CZ293421B6 - Ve vodě rozpustný C-kruhový analog 20(S)-kamptothecinu, způsob jeho přípravy a použití a farmaceutický prostředek s jeho obsahem - Google Patents

Abstract

Jsou popsány nové, ve vodě rozpustné C-kruhové analogy 20(S)-kamptothecinu obecného vzorce 1, které vykazují silné protirakovinové a protivirové účinky. Tyto sloučeniny se připravují ze sloučenin obecného vzorce 2 obsahujících 20(S)-chirální uhlík v několika krocích. Sloučeniny obecného vzorce 1 nacházejí použití pro léčení rakovin, leukémie a stavů vztahujících se k HIV. Jsou také popsány farmaceutické prostředky, které takovou sloučeninu obsahují jako účinnou látku.ŕ

Description

Tento vynález se týká nových, ve vodě rozpustných C-kruhových analogů 20(S)-kamptothecinu, způsobu jejich přípravy v několika krocích, použití pro léčení rakovin, leukémie a stavů vztahujících se kHIV, jakož i farmaceutického prostředku, který takovou sloučeninu obsahuje jako účinnou látku.

Dosavadní stav techniky

Kamptothecin mající vzorec 3

(3) je alkaloid se silnou protinádorovou aktivitou, který byl izolován z Camptotheca acuminata Wallem a kol. v roce 1996. Avšak jeho vývoj jako potenciálního léku pro léčbu rakoviny byl opuštěn následkem nepřijatelných vedlejších účinků u lidí a následkem problémů sjeho nízkou rozpustností ve vodě i vysokou toxicitou. Od nalezení mechanismu jeho působení jako inhibitoru topoizomerázy I autory Liu a kol. v roce 1985 [L. F. Liu a kol., J. Biol. Chem., 260, 14873 (1985)] byl zájem o výzkum kamptothecinu opět obnoven.

Pro překonání problému nízké rozpustnosti ve vodě a vysoké toxicity kamptothecinu několik výzkumných skupin po celém světě připravovalo a zkoumalo během posledních 20 let řadu kamptothecinových analogů včetně modifikace kruhů A až E nebo zavedení různých substituentů na všech pět kruhů kamptothecinu vzorce 3 [Μ. E. Wall a kol., J. Med. Chem., 36, 2689 (1993), R. P. Hertzberg a kol., J. Med. Chem., 715 (1989), S. W. Sawada a kol., Chem. Pharm. Bull., 41(2), 310 (1993)]. Z různých dosud připravených analogů kamptothecinu byly pouze dva, jmenovitě CPT-11 mající vzorec 4 [Chem. Pharm. Bull., 39,1446 (1991)]

-1 CZ 293421 B6 a topotekan vzorce 5 [J. Med. Chem., 34.98 (1991)]

nedávno uvedeny na trh jako léky proti rakovině. Jiná sloučenina, jmenovitě 9-aniino kamptothecin vzorce 6 [J. Med. Chem., 29, 2358 (1986)]

(6) je v současné době předmětem rozsáhlých klinických zkoušek. Široce studovaný „vzrah mezi strukturou a aktivitou“ (SAR) pro kamptothecin vzorce 3 [Μ. E. Wall a kol., J. Med. Chem., 36, 2689 (1993)] ukázal, že pro aktivitu kamptothecinu je zásadní 20(S)-a-hydroxy-6-laktonový (E-kruhový) zbytek. Avšak podle nedávných zpráv Ejimy a kol. náhrada hydroxylové skupiny ío aminoskupinou v poloze C-20 vedoucí ke sloučenině, jako je 7-ethyl-10-methoxykamptothecinový derivát vzorce 7 [A. Ejima a kol., Chem. Pharm. Bull., 40(3), 683 (1992)]

-2CZ 293421 B6

vykazoval zvýšenou protinádorovou aktivitu in vivo oproti 20(RS)-kamptothecinu vzorce 8. Také v další zprávě [Lawrence Snyder a kol., J. Org. Chem., 59, 7033 (1994)] vykazoval 18-noranhydrokamptothecinový analog vzorce 9

(9) mohutnou inhibici aktivity topoizomerázy I podobnou účinkům kamptothecinu. Obě tyto zprávy jsou v rozporu s předpokladem, že základem biologické aktivity kamptothecinu je jeho funkční 20(S)-a-hydroxylová skupina.

Na základě vztahů mezi strukturou a aktivitou obdržených pro kamptothecinové analogy připravené v literatuře bylo zjištěno, že modifikace substituentů v poloze C-9 a C-7 kamptothecinu vzorce 3 hraje důležitou úlohu při zvyšování protirakovinové aktivity propůjčením stability E kruhovému laktonu [T. G. Burker a kol., J. Med. Chem., 37, 40 (1994)]. Bylo též zjištěno, že otevřená forma laktonového zbytku, jmenovitě „karboxylátová forma“, je terapeuticky méně účinná než uzavřená „laktonová forma“ [Hertzberg a kol., J. Med. Chem., 32, 715 (1989), J. M. Covey, C. Jaxel a kol., Cancer Research, 49, 5016 (1989)], Giovanella a kol., Cancer Research, 51, 3052 (1991)]. Nedávné studie T. G. Burkeho a kol. o stabilitě „uzavřené laktonové formy“ různých kamptothecinových analogů v přítomnosti proteinu zvané „lidský sérumalbumin“ (HSA) ukazují, že sloučeniny, jako je CPT-11 vzorce 4 a 7—ethyl—10-hydroxykamptothecin (SN-38) vzorce 7a

(7a) a topotekan vzorce 5, vykazují v přítomnosti HSA při 37 °C vyšší procento (%) laktonové formy v rovnovážném stavu než 20(S)-kamptothecin vzorce 3 a 9-aminokamptothecin vzorce 6

-3CZ 293421 B6 [T. G. Burke a Mi. Zihou, J. Med. Chem. 37, 40 (1994), tamtéž, Biochemistry, 33, 12540 (1994)]. Na základě těchto studií se zjistilo, že pochopení faktorů ovlivňujících rovnováhu lakton-karboxylát analogů kamptothecinu se stalo důležitým určujícím faktorem při navrhování nových a terapeuticky účinných kandidátů na léky kamptothecinové řady.

I když modifikace substituentů na kruzích A a B kamptothecinu byla nastoupena s rychlým tempem k vytváření nových CPT analogů, byly C-kruhové analogy kamptothecinů omezeny pravděpodobně vzhledem k výzkumné práci provedené Sawadou a kol., kteří uvádějí, že substituenty v poloze kamptothecinu C-5 vedou ke snížení protinádorové aktivity kamptothecinů a poskytují neaktivní analogy [Sawada S. a kol., Chem. Pharm. Bull., 39(10), 2574 (1991)]. C-5 substituované kamptotheciny nárokované Sawadou a kol. (JP 58 154 584, US 4 513 138, US 4 473 692, US 4 545 880, US 4 339 282) mají strukturní vzorec 10

ve kterém

R je hydroxy lová skupina, nižší alkylová skupina, nižší alkoxyskupina nebo acyloxyskupina, _

R¹ je atom vodíku, methoxyskupina v poloze 9, atom vodíku, hydroxylová skupina, nižší alkoxyskupina, acyloxyskupina, merkaptoskupina, thioalkylová skupina, thioacylová skupina, nitroskupina, aminoskupina, alkylaminoskupina, acvlaminoskupina a atom halogenu v poloze 10 a

R^x je atom vodíku, nižší alkylová skupina, nižší aralkylová skupina, -CH2OH, -COOH, -COOMe, -CH₂OR, kde R je nižší alkylová skupina nebo acylová skupina.

Nedávné nálezy', které zveřejnil K. H. Lee a kol. [Bio. Org. Med. Chem. Lett., 5(1), 77 (1995)], zahrnující přípravu 5-hydroxymethylkamptothecinu reakcí formaldehydu v N,N-dimethylformamidu a 4-piperidinopiperidinu na 20(S)-kamptothecinu ukázaly sníženou protinádorovou aktivitu těchto látek. Danishefsky a kol. rovněž připravili některé z C-5 substituovaných 20(RS)kamptothecinových derivátů plně syntetickým způsobem [US 5 391 745 a US 5 446 047].

Avšak synteticky připravený 5-substituovaný kamptothecinový derivát vzorce 11 [Terasawa a kol., Heterocycles, 38, 81 (1994)] nárokoval protinádorovou aktivitu srovnatelnou s aktivitou 20(S)-kamptothecinu.

-4CZ 293421 B6

(11)

Při úvaze všech těchto faktorů původci tohoto řešení zaměřili své studium na 20(S)-kamptothecin s důrazem na návrh nových kamptothecinových analogů, které mohou vykazovat zlepšenou rozpustnost ve vodě a zlepšenou stabilitu laktonové formy v roztoku. Identifikovali pro tento účel oxidativní reakci v alkoholických rozpouštědlech. Výsledné nálezy vyvrcholily objevem nové syntetické transformace, která, může zavést řadu alkoxyskupin v poloze C-5 20(S)-kamptothecinů. Transformace funkčních skupin těchto 5-alkoxykamptothecinů poskytla řadu nových C-5 substituovaných analogů 20(S)-kamptothecinu vzorce 14

ve kterém

X je -NH- nebo -NR- a -CH?- nebo -CHR- a

R⁶ má výše popsaný význam, což je předmětem spisu US 5 972 955 (Atty Docket č. U 011025-3) a US 6 214 836 (Atty Docket č.U 011026-1).

Odtud tento objev vedl ke snadnému a přizpůsobivému semisyntetickému způsobu, při kterém lze v podstatě každý kamptothecinový derivát známý z literatury transformovat na řadu C-5 substituovaných kamptothecinových analogů. Proto tento vynález zajišťuje nový postup pro přípravu různých C-5 substituovaných derivátů 20(S)-kamptothecinu se vzorcem, ve kterém R⁶ má výše popsaný význam. Jako výsledek tohoto vynálezu byl také do kamptothecinů obecného vzorce 2 zaveden druhý střed chirality v poloze C-5 bez narušení přítomné 20-hydroxylové skupiny, středu chirality C-20(S). Dále vedlo velké množství substituentů představovaných OR⁶ na uhlíku C-5 20(S)-kamptothecinů vzorce 1 ke sloučenině se zlepšenou rozpustností ve vodě od 1 do 10 mg na ml. Všechny tyto sloučeniny připravené podle tohoto vynálezu vykazovaly význačnou protinádorovou aktivitu in vitro proti širokému rozmezí buněčných linií lidských nádorů.

-5CZ 293421 B6

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je sloučenina obecného vzorce 1

ve kterém

R¹, R², R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo představují skupinu zvolenou z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 8 atorny uhlíku, nitroskupiny nebo substituované aminoskupiny, kde aminoskupina je monosubstituována nebo disubstituována a kde substituent je zvolen z alkylové skupiny s 1 až 8 atomy uhlíku nebo substituované alkylové skupiny s 1 až 8 atomy uhlíku, přičemž tyto substituenty jsou zvoleny z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 8 atomy uhlíku a alkylaminoskupiny s 1 až 8 atomy uhlíku,

R⁵ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

R⁶ znamená substituovanou alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, kde substituent je zvolen z atomu halogenu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 8 atomy uhlíku nebo aminoskupiny, kde aminoskupina může být nesubstituována nebo monosubstituována či disubstituována, přičemž substituent je zvolen z hydroxyskupiny nebo alkylové skupiny s 1 až 8 atomy uhlíku, přičemž když aminoskupina je disubstituována, substituenty jsou nezávislé nebo kombinované dohromady za vzniku cyklického kruhu obsahujícího 6 atomů v kruhu, přičemž atomy kruhy jsou atomy uhlíku a atom dusíku, nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

Předmětem tohoto vynálezu dále je farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje účinné množství svrchu vymezené sloučeniny obecného vzorce 1 nebo její farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelnou netoxickou pomocnou látkou, zřeďovadlo nebo rozpouštědlo.

Předmětem tohoto vynálezu také je použití sloučeniny obecného vzorce 1 vymezené výše pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny, leukémie a stavů vztahujících se k HIV a sloučenina obecného vzorce 1 jako taková, pro léčení rakovin, leukémie a stavů vztahujících se k HIV.

Předmětem tohoto vynálezu konečně je způsob přípravy sloučeniny vzorce 1, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje tyto kroky:

-6CZ 293421 B6 (i) reakce sloučeniny obecného vzorce 2

ve kterém

R¹ až R⁵ mají význam popsaný svrchu, v přítomnosti kyseliny, která je zvolena z anorganických kyselin a Lewisových kyselin, a železité soli se sloučeninou obecného vzorce o R⁶'-OH, ve kterém

R⁶' znamená alkylovou skupinu s 1 až 8 atoiny uhlíku nebo hydioxyalkylovou skupinu, za vzniku sloučeniny obecného vzorce 12

a sloučeniny obecného vzorce 13

(13)_z ve kterých

R¹, R, R³, R⁴ a R⁵ mají význam uvedený svrchu, a podle potřeby (ii) oddělení sloučenin obecných vzorců 12 a 13 připravených v kroku (i), podle potřeby (iii) hydrolýzy sloučeniny obecného vzorce 12 k získání přídavných množství sloučeniny obecného vzorce 13, podle potřeby (iv) reakce sloučeniny obecného vzorce 13 v přítomnosti kyseliny, která je zvolena z anorganických kyselin, Lewisových kyselin nebo organických kyselin, se sloučeninou obecného vzorce

R⁶-OH, ve kterém

R⁶ má význam uvedený svrchu, za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1

ve kterém

-8CZ 293421 B6

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶ mají význam definovaný svrchu.

Dále je uveden podrobnější popis tohoto vynálezu.

V celém tomto popisu mají termíny představující R¹ až R' v těchto sloučeninách následující definice.

Termín „alkyl“ označuje monovalentní rozvětvený nebo přímý uhlovodíkový řetězec obsahující 1 až 8 atomů uhlíku. Zástupci alkylových skupin jsou methylová, ethylová, propylová, izopropylová, butylová, sekundární butylová, terciární butylová, pentylová, izopentylová, terciární pentylová, hexylová, izohexylová a oktylová skupina.

Termín „halogen“ představuje atom chloru, bromu nebo fluoru. Termín „halogenalkylová“ označuje alkylové skupiny, jak byly definovány výše, substituované halogeny, přednostně fluorem, bromem nebo chlorem. Zástupci halogenalkylových skupin jsou chlorethylová, brompropylová, fluorethylová, trifluorethylová, trichlorethylová a trifluorbutylová skupina.

Termín „alkoxyskupina“ označuje nižší alkylové skupiny, jak byly definovány výše, připojené přes atom kyslíku ke zbytku molekuly. Zástupci těchto skupin jsou methoxyskupina, ethoxyskupina, izopropoxyskupina, rerr-butoxyskupina, hexyloxyskupina, heptyloxyskupina a oktyloxyskupina.

