PT726895E

PT726895E - Produto pseudodipeptido possuindo um grupo imidazolo e suas aplicacoes

Info

Publication number: PT726895E
Application number: PT95900185T
Authority: PT
Inventors: Marc Babizhayev; Marie-Christine Seguin
Original assignee: Exsymol Sa; Marc Babizhayev
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-03
Publication date: 2000-12-29
Also published as: EP0726895B1; FR2711990B1; HU222566B1; HU9600989D0; CA2174526C; CN1136808A; US6046340A; EP0726895A1; CZ115596A3; BR9407971A; JPH09504540A; CZ292108B6; CN1056608C; KR960705785A; CA2174526A1; DE69425153D1; UA56123C2; WO1995012581A1; JP3503899B2; HUT74387A

Description

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DESCRIÇÃO “Produto pseudodipéptido possuindo um grupo imidazolo e suas aplicações” A presente invenção refere-se a produtos pseudodipéptidos e, em particular, a um novo produto pseudodipéptido possuindo um grupo imidazolo, bem como às aplicações de um tal produto nos domínios da terapêutica, cosmetologia ou agroalimentar. O objecto da invenção é um novo produto pseudodipéptido à base de imidazolo, sendo o dito produto seleccionado do grupo consistindo em glutamil-histamina, N-metil-2--amino-L-butiril-histamina, 2-aminoisobutiril-histamina, L-norleucil-histamina, L-2-amino-octil-histamina, Boc-2-amino-L-pentil-histamina, L-omitil-histamina, L-2,6-diaminopimelil-histamina, N-acetil-2-aminobutiril-histamina, N-fenacetil-2-aminobutiril-histamina, L-arginil-histamina, L-prolil-histamina, 4-hidroxi-L-prolil-histamina, L-piroglutamil-histamina. O produto pseudodipéptido de acordo com a invenção pode ser considerado como um produto de condensação entre um alfa-aminoácido e a histamina. A este título, pode assim ser obtido por diferentes processos de síntese quer químicos quer enzimáticos.

Um processo de preparação químico adequado para a preparação do produto pseudodipéptido da invenção, designado de forma simbólica por AA-Hist (AA é o aminoácido e Hist designa a histamina) apresenta-se segundo o seguinte esquema AA + X + Y -» X-AA-Y (1) X-AA-Y + Hist (,2Hcl) -> X-AA-Hist (2) A primeira etapa do processo consiste em tomar o aminoácido (AA) N-protegido por um grupo X e O-activado por um grupo Y. A N-protecção é efectuada, de preferência, por substituição de um átomo de hidrogénio no amino do aminoácido que pode ser um radical acilo ou aciloxi... De entre os grupos protectores podem citar-se, os mais interessantes, o benziloxicarbonilo, (Z) o

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc), os radicais benzilo, flaloílo, 2-nitrofenilsulfenilo e o trifluoroacetilo.

Ainda que seja possível dispensar, a activação O é realizada, de preferência, por esterificação da função carboxílica do aminoácido por um composto seleccionado do grupo consistindo em: álcool cianometílico, o-nitrofenol, 2,4,5-triclorofenol, p-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, N-hidroxiftalimida, N-hidroxissuccinimida, 1-hidroxipiperidina e 5-cloro-8-hidroxiquinolina.

De entre os modos de O-activação pode ainda citar-se o processo consistindo em transformar o ácido carboxílico em cloreto de ácido, uma hidrazida e um anidrido “misto” ou simétrico.

Um modo de activação particular consiste em fazer reagir fosgénio sobre o aminoácido AA levando à formação do N-carboxi-anidrido deste aminoácido. A segunda etapa do processo de preparação é a ligação com a histamina que pode ser feita com ou sem agente de ligação, fazendo reagir o aminoácido N-protegido e O-activado (ou não) com a histamina, de preferência sob a forma de dicloridrato. É preciso notar que o agente de ligação não é indispensável com um aminoácido O-activado. A ligação sem agente de ligação efectua-se num solvente orgânico (este poderá ser por exemplo clorofórmio, 1,2-dimetoxietano, dimetilformamida) na presença de ácido (por exemplo ácido acético...) ou de base (por exemplo trietilamina...) num solvente hidro-orgânico (por exemplo água-piridina ou água-1,2-dimetoxietano...) na presença de base (por exemplo soda ou bicarbonato de sódio...) depois ácido (por exemplo ácido clorídrico..); em condições catalíticas (por exemplo imidazolo, N-etilmorfolino...) ...

Se for utilizado um agente de ligação, este agente pode ser, por exemplo, o diciclo-hexilcarbodi-imida, o N-hidroxibenzotriazolo e seus derivados, tais como o hexafluorofosfato de benzotriazoliloxi(trisdimetilamino)fosfónio (BOP), o l-isobutiloxicarbonil-2-isobutiloxi-l ,2-di-hidroquinolina, o carbonildi-imidazolo, Woodward Reagent K, éter a-cloro viniletílico, éter a,a-dicloroetílico, éter diclorometilmetílico, DCC e aditivos, DCC-pentaclorofenol, DCC-pentafluorofenol, cianamida, ceteniminas e cetenos, sais de oxazolínio, EEDQ (‘l-etoxicarbonil-2-etoxi-l,2-di-hidroquinoleína), inaminas acilfosfónios. trifenilfosfito e imidazolo, complexos de cobre II, SiC14. 85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ

Quando tal se mostre necessário, o grupo X ou N-protector é eliminado numa terceira etapa: X-AA-Hist —» AA-Hist (3)

