ES2262649T3

ES2262649T3 - Procedimientos y composiciones que utilizan quinazolinonas.

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Publication number: ES2262649T3
Application number: ES01932769T
Authority: ES
Inventors: Jeffrey T. Finer; Gustav Bergnes; Bainian Feng; Whitney W. Smith; John C. Chabala; David J. Morgans, Jr.
Original assignee: Cytokinetics Inc
Current assignee: Cytokinetics Inc
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2006-12-01
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: PL204525B1; MXPA02012627A; NO20026172L; CN1437585A; EP1296959A1; HK1053837A1; PL358412A1; WO2001098278A1; US6562831B1; US7294634B2; CN1229353C; AU2001259270B2; US7105668B1; IL153554A; DK1296959T3; IL153554A0; KR20030047903A; DE60118921D1; AU5927001A; CY1105070T1

Abstract

Un compuesto de fórmula: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; en el que el grupo isopropilo está unido en la configuración R; R1 es un grupo bencilo, clorobencilo, metilbencilo, metoxibencilo, cianobencilo o hidroxibencilo; R2 es halógeno o ciano; y R3 es un grupo fenilo sustituido con metilo y/o halógeno.

Description

Procedimientos y composiciones que utilizan quinazolinonas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a derivados de quinazolinona que son inhibidores de la KSP de cinesina mitótica y son útiles en el tratamiento de enfermedades proliferativas celulares, por ejemplo cáncer, hiperplasia, reestenosis, hipertrofia cardiaca, trastornos inmunológicos e inflamación.

Antecedentes de la invención

A principios de 1950 se promovió el interés por la química médica de los derivados de quinazolina con el esclarecimiento de la estructura de un alcaloide de quinazolina, 3-[\beta-ceto-gamma-(3-hidroxi-2-piperidil)-propil]-4-quinazolona, de una planta asiática conocida por sus propiedades antimaláricas. Se han sintetizado diversas quinazolinas sustituidas en busca de encontrar agentes antimaláricos adicionales. De particular importancia era la síntesis del derivado 2-metil-3-o-tolil-4-(3H)-quinazolinona. Se encontró que este compuesto, conocido por el nombre metacualona, era un potente hipnótico, aunque ineficaz contra protozoos.

Desde la introducción de metacualona y su descubrimiento como un hipnótico se ha investigado la actividad farmacológica de quinazolinonas y compuestos relacionados. Ahora se sabe que las quinazolinonas y derivados de las mismas tienen una amplia variedad de propiedades biológicas que incluyen actividades hipnóticas, sedantes, analgésicas, anticonvulsivas, antitusivas y antiinflamatorias.

Los derivados de quinazolinona para los que se han descrito usos biológicos específicos incluyen la patente de los EE.UU. número 5.147.875 que describe quinazolinas 2-(fenil sustituidas)-4-oxo con actividad broncodilatadora. Las patentes de los EE.UU. números 3.723.432, 3.740.442 y 3.925.548 describen una clase de 1-sustituido-4-aril-2(1H)-derivados de quinazolinona útiles como agentes antiinflamatorios. La publicación de patente europea EP0056637B1 reivindica una clase de 4(3H)-derivados de quinazolinona para el tratamiento de hipertensión. La publicación de patente europea EP0884319A1 describe composiciones farmacéuticas de derivados de quinazolin-4-ona usados para tratar trastornos neurodegenerativos, psicotrópicos y del sistema nervioso central y periférico inducidos por fármacos y alcohol.

Las quinazolinonas están entre un número creciente de agentes terapéuticos usados para tratar trastornos proliferativos celulares, incluyendo cáncer. Por ejemplo, el documento PCT WO96/06616 describe una composición farmacéutica que contiene un derivado de quinazolinona para inhibir la proliferación de células lisas vasculares. El documento PCT WO96/19224 usa este mismo derivado de quinazolinona para inhibir la proliferación de células mesangiales. Las patentes de los EE.UU. números 4.981.856, 5.081.124 y 5.280.027 describen el uso de derivados de quinazolinona para inhibir timidilato sintasa, la enzima que cataliza la metilación de deoxiuridina monofosfato para producir timidina monofosfato que se requiere para la síntesis de ADN. Las patentes de los EE.UU. números 5.747.498 y 5.773.476 describen derivados de quinazolinona usados para tratar cánceres caracterizados por hiperactividad o actividad inapropiada de cinasas receptoras de tirosinas. La patente de los EE.UU. número 5.037.829 reivindica composiciones de quinazolina (1H-azol-1-ilmetil) sustituidas para tratar carcinomas que se producen en células epiteliales. El documento PCT WO98/34613 describe una composición que contiene un derivado de quinazolinona útil para atenuar la neovascularización y para el tratamiento de tumores malignos. La patente de los EE.UU. 5.187.167 describe composiciones farmacéuticas que comprenden derivados de quinazolin-4-ona que poseen actividad antitumoral. El documento WO0130768 describe derivados de quinazolin-4-ona que son útiles para tratar enfermedades proliferativas celulares y otros trastornos asociados con la actividad de cinesina de KSP. El documento WO0116114 describe derivados de quinazolin-4-ona que son útiles para tratar, entre otros, trastornos inflamatorios, autoinmunológicos o tumores.

Otros agentes terapéuticos usados para tratar cáncer incluyen los taxanos y alcaloides de vinca. Los taxanos y alcaloides de vinca actúan en microtúbulos, que están presentes en una variedad de estructuras celulares. Los microtúbulos son el elemento estructural primario del huso mitótico. El huso mitótico es responsable de la distribución de copias réplica del genoma a cada una de las dos células hijas que resultan de la división celular. Se supone que la interrupción del huso mitótico por estos fármacos da como resultado la inhibición de la división de células cancerosas y la inducción de muerte de células cancerosas. Sin embargo, los microtúbulos forman otros tipos de estructuras celulares que incluyen vías para el transporte intracelular en procesos nerviosos. Debido a que estos agentes no tienen como diana específicamente husos mitóticos, tienen efectos secundarios que limitan su utilidad.

Son de considerable interés las mejoras en la especificidad de agentes usados para tratar cáncer debido a los beneficios terapéuticos que se desarrollarían si pudieran reducirse los efectos secundarios asociados con la administración de estos agentes. Tradicionalmente se asocian mejoras espectaculares en el tratamiento de cáncer con la identificación de agentes terapéuticos que actúan mediante mecanismos novedosos. Ejemplos de esto incluyen no sólo los taxanos, sino también la clase de camptotecinas de inhibidores de la topoisomerasa I. Desde ambas perspectivas, las cinesinas mitóticas son dianas atractivas para nuevos agentes anticancerígenos.

Las cinesinas mitóticas son enzimas esenciales para la reunión y función del huso mitótico, pero generalmente no son parte de otras estructuras de microtúbulos, tales como en procesos nerviosos. Las cinesinas mitóticas desempeñan papeles esenciales durante todas las fases de la mitosis. Estas enzimas son "motores moleculares" que transforman la energía liberada por la hidrólisis del ATP en fuerza mecánica que impulsa el movimiento direccional de cargas celulares a lo largo de los microtúbulos. El dominio catalítico suficiente para esta tarea es una estructura compacta de aproximadamente 340 aminoácidos. Durante la mitosis, las cinesinas organizan los microtúbulos en la estructura bipolar que es el huso mitótico. Las cinesinas median el movimiento de cromosomas a lo largo de microtúbulos de husos, además de cambios estructurales en el huso mitótico asociados con fases específicas de la mitosis. La perturbación experimental de la función de la cinesina mitótica produce malformación o disfunción del huso mitótico, dando como resultado frecuentemente la detención del ciclo celular y muerte celular.

Entre las cinesinas mitóticas que se han identificado está la KSP. La KSP pertenece a una subfamilia de cinesinas conservadas de manera evolutiva de motores de microtúbulos dirigidos al extremo más que se reúnen en homotetrámeros bipolares constituidos por homodímeros antiparalelos. Durante la mitosis, la KSP se asocia con microtúbulos del huso mitótico. La microinyección de anticuerpos dirigidos frente a la KSP en células humanas evita la separación de polos del huso durante la prometafase, dando origen a husos monopolares y produciéndose detención mitótica e inducción de muerte celular programada. La KSP y las cinesinas relacionadas en otros organismos no humanos agrupan microtúbulos antiparalelos y los deslizan unos con respecto a los otros, forzando así que se alejen los dos polos del huso. La KSP también puede mediar en el alargamiento del huso en la anafase B y el enfoque de microtúbulos en el polo del huso.

Se ha descrito la KSP humana (también denominada HsEg5) [Blangy y col., Cell, 83:1159-69 (1995); Whitehead y col., Artritis Rheum., 39:1635-42 (1996); Galgio y col., J. Cell Biol., 135:339-414 (1996); Blangy y col., J Biol. Chem., 272:19418-24 (1997); Blangy y col., Cell Motil Cytoskeleton, 40:174-82 (1998); Whitehead y Rattner, J. Cell Sci., 111:2551-61 (1998); Kaiser y col., JBC 274:18925-31 (1999); números de registro de GenBank: X85137, NM004523 y U37426], y se ha descrito un fragmento del gen de la KSP (TRIP5) [Lee y col., Mol Endocrinol., 9:243-54 (1995); número de registro de GenBank L40372). Se ha informado de homólogos de KSP de Xenopus (figura 5), además de Drosophila KLP61 F/KRP130.

Las cinesinas mitóticas son dianas atractivas para el descubrimiento y desarrollo de quimioterápicos mitóticos novedosos. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es proporcionar procedimientos y composiciones útiles en la inhibición de KSP, una cinesina mitótica.

Resumen de la invención

Según los objetos resumidos anteriormente, la presente invención proporciona composiciones y procedimientos que pueden usarse para tratar enfermedades de células proliferantes. Las composiciones son inhibidores de KSP, particularmente inhibidores de KSP humana.

