CZ292108B6

CZ292108B6 - Pseudopeptidový produkt s imidazol skupinou, způsob jeho přípravy a jeho použití

Info

Publication number: CZ292108B6
Application number: CZ19961155A
Authority: CZ
Inventors: Marc Babizhayev; Marie Christine Sequin
Original assignee: Exsymol Societe Anonyme Monegasque; Marc Babizhayev
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2003-07-16
Also published as: WO1995012581A1; CZ115596A3; PT726895E; RU2159775C2; FR2711990A1; CA2174526A1; JP3503899B2; GR3034543T3; KR960705785A; DE69425153T2; KR100363812B1; HUT74387A; ES2149951T3; FR2711990B1; CN1136808A; HU222566B1; UA56123C2; US6046340A; CN1056608C; JPH09504540A

Abstract

eÜen se t²k pseudopeptidov ho produktu vybran ho ze skupiny sest vaj c z glutamylhistaminu, N-methyl-2-amino-L-butyrylhistaminu, 2-aminoisobutyrylhistaminu, L-norleucylhistaminu, 2-amino-L-oktanoylhistaminu, terc-butyloxykarbonyl-2-amino-L-pentanoylhistaminu, L-ornithylhistaminu, L-2,6-diamino-(pentan-1,5-dikarboxyl)-histaminu, N-acetyl-2-aminobutyrylhistaminu, N-fenacetyl-2-aminobutyrylhistaminu, L-arginylhistaminu, L-prolylhistaminu, 4-hydroxy-L-prolylhistaminu, L-pyroglutamylhistaminu, chel t tohoto produktu, chemick ho a enzymatick ho zp sobu jeho p° pravy a jeho pou it ve farmacii, kosmetice a ke stabilizaci a konzervaci.\

Description

Pseudopeptidový produkt s imidazol skupinou, způsob jeho přípravy a jeho použití

Oblast techniky

Vynález se týká pseudodipeptidových produktů, a zvláště pseudodipeptidového produktu s imidazol skupinou nebo s N-substituovaným imidazolem, a použití takovéhoto produktu v oblasti léčení, kosmetiky a potravinářství.

»

Dosavadní stav techniky

Struktury uvedené v literatuře, jmenovitě ty, které jsou uvedeny v evropských patentových přihláškách (EP 0 372 818, EP 0 144 290 a EP 0 143 746) nebo ty z pravidelně vycházejících 15 publikací vydávaných J.F. Modderem a kol. (Joumal of Organical Chemistry, 1991, svazek 56, č. 19, strany 5 606-5 610), H. Arnoldem a kol. (Zeitschrift fur Chemie, 1969, svazek 9, č. 4, strana 144), M.L. Peckem a kol. (Chemical abstracts, 1979, svazek 90, č. 15, anotace č. 115 121) nebo T. Gadjem a kol. (Joumal of the Chemistry Society, Perkin Transactions 2, 1994, č. 1, strany 157-164) se odlišují od struktur, které jsou předmětem vynálezu. Navíc se všechny tyto 20 struktury, spadající do stavu techniky, netýkají podstaty vynálezu, protože nevykazují aktivity a vlastnosti předmětných struktur.

Podstata vynálezu

Úkolem vynálezu je vytvořit pseudodipeptidový produkt na bázi imidazolu vybraný ze skupiny sestávající z glutamylhistaminu, N-methyl-2-amino-L-butyrylhistaminu, 2-aminoisobutyrylhistaminu, L-norleucylhistaminu, 2-amino-L-oktanoylhistaminu, /erc-butyloxykarbonyl-2amino-L-pentanoylhistaminu, L-omithylhistaminu, L-2,6-diamino-(pentan-l,5-dikarboxyl)30 histaxninu, N-acetyl-2-aminobutyrylhistaminu, N-fenacetyl-2-ammobutyrylhistaminu, L\ arginylhistaminu, L-prolylhistaminu, 4-hydroxy-L-prolylhistaminu, L-pyroglutamylhistaminu.

, Pseudodipeptidový produkt může být substituovaný jednou nebo více funkčními skupinami, jako jsou například alkohol, amin, karboxylová kyselina, alkoxy, thiolether, thiol, fosfát nebo sulfát.

Některé prvky této skupiny sloučenin jsou schopny vytvořit stabilní komplexy s atomy patřícími do skupiny přechodných kovů, cheláty, které sestávají ze spojení atomu kovu, například zinku, mědi, železa, kobaltu, manganu nebo niklu, přičemž zinek je nejvýhodnější s jednou nebo více molekulami pseudodipeptidu, a to v závislosti na způsobu přípravy a druhu pseudodipeptidu.

Pseudodipeptidový produkt podle vynálezu může být považován za produkt kondenzace mezi alfa aminokyselinou a histaminem nebo methylem substituovaným histaminem, jako je například 1-methylhistamin. Kromě toho lze nahradit atom kyslíku výsledné amidové vazby atomem síry.

Z toho důvodu pak může být pseudodipeptidový produkt získán různými způsoby syntézy jak chemické, tak i enzymatické.

Chemický způsob přípravy pseudodipeptidového produktu ve stručnosti spočívá vtom, že se vytvoří alfa aminokyselina N-chráněná skupinou X, vytvoří se alfa aminokyselina O-aktivovaná 50 skupinou Y, N-chráněná a O-aktivovaná aminokyselina se sloučí s histaminem a X se buď eliminuje podle požadovaného pseudodipeptidového produktu.

Detailněji je adekvátní proces chemické přípravy pro přípravu pseudodipeptidového produktu podle uvedeného vynálezu naznačen pomocí symbolů (AA je aminokyselina, Hist označuje 55 histamin) pro AA-Hist následujícím schématem:

-1CZ 292108 B6 (1)

AA + X + Υ--> X-AA-Y (2)

X-AA-Y + Hist (.2HC1) -> X-AA-Hist io První krok procesu zahrnuje přivedení aminokyseliny (AA) do stavu, kdy je N-chráněná skupinou X a O-aktivovaná skupinou Y.