„Aminoskupiny“ mohu být mono- či disubstituované a zástupci substituovaných aminoskupin jsou dimethylaminoskupina, diethylaminoskupina, dibenzylaminoskupina, ethylizopropylaminoskupina, pyrrolidinoskupina, piperidonoskupina, morfolinoskupina nebo piperazinoskupina.

Termín „substituovaná alkylová skupina“ užívaný v tomto vynálezu se vztahuje X těm substituentům, které lze zvolit ze skupin jako je hydroxylová skupina, alkylová skupina, halogenalkylová skupina, fenylová skupina, benzylová skupina, atom halogenu, alkoxyskupina, thioalkoxyskupina, benzyloxyskupina, karboxylová skupina, karbonyloxyskupina, kyanoskupinu, nitroskupina, amidoskupina, aminoskupina a alkylaminoskupina. Příklady takových skupin jsou fluorethylová, chlorpropylová, hydroxyethylová, methoxypropylová, N,N-diethylaminoethylová, N-benzoylaminopropylová, trifluorethoxylová, fenoxyethylová, methoxykarbonylethylová, (p-fluorbenzoyloxy)ethylová, aminopropylová a 2-thioethylová skupina.

Termín „substituovaná aminoskupina“ užívaný v tomto vynálezu se vztahuje k těm substituentům, které lze zvolit ze skupin, jako jsou hydroxylová skupina, alkylová skupina, halogenalkylová skupina, benzylová skupina, benzoylová skupina, alkoxyskupina, karboxylová skupina, amidoskupina, aminoskupina a alkylaminoskupina. Příklady takových skupin jsou Ν,Ν-diethylaminoskupina, N-benzoylaminoskupina, N-methoxyaminoskupina, N-ethoxykarbonylaminoskupina a N-chlorethylaminoskupina. Oba substituenty na aminoskupině mohou být též navzájem spojeny s vytvořením 5- nebo 6-členného pyrrolidinového, piperidinového, piperazinového, morfolinového, imidazolinového nebo thiazolidinového systému.

Termín „nižší“, používaný na některých místech tohoto popisu označuje, že příslušná skupina obsahuje 1 až 8 atomů uhlíku v příslušném řetězci.

-9CZ 293421 B6

Alternativa způsobu přípravy známých C-5 substituovaných sloučenin vzorce 1

ve kterém

R⁶ znamená atom vodíku nebo nižší alkylovou skupinu,

R¹ znamená atom vodíku nebo methoxyskupinu,

R² znamená atom vodíku, hydroxylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, thioalkylovou skupinu, merkaptoskupinu, thioacylovou skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, acylaminoskupinu nebo atom halogenu,

R³ a R⁴ znamenají atom vodíku a

Ř⁵ 'znamená atom vodíku, nižší alkylovou skupinu, nižší aralkylovou skupinu, -CH₂OH, -COOH, -COOMe nebo -ČH₂OR, kde R znamená nižší alkylovou či acylovou skupinu, spočívá ve (i) zreagování sloučeniny obecného vzorce 2

ve kterém

R¹ až R⁵ mají význam popsaný výše, v přítomnosti kyseliny a oxidačního činidla, jako je železitá sůl, se sloučeninou obecného vzorce

R^6,-OH, ve kterém

-10CZ 293421 B6

R⁶' znamená nižší alkylovou skupinu, s obdržením sloučeniny obecného vzorce 12 a sloučeniny obecného vzorce 13

ve kterých

R¹, R², R³, R⁴ a R⁵ mají význam uvedený výše, (ii) oddělení sloučenin obecných vzorců 12 a 13 připravených v kroku (i) konvenčními metodami, (iii) hydrolýzu sloučeniny obecného vzorce 12 konvenčními metodami s obdržením přídavných množství sloučeniny obecného vzorce 13, (iv) zreagování sloučeniny obecného vzorce 13 v přítomnosti kyseliny se sloučeninou obecného vzorce

R⁶-OH, ve kterém

R⁶ znamená nižší alkylovou skupinu, s obdržením sloučeniny obecného vzorce 1, ve kterém

R⁶ znamená nižší alkylovou skupinu,

R¹ znamená atom vodíku nebo methoxyskupinu,

R² znamená atom vodíku nebo hydroxylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, acyloxyskupinu, merkaptoskupinu, thioalkylovou skupinu, thioacylovou skupinu, nitroskupinu, aminoskupinu, alkylaminoskupinu, acylaminoskupinu nebo atom halogenu,

-11 CZ 293421 B6

R³ a R⁴ znamenají atom vodíku a

R⁵ znamená atom vodíku, nižší alkylovou skupinu, nižší aralkylovou skupinu, -CH₂OH, -COOH, -COOMe nebo -CH₂OR, kde R představuje nižší alkylovou či acylovou skupinu.

Způsoby vyvinuté a popsané v tomto vynálezu tvoří nový střed chirality v poloze C-5, ve sloučeninách vzorce 2 bez narušení integrity 20(S)-a-hydroxylového E kruhového laktonového zbytku. Vyvinutý postup se skládá žňového snadného a přizpůsobivého semisyntetického způsobu přípravy C-5 substituovaných známých a nových derivátů kamptothecinu vzorce 1 ze sloučeniny vzorce 2. Sloučeniny vzorce 1 připravená postupem podle tohoto vynálezu tak představuje diastereomery obsahující nově vytvořené centrum chirality C-5. Sloučenina obecného vzorce 1 se skutečně izoluje jako směs diasteromerů 20(S),5(R) a 20(S),5(S). Avšak použitím konvenčních analytických technik byly tyto dva diastereomery rovněž separovány na své jednotlivé opticky čisté složky.

Obecně se mohou veškeré sloučeniny vzorce 1, kde R¹, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶ mají význam vysvětlený výše, syntetizovat ze sloučeniny vzorce 2 postupem popsaným výše a mohou být ilustrovány příklady popsanými v oddílu „Příklady“. Příprava sloučeniny vzorce 12, kde R¹, R². R³, R⁴, R⁵ a R⁶ mají význam uvedený výše, ze sloučeniny vzorce 2, jak bylo uvedeno v kroku (i), je novým způsobem transformace, při kterém se dosahuje přímého zavedení různých typů alkoxysubstituentů do polohy C-5.

20(S)-Kamptothecinové deriváty se substituovaným kruhem A nebo A/B obecného vzorce 2, kde R¹, R², R³, R⁴ a R⁵ mají význam uvedený výše, užívané v tomto vynálezu jako výchozí materiály, jsou v široké míře známy a připraví se podle dřívějších znalostí stavu technik?/ dokumentovaných v literatuře. Například 7-ethylkamptothecin, 10-hydroxykamptothecin, 9-nitrokamptothecin, 12-nitrokamptothecin, 10-hydroxy-7-ethylkamptothecin (SN-38), 9-aminokamptothecin, 9-methoxykamptothecin, 9-hydroxykamptothecin, 9-methoxy-7-ethylkamptothecin, 9-hydroxy-7-ethylkamptothecin, 10,1 -methylendioxykamptothecin, 10,11 -ethylendioxykamptothecin, 10-hydroxy-9-(N,N-dimethylaminomethyl)kamptothecin byly připraveny podle známých způsobů uvedených v literatuře [T. R. Govindachari a kol., Ind. J. Chem., 10 (B), 453 (1972), S. Sawada a kol., Chem. Pharm. Bull., 39 (10) 2574 (1991), tamtéž, 39 (12), 3183 (1991), US patent č. 4 604 463 a US patent č. 4 545 880, Jaffery L. Wood a kol., J. Org. Chem., 60, 5739 (1995)] a byly využity jako výchozí materiály pro přípravu nových C-kruhových substituovaných analogů 20(S)-kamptothecinu obecného vzorce 1 popsaných v tomto vynálezu.

Například sloučenina vzorce 12, kde R¹, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle na sobě identické nebo rozdílné a mají význam uvedený výše, se může připravit, jak je uvedeno v kroku (i), reakcí sloučeniny vzorce 2 se sloučeninou mající vzorec R⁶-OH, kde R⁶ představuje atom vodíku, nižší alkylovou skupinu, nižší alkenylovou skupinu, halogenalkylovou skupinu, hydroxyalkylovou skupinu nebo C3-C7) cykloalkylovou skupinu, v přítomnosti silné kyseliny a železité soli. Kyselina používaná v této reakci se může vybrat z peroxokyselin, kyseliny chloristé, kyseliny chlorovodíkové, kyseliny dusičné, kyseliny sírové nebo z Lewisových kyselin, jako je fluorid boritý, chlorid zinečnatý, chlorid cíničitý a chlorid titaničitý. Železitou sůl použitou ve výše uvedené reakci je možno zvolit ze skupiny zahrnující dusičnan železitý, síran železito amonný a chlorid železitý. Obecně je možno výše uvedenou reakci provést při teplotě v rozmezí od 40 do 150 °C, výhodně mezi 60 až 120 °C.

V kroku (ii) způsobu podle tohoto vynálezu se pro rozdělení směsi sloučenin vzorců 12 a 13, připravených v kroku (i), tato směs podrobí výhodně buď krystalizaci nebo separaci pomocí sloupcové chromatografíe s použitím silikagelu. Směsi rozpouštědel použité ve výše uvedených způsobech mohou obsahovat kombinaci organických rozpouštědel, jako je chloroform, ethylacetát, methanol, ethanol, ether, aceton a hexan.

-12CZ 293421 B6

Sloučenina vzorce 13 se může též obdržet v kroku (iii) postupu podle tohoto vynálezu zpracováním sloučeniny vzorce 12 kyselinami v kombinaci s vodou při teplotě v rozmezí od 40 do 120 °C. Kyseliny použité pro tento účel lze vybrat ze skupiny zahrnující kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu bromovodíkovou, kyselinu sírovou, kyselinu p-toluensulfonovou, kyselinu octovou a kyselinu chloristou. Rozpouštědly použitými v této reakci mohou být methanol, ethanol, butanol, izopropanol nebo 1,4-dioxan.

V kroku (iv) způsobu podle tohoto vynálezu sloučenina vzorce 13 reagovala se sloučeninou vzorce R⁶-OH, kde R⁶ má význam uvedený výše, v přítomnosti kyselého prostředí při teplotě v rozmezí od 20 do 140 °C pro získání sloučeniny vzorce 1. Kyseliny použité v této reakci lze vybrat ze skupiny, kterou tvoří kyselina sírová, kyselina chlorovodíková, kyselina octová, kyselina p-toluensulfonová, kyselina pyridin-p-toluensulfonová, kyselina kamforsulfonová, kyselina methansulfonová, kyselina chloristá nebo Lewisovy kyseliny, jako je chlorid titaničitý, BF₃-etherát a chlorid zinečnatý. Rozpouštědlem použitým v této reakci může být hexan, benzen, toluen, xylen, chloroform, tetrachlormethan, dichlormethan, dichlormethan a 1,4-dioxan.

Tento vynález má tak zvláštní význam při vývoji C-5-substituovaných 20(S)-kamptothecinových derivátů jako nové třídy C-kruhových modifikovaných kamptothecinových analogů, které jsou použitelné jako protinádorové a/nebo protivirové prostředky. Tento vynález má také zvláštní význam vzhledem k tomu, že zde vyvinutá a popsaný postup je značně přizpůsobivý a přístupný pro přípravu kamptothecinových derivátů obecného vzorce 1 ve velkém měřítku.

Způsoby vyvinuté a popsané v tomto vynálezu zajistí přístup k širokému sortimentu C-5 substituovaných C-kruhových analogů majících různé substituenty na kruhu A a B 20(S)— kamptothecinu. Některé z výhodných sloučenin jsou takové, kde R¹ je nitroskupina, aminoskupina, aminoalkylová skupina, hydroxyskupina nebo methoxyskupina, R“ je hydroxylová skupina, karbonyloxyskupina nebo atom halogenu, R² a R³ jsou navzájem spojeny s vytvořením methylendioxyskupiny nebo ethylendioxyskupiny, R⁴ je atom vodíku nebo nitroskupina, R³ je ethylová skupina, aminomethylová skupina nebo substituovaná aminomethylová skupina, R⁶ je 2-hydroxyethylová skupina, alkoxyethylová skupina, chlorethylová skupina, fluorethylová skupina, trifluorethylová skupina nebo aminoethylová skupina či aminopropylová skupina, kde aminoskupina může být dimethylaminoskupinou, diethylaminoskupinou, pyrrolidinovou skupinou, piperidinovou skupinou, morfolinovou skupinou, piperazinovou skupinou nebo imidazolinovou skupinou.

Zástupcem sloučeniny vzorce 1 je:

1) 5-methoxy-CPT*

2) 5-ethoxy-CPT*

3) 5-butoxy-CPT*

4) 5-chlorethoxy-CPT*

5) 9-methoxy-5-ethoxy-CPT

6) 9-hydroxy-5-ethoxy-CPT

7) 10-hydroxy-5-ethoxy-CPT*

8) 7-ethyl-5-ethoxy-CPT*

9) 7-ethyl-5-hydroxy-CPT*

10) 9-nitro-5-ethoxy-CPT

11) 9-nitro-5-hydroxy-CPT

12) 7-ethyl-5-chlorethoxy-CPT

13) 10-hydroxy-7-ethyl-5-ethoxy-CPT*

14) 5-(2'-hydroxyethoxy)-CPT

15) 7-ethyl-9-hydroxy-5-ethoxy-CPT

16) 10-hydroxy-5-(2-hydroxyethoxy)-CPT

17) 7-ethyl-l 0-hydroxy-5-(2-hydroxyethoxy)-CPT

18) 9-nitro-5-fluorethoxy-CPT

-13CZ 293421 B6

19) 9-nitro-5-trifluorethoxy-CPT

20) 10-hydroxy-5-trifluorethoxy-CPT

21) 7—ethyl— 10-hydroxy-5-trifluorethoxy-CPT

22) 7-ethyl-5-pyrrolidinoethoxy-CPT

23) 7-ethy 1-5-dimethy laminopropoxy-CPT

24) 7—ethyl—10-hydroxy-5-fluorethoxy-CPT

25) 5-(2-hydroxyethoxy)-7-ethyl-CPT

26) 5-(2-methoxyethoxy)-CPT kde CPT znamená 20(S)-kamptothecin a * označuje sloučeniny známé z literatury.

Většina ze sloučenin připravených podle tohoto vynálezu má rozpustnost ve vodě od 1 až do 10 mg na ml při 37 °C. Tabulka 1A ukazuje hodnoty MTD (maximální tolerovaná dávka) u švýcarských bílých myší, stabilitu laktonu v plné krvi (po 3 hodinách), rozpustnost, farmakokinetinu při MTD a aktivitu in vitro po 1-hodinové expozici pro sloučeniny z příkladů 11, 26 a 27.