Esta eliminação faz-se, conforme os grupos protectores, por hidrogenólise, por redução por sódio em amoníaco líquido, por hidrazinólise, por acidólise, por hidrólise ou por via enzimática. A solução preferida consiste em efectuar esta etapa de desprotecção por acidólise pelo ácido trifluoroacético. Neste último caso, o produto pseudodipéptido é obtido sob a forma de base após tratamento com amoníaco. Além disso, quando é esse o objectivo, o composto na sua forma de base pode ser posto em presença de um sal de metal de transição para formar um quelato. A título de exemplo, o processo de preparação da L-glutamil-histamina pode ser feito da forma seguinte: A uma suspensão de 2,0 g (6,59 mmol) de Boc-Glu(OtBu)-OH contendo 1,456 g (7,91 mmol) de solução de pentafluorofenol em 8ml de acetato de etilo a 0°C são acrescentados, gota a gota, 4 ml de uma solução de 1,631 g (7,91 mmol) de diciclo-hexilcarbodi-imida-ureia em acetato de etilo. A agitação a 0°C é mantida 30 min. e depois 1 hora à temperatura ambiente. A mistura reaccional é filtrada para eliminar a diciclo-hexilureia. A diciclo-hexilureia é lavada com acetato de etilo e o filtrado é evaporado. O resíduo oleoso é seco numa bomba de palhetas durante 2 horas. São obtidos 3,1 g de Boc-Glu(OtBu)-OPfp sob a forma de um sólido branco. A uma suspensão de 1,213 g (6,59 mmol) de cloridrato de histamina em 15 ml de dimetilformamida contendo 1,331 g (13,18 mmol) de N-metilmorfolina a 0°C é acrescentada, gota a gota, uma solução de Boc-Glu(OtBu)-OPfp em 5 ml de dimetilformamida. A mistura reaccional é agitada 2 horas a 0°C e depois 1H30 à temperatura ambiente. A mistura reaccional é filtrada e o precipitado lavado com dimetilformamida. A mistura é filtrada para eliminar o precipitado de cloridrato de N-metilmorfolina e o precipitado é lavado com acetato de etilo, a dimetilformamida é evaporada sob vácuo da bomba de palhetas a t<40°C. São acrescentados ao resíduo 25 ml de acetato de etilo e depois a ffacção insolúvel é eliminada por filtração.

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ Ò produto é lavado com 20 ml de hidrogenocarbonato de sódio 0,5M, 10 ml de hidrogenocarbonato de sódio 0,5M, 20 ml de água e 20 ml de uma solução saturada em cloreto de sódio. Ápós secagem da fase orgânica sobre sulfato de sódio durante 1 hora, a evaporação conduz à obtenção de um pó branco. São recuperados 3,234 g (Rdt>100%) de produto mas a CCM mostra que fica fenol e histamina que serão eliminadas aquando da seguinte etapa. São acrescentados, a 1,12 g de Boc-Glu(OtBu)-Hist sólido, 25 ml de ácido trifluoroacético. A agitação é mantida 1 hora à temperatura ambiente. O solvente é vaporado pela bomba de palhetas a t<40°C, São acrescentados 12 ml de éter etílico ao produto que é agitado durante 30 minutos à temperatura ambiente. Forma-se um produto branco pastoso. O éter é decantado, o resíduo lavado com 10 ml de éter etílico e depois seco na bomba de palhetas. Q resíduo é em seguida dissolvido em 7 ml de etanol e é depois acrescentado amoníaco a 5% até um pH 7,5. São então acrescentados 25 ml de acetato de etilo e o todo é colocado a 0°C durante algumas horas.

Formam-se duas fases que serão separadas por decantação e a fase inferior oleosa amarelada é evaporada. Forma-se um pó branco muito higroscópico. O produto é recristalizado em etanol/acetato de etilo. O produto é separado por filtração e depois lavado com a mistura de etanol/acetato de etilo (1/1). São obtidos 510 mg de produto (Rdt=65%).

Em termos de rendimento e de custo, os produtos peptídicos podem vantajosamente ser preparados utilizando um método de síntese total ou parcialmente enzimático.

De acordo com este processo, podem propor-se os seguintes esquemas de síntese: A reacção de ligação pode ser descrita pela seguinte equação:

X-AA-Y + hist + enzima —> X-AA-hist + Y

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 5 onde Χ-ΑΑ-Υ é um aminoácido N-protegido cuja preparação foi já descrita e em que o grupo protector X pode ser um radical acilo, aciloxi,...

No caso presente, o grupo X permite também aumentar a solubilidade de AA no meio reaccional. Este pode dirigir a escolha de X de forma a aumentar a solubilidade de AA nos meios orgânicos, tais como: X = Ph-CH2-0-C- radical benziloxicarbonilo

II

O X-AA-Y é O-activado por esterificação da função carboxílica por um álcool seleccionado do grupo consistindo em: álcoois alifáticos e, preferencialmente, o etanol, halogenoalquilálcoois tal como o 2,2,2-tricloroetanol, álcoois aromáticos tal como o fenol, assim como todos os álcoois citados anteriormente para a activação em síntese química. Esta lista exclui, contudo, todos os álcoois terciários. A reacção de ligação com a base histamina (ou seus derivados metilados) ou um sal de histamina (ou um dos seus derivados metilados), por exemplo, o dicloridrato de histamina, é realizada numa variedade de solventes orgânicos, tais como os solventes hidrocarbonados alifáticos (ciclo-hexano, heptano, ...) ou aromáticos (tolueno), os álcoois terciários (t-butanol, terc-amilálcool), os halogenetos de alquilo (diclorometano), os éteres (isopropiléter), o acetonitrilo, a dimetilformamida ou o dimetilsulfóxido. Estes solventes podem ser utilizados sozinhos ou em associação, anidros ou em presença de uma pequena quantidade de água. A reacção pode ser conduzida em presença, ou não, de uma base, tal como a trietilamina. O catalisador enzimático é uma hidrólase (lípase, protease) de origem microbiana ou animal ou vegetal. Ele pode ser utilizado sob uma forma pura ou não purificada. Podem citar-se qualidades comerciais muito pouco onerosas tais como lípases, extractos de microorganismos; Pseudomonas sp., Candida rugosa, Mucor, ou de origem animal: lípase pancreática do porco (LPP), proteases: tripsina, quimotripsina, substilisina, papaína, ....