En un aspecto, la invención se refiere a procedimientos para tratar enfermedades proliferativas celulares, para tratar trastornos asociados con la actividad de cinesina de KSP y para inhibir cinesina de KSP. Los procedimientos emplean compuestos elegidos del grupo constituido por un compuesto de fórmula:

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

en el que el grupo isopropilo está unido en la configuración R; R_{1} es un grupo bencilo, clorobencilo, metilbencilo, metoxibencilo, cianobencilo o hidroxibencilo; R_{2} es halógeno o ciano; y R_{3} es un grupo fenilo sustituido con metilo y/o halógeno.

Las enfermedades y los trastornos que responden a la terapia con compuestos de la invención incluyen cáncer, hiperplasia, reestenosis, hipertrofia cardiaca, trastornos inmunológicos e inflamación; especialmente cáncer, hiperplasia, reestenosis e hipertrofia cardiaca; particularmente cáncer.

En otro aspecto, la invención se refiere a compuestos útiles en inhibir cinesina de KSP. Los compuestos tienen las estructuras mostradas anteriormente.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona procedimientos de selección para compuestos que se unirán a una cinesina de KSP, por ejemplo compuestos que desplazarán o competirán con la unión de las composiciones de la invención. Los procedimientos comprenden combinar un compuesto marcado de la invención, una cinesina de KSP, y al menos un agente candidato y determinar la unión del agente bioactivo candidato a la cinesina de KSP.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos de selección para moduladores de la actividad de cinesina de KSP. Los procedimientos comprenden combinar una composición de la invención, una cinesina de KSP, y al menos un agente candidato y determinar el efecto del agente bioactivo candidato en la actividad de cinesina de KSP.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa un esquema sintético genérico para hacer compuestos de la invención.

La figura 2 representa una ruta sintética para la síntesis de inhibidores de KSP de quinazolinona relacionados.

La figura 3 representa una ruta sintética para enantiómeros individuales sustancialmente puros.

La figura 4 representa rutas sintéticas para compuestos de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está dirigida a una clase de compuestos novedosos basados en una estructura central de quinazolinona, que son moduladoras de cinesinas mitóticas. Mediante la inhibición o la modulación de cinesinas mitóticas, pero no otras cinesinas (por ejemplo, cinesinas de transporte), se logra la inhibición específica de la proliferación celular. Por tanto, la presente invención saca provecho del hallazgo de que la perturbación de la función de cinosina mitótica produce malformación o disfunción de husos mitóticos, dando como resultado frecuentemente la detención del ciclo celular y muerte celular. Los procedimientos para inhibir una cinesina de KSP humana comprenden poner en contacto un inhibidor de la invención con una cinesina de KSP, particularmente cinesinas de KSP humana, que incluye fragmentos y variantes de KSP. La inhibición puede ser de la actividad hidrolítica del ATP de la cinesina de KSP y/o la actividad de formación del huso mitótico, tal como la interrupción de los husos mitóticos. También pueden interrumpirse los husos meióticos.

Un objeto de la presente invención es desarrollar inhibidores y moduladores de cinesinas mitóticas, en particular KSP, para el tratamiento de trastornos asociados con proliferación celular. Tradicionalmente se han asociado mejoras espectaculares en el tratamiento del cáncer, un tipo de trastorno proliferativo celular, con la identificación de agentes terapéuticos que actúan por mecanismos novedosos. Ejemplos de éstos incluyen no sólo la clase de taxanos de agentes que parece que actúan en la formación de microtúbulos, sino también la clase de camptotecinas de inhibidores de la topoisomerasa I. Las composiciones y procedimientos descritos en este documento pueden diferir en su selectividad y se usan preferentemente para tratar enfermedades de células proliferantes que incluyen, pero no se limitan a, cáncer, hiperplasias, reestenosis, hipertrofia cardiaca, trastornos inmunológicos e inflamación.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a compuestos y procedimientos que emplean compuestos de fórmula

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o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos;

en los que el grupo isopropilo está unido en la configuración R; R_{1} es un grupo bencilo, clorobencilo, metilbencilo, metoxibencilo, cianobencilo o hidroxibencilo; R_{2} es halógeno o ciano; y R_{3} es un grupo fenilo sustituido con metilo y/o halógeno.

Preferentemente R_{1} es bencilo.

Halógeno se refiere a flúor, cloro bromo o yodo. Se prefieren flúor, cloro y bromo. Preferentemente R_{2} es cloro.

Los compuestos descritos en este documento contienen un centro asimétrico y por tanto dan lugar a isómeros (R) o (S). Los isómeros (R) ópticamente activos pueden prepararse usando sintones quirales o reactivos quirales o resolverse usando técnicas convencionales. Similarmente, también se pretende incluir todas las formas tautoméricas.

Si se desea, los isómeros R y S pueden resolverse por procedimientos conocidos para aquellos expertos en la materia, por ejemplo mediante formación de sales o complejos diastereoisoméricos que pueden separarse, por ejemplo mediante cristalización; mediante formación de derivados diastereoisoméricos que pueden separarse, por ejemplo mediante cristalización, cromatografía gas-líquido o líquida; reacción selectiva de un enantiómero con un reactivo específico para enantiómero, por ejemplo oxidación o reducción enzimática, seguida por separación de los enantiómeros modificados y no modificados; o cromatografía gas-líquido o líquida en un ambiente quiral, por ejemplo en un soporte quiral tal como sílice con un ligando quiral unido o en presencia de un disolvente quiral. Se apreciará que cuando el enantiómero deseado se convierta en otra entidad química por uno de los procedimientos de separación anteriormente descritos pueda requerirse una etapa adicional para liberar la forma enantiomérica deseada. Alternativamente, el enantiómero específico puede sintetizarse mediante síntesis asimétrica usando reactivos, sustratos, catalizadores o disolventes ópticamente activos, o convirtiendo un enantiómero en el otro mediante transformación asimétrica. En la figura 3 se muestra un ejemplo de una síntesis a partir de materiales de partida ópticamente activos.

La invención contempla el uso de enantiómeros puros y mezclas de enantiómeros que incluyen mezclas racémicas, aunque generalmente se preferirá el uso del enantiómero sustancialmente puro, particularmente el enantiómero R cuando un grupo i-propilo está unido al primer átomo de carbono de la cadena lateral.

Síntesis, prueba y uso

Las composiciones de la invención se sintetizan como se resume a continuación, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, como se describe en Ager y col., J. of Med. Chem., 20:379-386 (1977), las quinazolinonas pueden obtenerse mediante condensación catalizada por ácido de ácidos N-acilantranílicos con aminas primarias aromáticas. En las solicitudes de patente de los EE.UU. 5.783.577, 5.922.866 y 5.187.167 se describen otros procedimientos para preparar quinazolinonas.

Las composiciones de la invención pueden hacerse como se muestra en la figuras 1-4.

Una vez hechas, las composiciones de la invención encuentran uso en una variedad de aplicaciones. Como será apreciado por aquellos en la técnica, la mitosis puede alterarse en una variedad de formas; es decir, se puede afectar la mitosis o aumentando o disminuyendo la actividad de un componente en la ruta mitótica. Expuesto de otra manera, la mitosis puede afectarse (por ejemplo, interrumpirse) perturbando el equilibrio, o inhibiendo o activando ciertos componentes. Pueden usarse aproximaciones similares para alterar la meiosis.

En una realización preferida, las composiciones de la invención se usan para modular la formación de husos mitóticos, produciéndose por tanto la detención prolongada del ciclo celular en la mitosis. En este documento se entiende por "modular" alterar la formación de husos mitóticos, que incluye aumentar y disminuir la formación de husos. En este documento se entiende por "formación de husos mitóticos" la organización de microtúbulos en estructuras bipolares por cinesinas mitóticas. En este documento se entiende por "disfunción de husos mitóticos" la detención mitótica y la formación de husos monopolares.

Las composiciones de la invención son útiles para unirse a y/o modular la actividad de una cinesina mitótica, KSP. En una realización preferida, la KSP es KSP humana, aunque también pueden usarse cinesinas de KSP de otros organismos. En este contexto, modular significa o aumentar o disminuir la separación de polos del huso, produciéndose malformación, es decir, ensanchamiento de polos del huso mitótico o, por otra parte, producir perturbación morfológica del huso mitótico. Para estos fines también esta incluida dentro de la definición de KSP variantes y/o fragmentos de KSP. Véase la patente de los EE.UU. "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States", presentada el 27 de octubre de 1999 (patente de los EE.UU. número 6.617.115). Además, en la presente invención pueden usarse otras cinesinas mitóticas. Sin embargo, las composiciones de la invención han mostrado tener especificidad por KSP.

Para ensayar la actividad, generalmente se une de manera no difusible o una KSP o un compuesto según la invención a un soporte insoluble que tienen áreas que alojan muestras aisladas (por ejemplo una placa de microtitulación, una matriz, etc.). El soporte insoluble puede estar hecho de cualquier composición a la que puedan unirse las composiciones, se separa fácilmente del material soluble y, por otra parte, es compatible con el procedimiento de selección total. La superficie de tales soportes puede ser sólida o porosa y de cualquier forma conveniente. Ejemplos de soportes insolubles adecuados incluyen placas de microtitulación, matrices, membranas y lechos. Éstos están hechos normalmente de vidrio, plástico (por ejemplo poliestireno), polisacáridos, nailon o nitrocelulosa, Teflon^{MR}, etc. Las placas de microtitulación y las matrices son especialmente convenientes debido a que simultáneamente pueden llevarse a cabo un gran número de ensayos usando pequeñas cantidades de reactivos y muestras. El modo particular de unir la composición no es crucial siempre que sea compatible con los reactivos y todos los procedimientos de la invención, mantenga la actividad de la composición y sea no difusible. Los procedimientos de unión preferidos incluyen el uso de anticuerpos (que no bloquean estéricamente ni el sitio de unión del ligando ni la secuencia de activación cuando la proteína está unida al soporte), unión directa a soportes "pegajosos" o iónicos, reticulamiento químico, la síntesis de la proteína o agente en la superficie, etc. Tras la unión de la proteína o agente se elimina mediante lavado el exceso de material no unido. Entonces, las áreas que alojan muestras pueden bloquearse mediante incubación con albúmina de suero bovino (BSA), caseína u otra proteína inocua u otro resto.