Postupy použité pro provedení experimentů jsou uvedeny níže.

1. MTD u švýcarských bílých myší

Každé švýcarské bílé myši se podává jednorázová injekce zkoušené látky v den určený jako den 1. Testují se dávky 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 8,3, 6,25 a 3,13 mg/kg tělesné hmotnosti. Zvířata se pozorují denně ohledně mortality a morbidity a zaznamenávají se tělesné hmotnosti přežívajících zvířat ve dnech 1, 5, 10 a 14. Maximální tolerovaná dávka se definuje jako dávka, při které zkoušená látka nevykazuje žádnou morbiditu a úbytek hmotnosti nepřevyšuje 30 % ve srovnání se dnem 1. (V souladu s postupem (J. S. National Cancer Institute).

2. Stabilita laktonu v plné krvi ml krve od zdravého dobrovolníka se odeberou do zkumavky obsahující 40 μΐ heparinu (572 m.j.) pro zabránění koagulace. Připraví se 4 mM a 40 μΜ pracovní roztoky léku v DMSO a přidají se kalikvótům plné krve pro získání konečné koncentrace 100 μΜ a 1 μΜ. Lék se inkubuje v plné krvi při 37 °C a 20 μΐ vzorku se odebere do 180 μΐ vychlazeného methanolu (-30 °C) v různých časových intervalech (0, 1, 2 a 3 hodiny). Směs se promíchá vířivým pohybem a poté centrifuguje při frekvenci otáček 11 000 za minutu po dobu 3 minut v mikrocentrifuze při teplotě místnosti. 100 μΐ supematantu se zředí vodou na 300 až 500 μΐ v závislosti na odpovědi signálu (ultrafialový pro koncentraci 100 μΜ a fluorescenční pro koncentraci 1 μΜ) látky. 200 μΐ zředěného vzorku se vstřikuje na kolonu HPLC, na které se předtím ustavila rovnováha s mobilní fází. Měří se plocha pod vrcholem křivky odpovídající formám laktonu. Plocha vrcholu v čase nula se uvažuje jako 100 % a podíl plochy pod vrcholem laktonu v různých časech se vypočítá pro stanovení rovnovážné stability laktonu obdržené konzistentním podílem laktonu během dvou následných časových bodů (Biochemistry, 33, 10325-10336 (1964) a J. Pharm. Sci., 84. 518-519 (1994)].

3. Farmakokinetika přiMTD

Všechny studie se provádějí na švýcarských bílých myších v rozmezí tělesné hmotnosti 35 až 40 g. Zvířata se nechají bez potravy během noci před podáním dávky léku a krmí se 3 hodiny po podání dávky. Zvířatům se podává dávka intraperitoneálně ve formě roztoku ve směsi DMSO a vody (50:50 objemových dílů). Vzorky krve se odebírají z orbitální dutiny v hodinách 1, 2,4, 6 a 8 po podání dávky do heparinizovaných zkumavek a centrifugují se při frekvenci otáček 13 000 za minutu po dobu 10 minut. Vzorky krevní plazmy se oddělí a analyzují pomocí HPLC. K 50 μΐ vzorku se přidá 100 μΐ ochlazeného okyseleného methanolu a směs se promíchá, aby se

-14CZ 293421 B6 vysrážely proteiny. Vzorek se centrifuguje při frekvenci otáček 13 000 za minutu po dobu 10 minut, 100 μΙ supematantu se zředí na objem 200 μΐ směsí methanolu a vody (50:50 objemových dílů) a 100 μΐ se vstříkne kHPLC. Plocha pod vrcholem léku se použije pro kvantitativní vyhodnocení. Vzorky pro kalibraci, kontrolu a stanovení výtěžku se připraví přidáním známého množství léku do 50 μΐ prázdné plazmy a zpracují se stejným způsobem jako ostatní vzorky [J. Nati. Cancer Inst., 88, 817-824 (1996)].

4. Stanovení rozpustnosti pomocí HPLC

Přebytek sloučeniny se ponechá nasáknout v 0,5 ml pufru na bázi octanu sodného, 0,1 mol/dm³, při pH 5,0 během 24 hodin při teplotě místnosti. Roztok se filtruje filtrem injekční stříkačky PVDF 0,45 pm (Gelman Sciences). Filtrát se vstřikuje na HPLC při různých objemech (10 a 20 μΐ). Zaznamenají se chromatogramy. Zaznamenané odpovědi se extrapolují z kalibrační křivky a vypočítá se rozpustnost sloučeniny [J. Med. Chem., 38, 400 (1995)].

5. Stanovení rozpustnosti rutinním postupem

Sloučenina se suspenduje v 5 ml deionizované vody a zahřívá po dobu 10 min na 37 °C. Potom se roztok filtruje, filtrát se odpaří dosucha s použitím methanolu a stanoví se jeho hmotnost.

6. Aktivita in vitro po jednohodinové expozici

Buňky se ponechají růst v 15 ml úplného živného prostředí (RPM1-1640 s 10% fetálního hovězího séra a 0,2 % hydrogenuhličitanu sodného) po dobu 3 až 5 dnů pro obdržení počtu buněk 10⁶ buněk/baňka. Živné prostředí se odstraní a připojené buňky se promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS). Přidá se 1 ml 0,1% Trypsin-EDTA a vzorek se inkubuje po dobu 5 min při 37 °C. Baňky se jemně poklepou a přidá se 5 ml úplného živného prostředí. Suspenze buněk se odebere a centrifuguje při frekvenci otáček 2 000 za minutu po dobu 5 minut. Odstraní se supematant a pelety se suspendují v 5 ml úplného živného roztoku. Počet buněk se počítá pomocí hemocytometru. Suspenze buněk se zředí na 10 000 buněk ve 100 μΐ úplného živném roztoku. Po 100 μΐ buněčné suspenze se nanese do 96 jamek mikrotitrační plotny a inkubuje se po dobu 24 hodin při 37 °C v přítomnosti 5 % CO2. Růst v referenčním blanku (nanesen na plotnu odděleně) se ukončí přídavkem 25 μΐ 50% vychlazené kyseliny trichloroctové (TCA). Inkubuje se po dobu 1 hodiny při 4 °C. Deska se promyje (5x) deionizovanou vodou, vysuší se na vzduchu a uchovává se při 4 °C pro stanovení hodnoty To. Připraví se vhodně zředěný roztok zkušební látky v úplném živném prostředí a přidá se 100 μΐ do každé jamky pro udržení konečné koncentrace mezi 10⁴ a 10⁸ mol/dm³. Inkubuje se po dobu 1 hodiny při 37 °C v přítomnosti 5 % CO2. Mikrotitrační plotna se centrifuguje při frekvenci otáček 1000 ot/min po dobu 5 minut. Odstraní se supematant. Buňky se dvakrát promyjí 100 μΐ PBS, aby se odstranily stopy zkoušené látky. Přidá se 200 μΐ úplného živného prostředí do každé jamky a inkubuje se po dobu 48 hodin při 37 °C v přítomnosti 5 % CO₂. Růst buněk se ukončí přídavkem 50 μΐ 50% vychlazené kyseliny trichloroctové. Plotna se inkubuje po dobu 1 hodiny při 4 °C, promyje deionizovanou vodou (5x) a vysuší na vzduchu. Přidá se 100 μΐ roztoku sulforhodamínu B (0,4 % v 1% kyselině octové) do každé jamky, při udržování teploty místnosti po dobu 15 minut. Promyje se (5x) 1% kyselinou octovou a vysuší na vzduchu. Přidá se 100 μΐ báze Trizma (Sigma) 10 mmol/dm³, jemně se protřepe na třepačce plotny po dobu 15 min a odečítá se optická hustota při 490 nm na spektrofotometrickém zařízení pro odečítání ploten (podle postupu U.S. National Cancer Institute).

-15CZ 293421 B6

Tabulka 1A

MTD u švýcarských bílých myší

Způsob podání_______________Příklad 11 intraperitoneálně 400 mg intravenózně 100 mg

Příklad 26

200 mg

25-50 mg

Příklad 27

400 mg

200 mg

Stabilita laktonu v plné krvi (po 3 hodinách)

Koncentrace Příklad 11 Příklad 26 Příklad 27 ____________Diastereomer A Diastereomer B____________Diastereomer A Diastereomer B

100 μΜ 3,73+1,50 6,15+2,53 - 4,58+1,72 11,9+2,91 μΜ₌-5,3-Rozpustnost

Metoda_____________________Příklad 11______________Příklad 26___Přiklad 27______

Metoda HPLC 0,17 mg/ml 0,8 mg/ml 9,5 mg/ml

Rutinní metoda<1 mg/ml 6 mg/ml 2-3 mg/ml

Farmakokinetika při MTD

Parametr Příklad 11 Příklad 26 Příklad 27

AUCo_] (pM.h)	18,47+2,1	561,69+41,8	23,10+2,7
Cmax (μΜ)	6,95+1,2	264,15+21,9	7,4+0,8
Tmax(h)	1,00+0,0	1,0+0,0	1,33+0,6
Kelim	0,37+0,07	0,38+0,06	0,29+0,02
Poločas (h)	1,92+0,4	1,84+0,3	2,38+0,2

Aktivita in vitro po 1 hodině expozice (hodnoty GI₅₀)

Buněčná linie	Příklad 11	Příklad 26	Příklad 27
SF-268	6x1 O^M	>10^4	>1θΛ4
OVCAR-8	4,5x1 O^M	>10^1	7,5xlO’5M
MCF-7/ADR	1,5x10^M	>10^M	6x10~5M
DU-145	3,5x10’7M	5xlO~5M	3,5x1 0'7M
ACHN	5,5x1 0~7M	>10^M	8x10^M
HOP-62	6x10’6M	>10~lM	2x1 O^M
UACC-62	4x105M	7,5x10“8M	9x1 O^M

Dále několik sloučenin připravených v tomto vynálezu vykazovalo dobrou protirakovinnou aktivitu in vitro proti různým liniím lidských nádorových buněk podle výsledků obdržených z 60 rozborů s lidskými nádorovými buněčnými liniemi provedených v National Cancer Institute (NCI), Bethesda, Maryland, U.S.A.

Tabulka 1 uvádí aktivitu buněčné linie in vitro vyjádřenou jako hodnoty IC50 pro různé C-kruhové analogy 20(S)-kamptothecinu připravené v rámci tohoto vynálezu. Diagramy 1 až 3 ukazují data kompilovaná na základě průměrných grafů NCI pro úplnou inhibici růstu (TGI) různých typů lidských rakovinných buněčných linií pro sloučeniny připravené v příkladech 27,

-16CZ 293421 B6 a 43. Pro srovnání se uvádějí podobná komplikovaná data pro topotekan založená na průměrném grafu NCI. Data shrnutá v tabulkách 2 a 3 ukazují, že C-kruhové analogy 20(S)-kamptothecinu připravené v rámci tohoto vynálezu vykazují protinádorovou aktivitu stejnou nebo lepší než topotekan vůči určitým buněčným liniím různých souborů rakovinných buněk. Tabulka 4 udává údaje obdržené pro sloučeninu připravenou v příkladu 32 proti buněčným liniím lymfomu vztahujícího se kAIDS (ARL). Veškeré sloučeniny použité ve screeningovém protirakovinném programu NCI in vitro jsou směsi obsahující v podstatě oba diastereomery mající konfigurace 20(S),5(S) a 20(S),5(R) v různých poměrech,

Výsledky ukázané v diagramech 1 až 3 a tabulkách 1 až 4 pocházejí z provádění pokusů podle postupů U.S. National Cancer Institute (NCI), jak se udává níže.

Každá zkoušená látka se podrobila screeningu proti souboru 60 lidských buněčných linií obdržených z osmi orgánů. V obvyklém postupu se buněčné suspenze zředěné podle příslušného typu buněk a očekávané cílové hustoty buněk (5000 až 40 000 buněk na jamku na základě charakteristik růstu buněk) nanesou na mikrotitrační plotny s 96 jamkami. Inokuláty se ponechají stabilizovat po preinkubační dobu 24 hodin při 37 °C. Do jamky’ mikrotitrační plotny se v čase nula přidají zředění odpovídající dvojnásobku zamýšlených zkušebních koncentrací ve 100 μΐ alikvótech. Obvykle se zkoušené látky vyhodnocují při 5 desetinásobných zředěních. Nejvyšší koncentrace v jamce používaná ve zkoušce je 1(Π mol/dm³. Buňky se poté inkubují v přítomnosti léku (zkoušená sloučenina) po dalších 48 hodin v atmosféře s 5 % CO₂ při 100% relativní vlhkosti. Na konci této doby se adherující buňky fixují k plotně pomocí kyseliny trichloroctové a po několikanásobném promytí se vrstva buněk zpracovává barvivém proteinu sulforhodaminem B. Optická hustota, která je úměrná hmotnosti proteinu, se potom odečítá automatizovaným spektrofotometrickým zařízením pro vyhodnocování ploten při vlnové délce 515 nm. Čtení se převádějí na mikropočítač a konečné zprávy se vytvářejí s použitím speciálně vyvinutého programového vybavení.

Sloučeniny vzorce 1 podle tohoto vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli, jak bylo popsáno výše a prostředky, která ji obsahují, lze použít jako protirakovinné a protivirové prostředky. Podání nových aktivních sloučenin vzorce 1 v čisté formě nebo v příslušném farmaceutickém prostředku se může provádět jakýmikoliv přijatými způsoby podávání, sloužícími pro podobná podání. Proto lze sloučeninu podávat například ústy, nosem, parenterálně nebo místně ve formě pevné látky, polopevné látky, lyofilizovaného prášku nebo kapalných dávkových forem, jako například s použitím tablet, čípků, pilulek, tobolek, prášků, roztoků, suspenzí, emulzí, krémů, tekutých forem k zevnímu použití, aerosolů, mastí, injekcí a podobně, výhodně ve vhodné dávkové formě pro jednoduché podání přesných dávek. Prostředky zahrnují konvenční farmaceutický nosič, zřeďovací činidla či vehikulum a aktivní novou látku sloučeninu 1 a navíc mohou zahrnovat léčivé přípravky, farmaceutické přípravky, nosiče, látky zvyšující účinek léku atd.

Vynález se popisuje podrobně se specifickými příklady udanými níže, které slouží pouze pro ilustraci a neměly by se považovat za omezující pro rozsah tohoto vynálezu.

