léčit metodami a kompozicemi zde zahrnutými mimo jiné zahrnují rakovinu (blíže popsáno dále v textu), autoimunitní onemocnění, artritidu, odmítnutí štěpu, zánětlivé onemocnění střev, proliferaci indukovanou lékařskými postupy jako například operacemi, angioplastikou a podobně. Oceňuje se, že v některých případech buňky nemusí být ani ve stavu hyperproliferace nebo hypoproliferace (abnormální stavy), a přesto potřebují léčbu. Například během léčby zranění mohou buňky proliferovat „normálně“, ale může být požadováno zesílení jejich (blíže popsáno dále v textu), autoimunitní onemocnění, artritidu, odmítnutí štěpu, zánětlivé oneproliferace nebo hypoproliferace (abnormální stavy), a přesto potřebují léčbu. Například během proliferace. Podobně, jak již bylo výše uvedeno, v oblasti zemědělství, buňky mohou být v „normálním“ stavu, ale může být požadována modulace proliferace pro zvýšení úrody přímým posílením růstu úrody nebo inhibici růstu rostliny nebo organismu, který úrodu nepříznivě ovlivňuje.

Proto jedno provedení tohoto vynálezu zahrnuje aplikaci do buněk nebo jednotlivců trpících či počínajících trpět kteroukoli z těchto n emocí či stavů.

- 15CZ 303007 B6

Kompozice a způsoby tohoto vynálezu jsou považovány za zvláště užitečné v léčbě rakoviny včetně pevných nádorů jakojsou kožní nádory, rakovina prsu, rakovina mozku, karcinomy děložního čípku, karcinomy varlat atd. Přesněji, rakoviny, které mohou být léčeny kompozicemi a metodami tohoto vynálezu kromě jiného zahrnují: srdeční: sarkom (angiosarkom, fibrosarkom, Rhabdomyosarkom, liposarkom), myxom, rhabdomyom, fibrom, lípom a teratom; plíce: bronchogenní karcinom (dlaždicové buňky, nediferenciované malé buňky, nediferenciované velké buňky, adenokarcinom), alveolámí (bronchiolámí) karcinom, bronchiální adenom, sarkom, lymfom, chondromatózní hemartom, mesotheliom; gastrointestinální soustava; jícen (karcinom dlaždicového epitelu, adenokarcinom, leiomyosarkom, lymfom), žaludek (karcinom, lymfom, leiomyosarkom), pankreas (duktální adenokarcinom, insulinom, glukagonom, gastrinom, karcinoidní nádory, v i porn), tenké střevo (adenokarcinom, lymfom, karcinoidní nádory, Karposiho sarkom, leiomyom, hemangiom, lípom, neurofibrom, fibrom), tlusté střevo (adenokarcinom, tubu lamí adenom, vilózní adenom, hemartom, leiomyom); močopohlavní trakt: ledviny (adenokarcinom, Wilmův nádor [nefroblastom], lymfom, leukémie), močový měchýř a močová trubice (karcinom dlaždicového epitelu, karcinom přechodných buněk, adenokarcinom), prostata (adenokarcinom, sarkom), varlata (seminom, teratom, embryonální karcinom, teratokarcinom, chloriokarcinom, sarkom, karcinom vmezerených buněk, fibrom, fibroadenom, adenomatózní nádory, li porn); játra: hepatom (karcinom jatemích buněk), cholangiokarcinom, hepatoblastom, angiosarkom, adenom jatemích buněk, hemangiom; kosti: osteogenní sarkom (osteosarkom), fibrosarkom, maligní fibrózní histiocytom, chondrosarkom, Ewingův sarkom, maligní lymfom (sarkom retikulámích buněk), násobný myelom, maligní tumor chordoma obrovských buněk, osteochondrom (osteokartilaginózní oxostóza), benigní chondrom, chondroblastom, chondromyxofibrom, osteoidní osteom a nádory obrovských buněk; nervový systém: lebka (osteom, hemangiom, granulom, xanthom, deformující záněty kostí), mozkové pleny (meningiom, meningiosarkom, gliomatóza), mozek (astrocytom, medulloblastom, gliom, ependyom, germinom [p i nalom], multiformní glioblastom, olígodendrogliom, schwannom, retinoblastom, kongenitální nádory), neurofibrom míchy, meningiom, gliom, sarkom); gynekologické: děloha (karcinom endometria), děložní čípek (karcinom děložního čípku, pre-tumorální cervikální dysplazie), vaječníky (karcinom vaječníků [serózní cystadenokarcinom, mucinoidní cystadenokarcinom, neklasifikované karcinomy], nádory buněk zrnité blány, nádory Sertoli-Leydigových buněk, dysgerminom, maligní teratom), vulva (karcinom dlaždicového epitelu, intraepitelový karcinom, adenokarcinom, fibrosarkom, melanom), pochva (karcinom jasných buněk, karcinom dlaždicového epitelu, botryoidní sarkom, embryonální rhabdomyosarkom), karcinom vejcovodů; hematologie: krev (myeloidní leukémie [akutní a chronická], akutní lymfoblastická leukémie, chronická lymfocytická leukémie myeloproliferativní nemoci, násobný myelom, myelodysplastický syndrom), Hodgkinsova nemoc, non-Hodgkinův lymfom [maligní lymfom]; kůže: maligní melanom, karcinom bazálních buněk, karcinom dlaždicového epitelu, Karposiho sarkom, mateřská znaménka, lipom, angiom, dermatofibrom, keloidy, iupénka; nad ledvinky: neurob Iastom. Takže zde používaný termín „rakovinná buňka“ zahrnuje buňky postižené kterýmkoli z výše uvedených stavů. Kompozice tohoto vynálezu jsou tedy aplikovány na buňky. „Aplikací“ se v tomto textu rozumí použití terapeuticky účinné dávky mitotického agens tohoto vynálezu na buňky v buněčné kultuře nebo u pacienta. „Terapeuticky účinnou dávkou“ se zde rozumí dávka, která vyvolává účinek, kvůli kterému je aplikována. Přesná dávka bude záviset na účelu léčby a pro pracovníky v oboru bude zjistitelná pomocí známých technik. Pracovníci v oboru vědí, že mohou být nutné úpravy pro systémovou nebo lokální distribuci, věk, tělesnou váhu, celkový zdravotní stav, pohlaví, dietu, čas aplikace, interakci léčiva a závažnost stavu pacienta a tyto úpravy je možno stanovit pomocí obvyklých experimentů, které jsou pracovníkům v oboru známy. „Buňkami“ se v tomto textu rozumí téměř jakákoli buňka, ve které může být upravena mitóza nebo meióza.