Este catalisador, não solúvel no meio reaccional, está disperso no solvente sozinho ou imobilizado num suporte inerte, a fim de facilitar a sua reciclagem.

85 552 ΕΡ Ο 729 8,95/ΡΤ 6 A reacção é efectuada a uma temperatura compreendida entre 4°C e 70°C, mais preferivelmente, entre 35°C e 45°C sob agitação. O produto de ligação é recolhido por filtração ou após extracção com um solvente apropriado. -; A desprotecção e a purificação podem então ser realizadas de acordo com os processos descritos para a síntese química.

Contudo, a etapa de desprotecção pode ser realizada por uma reacção enzimática segundo a reacção: X-AA-hist + enzima R- OH-» AA-hist + X-OR onde R = H ou um radical alquilo. O' protocolo é similar ao descrito para a etapa de ligação, no entanto, verifica-se que no caso particular em que R = H, a reacção é conduzida na água.

Para a etapa de ligação, podem-se prever situações menos favoráveis, mas que permitem reduzir os custos de produção de forma importante, utilizando: um aminoácido não N-protegido (onde X = H), O-activado como anteriormente um aminoácido N-protegido mas não O-activado (onde Y = H) ou mesmo o aminoácido de partida (X = Y = H)

As condições operatórias são semelhantes às descritas anteriormente para o derivado N-protegido, O-activado.

As características estruturais do produto pseudodipéptido da invenção permitem obter um princípio activo insensível à desactivação enzimática. A característica estrutural essencial é a ausência de um grupo carboxilo nos carbonos em alfa relativamente ao azoto que participam na ligação peptídica,

De uma maneira geral, a resistência à desactivação enzimática é favorecida pela presença, no carbono terminal, de impedimento estereoquímico por substituintes. A resistência à desactivação enzimática é igualmente reforçada quando a amina terminal é incorporada numa estrutura cíclica.

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De uma forma mais geral ainda, a resistência às enzimas, e em particular às proteases, é reforçada quando o alfa-aminoácido do produto pseudodipéptido apresenta uma estrutura que difere da dos aminoácidos naturais (falamos então de aminoácidos não proteínicos ou não naturais). Isto pode ser realizado por uma escolha rigorosa da estereoquímica do carbono terminal. Com efeito, a presença de um carbono terminal assimétrico permite obter uma configuração absoluta diferente da dos aminoácidos naturais.

Propriedades farmacológicas

As propriedades farmacológicas do produto pseudodipéptido de acordo com a invenção resultam desta insensibilidade à desactivação enzimática.

Antes de tudo, eles possuem propriedades antioxidantes. São, com efeito, capazes de se opor ao stress oxidativo, quer dizer, de se opor aos danos provocados pelas espécies radicalares sobre as estruturas biológicas. Estes produtos são capazes de agir a diversos níveis: eles podem reagir directamente sobre diversos tipos de radicais livres (R.L.), mas também sobre os subprodutos tóxicos do stress oxidativo. Demonstra-se igualmente que estes produtos activos podem, igualmente, exercer uma actividade reparadora face às alterações provocadas pelos R.L. sobre as estruturas biológicas. A reactividade de um membro desta família de compostos face a tal ou tal espécie radicalar depende de elementos estruturais precisos, sem que seja possível, no momento actual, estabelecer regras de estrutura-actividade. Mostra-se, nomeadamente, que uma fraca diferença estrutural conduz a modificações importantes do potencial redox do pseudodipéptido, propriedade físico-química directamente ligada ao poder antioxidante. Esta particularidade explica a diversidade das propriedades observadas para esta família de compostos. A título de exemplo, os resultados das experiências in vitro obtidos com dois pseudodipéptidos são apresentados:

Io) Realce de um poder inibidor sobre o radical livre OH°:

Protocolo descrito por J.M.C. Gutteridge em Biochemistry Journal, vol 224 (1984), p 761-767: substrato de oxidação: desoxirribose, sistema de produção de radical hidroxilo OH°:EDTA/Fer, H2O2, detecção: ácido tiobarbitúrico/malonodialdeído (MD A) - o antioxidante de referência que foi utilizado é a L-camosina ou β-alanil-I-histidina, em particular para a captura das espécies radicalares como OH-(radical

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 8 hidroxilo) mas igualmente Ο2 (anião superóxido). Pode-se encontrar a confirmação destas propriedades nas seguintes publicações: “Free Radical Scavenging Activity of Camosine” Free Radical Research Communications, Vol. 14, N° 4 (1991), pp 263-270. “Camosine, homocamosine and ansécrine; could they act as antioxidants in vivo?” em Biochemistry Journal, vol. 264, (1989) pp 863-869. % de inibição Testemunho (ausência de antioxidante) 0 β-alanil-L-histidina (10 miM) 38 L-prolil-histamina (10 mM) 62 L-glutamil-histamina (10 mM) 0 2P) Realce de um poder inibidor sobre o anião superóxido O20-: sistema de produção de anião superóxido: xantina-oxidase/hipoxantina (ausência de ferro) 0 anião superóxido é uma substância redutora. E em particular capaz de reduzir , um substrato, o citocromo c. A sua redução é seguida por espectrofotometria de 1 ultravioleta a 550 nm. A percentagem de inibição é definida como se segue:

Velocidade de redução do citocromo c sem inibidor- velocidade de redução com inibidor x 100 Velocidade de redução do citocromo c sem inibidor L -glutamil-hi stamina % de inibição (mM) 1 3,5 5 14 10 24 20 35

No sistema enzimático gerador de anião superóxido, a L-glutamil-histamina é capaz de inibir fortemente a redução do citocromo c. Esta inibição varia em função da concentração. A L-prolil-histamina, ou o antioxidante de referência, a β-alanil-histamina, não têm poder inibidor face ao anião superóxido.