Los agentes antimitóticos de la invención pueden usarse solos para modular la actividad de una cinesina mitótica, particularmente KSP. En esta realización, los agentes mitóticos de la invención se combinan con KSP y se ensaya la actividad de la KSP. En la técnica se conoce la actividad de cinesina e incluye una o más actividades de cinesina. Las actividades de cinesina incluyen la capacidad de afectar la hidrólisis del ATP; unión de microtúbulos; deslizamiento y polimerización/despolimerización (efectos en dinámicas de microtúbulos); unión a otras proteínas del huso; unión a proteínas que participan en el control del ciclo celular; servir como un sustrato para otras enzimas; tales como cinasas o proteasas; y actividades celulares de cinesinas específicas tales como separación de polos del huso.

Los procedimientos para realizar los ensayos de motilidad son bien conocidos para aquellos expertos en la materia. [Véase, por ejemplo, Hall y col. (1996), Biophys. J., 71:3467-3476, Turner y col., 1996, AnaL. Biochem. 242 (1):20-5; Gittes y col., 1996, Biophys. J. 70 (1):418-29; Shirakawa y col., 1995, J. Exp. BioL 198:1809-15; Winkelmann y col., 1995, Biophys. J. 68:2444-53; Winkelmann y col., 1995, Biophys. J. 68:72S].

También pueden usarse los procedimientos conocidos en la técnica para determinar la actividad hidrolítica de la ATPasa. Preferentemente se utilizan ensayos basados en disoluciones. La patente de los EE.UU. número 6410254 presentada el 18 de mayo de 1999 describe tales ensayos. Alternativamente se usan procedimientos convencionales. Por ejemplo, puede cuantificarse la liberación de P_{i} de cinesina. En una realización preferida, el ensayo de actividad hidrolítica de la ATPasa utiliza PCA 0,3 M (ácido perclórico) y reactivo verde malaquita (molibdato II de sodio 8,27 mM, oxalato de verde malaquita 0,33 mM y Triton X-100 0,8 mM). Para realizar el ensayo se enfrían 10 \mul de reacción en 90 \mul de PCA 0,3 M frío. Se usan patrones de fosfato, de manera que los datos puedan convertirse en mM de fosfato inorgánico liberado. Cuando se han enfriado todas las reacciones y patrones en PCA, se añaden 100 \mul de reactivo verde malaquita a los pocillos relevantes en, por ejemplo, una placa de microtitulación. La mezcla se revela durante 10-15 minutos y la placa se lee a una absorbancia de 650 nm. Si se usaron patrones de fosfato, las lecturas de absorbancia pueden convertirse en P_{i} mM y representarse con el tiempo. Adicionalmente, los ensayos de ATPasa conocidos en la técnica incluyen el ensayo de luciferasa.

También puede usarse la actividad de ATPasa de dominios motores de cinesina para monitorizar los efectos de agentes de modulación. En una realización, los ensayos de ATPasa de cinesina se realizan en ausencia de microtúbulos. En otra realización, los ensayos de ATPasa se realizan en presencia de microtúbulos. En los ensayos anteriores pueden detectarse diferentes tipos de agentes de modulación. En una realización preferida, el efecto de un agente de modulación es independiente de la concentración de microtúbulos y ATP. En otra realización puede disminuirse el efecto de los agentes en la ATPasa de cinesina aumentando las concentraciones de ATP, microtúbulos o ambas. En todavía otra realización, el efecto del agente de modulación se aumenta aumentando las concentraciones de ATP, microtúbulos o ambas.

Entonces, pueden seleccionarse in vivo agentes que modulan la actividad bioquímica de la KSP in vitro. Los procedimientos para tales agentes in vivo incluyen ensayos de distribución del ciclo celular, viabilidad celular o la presencia, morfología, actividad, distribución o cantidad de husos mitóticos. Los procedimientos para monitorizar la distribución del ciclo celular de una población celular, por ejemplo por citometría de flujo, son bien conocidos para aquellos expertos en la materia, ya que son procedimientos para determinar la viabilidad celular. Véase por ejemplo la patente de los EE.UU. "Methods of Screening for Modulators of Cell Proliferation and Methods of Diagnosing Cell Proliferation States", presentada el 27 de octubre de 1999, número de patente 6.617.115.

Además de los ensayos descritos anteriormente, para aquellos expertos en la materia son bien conocidos los procedimientos microscópicos para monitorizar la formación y malformación de husos (véase, por ejemplo, Whitehead y Rattner (1998), J. Cell Sci. 111:2551-61; Galgio y col., (1996) J. Cell biol., 135:399-414).

Las composiciones de la invención inhiben la cinesina de KSP. Una medida de la inhibición es CI_{50}, definida como la concentración de la composición a la que disminuye al cincuenta por ciento la actividad de la KSP. Las composiciones preferidas tienen CI_{50} inferiores a aproximadamente 1 mM, teniendo las realizaciones preferidas CI_{50} inferiores a aproximadamente 100 \muM, teniendo las realizaciones más preferidas CI_{50} inferiores a aproximadamente 10 \muM, teniendo las realizaciones particularmente preferidas CI_{50} inferiores a aproximadamente 1 \muM y realizaciones especialmente preferidas que tienen CI_{50} inferiores a aproximadamente 100 nM, y teniendo las realizaciones más preferidas CI_{50} inferiores a aproximadamente 10 nM. La medición de CI_{50} se hace usando un ensayo de ATPasa.

Otra medida de la inhibición es K_{i}. Para compuestos con CI_{50} inferiores a 1 \muM, la K_{i} o K_{d} se define como la constante de velocidad de disociación para la interacción de la quinazolinona con KSP. Los compuestos preferidos tienen K_{i} inferiores a aproximadamente 100 \muM, teniendo las realizaciones preferidas K_{i} inferiores a aproximadamente 10 \muM, y realizaciones particularmente preferidas que tienen K_{i} inferiores a aproximadamente 1 \muM y realizaciones especialmente preferidas que tienen K_{i} inferiores a aproximadamente 100 nM, y teniendo las realizaciones más preferidas K_{i} inferiores a aproximadamente 10 nM. La K_{i} para un compuesto se determina a partir de la CI_{50} basada en tres suposiciones. Primera, sólo una molécula de compuesto se une a la enzima y no hay cooperatividad. Segunda, se conocen las concentraciones de enzima activa y el compuesto probado (es decir, no hay cantidades significativas de impurezas o formas inactivas en las preparaciones). Tercera, la velocidad enzimática del complejo enzima-inhibidor es cero. Los datos de velocidad (es decir, la concentración de compuesto) se ajustan a la ecuación:

V = V_{máx}E_{0} \left[I - \frac{(E_{0} + I_{0} + Kd) - \sqrt{(E_{0} + I_{0} + Kd)^{2} - 4 \ E_{0} \ I_{0}}}{2 E_{0}}\right]

En la que V es la velocidad observada, V_{máx} es la velocidad de la enzima libre, I_{0} es concentración de inhibidor, E_{0} es la concentración de enzima y K_{d} es la constante de disociación del complejo enzima-inhibidor.

Otra medida de la inhibición es CI_{50}, definida como la concentración del compuesto que da como resultado una disminución de la velocidad del crecimiento celular al cincuenta por ciento. Los compuestos preferidos tienen CI_{50} inferiores a aproximadamente 1 mM. El nivel de preferencia de realizaciones es una función de su CI_{50}: son más preferidas aquellas que tienen CI_{50} inferiores a aproximadamente 20 \muM; todavía más aquellas que tienen CI_{50} de 10 \muM; todavía más aquellas que tienen CI_{50} inferiores a aproximadamente 1 \muM; todavía más aquellas que tienen CI_{50} de 100 nM; incluso todavía más aquellas que tienen CI_{50} inferiores a aproximadamente 10 nM. La medición de CI_{50} se hace usando un ensayo de proliferación celular.

Las composiciones de la invención se usan para tratar enfermedades de proliferación celular. Los estado de enfermedad que pueden tratarse mediante los procedimientos y composiciones proporcionados en este documento incluyen, pero no se limitan a, cáncer (tratado adicionalmente más adelante), enfermedad autoinmunológica, artritis, rechazo de injerto, enfermedad inflamatoria del intestino, proliferación inducida después de procedimientos médicos que incluyen, pero no se limitan a, cirugía, angioplastia y similares. Se aprecia que en algunos casos las células puedan no estar en un estado de hiper o hipoproliferación (estado anómalo) y todavía requieran tratamiento. Por ejemplo, durante la cicatrización de heridas, las células pueden estar proliferando "normalmente", pero puede desearse una mejora de la proliferación. Similarmente, como se trata anteriormente, en el sector agrícola las células pueden estar en un estado "normal", pero puede desearse la modulación de la proliferación para mejorar una cosecha, mejorando directamente el crecimiento de una cosecha, o inhibiendo el crecimiento de una planta u organismo que afecta adversamente la cosecha. Por tanto, en una realización, la invención en este documento incluye la administración a células o individuos aquejados o de aflicción inminente con uno cualquiera de estos trastornos o estados.