„Pacientem“ se pro účely tohoto vynálezu rozumí jak lidé, tak další živočichové, zvláště pak savci a další organismy. Tak jsou tyto způsoby použitelné jak pro humánní medicínu, tak pro veterinární použití. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je pacientem savec a v nej výhodnějším provedení tohoto vynálezu je pacientem člověk.

- 16CZ 303007 B6

Mitotické agens mající požadované farmakologické aktivity mohou být aplikovány ve fyziologicky akceptovatelném nosiči pacientovi, jak je popsáno v tomto textu. V závislosti na způsobu aplikace mohou být sloučeniny připraveny různými způsoby, jak bude dále popsáno. Koncentrace terapeuticky aktivní sloučeniny v léčebném přípravku se mohou lišit od 0,1 do 100 hmotnostních %. Agens mohou být aplikována samotná nebo v kombinaci s jinou léčbou, např. ozařováním nebo jinými chemoterapeutickými agens.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu jsou farmaceutické kompozice ve formě rozpustné ve vodě, jako jsou farmaceuticky akceptovatelné sole, které zahrnují sole vzniklé přidáním jak kyseliny, tak zásady. „Farmaceuticky akceptovatelné sole vzniklé přidáním kyseliny“ znamenají ty sole, které si zachovávají biologickou účinnost volných bází, a které nejsou biologicky aktivní či jinak nežádoucí, které jsou připraveny takovými anorganickými kyselinami jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina dusičná, kyselina fosforečná a podobně, a které jsou připraveny organickými kyselinami jako je kyselina octová, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina pyrohroznová, kyselina šťavelová, kyselina maleinová, kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina fumarová, kyselina vinná, kyselina citrónová, kyselina benzoová, kyselina skořicová, kyselina mandlová, kyselina methansulfonová, kyselina ethansulfonová, kyselinap-toluensulfonová, kyselina salicylová a tak podobně.

„Farmaceuticky akceptovatelné sole vzniklé přidáním zásady“ zahrnují sole odvozené od anorganických zásad jako jsou sole sodíku, draslíku, lithia, amonia, vápníku, hořčíku, železa, zinku, mědi, manganu, hliníku a podobně. Zvláště výhodnými jsou sole amonia, draslíku, sodíku, vápníku a hořčíku. Sole odvozené od farmaceuticky akceptovatelných netoxických organických zásad zahrnují sole primárních, sekundárních a terciárních aminů, substituované aminy zahrnující přirozeně se vyskytující substituované aminy, cyklické aminy a pryskyřice měnící záporné ionty, jako je isopropylamin, trimethy lamin, diethylamin, triethylamin, tripropylamin a ethanolamin.

Farmaceutické přípravky mohou být připraveny v různých formách, jako jsou granule, tablety, pilulky, čípky, kapsle, suspenze, masti, pleťové vody a podobně. Pro přípravu kompozic obsahujících terapeuticky aktivní sloučeniny mohou být použity farmaceutické organické Či anorganické nosiče a/nebo ředicí roztoky vhodné pro orální nebo povrchové použití. Ředicí roztoky známé pracovníkům v oboru zahrnují například vodná média, rostlinné a živočišné oleje a tuky. Stabilizační agens, zvlhčující a emulzifikační agens, sole pro změnu osmotického tlaku nebo pufry zajišťující odpovídající hodnotu pH a látky podporující prostupnost pokožkou mohou být použity jako pomocná agens. Farmaceutické kompozice mohou rovněž obsahovat jednu nebo více z následujících látek: nosičové proteiny jako je sérový albumin; pufry; plnidla jako je mikrokiystalinová celulóza, laktóza, kukuřičný škrob a jiné škroby; vazebná činidla; sladidla a další ochucovadla; barvicí agens a polyethylen glykol. Aditiva jsou pracovníkům v oboru dobře známá a mohou být použita v řadě formulací.

Aplikace mitotických agens tohoto vynálezu může být provedena mnoha různými způsoby, jak bude dále uvedeno, včetně, nikoli však pouze, orálně, podkožně, nitrožilně, intranazálně, transdermáíně, intraperitoneálně, intramuskulámě, intrapulmonámě, vaginálně, rektálně nebo nitroočně. V některých případech, například pri léčbě zranění nebo zánětů, mohou být antimitotická agens aplikována přímo jako roztok nebo sprej.

Pro využití sloučenin tohoto vynálezu v metodě testování sloučenin, které se váží na KSP kinesin, je KSP vázán na nosič a sloučenina tohoto vynálezu, (která je mitotickým agens), je k testu přidána. Alternativně je sloučenina tohoto vynálezu vázána k nosiči a přidán KSP. Třídy sloučenin, mezi kterými lze najít nová vazebná agens, zahrnují specifické protilátky, neprirodní vazebná agens identifikovaná pomocí chemických knih, peptidová analoga a tak podobně. Zvláště zajímavé jsou vyhledávací testy pro možná agens s nízkou toxicitou pro lidské buňky. Pro tyto účely může být použito široké spektrum testů včetně in vitro testů využívajících vazbu proteinů na značené proteiny, elektroforetické testy změny pohyblivosti látek, imunotesty pro vazbu proteinů, testy fiinkcí (fosforylační test aj.) a tak podobně.

- 17CZ 303007 B6

Stanovení vazby mitotického agens na KSP může být provedeno řadou způsobů. Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je mitotické agens (sloučenina tohoto vynálezu) označena například fluorescenční nebo radioaktivní složkou a vazba je stanovena přímo. To může být například provedeno navázáním veškerého KSP nebo jeho Části k pevnému nosiči, přidáním značeného mitotického agens (například sloučeniny tohoto vynálezu, ve které byl nejméně jeden atom nahrazen detekovatelným izotopem), odmytím přebytku činidel a stanovením množství značené látky na pevném nosiči. Mohou být použity různé odborníkům známé postupy blokování a odmývání příslušných látek.

Termínem „značený“ se v tomto textu míní, že daná sloučenina je buď přímo, nebo nepřímo označena značkou, která poskytuje detekovatelný signál, jako je například radioizotop, fluorescenční značka, enzym, protilátka, částice jako jsou magnetické částice, chemiluminiscenční značka nebo specifické vazebné molekuly atd. Specifické vazebné molekuly zahrnují páry jako jsou biotin a streptavidin, digoxin a antidigoxin atd. Pro specifické vazebné Členy bude komplementární člen normálně označen molekulou, která umožňuje detekci, pomocí známých postupů, jak bylo uvedeno výše. Značka může detekovatelný signál poskytnout přímo nebo nepřímo.