N-ochrana je výhodou uskutečňována nahrazením atomu vodíku v aminu aminokyseliny, což může být acyl- nebo acyloxy radikál. Mezi nejzajímavější chránící skupiny můžeme zařadit 15 benzyloxykarbonyl (Z), 9-fluorenyl-methyloxykarbonyl (Fmoc), a radikály benzylu, ftaloylu, 2-nitrofenylsulfenylu a trifluoracetylu.

Ačkoli je možné se bez toho obejít, O aktivace se s výhodou uskutečňuje esterifikací karboxylové funkce aminokyseliny sloučeninou vybranou ze skupiny, kterou tvoří: kyanomethyl alkohol, 20 o-nitrofenol, 2,4,5-trichlorfenol, p-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, pentachlorfenol, pentafluorfenol, N-hydroxyftalamid, N-hydroxysukcinimid, 1-hydroxypiperidin a 5-chlor-8-hydroxychinolin.

Ze způsobů O-aktivace můžeme zase uvést procesy zahrnující transformaci karboxylové kyseliny na acylchlorid, hydrazid nebo smíšený nebo symetrický anhydrid.

Konkrétní způsob aktivace sestává z přivedení aminokyseliny AA do reakce s fosgenem, která vede k vytvoření N-karboxyanhydridu této aminokyseliny.

Druhým krokem procesu přípravy je spojení s histaminem, což může být uskutečněno se 30 spojovacím prostředkem nebo bez něj tak, že se nechá reagovat N-chráněná a O-aktivovaná (nebo ne) aminokyselina s histaminem s výhodou ve formě dihydrochloridu. Je nutno uvést, že spojovací prostředek není zásadně nutný při použití O-aktivované aminokyseliny.

Spojování bez spojovacího prostředku je uskutečňováno v organickém rozpouštědle (kterým 35 může být například chloroform, 1,2-dimethoxy-ethan, dimethylformamid...) v přítomnosti kyseliny (například kyseliny octové) nebo v zásadě (například triethylaminu) v hydroorganickém rozpouštědle (například voda-pyridin, nebo voda-l,2-dimethoxyetiian...) se zásadou (například soda nebo hydrogenuhličitan sodný...) a pak kyselinou (například kyselina chlorovodíková), v katalytických podmínkách ( například imidazol, N-ethylmorfolin...).

Pokud se použije spojovací prostředek, může být tímto prostředkem například dicyklohexylkarbodiimid, N-hydroxybenzotriazol a jeho deriváty, například hexafluorfosfát benzotriazolyoxy (trisdimethyl-amino) fosfonia (BOP), l-izobutyloxykarbonyl-2-izobutyloxy-l,2-dihydrochinolin, karbonyldiimidazol, Woodwardovo činidlo K, alfa-chlorvinylethylether, alfaalfa-dichlor45 diethylether, dichlormethylether, DCC a aditiva, DCC-pentachlorfenol, DCC-pentafluorfenol, kyanamid, ceteniminy a ceteny, soli oxazolinia, EEDQ (r-ethyloxykarbonyl-2-ethoxy-l,2dihydrochinolin), ynaminy acylfosfonia, trifenylfosfit a imidazol, měďnaté komplexní sloučeniny, SiCl.

Pokud je to nutné, skupina X nebo N-chránicí skupina, je eliminována ve třetím kroku:

X-AA-Hist --> AA-Hist

Tato eliminace je uskutečňována podle chránící skupiny hydrogenolýzou, redukcí sodíkem 55 v kapalném amoniu, hydrazinolýzou, acidolýzou, hydrolýzou nebo enzymaticky. Vhodné řešení

-2CZ 292108 B6 zahrnuje provedení tohoto kroku sejmutí chránící skupiny acidolýzou trifluoroctovou kyselinou.

V takovém případě se pseudodipeptidový produkt získá v jeho základní formě po ošetření amoniakem. Dále, když je tohoto dosaženo, daná sloučenina v její základní formě může být sloučena se solí přechodných kovů, aby se vytvořil chelát, například s výhodou asociace zinku s L-glutamylhistaminem.

Peptoidové produkty mohou být s výhodou - s ohledem na výtěžek a náklady - připraveny syntézou zcela nebo částečně enzymatickou. Enzymatický způsob přípravy spočívá v tom, že se spojí alfa aminokyselina s histaminem v přítomnosti enzymatického katalyzátoru typu hydrolázy.

, * Podle tohoto procesu lze navrhnout následující schéma syntézy:

Slučovací reakce může být popsána následující rovnicí:

X-AA-Y + hist + enzym-----> X-AA-hist + Y kde X-AA-Y je N-chráněná aminokyselina, jejíž příprava již byla popsána, a kde chránící skupina X může být acylový radikál, acyloxyradikál a podobně.

V daném případě skupina X umožňuje také zvýšení rozpustnosti AA v reakčním médiu. To může vést k volbě X za účelem zvýšení rozpustnosti AA v organickém médiu, například

X = Ph-CH2-O-C-benzyloxykarbonylový radikál

II

O

X-AA-Y je O-aktivované s esterifikací karboxylové funkce alkoholem vybraným ze skupiny, kterou tvoří: alifatické alkoholy, a zvláště ethanol, halogenalkylalkoholy, jako například 2,2,2trichlorethanol, aromatické alkoholy, například fenol, a všechny alkoholy uvedené výše pro aktivaci v chemické syntéze. Avšak z tohoto seznamu jsou vyloučeny všechny terciární alkoholy.

Slučovací reakce s histaminem (nebo methylovanými deriváty) v základní formě nebo se solí histaminu (nebo jednoho z jeho methylovaných derivátů), například s dihydrochloridemhistaminu, může být uskutečněna v rozsahu organických rozpouštědel, například alifatických hydro35 uhličitanových rozpouštědel (cyklohexan, heptan,...) nebo aromatických (toluen), terciárních alkoholů (terc-butanol, terc-amylalkohol), alkylhalogenidy (dichlormethan), ethery (isopropylether), acetonitril, dimethylformamid nebo dimethylsulfoxid.

Rozpouštědla mohou být použita samotná nebo v přítomnosti jiných látek, bez vody nebo v přítomnosti malého množství vody.