Las composiciones y procedimientos proporcionados en este documento se consideran particularmente útiles para el tratamiento de cáncer, que incluye tumores sólidos tales como carcinomas cutáneos, de mama, cerebrales, cervicales, carcinomas testiculares, etc. Más particularmente, los cánceres que pueden tratarse mediante las composiciones y procedimientos de la invención incluyen, pero no se limitan a: cardiaco: sarcoma (angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma), mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma; pulmón: carcinoma broncogénico (célula escamosa, célula pequeña no diferenciada, célula grande no diferenciada, adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; gastrointestinal: esófago (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), estómago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), páncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, vipoma), intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Karposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velloso, hamartoma, leiomioma); tracto genitourinario: riñón (adenocarcinoma, tumor de Wilm [nefroblastoma], linfoma, leucemia), vejiga y uretra (carcinoma de células escamosas, carcinoma de células de transición, adenocarcinoma), próstata (adenocarcinoma, sarcoma), testículos (seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células intersticiales, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides, lipoma); hígado: hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma; hueso: sarcoma osteogénico (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de células reticulares), mieloma múltiple, tumor maligno de células gigantes, cordoma, osteocondroma (exostosis osteocartilaginosa), condroma benigno, condroblastoma, condromixofibroma, osteoma osteoide y tumores de células gigantes; sistema nervioso: craneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteítis deformante), meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), cerebro (astrocitoma, meduloblastoma, glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), neurofibroma de médula espinal, meningioma, glioma, sarcoma); ginecológico: útero (carcinoma endometrial), cuello del útero (carcinoma cervical, displasia cervical previa a tumor), ovarios (carcinoma ovárico [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma no clasificado], tumores de células granulosotecales, tumores de células de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), vulva (carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), vagina (carcinoma de células claras, carcinoma de células escamosas, sarcoma botrioide (rabdomiosarcoma embrionario], trompas de Falopio (carcinoma); hematológico: sangre (leucemia mieloide [aguda y crónica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico), enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin [linfoma maligno]; piel: melanoma maligno, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Karposi, lunares, nevos displásicos, lipoma, angioma, dermatofibroma, queloides, psoriasis; y glándulas adrenales: neuroblastoma. Por tanto, el término "célula cancerosa" como se proporciona en este documento incluye una célula aquejada por una cualquiera de las dolencias anteriormente
identificadas.

Por consiguiente, las composiciones de la invención se administran a células. En este documento se entiende por "administrado" la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de los agentes mitóticos de la invención a una célula o en cultivo celular o en un paciente. En este documento se entiende por "dosis terapéuticamente eficaz" una dosis que produce los efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del fin del tratamiento y será determinada por un experto en la materia usando técnicas conocidas. Como se conoce en la técnica, pueden ser necesarias adaptaciones para la liberación sistémica frente a localizada, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, interacción de fármacos y la gravedad de la dolencia, y serán determinadas con experimentación rutinaria por aquellos expertos en la materia. En este documento se entiende por "células" casi cualquier célula en la que pueda alterarse la mitosis o meiosis.

Un "paciente" para los fines de la presente invención incluye tanto seres humanos como otros animales, particularmente mamíferos, y otros organismos. Por tanto, los procedimientos son aplicables tanto al tratamiento de seres humanos como a aplicaciones veterinarias. En la realización preferida el paciente es un mamífero y en la realización más preferida el paciente es un ser humano.

Los agentes mitóticos que tienen la actividad farmacológica deseada pueden administrarse en un vehículo fisiológicamente aceptable a un paciente, como se describe en este documento. Dependiendo del modo de introducción, los compuestos pueden formularse en una variedad de formas como se trata más adelante. La concentración del compuesto terapéuticamente activo en la formulación puede variar de aproximadamente 0,1-100% en peso. Los agentes pueden administrarse solos o en combinación con otros tratamientos, es decir, radiación u otros agentes quimioterápicos.

En una realización preferida, las composiciones farmacéuticas están en una forma soluble en agua, tal como sales farmacéuticamente aceptables, que pretenden incluir tanto sales de adición de ácidos como de bases. "Sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia biológica de las bases libres y que no son no deseables biológicamente o de otra manera, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares. "Sales de adición de bases farmacéuticamente aceptables" incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, cinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Se prefieren particularmente las sales de amonio, potasio, sodio, calcio, y magnesio. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas que se producen naturalmente, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse de diversas formas, tales como gránulos, comprimidos, píldoras, supositorios, cápsulas, suspensiones, ungüentos, lociones y similares. Los vehículos y/o diluyentes orgánicos o inorgánicos de calidad farmacéutica adecuados para uso oral y tópico pueden usarse para preparar composiciones que contienen los compuestos terapéuticamente activos. Los diluyentes conocidos para la técnica incluyen medios acuosos, aceites y grasas vegetales y animales. Como agentes auxiliares pueden usarse agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para variar la presión osmótica o tampones para asegurar un valor de pH adecuado y potenciadores de la penetración en la piel. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir uno o más de los siguientes: proteínas vehículo tales como albúmina de suero; tampones; cargas tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes de unión; edulcorantes y otros agentes aromatizantes; agentes colorantes; y polietilenglicol. Los aditivos son bien conocidos en la técnica y se usan en una variedad de formulaciones.

La administración de los agentes mitóticos de la presente invención puede hacerse en una variedad de formas como se trata anteriormente, que incluyen, pero no se limitan a, vía oral, vía subcutánea, vía intravenosa, vía intranasal, vía transdérmica, vía intraperitoneal, vía intramuscular, vía intrapulmonar, vía vaginal, vía rectal o vía intraocular. En algunos casos, por ejemplo en el tratamiento de heridas e inflamación, los agentes antimitóticos pueden administrarse directamente como una disolución o aerosol.

Para emplear los compuestos de la invención en un procedimiento de selección para compuestos que se unen a cinesina de KSP, la KSP se une a un soporte y se añade al ensayo un compuesto de la invención (que es un agente mitótico). Alternativamente, el compuesto de la invención se une al soporte y se añade la KSP. Las clases de compuestos entre los que pueden buscarse los agentes de unión novedosos incluyen anticuerpos específicos, agentes de unión no naturales identificados en investigaciones de bibliotecas químicas, análogos de péptidos, etc. Los ensayos de selección son de particular interés para agentes candidatos que tienen un baja toxicidad para células humanas. Para este fin puede usarse una amplia variedad de ensayos que incluye ensayos in vitro de unión proteína-proteína marcada, ensayos de desplazamiento de movilidad electroforética, inmunoensayos para la unión de proteínas, ensayos funcionales (ensayos de fosforilación, etc.) y similares.

La determinación de la unión del agente mitótico a la KSP puede hacerse de varias formas. En una realización preferida, el agente mitótico (el compuesto de la invención) se marca, por ejemplo con un resto fluorescente o radioactivo, y la unión se determina directamente. Por ejemplo, esto puede hacerse uniendo toda o una parte de la KSP a un soporte sólido, añadiendo un agente mitótico marcado (por ejemplo un compuesto de la invención en el que al menos se ha sustituido un átomo por un isótopo detectable), eliminando por lavado el reactivo en exceso y determinando si la cantidad del marcaje es la presente en el soporte sólido. Pueden utilizarse diversas etapas de bloqueo y lavado como se conocen en la técnica.

En este documento se entiende por "marcado" que el compuesto está marcado o directamente o indirectamente con un marcaje que proporciona una señal detectable, por ejemplo radioisótopo, etiqueta fluorescente, enzima, anticuerpos, partículas tales como partículas magnéticas, etiqueta quimioluminiscente o moléculas de unión específica, etc. Las moléculas de unión específicas incluyen pares tales como biotina y estreptavidina, digoxina y antidigoxina, etc. Para los miembros de unión específicos, el miembro complementario se marcaría normalmente con una molécula que proporciona detección, según procedimientos conocidos, como se resume anteriormente. El marcaje puede proporcionar directamente o indirectamente una señal detectable.

En algunas realizaciones sólo se marca uno de los componentes. Por ejemplo, las proteínas de cinesina pueden marcarse en posiciones de tirosina usando ^{125}I o con fluoróforos. Alternativamente puede marcarse más de un componente con diferentes marcajes; por ejemplo usando ^{125}I para las proteínas y un fluoróforo para los agentes mitóticos.

Los compuestos de la invención también pueden usarse como competidores para seleccionar candidatos de fármacos adicionales. Como se usa en este documento, "agente bioactivo candidato" o "candidato de fármaco" o equivalentes gramaticales describen cualquier molécula, por ejemplo proteína, oligopéptido, pequeña molécula orgánica, polisacárido, polinucleotido, etc., que va a probarse para la bioactividad. Pueden alterar directa o indirectamente el fenotipo de proliferación celular o la expresión de una secuencia de proliferación celular, incluyendo tanto secuencias de ácidos nucleicos como secuencias de proteínas. En otros casos se selecciona la alteración de la unión y/o actividad de proteínas de proliferación celular. Las investigaciones de este tipo pueden realizarse o en presencia o en ausencia de microtúbulos. En el caso en que se seleccione la unión o actividad de proteína, las realizaciones preferidas excluyen moléculas ya conocidas por unirse a esa proteína particular, por ejemplo estructuras poliméricas tales como microtúbulos, y fuentes de energía tales como ATP. Las realizaciones preferidas de ensayos en este documento incluyen agentes candidatos que no se unen a la proteína de proliferación celular en su estado nativo endógeno, denominados en este documento como agentes "exógenos". En otra realización preferida, los agentes exógenos excluyen además anticuerpos para la KSP.

Los agentes candidatos pueden englobar numerosas clases químicas, aunque normalmente son moléculas orgánicas, preferentemente pequeños compuestos orgánicos que tienen un peso molecular superior a 100 e inferior a aproximadamente 2.500 dalton. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interacción estructural con proteínas, particularmente enlace de hidrógeno y enlace lipófilo, y normalmente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo, éter o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales. Los agentes candidatos comprenden frecuentemente estructuras de carbono cíclicas o heterocíclicas y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales anteriores. También se encuentran agentes candidatos entre biomoléculas que incluyen péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, análogos estructurales o combinaciones de los mismos. Particularmente se prefieren péptidos.

Los agentes candidatos se obtienen de una amplia variedad de fuentes que incluyen bibliotecas de compuestos sintéticos o naturales. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis al azar y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluye la expresión de oligonucleotidos al azar. Alternativamente, las bibliotecas de compuestos naturales están disponibles o se producen fácilmente en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales. Adicionalmente, las bibliotecas y los compuestos producidos natural o sintéticamente se modifican fácilmente mediante medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales. Los agentes farmacológicos conocidos pueden someterse a modificaciones químicas dirigidas o al azar, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación para producir análogos estructurales.

Los ensayos de selección competitiva pueden hacerse combinando KSP y un candidato de fármaco en una primera muestra. Una segunda muestra comprende un agente mitótico, KSP y un candidato de fármaco. Esto puede realizarse o en presencia o en ausencia de microtúbulos. La unión del candidato de fármaco se determina para ambas muestras y un cambio o diferencia en la unión entre las dos muestras indica la presencia de un agente que puede unirse a la KSP y modular potencialmente su actividad. Es decir, si la unión del candidato de fármaco es diferente en la segunda muestra con respecto a la primera muestra, el candidato de fármaco puede unirse a la KSP.

