KR20090040187A

KR20090040187A - 펩타이드가 결합된 아스코르빈산 유도체

Info

Publication number: KR20090040187A
Application number: KR1020070105843A
Authority: KR
Inventors: 이윤식; 김한영; 노진미
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2007-10-20
Filing date: 2007-10-20
Publication date: 2009-04-23
Also published as: WO2009051460A2; KR101413939B1; WO2009051460A3

Abstract

본 발명은 미백 효과를 나타내는 하기 화학식 (I)의 펩타이드가 결합된 아스코르빈산 유도체에 관한 것이다. 보다 상세하게는,

는 아미노산 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드; R¹은 아미노산 잔기의 곁가지; R²는 NH₂ 또는 OH; 그리고 n은 2 내지 5인 정수인, 하기 화학식 (I)의 펩타이드 결합 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법에 대한 것이다.

화학식 (I)

아스코르빈산

Description

펩타이드가 결합된 아스코르빈산 유도체{PEPTIDE COUPLED ASCORBIC ACID DERIVATIVES}

본 발명은 미백 효과를 나타내는 펩타이드가 결합된 하기 화학식 (I)의 아스코르빈산 유도체에 관한 것이다. 보다 상세하게는,

화학식 (I)

아미노산은 단백질의 최소 구성 단위로 모두 20종이 있고, 이 중 9종은 인체에서 합성되지 않아 반드시 식품으로 섭취해야 하는 필수 아미노산이다. 아미노산은 친수성과 소수성으로 구분할 수 있는데, 탄화수소 사슬이나 고리를 갖는 아미노산은 소수성을 띠게 되며, 알라닌(alanine), 글라이신(glycine), 아이소류신(isoluecine), 류신(luecine), 메티오닌(methionine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트립토판(tryptophan), 프롤린(proline), 발린(valine)이 그 예이다.

펩타이드(Peptide)는 아미노산의 중합분자로 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태로, 많은 아미노산이 연결되면 단백질로 부른다. 펩타이드 결합은 -COOH와 -NH₂ 사이에 물이 빠져나가고 -CO-NH- 형태를 이루는 결합이다. 즉, 펩타이드는 단 백질을 구성하는 주요 성분인 아미노산이 2개 이상의 펩타이드 결합으로 연결된 형태의 화합물을 말한다. 보통 2 내지 50 개의 아미노산이 결합한 상태이고, 분자량은 100,000 이하이다. 구성 아미노산의 수가 2, 3, 4 등인 펩타이드는 그 수에 따라서 각각 디펩타이드(dipeptide), 트리펩타이드, 테트라펩타이드 등이라고 한다. 약 10개 이하의 펩타이드결합으로 된 것을 올리고펩타이드(oligopeptide)라고 하며, 다수의 펩타이드결합으로 구성된 것을 폴리펩타이드라고 총칭한다.

아스코르빈산(Ascorbic acid) 흔히 말하는 비타민 C로서, 친수성을 갖으며 미백의 효과가 뛰어난 것으로 알려져 있다.

최근 인구의 노령화, 레저 인구의 증가로 인하여 자외선에 노출 기회의 증가, 사회적 스트레스의 증가, 환경오염에 의한 오존층의 파괴에 따른 자외선 조사량이 증가함에 따라 피부의 색소침착 이상 현상을 일으킬 수 있는 기회가 늘어나면서 이에 상응하여 피부 미백에 관한 관심도 증대되고 있다. 이러한 피부 미백에 대한 사회 경제적 요구의 점증에 따라 생체 친화적이면서도 미백 활성이 높은 물질을 개발하는 것이 중요한 기술적 과제로 대두되고 있다.

국내에서도 이에 관한 연구가 활발히 진행되어 이러한 색소 침착을 치료하기 위한 약품이 이미 40 여종 이상 출시되고 있으며, 화장품에서도 미백 제품이라 하여 피부 미백에 효과를 나타내는 화장품들이 여러 회사에서 판매되고 있다.