V některých provedeních tohoto vynálezu je značena pouze jedna složka. Například kinesinové proteiny mohou být značeny v poloze tyrosinu použitím ¹²⁵I nebo pomocí fluoroforů. Je rovněž možné označit více než jednu složku různými značkami použitím například ^l25I pro proteiny a fluorofory pro mitotická agens.

Sloučeniny tohoto vynálezu mohou být rovněž použity jako kompetitoři pro vyhledávání dalších kandidátů léčiv. „Kandidátské bioaktivní agens“ nebo „kandidát na léčivo“ nebo gramatický ekvivalent, jak je zde použito, popisuje jakoukoli molekulu, např. protein, oligopeptid, malou organickou molekulu, polysacharid, polynukleotid atd., který má být testován na bioaktivitu. Mohou mít schopnost přímo nebo nepřímo změnit fenotyp buněčné proliferace nebo exprese sekvence pro buněčnou proliferaci, a to jak sekvence nukleové kyseliny, tak sekvence proteinů.

V jiných případech je testována změna vazby a aktivity proteinů buněčné proliferace. Testy tohoto druhu mohou být prováděny buď v přítomnosti, nebo nepřítomnosti mikrotubulů. V případech, kdy je testována vazba nebo aktivita proteinu, nezahrnují výhodná provedení tohoto vynálezu molekuly, u kterých je již známo, že se vážou k těmto konkrétním proteinům, jako například na polymerní struktury jako jsou mikrotubuly a zdroje energie jako je ATP. Výhodná provedení testů zde zahrnují kandidátské agens, která se nevážou na proteiny buněčné proliferace ve svém endogenním nativním stavu zde označované jako „exogenní“ agens. V jiném provedení tohoto vynálezu exogenní agens nezahrnují protilátky na KSP.

Kandidátské agens mohou zahrnovat mnoho chemických tříd, typicky jsou to organické molekuly, výhodně malé organické sloučeniny mající molekulovou hmotnost větší než 100 a menší než okolo 250 daltonů. Kandidátské agens obsahují funkční skupiny nutné pro strukturální interakci s proteiny, zvláště pak pro vodíkové a lipofilní vazby a obvykle obsahují amin, karbonyl, hydroxyl, ether nebo karboxyskupinu, výhodně nejméně dvě funkční skupiny. Kandidátské agens často zahrnují cyklické nebo heterocyklické struktury a/nebo aromatické nebo póly aromatické struktury substituované jednou nebo více výše uvedenými funkčními skupinami. Kandidátské agens jsou často také nalezeny mezi biomolekulami zahrnujícími peptidy, sacharidy, mastné kyseliny, steroidy, puriny, pyrimidiny, deriváty, strukturálními analogy a jejich kombinacemi. Zvláště výhodné jsou peptidy.

Kandidátské agens jsou získávány z bohatých zdrojů zahrnujících knihovny syntetických a přírodních sloučenin. Například některé z nich jsou získávány náhodnou nebo přímou syntézou širokého spektra organických sloučenin a biomolekul, včetně exprese náhodných oligonukleotidů. Alternativně jsou dostupné nebo připravované knihovny přírodních sloučenin ve formě bakteriálních, fungálních, rostlinných a zvířecích extraktů. Dále jsou pak přirozeně nebo synteticky produkované knihovny a sloučeniny jsou modifikovány obvyklými chemickými, fyzikálními a

- 18 CZ 303007 B6 biochemickými způsoby. Známé farmakologické agens mohou být převedeny na strukturní analogy náhodnými chemickými modifikacemi jako jsou acylace, alkylace, esteriflkace a amidifíkace.

Na prvním vzorku mohou být provedeny kompetitivní testy kombinací KSP s kandidátem léčiva. Na druhém vzorku mohou být provedeny testy obsahující mitotické agens, KSP a kandidáta na léčivo. Toto může být provedeno v přítomnosti nebo nepřítomnosti mikrotubulů. Pro oba vzorky je určeno navázání kandidáta léčiva a změny nebo odlišnosti v navázání mezi oběma vzorky určuje přítomnost činidla, které je vhodné pro vazbu s KSP a potenciálně moduluje jeho aktivitu, io To znamená, že je-li navázání kandidáta na léčivo v druhém vzorku odlišné oproti prvnímu vzorku, je kandidát na léčivo vhodný pro vazbu s KSP.

Ve výhodném provedení tohoto vynálezu je navázání kandidáta léčiva určováno pomocí kompetitivních testů. V tomto provedení jsou kompetitorem látky, které jsou schopné vázat se na KSP, i5 jako jsou protilátky, peptidy, vazebný partner, ligandy, atd. Za jistých okolností může být kompetitivní navázání mezi kandidátem léčiva a vazebnou látkou takové, že vazebná látka nahrazuje kandidáta léčiva.

V jednom provedení vynálezu je kandidát na léčivo značený. Buď kandidát léčiva, nebo kompe20 titor nebo oba jsou přidány ke KSP na dobu dostačující pro vytvoření vazby, jestliže k ní dochází.

Inkubace může být provedená pri jakékoliv teplotě, která zaručuje optimální aktivitu, obvykle mezi 4 a 40 °C.

Inkubační periody jsou vybrány pro optimální aktivitu, ale mohou být také optimalizovány pro rychlé testování. Obvykle dostačuje doba mezi 0,1 a 1 hodinou. Přebytek Činidla je obvykle odstraněn nebo vymyt. Poté je přidána druhá komponenta a následuje indikace navázání pomocí přítomnosti nebo absence značené komponenty.

Ve výhodném provedení je kompetitor přidáván jako první a následně poté je přidán kandidát na léčivo. Nahrazení kompetitoru je indikací, že kandidát léčiva se navázal na KSP a je tedy vhodný pro tuto vazbu a potenciálně moduluje aktivitu KSP. V tomto provedení může být značen také komponent. A tedy např. je-li kompetitor značený, přítomnost značky v promývacím roztoku indikuje nahrazení léčivem. Alternativně, jestliže je značený kandidát léčiva, nahrazení indikuje značka na nosiči.

V alternativním provedení je kandidát léčiva přidáván jako první, inkubován a promyt a následně je přidán kompetitor. Absence navázání kompetitoru může indikovat, že kandidát na léčivo se váže na KSP s větší afinitou. A tedy, je-li kandidát léčiva značený, přítomnost značky na nosiči, která souvisí s nedostatkem navázaného kompetitoru, může indikovat, že kandidát na léčivo je vhodný pro vazbu s KSP.