Reakce může být uskutečněna v přítomnosti nebo nepřítomnosti zásady, například triethylaminu.

Enzymatický katalyzátor patří do skupiny hydrolázových enzymů (lipáza, proteáza), které mohou být mikrobiálního, živočišného nebo rostlinného původu. Mohou se používat v čisté nebo nevyčištěné formě. S výhodou je enzymatickým katalyzátorem hydroláza vybraná ze skupiny sestávající z lipázy extrahované z mikroorganismů nebo živočišného původu, a proteázy.

Je možno uvést levné, na trhu dostupné typy, například lipázy extrahované z mikroorganismů:

Pseudomas sp., Candida rugosa, Mucor, nebo živočišného původu: pankreatická lipáza z vepřů (PLP), protázy, trypsin, chymotrypsin, substiliyin, papain, a podobně.

Tento katalyzátor, který není rozpustný v reakčním médiu, je rozptýlen v samotném rozpouštědle neboje imobilizovaný na externím inertním nosiči, aby se usnadnilo jeho recyklování.

-3CZ 292108 B6

- Reakce je uskutečňována v širokém rozsahu teplot mezi 4 °C a 70 °C, ale s výhodou od 35 °C do 45 °C, při míchání.

- Produkt slučování je shromážděn při filtraci nebo extrakci s vhodným rozpouštědlem.

- Tedy kroky sejmutí chránící skupiny s čištění mohou být uskutečněny podle procesu popsaného pro chemickou syntézu.

Avšak, krok sejmutí chránící skupiny může být uskutečněn enzymatickou reakcí podle reakce:

X-AA-hist + enzym------> AA-hist + X-OR

R-OH kde R = H nebo alkylový radikál.

Postup je stejný jako postup popsaný pro krok spojování, avšak lze zaznamenat, že ve speciálním případě, kdy R = H, probíhá reakce ve vodě.

Pro krok spojování lze předpokládat situace méně výhodné, avšak umožňující zásadně snížit náklady na použití:

- aminokyseliny nikoli N-chráněné (kde X = H), O-aktivované jako dříve,

- N-chráněné aminokyseliny, ale nikoli O-aktivované (kde Y = H) nebo dokonce původní aminokyseliny (X = Y = H).

Podmínky procesu jsou stejné jako u procesu popsaného výše pro N-chráněné, O-aktivované deriváty.

Strukturní charakteristiky pseudodipeptidového produktu podle vynálezu umožňují získat aktivní základní látky, které nejsou citlivé na enzymatickou deaktivaci.

Základní strukturní charakteristikou je nepřítomnost skupiny karboxylových kyselin na atomu uhlíku, umístěném v poloze alfa dusíku peptidové vazby, a pro některé produkty podle vynálezu je další strukturní charakteristikou nepřítomnost vodíku na atomu uhlíku navázaném na B (tedy R a R' = CF₃) nebo uhlovodíkovým radikálem.

Obecně je odolnost vůči enzymatické deaktivaci podporována stericky brzdícími substituenty, které jsou přítomny na koncovém uhlíku (napojeném na B), jako je například izopropylový, sefc-butylový, tórc-butylový nebo neopentylový radikál.

Odolnost vůči enzymatické deaktivaci se rovněž zvýší, když je koncový amin začleněn do cyklické struktury, jako je například typ získaný b) u výše uvedeného obecného vzorce nebo typ získaný a) u výše uvedeného vzorce, kde B je terciární cyklický amin (například piperidin).

Ještě obecněji, odolnost vůči enzymům, zvláště proteázám, když alfa-aminokyselina pseudodipeptidového produktu představuje strukturu, která je rozdílná od struktury přirozených alfaaminokyselin (tedy můžeme mluvit o neproteinogenních nebo nepřirozených aminokyselinách), to může být realizováno rozvážnou volbou stereochemie uhlíku navázaného na B v obecném vzorci. Ve skutečnosti přítomnost koncového asymetrického uhlíku umožňuje získat absolutní konfiguraci odlišnou od konfigurace přirozených aminokyselin.

-4CZ 292108 B6

Farmakologické vlastnosti

Farmakologické vlastnosti pseudodipeptidového produktu podle tohoto vynálezu vyplývají z uvedené necitlivosti vůči enzymatické deaktivaci.

Za prvé mají antioxidační vlastnost. Ve skutečnosti jsou schopny vzdorovat oxidačnímu tlaku, tedy takzvaně bojovat vůči radikálům na biologických strukturách. Tyto produkty jsou schopny působit v různých úrovních: jsou schopny reagovat přímo na různé typy volných radikálů (F.R.), ale také na toxické vedlejší produkty oxidačního tlaku. Také je zjištěno, že tyto aktivní produkty rovněž mohou opravně působit na změny způsobené volnými radikály na biologických strukturách.

Reaktivita jednoho ze členů této skupiny sloučenin takovýchto typů radikálů závisí na přesných strukturních prvcích, a není možno podat pravidla strukturní aktivity. Například se zdá, že menší strukturní rozdíl může vést k významné modifikaci pseudodipeptidového oxidačně-redukčního potenciálu, fyzikálně-chemické vlastnosti, která je přímo svázána s antioxidačním potenciálem. Tato konkrétní vlastnost vysvětluje rozdílnost vlastností pozorovaných u této skupiny sloučenin. Jako příklad jsou uvedeny výsledky pokusů in-vitro uskutečněných se dvěma pseudodipeptidovými produkty.

°) Byla zjištěna inhibiční schopnost na volném radikálu OH*:

Postup experimentuje popsán J.M.C. Gutteridgem v Biochemistry Joumal, svazek 224 (1984), strany 761-767:

- oxidační substrát: deoxyribóza

- systém produkce hydroxylového radikálu OH*: EDTA (ethylendiamintetraoctová kyselina)/železo, H2O2,

- Detekce: thiobarbiturová kyselina/malondialdehyd (MDA)

- Referenční antioxidant: dipeptid beta-alanyl-L-histidin (citlivý vůči enzymatické deaktivaci) % inhibice kontrolní vzorek (bez antioxidantu)0 beta-alanyl-L-histidin (10 mM)3 8

L-prolylhistamin62

L-glutamylhistamin (10 mM)0

2°) Byla zjištěna inhibiční schopnost na hyperoxidovém anionu O₂*~:

- Systém produkce hyperoxidového aniontu: xanthinoxydáza / hypoxanthin (nepřítomnost železa)

- Hyperoxidový anion je redukční látkou. Zvláště je schopen redukovat substrát, cytochrom c.