En una realización preferida, la unión del agente candidato se determina mediante el uso de ensayos de unión competitiva. En esta realización, el competidor es un resto de unión conocido por unirse a la KSP, tal como un anticuerpo, péptido, reactivo de unión, ligando, etc. En ciertas circunstancias puede darse un enlace competitivo entre el agente candidato y el resto de unión, desplazando el resto de unión el agente candidato.

En una realización se marca el agente candidato. O el agente candidato o el competidor, o ambos, se añaden primero a la KSP durante un tiempo suficiente para permitir la unión, si está presente. Las incubaciones pueden realizarse a cualquier temperatura que facilite la actividad óptima, normalmente entre 4 y 40ºC.

Los periodos de incubación se seleccionan para actividad óptima, pero también pueden optimizarse para facilitar la rápida selección de alto rendimiento. Normalmente será suficiente entre 0,1 y 1 hora. Generalmente se elimina o se lava el exceso de reactivo. Entonces se añade el segundo componente y se sigue la presencia o ausencia del componente marcado, para indicar la unión.

En una realización preferida, el competidor se añade primero, seguido por el agente candidato. El desplazamiento del competidor es una indicación de que el agente candidato se está uniendo a la KSP y por tanto puede unirse a, y modular potencialmente, la actividad de la KSP. En esta realización puede marcarse cualquier componente. Por tanto, por ejemplo, si se marca el competidor, la presencia del marcaje en la disolución de lavado indica desplazamiento por el agente. Alternativamente, si se marca el agente candidato, la presencia del marcaje en el soporte indica desplazamiento.

En una realización alternativa, el agente candidato se añade primero, con incubación y lavado, seguido por el competidor. La ausencia de unión por el competidor puede indicar que el agente candidato está unido a la KSP con una mayor afinidad. Por tanto, si se marca el agente candidato, la presencia del marcaje en el soporte, acoplado con una carencia de unión del competidor, puede indicar que el agente candidato puede unirse a la KSP.

Puede ser de valor identificar el sitio de unión de la KSP. Esto puede hacerse en una variedad de formas. En una realización, una vez que la KSP se ha identificado como unida al agente mitótico, la KSP se fragmenta o modifica y se repiten los ensayos para identificar los componentes necesarios para la unión.

La modulación se prueba seleccionando agentes candidatos que puedan modular la actividad de la KSP, que comprende las etapas de combinar un agente candidato con KSP, como anteriormente, y determinar una alteración en la actividad biológica de la KSP. Por tanto, en esta realización, el agente candidato debería tanto unirse a la KSP (aunque esto puede no ser necesario) como alterar su actividad biológica o bioquímica como se define en este documento. Los procedimientos incluyen tanto procedimientos de selección in vitro como de selección in vivo de células para alteraciones en la distribución del ciclo celular, viabilidad celular, o para la presencia, morfología, actividad, distribución o cantidad de husos mitóticos, como generalmente se resumen antes.

Alternativamente puede usarse la selección diferencial para identificar candidatos de fármacos que se unen a la KSP nativa, pero que no pueden unirse a la KSP modificada.

En los ensayos pueden usarse controles positivos y controles negativos. Preferentemente, todas las muestras de control y de prueba se realizan al menos por triplicado para obtener resultados estadísticamente significativos. La incubación de todas las muestras es durante un tiempo suficiente para la unión del agente a la proteína. Tras la incubación, todas muestras se liberan mediante lavado del material no específicamente unido y se determina la cantidad de agente unido, generalmente marcado. Por ejemplo, si se emplea un radiomarcaje, las muestras pueden contarse en un contador de centelleo para determinar la cantidad de compuesto unido.

En los ensayos de selección pueden incluirse una variedad de otros reactivos. Éstos incluyen reactivos como sales, proteínas neutras, por ejemplo albúmina, detergentes, etc., que pueden usarse para facilitar la unión óptima proteína-proteína y/o reducir las interacciones no específicas o de fondo. Por tanto, pueden usarse reactivos que mejoran por otra parte la eficiencia del ensayo, tales como inhibidores de proteasa, inhibidores de nucleasa, agentes antimicrobianos, etc. La mezcla de componentes puede añadirse en cualquier orden que proporcione la unión requerida.

Los siguientes ejemplos, cuyo ejemplo 4 es un ejemplo de la invención, sirven para describir en más detalle el modo de usar la invención anteriormente descrita.

Ejemplos Abreviaturas y definiciones

Los siguientes términos y abreviaturas tienen los significados indicados en todo el documento;

Ac: = \hskip0.5cm acetilo

BNB: = \hskip0.5cm ácido 4-bromometil-3-nitrobenzoico

Boc: = \hskip0.5cm t-butiloxicarbonilo

Bu: = \hskip0.5cm butilo

c-: = \hskip0.5cm ciclo

CBZ: = \hskip0.5cm carbobenzoxi = benciloxicarbonilo

DBU: = \hskip0.5cm diazabiciclo[5.4.0] undec-7-eno

DCM: = \hskip0.5cm diclorometano = cloruro de metileno = CH_{2}Cl_{2}

DCE: = \hskip0.5cm dicloroetileno

DEAD: = \hskip0.5cm azodicarboxilato de dietilo

DIC: = \hskip0.5cm diisopropilcarbodiimida

DIEA: = \hskip0.5cm N,N-diisopropiletilamina

DMAP: = \hskip0.5cm 4-N,N-dimetilaminopiridina

DMF: = \hskip0.5cm N,N-dimetilformamida

DMSO: = \hskip0.5cm sulfóxido de dimetilo

DVB: = \hskip0.5cm 1,4-divinilbenceno

EEDQ: = \hskip0.5cm 2-etoxi-1-etoxicarbonil-1,2-dihidroquinolina

Et: = \hskip0.5cm etilo

Fmoc: = \hskip0.5cm 9-fluorenilmetoxicarbonilo

CG: = \hskip0.5cm cromatografía de gas

HATU: = \hskip0.5cm hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio

HMDS: = \hskip0.5cm hexametildisilazano

HOAc: = \hskip0.5cm ácido acético

HOBt: = \hskip0.5cm hidroxibenzotriazol

Me: = \hskip0.5cm metilo

Mesilo: = \hskip0.5cm metanosulfonilo

MTBE: = \hskip0.5cm éter metil t-butílico

NMO: = \hskip0.5cm óxido de N-metilmorfolina

PEG: = \hskip0.5cm polietilenglicol

Ph: = \hskip0.5cm fenilo

PhOH: = \hskip0.5cm fenol

PtP: = \hskip0.5cm pentafluorofenol

PPTS: = \hskip0.5cm p-toluenosulfonato de piridinio

Py: = \hskip0.5cm piridina

PyBroP: = \hskip0.5cm hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidino-fosfonio

ta: = \hskip0.5cm temperatura ambiente

sat=d: = \hskip0.5cm saturado

s-: = \hskip0.5cm secundario

t-: = \hskip0.5cm terciario

TBDMS: = \hskip0.5cm t-butildimetilsililo

TES: = \hskip0.5cm trietilsilano

TFA: = \hskip0.5cm ácido trifluoroacético

THF: = \hskip0.5cm tetrahidrofurano

TMOF: = \hskip0.5cm ortoformiato de trimetilo

TMS: = \hskip0.5cm trimetilsililo

tosilo: = \hskip0.5cm p-toluenosulfonilo

Trt: = \hskip0.5cm trifenilmetilo

Ejemplo de referencia 1

Síntesis de compuestos

La síntesis general se muestra en las figuras 1 y 2.

Etapa 1

Ácido N-butirilantranílico

A un matraz de fondo redondo de 500 ml de tres cuellos equipado con un termómetro, embudo de goteo y una eficaz barra de agitación magnética se añadió ácido antranílico (1) (0,5 mol, 68,5 g) y dimetilformamida (250 ml). A esta disolución se añadió gota a gota cloruro de butirilo (0,55 mol, 57,1 ml) a una velocidad tal que la temperatura de la mezcla no subió por encima de 40ºC. La suspensión se agitó vigorosamente a temperatura ambiente durante al menos 3 h adicionales. La mezcla se vertió en agua (2000 ml) y se agitó durante otra 1 h. El producto precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua fría y se secó a presión reducida sobre P_{2}O_{5}, dando el compuesto 2 (67,3 g, 65%).

Etapa 2

2-propil-3,1-[4H]benzoxazin-4-ona

El compuesto 2 (51,8 g, 0,25 mol) se disolvió en anhídrido acético (180 ml) en un matraz de fondo redondo de 500 ml equipado con una barra de agitación magnética, una cabeza de destilación Claisen (con entrada de vacío) y un termómetro. El matraz se colocó en un baño de aceite y se calentó lentamente hasta 170-180ºC con agitación vigorosa. El ácido acético producido se eliminó lentamente por destilación a presión atmosférica. Se usó la monitorización de la temperatura de cabeza de la unidad de destilación para seguir el progreso de la transformación. Entonces, la mezcla de reacción se enfrió hasta 60ºC y el exceso de anhídrido acético se eliminó por destilación a presión reducida (aproximadamente 2,666 kPa (20 mm Hg)). Después se enfrió el residuo y cristalizó el producto. El producto se trituró con n-hexano (75 ml) y se aisló por filtración para dar 2-propil-3,1-[4H]benzoxazin-4-ona (3) (29,3 g, 62%). El procedimiento anterior dio el compuesto 3 suficientemente puro para usarlo directamente en la siguiente etapa.