Hodnotné může být také určení místa navázání na KSP. To může být provedeno mnoha způsoby.

V jednom provedení, je-li identifikováno, že KSP je vázán s mitotickým agens, je KSP fřagmentován nebo modifikován a test je proveden znovu a jsou určeny součásti, které jsou nutné pro navázání.

Modulace je určována testováním kandidátů léčiv, které jsou schopné modulovat aktivitu KSP, zahrnující kombinaci kandidátů léčiv s KSP, jak je uvedeno výše, a určením změny biologické aktivity KSP. V tomto provedení by se tedy kandidát léčiva měl vázat na KSP (ačkoliv to nemusí být nutné) a také změnit jeho biologickou nebo biochemickou aktivitu jak je zde definováno. Způsoby zahrnují testování in vivo a in vitro. Tímto způsobem se testují změny buněk v cyklu buněčného dělení, životaschopnost buněk nebo přítomnost morfologie, aktivita, rozdělení nebo množství mitotických vřetének, jak je naznačeno výše.

- 19CZ 303007 B6

Alternativně, odlišné testování může být použito pro identifikaci kandidátů léčiv, které se váží na původní KSP, ale nemohou se vázat na modifikovaný KSP.

V testech mohou být použity pozitivní a negativní kontroly. Výhodně jsou všechny kontroly a testy vzorků prováděny nejméně třikrát, aby se získaly statisticky významné výsledky. Všechny vzorky jsou inkubovány po dobu, která je dostačující pro navázání agens na protein. Po inkubaci jsou všechny vzorky omyty specificky neváže bným materiálem a je určeno množství vazeb, což je obecně prováděno značenými činidly. Například je-li použito radioaktivní značení, množství navázaných sloučenin ve vzorcích může být určeno pomocí scintilátoru.

Při testování mohou být použity další Činidla, které zahrnují sole, neutrální proteiny např. albumin, detergenty atd., které mohou být použity pro usnadnění optimálního navázání protein-protein a/nebo redukovat nespecifické nebo specifické nebo vedlejší interakce. Mohou být také použita činidla, která jakkoli zvyšují efektivitu testů. Těmito činidly jsou inhibitory proteáz, inhibitory nukleáz, antimikrobiální agens atd. Z důvodů zajištění navázání může být přidána také směs komponent.

Následující příklady slouží pro úplnější popis způsobů použitých ve výše popsaném vynálezu, stejně tak jako stanovení nej lepších způsobů provedení různých aspektů tohoto vynálezu. Tyto příklady v žádném případě nelimitují rámec tohoto vynálezu, ale jsou zde uvedeny pro ilustraci. Všechny citované odkazy jsou zahrnuty jako odkazy v celém svém rozsahu.

Příklady provedení vynálezu

Zkratky a definice

Zkratky a termíny mají následující význam:

Ac = acetyl

BNB = 4-brommethyI“3-nitrobenzoová kyselina

Boc = ř-butyloxy karbonyl

Bu = butyl c— ~ cyklo

CBZ = karbobenzoxy = benzy loxy karbonyl

DBU = diazabicyklo [5.4.0]undec-7-en

DCM — dichlormethan = methy lench lorid = CH2CI2

DCE = dichlorethylen

DEAD = diethyl azodi karboxy lát

DIC - diisopropylkarbodiimid

DIEA - V.V-diisopropylethylamin

DMAP = 4-2V,/V-dimethylaminopyridin

DMF = N, N-d i methyl formamid

DMSO = dimethylsulfoxid

DVB = 2,4-divinylbenzen

EEDQ = 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l ,2-dihydrochinolin

Et = ethyl

Fmoc = 9-fluorenyl methoxy karbonyl

GC = plynová chromatografie

HATU = O-(7-azabenzotriazol-l-y 1)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfát

HMDS = hexamethyldisilazan

HOAc = octová kyselina

HOBt = hydroxybenzotriazol

Me methyl

Mesyl = methansulfonyl

MTBE = methyl Z-butylether

-20CZ 303007 B6

NMO	-	V-methylmorfolin oxid
PEG	—	polyethylyneglykol
Ph	—	fenyl
PhOH	=	fenol
PfP		pentafluorfenol
PPTS	=	pyridinium p-toluensulfonát
Py	-	pyridin
PyBroP		brom-tris-pyrrolidino-fosfonium hexafluorofosfát
rt	=	pokojová teplota
sat=d	-	nasycený
s—	=	sekundární
/-	=	terciární
TBDMS	-	Z-buty Idi methy lsilyl
TES	=	triethylamin
TFA	=	trifluoroctová kyselina
THF	=	tetrahydrofuran
TMOF	—	tri methy 1 orthoform i át
TMS	=	trimethy lsilyl
Tosyl	=	p-toluensulfonyl
Trt	=	tri fenyl methyl

Příklad 1

Syntéza sloučenin

Obecná syntéza je naznačena na obrázcích 1 a 2.

Krok 1: V-butyryl anthranilová kyselina.

Do tříhrdlé 500ml baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, přikapávací nálevkou a výkonným magnetickým míchadlem se přidá anthranilová kyselina (1) (0,5 mol, 68,5 g) a dimethylformamid (250 ml). Do tohoto roztoku se přidá po kapkách butyrylchlorid (0,55 mol, 57,1 ml) takovou rychlostí, aby teplota směsi nepřekročila 40 °C. Suspenze se silně míchá při pokojové teplotě po dobu nejméně dalších 3 hodin. Směs se přilije do vody (2000 ml) a míchá se další 1 hodinu. Precipitovaný produkt se shromáždí filtrací, promyje studenou vodou a suší za sníženého tlaku nad P₂O₅, čímž se získá sloučenina 2 (67,3 g, 65 %).

Krok 2: 2-propyI—3,l-[4H]benzoxazin—4—on.

Sloučenina 2 (51,8 g, 0,25 mol) se rozpustí v acetanhydridu (180 ml) v 500ml baňce s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem, Claisenovým destilačním nástavcem (s přívodem vakua) a teploměrem. Baňka se umístí do olejové lázně a pomalu se zahřívá na teplotu 170 až 180 °C za stálého míchání. Octová kyselina, která se tvoří, se pomalu oddestilovává za atmosférického tlaku. Monitorování teploty deštilačního nástavce bylo použito pro následující vývoj transformace. Reakční směs se poté zchladí na teplotu 60 °C a přebytek acetanhydridu se odstraní destilací za sníženého tlaku (cca, 20 mm Hg). Zbytek se posléze zchladí a produkt se nechá vykrystalizovat. Produkt se rozmělní s n-hexanem (75 ml) a izoluje se filtrací, čímž se získá 2propyl-3,l-[4H]benzoxazin-4-on (3) (29,3 g, 62 %). Výše uvedeným postupem se získá sloučenina 3 dostatečně čistá pro přímé použití do příštího kroku.