Po jeho redukci následuje ultrafialová spektrofotometrie na 550 nm.

Procentuální množství inhibice je popsáno následovně:

Rychlost redukce cytochromu c bez inhibitoru - rychlost s inhibitorem --------------------------------------------------------- xlOO

Rychlost redukce cytochromu c bez inhibitoru

-5CZ 292108 B6

L-glutamylhistamm (mM) % inhibice

3,5

V enzymatickém systému, který produkuje hyperoxidový anion, L-glutamylhistamm je schopen silně inhibovat redukci cytochromu c. Tato inhibice se různí podle koncentrace. L-prolylhistamin nebo příslušný antioxidant, beta-alanylhistamin nemají schopnost inhibovat hyperoxidový anion.

V některých případech, když B je sekundární amin, radikál X byl schopen zesílit některé antioxidační vlastnosti pseudodipeptidového produktu podle vynálezu. A to zvláště v případě, kdy substituentem je terc-butoxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl.

Další důležitou vlastností těchto produktů je jejich schopnost chránit vůči oxidačnímu tlaku jak biologické lipofílní struktury (buněčné membrány), tak hydrofilní struktury (biopolymery, například proteiny, DNA).

V důsledku přítomnosti imidazolového kruhu a nukleofilního aminu, některé prvky této skupiny mohou mít anti-glykační aktivitu a tak bránit neenzymatické reakci cukrů na proteinech a tedy bránit jejich rozkladu.

Přítomnost části strukturně podobné histaminu umožňuje některým prvkům této skupiny získat inhibiční aktivitu biologických účinků histaminu.

Naopak, v některých speciálních případech je možné získat sloučeninu s částí biologických vlastností histaminu.

A konečně tyto produkty mají také cytostimulační vlastnosti a v běžných podmínkách výhodu množení určitého typu buněk. Tato vlastnost může také vysvětlovat imunostimulační a imunomodulační chování někteiých členů této skupiny sloučenin.

Tímto způsobem by pseudodipeptidové produkty podle vynálezu podporovaly léčivé působení na imunitní systém buněk implikovaný v pokročilém stadiu léčby (lymfocyty, mastocyty, monocyty) a jejichž hlavním úkolem je vylučování růstových faktorů.

Tato imunostimulační schopnost je prokázána pomocí testu „in vitro“ na myších splenocytech. Postup experimentuje získán z: J.Kunert-Radek, H.Stepien, K.Lyson a M.Pawlikowski-,,Effects of calcium channel modulators on the proliferation of spleen lymphocytea in vitro“ - Agents and Aktions, svazek 29, č. 3-4 (1990), strany 254-258.

Po proliferací buněk následuje měření rychlosti včleňování tritiovaného thymidinu v buňkách, vyjádřený počtem rozpojení za minutu, odvozeno z šumového pozadí.

Výsledky získané uváděným imunostimulátorem, konkanavalinem A, jsou podány pro srovnání.

Imunostimulační účinek je vyjádřen indexem stimulace (IS).

IS =

Počet rozpojení za minutu u buněčné suspenze s přidáním mitogenu

Počet rozpojení za minutu u referenční buněčné suspenze bez mitogenu

-6CZ 292108 B6

Hodnoty odpovídají průměru tří měření.

Je možno pozorovat maximální imunostimulační účinek pro koncentraci 5 pg/ml L-glutamylhistaminu. Na závěr lze pozorovat střední imunostimulační účinek (buněčná proliferace) s tímto pseudodipeptidem pro koncentrace v rozmezí 5 až 10 pg/ml.

Koncentrace imunomodulátoru (pg/ml)

	2,5	5,0	10,0	25,0
IS (L-glutamylhistamin)	7,8	42,7	42,1	5,6
IS (konkanavalin A)	8,3	33,4	61,5	4,3

Tato účinnost je srovnatelná s účinností referenčního mitogenu: konkanavalinu A. Avšak buněčná preparace použitá pro tento test je heterogenní, a ve skutečnosti obsahuje několik typů mononukleových buněk.

Za účelem specifikace režimu působení pseudodipeptidů byl proveden druhý experiment na homogenním souboru lidských monocytů.

Buněčná proliferace byla vyhodnocena stejným způsobem jako výše:

Koncentrace imunomodulátoru (pg/ml)

	2,5	5,0	10,0	25,0
IS (L-glutamylhistamin)	8,23	39,80	23,50	2,50
IS (konkanavalin A)	4,82	29,60	21,0

Tak je demonstrována optimální stimulace monocytů pro stejné koncentrace jako výše. Můžeme rovněž pozorovat, že pseudodipeptid je mírně aktivnější než konkanavalin A s průměrným faktorem 1,34.

Výsledky podporují hypotézu o nepřímém režimu působení na lymfocyty přes aktivaci monocytů.

Ve většině případů je v in vivo pokusech zachování aktivity pseudodipeptidových produktů podle vynálezu svázáno se zachováním molekulární integrity ve styku s hydrolytickými enzymatickými systémy, a zvláště peptidázami.