사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되는데, 특히 멜라닌이 결정적 요소로 작용한다. 멜라닌은 피부 표피 내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트에서 합성되고, 주변 각질세포(케라티노사이트)로 전이되 어 사람의 피부색을 나타내게 된다. 피부의 외각인 표피층에 존재하는 멜라닌은 자외선 차단의 역할을 하여 진피 이하의 피부기관을 보호해 주는 동시에 피부 생체 내에서 생성된 자유 라디칼(free radical)등을 잡아주는 역할을 하여 피부 내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 한다.

그러나 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되지 않는 안정한 물질로서, 과잉 생산된 멜라닌은 여성들의 주요 고민인 기미, 주근깨 등을 유발하는 등 문제가 되고 있다.

생체 내에서 일어나는 멜라닌의 합성 과정을 살펴보면, 멜라닌은 타이로신(tyrosine) 혹은 도파(DOPA)를 기질로 하여 타이로시나아제(tyrosinase) 등의 효소를 촉매로 한 중합화 산화 과정을 통해 생성되는 것으로 알려져 있다. 또한, 피부에 자유 라디칼 생성이 많아지거나, 염증 반응이 있거나, 자외선 등의 자극이 가해지면 멜라닌 생성은 증가된다.

현재 유통되고 있는 미백제는 멜라닌 색소가 생성되는 것을 억제하는 성분과 각질 등에 이미 침착돼 있는 멜라닌 색소를 제거하는 성분 등이 함유돼 있다.

멜라닌 색소의 형성을 억제하는 미백 성분으로는 알부틴, 코직산, 아스코르빈산 등이 있으며, 색소가 침착된 각질을 제거하는 물질로는 AHA(alpha hydroxy acid), BHA(butylated hydroxyanisole), 레티노이드 등이 있다.

미백제 용도로 주로 사용되는 의약품은, 멜라닌 생성 억제 원료로 알려진 물질로서 페놀, 카테콜, 레소시놀, 히드로퀴논(hydroquinone)등의 폴리히드록시페놀 화합물이다. 폴리히드록시 화합물은 항산화 효과에 의하여 타이로시나아제의 활성 을 억제하는 화합물이며 효소 활성의 억제라는 긍정적인 효과가 있으나, 반면 멜라닌 생성세포를 파괴하여 백반증을 유발하는 등 심한 피부 자극을 유발하므로 그대로 피부에 적용하기에는 안전성 측면에서 문제가 있다.

또한 화장품에서 현재 주로 쓰이고 있는 피부 미백제인 아스코르빈산 유도체 또는 상백피, 알로에, 감초 등의 식물 추출물들은 그 미백 효과가 충분하지 못할 뿐 아니라, 이러한 물질 대부분이 환원성을 지니기 때문에 화장품으로서 상온에서 장기간 보관 시에는 그 효과가 감소하거나 색이 변질되는 단점이 있어서, 이러한 단점이 제거된 좀 더 효과적인 미백제의 개발이 요구되어 왔다.

이러한 미백제의 개발에 있어서 중요한 것은 높은 미백 활성을 가지면서 생체 친화적이고, 장기 보관에도 안정한 물질을 개발하는 것이다. 즉, 효과적으로 타이로시나제의 활성을 저해하면서 생체 친화적이어서 피부에 부작용이 없어야 하고, 동시에 장기보관이 가능한 미백제를 개발하는 것이 중요한 기술적 관건이다. 이러한 기준을 만족시키는 미백제를 합성하기 위해서 당 업계에서는 기존의 미백 활성이 있는 것으로 알려진 물질에 생체 친화적인 물질을 도입시켜 미백 활성과 생체 친화성을 적절히 조절하는 것과 동시에 저장 안정성을 확보하기 위한 노력을 해왔다.

그러나 이제까지 미백활성과 생체 친화성을 갖춘 물질들에 대한 연구 개발은 다양하게 이루어졌음에도 불구하고, 장기 보관 안전성까지 갖춘 미백제 물질은 아직까지 개발되지 못하고 있다.