Tabulka 1

č.	SLOUČENINA	IC501
1	5-methoxykamptothecin*	8,5
2	5-ethoxykamptothecin*	9,54
3	5-n-butoxykamptothecin*	6,16
4	5-(2-hydroxyethoxy)kamptothecin	1,51
5	5-(2-chlorethoxy)kamptothecin	4,57
6	7-ethyl-5-ethoxykamptothecin*	1,41
7	9-methoxy-7-ethyl-5-ethoxykamptothecin	2,13
8	7-ethyl-5-chlorethoxykamptothecin	2,75

-17CZ 293421 B6

Tabulka 1 - pokračování

č.	SLOUČENINA	IC50 (pm)a
9	7-ethyl-5-aminoethoxykamptothecin	18,6
10	7-ethyl-5-pyrrollidinethoxykamptothecin	18,6
11	7-ethyl-5-piperidinethoxykamptothecin	>30
12	7-ethyl-5-N,N-dimethylaminoethoxykamptothecin	13,8
13	7-ethyl-5-N,N-dimethylaminopropoxykamptothecin	>30
14	9-methoxy-5-ethoxykamptothecin	2,45
15	5-trifluorethoxykamptothecin	1,82
16	5-aminoethoxykamptothecin	30,0
17	7-ethyl-5-trifluorethoxykamptothecin	7,41
18	7-ethyl-5-(2-hydroxyethoxy)kamptothecin	4,78
19	5-fluorethoxykamptothecin	1,58
20	10-hydroxy-5-trifluorethoxykamptothecin	0,38
21	9-nitro-5-trifluorethoxykamptothecin	0,46
22	10-hydroxy-5-(2-hydroxyethoxy)kamptothecin	8,12
23	9-nitro-5-(2-hydroxyethoxy)kamptothecin	7,94
24	7-ethyl-5-fluorethoxykamptothecin	4,36
25	5-methoxyethoxykamptothec in	2,23
26	9-nitro-5-methoxyethoxykamptothecin	2,04
27	12-nitro-5-ethoxykamptothecin	>30
28	12-nitro-5-hydroxykamptothecin	>30
29	9-amino-5-methoxykamptothecin	6,76
30	9-hydroxy-5-ethoxykamptothecin	6,68

^a IC₅₀ = střední hodnota minimální koncentrace (pmol/dnť) sloučeniny požadované k vyvolání 50% inhibice růstu buněk (GI50) proti 60 buněčným liniím lidských nádorů NCI * značí C-5 substituované deriváty kamptothecinu známé v literatuře

Tabulka 2

Soubor buněk	Leukémie	CMS	PRS	Tlusté střevo
Buněčná linie	MOLT4	SF 295	U251	MCF7	HT29
Topotekan	1,2	2,18	2,81	100	>100
Příklad 25	3,0	2,15	3,57	9,2	7,90

Tabulka 3

Soubor bunék	NSLC	Rakovina tlustého střeva	Vaječniků	Ledvin	CNS
Buněčná	EKVX	H	H	HCC	HT29	HCT 15	SK OV3	OVCAR	UO31	SF268	u
linie								8
		460	322M	2998							251
Topotecan	100	1,2	16,9	15,8	>100	44,6	5,12	18,19	2,51	56	2,81
Příklad 26	63	1,0	31,6	10,47	46	36,3	3,80	13,4	3,89	30,9	7,58
Všechny	výše	uvedené hodnoty	se	vztahují	ke koncentraci	úplné inhibice	růstu	*(TGI)

v pmol/dm³ * TGI se vztahuje k minimálním koncentracím přípravku (zkoušené sloučeniny) požadované pro úplnou inhibici růstu buněk ve studii provedené podle NCI in vitro s 60 liniemi buněk lidských nádorů

-18CZ 293421 B6

Tabulka 4*

Aktivita in vitro sloučeniny z příkladu 32 proti buněčným liniím lymfomu vztahujícího se k AIDS (ARL)

Název buněk	GI5o*	TGI**
CCRF-CEM	0,318	1,83
RL	0,463	3,94
KD488	0,246	2,28
AS 283	0,268	0,678
PA 682	0,456	7,23
SU-DHL-7	0,609	3,51

* GI₅o se vztahuje k minimální koncentraci (pmol/dm³) zkoušené sloučeniny požadované pro 50% inhibici růstu buněk ** TGI se vztahuje k minimální koncentraci (pmol/dm³) zkoušené sloučeniny požadované pro úplnou inhibici růstu

Diagram 1

Údaje o protirakovinné aktivitě sloučeniny z příkladu 27 in vitro [Ukázané údaje se vztahují k hodnotám koncentrací pro úplnou inhibici růstu (TGI) v pmol/dm³]

NSLC

Buněčné linie	HOP 62	HOP 92	H226	H23	H460	H522
Příklad 27	4,95	4,88	4,75	0,91	5,09	7,66
Topotekan	0,04	7,90	10,96	0,87	1,20	4,16

Rakovina tlustého střeva

Buněčné linie	COLO 205	HCC 2998	HCT 116	HCT 15	HT29	KM 12
Příklad 27	19,5	7,67	4,06	20,0	2,41	10,6
Topotekan	7,94	15,8	2,51	44,6	100	6,45

Rakovina prsu

Buněčné linie	MCF 7/ADR	MDA-MB-435	MDA-N	BT 549	T47D
Příklad 27	1,25	9,62	11,0	11,4	0,81
Topotekan	1,50	2,5	nedetekováno	>100	1,8

Diagram 2

Údaje o protirakovinné aktivitě sloučeniny z příkladu 28 in vitro [Ukázané údaje se vztahují k hodnotám koncentrací pro úplnou inhibici růstu (TGI) v pmol/dm³]

-19CZ 293421 B6

NSLC

Buněčné linie	HOP92	H226	H23	H322M	H460	H522
Příklad 28	8,44	4,3	0.76	30,2	1,22	13,0
Topotekan	7,90	10,96	0.87	16,9	1,20	4,16

Rakovina tlustého střeva

Buněčné linie	COLO 205	HCC 2998	HCT 116	HCT 15	HT 29	KM 12
Příklad 28	9,48	7,65	8,01	>30	7,94	27,4
Topotekan	7,94	15.80	2,51	44,6	100	6,45

Rakovina prsu

Buněčné linie	MCF 7/ADR	MDA-MB-435	BT—159	MDA-N	T47D
Příklad 28	1,21	11.4	32	13,4	1,09
Topotekan	1,5	2,5	>100	nedetekováno	1,8

Rakovina ledvin

Buněčné linie	786-0	A 498	ACHN	CAKI	RXF 393	SN12C	UO31
Příklad 28	0,85	1,76	0,37	0,75	15,9	2,31	1,23
Topotekan	0,12	1,69	0,28	0,51	1,41	1,58	2,51

Diagram 3

Údaje o protirakovinné aktivitě sloučeniny z příkladu 43 in vitro [Ukázané údaje se vztahují k hodnotám koncentrací pro úplnou inhibici růstu (TGI) v pmol/dm³]

NSLC

Buněčné linie	HOP 92	H226	H23	H460
Příklad 43	3,92	6,89	2,52	14,2
Topotekan	0,04	10,96	0,87	1,20

Rakovina tlustého střeva

Buněčné linie	COLO 205	HCC 2998	HCT 166	HT 29	KM 12
Příklad 43	37,3	23,2	23,6	18,9	41,9
Topotekan	7,94	15,8	2,51	100	6,45

Rakovina prsu

Buněčné linie	MCF7/ADR/RES	MCF 7
Příklad 43	9,30	17,8
Topotekan	1,5	100

-20CZ 293421 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava 5-methoxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krok 1: Ke směsi 20(S)-kamptothecinu vzorce 3 (2 g) a chloridu železitého (2 g) rozpuštěného v 80 ml methanolu se přidá po kapkách 10 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 70 °C po dobu 24 hodin. Přebytečná ky selina a methanol se odpaří ve vakuu a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a vysuší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 1,8 g žlutavého prášku obsahujícího 5-methoxykamptothecin a 5-hydroxykamptothecin v poměru 5:1.

Krok 2: Separace směsi sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím rozpouštědlové směsi methanol-chloroform jako elučního činidla poskytuje 1,5 g 5-methoxykamptothecinu a 300 mg 5-hydroxykamptothecinu. Následují analytické údaje pro 5-methoxykamptothecin. Teplota tání: 156 °C [a]_D při 28 °C = +41,74 (c 0,103, CHC1₃). IČ: 3426, 1747, 1664, 1616, 1228, 1155, 1046, 762 cm*'. 'H NMR (CDC1₃,200 MHz): δ 8,42 (s, 1 H), 8,26 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,96 (d, J = 8 Hz, l H), 7,88 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,68 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,58 (s, 0,5 H), 7,54 (s, 0,5 H), 6,95 (s, 0,5 H), 6,80 (s, 0,5 H), 5,74 (d, J = 16,5 Hz, 0,5 H), 5,72 (d, J = 16,5 Hz, 0,5 H), 5,25 (d, J = 16,5 Hz, 1 H), 3,75 (s, 1 H), 3,70 (s, 1,5 H), 3,50 (s, 1,5 H), 2,01-1,82 (m, 2 H), 1,06 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 379 (M+H), 348, 319.

Příklad 2

Příprava 5-hydroxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krok 1: Příprava 5-methoxykamptothecinu:

5-methoxykamptothecin vzorce 1, kde R¹ - R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, R⁶ = Me, se připraví z 20(S)-kamptothecinu vzorce 3, jak se popisuje výše v příkladu 1.

Krok 2: 1,5 g 5-methoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, R⁶ = Me, se rozpustí v 50 ml methanolu a zpracuje 50 ml 50% HC1. Roztok se zahřívá pod zpětným chladičem po dobu 30 hodin. Ke konci se odpaří přebytečná voda a methanol jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 1,2 g 5-hydroxykamptothecinu po vyčištění pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu s použitím rozpouštědlové směsi ethylacetátu a chloroformu. Teplota tání: 220 °C. [a]o při 26 °C = +28,00 (c 0,1, CHC13. IČ: 3367, 1749, 1658, 1591, 1159, 1046 cm’¹. ’H NMR (CDC13 + DMSO - d₆, 200 MHz): δ 8,50 (s, 1 H), 8,20 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,94 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,85 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,64 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,58 (s, 0,5 H), 7,56 (s, 0,5 H), 7,06 (s, 0,5 H), 7,01 (s, 0,5 H), 6,95 (široký d, 1 H, D₂O vyměnitelné), 5,67 (d, J = 16,5 Hz, 1 H), 5,25 (d, J = 16,5 Hz, 1 H), 5,05 (široký d, 1 H, D₂O vyměnitelné), 2,05 - 1,86 (m, 2 H), 1,06 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 364 (M+l), 348, 320, 277, 236, 91, 57.

Příklad 3

Příprava 5-ethoxy-7-ethylkamptothecinu (známá sloučenina)

-21 CZ 293421 B6

Krok 1: Ke směsi 7-ethylkamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H, R⁵ = Et (1,5 g) a chloridu železitého (1,35 g) rozpuštěného ve 150 ml ethanolu, se přidá po kapkách 9 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 30 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 1,6 g hnědavého prášku obsahujícího 5-ethoxy-7-ethylkamptothecin a 5-hydroxy-7-ethylkamptothecin v poměru 10:1.

Krok 2: Separace směsi sloupcovou chromatografií poskytuje 1 g 5-ethoxy-7-ethylkamptothecinu a 100 mg 5-hydroxy-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 150 °C. [a]_D při 27 °C = + 10,526 (c 0,085, CHC1₃). IČ: 3419, 1751, 1662, 1613, 1157, 1075, 1050, 764 cm’¹. ’HNMR (CDC1₃, 200 MHz): δ 8,20 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8,15 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,81 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,66 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,54 (s. 0,5 H), 7,51 (s, 0,5 H), 7,01 (s, 0,5 H), 6,89 (s, 0,5 H), 5,72 (d, J= 16,5 Hz, 0,5 H), 5,71 (d, J = 16,5 Hz, 0,5 H), 5,28 (d, J= 16,5 Hz, 0,5 H), 5,26 (d, J = 16,5 Hz, 0,5 H), 4,3 - 3,6 (m. 3 H), 3,5 - 3,1 (m, 2H), 2,05 - 1,71 (m, 2H), 1,45 (t, J = 7,5 Hz, 3 H), 1,06 (t, J = 7 Hz, 3 H).

Příklad 4

Příprava 5-hydroxy-7-ethylkamptothecinu (známá sloučenina)

Krokl: Příprava 5-ethoxy-7-ethylkarnptothecinu: 5-ethoxy-7-ethylkamptothecin vzorce 1, kde, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H, R³ = R⁶ = Et, se připraví z 20(S)-kamptothecinu vzorce 2, jak se popisuje v příkladu 3.

Krok 2: 50 ml 25% H2SO4 se přidá k 1,0 g 5-ethoxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 1, kde R* = R² = R³ = R⁴ = H, R⁵ - R⁶ = Et, rozpuštěného ve 30 ml ethanolu a vaří se pod zpětným chladičem po dobu 30 hodin. Na konci se přebytečná voda a ethanol odpaří jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 700 mg 5-hydroxy-7-ethylkamptothecinu, po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 252 °C. IČ: 3349,1752,1656, 1605, 1159, 1054, 766 cm’¹ Částečné údaje *H NMR (CDClý + DMSO - d₆), δ 7,19 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 7,15 (s, 0,5 H), 7,05 (s, 0,5 H), 5,75 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 5,65 (d, J = 16,5 Hz, 1 H), 5,25 (d, J= 16,6 Hz, 1 H), 3,52 - 3,19 (m, 2 H), 1,45 (t, J = 7,5 Hz, 3 H), 1,02 (m, 3 H).

Příklad 5

Příprava 5-ethoxy-9-methoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H aR⁶ = Et

Krok 1: Ke směsi 9-methoxykamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = OMe a R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H (1 g) a chloridu železitého (500 mg) rozpuštěného v 50 ml ethanolu se přikape 10 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 22 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří vakuovou destilací a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje tmavě hnědavý prášek.

Krok 2: Čištění výše uvedeného zbytku pomocí sloupcové chromatografie na silikagelu poskytuje 500 mg 5-ethoxy-9-methoxykamptothecinu vzorce 1 a 300 mg 5-hydroxy-9-methoxykamptothecinu. Teplota tání: 235 °C. [a]_D při 30 °C = + 34,18 (c 0,093, MeOH). IČ: 3436, 1748, 1665,1619,1461,1366,1093, 814 cm’¹. *HNMR(CDC1₃,200 MHz): δ 8,81 (s, 1 H), 7,78 (m, 2 H), 7,53 (d, J = 5,5 Hz, 1 H), 6,96 (d, J = 7 Hz, 1 H), 6,88 (s, 1 H), 6,77 (s, 1 H), 5,72 (d,

-22CZ 293421 B6

J = 16 Hz, 0,5 H), 5,75 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,27 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,24 - 3,90 (m, 2 H), 4,06 (s, 3 H), 3,80 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 1,90 (m, 2 H), 1,31 (m, 3 H), 1,01 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 422 (M+l), 394, 378, 350, 305, 98, 57.