Avšak bylo rovněž usilováno o určitou citlivost pseudodipeptidových produktů podle vynálezu vůči enzymatickým systémům, a to pro speciální použití. To je v případě, že B je sekundární amin a radikál X je

II ph - c CH3 - C - ^nefc>o

Aktivní produkt získaný například v prvním případě je možno hydrolyzovat in vivo enzymatickým způsobem, za účelem přetvoření nového pseudodipeptidu, který je rovněž aktivní:

O H R O H

III I III

CH3-C-N-C-Č-N-CH2-CH2-Im

H R O H

I III I

-------> H-N-C-C-N’-CH2-Ch*2“lm fV

Proto pouze získáme dočasnou ochranu peptoidní sloučeniny, ale je to rovněž způsob, jak přetvořit „in šitu“ primární aminovou funkci peptoidu, a tak znovu ustavit vlastnosti související s přítomností nukleofilního aminu v molekule, který je ionizovatelný při fyziologické hodnotě pH. Je možno zaznamenat antiglykační účinek, který částečně souvisí se schopností aminosloučeniny vázat se na redukující cukr kovalentní vazbou. Tento postup může být v případě, kdy je požadována modifikace polarity původního peptoidu (například za účelem jeho přizpůsobení speciální sloučenině), zamezení přítomnosti skupiny, ionizovatelné při fyziologické hodnotě pH, na molekule, nebo konečně za účelem snížení reaktivity peptoidu v souvislosti s dalšími chemickými typy přítomnými ve vzorci (neslučitelnost s přítomností elektrofilní sloučeniny).

V některých případech umožňuje tento postup rovněž zlepšit biologickou dostupnost a farmakokinetiku této kategorie aktivních produktů, což má za následek potencializaci farmakologického účinku.

Terapeutické a kosmetické aplikace

Všechny výše uvedené vlastnosti vedou ke kosmetickým a terapeutickým využitím pseudodipeptidových produktů podle vynálezu.

Antioxidační vlastnosti pseudodipeptidů podle vynálezu umožňují navrhování těchto produktů pro ošetřování patologických jevů spojených s „oxidačním tlakem“.

Mezi těmito charakteristikami má velký terapeutický význam léčba katarakty. Příčiny různých katarakt se různí. Mechanismy těchto patologických jevů, které jsou typu „senilní katarakty“ nebo „diabetické katarakty“ jsou rozděleny do dvou skupin: oxidační mechanismus (M.A.Babizhayev, A.I.Deyev, L.F.Lindberg, „Lipid peroxidation as a possible cause of cataract“, Mechanisme of Aging Dev., svazek 44 (1988), strana 69-89), a mechanismy retikulace glykačního typu, (TJ.Lyons, G.Silvestri, J.A.Dunn, D.G.Dyer, J.W.Baynes „Role of glacation of lens crystallins in diabetic and non diabetic senile cataracts“, Diabetes, svazek 40, č.8, (1991), strana 1010 - 1015).

Pseudodipeptidové produkty podle vynálezu mohou být použity při léčbě některých komplikací diabetes a pro redukci keloidů při procesu léčení pokožky.

Již dříve bylo pozorováno, že antioxidační vlastnosti pseudodipeptidů, vyplývající zvláště z jejich působení proti volným radikálům a aktivity typu „peroxydázy“ a rovněž z jejich antiglykační aktivity, způsobují, že pseudodipeptidy podle vynálezu jsou účinnými produkty pro ošetřování katarakty. Schopnost těchto sloučenin, působit nápravně na změny způsobené volnými radikály v biologických strukturách, je zvláště významná v léčbě katarakty, protože má za následek regresi zákalu čočky.

Pseudodipeptidové produkty podle vynálezu mohou bránit oxidačnímu jevu způsobujícímu aterosklerózu. U tohoto patologického jevu oxidace částic proteinu nízké hustoty (LDL) cirkulujících v krvi má za následek fragmentaci proteinové části (apoprotein B), a rovněž lipidové frakce těchto částic. Vytvořené fragmenty by dodávaly vzhled abnormálních tvarů buněk (monocyty a makrofágy naplněné cholesterolem), které jsou schopny se shlukovat na stěnách krevních cév a vytvářet ateromatózní pláty.

Kromě toho pseudodipeptidové produkty podle vynálezu by byly zvláště vhodné pro léčbu této nemoci, když bylo prokázáno, že glykační jevy patří mezi původce ateromatózních plátů (viz T-J.Lyons - Glycation and oxidation - „A role in the pathogenesis of Atherosclerosis“ -Američan Joumal of Cardiology, svazek 71, č.6 (1993), strana 1 326-1 331).

Pseudodipeptidové produkty podle vy\nálezu mohou rovněž působit proti procesu kancerogeneze, když bylo prokázáno, že typy radikálů odvozené od kyslíku způsobují přerušení nebo

-8CZ 292108 B6 modifikaci řetězců DNA, přičemž tyto transformace mohou způsobit přeměnu zdravých buněk na nádorové buňky.

Stejným způsobem antioxidační vlastnosti pseudodipeptidových produktů podle vynálezu umož5 ňují indikovat tyto produkty pro léčbu patologických zánětových stavů, a zvláště pro léčbu revmatické artritidy. Ve skutečnosti zhoršení sinoviální kapaliny je charakteristickým symptomem artritidy zánětového typu a bylo prokázáno, že rozklad jedné z jejích základních složek, hyaluronové kyseliny, byl důsledkem „oxidačního tlaku“. Některé nedávné studie (viz B.Halliwell a J.M.C.Gutteridge Eds - Clarenton Press (1989), Oxford, strana 422 - 438) sem rovněž io zahrnuly peroxidace lipidů související s tímto procesem, což vysvětluje prospěšné působení produktů podle vynálezu.

Antioxidačních vlastností pseudodipeptidových produktů podle vynálezu může být rovněž využito v léčbě ozařováním jako přídavná léčba. Tento ochranný účinek před zářením, který je již znám pro beta-alanyl-histidin spočívá v cytostimulačních vlastnostech tohoto typu sloučenin, zvláště s ohledem na buňky kostní dřeně, které jsou velmi citlivé na záření používané pro léčbu ozařováním.

Podle posledních údajů by mohly mít některé epileptické symptomy původ v lézích, které se 20 vytvářejí okysličenými volnými radikály v některých částech mozku (viz G.R.Jackson, K.Werrbach-Perer, J.R.Perez-Polo - „Role of nerve growth factor in oxidant-antioxidant balance and neuronal injury - Π - A conditioning lesion paradigon“ - Joumal of Neuroscience Research, sv. 25, č.3 (1991), strana 369 - 374). Schopnost produktů podle vynálezu regenerovat tkáň (v tomto případě nervovou) je důležitým prvkem pro tento patologický jev spojený s degenerací nervové 25 tkáně. Tyto produkty by bylo možné indikovat i pro léčbu Parkinsonovy choroby, v níž by byl zaznamenán „oxidační tlak“ týkající se mozkové tkáně.