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Em certos casos, quando o aminoácido contém um grupo amino secundário, o substituinte do amino secundário mostrou-se capaz de reforçar certas propriedades antioxidantes do produto pseudodipéptido, é, nomeadamente, o caso quando o substituinte é o terc-butoxicarbonilo.

Uma outra propriedade importante destes produtos é a sua capacidade de proteger contra o stress oxidativo, estruturas biológicas lipófilas (membranas celulares) ou hidrófilas (biopolímeros tais como proteínas, ADN).

Graças à presença do núcleo imidazolo e de uma amina nucleófila, certos elementos desta família podem apresentar uma actividade anti-glicação e então oporem-se à condensação não enzimática dos açúcares sobre as proteínas e assim impedir a sua degradação. A presença de um elemento de estrutura próxima da da histamina permite, para certos elementos desta família, obter um comportamento inibidor dos efeitos biológicos da histamina. Áo contrário, em certos casos particulares, é possível obter um composto possuindo uma parte das propriedades biológicas da histamina.

Finalmente, estes produtos apresentam igualmente propriedades citoestimuladoras e favorecem, de forma moderada, a multiplicação de certos tipos de células. Esta propriedade pode, nomeadamente, explicar o comportamento imunoestimulador ou imunomodulador de certos membros desta família de compostos.

De acordo com este modo de acção, os produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção favoreceriam a cicatrização agindo sobre as células do sistema imunitário envolvidas num estádio precoce da cicatrização (linfócitos, mastócitos, monócitos) e cujo papel principal é a secreção dos factores de crescimento.

Este poder “imunoestimulador” é posto em evidência com a ajuda de um teste in vitro sobre esplenócitos de murinos. O protocolo é extraído de: J. Kunert-Radek, H. Stepien, K. Lyson e M. Pawlikowski - “Effects of calcium channel modulators on the proliferation of mouse spleen lymphocytes in vitro ” - Agents and Actions, vol. 29, Nos 3-4 (1990), p. 254-258.

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 10 A proliferação celular é seguida pela medição da taxa de incorporação de timidina tritiada nas células, expressa em número de desintegrações por min., deduzidas do ruído de fundo.

Os resultados obtidos com um imunoestimulante de referência, a concanavalina A, são fornecidos a título de comparação. O efeito imunoestimulador é expresso através de um índice de Estimulação (IE). IE,= N. de desintegrações por min. de uma suspensão celular adicionada de comnosto mitogénio N. de desintegrações por min. de uma suspensão celular de referência sem mitogénio

Os valores correspondem à média de três medições.

Observa-se um efeito imunoestimulador máximo para uma concentração de 5 μg/ml em L-glutamil-histamina. Concluindo, observa-se um efeito imunoestimulador (proliferação celular) moderado para este pseudodipéptido para concentrações compreendidas entre 5 e 10 ,ug/ml.

Concentração em imunomodulador ^g/ml) 2,5 5 10 25 IE(L-glutamil-histamina) 7,8 42,7 42,1 5,6 IE (concanavalina A) 8,3 33,4 61,5 4,3

Esta actividade é comparável à de um mitogénio de referência, a concanavalina A. No entanto, a preparação celular utilizada para este teste é heterogénea e contém na realidade diversos tipos de células mononucleadas. A fim de precisar o modo de acção dos pseudodipéptidos, foi realizada uma segunda experiência com uma população homogénea de monócitos humanos. A proliferação celular foi avaliada da mesma forma que anteriormente.

Concentração em imunomodulador (pg/ml) 2;5 5 10 25 IE(L-glutamil-histamina) 8,23 39,8 23,5 2,5 IE (concanavalina A) 4,82 29,6 21,1

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 11 Põe-se assim em evidência uma estimulação óptima dos monócitos para a mesma concentração que anteriormente. Observa-se igualmente que este pseudodipéptido é ligeiramente mais activo que a concanavalina A, por um factor de 1,34 em média.

Estes resultados sustentam a hipótese de um modo de acção indirecta sobre os linfócitos através da activação dos monócitos.

Na maioria dos casos, a conservação in vivo da actividade dos produtos pseudodipéptidos da invenção está ligada à preservação da integridade da molécula no contacto com os sistemas enzimáticos hidrolíticos e, em particular, das peptidases.

Contudo, para aplicações particulares, foi procurada uma certa sensibilidade dos produtos pseudodipéptidos da invenção aos sistemas enzimáticos.. E o caso em que o aminoácido contém uma amina secundária substituída por um dos seguintes radicais

O O

II II CH3-C- ou Ph-C-

Por exemplo, o produto activo obtido no primeiro caso (N-acetil-2-aminobutiril-histamina), é susceptível de ser hidrolizado de forma enzimática in vivo para reformar um novo composto pseudodipéptido sempre activo:

O H CHrCH3 Η H CH2-CH3 H CH?—G—N—C— C — N—Cff—CHi—Im->H—N—C— C— N—CH?—CHi—Im

I II I II

HO. HO

Obtém-se apenas uma protecção temporária do composto peptídico, mas é também uma forma de reformar in situ a função amina primária do péptido e de assim restaurar certas propriedades ligadas à presença de uma amina nucleófila, ionizável, a pH fisiológico, na molécula. Pode citar-se o efeito anti-glicação associado, em parte, à capacidade de um composto aminado se ligar, com a ajuda de uma ligação covalente, a um açúcar redutor.