Příklad 6

Příprava 5-hydroxy-9-methoxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krokl: Nejprve se připraví 5-ethoxy-9-methoxykamptothecin vzorce 1, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et, jak se popisuje v příkladu 5.

Krok 2: 25 ml 80% HCI se přidá k 560 mg 5-ethoxy-9-methoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = R - H a R⁶ = Et, rozpuštěného v 25 ml ethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Na konci se odpaří přebytečná voda a ethanol jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 520 mg 5-hydroxy-9-methoxykamptothecinu, po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 162 °C. [a]D při 30 °C = +39,68 (c = 0,012, MeOH). IČ: 3398, 1749, 1656, 1616, 1577. 1465, 1383, 1154 cm^-1. 'H NMR (CDC13 + DMSO-d₆): δ 8,81 (s, 1 H), 7,81 - 7,61 (m, 2 H), 7,50 (d, J = 5,5 Hz, 1 H), 7,12 - 6,71 (m, 2 H), 5,70 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,30 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,06 (s, 3 H), 1,98 - 1,75 (m, 2 H), 1,10 - 0,98 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 394 (M+l), 377, 348, 266, 149, 88, 57.

Příklad 7

Příprava 5-ethoxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecinu vzorce I, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = R⁶ = Et

Krok 1: Ke směsi 9-methoxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = H a R' = R⁶ = Et (100 mg) a chloridu železitého (100 mg) rozpuštěného v 32 ml ethanolu se přikapou 2 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 4 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 120 mg odparku obsahujícího 5-ethoxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecin a 5-hydroxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecin v poměru 1:4.

Krok 2: Separace směsi sloupcovou chromatografií s použitím směsi rozpouštědel ethylacetátchloroform poskytuje 15 mg 5-ethoxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 1 a 55 mg 5-hydroxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 240 °C. IČ: 3443, 1747, 1663, 1609, 1458, 1254, 1160, 1074 cm’¹. *H NMR (CDC1₃, 200 MHz): δ 7,80 - 7,68 (m, 2 H), 7,50 (s, 0,5 H), 7,47 (s, 0,5 H), 7,01 (s, 0,5 H), 6,98 (d, J = 8 Hz, 1 H), 6,89 (s, 0,5 H), 5,76 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,28 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,26 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 4,25 - 3,81 (m, 2 H), 4,02 (s, 3 H), 3,72- 3,28 (m, 2 H), 3,15 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 2,02 - 1,82 (m, 2 H), 1,37 - 1,33 (m, 3 H), 1,05 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 451 (M+l), 406, 377, 362, 347, 331,181, 149, 97.

Příklad 8

Příprava 5-hydroxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = R⁶ = Et

-23CZ 293421 B6

Krokl: Nejprve se připraví 5-ethoxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecin vzorce 1, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = R⁶ = Et, jak je popsáno v příkladu 7.

Krok 2: 5 ml 50% kyseliny chlorovodíkové se přidá ke 100 mg 5-ethoxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = OMe, R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = R⁶ = Et, rozpustí v 5 ml ethanolu a vaří pod zpětným chladičem po dobu 26 hodin. Ke konci se přebytečná voda a ethanol odpaří jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 80 mg 5-hydroxy-9-methoxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 13, po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 242 °C. IČ: 3440, 1742, 1660, 1610, 1456, 1250, 1160 cm¹.

Příklad 9

Příprava 5-ethoxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krok 1: Ke směsi 20(S)-kamptothecinu vzorce 3(1 g) a chloridu železitého (1 g) rozpuštěného v 50 ml ethanolu se přikape 12 ml BF₃-etherátu a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 40 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 1 g žlutavého prášku obsahujícího 17-ethoxykamptothecin a 5-hydroxykamptothecin v poměru 6:1.

Krok 2: Separace této směsi sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel ethylacetát-hexan jako elučního činidla poskytuje 700 mg 5-ethoxykamptothecinu a 120 mg dříve připraveného 5-hydroxykamptothecinu. Teplota tání: 140 °C. [a]_D při 28^ = +29,703 (c 0,101, CHC1₃). IČ: 3423, 1746, 1663, 1616, 1155, 1070, 1040 cm¹. Částečné údaje 'H NMR v CDC1₃: δ 6,9 (s, 0,5 H), 6,78 (s, 0,5 H), 4,25 - 3,85 (m, 2 H), 3,70 (s, 1 H), 2,00 - 1,80 (m, 2 H), 1,40 - 1,22 (m, 3 H), 1,12 - 0,98 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 393 (M+l), 378,362, 348,319,247,219, 57.

Příklad 10

Příprava 5-butoxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krok 1: Ke směsi 20(S)-kamptothecinu vzorce 3 (500 mg) a chloridu železitého (500 mg) rozpuštěného v 15 ml n-butanolu se přikape kyselina sírová a směs se udržuje při teplotě 100 °C po dobu 20 hodin. Přebytečná kyselina a n-butanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje práškovitý materiál.

Krok 2. Čištění výše uvedeného materiálu sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel ethylacetát-hexan jako elučního činidla poskytuje 300 mg 5-butoxykamptothecinu a 50 mg dříve připraveného 5-hydroxykamptothecinu. Teplota tání: 82 °C [a]_D při 28 °C = +28,00 (c 0,01, CHC1₃). Částečné údaje *H NMR v CDC1₃: δ 6,92 (s, 0,5 H), 6,79 (s, 0,5 H), 4,12 - 3,75 (m, 2 H), 3,80 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 2,00 - 1,82 (m, 2 H), 1,75 - 1,52 (m, 2 H), 1,50 - 1,29 (m, 2 H), 1,15 - 0,82 (m, 6 H). Hmot, spektr, (m/z): 422 (M+l), 363,348,319, 84,51.

-24CZ 293421 B6

Příklad 11

Příprava 5-ethoxy-9-hydroxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et

Krok 1: Ke směsi 9-hydroxykamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H (200 mg) a chloridu železitého (250 mg) rozpuštěného ve 40 ml ethanolu se přikape 1,5 ml kyseliny sírové a pokračuje se v zahřívání směsi na teplotu 85 °C po dobu 26 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje 5% směsí methanolchloroform. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 170 mg odparku obsahujícího 5-ethoxy-9hydroxykamptothecin a 5,9-dihydroxykamptothecin v poměru 3:1.

Krok 2: Separace směsi sloupcovou chromatografií s použitím směsi rozpouštědel ethvlacetátchloroform poskytuje 75 mg 5-ethoxy-9-hydroxykamptothecinu vzorce 1 spolu s 25 mg

9,5-dihydroxykamptothecinu. Teplota tání: 230 °C. IČ: 3400, 2920, 1745, 1663, 1597, 1360, 1280, 1228, 1157, 1083, 902, 816 cm’¹. ’H NMR (CDC1₃): δ 8,83 (s, 1 H), 7,78 (d, J= 6,8 Hz, 1 H), 7,67 - 7,56 (m, 2 H), 7,01 (s, 0,5 H), 6,98 (s, 0,5 H), 6,91 (s, 0,5 H), 6,81 (s, 0,5 H), 5,70 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,33 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,15 - 3,91 (m, 2 H), 1,90 (m, 2 H), 1,05 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 409 (M+l), 364, 335, 320, 291, 267, 263, 221, 206, 171, 159, 129, 111,98, 85.

Příklad 12

Příprava 9,5-dihydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴ - R⁵ = H

73

Krok 1: Nejprve se připraví 5-ethoxy-9-hydroxykamptothecin vzorce 1, kde R = OH, R = R = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et, jak je popsáno v příkladu 11.

Krok 2: 25 ml 80% HC1 se přidá k 560 mg 5-ethoxy-9-hydroxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et, rozpuštěného ve 25 ml ethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Ke konci se přebytečná voda a ethanol odpaří jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 320 mg

9,5-dihydroxykamptothecinu vzorce 13 po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 102 °C. IČ: 3400, 1744, 1659, 1594, 1462, 1361, 1280, 1229, 1049, 820 cm'¹. ’H NMR (DMSO-d₆): δ 10,82 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 7,63 - 7,69 (m, 2 H), 7,22 (s, 0,5 H), 7,19 (s, 0,5 H), 7,11 (d, J = 7 Hz, 1 H), 6,98 (s, 0,5 H), 6,95 (s, 0,5 H), 6,50 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 5,42 (s, 2 H), 1,89 (m, 2 H), 0,90 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 380 (M+l), 320,305,293,264.

Příklad 13

Příprava 5-ethoxy-9-hydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 1, kde R* = OH, R² = R³ = R⁴ = H aR⁵ = R⁶ = Et

Krok 1: Ke směsi 9-hydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = Et (150 mg) a chloridu železitého (150 mg) rozpuštěného ve 30 ml ethanolu se přikape 2 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 40 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 120 mg odparku obsahujícího 5-ethoxy-9-hydroxy-7-ethylkamptothecin a 9,5-dihydro-7-ethylkamptothecin v poměru 5:1.

-25CZ 293421 B6

Krok 2: Separace směsi sloupcovou chromatografií s použitím směsi rozpouštědel acetonchloroform poskytuje 85 mg 5-ethoxy-9-hydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 1 a 15 mg 5,9dihydroxy-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 240 °C. IČ: 3500, 2976, 1749, 1662, 1588, 1555, 1461, 1390, 1147, 1079, 921 cm^-1. 'H NMR (DMSO-d₆): 8 10,77 (s, 1 H D₂O vyměnitelné). 7,62 - 7,67 (m, 2 H), 7,57 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,08 - 7,18 (m, 2 H), 6,50 (s, 1 H, DO vyměnitelné), 5,39 (s, 2 H), 4,08 (m, 2 H), 3,42 (m, 2 H), 1,87 (m, 2 H), 1,35 (t, J = 7 Hz, 3 H). 0,87 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 437 (M+l), 392, 363, 348, 333, 291, 261. 246, 219. 191,149,119,89.

Příklad 14

Příprava 9,5-dihydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴= H a R⁵ = Et

Krok 1: Nejprve se připraví 5-ethoxy-9-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 1, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴ = H a R = R⁶ = Et, jak se popisuje v příkladu 13.

Krok 2: 35 ml 80% HC1 se přidá k 560 mg 5-ethoxy-9-hydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = OH, R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = R⁶ = Et, rozpuštěného ve 25 ml ethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Ke konci se odpaří přebytečná voda a ethanol jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší se nad bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 380 mg 5,9-dihydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 13, po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 165 °C. IČ: 3351, 2929, 1744, 1657, 1606, 1460, 1218, 1162, 1035, 872 cm“¹. ’H NMR (DMSO-d₆): 8 10,62 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 7,60 - 7,57 (m, 2 H), 7,16 - 7,00 (m, 3 H), 5,40 (s, 2 H), 3,42 (q, J = 7,6 Hz, 2 H), 2,08 (m, 2 H), 1,33 (t, J = 7 Hz, 3 H), 0,89 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 408 (M+l), 380, 336, 319, 291,267,235,219, 185, 127,99, 83.

Příklad 15

Příprava 9-nitro-5-ethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = NO₂, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et

Krok 1: Ke směsi 9-nitrokamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = NO₂ a R² = R³ = R⁴ = R⁵ = Η (1 g) a chloridu železitého (1 g) rozpuštěného ve 100 ml ethanolu se přidá po kapkách 10 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 24 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší se bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 900 mg žlutavého prášku.

Krok 2: Vyčištění výše uvedené pevné látky sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla poskytuje 700 mg 9-nitro-5ethoxykamptothecinu vzorce 1 a 80 mg 9-nitro-5-hydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = NO2, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H. Teplota tání: 202 °C. IČ (KBr): 3474, 1743, 1668, 1622, 1526, 1344, 1154, 1073, 831 cm'¹. ’H NMR (CDClj, 200 MHz): 8 9,23 (s, 1 H), 8,52 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8,47 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,92 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,55 (s, 1 H), 6,91 (s, 1 H), 5,71 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,28 (d, J= 16 Hz, 1 H), 4,39 - 3,98 (m, 2 H), 3,75 (široký s, 1 H, D2O vyměnitelné), 1,99 - 1,79 (m, 2 H), 1,32 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,04 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 438 (M+l), 407, 393, 364, 349, 319, 262, 118.

-26CZ 293421 B6

Příklad 16

Příprava 12-nitro-5-ethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R² = R’ = R⁵ = H, R⁴ = NO? a R⁶ = Et

Krok 1: Ke směsi 12-nitrokamptothecinu vzorce 2, kde R⁴ = NO? a R¹ = R² = R³ = R’ = H (2 g) a chloridu železitého (2 g) rozpuštěného ve 150 ml ethanolu se přidá po kapkách 15 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 24 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje pevnou látku charakteru gumy.

Krok 2: Vyčištění výše uvedeného odparku sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla poskytuje 1,4 g žlutavého prášku obsahujícího 12-nitro-5-ethoxykamptothecin vzorce 1 a 100 mg 12-nitro-5-hydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R⁴ = NO2 a R = R² = R³ = R’ = H. Teplota tání: 250 °C. IČ (KBr): 3450, 1750, 1666, 1618, 1525, 1357, 1154, 1042, 766 cm'¹.’H NMR (CDC13, 200 MHz): δ 8,49 (s, 1 H), 8,17 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8,14 (d, J = 9 Hz, 1 H). 7,75 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,54 (s, 1 H), 6,95 (s, 0,5 H), 6,82 (s, 0,5 H), 5,71 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,26 (d. J = 16 Hz, 1 H), 4,31 - 3,91 (m, 2 H), 3,75 (m, široký s, 1 H, D?O vyměnitelné), 2,05 - 1,81 (m, 2 H), 1,35 (1, J - 7 Hz, 3 H), 1,05 (1, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 438 (M+l). 420, 393, 376, 364, 349, 319, 84.

Příklad 17

Příprava 10-hydroxy-5-ethoxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krok 1: Ke směsi 10-hydroxykamptothecinu vzorce 2, kde R' = OH, R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H (200 mg) a chloridu železitého (200 mg) rozpuštěného v 10 ml ethanolu se přikape 1,5 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 85 °C po dobu 24 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje 5% směsí methanol-ethylacetát. Organická vrstva se promyje vodou, solankou a suší se nad bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje žlutou pevnou látku.

Krok 2: Vyčištění výše uvedené pevné látky sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla poskytuje 100 mg 10-hydroxy-5ethoxykamptothecinu vzorce 1 a 20 mg 10,5-dihydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R² = OH a R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H. Teplota tání: 165 °C. IČ (KBr): 3384, 1747, 1662, 1608, 1229, 1044, 831 cm'¹. ’H NMR (CDC1₃ + DMSO, 200 MHz): δ 9,8 (1 H, široký s, D₂O vyměnitelné), 8,25 (s, 1 H), 8,05 (d, J = 6, Hz, 1 H), 7,56 - 7,39 (m, 2 H), 7,25 (s, 1 H), 6,85 (s, 0,5 H), 6,70 (s, 0,5 H), 5,58 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,35 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,21 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 4,35 - 3,75 (m, 4 H), 3,50 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 2,10 - 3,78 (m, 2 H), 1,22 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,05 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 409 (M+l), 392, 364, 349, 335, 320, 291, 235, 117, 84.