Krok 3: 2-propyl-3-benzylchinazolin-4-on.

Sloučenina 3 (28,4 g, 0,15 mol) a benzylatnin (17,5 ml, 0,16 mol) se refluxují v chloroformu (50 ml) vjednohrdlé 250ml baňce s kulatým dnem po dobu 6 hodin. Poté co je sloučenina 3

-21 CZ 303007 B6 kompletně spotřebována se chloroformem odpaří za sníženého tlaku. Do zbytku v baňce, která je vybavena Claisenovým destilačním nástavcem a magnetickým míchadlem, se přidá ethylenglykol (100 ml) a NaOH tabletky (0,60 g). Baňka se ponoří do olejové lázně a znovu zahřeje na teplotu lázně 130 až 140 °C za stálého míchání a udržuje se na této teplotě po dobu 5 hodin, tvořící se voda se odstraňuje destilací. Po kompletní reakci se čistý roztok ponechá zchladit na pokojovou teplotu a nechá se stát přes noc, čímž se utvoří precipitát produktu. Hodnota pH suspenze se upraví na 7 až 8 přidáním 3% vodné HCI, krystaly se zfiltrují a promyjí studenou vodou, a poté rekiystalizují z isopropanolu (nebo případně z acetonu), čímž se získá sloučenina, 2 propyl-3benzylchinazolin^4-on (sloučenina 4) (28,0 g, 67 %).

Krok 4: 2-(l '-brompropyI)-3-benzylchinazolin-4-on.

Do tříhrdlé 250ml baňky s kulatým dnem vybavené teploměrem, přtkapávací nálevkou a výkonným magnetickým míchadlem se přidá sloučenina 4 (27,8 g, 0,10 mol), bezvodý acetát sodný (10,0 g) a ledová kyselina octová (130 ml). Do roztoku se při teplotě 40 °C po dobu 1 až 2 hodiny přidává po kapkách brom (16,0 g, 0,10 mol) rozpuštěný v kyselině octové (10 ml). Poté se směs přelije do vody (1500 ml) a míchá se po dobu 1 až 2 hodiny při pokojové teplotě. Precipitovaný produkt, 2-(l -brompropyl)-3-benzylchinazolin-4-on (5) se izoluje filtrací, promyje se horkou vodou, aby se odstranily zbytky kyseliny octové a opláchne se malým množstvím isopropanolu. Sušením se získá sloučenina 5 (33,0 g, 92 %),

Krok 5: 2-[l '-(;V,;V-dimethylethylendiamino)propyl]-3-benzylchinazolin-4-on.

Sloučenina 5 (10,7 g, 0,03 mol) a V,V-dimethylethylendiamin (6,6 ml, 0,06 mol) se rozpustí v abs. ethanolu (60 ml) a zahřívá se pod refluxem po dobu 6 hodin. Po dokončení reakce se rozpouštědlo odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí v dichlormethanu (150 ml) a promyje se 3% vodným roztokem NaOH (cca. 10 až 20 ml). Organická vrstva se suší nad MgSO₄ a odpaří se do sucha za sníženého tlaku. Zbývající olejovitý produkt se přečistí tlakovou ehromatografií na krátkém sloupci silikagelu mobilní fází CHCl₃-MeOH-vodný NH₃, 90:10:0,1, čímž se získá požadovaná sloučenina (5), 2-[ 1'-(;V,/V—dimethylethylendiamino)propyl]-3-benzylchinazolin— 4-on (6) (6,0 g, 55%).

Krok 6: 2-[l '-(AM-fluorbenzoylj-CYW-dimethylethylenediaminojpropyl^-benzyl-chinazoΙίη-4-οη.

Zásobní roztok sloučeniny 5 (1,822 g, 5,0 mmol) se připraví v HPLC kvalitě v CHC1₃ (0,5 ml). Zásobní roztok p-fluorbenzoylchloridu (160,2 mg, 1 mmol) v HPLC kvalitě v 1,2-dichlorethanu (2,0 ml) se připraví v 2,0ml odměmé baňce. Třetí roztok triethylaminu (2,0 ml, 0,5 M) se připraví v HPLC kvalitě v 1,2-dichIorethanu. 100 μί alikvotní části každého roztoku se napipetuje do skleněné reakční nádoby pomocí automatu Beckman Biomet 2000. Reakční směs se míchá pomocí automatického míchadla, sonikuje v ultrazvukové vodní lázni a poté inkubuje přes noc při pokojové teplotě. Směs se zředí CHC1₃ (300 μί) a promyje se 5% vodným roztokem NaHCO₃ a vodou. Rozpouštědlo se odstraní ve vakuu, čímž se získá požadovaná sloučenina 6 (65%). Čistota sloučeniny se analyzuje pomocí TLC v mobilní fázi CH₂Cl₂-ethanol-koncentrovaný vodný NH₃, 100:10:1.

Všechna bezvodá rozpouštědla byla zakoupena u od Aldrich Chemical Company ve SureSeaí®. Příklady 2 až 4

Šest racemických chinazolinonů se separuje na jednotlivé enantiomery chirální ehromatografií. Chirální chromatografie tří těchto sloučenin je popsána níže:

-22CZ 303007 B6

Příklad 2

Kolona-Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel lne.). Vzorek - 0,5 mg/ml v EtOH.

Podmínky - 15 minut v 60% EtOH v hexanu, enantiomer 1 eluuje po 4,5 minutách, enantiomer 2 eluuje po 4,9 minutách.

Příklad 3

Kolona -Chiralcel OJ, 250 x 4,6 mm (Diacel lne.). Vzorek - 0,5 mg/ml v EtOH.

Podmínky - 15 minut v 10% EtOH v hexanu, (Rý-enantiomer eluuje po 8,4 minutách, (S)-enantiomer eluuje po 9,6 min.

Příklad 4

Kolona-Chiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel lne.). Vzorek - 0,5 mg/ml v EtOH.

Podmínky - 15 minut v 70% EtOH v hexanu, enantiomer 1 eluuje po 6,5 minutách, enantiomer 2 eluuje po 8,8 minutách.

Níže uvedená tabulka znázorňuje IC₅₀ aktivitu racemátů a enantiomerů třech různých sloučenin oddělených způsobem uvedeným výše. Ve všech třech případech byl jeden enantiomer podstatně účinnější než ostatní. Podle nezávislé chirální syntézy se jako aktivnější enantiomer jeví R enantiomer.