Esta estratégia pode ser útil quando for desejável: modificar a polaridade do péptido de partida (por exemplo, para o tomar compatível com uma formulação particular), evitar a presença de um grupo ionizável a pH fisiológico na molécula ou, finalmente, reduzir a reactividade do péptido face a outras espécies químicas (incompatibilidade com a presença de uma espécie electrófila), presentes numa formulação.

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Esta estratégia permite também melhorar, em certos casos, a biodisponibilidade e a farmacocinética desta categoria de produtos activos, resultando numa potencialização do efeito farmacológico.

Aplicações farmacêuticas e cosmetológicas O conjunto das propriedades enunciadas acima conduz a aplicações terapêuticas e cosmetológicas apreciáveis dos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção.

As propriedades antioxidantes dos pseudodipéptidos de acordo com a invenção permitem propor estes produtos para o tratamento das patologias associadas ao “stress oxidativo”

De entre estas, uma aplicação terapêutica importante é o tratamento da catarata. As causas das diferentes cataratas sào diversas. Os mecanismos implicados nestas patologias, quer sejam do tipo “catarata senil” ou “catarata diabética” são agrupados em duas categorias: os mecanismos oxidativos (Μ. A. Babizhayev, A.I. Deyev, L.F. Lindberg, “Lipid peroxidation as a possible cause of cataract”, Mechanisms of Ageing Dev., Vol. 44 (1988); P. 69-89), e os mecanismos de reticulação do tipo glicação (T.J. Lyons, G. Silvestri, J.A. Dunn, D.G. Dyer, J.W. Baynes “Role of glycation of lens crystallins in diabetic and non-diabetic senile cataracts”, Diabetes Vol. 40, N° 8, (1991), P. 1010-1015).

Como se viu anteriormente, as propriedades antioxidantes dos pseudodipéptidos, exercendo-se em particular pela sua actividade anti-radicais livres e tipo “peroxidase” e, igualmente, pela sua actividade anti-glicação, fazem dos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção produtos eficazes para tratar a catarata. A capacidade destes compostos em exercer uma actividade reparadora face às alterações provocadas pelos R.L. sobre as estruturas biológicas é particularmente importante no tratamento da catarata dado que se traduz por uma regressão das opacidades do cristalino.

Os produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção podem opor-se aos fenómenos oxidativos responsáveis pela aterosclerose. Nesta patologia, a oxidação das partículas lipoproteicas de baixa densidade (LDL) que circulam no sangue é responsável pela fragmentação da parte proteica (apoproteína B) como da fracção lipídica destas partículas. Os fragmentos formados induziriam ao aparecimento de formas celulares anormais (monócitos e macrófagos carregados de colesterol) capazes de se agregarem sobre as paredes dos vasos sanguíneos e de formar a placa de ateroma.

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Os produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção seriam ainda particularmente adaptados ao tratamento desta doença na medida em que foi recentemente posto em evidência que os fenómenos de glicação são igualmente implicados na génese da placa de ateroma (Ref. T.J. Lyons - “Glycation and oxidation - A role in the pathogenesis of Atherosderosis” - American Journal of Cardiology, vol. 71, N° 6 (1993), p. 1326-1331).

Os produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção podem igualmente opor-se ao processo de cancerogénese na medida em que foi demonstrado que as espécies radicalares derivadas do oxigénio são responsáveis pela cisão ou modificação das cadeias de ADN, podendo estas transformações estar na origem da evolução das células sãs em células cancerosas.

Da mesma forma, as propriedades antioxidantes dos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção permitem indicar estes produtos para o tratamento dos estados inflamatórios patológicos e, em particular, para o tratamento da artrite reumática. Com efeito, a deterioração do líquido sinovial é um sintoma característico da artrite do tipo inflamatória e foi possível mostrar que a degradação de um dos seus constituintes essenciais, o ácido hialurónico, era devida a um “stress oxidativo”. Estudos mais recentes (Ref. B. Halliwell e J.M.C. Gutteridge - “Chronic inflammatio and the auto immune deseases” - Free Radicais in Biology and Medecine - B. Halliwell e J.M.C. Gutteridge Eds - Clarenton Press (1989), Oxford, p. 422-438) puseram igualmente em causa os fenómenos de peroxidação lipídica envolvidos neste processo e que explicariam a acção benéfica dos produtos de acordo com a invenção.

As propriedades antioxidantes dos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção podem igualmente ser exploradas em tratamento anexo a uma radioterapia. Este efeito radioprotector, já conhecido para a β-alanil-histidina assenta igualmente sobre as propriedades citoestimulantes deste tipo de composto, nomeadamente face às células da medula óssea, muito sensíveis às irradiações utilizadas em radioterapia.