Příklad 18

Příprava 10-hydroxy-7-ethyl-5-ethoxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krok 1: Ke směsi 10-hydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 2, kde R² = OH, R¹ = R³ = R⁴ = H aR⁵ = Et (200 Mg) a chloridu železitého (200 mg) rozpuštěného v 10 ml ethanolu se přikape 1,7 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 80 °C po dobu 20 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se

-27CZ 293421 B6 promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje pevnou látku.

Krok 2: Vyčištění výše uvedeného pevného zbytku sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla poskytuje 85 mg 10-hydroxy-7-ethyl-5-ethoxykamptothecinu jako žlutavý prášek a 20 mg 10,5-dihydroxy-7ethylkamptothecinu vzorce 13, kde R² = OH, R¹ = R⁵ = R⁴=HaR’ = Et. Teplota tání: 190 °C. IČ (KBr): 3277, 1746, 1660, 1599, 1231, 1078, 800 cm^-'. 'H (NMR (CDC1₃ + DMSO): δ 9,6 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 8,1 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 7,51 - 7,35 (m, 3 H), 6,92 (s. 0,5 H), 6,80 (s, 0,5 H), 5,66 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,22 (d, J= 16 Hz, 1 H), 3,85 - 3,65 (m, 2 H), 3,35-2,95 (m, 2 H), 1,95 - 1,75 (m, 2 H), 1,37 (t, J = 7,4 Hz, 3 Η), 1,17 (t, J = 7,2 Hz. 3 H), 0,99 (t, J = 7,4 Hz, 3 H), Hmot, spektr, (m/z): 437 (M=l), 392, 363, 348, 333, 291, 147, 84.

Příklad 19

Příprava 9-amino-5-ethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = NH?, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et

Krok 1: Ke směsi 9-aminokamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = NH2, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H (120 mg) a chloridu železitého (112 mg) rozpuštěného v 10 ml ethanolu se přikape 1,5 ml bortrifluorid-etherátu (BF3.Et₂O) a směs se udržuje při teplotě 80 °C po dobu 16 hodin. Ethanol se odpaří ve vakuu a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným a při odpaření rozpouštědla poskytuje pevnou sloučeninu charakteru viskózní gumy.

Krok 2: Vyčištění výše uvedeného odparku sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla poskytuje 65 mg 9-amino-5ethoxykamptothecinu vzorce 1. Teplota tání: 170 °C. IČ: 3221, 1744, 1661, 1231, 1157, 1074, 815 cnf’. ^lH NMR (CDC1₃ + DMSO-d₆): δ 8,69 (s, 1 H), 7,64 (s, 1 H), 7,63 - 7,51 (m, 2 H), 7,06 (d, J = 5,41 Hz, 1 H), 6,90 (s, 0,5 H), 6,80 (s, 0,5 H), 5,65 (d, J = 16 Hz, 1 H). 5,26 (d, J=16Hz, 1H), 4,19 -3,98 (m, 1 H), 3,97 - 3,78 (m, 1 H), 2,98 (široký s, 3 H, D₂O vyměnitelné), 1,95 - 1,80 (m, 2 H), 1,39 - 1,19 (m, 3 H), 1,11 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 407 (M+2), 389, 363, 334, 319, 290,262, 233,101.

Příklad 20

Příprava 9-amino-5-methoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = NH₂, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Me

Krok 1: Ke směsi 9-aminokamptothecinu vzorce 2, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H (180 mg) a chloridu železitého (162 mg) rozpuštěného v 15 methanolu se přidají po kapkách 2 ml bortrifluorid.etherátu (BF₃.Et₂O) a směs se udržuje při teplotě 80 °C po dobu 16 hodin. Methanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Při odpaření rozpouštědla se získá sloučenina charakteru viskózní gumy.

Krok 2: Vyčištění výše uvedeného zbytku sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla poskytuje 125 mg 9-amino-5-methoxykamptothecinu vzorce 1. Teplota tání: 200 °C. IČ: 3364,2925,1744,1660,1610,1156,1081, 811 cm¹. 'H NMR (CDC1 + DMSO - d₆): δ 8,82 (s, 1 H), 7,60 (s, 1 H), 7,63 - 7,46 (m, 2 H), 6,97 (d, J = 7 Hz, 1 H), 6,89 (s, 0,5 H), 6,80 (s, 0,5 H), 5,6 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,25 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3,57 (s, 1,5 H), 3,46 (s, 1,5 H), 3,41 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 3,15 (široký s, 2 H,

-28CZ 293421 B6

D₂O vyměnitelné), 2,05 - 1,89 (m, 2 H), 1,01 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 393 (M+l), 376, 363, 349, 334, 319, 290, 262, 233, 205, 116.

Příklad 21

Příprava 9-nitro-5-hydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = NO₂ a R² = R’ = R⁴ = R⁵ = H

Krok 1: Nejprve se připraví 9-nitro-5-ethoxykamptothecin vzorce 1. kde R¹ = NO₂, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et, jak je popsáno v příkladu 15.

Krok 2: 80 ml 50% HCI se přidá k 1,0 g 9-nitro-5-ethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = NO2, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et rozpuštěného ve 20 ml ethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 30 hodin. Ke konci se přebytečná voda a ethanol odpaří jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 700 mg 9-nitro-5-hydroxykamptothecinu vzorce 13, po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 278 °C. IČ (KBr): 3402, 1744, 1657, 1602, 1533, 1155, 1051, 833 cm^-'. 'HNMR (CDC13 + DMSO, 200 MHz): δ 9,28 (s, 1 H), 8,50 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 8,45 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 7,96 (t, J = 8,2 Hz, 1 H), 7,59 (s, 0,5 H), 7,58 (s, 0,5 H), 7,12 (s, 0,5 H), 7,08 (s, 0,5 H), 5,67 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,27 (d, J = 16 Hz, 1 H), 1,92 (q. J = 7,2 Hz, 2 H), 1,07 (t, J = 7 Hz, 3 H).

Příklad 22

Příprava 10,5-dihydroxykamptothecinu (známá sloučenina)

Krok 1: Nejprve se připraví 10-hydroxy-5-ethoxykamptothecin vzorce 1, kde R² = OH, R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et, jak je popsáno v příkladu 17.

Krok 2: 10 ml 50% HCI se přidá k 250 mg 10-hydroxy-5-ethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R² = OH, R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = Et, rozpuštěného v 10 ml ethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 20 hodin. Ke konci se odpaří přebytečná voda a ethanol jako azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 210 mg

10,5-dihydroxykamptothecinu vzorce 13, po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 240 °C. IČ (KBr): 3226, 1743, 1659, 1596, 1382, 1231, 1048, 832 cm^-1. 'HNMR (CDCI3 + DMSO): δ 10,0 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 8,31 (s, 0,5 H), 8,29 (s, 0,5 H), 8,05 (d, J = 6 Hz, 0,5 H), 7,95 (d, J = 6 Hz, 0,5 H), 7,95 (d, J = 6 Hz, 0,5 H), 7,50 - 7,31 (m, 2 H), 7,21 (s, 1 H), 6,95 (s, 0,5 H), 6,85 (s, 0,5 H), 5,55 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,25 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3,99 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 20,5 - 1,81 (m, 2 H), 1,0 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 381 (M+l), 352, 336, 320,264,149, 83.

Příklad 23

Příprava 12-nitro-5-hydroxykamptothecinu vzorce 12, kde R¹ = R² = R³ = R⁵ = H a R⁴ = NO₂

Krok 1: Nejprve se připraví 12-nitro-5-ethoxykamptothecin vzorce 1, kde R⁴ = NO₂, R¹ = R² = R³ = R⁵ = H a R⁶ = Et, jak je popsáno v příkladu 16.

Krok 2: 125 ml 50% HCI se přidá ke 2 g 12-nitro-5-ethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R⁴ = NO₂, R¹ = R² = R³= R⁵ = H a R⁶= Et, rozpuštěného v 30 ml ethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 24 hodin. Ke konci se odpaří přebytečná voda a ethanol jako

-29CZ 293421 B6 azeotropická směs a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 1,5 g 12-nitro-5-hydroxykamptothecinu vzorce 13 po vyčištění sloupcovou chromatografií na silikagelu. Teplota tání: 247 °C. IČ (KBr): 3371, 1746, 1664, 1602, 1532, 1380, 1048, 829 cm¹, 'H NMR (CDCI3, 200 MHz): δ 8,58 (s, 1 H), 8,17 (d, J = 9 Hz, 1 H), 8,12 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,74 (t, J = 8,3 Hz, 1 H), 7,58 (s, 1 H), 7,12 (s, 0,5 H), 7,08 (s, 0,5 H), 5,71 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,26 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3,90 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 1,99 - 1,85 (m, 2 H), 1,05 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 409 (M+l), 393, 380, 363, 348, 333, 318, 149, 85..

Příklad 24

Příprava 5-(2-chlorethoxy)kamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = CH₂CH₂C1

Krok 1: Ke směsi 20(S)-kamptothecinu vzorce 3(1 g) a chloridu železitého (1 g) rozpuštěného ve 25 ml 2-chlorethanolu se přikape 5 ml kyseliny sírové a směs se udržuje při teplotě 90 °C po dobu 24 hodin. Přebytečná kyselina a 2-chlorethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 1,2 g hnědavé pevné látky.

Krok 2: Výše uvedená pevná látka se čistí sloupcovou chromatografií a poskytuje 650 mg 5-(2'-chlorethoxy)kamptothecinu vzorce 1 a 150 mg dříve připraveného 5-hydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H. Teplota tání: 202 °C. [a]D při 28 °C = +5,37 (c 0,093, CHCb). ÍČ: 3354, 1744, 1662, 1622, 1223, 1160, 1090, 1044, 752, 663 cm^-1. Částečné údaje ’H NMR v CDC13: δ 6,92 (s, 0,5 H), 6,82 (s, 0,5 H), 4,51 (t, J = 5 Hz, 1,5 H), 4,38 (t, J = 5 Hz, 1,5 H), 3,75 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 3,85 - 3,58 (m, 2 H), 2,00 - 1,78 (m, 2 H), 1,06 (t, J = 7,5 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 426 (M+l), 391, 377, 363,348,319,105, 84, 51.

Příklad 25

Příprava 5-trifluorethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = CF₂CF₃

Krok 1: Ke směsi 20(S)-kamptothecinu vzorce 3 (0,5 g) a chloridu železitého (0,5 g) rozpuštěného v 18 ml 2,2,2-trifluorethanolu se přikape kyselina sírová a pokračuje se v zahřívání směsi při teplotě 80 °C po dobu 24 hodin. Přebytečná kyselina a trifluorethanol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 600 mg pevné látky.

Krok 2: Výše uvedená pevná látka se čistí sloupcovou chromatografií a poskytuje 250 mg 5-trifluorethoxykamptothecinu vzorce 1 spolu se 150 mg dříve připraveného 5-hydroxykamptothecinu vzorce 13. Teplota tání: 188 °C. IČ: 3438, 1748, 1667, 1620, 1160, 1106, 1003 cm'¹. Částečné údaje 'H NMR v CDC1₃: δ 6,84 (s, 0,5 H), 6,75 (s, 0,5 H), 5,21 - 4,90 (m, 1 H), 4,60 - 4,38 (m, 2 H), 3,70 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 2,0 - 1,79 (m, 2 H), 1,15 - 0,99 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 447 (M+l), 378, 348, 304, 111, 69.

Příklad 26

Příprava 5-(2'-hydroxyethoxy)kamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H a R⁶ = CH₂CH₂OH

-30CZ 293421 B6

Krok I: Ke směsi 20(S)-kamptothecinu vzorce 3(1 g) a chloridu železitého (1 g) rozpuštěného v 10 ml ethylenglykolu se přikape 5 ml kyseliny sírové a pokračuje se v zahřívání směsi při teplotě 70 °C po dobu 36 hodin. Přebytečná kyselina a ethylenglykol se odpaří s použitím vakua a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje 1,1 g žlutavého prášku.

Krok 2: Pevná látka obdržená jak je uvedeno výše, se podrobí čištění na sloupci s použitím směsi rozpouštědel ethylacetát-hexan k získání 700 mg 5-(2'-hydroxyethoxy)kamptothecinu vzorce 1 a 200 mg dříve připraveného 5-hydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H. Teplota tání: 190 °C. [a]D při 26 °C = +28,30 (c 0,106, CHC13). IČ: 3300, 3285, 1745, 1665, 1620, 1605, 1227, 1160, 1112, 1047 cm¹. Částečné údaje ’H NMR v CDC13: δ 7,01 (s, 0,5 H), 6,92 (s, 0,5 H), 4,30 - 3,71 (m, 4 H), 3,75 (široký s, 2 H, D₂O vyměnitelné), 2,0 - 1,79 (m, 2 H), 1,15 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 408 (M+l), 390, 378, 364,348, 319, 101, 76.

Příklad 27

Příprava 10-hydroxy-5-trifluorethoxy-kamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R³ = R⁴= R⁵ = H, R² = OH a R⁶ = CH₂CF₃

Krok 1: Nejprve se připraví 10,5-dihydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H, R² = OH, jak je popsáno v příkladu 22.

Krok 2: Směs 10,5-dihydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R² = OH, R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H (200 mg) a trifluorethanolu (1 ml) se suspenduje v 50 ml dichlorethanu a vaří pod zpětným chladičem v přítomnosti kyseliny sírové (0,5 ml) po dobu 18 hodin. Reakční směs se odpaří dosucha a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje olejovitý odparek, který se čistí na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla pro obdržení 140 mg 10-hydroxy-5-trifluorethoxykamptothecinu vzorce 1 ve formě pevné látky. Teplota tání: 237 °C. IČ: 3420, 1748, 1664, 1605, 1159 cm^-1. ’HNMR (DMSO-d6): δ 10,48 (s, 1 H, D2O vyměnitelné), 8,45 (s, 1 H), 8,04 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,47 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,40 (s, 1 H), 7,18 (s, 1 H), 7,11 (s, 0,5 H), 7,06 (s, 0,5 H), 6,58 (s, 1 H, D2O vyměnitelné), 5,41 (s, 2H), 5,05 - 4,55 (m, 2 H), 2,05 - 1,75 (m, 2 H), 1,00-0,8 (m, 3 H). ¹³CNMR (DMSO-d6): δ 172,4, 161,0, 157,7, 157,1, 151,2, 147,5, 144,3, 143,7, 131,0, 130,8, 129,8, 129,1, 124,0, 121,4, 120,7, 109,6, 96,6, 89,7, 72,3, 65,1, 30,4, 7,8. Hmot, spektr, (m/z): 462 (M+l), 418, 364, 320,291,263.