Některá cévní onemocnění, a zvláště endotoxemie, jsou spojeny s nadměrnou produkcí radikálového typu, kterým je radikál oxidu dusíku NO*. Působením tohoto radikálu produkovaného 30 buňkami endotelu a buňkami hladkého svalstva krevních cév má za následek chronickou vazodilataci. Tento stav může být velmi škodlivý při léčbě vazokonstrikčními látkami. V buňkách enzym NO-syntáza katalyzuje transformaci aminokyseliny, L-argininu, na NO*. Antioxidační pseudodipeptid podle vynálezu obsahující radikál L-arginyl (nebo derivát N^G-methyl-L-arginyl) ve své struktuře, by mohl působit přímo na NO’, ale rovněž na enzym způsobující NO’ syntézu, 35 pomocí inhibičního působení na enzymatickou katalýzu.

Pro pokožku mohou být antioxidační vlastnosti pseudodipeptidových produktů podle vynálezu využity pro neutralizaci okysličených volných radikálů vyvolávaných slunečním zářením. Tímto způsobem budou účinně blokovat fotoalergické reakce (volné radikály vyvolávají na úrovni 40 pokožky tvorbu molekul citlivých na světlo). Ve spojení s aktivním základem citlivým na oxidaci (například s chlorpromazinem) budou zabraňovat jejich přeměně na toxickou sloučeninu.

Tento základ se nejlépe využije při fotochemické léčbě určitých kožních chorob. Ve skutečnosti tato léčba spočívá v použití fotosenzibilátoru (například psoralenu), které má při ozařování 45 prospěšné účinky (interakce s DNA), ale které je bohužel doprovázeno tvorbou volných radikálů, způsobujících nežádoucí vedlejší účinky.

Produkty podle vynálezu mohou být rovněž indikovány pro zamezení toho, aby se u osob trpících porfyrií objevovaly kožní symptomy, protože porfyriny dávají možnost vzniku poškození způso50 bených volnými radikály.

Mohou se rovněž nasadit proti tvorbě kožních lézí spojených s „oxidačním tlakem“ u osob trpících autoimunitními chorobami, jako je například soustavný lupus eiythematodes (SLE).

-9CZ 292108 B6

Rovněž účinně působí proti důsledkům „opalování na slunci“: erytémy, edémy a tvorba charakteristických buněk v kůži.

Antioxidační vlastnosti sloučenin podle vynálezu mohou být samozřejmě využity pro prevenci stárnutí kůže. Ve skutečnosti četné experimentální důvody, analytické a epidemiologické, podporují teorii, podle které má nahromadění biochemických poškození způsobovaných volnými radikály konstituovat základní proces stárnutí. Je zcela jasné, že vystavování slunečnímu záření, které způsobuje tvorbu volných radikálů typů odvozených od kyslíku, je důvodem předčasného stárnutí pokožky.

A konečně, bylo experimentálně prokázáno, že tyto sloučeniny mohou potírat další charakteristické jevy stárnoucí kožní tkáně:

- Neenzymatické síťování proteinů, jako například kolagenu nebo elastinu cukrem (V.M.Monnier - Nonenzymatic glycosylation, the Mailard reaction and the aging process“ Joumal of Gerontology, sv.45, č.4 (1990), strana B 105 -111).

Tvorba lipoproteinových komplexů: lipofíscinů (zesíťování s vedlejšími produkty oxidačního tlaku).

Bylo prokázáno, že L-arginin má schopnost odolávat neenzymatickému síťování (tato aminokyselina může kondenzovat na cukrech, ale také na některých dikarbonylovaných vedlejších produktech oxidačního tlaku). Pak pseudodipeptidové produkty podle vynálezu obsahující ve své struktuře L-arginylový radikál budou tedy zvláště indikovány za účelem zabraňování mechanismu stárnutí tkáně.

Další řada aplikací vyplývá z cytostimulačních schopností pseudodipeptidových produktů podle vynálezu a, jak bylo prokázáno, jejich imunostimulačních schopností. Tyto schopnosti umožňují podporu regenerace a ozdravování tkáně, a obecně umožňují regulovat funkce, které zahrnují zprostředkující látky imunitní reakce.

Tak mohou být použity pro podporu regenerace narušených kožních pojivových tkání. Podporují nápravu mukózy po spálení nebo po chemoterapii nebo radioterapii.

V souladu s tímto principem mohou být tyto produkty indikovány pro prevenci a při ošetřování vrásek.

Cytostimulační a regenerační schopnosti pseudodipeptidů působí zvláště na svalové tkáně, kde můžeme najít vysoké koncentrace příbuzných přirozených dipeptidů: beta-alanyl-histidin. I když není fyziologická úloha této sloučeniny v současnosti dokonale stanovena, je tato úzce svázána se svalovým metabolismem. Tak by produkty podle vynálezu mohyl participovat na zlepšení svalové kontraaktility, a regulovat srdeční kontrakce. Můžeme rovněž využít tento typ schopností pro léčbu některých svalových degenerací, například Dushenovy myodistrofie.

Pseudodipeptidové produkty mohou být použity pro výrobu léků pro léčbu tkání vybraných ze skupiny obsahující kožní tkáň, žaludeční sliznici a oční tkáň.

Léčivé vlastnosti pseudodipeptidových produktů podle vynálezu nacházejí své uplatnění v četných oblastech. Můžeme uvést léčbu žaludečních vředů, u kterých měl dobré výsledky dipeptidový produkt příbuzný kamozinu. (M.Ito, T.Tanaka a Y.Susuki - Effekt of N-(3-aminoproprionyl-L-histidinatozonic) (Z-103) on healing and hydrocoírtisone-induced release of acetic acid in rats with limited food-intake-time“ -Japanese Joumal of Pharmacology, svazek 54, (1990), strana 513 - 521). Kromě toho antioxidační a protizánětové vlastnosti produktů podle vynálezu jsou využitelné pro léčbu těchto patologických jevů. Chelát zinku podle tohoto vynálezu je zvláště indikován pro toto využití, jak bylo výše popsáno.