Segundo dados recentes, certos sintomas epilépticos poderiam provir de lesões provocadas pelos radicais livres oxigenados sobre certas regiões do cérebro (Ref. G.R. Jackson, K. Werrbach-Perer, J.R. Perez-Polo - “Role of nerve growth factor in oxidant-antioxidant balance and neuronal injury - II - A conditioning lesion paradigon” - Journal of Neuroscience Research, vol. 25, N° 3 (1990), p. 369-374). O poder regenerador dos tecidos (nervosos no caso) dos produtos da invenção é um elemento importante nesta patologia associada a uma degenerescência dos tecidos nervosos. Estes produtos poderiam igualmente 85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 14

ser indicados para ο tratamento da doença de Parkinson na qual estaria envolvido um “stress oxidativo” afectando o tecido cerebral.

Certas afecções vasculares e, nomeadamente, a endotoxemia, estão associadas à sobreprodução de uma espécie radicalar: o radical óxido nítrico NO°. A acção deste radical, produzido pelas células endoteliais e as células dos músculos lisos dos vasos sanguíneos, traduz-se por uma vasodilatação crónica. Este estado pode, nomeadamente, ser prejudicial quando de tratamentos que implicam agentes vasoconstritores. Nas células, uma enzima, a NO-sintase, catalisa a transformação de um aminoácido, a L-arginina, em NO°. De acordo com a invenção um pseudodipéptido antioxidante incorporando o radical L-arginilo (ou um derivado TS^-metil-L-arginilo) na sua estrutura, seria capaz de agir directamente sobre NO°, mas igualmente sobre a enzima responsável pela sua síntese, por um comportamento de inibidor da catálise enzimática.

Ao nível da pele, as propriedades antioxidantes dos produtos pseudodipéptidos da invenção podem ser exploradas para neutralizar os efeitos das espécies radicalares oxigenadas geradas pela irradiação luminosa. Opor-se-ão assim eficazmente às reacções fotoalérgicas (as espécies radicalares induzem ao nível da pele a formação de moléculas alergizantes). Em associação com um princípio activo sensível à oxidação (ex.: clorpromazina) prevenirão a sua transformação num composto tóxico.

Este princípio encontra a sua melhor aplicação aquando dos tratamentos por fotoquimioterapia de certas doenças da pele. Com efeito, estes tratamentos assentam na utilização de um fotossensibilizante (ex: psoralen) que, sob o efeito de uma irradiação, exerce uma acção benéfica (interacção com o ADN), mas que, infelizmente, se acompanha da formação de espécies radicalares, responsáveis por efeitos secundários indesejáveis.

Os produtos da invenção podem igualmente ser indicados para se oporem ao aparecimento de sintomas cutâneos em indivíduos que sofram de porfiria, dado que as porfirinas potenciam os danos ocasionados pelos R.L.

Podem igualmente opor-se à formação de lesões cutâneas ligadas ao “stress oxidativo” nas pessoas que sofrem de doenças autoimunes tais como o Lúpus Eritematoso Crónico (SLE).

Opor-se-ão igualmente eficazmente aos efeitos de um “golpe de sol”: eritemas, edemas è formação de células características ao nível da pele. As propriedades antioxidantes dos compostos de acordo com a invenção podem certamente ser utilizadas para a prevenção

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 15 do envelhecimento cutâneo. Com efeito, múltiplos argumentos experimentais, analíticos e epidemiológicos, militam a favor da teoria segundo a qual a acumulação de danos bioquímicos provocados pelos R.L. constituiria o processo essencial do envelhecimento. É nomeadamente claro que a exposição à irradiação solar, responsável pela formação de espécies radicalares derivadas do oxigénio, é uma causa do envelhecimento cutâneo prematuro.

Foi finalmente demonstrado experimentalmente que estes compostos se opunham a outros fenómenos característicos do tecido cutâneo em envelhecimento: A reticulação não enzimática de proteínas tais como o colagénio ou a elastina pelos açucares (V.M. Monnier - “Nonenzymatic glvcolysation, the Maillard reaction and the aging process” - Journal of Gerontology, vol. 45, N° 4 (1990), p. B105-111), A formação de complexos lipoproteicos: lipofusinas (reticulação pelos subprodutos do stress oxidativo)

Foi demonstrado que a L-arginina era capaz de se opor à reticulação não enzimática (este aminoácido pode condensar-se sobre os açúcares mas também sobre certos subprodutos dicarbonilados do stress oxidativo). Um pseudodipéptido de acordo com a invenção que incorpora na sua estrutura um radical L-arginilo será portanto particularmente indicado para se opor a estes mecanismos de envelhecimento tissular.

Uma outra série de aplicações ressalta das propriedades citoestimulantes dos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção e, como foi demonstrado, das suas propriedades imunoestimuladoras. Estas propriedades permitem favorecer a regeneração tissular e a cicatrização e, de uma maneira geral, regular as funções fazendo intervir os efectores da resposta imunitária.

Podem assim ser utilizados para favorecer a regeneração dos tecidos conjuntivos cutâneos perturbados. Favorecem a reparação das mucosas após queimaduras ou após tratamentos quimio- e radio-terapêuticos.

Segundo este princípio, estes produtos podem igualmente ser indicados para a prevenção e o tratamento das rugas.

As propriedades citoestimuladoras e regeneradoras dos péptidos exercem-se mais particularmente face aos tecidos musculares onde se encontram concentrações elevadas de 85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 16

um péptido natural aparentado, a β-alanil-histidina. Ainda que o papel fisiológico deste composto não esteja, actualmente, perfeitamente estabelecido, ele está estreitamente ligado ao metabolismo muscular. Assim, os produtos da invenção poderiam participar no melhoramento da contractilidade dos músculos, regular a contracção cardíaca. Pode-se igualmente utilizar este tipo de propriedades para o tratamento de certas degenerescências musculares tais como a miodistrofia de Dushen.