Příklad 28

Příprava 9-nitro-5-trifluorethoxykamptothecinu vzorce 1, kde R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, R¹ =NO2 a R⁶ = CH2CF₃

Krok 1: Nejprve se připraví 9-nitro-5-hydroxykamptothecin vzorce 13, kde R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, R¹ = NO₂, jak je popsáno v příkladu 21.

Krok 2: Směs 9-nitro-5-dihydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = NO₂, R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H (100 mg) a trifluorethanolu (0,5 ml) se suspenduje ve 25 ml dichlorethanu a vaří pod zpětným chladičem v přítomnosti kyseliny sírové (0,3 ml) po dobu 18 hodin. Reakční směs se odpaří dosucha a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje olejovitý odparek, který se čistí na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel acetonchloroform jako elučního činidla pro obdržení 60 mg 9-nitro-5-trifluorethoxykamptothecinu

-31 CZ 293421 B6 vzorce 1 jako pevné látky. Teplota tání: 210 °C. IČ: 3457, 1745, 1665, 1623, 1527, 1154, 1000 cm’¹. 'H NMR (CDCI₃): δ 9,30 (s, 1 H), 8,53 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 8.49 (d, J = 8,6 Hz, 1 H), 7,94 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,62 (s, 0,5 H), 7,60 (s, 0,5 H), 6,87 (s, 0,5 H), 6,81 (s, 0,5 H), 5,69 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,29 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,97 (m, 1 H), 4,52 (m, 1 H), 3,90 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 1,90 (m, 2 H), 1,05 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 491 (M+l), 461, 446, 418, 393, 364, 349, 319, 290, 216.

Přiklad 29

Příprava 5-(2'-fluorethoxy)kamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R² = R^! = R⁴= R⁵ = H a R⁶ = CH₂CH₂F

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, jak je popsáno v příkladu 2.

Krok 2: Směs 5-hydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H (200 mg) a 2-fluorethanolu (2 ml) se suspenduje ve 30 ml dichlorethanu a vaří pod zpětným chladičem v přítomnosti kyseliny sírové (0,3 ml) po dobu 18 hodin. Reakční směs se odpaří dosucha a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a solankou a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje olejovitý odparek, který se čistí na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla k obdržení 130 mg 5-(2-fluorethoxy)kamptothecinu vzorce 1 jako pevné látky. Teplota tání: 174 °C. IČ: 1745, 1664, 1615, 1160, 1040, 752 cm^-1. 'H NMR (CDCI3 + DMSO-d₆): δ 8,46 (s, 1 H), 8,20 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,95 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,83 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,65 - 7,55 (m, 2 H), 6,86 (s, 0,5 H), 6,78 (s, 0,5 H), 5,68 (d, J = 16,5 Hz, i H), 5,26 (d, J = 16,5 Hz, 1 H), 4,90 - 4,20 (m, 4 H), 4,44 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 2,05 - 1,85 (m, 2 H), 1,12 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 410 (M+l), 365, 348, 319, 304.

Příklad 30

Příprava 10-hydroxy-5-(2-fluorethoxy)kamptothecinu vzorce 1, kde R¹ = R³ = R⁴ - R⁵= H, R² = OH a R⁶ = CH₂CH₂F

Krok 1: Nejprve se připraví 10,5-dihydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H, R² = OH, jak je popsáno v příkladu 22.

Krok 2: Směs 10,5-dihydroxykamptothecinu vzorce 13, kde R² = OH, R¹ = R³ = R⁴ = R⁵ = H, (100 mg) a 2-fluorethanolu (2 ml) se suspenduje ve 25 ml dichlorethanu a vaří pod zpětným chladičem v přítomnosti kyseliny sírové (0,2 ml) po dobu 16 hodin. Reakční směs se odpaří dosucha a odparek se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a roztokem chloridu sodného a suší bezvodým síranem sodným. Odpaření rozpouštědla poskytuje olejovitý odparek, který se čistí na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučního činidla a obdrží se 60 mg 10-hydroxy-5-fluorethoxykamptothecinu vzorce 1 jako pevné látky. Teplota tání: 258 až 260 °C. IČ: 3225, 1748, 1660, 1593, 1159 cm’¹. *HNMR (CDCI3 + DMSO-d₆): δ 10,0 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 8,31 (s, 1 H), 8,00 (d, J = 6 Hz, 1 H), 7,80 (s, 1 H), 7,45 (d, J = 6 Hz, 1 H), 7,40 (s, l H), 6,85 (s, 0,5 H), 6,80 (s, 0,5 H), 6,15 (s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 5,55 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,23 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,85 - 4,20 (m, 4 H), 2,05 - 1,81 (m, 2 H), 1,0 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 426 (M+l), 382, 364, 320.

Příklad 31

Příprava 5-(2'-fluorethoxy)-7-ethylkamptothecinu

-32CZ 293421 B6

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxy-7-ethylkamptothecinu vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 80 mg 5-hydroxy-7-ethvlkamptothecinu a 0,1 ml kyseliny ptoluensulfonové suspendované ve 12 ml benzenu se přidá 20 mg 2-fluorethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 14 hodin. Reakce se přeruší přidáním kapky pyridinu a provede se extrakce ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel ethylacetát-chloroform jako elučního činidla a poskytuje 60 mg 5-(2'-fluorethoxy)-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 112 °C. IČ: 3070, 1748, 1665, 1605, 1456, 1155, 1038, 767 cm'¹. ’H NMR (CDC1₃): δ 8,21 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 8,17 (d, J = 9,2 Hz, 1 H), 7,82 (t, J = 7,4 Hz. 1 H). 7,67 (t, J = 7,4 Hz, 1 H), 7,57 (s, 0,5 H), 7,54 (s, 0,5 H), 7,00 (s, 0,5 H), 6,89 (s, 0,5 H), 5,69 (d. J = 16 Hz, 1 H), 5,27 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,81-4,12 (m, 4 H), 3,51-3,15 (m, 2 H), 1,93 (m, 2 H), 1,45 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,05 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 438 (M+l), 420, 406, 376, 347, 332, 317, 245, 91.

Příklad 32

Příprava 5-(2'-hydroxyethoxy)-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 250 mg 5-hydroxy-7-ethylkamptothecinu a 10 μΐ koncentrované kyseliny sírové suspendované v 25 ml dichlorethanu se přidá 0,5 ml ethylenglykolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 14 hodin. Reakce se přeruší přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a roztokem chloridu sodného a odpaří dosucha. Odparek se čistí chromatografií na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel ethylacetát-chloroform jako elučního činidla a poskytne 180 mg 5-(2'-hydroxyethoxy)-7ethylkamptothecinu a 25 mg výchozího materiálu. *HNMR (CDC1₃, 200 MHz): δ 8,20 (d, J = 8 Hz, 1 H), 8,15 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,85 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,69 (t, J = 7,3 Hz, 1 H), 7,56 (s, 0,5 H), 7,54 (s, 0,5 H), 7,11 (s, 0,5 H), 6,99 (s, 0,5 H), 5,72 (d, J = 16,5 Hz, 1 H), 5,28 (d, J = 16,5 Hz, 0,5 H), 5,26 (d, J = 16,5 Hz, 0,5 H), 3,95 - 3,65 (m, 4 H), 3,78 (široký s, 2 H, D₂O vyměnitelné), 3,5-3,18 (m, 2 H), 1,95-1,81 (m, 2 H), 1,45 (t, J = 7,5 Hz, 3 H), 1,06 (m, 3 H).

Příklad 33

Příprava 5-(2'-hydroxyethoxy)-l 0-hydroxykamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 10,5-dihydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ - R³ = R⁴ = R⁵ = H a R² = OH, jak je popsáno v příkladu 22.

Krok 2: Ke směsi 60 mg 10,5-dihydroxykamptothecinu a 5 mg kyseliny p-toluensulfonové suspendované v 10 ml dichlorethanu se přidá 25 mg ethylenglykolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Reakce se přeruší přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a roztokem chloridu sodného a odpaří dosucha. Odparek se čistí chromatografií na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel methanol-chloroform jako elučního činidla a poskytne 40 mg 5-(2'-hydroxyethoxy)-10hydroxykamptothecinu a 10 mg výchozího materiálu. 1Č: 3070, 1760, 1660, 1600, 1558, 1509, 1384, 1160, 1047, 832 cm'¹. ’HNMR (CDC1₃ + DMSO): δ 10,05 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 8,35 (s, 1 H), 8,05 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,75 (s, 1 H), 7,45 (d, J = 9 Hz, 1 H),

-33CZ 293421 B6

7,28 (s, 1 H), 6,95 (s, 0,5 H), 6,85 (s, 0,5 H), 5,65 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,25 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,11 (m, 2 H), 3,78 (m, 2 H), 4,05 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 1,98 (m, 2 H), 1,05 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 425, 408, 380, 364, 336, 320, 305, 264, 235, 147, 105.

Příklad 34

Příprava 5,10-dihydroxy-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-ethoxy-10-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 1, kde R¹ = R³ = R⁴ = H, R - R⁶ = Et a R² = OH, jak je popsáno v příkladu 18.

Krok 2: 12 ml 25% HC1 se přidá ke 200 mg 5-ethoxy-10-hydroxy-7-ethylkamptothecinu rozpuštěného v 10 ml ethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 24 hodin. Přebytečná kyselina a ethanol se oddestilují a zbývající odparek se zředí ethylacetátem. Organická vrstva se promyje 5% roztokem hydrogenuhličitanu sodného a roztokem chloridu sodného. Odpaření rozpouštědla a vyčištění pevné látky na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel aceton-chloroform jako elučniho činidla poskytuje 105 mg 5,10-dihydroxy-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 197 °C. IČ: 3268, 2975, 1748, 1656, 1597, 1514, 1230, 1161, 1052, 841 cm“¹. 'H NMR (CDClj + DMSO): δ 10,0 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 8,05 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,76 (s, 2 H), 7,42 (m, 1 H), 7,04 (s, 0,5 H), 6,98 (s, 0,5 H), 5,65 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,23 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3,51 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 3,45 - 3,12 (m, 2 H), 1,94 (m, 2 H), 1,42 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,01 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 408 (M+l), 379, 364, 347, 335, 285,169, 119, 101,83.

Příklad 35

Příprava 5-(2'-hydroxyethoxy)-l 0-hydroxy-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 7-ethyl-5,10-dihydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R³ = R⁴ = H, R² = OH a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 34.

Krok 2: Ke směsi 100 mg 10,5-dihydroxy-7-ethylkamptothecinu a 5 mg kyseliny p-toluensulfonové suspendované v 10 ml dichlorethanu se přidá 50 mg ethylenglykolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Reakce se přeruší přídavkem kapky pyridinu a provede se extrakce ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou a roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel methanol-chloroform jako elučniho činidla a poskytuje 60 mg 5-(2'-hydroxyethoxy)-10-hydroxy-7-ethylkamptothecinu a 12 mg výchozího materiálu. Teplota tání: 124 °C. ’H NMR (CDC1₃ + DMSO): δ 10,0 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 8,02 (d, J = 9 Hz, 1 H), 7,55 - 7,39 (m, 3 H), 7,02 (s, 0,5 H), 6,93 (s, 0,5 H), 6,05 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 5,63 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,23 (d, J = 16 Hz, 1 H), 3,94 - 3,54 (m, 2 H), 3,41 - 3,05 (m, 2 H), 1,93 (m, 2 H), 1,40 (t, J = 7 Hz, 3 H), 1,02 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 408 (M+l), 379, 364, 347, 335,285, 169, 119, 101,83.

Příklad 36

Příprava 5-(2'-aminoethoxy)kamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, jak je popsáno v příkladu 2.

-34CZ 293421 B6

Krok 2: Ke směsi 60 mg 5-hydroxykamptothecinu a 5 mg kyseliny p-toluensulfonové suspendované v 10 ml benzenu se přidá 15 mg 2-aminoethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 14 hodin. Reakce se přeruší přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí sloupcovou chromatografií na silikagelu s použitím směsi rozpouštědel methanol-chloroform jako elučního činidla a poskytne 36 mg 5-(2'-aminoethoxy)kamptothecinu a 10 mg výchozí látky. Teplota tání: 170 °C. IČ: 3451, 1740, 1664, 1604, 1383, 1189, 1042 cm’¹. Částečné údaje ’HNMR v (CDC1₃ + DMSO-d₆): δ 7,5 (d, D₂O vyměnitelné, 1 H), 7,15 (d, D₂O vyměnitelné), 1 H), 7,02 (s, 0,5 H), 6,92 (s, 0,5 H), 5.65 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,28 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,24 - 3,85 (m, 2 H), 2,35 (s, D₂O vyměnitelné, 1 H), 2,34 (m, 1 H), 2,15 - 1,85 (m, 3 H), 1,12 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 408 (M+l), 364, 347, 319, 305, 291, 249, 103, 62.

Příklad 37

Příprava 5-(2'-aminoethoxy)-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 85 mg 7-ethyl-5-hydroxykamptothecinu a 5 mg kyseliny p-toluensulfonové suspendované ve 20 ml benzenu se přidá 11 mg 2-aminoethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 10 hodin. Reakce se ukončí přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí chromatografií na sloupci silikagelu s použitím rozpouštědel methanol-chloroform jako elučního činidla a s obdržením 65 mg 5-(2'-aminoethoxy)-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 230 °C. Částečné údaje ’H NMR v (CDC1₃ + DMSO-de): δ 7,5 (d, D₂O vyměnitelné, 1 H), 7,15 (d, D₂O vyměnitelné, 1 H), 7,02 (s, 0,5 H), 6,92 (s, 0,5 H), 5,65 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,28 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,24 - 3,85 (m, 2 H),

2.35 (s, D₂O vyměnitelné, 1 H), 2,34 (m, 1 H), 2,15 - 1,85 (m, 3 H), 1,12 - 0,95 (m, 1 H). Hmot, spektr, (m/z): 408 (M+l), 364, 347, 319, 305, 103, 74, 62.

Příklad 38

Příprava 5-(3'-dimethylaminopropoxy)-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 13, kde R¹ — R² = R³ - R⁴ = H a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 50 mg 7-ethyl-5-hydroxykamptothecinu a 0,05 ml kyseliny sírové suspendované ve 20 ml benzenu se přidá 30 mg 3-dimethylamino-l-propanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 12 hodin. Reakce se ukončí přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí chromatografií na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel methanol-chloroform jako elučního činidla pro obdržení 42 mg 5-(3'-dimethylaminopropoxy)-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 113 °C. Částečné údaje ’H NMR v (CDC1₃ + DMSO-d₆): δ 6,95 (s, 0,5 H), 6,85 (s, 0,5 H), 5,65 (d, J = 16 Hz, 1 H),

5.35 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,25 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 3,95 - 3,57 (m, 2 H), 3,30 - 3,05 (m, 2 H), 2,85 (s, 3 H), 2,83 (s, 3 H), 2,15 - 1,72 (m, 6 H), 1,45 (t, J = 7,5 Hz, 3 H), 1,12 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 478 (M+l), 434,375,347,331,169,102, 84.