Etapa 3

2-propil-3-bencilquinazolin-4-ona

El compuesto 3 (28,4 g, 0,15 mol) y bencilamina (17,5 ml, 0,16 mol) se calentaron a reflujo en cloroformo (50 ml) durante 6 h en un matraz de fondo redondo de 250 ml de un solo cuello. Después del consumo completo del compuesto 3, el cloroformo se evaporó a presión reducida. Se añadieron etilenglicol (100 ml) y lentejas de NaOH (0,60 g) al residuo y el matraz se equipó con una cabeza de destilación Claisen y una barra de agitación magnética. El matraz se sumergió en un baño de aceite y se recalentó con agitación vigorosa hasta una temperatura de baño de 130-140ºC y allí se mantuvo durante 5 h mientras que el agua producida se eliminaba por destilación. Después de completarse la reacción se permitió que la disolución transparente se enfriara hasta temperatura ambiente y se mantuvo durante la noche para precipitar el producto. El pH de la suspensión se ajustó a 7-8 mediante adición de HCl acuoso al 3%, los cristales se eliminaron por filtración y se lavaron con agua fría, y entonces recristalizaron en isopropanol (o alternativamente en acetona) para proporcionar el compuesto 2-propil-3-bencilquinazolin-4-ona (compuesto 4) (28,0 g, 67%).

Etapa 4

2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolin-4-ona

A un matraz de fondo redondo de 250 ml de tres cuellos equipado con un termómetro, embudo de goteo y una eficaz barra de agitación magnética se añadió el compuesto 4 (27,8 g, 0,10 mol), acetato sódico anhidro (10,0 g) y ácido acético glacial (130 ml). Se añadió gota a gota bromo (16,0 g, 0,10 mol) disuelto en ácido acético (10 ml) a la disolución anterior a 40ºC durante 1-2 h. Después de completarse la adición, la mezcla se vertió en agua (1500 ml) y se agitó durante 1-2 h a temperatura ambiente. El producto precipitado, 2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolin-4-ona (5), se aisló por filtración, se lavó con agua caliente para eliminar trazas de ácido acético y se aclaró con una pequeña cantidad de isopropanol. El secado dio el compuesto 5 (33,0 g, 92%).

Etapa 5

2-[1'-(N,N-dimetiletilendiamino)propil]-3-bencilquinazolin-4-ona

Se disolvieron el compuesto 5 (10,7 g, 0,03 mol) y N,N-dimetiletilendiamina (6,6 ml, 0,06 mol) en etanol absoluto (60 ml) y se calentaron a reflujo durante 6 h. Después de completarse la reacción, el disolvente se evaporó a presión reducida. El residuo se disolvió en diclorometano (150 ml) y se lavó con disolución de NaOH acuosa al 3% (aproximadamente 10-20 ml). La fase orgánica se secó sobre MgSO_{4} y se evaporó hasta sequedad a presión reducida. El producto aceitoso restante se purificó por cromatografía ultrarrápida en una almohadilla corta de gel de sílice usando un eluyente de CHCl_{3}-MeOH-NH_{3} acuoso, 90:10:0,1, para dar el compuesto deseado (5), 2-[1'-(N,N-dimetiletilendiamino)propil]-3-bencilquinazolin-4-ona (6) (6,0 g, 55%).

Etapa 6

2-[1'-(N-4-fluorobenzoil)-(N,N-dimetiletilendiamino)propil]-3-bencilquinazolin-4-ona

Se preparó una disolución madre del compuesto 5 (1,822 g, 5,0 mmol) en CHCl_{3} de calidad para HPLC (0,5 ml). Se preparó una disolución madre de cloruro de p-fluorobenzoílo (160,2 mg, 1 mmol) en 1,2-dicloroetano de calidad para HPLC (2,0 ml) en un matraz volumétrico de 2,0 ml. Se preparó una tercera disolución de trietilamina (2,0 ml de 0,5 M) en 1,2-dicloroetano de calidad para HPLC. De cada disolución se pipeteó una alícuota de 100 ml en un recipiente de reacción de vidrio usando un dosificador de líquido automatizado Beckman Biomet 2000. La mezcla de reacción se agitó usando un agitador mecánico, se sonicó en un baño ultrasónico de agua y entonces se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó en CHCl_{3} (300 ml) y se lavó con NaHCO_{3} acuoso al 5% y agua. El disolvente se eliminó a vacío para proporcionar el compuesto 6 (65%). La pureza del compuesto se analizó mediante CCF eluida con CH_{2}Cl_{2}-etanol-NH_{3} acuoso concentrado, 100:10:1.

Ejemplos de referencia 2 y 3

Síntesis de compuestos de fórmula general 1d

3

Todos los disolventes anhidros se adquirieron de Aldrich Chemical Company en envases SureSeal®. La mayoría de los reactivos se adquirieron de Aldrich Chemical Company. Abreviaturas: DCM, diclorometano; DIEA, N,N-diisopropiletilamina; DMF, N,N-dimetilformamida; TES, trietilsilano; TFA, ácido trifluoroacético. La síntesis de matriz se condujo en viales de tapa roscada de fondo redondo de vidrio de 15 x 75 mm contenidos en un bloque de síntesis de aluminio de matriz 4 x 6, sellados con una membrana de goma cubierta con teflón. Se añadieron los reactivos y las extracciones acuosas se realizaron con pipetas individuales o multicanal. Las filtraciones se realizaron usando bloques de filtración de 10 ml de 24 pocillos de Whatman/Polyfiltronics. La evaporación de materiales volátiles de la matriz se realizó con un evaporador de vórtice Labconco o barriendo con un distribuidor de nitrógeno 4 x 6.

Ejemplo de referencia 2

Síntesis en fase sólida de un compuesto individual

Etapa 1

Se pesó resina de 1,3-diaminopropanotritilo (Novabiochem, 1,2 mmol/g) (0,20 g, 0,24 mmol) en un vial de tapa roscada y se añadieron 3 ml de una mezcla 1:1 de DMF y cloroformo. Se añadieron DIEA (0,130 ml, 0,72 mmol) y 2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolin-4-ona (del ejemplo 1) (0,188 g, 0,48 mmol). El vial se selló, se calentó hasta 70ºC y se agitó durante la noche. La resina se filtró y se lavó (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x éter) y se secó a vacío. Una alícuota de 27 mg de resina se trató con TFA:TES:DCM 5:5:90 durante 15 min y la mezcla se filtró y evaporó, dando como resultado 8 mg (rendimiento del 64%) del producto intermedio de quinazolinona-diamina. Los análisis de LCMS mostraron una pureza >80%.

Etapa 2

La resina de la etapa 1 se hinchó en 3 ml de DCM. Se añadieron DIEA (0,130 ml, 0,72 mmol) y bromuro de 4-bromobencilo (0,12 g, 0,48 mmol). El vial se selló y se agitó durante la noche. Los análisis de LCMS de una alícuota separada revelaron una mezcla de aproximadamente 1:1 de material de partida y producto. Se añadieron otros 0,130 ml de DIEA y 0,12 g de bromuro de 4-bromobencilo y la mezcla se agitó a 70ºC durante 8 h. La resina se filtró, se lavó (como anteriormente) y se secó a vacío.

Etapa 3

La resina de la etapa 2 se agitó dos veces durante 30 min con TFA:TES:DCM 5:5:90 y se filtró. Los filtrados se combinaron y evaporaron, dando 140 mg de un aceite naranja. Este material se purificó por HPLC preparativa en fase inversa (gradiente de acetonitrilo-agua) para proporcionar 27 mg (17% durante 3 etapas) de la sal de mono-TFA.

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Ejemplo de referencia 3

Síntesis combinatoria de múltiples compuestos

Etapa 1

Se colocaron resina de 1,2-diaminoetanotritilo (Novabiochem, 0,95 mmol/g) (200 g, 1,9 mmol) y resina de 1,3-diaminopropanotritilo (Novabiochem, 1,14 mmol/g) (2,0 g, 2,28 mmol) cada una en diferentes tubos de placa porosa de polipropileno de 10 ml (Bio-Rad). A cada uno se añadieron 4 ml de DMF, 4 ml de cloroformo, 3 eq de DIEA (1,0 ml y 1,2 ml, respectivamente) y 2 eq de 2-(1'-bromopropil)-3-bencilquinazolin-4-ona (del ejemplo 1) (1,5 g y 1,8 g, respectivamente). Las mezclas se agitaron a 70ºC durante la noche. Cada mezcla se lavó (3 x DCM, 2 x MeOH, 1 x DCM, 2 x éter) y se secó a vacío. El análisis de una alícuota separada reveló la presencia de la quinazolinona-diamina apropiada para cada una en una pureza >90%.

Etapa 2

La resina de quinazolinona-etildiamina (105 mg, 0,10 mmol) se colocó en cada uno de los viales en las 2 primeras filas de la matriz y la resina de quinazolinona-propildiamina (88 mg, 0,10 mmol) se colocó en cada vial de las 2 últimas filas de la matriz. A cada vial se añadió DIEA (0,131 ml, 0,75 mmol). En cada vial de las 2 primeras filas de la matriz se añadió una amina diferente y las adiciones se repitieron para las dos últimas filas de la matriz. El bloque de reacción se agitó a 70ºC durante la noche. Se eliminó el líquido de cada vial mediante una pipeta multicanal usando puntas para pocillos de gel de punta fina y las resinas se lavaron (2 x DCM, 1 x MeOH, 1 x DCM) y se secaron a
vacío.

Etapa 3

A cada vial de la matriz se añadieron 2 ml de una disolución TFA:TES:DCM 10:5:85. El bloque de reacción se agitó durante 45 min y las mezclas se transfirieron a un bloque de filtración, se filtraron y se lavaron dos veces con 0,75 ml de DCM. Las disoluciones se evaporaron para dar aceites de amarillentos a rojizos. Estos aceites densos se trituraron dos veces con éter, se disolvieron en DCM y se trataron con HCl 4 M en dioxano para proporcionar las sales de HCl (número desconocido de sales por compuesto) como sólidos pulverulentos o amorfos de tostados a blancos. El análisis por LCMS mostró que todos eran puros >75%.

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Ejemplos 4-6

Se separaron seis quinazolinonas racémicas en sus enantiómeros mediante cromatografía quiral. A continuación se describe la cromatografía quiral de tres de estos compuestos:

Ejemplo 4

4

Columna - Quiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Muestra - 0,5 mg/ml en EtOH. Condiciones - 15 min a EtOH al 60% en hexano, el enantiómero 1 eluye a 4,5 min, el enantiómero 2 eluye a 4,9 min.