As propriedades cicatrizantes dos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção encontram aplicação em numerosos domínios. Pode-se citar o tratamento das úlceras gástricas, para o qual um produto dipéptido aparentado da camosina, ofereceu bons resultados (M. Ito, T. Tanaka e Y.Suzuki - “Effect of N-(3-aminoproprionyl)-L-histidinato zinc (Z-1’03) on healing and hydrocortisone-induced release of acetic acid ulcers in rats with limited food-intake-time” - Japanese Journal of Pharmacology, vol. 54 (1990), p. 513-521). Além disso, as propriedades antioxidantes e anti-inflamatórias dos produtos da invenção são úteis para o tratamento desta patologia. Um quelato de zinco de acordo com a invenção, tal como foi descrito anteriormente, é particularmente indicado para esta aplicação.

As propriedades cicatrizantes dos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção são igualmente particularmente indicadas para o tratamento das afecções da cómea. Poderão ser administrados em tratamento pós-operatório, após incisão da cómea para a correcção da miopia, por exemplo.

Podem igualmente ser vantajosamente utilizados para o tratamento das patologias do “olho seco” favorecendo a cicatrização do epitélio comeano mas igualmente graças a um comportamento de “lágrima artificial”: protecção dos tecidos lesados contra o “stress oxidativo” (estado, inflamação, irradiação U.V.), incorporação em formulações que favorecem a restauração do filme lacrimal.

As composições que contêm os produtos pseudodipéptidos da invenção poderão também, devido à sua acção imunoestimulante e regeneradora dos tecidos, opor-se aos fenómenos de degenerescência retiniana. Eles verão os seus efeitos reforçados devido ao facto de um componente “stress oxidativo” intervir nesta patologia (Ref. R.E. Anderson, L.M. Rapp, R.D. Wiegand - Current Eye Research, vol. 3 (1984), p.223-227).

As propriedades imunoestimuladoras dos produtos pseudodipéptidos da invenção podem finalmente ser aproveitados para a potencialização das vacinas em substituição dos adjuvantes classicamente utilizados para reforçar a resposta imune nos homens (sais de alumínio, extractos de origem bacteriana, monofosforil A ...) cujos efeitos secundários não

85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 17 são descurados (RK Gupta, EH Relyveld, EB Lindblad, B. Bizzini, S Ben-Efraim e CK Gupta “Adjuvants - a balance between toxicity and adjuvancity” Vaccine, vol. 11, n° 3 (1993), P.293-306). Còmo foi já mencionado, certos pseudodipéptidos que respondem à fórmula geral dada acima podem comportar-se como inibidores da histamina. De entre as aplicações terapêuticas que exploram esta propriedade, podemos citar:

Um antagonista da histamina poder-se-á opor à agregação plaquetária em aplicações para o tratamento das afecções do sistema vascular periférico. Com efeito, provou-se que a histamina é um mediador intracelular que favorece a agregação plaquetária (S.P. Saxena, L.J. Brandes, A.B. Beckerk, J. Simons, F.S. La Bella e J.M. Gerrard, Science, vol. 243, n° 24 (1989), P. 1596-1599). A histamina é igualmente um mediador intracelular implicado no crescimento e na multiplicação celular (JR. Chanda, A.K. Ganguly Câncer Letters, vol. 34 (1987), P.207). Um pseudodipéptido antagonista de acordo com a invenção poderá assim ser utilizado para regular a multiplicação celular, nomeadamente, ao nível dos tecidos cicatriciais hipertróficos (quelóides). A histamina é também um mensageiro extracelular que intervém em numerosos processos biológicos. Assim um antagonista de acordo com a invenção poderá ser aplicado para o tratamento das alergias, da inflamação, de certos disfuncionamentos cardíacos, ... e para todas as patologias em que a libertação excessiva da histamina é posta em causa.

Poderia assim ser particularmente benéfico incluir os produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção nos perfumes e desodorizantes a fim de se opor às reacções alérgicas, e em particular aos choques anafiláticos, provocadas por certas composições fortemente odorantes.

Certos elementos desta família de compostos podem, ao contrário do caso anterior, possuir certas das propriedades da histamina (comportamento “pró-histamínico”). Um comportamento de antagonista dos receptores H2 da histamina permite inibir a activação dos neutrófilos e em consequência a produção excessiva de radicais livres por estas células (R.Burde, R.Seifert, A.Buschauer, G.Schultz, “Histamine inhibits activation of human neutrophils and HL-60 leukemic cells via H2-receptors” Naunym-Schmiedebergs Arch. of

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Pharmaçology, νοί. 340, η° 6 (1989), Ρ 671-678). Este permite considerar a utilização de tais pseudodipéptidos para o tratamento de certos estados inflamatórios patológicos. A histamina favorece igualmente a multiplicação e o crescimento celular (G. Kahlson, E. Rosengren, C. Steinhardt Journal of Physiology, vol. 151 (1960), P. 131). Um composto “pró-histamínico” poderia assim favorecer a regeneração celular.

Uma série de aplicações assenta na capacidade de certos produtos pseudodipéptidos de acordo com a invenção, que possuem na sua estrutura um radical L-prolilo (e derivados), se oporem a uma síntese anormal de colagénio e à sua acumulação nos tecidos. Esta propriedade particular poderia estar ligada a uma analogia estrutural com um dipéptido natural, a L-glicil-L-prolina, favorecendo a degradação do colagénio, mas também às suas propriedade antioxidantes dado que o stress oxidativo foi recentemente posto em causa na sobreprodução de colagénio (J.C. Geesin, L.J, Hendricks, P.A. Falkenstein, J.S. Gordon, R. A. Berg “Regulation of collagen synthesis by ascorbic acid: characterization of the role of ascorbate-stimulated lipid peroxidation” Archives of Biochemistry and Biophysics, vol. 290, n° 1 (1991) P. 127-132). A acumulação de colagénio nos tecidos cardíacos é, nomeadamente, uma das maiores complicações dos diabetes.