현재까지 알려진 타이로시나제의 활성 억제제로 사용할 수 있는 미백 물질 은, 타이로신의 가지에 있는 페놀과 유사한 구조를 가지는 환원성을 가지는 물질들이며, 코직산, 알부틴, 아스코르빈산 등이 가장 널리 사용되고 있다.

코직산의 경우 멜라닌 생성 억제효과가 있어, 미백화장품의 원료로 사용이 가능하지만, 빛과 열, 그리고 pH에 대한 안정성 등이 좋지 않아 화장품 원료로 배합이 어렵다는 단점을 가지고 있다.

이러한 단점을 개선하기 위하여 코직산-비타민C 복합체(Chem.Pharm.Bull.,44(9), 1647-1655(1996)), 코직산-아미노산 복합체(Biosci.Biothech.Biochem.,59(9), 1745-1746,(1995)), 코직산-코직산 복합체(WO 02/053562), 코직산-신남산 복합체(US5,486,624), 코직산-옥소티아졸리딘 복합체(US5,968,487), 코직산 모노지방산 에스테르(일본국특허공개 소60-9722), 코직산 디지방산 에스테르(일본특개공 61-60801), 코직산 배당체(일본국특허공개 평6-56872)등의 코직산 유도체가 개발된 바 있다.

알부틴도 피부 미백제 성분으로서 비교적 낮은 자극성을 지니기 때문에 피부 색소형성 억제(skin de-pigmentation)에 많이 이용되고 있다. 알부틴은 하이드로퀴논에 β-D-글루코오스가 결합되어 있는 구조를 가지고 있으며, 피부에 적용될 경우 인체 내에 존재하는 분해효소에 의해 β-D-글루코오스가 서서히 분해되고, 이에 따라 생리활성물질인 하이드로퀴논이 서서히 분해됨으로써 뛰어난 미백작용을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 알부틴의 미백기능을 이용하는 선행기술은 대한민국 특허공개 제2001-0109730호에 기재되어 있는바, 알부틴을 함유하는 월귤나무를 사용하여 미백 화장품을 제조하고자 시도한 기술이 개시되어 있다.

그러나 이와 같은 알부틴은 뛰어난 미백효과를 가지는 반면 화장품으로 제형화할 시에 심한 변색을 야기시키는 단점을 가지고 있기 때문에 그 사용량에 제한을 받아왔으며, 이러한 단점을 해결하고자 하는 많은 연구들이 수행되어 왔다.

이러한 예로서, 대한민국 특허공개 제1999-0065147호에 보면, 알부틴과 함께 루틴을 함유시켜 유효성분인 알부틴을 안정화시키고자 한 시도가 개시된 바 있으며, 대한민국 특허등록 제10-0198508호에 보면, 폴리락트산(PLA)을 벽재로 하여 알부틴을 캡슐화함으로써 알부틴 함유 미백 화장품의 안정성을 획득하고자 한 시도가 개시된 바도 있다.

그러나 알부틴만을 함유시킨 미백제의 경우 안정성이 떨어졌고, 안정성을 확보하기 위하여 루틴과 같은 다른 안정화 성분을 첨가하는 경우 첨가된 안정화제가 미백의 효과를 저하시키는 문제가 있었고, 캡슐화의 경우에도 비경제적이며, 미백효능을 보장하지 못하는 등의 단점이 있었다.

화장품 원료 물질 중 가장 대표적인 것으로서는 비타민(Vitamin)이 사용되어 왔다. 비타민은 생체의 신진대사 촉진, 항산화 효과, 세포벽 보호, 면역력 증진, 감염 저항력 상승 등의 기능을 가진 생체 내 필수 물질로서, 대부분 영장류의 경우 생합성이 불가능하여 음식물을 통한 섭취가 필수적이고 부족한 경우 다양한 결핍증을 일으키는 원인이 된다. 또한 피부 미용 및 치료에 있어서는 색소 침착 방지, 콜라겐 합성 촉진, 자외선 차단, 피부의 건조와 각화 방지, 주름 방지, 피부 보습 등 건강한 피부를 유지하는 데 매우 중요한 역할을 하는 물질이다.