Ejemplo de referencia 5

5

Columna - Quiralcel OJ, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Muestra - 0,5 mg/ml en EtOH. Condiciones - 15 min a EtOH al 10% en hexano, el enantiómero (R) eluye a 8,4 min, el enantiómero (S) eluye a 9,6 min.

Ejemplo de referencia 6

6

Columna - Quiralpak AD, 250 x 4,6 mm (Diacel Inc.). Muestra - 0,5 mg/ml en EtOH. Condiciones - 15 min a EtOH al 70% en hexano, el enantiómero 1 eluye a 6,5 min, el enantiómero 2 eluye a 8,8 min.

La tabla de a continuación representa la actividad de CI_{50} del racemato y los enantiómeros de otros tres compuestos de referencia separados como antes. En los tres casos, un enantiómero era significativamente más potente que los otros. Mediante síntesis quiral independiente parece que el enantiómero más activo es el enantiómero R.

7

Ejemplos de referencia 7 y 8

Los dos compuestos siguientes se sintetizaron como enantiómeros individuales por la ruta mostrada en la figura 4. Los datos indican que el enantiómero más activo es el enantiómero R.

8

Ejemplo de referencia 9

Resolución quiral mediante recristalización con ácido tartárico

El producto intermedio A, preparado en el ejemplo 1, puede convertirse en un producto intermedio B que, con resolución, proporciona una alternativa a las cinco primeras etapas mostradas en la figura 3. El procedimiento se muestra en el esquema de a continuación:

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9

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El enantiómero R de B puede cristalizarse selectivamente calentando una mezcla de B con 1,1 equivalentes de ácido D-tartárico en una mezcla de isopropanol y metanol y entonces permitir que la mezcla vuelva hasta la temperatura ambiente.

Ejemplo de referencia 9: X = Cl, R = H

Se mezcló el producto intermedio racémico B (1,5 g), disuelto en 100 ml de isopropanol en ebullición, con 0,8 g de ácido D-tartárico en 100 ml de metanol en ebullición. Se permitió que la mezcla alcanzara lentamente la temperatura ambiente. Después de permanecer durante la noche, el sólido se eliminó por filtración y se aclaró con acetato de etilo y hexanos, y se permitió que se secara al aire. Entonces, el sólido secado (0,8 g) se disolvió en una mezcla en ebullición de 50 ml de isopropanol y 50 ml de metanol y se permitió que se enfriara lentamente hasta temperatura ambiente. Después de permanecer durante la noche, el sólido resultante se eliminó por filtración y se aclaró con acetato de etilo y hexanos, y se permitió que se secara al aire. Entonces, el sólido secado se agitó con bicarbonato sódico saturado durante 30 min y se extrajo con acetato de etilo. Las fases orgánicas se secaron (MgSO_{4}), se filtraron y se evaporaron hasta sequedad. El aceite transparente resultante pesó 345 mg. La pureza quiral de >95% se determinó mediante conversión de una parte a la amida de S-Mosher y reconocimiento del producto por RMN ^{1}H. Los compuestos enantioméricamente puros de a continuación se prepararon, según las etapas restantes en la figura 4, a partir de material resultante del procedimiento descrito anteriormente usando tanto ácido D- como L-tartárico.

10

Ejemplo 10 Inducción de detención mitótica en poblaciones celulares tratadas con un inhibidor de la KSP de quinazolinona

Se realizó el análisis de FACS para determinar la fase de ciclo celular midiendo el contenido de ADN del siguiente modo. Se fraccionaron 1:10 células de Skov-3 (cáncer ovárico humano) para sembrarlas en placas de 10 cm y crecieron hasta subconfluencia con medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 5% (SBF). Entonces, las células se trataron con o paclitaxel 10 nM, quinazolinona 1 400 nM, quinazolinona 2 200 nM o DMSO al 0,25% (vehículo para compuestos) durante 24 horas. Entonces, las células se enjuagaron de las placas con PBS que contenía EDTA 5 nM, se sedimentaron, se lavaron una vez en PBS que contenía SBF al 1% y entonces se fijaron durante la noche en etanol al 85% a 4ºC. Antes del análisis, las células se sedimentaron, se lavaron una vez y se tiñeron en una disolución de 10 \mug de yoduro de propidio y 250 \mug de ribonucleasa (ARNasa) A por mililitro a 37ºC durante media hora. El análisis de citometría de flujo se realizó en un FACScan de Becton-Dickinson y se analizaron datos de 10.000 células por muestra con el sofware Modfit.

Los compuestos quinazolinona, además del conocido agente antimitótico paclitaxel, produjeron un desplazamiento en la población de células de una fase del ciclo celular G0/G1 (contenido de 2n ADN) a una fase del ciclo celular G2/M (contenido de 4n ADN). Se encontró que otros compuestos de esta clase tenían efectos similares.

Formación de husos monopolares tras la aplicación de un inhibidor de la KPS de quinazolinona

Para determinar la naturaleza de la acumulación de G2/M se sembraron líneas celulares de tumor humano Skov-3 (ovárico), HeLa (cervical) y A549 (pulmonar) en placas de 96 pocillos a densidades de 4.000 células por pocillo (SKOV-3 y HeLa) o 8.000 células por pocillo (A549), se permitió que se adhirieran durante 24 horas y se trataron con diversas concentraciones de los compuestos de quinazolinona durante 24 horas. Las células se fijaron en formaldehído al 4% y se tiñeron con anticuerpos antitubulina (posteriormente se reconocieron usando anticuerpo secundario marcado fluorescentemente) y tinte de Hoechst (que tiñe ADN).

La inspección visual reveló que los compuestos quinazolinona produjeron detención del ciclo celular en la fase de prometafase de la mitosis. El ADN se condensó y se había iniciado la formación de husos, pero las células detenidas presentaron uniformemente husos monopolares, indicando que había una inhibición de la separación del cuerpo del polo del huso. La microinyección de anticuerpos anti-KSP también produce detención mitótica con células detenidas que presentan husos monopolares.

Inhibición de la proliferación celular en líneas celulares de tumores tratadas con inhibidores de la KPS de quinazolinona

Se sembraron células en placas de 96 pocillos a densidades de 1000-2500 células/pocillo de una placa de 96 pocillos (dependiendo de la línea celular) y se permitió que se adhirieran/crecieran durante 24 horas. Entonces se trataron con diversas concentraciones de fármaco durante 48 horas. El tiempo al que los compuestos se añadieron se considera T_{0}. Se usó un ensayo basado en tetrazolio usando el reactivo 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) (I.S> número de patente 5.185.450) (véase el catálogo de productos Promega nº G3580, CeIlTiter 96® AQ_{ueous} One Solution Cell Proliferation Assay) para determinar el número de células viables a T_{0} y el número de células restantes después de 48 horas de exposición del compuesto. El número de células restantes después de 48 horas se comparó con el número de células viables en el momento de la adición del fármaco, permitiendo el cálculo de la inhibición del crecimiento.

El crecimiento por encima de 48 horas de células en pocillos control que sólo se habían tratado con vehículo (DMSO al 0,25%) se considera crecimiento al 100% y con éste se compara el crecimiento de células en pocillos con compuestos. Los inhibidores de la KSP de quinazolinona inhibieron la proliferación celular en líneas celulares de tumores humanos de los siguientes tipos de tumores: pulmón (NCI-H460, A549), mama (MDA-MB-231, MCF-7, MCF-7/ADR-RES), colon (HT29, HCT15), ovárico (SKOV-3, OVCAR-3), leucemia (HL-60(TB), K-562), sistema nervioso central (SF-268), renal (A498), osteosarcoma (U2-OS) y cervical (HeLa). Además, también se inhibió el crecimiento de una línea tumoral de ratón (B16, melanoma) en presencia de los compuestos de quinazolinona.

Se calculó una CI_{50} representando la concentración de compuesto en \muM frente al porcentaje de crecimiento celular del crecimiento celular en pocillos tratados. La CI_{50} calculada para los compuestos es la concentración estimada a la que se inhibe el crecimiento al 50% comparado con el control, es decir, la concentración a la que:

100 \times [(Tratado_{48} - T_{0}) / (Control_{48} - T_{0})] = 50

Todas las concentraciones de compuestos se prueban por duplicado y los controles se promedian sobre 12 pocillos. El Instituto nacional del cáncer (véase Monks y col., J. Natl. Cancer Inst. 83:757-766 (1991)) usa un diagrama muy similar de placa de 96 pocillos y esquema de cálculo de CI_{50}. Sin embargo, el procedimiento por el que el Instituto nacional del cáncer cuantifica el número de células no usa MTS, pero en su lugar emplea procedimientos alternativos.

Cálculo de CI_{50}:

La medición de una CI_{50} de composición para la actividad de la KSP usa un ensayo de ATPasa. Se usan las siguientes disoluciones: la disolución 1 está constituida por sal potásica de fosfoenolpiruvato 3 mM (Sigma P-7127), ATP 2 mM (Sigma A-3377), IDTT 1 mM (Sigma D-9779), paclitaxel 5 \muM (Sigma T-7402), 10 ppm de antifoam 289 (Sigma A-8436), Pipes 25 mM /KOH pH 6,8 (Sigma P6757), MgCl_{2} 2 mM (VWR JT400301) y EGTA 1 mM (Sigma E3889). La disolución 2 está constituida por NADH 1 mM (Sigma N8129), 0,2 mg/ml de BSA (Sigma A7906), 7 U/ml de piruvato cinasa, 10 U/ml de L-lactato deshidrogenasa (Sigma P0294), dominio motor de la KSP 100 nM, 50 \mug/ml de microtúbulos, DTT 1 mM (Sigma D9779), paclitaxel 5 \muM (Sigma T-7402), 10 ppm de antifoam 289 (Sigma A-8436), Pipes 25 mM/KOH pH 6,8 (Sigma P6757), MgCl_{2} 2 mM (VWR JT4003-01) y EGTA 1 mM (Sigma E3889). Las diluciones en serie (8-12 diluciones duplicadas) de la composición se hacen en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Corning Costar 3695) usando la disolución 1. Tras la dilución en serie, cada pocillo tiene 50 \mul de disolución 1. La reacción se inicia mediante la adición de 50 \mul de disolución 2 a cada pocillo. Esto puede hacerse con una pipeta multicanal o manualmente o con dispositivos automatizados de manejo de líquidos. La placa de microtitulación se transfiere entonces a un lector de absorbancia de microplacas y se toman múltiples lecturas de absorbancia a 340 nm para cada pocillo en un modo cinético. Entonces se representó la velocidad de cambio observada, que es proporcional a la velocidad de ATPasa, como una función de la concentración del compuesto. Para una determinación de CI_{50} habitual, los datos adquiridos se ajustan por la siguiente ecuación de cuatro parámetros usando un programa de ajuste no lineal (por ejemplo, Grafit 4):

y = \frac{Intervalo}{1 + \left(\frac{x}{Cl_{50}} \right)^{s}} + Fondo

en la que y es la velocidad observada y x la concentración del compuesto.