-35CZ 293421 B6

Příklad 39

Příprava 5-(2'-n-pyrrolidinoethoxy)-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 13. kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 100 mg 7-ethyl-5-hydroxykamptothecinu a 10 mg kyseliny kafrosulfonové suspendované ve 25 ml benzenu se přidá 30 mg l-(2-hydroxyethyl)pyrrolidinu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 16 hodin. Reakce se přeruší přídavkem kapky py ridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí chromatografíí na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel methanol-chloroform jako elučního činidla s obdržením 85 mg 5-(2'-N-pynOlidinoethoxy)-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 225 °C. IČ: 3424, 1749, 1666, 1616, 1384, 1156, 1078, 1049 cm’¹. Částečné údaje *HNMR vCDC1₃: δ 7.02 (s, 0,5 H), 6,95 (s, 0,5 H), 5,70 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,33 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,26 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 4,18-3,88 (m, 2 H), 3,45 - 3,15 (m, 2 H), 3,06 - 2,58 (m, 6 H), 2,05 - 1,72 (m, 6 H), 1,43 (t, J = 8 Hz, 3 H), 1,15 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 446 (M+l), 375, 347, 331, 245, 169, 116, 97, 84.

Příklad 40

Příprava 5-(2'-€hlorethoxy)-7-ethylkamptothec inu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 500 mg 7-ethyl-5-hydroxykamptothecinu a 0,1 ml koncentrované kyseliny sírové suspendované ve 30 ml benzenu se přidá 700 mg 2-chlorethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem s použitím Deanovy-Starkova nástavce po dobu 8 hodin. Reakce se ukončí přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí chromatografíí na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel ethylacetát-chloroform jako elučního činidla a poskytne 400 mg 5-(2'-chlorethoxy)-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 168 °C. *H NMR (CDC1₃, 200 MHz): 5 8,20 (d, J = 9,5 Hz, 1 H), 8,15 (d, J = 9,5 Hz, 1 H), 7,82 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,67 (t, J = 8 Hz, 1 H), 7,54 (d, J = 6,2 Hz, 1 H), 7,02 (s, 0,5 H), 6,90 (s, 0,5 H), 5,70 (d, J= 16 Hz, 0,5 H), 5,69 (d, J= 16 Hz, 0,5 H), 5,26 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,25 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 4,61 - 3,95 (m, 2 H), 3,78 - 3,58 (m, 2 H), 3,50 - 3,15 (m, 2 H), 1,98- 1,78 (m, 2 H), 1,45 (t, J = 7,5 Hz, 3 H), 1,12 - 0,95 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 455 (M+l), 437, 409, 392, 376, 347, 331, 245, 115, 81.

Příklad 41

Příprava 5-(2'-dimethylaminoethoxy)-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxy-7-ethylkamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = Ha a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 100 mg 7-ethyl-5-hydroxykamptothecinu a 0,1 ml koncentrované kyseliny sírové suspendované v 10 ml benzenu se přidá 50 mg 2-N,N-dimethylaminoethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem s použitím Deanovy-Starkova nástavce po dobu 10 hodin. Reakce se ukončí přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se

-36CZ 293421 B6 promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí chromatografií na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel methanolchloroform jako elučního činidla s obdržením 65 mg 5-(2'-dimethylaminoethoxy)-7-ethylkamptothecinu. Částečné údaje 'H NMR v CDCh: δ 7,05 (s, 0.5 H), 6,93 (s, 0,5 H), 5,74 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,73 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,29 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,41 - 3,75 (m, 2 H), 3,53 - 3,18 (m, 2 H), 2,57 (q, J = 6 Hz, 2 H), 2,26 (s, 3 H), 2,23 (s, 3 H), 2,05 - 1,86 (m, 2 H), 1,47 (t, J = 8 Hz, 3 H), 1,18 - 1,01 (m, 3 H).

Příklad 42

Příprava 5-(4'-aminobutoxy)kamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, jak je popsáno v příkladu 2.

Krok 2: Ke směsi 53 mg 5-hydroxykamptothecinu a 8 mg kyseliny p-toluensulfonové suspendované v 16 ml benzenu se přidá 14 mg 4-aminobutanolu a směs se zahřívá pod zpětným chladičem po dobu 10 hodin. Reakce se přeruší přídavkem kapky' pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí chromatografií na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel ethylacetát-chloroform jako elučního činidla s obdržením 45 mg 5-(4'-aminobutoxy)kamptothecinu. Teplota tání: 150 °C. IČ: 3397, 1745, 1664, 1617, 1384, 1224, 1162, 1038, 684, 570 cnT*. Částečné údaje ‘HNMR v (CDC1₃ + DMSO-d₆): δ 7,50 (d, D₃O vyměnitelné, 1 H), 6,95 (s, 0,5 H), 6,85 (s, 0,5 H), 6,25 (d, D₂O vyměnitelné, 1 H), 5.65 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,35 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 5,25 (d, J = 16 Hz, 0,5 H), 4,15 - 3,80 (m, 2 H), 2,15 - 1,65 (m, 8 H), 1,15 - 0,98 (m, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 436 (M+l), 392, 347, 333, 305, 153, 123, 105,90, 62.

Příklad 43

Příprava 5-(2'-methoxyethoxy)kamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hydroxykamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = R⁵ = H, jak je popsáno v příkladu 2.

Krok 2: Ke směsi 120 mg 5-hydroxykamptothecinu a 0,13 ml kyseliny sírové suspendované v 18 ml chloroformu se přidá 20 mg ethylenglykolmonomethyletheru a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 10 hodin. Reakce se ukončí přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří se dosucha. Odparek se čistí chromatografií na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel ethylacetátu-chloroformu jako elučního činidla a obdrží se 80 mg 5-(2'-methoxyethoxy)kamptothecinu. Teplota tání: 123 ^CC. IČ: 3294, 2933, 1748, 1665, 1617, 1384, 1155, 1077, 1045, 761 cm'¹. 'HNMR (CDC1₃): δ 8,51 (s, 1 H), 8,24 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,93 (d, J = 8 Hz, 1 H), 7,79 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,65 (t, J = 6,8 Hz, 1 H), 7,58 (s, 0,5 H), 7,56 (s, 0,5 H), 6,91 (s, 0,5 H), 6,82 (s, 0,5 H), 5,71 (d, J = 16 Hz, 1 H), 5,28 (d, J = 16 Hz, 1 H), 4,55 - 4,05 (m, 2 H), 3,95 (široký s, 1 H, D₂O vyměnitelné), 3,81 - 3,56 (m, 2 H), 3,48 (s, 1,5 H), 3,44 (s, 1,5 H), 1,94 (m, 2 H), 1,05 (t, J = 7 Hz, 3 H). Hmot, spektr, (m/z): 423 (M+l), 364, 347, 319,304,275,218,128,101,82.

-37CZ 293421 B6

Příklad 44

Příprava 5-(2'-N-methylpyrrolidinoethoxy)-7-ethylkamptothecinu

Krok 1: Nejprve se připraví 5-hy droxy-7-ethylkamptothecin vzorce 13, kde R¹ = R² = R³ = R⁴ = H a R⁵ = Et, jak je popsáno v příkladu 4.

Krok 2: Ke směsi 50 mg 5-hydroxy-7-ethylkamptothecinu a 10 mg kyseliny p-toluensulfonové suspendované v 15 ml benzenu se přidá 18 mg l-methyl-2-pyrrolidinoethanolu a směs se vaří pod zpětným chladičem po dobu 8 hodin. Reakce se ukončí přídavkem kapky pyridinu a směs se extrahuje ethylacetátem. Organická vrstva se promyje vodou, hydrogenuhličitanem sodným, roztokem chloridu sodného a odpaří dosucha. Odparek se čistí chromatografii na sloupci silikagelu s použitím směsi rozpouštědel methanol-chloroform jako elučního činidla a získá se 35 mg 5-(2'-N-methylpyrrolidinoethoxy)-7-ethylkamptothecinu. Teplota tání: 102 °C. Hmot, spektr, (m/z): 504 (M+l), 460, 375, 347, 331, 275, 245, 128, 110, 84.

Claims (9)

1. Analog 20(S)-kamptothecinu obecného vzorce 1 ve kterém

R¹, R², R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě atom vodíku nebo představují skupinu zvolenou z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 8 atomy uhlíku, nitroskupiny nebo substituované aminoskupiny, kde aminoskupina je monosubstituována nebo disubstituována a kde substituent je zvolen z alkylové skupiny s 1 až 8 atomy uhlíku nebo substituované alkylové skupiny s 1 až 8 atomy uhlíku, přičemž tyto substituenty jsou zvoleny z hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 8 atomy uhlíku a alkylaminoskupiny s 1 až 8 atomy uhlíku,

R⁵ znamená atom vodíku nebo alkylovou skupinu s 1 až 6 atomy uhlíku,

R⁶ znamená substituovanou alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku, kde substituent je zvolen z atomu halogenu, hydroxyskupiny, alkoxyskupiny s 1 až 8 atomy uhlíku nebo aminoskupiny, kde aminoskupina může být nesubstituována nebo monosubstituována či disubstituována, přičemž substituent je zvolen z hydroxyskupiny nebo alkylové skupiny s 1 až 8 atomy uhlíku, přičemž když aminoskupina je disubstituována, substituenty jsou nezávislé nebo kombinované dohromady za vzniku cyklického kruhu obsahujícího 6 atomů v kruhu, přičemž atomy kruhy jsou atomy uhlíku a atom dusíku,

-38CZ 293421 B6 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

2. Sloučenina podle nároku 1, která je zvolena z

5-trifluorethoxy-CPT,

9- nitro-5-(2'-methoxyethoxy)-CPT, 7-ethyl-5-(2-chlorethoxy)-CPT.

5-(2'-hydroxyethoxy)-CPT,

10- hydroxy-5-(2'-hydroxyethoxy)-CPT,

7-ethyl-10-hydroxy-5-(2'-hydroxyethoxy)-CPT,

9- nitro-5-fluorethoxy-CPT,

10- hydroxy-5-trifluorethoxy-CPT,

7-ethyl-10-hydroxy-5-trifluorethoxy-CPT, 7-ethyl-5-dimethylaminopropoxy-CPT,

7—ethyl—10-hydroxy-5-fluorethoxy-CPT,

5-(2'-hydroxyethoxy)-7-ethyl-CPT a

5-(2'-methoxyethoxy)-CPT, kde CPT představuje 20(S)-kamptothecin.

3. Sloučeniny obecného vzorce 1, ve kterém R¹ až R⁶ mají význam vy mezený v kterémkoliv z nároků 1 a 2, jako směs dvou diastereomerů, kde tyto diastereomery mají konfigurace 20(S),5(R) a 20(S),5(S).

4. Sloučeniny obecného vzorce 1, kde každý z diastereomerů má konfiguraci 20(S),5(R) a 20(S),5(S) jako jednotlivý izomer v podstatě prostý druhého izomeru, ve kterém R¹ až R⁶ mají význam vymezený v některém z nároků 1 a 2.

5. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny obecného vzorce 1, jak je definována v kterémkoliv z nároků 1 až 4, nebo její farmaceuticky přijatelné soli a farmaceuticky přijatelnou netoxickou pomocnou látkou, zřeďovadlo nebo rozpouštědlo.

6. Sloučenina obecného vzorce 1, podle nároků 1 až 4, pro léčení rakovin, leukémie a stavů vztahujících se k HIV.

7. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny, leukémie a stavů vztahujících se k HTV.

8. Způsob přípravy sloučeniny vzorce 1 podle nároku 1,vyznačující se tím, že se (i) nechá reagovat sloučenina obecného vzorce 2

CL 293421 B6 ve kterém

R¹ až R⁵ mají popsaný význam, v přítomnosti kyseliny, která je zvolena z anorganických kyselin a Lewisových kyselin, a železité soli se sloučeninou obecného vzorce

R⁶'-OH, ve kterém

R⁶' znamená alkylovou skupinu s 1 až 8 atomy uhlíku nebo hydroxyalkylovou skupinu,

15 za vzniku sloučeniny obecného vzorce 12 a sloučeniny obecného vzorce 13

-40CZ 293421 B6 (13) ve kterých

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶ mají uvedený význam, a podle potřeby (ii) se oddělí sloučeniny obecných vzorců 12 a 13 připravené v kroku (i), podle potřeby (iii) se hydrolyzuje sloučenina obecného vzorce 12 k získání přídavných množství sloučeniny obecného vzorce 13, podle potřeby (iv) reakce sloučeniny obecného vzorce 13 v přítomnosti ky seliny, která je zvolena z anorganických kyselin, Lewisových kyselin nebo organických kyselin, se sloučeninou obecného vzorce

R⁶-OH, ve kterém

R⁶ má význam uvedený v nároku 1, za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1 ve kterém

R¹, R², R³, R⁴, R⁵ a R⁶ mají význam definovaný v nároku 1.

-41 CZ 293421 B6

9. Způsob podle nároku 8 pro přípravu sloučeniny vzorce 1, ve kterém R¹, R³, R⁴ a R⁵ znamenají atom vodíku, R² znamená hydroxyskupinu a R⁶ znamená trifluorethylovou skupinu, vyznačující se tím, že

5 (i) se nechá reagovat sloučenina obecného vzorce 2 ve kterém

R¹, R³, R⁴ a R⁵ znamenají atom vodíku a

R² znamená hydroxyskupinu, v přítomnosti koncentrované kyseliny sírové a trihydrátu chloridu železitého s ethanolem a zahřívání směsi za podmínek refluxu, za vzniku sloučeniny obecného vzorce 12

-42CZ 293421 B6 a sloučeniny obecného vzorce 13 (13), ve kterých

R¹, R², R³, R⁴ a R' znamenají atom vodíku,

R² je hydroxyskupina a

R⁶' znamená ethylovou skupinu, (ii) se oddělí sloučeniny obecného vzorce 12 a obecného vzorce 13 připravených v kroku (i), (iii) se hydrolyzuje sloučenina obecného vzorce 12 jejím rozpuštěním ve vodném ethanolu a refluxování s kyselinou chlorovodíkovou za vzniku přídavných množství sloučeniny obecného vzorce 13, (iv) se nechá reagovat sloučenina obecného vzorce 13 v přítomnosti koncentrované kyseliny sírové s trifluorethanolem rozpuštěným v dichlorethanu jako rozpouštědle, za vzniku sloučeniny obecného vzorce 1