-23 CZ 303007 B6

IC» (μΜ)

IC»(gM)

ΙΟ»(μΜ)

Racemát

Enantiomer 1

Enantiomer 2

0,06

0,28

0,03

12-7 »40 »40

6,6

-24CZ 303007 B6

Příklady 5 a 6

Následující dvě sloučeniny byly syntetizovány jako jednotlivé enantiomery způsobem, který je naznačen na obrázku 22. Hodnoty naznačují, že účinnějším enantiomerem je R enantiomer.

	Κι (μΜ)	Κι (μΜ)
	5 enantiomer	R enantiomer
οόγ NH,	2	<0,1
	o Λ	<0,05

Příklad 7

Chirální rozlišení pomocí krystalizace s kyselinou vinnou

Intermediát A, připravený v příkladu 1, může být převeden na intermediát B, který je po rozlišení alternativou prvních pěti kroků naznačených na obrázku 4. Postup je znázorněn na následujícím schématu:

B

A

-25CZ 303007 B6

R enantiomer sloučeniny B může být selektivně vykrystalizován zahříváním směsi B a 1,1 ekvivalentu £>-vinné kyseliny ve směsi isopropanolu a methanolu, a poté opětným ochlazením na pokojovou teplotu.

Příklad 7

X = CI, R = H io Racemický intermediát B (1,5 g), rozpuštěný ve 100 ml vroucího isopropanolu se smíchá s 0,8 g D-vinné kyseliny ve 100 ml vroucího methanolu. Směs se ponechá pomalu ochladit na pokojovou teplotu. Po stání přes noc se pevná látka odstraní filtrací a propláchne se ethylacetátem a hexany, poté se nechá vyschnout na vzduchu. Suchá pevná látka (0,8 g) se poté rozpustí ve vroucí směsi 50 ml isopropanolu a 50 ml methanolu a nechá se pomalu chladnout na pokojovou teplotu. Po stání přes noc se utvoří pevná látka, která se zfíltruje a propláchne ethylacetátem a hexany, a poté se nechá vyschnout na vzduchu. Suchá pevná látka se poté míchá s nasyceným hydrogenuhličitanem sodným po dobu 30 minut a extrahuje se ethylacetátem. Organické vrstvy se suší (MgSO4), filtrují a odpaří do sucha. Získá se čistý olej, 345 mg. Chirální čistota > 95 % byla určena převedením části produktu na S-Mosher amid a změřením ^!HNMR produktu. Násle20 dující enantiomericky čistá sloučenina se připraví podle zbývajících kroků obrázku 4, z látky, která se získá postupem popsaným výše použitím jak D-, tak L-vinné kyseliny.

	Racemát I IC50 (μΜ)	R Isomer IC50 (μΜ)	S Isomer IC50 (μΜ)
„o xóv Φ ch3	<0,05	<0,05	>0,5

Příklad 8

Zastavení mitózy buněčných populací působením chinazolinonového inhibitoru KSP

FACS analýza pro stanovení stadia buněčného cyklu pomocí měření obsahu DNA byla provedena následujícím způsobem. Buňky Skov-3 (buňky rakoviny vaječníků) byly rozděleny v poměru 1:10 pro výsev na 1 Ocm misky a pěstovány do částečných shluků v médiu RPMI obsahuj ícím 5 % fetálního hovězího séra (FBS). Poté byly buňky na 24 hodin zality buď lOnM paclitaxefem, 400 nM chinazolinonu 1, 200 nM chinazolinonu 2 nebo 0,25 % DMS (nosič pro slouce35 niny). Buňky byly poté opláchnuty z misek pomocí PBS obsahujícího 1 % FCS a fixovány přes noc 85% ethanolem pri teplotě 4 °C, Před analýzou byly buňky peletovány, jednou omyty a obarveny v roztoku 10 gg propidium jodidu a 250 gg ribonukleázy A (RNáza) na mililitr při teplotě 37 °C po dobu půl hodiny. Analýza pomocí průtokové cytometrie byla provedena na Becton-Dickinson FACScan a údaje o vzorcích, z nichž každý obsahoval 10 000 buněk, byly analyzovány pomocí programu Modfit.

-26CZ 303007 Β6

Chinazolinonové sloučeniny stejně jako známé antimitotické činidlo paclitaxel způsobily posun populace buněk ze stadia G0/G1 buněčného cyklu (obsah DNA 2n) do stadia G2/M buněčného cyklu (obsah DNA 4n). Bylo zjištěno, že ostatní sloučeniny této třídy mají podobné účinky. Tvorba monopolámího vřeténka následující po aplikaci chinazolinonového inhibitoru KSP.

K určení povahy akumulace G2/M byly nádorové buňky linie Skov-3 (buňky vaječníku), HeLa (buňky děložního čípku) a A549 (plicní buňky) vysety na misky v hustotě 4 000/misku (SKOV-3 & HeLa) nebo v hustotě 8 000/misku (A549), ponechány 24 hodin adherovat, a pak ponechány k působení roztoků o různých koncentrací chinazolinonových sloučenin po dobu 24 hodin. Buňky byly fixovány 4% formaldehydem a obarveny anti-tubulinovými protilátkami (následně rozpoznávané pomocí fluorescenčně značených sekundárních protilátek) a Hechstovým barvivém (barvícím DNA).

Vizuální kontrola ukázala, že chinazolinonové sloučeniny způsobily zastavení buněčného cyklu ve stadiu prometafázy mitózy. DNA byla kondenzována a tvorba vřeténka byla zahájena, ale takto zastavené buňky jednotně vykazovaly monopolámí vřeténka, což naznačovalo, že došlo k inhibici oddělení pólových částí vřeténka. Mikroinjekce protilátek anti-KSP rovněž způsobuje zastavení mitózy, přičemž zastavené buňky vykazují monopolámí vřeténka.

Inhibíce buněčné proliferace v nádorové buněčné linie ošetřené chinazolinonovými inhibitory KSP.

Buňky byly vysety do 96ti-jamkových destiček v hustotě 1000 až 2500 buněk/jamku (podle buněčné linie) ponechány 24 hodin adherovat a růst. Buňky byly ponechány k působení nižných koncentrací léčiva po dobu 48 hodin. Čas, ve kterém byly přidány sloučeniny, je označován jako T_o. Ke stanovení počtu živých buněk v čase T_o a počtu buněk zbylých po 48 hodinách působení sloučeniny byl použit test založený na tetrazolinu využívající látku 3-(4,5-di methy lth iazo 1-2yl)-5-(3-karboxymethoxyfenyI)_2-(4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium (MTS) (I.S>Patent č. 5 185 450) (viz Katalog výrobků Promega Č.G3580, CellTiter96*AQueous One Solution Cell Proliferation Assay). Počet buněk zbylých po 48 hodinách byl porovnán s počtem živých buněk v době aplikace léčiva a použit pro výpočet inhibíce růstu buněk.