Los compuestos de quinazolinona inhiben el crecimiento en una variedad de líneas celulares que incluye líneas celulares (MCF-7/ADR-RES, HCT1 5) que expresan P-glicoproteína (también conocido como resistencia multifármaco o MDR^{+}), que transmite resistencia a otros fármacos quimioterápicos tales como pacilitaxel. Por tanto, las quinazolinonas son antimitóticos que inhiben la proliferación celular y que no están sometidas a resistencia por sobreexpresión de MDR^{+} por líneas tumorales resistentes a fármacos.

Se encontraron otros compuestos de esta clase que inhibían la proliferación celular, aunque variaban los valores de CI_{50}. Los valores de CI_{50} para los compuestos quinazolinona probados oscilaban de 200 nM a mayores que la concentración más alta probada. Esto significa que aunque la mayoría de los compuestos que inhibían la actividad de la KSP inhibieron bioquímicamente la proliferación celular, para algunos en la concentración más alta probada (generalmente aproximadamente 20 \muM), el crecimiento celular se inhibió menos del 50%. Muchos de los compuestos tienen valores de CI_{50} inferiores a 10 \muM y varios tienen valores de CI_{50} inferiores a 1 \muM. Los compuestos antiproliferativos que se han administrado satisfactoriamente en la clínica para el tratamiento de cáncer (quimioterápicos de cáncer) tienen CI_{50} que varían enormemente. Por ejemplo, en células A549, CI_{50} de paclitaxel es 4 nM, doxorubicina es 63 nM, 5-fluorouracilo es 1 \muM e hidroxiurea es 500 \muM (datos proporcionados por el Instituto nacional del cáncer, programa terapéutico del desarrollo, http://dtp.nci.nih.gov/). Por tanto, pueden ser útiles los compuestos que inhiben la proliferación celular en prácticamente cualquier concentración. Sin embargo, preferentemente, los compuestos tendrán valores de CI_{50} inferiores a 1 mM. Más preferentemente, los compuestos tendrán valores de CI_{50} inferiores a 20 \muM. Incluso más preferentemente, los compuestos tendrán valores de CI_{50} inferiores a 10 \muM. También puede ser deseable la reducción adicional en los valores de CI_{50}, que incluye compuestos con valores de CI_{50} inferiores a 1 \muM. Algunos de los compuestos quinazolinona de la invención inhiben la proliferación celular con valores de CI_{50} de inferiores a 200 nM a inferiores a 10 nM.

Ejemplo 11

Se implantaron subcutáneamente mediante trocar fragmentos de carcinomas de tumores humanos cosechados de tumores de crecimiento subcutáneo en huésped de ratón atímico en ratones atímicos hembra que pesaban aproximadamente 20 g. Cuando los tumores eran de aproximadamente 77 mg de tamaño, los animales formaron parejas en grupos tratamiento y de control. Cada grupo contenía 8 ratones con tumor, cada uno de los cuales estaba etiquetado en la oreja y se siguió individualmente a lo largo del experimento. Las dosis iniciales (10 ml/kg de un tampón de citrato 66 mM, pH 5,0/solución salina al 0,9%/formulación de Tween 80 al 10% de cada compuesto de prueba que tiene una concentración máxima de 5 mg/ml) se administraron en el día 1 tras la formación de parejas, dosificando a los niveles y programas indicados.

Los ratones se pesaron dos veces a la semana y las mediciones del tumor se tomaron dos veces a la semana mediante calibradores, empezando en el día 1. Estas mediciones del tumor se convirtieron en mg de peso de tumor mediante una fórmula bien conocida, W^{2} x L/2. El experimento se terminó cuando el tamaño del tumor del grupo de control alcanzó un promedio de 1 gramo. Con la finalización, los ratones se pesaron, se sacrificaron y se quitaron sus tumores. Se pesaron los tumores y se calculó el peso medio de tumor tratado por grupo. En este modelo, el cambio en el peso medio de tumor tratado/el cambio en el peso medio de tumor de control x 100% (\DeltaT/\DeltaC) se restó del 100% para dar la inhibición del crecimiento del tumor (ICT) para cada grupo.

Los compuestos de referencia 1-5 (a continuación) se probaron por el procedimiento anteriormente descrito, dando los resultados resumidos a continuación en las tablas A - D. Otros compuestos de la presente invención muestran actividades comparables cuando se prueban por este procedimiento.

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TABLA A

Xenoinjerto de tumor SKOV3
	Vehículo	Compuesto de	Taxol
		referencia 1
Dosis y programa	Diariamente x 5	80 mg/kg cada 3	20 mg/kg
		días x 4	diariamente x 5
Vía	intravenosa	intravenosa	intraperitoneal
Nº de ratones al principio	8	8	8
Peso final del tumor (media \pm EEM)	904,1 \pm 126,5	554,3 \pm 76,8	90,4 \pm 36,0
Inhibición del crecimiento del tumor	- -	41,5%	91,7%
Ratones con disminución parcial del tumor	0	0	4
Disminución del tumor en % medio	- -	- -	27,9%
Máxima pérdida de peso	Ninguna	Ninguna	16,5%
Mortalidades	0	1	0

TABLA B

Xenoinjerto de tumor SKOV3
	Vehículo	Compuesto de	Compuesto de	Taxol
		referencia 2	referencia 3
Dosis y programa	Diariamente x 5	50 mg/kg cada 3	60 mg/kg diariamente	20 mg/kg diariamente
		días x 4	x 5	x 5
Vía	intravenosa	intravenosa	intravenosa	intraperitoneal
Nº de ratones al principio	8	8	8	8
Peso final del tumor	1506,3 \pm 227,1	340,8 \pm 93,0	806,1 \pm 163,8	55,9 \pm 29,4
(media \pm EEM)
Inhibición del crecimiento	- -	81,5%	48,3%	99,7%
del tumor
Ratones con disminución	0	0	0	7
parcial del tumor
Disminución del tumor	- -	- -	- -	43,5%
en % medio
Máxima pérdida de peso	Ninguna	Ninguna	2,76%	7,49%
Mortalidades	0	0	1	0

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TABLA C

Xenoinjerto de tumor SKOV3
	Vehículo	Compuesto de	Taxol
		referencia 4
Dosis y programa	Diariamente x 5	4 mg/kg semanalmente	20 mg/kg diariamente
		x 3	x 5
Vía	intravenosa	intravenosa	intraperitoneal
Nº de ratones al principio	8	8	8
Peso final del tumor (media \pm EEM)	1191,1 \pm 239,6	726,9 \pm 147,2	90,6 \pm 34,5
Inhibición del crecimiento del tumor	- -	40,1%	87,1%
Ratones con disminución parcial del tumor	0	0	4
Disminución del tumor en % medio	- -	- -	44,4%
Máxima pérdida de peso	Ninguna	0,02%	12,26%
Mortalidades	1	1	1

TABLA D

Xenoinjerto de tumor SKOV3
	Vehículo	Compuesto de	Taxol
		referencia 5
Dosis y programa	Diariamente x 5	25 mg/kg diariamente	20 mg/kg
		x 5	diariamente x 5
Vía	intravenosa	intravenosa	intraperitoneal
Nº de ratones al principio	8	8	8
Peso final del tumor (media \pm EEM)	1230,4 \pm 227,3	405,6 \pm 124,8	379,0 \pm 154,0
Inhibición del crecimiento del tumor	- -	71,0%	73,0%
Ratones con disminución parcial del tumor	0	1	0
Disminución del tumor en % medio	- -	56,3%	- -
Máxima pérdida de peso	Ninguna	Ninguna	8,77%
Mortalidades	0	0	0

Claims

1. Un compuesto de fórmula:

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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

2. Un compuesto o sal según la reivindicación 1 en forma de un isómero R óptico sustancialmente puro.

3. Un compuesto o sal según las reivindicaciones 1 ó 2 en el que R_{1} es un grupo bencilo.

4. Un compuesto o sal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en el que R_{2} es cloro.

5. El compuesto o sal según la reivindicación 1 en el que R_{1} es un grupo bencilo; R_{2} es cloro; y R_{3} es un grupo 4-metilfenilo.

6. El compuesto o sal según la reivindicación 5 en forma de un isómero R óptico sustancialmente puro.

7. Procedimiento in vitro para inhibir la cinesina de KSP que comprende poner en contacto la cinesina de KSP con un compuesto o sal según cualquier reivindicación precedente.

8. Un compuesto o sal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso como un medicamento.

9. El compuesto o sal según la reivindicación 6 para uso como un medicamento.

10. El uso, en la fabricación de un medicamento para tratar enfermedad proliferativa celular, de un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. El uso según la reivindicación 10, en el que la enfermedad es cáncer, hiperplasia, reestenosis, hipertrofia cardiaca, trastorno inmunológico o inflamación.

12. El uso según la reivindicación 11 para el tratamiento de cáncer de un compuesto o sal según la reivindicación 5 ó 6.

13. Una composición farmacéutica que comprende un compuesto o sal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un vehículo para el mismo.