비타민에는 예를 들면 레티놀(Retinol, 비타민 A), 아스코르빈산(Ascorbic acid, 비타민 C), 토코페롤(Tocophirol, 비타민 E) 및 이들의 유도체 등이 포함된다. 그 중 미백의 효과가 뛰어난 것으로 알려진 것은 아스코르빈산이다.

(아스코르빈산)

비타민 C는 자외선(UV) 차단 효과, 항산화 효과, 콜라겐 형성 촉진을 통한 피부 주름 개선, 기미/주근깨/검버섯 등의 색소 침착개선 효과, 면역체계 강화 등을 가진다. 이와 같은 비타민 C의 작용을 요약하면 다음과 같다.

비타민 C는 자외선, 특히 UVA에 대한 차단기능이 강하다(Darr, D. et al., 1996, Acta Derm. Venereol. (Strckh). 76: 264-268; Black, H. S. et al., 1975, J. Invest. Dermatol. 65: 412-414). 또한, 비타민 C는 UVB에 의해 발생하는 피부 손상을 보호하는 역할을 하는데, UVB 조사전에 비타민 C를 돼지와 인간의 UVB가 쬐여지는 피부 부위에 바르면 홍반과 햇볕에 타는 현상이 방지한다고 밝혀졌다(Darr, D. et al., 1992, Brit. J. Dermatil. 127: 247-253; Murry, J. et al., 1991, J. Invest. Dermatol. 96: 587).

피부, 혈액 및 기타 조직에서 화학적 오염, 흡연, 특히 자외선(UV)에 의해 유발되는 활성산소종(ROS, Reactive Oxygen Species)을 중화시키는 강력한 생체 항산화제로서의 비타민 C의 작용은 비타민 C가 두개의 전자를 받아들여 탈수소-L-아스코르브산(Dehydro-L-ascorbic acid) 형태로 쉽게 산화될 수 있는 구조를 가지기 때문이다. 비타민 C는 피부의 비효소적 항산화제 방어 시스템의 중요한 요소로 비타민 C가 고농도로 존재할 때 싱글렛 산소(singlet oxygen), 슈퍼옥사

이드 음이온(superoxide anion), 히드록시 라디칼(hydroxy radical)과 같은 ROS 등이 단백질, 핵산, 세포막지질등의 생체 성분을 산화시키거나 변성시키기 전에 이들을 중화시키는 역할을 하는 것이다(Buettner, G. R. et al. 1996.Cadenas, E., Packer, L., eds. Handbook of antioxidants. pp. 91-115).

각질층으로 경피적으로 공급됨으로써 피부 광택, 피부색 개선, 주름 감소, 탄력 증가 등을 나타내는 비타민 C의 효과는(미국 특허 제4,983,382호), 비타민 C에 의해 콜라겐 합성이 촉진되기 때문이다. 콜라겐 폴리펩타이드의 10% 정도를 차지하는 히드록시프롤린은 프롤린 히드록실라제(proline hydroxylase)에 의해 생합성되는데 이 효소의 보조인자(cofactor)로 비타민 C가 작용한다(Tomita, Y. et al., 1980, J. Invest. Dermatol. 75(5): 379-382). 즉, 비타민C는 프롤린 히드록실라제의 활성을 촉진하여 히드록실프롤린의 합성을 촉진하고, 이는 삼중나선 구조의 콜라겐(대한민구 공개특허 제10-2004-0094302호) 생합성을 촉진하여 피부 주름 형성 억제등의 피부 개선 효과를 가지는 것이다.

비타민 C의 미백 효과는 비타민 C가 멜라닌 형성에 중요한 티로시나아제(tyrosinase) 활성과 멜라닌 형성을 억제하기 때문이다(Tomita, Y. et al., 1980, J. Invset. Dermatol. 75(5); 379-382).