Růst buněk po 48 hodinách v kontrolních jamkách, do kterých byl aplikován pouze nosič (0,25 % DMSO), byl považován za 100% růst a růst buněk v ostatních jamkách byl s tímto porovnáván. Chinazolinonové inhibitory KSP inhibovaly proliferaci buněk v nádorových buněčných liniích následujících typů nádorů: plíce (NCI-H460, A549), prsa (MDA-MB-231, MCF-7, MCF7/ADR-RES), tlusté střevo (HT29, HCT 15), vaječníky (SKOV-3, OVCAR-3), leukémie (HL60(TB), K-562), centrální nervový systém (SF-268), ledviny (A498), osteosarkom (U2-OS) a cervikální (HeLa). Navíc myší nádorové buňky (B16, melanom) byly rovněž inhibovány ve svém růstu v přítomnosti chinazolinonových sloučenin.

Hodnota Gi₅o byla vypočtena pomocí vynesení koncentrace sloučeniny v μΜ proti procentům buněčného růstu buněk v jamkách obsahujících sloučeniny. Gi₅o vypočtené pro sloučeniny je odhadovaná koncentrace, při které je růst buněk inhibován o 50 % v porovnání s kontrolními vzorky, tj. koncentrace, při které

100 x [(se sIoučeninou48-To)/(kontrola4₈-To)] = 50

Všechny koncentrace sloučenin jsou testovány ve dvou vzorcích a kontroly jsou průměrovány z 12 jamek. Velice podobné rozvržení 96ti-jamkových destiček a výpočetní schéma pro Gi₅₀ je používáno National Cancer Institute (viz Monks, et al., J. Nati. Cancer Inst. 83:757 až 766 (1991)). Nicméně tato metoda používaná National Cancer Institutes pro kvantifikaci buněk nepoužívá MTS, ale místo toho využívá jiné alternativní způsoby.

-27CZ 303007 B6

Výpočet IC₅o:

Měření IC;o kompozicí pro KSP aktivity využívá ATPázový test. Jsou používány následující roztoky: roztok 1 obsahuje 3 mM draselnou sůl fosfoenolpyruvátu (Sigma P—7127), 2 mM ATP (Sigma A-3377), 1 mM IDTT (Sigma D-9779), 5 μΜ paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm antifoam 289 (Sigma A-8436), 25 mM trubičky/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgCb (VWR JT400301) a 1 mM EGTA (Sigma E3889). Roztok 2 obsahuje 1 mM NADH (Sigma N8129), 0,2 mg/ml BSA (Sigma A7906), pyruvát kinázu 7U/ml, L-laktátdehydrogenázu 10 U/ml (Sigma PO294), 100 nM KSP motorovou doménu, 50 gg/ml mikrotubulů, 1 mM DTT (Sigma D9779), 5 μΜ paclitaxel (Sigma T-7402), 10 ppm antifoam 289 (Sigma A-8436), 25 mM trubičky/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), 2 mM MgCI₂ (VWR JT4003-01) a 1 mM EGTA (Sigma E3889). V 96tijamkových mikrotitračních destičkách (Corning Costar 3695) bylo provedeno postupné ředění (8 až 12ti násobné ředění) roztokem 1. Po tomto ředění obsahovala každá jamka 50 μΐ roztoku 1. Reakce byla nastartována přidáním 50 μΐ roztoku 2 do každé jamky. To může být provedeno buď násobnou pipetou ručně, nebo automatickým zařízením na pipetování tekutin. Mikrotitrační destička je pak přenesena na analyzátor absorbanci na mikrodeskách a pro každou jamku je v kinetickém módu odečteno několik hodnot při absorbanci 340 nm. Pozorovaná míra změny, která je úměrná poměru ATPázy, je pak vynesena jako funkce koncentrace sloučeniny. Pro stanovení IC₅o standardu jsou údaje získány pomocí následující rovnice o čtyř parametrech při použití programu nelineárních čísel (např. Grafit 4):

rozsah

+ pozadí kde y je pozorovaná míra změny a x koncentrace sloučeniny.

Chinazolinonové sloučeniny inhibují růst buněk různých buněčných linií včetně linií (MCF7/ADR-RES, HCT1 5), které exprimují P-glykoprotein (rovněž známý jako Multidrug Resistence nebo MDR⁺), který je nositelem rezistence na další chemoterapeutická léčiva, jako je paclitaxel. Chinazolinony jsou tudíž antimitotika, která inhibují buněčnou proliferaci a nepodléhají rezistenci v důsledku nadměrné exprese MDR⁺ buňkami nádorových linií rezistentních na léčiva.

Bylo zjištěno, že další sloučeniny této třídy inhibují proliferaci buněk, ačkoli se jejich hodnoty GI50 liší. Hodnoty GI50 testovaných chinazolinonových sloučenin se pohybovaly od 200 nM k hodnotám vyšším než nejvyšší testovaná koncentrace. Tímto máme na mysli, že ačkoli většina sloučenin, které inhibují KSP aktivitu biochemicky, skutečně inhibovala proliferaci buněk, u některých byl buněčný růst při nejvyšší testované koncentraci inhibován méně než 50 %. Mnohé tyto sloučeniny mají hodnoty GI50 menší než 10 μΜ a některé mají hodnoty GI50 nižší než 1 μΜ. Anti-proliferativní sloučeniny, které byly úspěšně použity při klinické léčbě rakoviny (rakovinná chemoterapeutika) mají velmi různé hodnoty GI₅₀. Například u buněk A549 je GI₅₀ paclitaxelu 4 nM, doxorubicinu 63 nM, 5-fluoruracilu 1 μΜ a hydroxy močoviny 500 μΜ (údaje poskytnuté National Cancer Institute, Developmental Therapeutic Program, http://dtp.nci.nih.gov/). U sloučenin, které inhibují proliferaci buněk, může být tedy použita jakákoli koncentrace. Nicméně je preferováno, aby sloučeniny měly hodnoty GI₅₀ nižší než 1 mM. Více preferováno je, aby sloučeniny měly hodnoty GI₅₀ nižší než 20 μΜ. Ještě více je preferováno, aby sloučeniny měly hodnoty GI50 nižší než 10 μΜ. Další snížení hodnot GI₅o může být také vhodné, včetně sloučenin s hodnotami GI₅₀ nižšími než 1 μΜ. Některé chinazolinonové sloučeniny tohoto vynálezu inhibují proliferaci buněk při hodnotách GI₅o pod 200 nM do hodnot pod 10 nM.