-10CZ 292108 B6

Léčivé vlastnosti pseudodipeptidových produktů podle vynálezu jsou také zvláště indikovány pro léčbu poškození rohovky. Mohou být podávány v rámci pooperačního ošetření, například po chirurgickém zákroku na rohovce za účelem korekce myopie.

Mohou být rovněž s velkou výhodou využity pro léčbu „suchého oka“, kdy je podporováno léčení epitelu rohovky, ale také díky funkci „umělé slzy“: ochrana poškozených tkání před „oxidačním tlakem“ (zdravotní stav, zánět, UV záření), začlenění do formulací podporujících obnovu slzného filmu.

»

Kompozice obsahující pseudodipeptidové produkty podle vynálezu budou rovněž schopny, díky svému imunostimulačnímu a regeneračnímu působení na tkáně zabraňovat degeneraci sítnice. Jejich účinky budou posíleny v důsledku toho, že u těchto patologických jevů dochází rovněž k oxidačním reakcím (viz R.E.Adderson, L.M.Rapp, R.D.Wiegand - Current Eye Research, svazek 3 (1984), strana 223 - 227).

Imunostimulační vlastnosti těchto pseudodipeptidových produktů podle vynálezu mohou rovněž zaznamenat obrat k potencializaci vakcín náhradou za adjuvanty, kterých se obvykle používá pro zesílení imunitní odpovědi člověka (soli hliníku, výtažky bakterielního původu, monofosfoiyl A,

...), u kterých nejsou bezvýznamné vedlejší účinky (R.K. Gupta, E.H.Relyveld, E.B.Lindblad,

B.Bizzini, S.Ben-Efraim a C.K.Gupta „Adjuvants - a balance between toxicity and adjuvancy“, Vaccine, svazek 11, č.3 (1993), strana 293 -306).

Jak již bylo uvedeno, některé pseudodipeptidy podle vynálezu se mohou chovat jako histaminové inhibitory. Mezi terapeutické aplikace využívající této vlastnosti lze uvést:

- Antagonista histaminu by se mohl postavit proti shlukování destiček. (S.P.Saxena, L. J.Brandes, A.B.Beckerk, J.Simons, F.S.LaBella a J.M.Gerrard, Science, svazek 243, č.24, (1989), strana 1 596 - 1 599). Histamin je rovněž nitrobuněčný mediátor účastnící se buněčného vývoje a množení (J.R.Chanda, A.K.Ganguly „Cancer Letters“, svazek 34 (1987), strana 207). Proto antagonistický pseudodipeptid podle vynálezu by mohl být použit pro regulaci buněčného množení, zvláště u hypertrofhích jizevnatých tkání (keloidy).

- Histamin je rovněž mimobuněčný mediátor zapojující se do četných biologických procesů. Tak může být antagonista podle vynálezu využit u alergií, pro léčbu zánětů u některých srdečních dysfunkcí a pro všechny patologické jevy, u kterých dochází k nadměrnému uvolňování histaminu.

Tak by mohlo být obzvláště výhodné zahrnout pseudodipeptidové produkty podle vynálezu do vůní a dezodorantů pro potlačení alergických reakcí, a zvláště anafylaktického šoku, způsobovaného některými silnými vonnými směsmi.

Naopak, některé prvky této rodiny sloučenin mohou mít některé vlastnosti histaminu („prohistaminové“ chování). Antagonistické chování receptoru H2 histaminu umožňuje inhibovat aktivaci neutrofilů a tedy nadměrnou produkci volných radikálů u těchto buněk (R.Burde, R.Seifert, A.Buschauer, G.Schultz, „Histamine inhibits activation of human neurophiles a and HL-60 leukemie cells via H2-receptors“, Naunyn Schmiedebergs Arch. OfPharamcology, svazek 340, č.6 (1989) strana 671 - 678). Toto umožňuje zvážit použití takovýchto pseudodipeptidů pro léčbu některých patologických zánětových stavů.

Histamin rovněž podporuje buněčná množení a vývoj (G.Kahlson, E.Rosengren, C.Steinhardt „Joumal of Physiology“, svazek 151, (1960), strana 131). „Prohistaminová“ sloučenina by pak mohla podporovat regeneraci buněk.

-11 CZ 292108 B6

Rada aplikací je spojena se schopností některých pseudodipeptidových produktů podle vynálezu, zahrnujících ve své struktuře L-prolylový radikál (a jeho deriváty), působit proti abnormální syntéze kolagenu a jeho shlukování ve tkáních. Tato zvláštní schopnost by mohla být spojena se strukturní analogií s přirozeným peptidem, kterým je L-glycyl-L-prolin, který podporuje odbou5 rávání kolagenu, ale také s jejich antioxidačními vlastnostmi, protože se nedávno zjistilo, že oxidační tlak se účastní nadprodukce kolagenu. (J.C.geesin, L.J.Hendricks, P.A.Falkenstem, J.S.Gordon, R.A.Berg „Reguletion of collagen synthesis by ascorbic acid: chracterization of the role of ascorbate stimulated lipid peroxidadion“ Archives of Biochemistry and Biopysics, svazek 290, č.l (1991), strana 127 - 132).

Akumulace kolagenu v srdeční tkáni je jednou z hlavních komplikací u cukrovky.

Tento typ sloučenin je indikován za účelem redukce keloidů spolu s nadprodukcí kolagenu v době léčebného procesu. Jelikož pseudodipeptidy podle vynálezu se mohou rovněž chovat jako 15 anti-histaminové látky, a protože bylo nedávno prokázáno, že histamin stimuluje produkci kolagenu (A.Himatochi, H.Ueki, C.Mauch, T.Krieg „Effekt of histamine on collagen m-RNA production in human skin fíbroplast“, Joumal of Dermatologic Sciences, sv. 2 (1991), strana 407 - 412), peptoidy podle vynálezu jsou zvláště vhodné pro tuto aplikaci.