Este tipo de compostos é indicado para reduzir as quelóides associadas a uma sobreprodução de colagénio aquando do processo de cicatrização. Na medida em que os pseudodipéptidos de acordo com a invenção se podem igualmente comportar como anti-histamínicos e que foi recentemente demonstrado que a histamina estimula a produção de colagénio (A. Hatamochi, H. Uecki, C. Mauch, T. Krieg “Effect of histamine on collagen and collagen m-RNA production in human skin fibroplast”, Journal of Dermatologic Sciences, Vol 2 (1991), P.407-412), os péptidos de acordo com a invenção estão particularmente adaptados a esta aplicação.

Aplicações como estabilizante e conservante A excelente tolerância face aos pseudipéptidos de acordo com a invenção e as suas propriedades antioxidantes e citoestimulantes moderadas permitem propor estes produtos para a conservação e a protecção de substâncias sensíveis à oxidação, matérias alimentares ou órgãos e tecidos conservados ex vivo. 19 85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ

Pode-se citar a prevenção da oxidação dos lipossomas a fim de melhorar a sua estabilidade e evitar a formação de subprodutos tóxicos, a protecção do ácido hialurónico incorporado nas fórmulas cosméticas contra a acção despolimerizante dos radicais livres, a protecção dos óleos e dos produtos alimentares oxidáveis, de produtos dietéticos.

Os produtos da invenção permitem melhorar a conservação das vacinas, do sangue e do soro, a conservação de órgãos destinados à transplantação (com uma referência particular para o coração).

Lisboa, ~Z ΠΗΤ ^00

Por EXSYMOL S.A.M. e MARC BABIZHAYEV - O AGENTE OFICIAL -

Claims

C*·' 85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1 - Produto pseudodipéptido à base de imidazolo, sendo o dito produto seleccionado do grupo consistindo em glutamil-histamina, N-metil-2-amino-L-butiril-histamina, 2-aminoisobutiril-histamina, L-norleucil-histamina, L-2 aminoctil-histamina, Boc-2-amino--L-pentil-histamina, L-omitil-histamina, L-2,6-diaminopimelil-histamina, N-acetil-2--aminobutiril-histamina, N-fenacetil-2-aminobutiril-histamina, L-arginil-histamina, L-proIil--histamina, 4-hidroxi-L-prolil-histamina, L-piroglutamil-histamina.
2 - Processo químico de preparação do produto de acordo com a reivindicação 1 compreendendo as seguintes etapas tomar um alfa-aminoácido N-protegido por um grupo X, tomar o dito alfa-aminoácido O-activado por um grupo Y, ligar o dito alfa-aminoácido N-protegido e O-activado com a histamina, e -1 eliminar X, ou não, de acordo com o produto pseudodipéptido procurado.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2 na qual o alfa-aminoácido é tomado O-activado por esterificação da função carboxílica do dito aminoácido.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3 no qual a etapa de esterificação para tomar o alfa-aminoácido O-activado é realizada pela reacção com um composto seleccionado do grupo consistindo em: álcool cianometílico, o-nitrofenol, 2,4,5-triclorofenol, p-nitrofenol, 2,4-dinitrofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, N-hidroxiftalimida, N-hidroxissuccinimida, 1-hidroxipiperidina e 5-cloro-8-hidroxiquinolina.
5 - Processo enzimático de preparação do produto de acordo com a reivindicação 1 consistindo em ligar um alfa-aminoácido com a histamina na presença de um catalisador enzimático do tipo hidrólase.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 5 na qual o dito catalisador enzimático é uma hidrólase seleccionada do grupo consistindo em lípases extraídas de microorganismos ou de origem animal, e em proteases.
7 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento destinado a tratar a catarata.

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8 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento destinado a tratar a aterosclerose.
9 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento destinado a tratar os estados inflamatórios.
10 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento destinado a tratar as doenças da pele associadas ao stress oxidativo tais como a fotoalergia, a porfiria e o Lúpus Eritematoso.
11, - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento contra a endotoxemia e outras doenças vasculares associadas a uma sobreprodução do radical livre NO.
12 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento destinado à cicatrização dos tecidos tais como os tecidos cutâneos, a mucosa gástrica e os tecidos oculares.
13 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento para o tratamento das lesões gástricas no qual o dito produto pseudodipéptido está sob a forma de um quelato com um átomo de zinco.
14 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento que actue como agente radioprotector.
15 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento utilizado como inibidor da síntese do colagénio.
16 - Medicamento resultante da aplicação de acordo com a reivindicação 15 para o tratamento de certas complicações dos diabetes e para a redução dos quelóides quando do processo de cicatrização da pele.
17: - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter uma composição terapêutica ou cosmética destinada à regeneração e ao rejuvenescimento dos tecidos tais como as mucosas e os tecidos cutâneos.
18 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento que actue como imunoestimulante para a potencialização das vacinas. 85 552 ΕΡ Ο 729 895/ΡΤ 3/3
19 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento capaz de se opor à agregação plaquetária.
20 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter um medicamento anti-alérgico.
21 - Aplicação do produto de acordo com a reivindicação 1 para obter, para a conservação e a estabilização de substâncias sensíveis à oxidação, matérias alimentares ou órgãos e tecidos conservados ex vivo. Lisboa, -2. 0nT. ECOO Por EXSYMOL S.A.M. e MARC BABIZHAYEV - O AGENTE OFICIAL -