-28CZ 303007 B6

Příklad 9

Samicím holých myší vážících přibližně 20 g byla provedena s.c. implantace pomocí trokaru s fragmenty lidských nádorových karcinomů získaných z s.c. vypěstovaných nádorů hostitelských holých myší. Když nádory vážily přibližně 77 mg, byla zvířata rozpárována do ošetřovaných a kontrolních skupin. Každá skupina čítala 8 myší s nádory, kde každá myš byla označena (ucho) a dále byla individuálně podrobena excipientu. Iniciální dávky (přípravek obsahoval 10 mg/kg 66 mM citrátového pufru („Citráte buffer“), pH 5,0/0,9% fyziologického roztoku/10% Tween 80, kde maximální koncentrace každé z testovaných sloučenin činila 5 mg/ml) byly podávány 1. den po rozpárování, dávkování v uvedených hladinách a režimech.

Myši byly váženy dvakrát týdně a měření nádoru byla prováděna pomocí kaliperů dvakrát týdně počínaje 1. dnem. Výsledky těchto měření nádorů byly konvertovány na mg standardním postupem, W² x L/2. Když velikost nádoru v kontrolní skupině dosáhla průměru 1 g, byl experiment ukončen. Po ukončení byly myši zváženy, usmrceny a jejich nádory excidovány. Nádory byly váženy a byla vypočtena průměrná hmotnost léčeného nádoru na skupinu. V tomto modelu znamenal inhibici růstu nádoru (TGI) pro každou skupinu poměr změny průměru hmotnosti ošetřovaného nádoru ku změně průměru hmotnosti kontrolního nádoru násobený 100 (ΔΤ/AC) a odečtený od 100 %.

Sloučeniny 1 až 3 (níže) byly testovány výše uvedeným způsobem, čímž byly získány výsledky uvedené a sumarizované níže v tabulkách A - B. Další sloučeniny podle předloženého vynálezu, pokud byly testovány tímto způsobem, vykazovaly srovnatelné aktivity.

Sloučenina 1

Sloučenina 2

Sloučenina 3

-29CZ 303007 B6

Tabulka A SK.OV3 nádorový xenoimplantát
	nosič	slouč. 1	slouč. 2	Taxol
dávky a režim	denně x 5	50 mg/kg každé 3 dny x 4	60 mg/kg denně x 5	20 mg/kg denně x 5
způsob	i.v.	i.v.	i.v.	i.p.
# myší na počátku	8	8	8	8
konečná váha nádoru (průměr±SEM)	1506,3±227, 1	340,8±93,0	806,l±163,8	55,9±29,4
inhibice růstu nádoru		81,5%	48,3%	99,7%
myši s částečnou kontrakcí nádoru	0	0	0	7
průměrná % kontrakce nádoru				43,5%
maximální úbytek hmotnosti	žádný	žádný	2,76%	7,49%
mortalita	0	0	1	0

-30CZ 303007 B6

Tabulka B SKOV3 nádorový xenoimplantát
	nosič	sloučenina 3	Taxol
dávky a režim	denně x 5	25 mg/kg denně x 5	20 mg/kg denně x 5
způsob	i.v.	i.v.	i.p.
# myší na počátku	8	8	8
konečná váha nádoru (průměr±SEM)	1230,4±227,3	405,6±124,8	379,0±154,0
inhibice růstu nádoru	—	71,0%	73,0%
myši s částečnou kontrakcí nádoru	0	1	0
průměrná % kontrakce nádoru	—	56,3%	—
maximální úbytek hmotnosti	žádný	žádný	8,77%
mortalita	0	0	0

Když byl předložený vynález popsán společně s odkazy na jeho specifická provedení, mohou být 5 provedeny různé změny a příslušné ekvivalenty mohou být nahrazeny bez vzdálení se od charakteru a rozsahu vynálezu. Dále mohou být provedeny modifikace k přizpůsobení se konkrétní situaci, látce, matrici kompozice, způsobu, krok nebo krokům ve způsobu záměru, charakteru a rozsahu předloženého vynálezu. Všechny tyto modifikace spadají do rozsahu patentových nároků, které jsou zde přiloženy. Veškeré patenty a publikace citované výše jsou zde uvedeny io jako odkaz.

Claims (10)

15 PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chinazolinonový derivát obecného vzorce nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl,

-31 CZ 303007 B6 kde izopropylová skupina je připojena v R-konfiguraci; R| je benzyl, chlorbenzyl, methylbenzyl, meth oxy benzyl, kyanobenzyl nebo hydroxy benzylová skupina; R? je halogen nebo kyano skupina; a R-t je methylem a/nebo halogenem substituovaná fenylová skupina.

2. Chinazolinonový derivát nebo jeho sůl podle nároku 1 ve formě optického R-izomeru.

3. Chinazolinonovy derivát nebo jeho sůl podle nároku 1 nebo 2, kde R[ je benzyl.

io 4. Chinazolinonovy derivát nebo jeho sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde R? je chlor.

5. Chinazolinonový derivát nebo jeho sůl podle nároku t, kde R] je benzyl; R₇ je chlor; a R₃ je

4-methyl fenylová skupina.

15 6. Chinazolinonový derivát nebo jeho sůl podle nároku 5 ve formě optického R-izomeru.

7. Způsob in vitro inhibice KSP kinesinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kontakt KSP kinesinu s chinazolinonovým derivátem nebo jeho solí podle kteréhokoliv z předchozích nároků.

8. Chinazolinonový derivát nebo jeho sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, pro použití jako léčivý přípravek.

9. Chinazolinonový derivát nebo jeho sůl podle nároku 6, pro použití jako léčivý přípravek.

10. Použití chinazolinonového derivátu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pri výrobě léčivého přípravku pro ošetření buněčných proíiferativních onemocnění.

11. Použití podle nároku 10, kde uvedené onemocnění je vybráno ze skupiny sestávající se 30 z rakoviny, hyperplazie, restenózy, srdeční hypertrofie, imunitních poruch a zánětu.

12. Použití chinazolinonového derivátu nebo jeho soli podle nároků 5 nebo 6 pro ošetření rakoviny podle nároku 11.

35 13. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje chinazolinonový derivát nebo jeho sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 a farmaceuticky přijatelný nosič.