Aplikace jako stabilizační a konzervační prostředek

Vynikající snášenlivost vůči pseudodipeptidům podle vynálezu a jejich mírné antioxidační a cytostimulační vlastnosti umožňují navrhnout tyto produkty pro konzervaci a ochranu látek citlivých na oxidaci, potravin nebo orgánů a tkám uchovávaných ex-vivo.

Lze uvést zamezení oxidace lipozomů pro zvýšení stability a zabránění tvorbě toxických vedlejších produktů, ochranu hyaluronové kyseliny rozmíchané v kosmetických přípravcích proti depolymerizačním účinkům volných radikálů, a ochranu olejů a potravinářských výrobků citlivých na oxidaci, dietetických výrobků.

Produkty podle vynálezu umožňují zlepšení konzervace krve a vakcinačního séra, ochranu orgánů určených pro transplantaci (zvláště pro srdeční transplantáty).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Například proces přípravy L-glutamylhistaminu může být uskutečněn následovně:

Do suspenze 2,0 g (6,59 mmol) Boc-Glu-(OtBu}-OH obsahující 1,456 g (7,91 mmol) pentafluorfenolu (píp) v roztoku 8 ml ethylacetátu ochlazeném na 0 °C se po kapkách přidají 4 ml 1,631 g (7,91 mmol) dicyklohexylkarbodiimidu rozpuštěného v ethylacetátu. Toto se protřepává 45 při 0 °C po dobu 30 minut a pak hodinu při pokojové teplotě.

Reakční směs se přefiltruje, aby se eliminovala dicyklohexylmočovina. Tato dicyklohexylmočovina se promyje ethylacetátem a filtrát se nechá odpařit. Olejovité reziduum se vysuší pomocí lopatkové vývěvy během dvou hodin.

3,1 g Boc-Glu-(OtBu)-Opfp se získá ve formě bílé tuhé látky.

Do suspenze 1,213 g (6,59 mmol) histaminhydrochloridu v 15 ml dimethylformamidu obsahující 1,331 g (13,18 mmol) N-methylmorfolinu se přidá při 0 °C po kapkách 5 ml roztoku, který 55 obsahuje Boc-Glu-(OtBu)-Opfp rozpuštěného v dimethylformamidu.

-12CZ 292108 B6

Reakční směs se míchá po dobu dvou hodin při 0 °C, a pak jeden a půl hodiny při pokojové teplotě. Reakční směs se filtruje a precipitát se promyje dimethylformamidem.

Směs se filtruje, aby se eliminoval precipitát N-methylmorfolinchlorhydrátu a daný precipitát se promyje ethylacetátem, dimethylformamid se nechá odpařit ve vakuu pomocí lopatkové vývěvy při teplotě t < 40 °C. 25 ml ethylacetátu se přidá do získaného rezidua a výsledná nerozpustná frakce se eliminuje filtrací. Produkt se promyje nasyceným roztokem 20 ml natrium-hydrogenkarbonátu 0,5 mol, 10 ml natrium-hydrogenkarbonátu 0,5 mol, 20 ml vody a 20 ml chloridu sodného.

Po 1 hodině sušení organické fáze na natrium-sulfát se odpařením získá bílý prášek.

3,234 g (výtěžek > 100 %) produktu se regeneruje, ale chromatografie na tenké vrstvě (TLC) ukazuje, že část fenolu a histaminu zůstává, tyto budou eliminovány během dalšího kroku.

Do 1,12 g tuhého Boc-Glu-(OtBu)-Hist se přidá 25 ml trifluoroctové kyseliny. Protřepává s po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě t < 40 °C.

ml ethyletheru se přidá k danému produktu, který se pak mísí po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Bílý produkt se vytvoří při míchání. Ether se dekantuje, reziduum se promyje 10 ml ethyletheru, a pak se suší za pomoci lopatkové vývěvy.

Reziduum se pak rozpustí v 7 ml ethanolu, pak se přidává amoniak (5 % koncentrace) až do pH 7,5. Pak se přidá 25 ml ethylacetátu, a to celé seč nechá stát několik hodin při teplotě 0 °C.

Vytvoří se dvě fáze a tyto se separují dekantací a nažloutlá olejovitá spodní fáze se nechá odpařit. Objeví se velmi hydroskopický bílý prášek. Produkt se nechá rekrystalizovat v ethylethanolu/ethylacetátu. Po filtraci se tuhá látka promyje ethylethanolem/ethylacetátem (1/1).

Získá se 510 mg produktu (výtěžek = 65 %).

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Pseudodipeptidový produkt na bázi imidazolu, který je vybrán ze skupiny sestávající z glutamylhistaminu, N-methyl-2-amino-L-butyrylhistaminu, 2-aminoisobutyrylhistaminu, Lnorleucylhistaminu, 2-amino-L-oktanoylhistaminu, terc-butyloxykarbonyl-2-amino-L-pentanoylhistaminu, L-omithylhistaminu, L-2,6-diamino-(pentaii-l,5-dikarboxyl)histaminu, Nacetyl-2-aminobutyrylhistaminu, N-fenacetyl-2-aminobutyrylhistaminu, L-arginylhistaminu, L-prolylhistaminu, 4-hydroxy-L-prolylhistaminu, L-pyroglutamylhistaminu.

2. Pseudodipeptidový produkt podle nároku 1, který je ve formě chelátu s atomem zinku.

3. Způsob přípravy produktu podle nároku 1,vyznačující se tím, že se vytvoří alfa aminokyselina N-chráněná skupinou X , vytvoří se alfa aminokyselina O-aktivovaná skupinou Y, N-chráněná a O-aktivovaná aminokyselina se sloučí s histaminem a X se buď eliminuje nebo neeliminuje podle požadovaného pseudodipeptidového produktu.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že O-aktivovaná alfa aminokyselina je vytvořena esterifikací funkce karboxylové kyseliny aminokyseliny.