비타민 C의 면역체계를 강화시키는 역할은 알러지 반응물질인 히스타민의 세포막에서의 방출을 억제함으로써 민감성 피부에서 알러지 반응을 억제하고 쥐에서 항원에 접촉시 자외선 유도된 면역억제와 내성으로부터 보호한다는 것이 증명되었다(Nakamura, T. et al., 1997, J. Invest. Dermatol. 109: 20-24). 또한, 백혈구의 식균작용을 도와주고 감염이 전개되는 동안 백혈구 이동을 촉진시켜 감염을 억제하고 바이러스 증식 억제 물질인 인터페론의 생합성을 증가시키는 작용을 하여, 다양한 감염성 질환에 대한 생체 저항성을 상승시키는 역할도 한다. 그 외 비타민 C는 생체내엽산 대사 및 아미노산의 대사 과정에도 관여하는 등 다양한 기능을 수행한다.

상기 언급한 다양한 역할을 담당하는 비타민 C는 C₆H₈O₆의 화학식을 가지는 수용성의 물질이다. 비타민 C는 분자의 2, 3, 5, 6번 탄소에 위치하는 수산화 그룹 때문에 친수성(hydrophilicity)을 가진다. 물과 같은 중성의 pH에서는 이들 수산화 그룹, 특히 2번과 3번 탄소가 음의 전하를 가지게 되는데 이로 인해 수용액에 빨리, 완전히 녹게 되지만 수용액이 아닌 피부와 같은 유기적인 환경에서는 용해도의 제한이 있다.

또한, 비타민 C는 외용제에 공식적으로 사용되는 유기용매 예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 다양한 지방(fat)등에 잘 녹지 않아서, 비타민 C를 피부로 운반하는데 한계를 가진다. 즉, 비타민 C가 이온화되지 않았을 때 피부장벽을 쉽 게 통과하여 흡수되는데 비이온 상태를 유지하기 위해서는 pH가 4.2 이하여야만 한다는 제한점이 있다.

비타민 C의 피부 축적량은 경구 투여보다 외용제로 사용하였을 때 20배 내지 40배 정도 높은 것으로 알려졌다. 자외선(UV) 차단 효과, 항산화 효과, 콜라겐 형성 촉진을 통한 피부 주름 개선, 기미/주근깨/검버섯 등의 색소 침착개선 효과, 면역체계 강화등을 도모하기 위한 목적으로 사용하는 피부외용제의 경우에는 효능물질이 피부의 각질층을 통과하여 표피에 있는 세포까지 도달하여야 작용을 하므로 효능물질의 경피흡수율이 높아야 한다.

일반적으로 어떤 물질의 피부 침투율은 그 물질의 친유성(lipophilicity)과 관계가 있다. 피부의 친유성과 유사한 물질인 경 우 피부로의 분배계수가 커져 경피흡수가 잘되는 것으로 알려져 있는데 비타민 C의 경우는 친수성이 높아 피부로의 분배가 낮아 경피흡수가 어렵다.

아스코르빈산, 즉 비타민 C는 멜라닌 생합성 과정 중 율속 단계 효소인 타이노시나아제에 대한 타이로신과의 경쟁적 결합을 시도하는 경쟁물질이고, 타이로시나아제 유전자의 발현 자체에 대한 억제제이며, 산화된 멜라닌을 환원하여 필요 이상의 멜라닌 생합성을 억제함으로써 미백 관련 생체 과정에 대한 전반적인 활성을 나타낸다 (Postaire E et al., Biochem Mol Int, 42, 1023pp-1033pp,1997). 그러나, 이러한 아스코르빈산은 불안정성으로 인하여 사용에 어려움이 있었다. 특히 파괴 정도에 따라 노란색에서 갈색을 거쳐 거의 흑색에 가까운 짙은 갈색까지 색상이 변화하게 되어 상품성을 크게 감소시킨다.

이러한 문제를 해결하기 위한 방법으로서, 아스코르빈산의 변질되기 쉬운 부위에 여러 가지 다른 염들과 화학 반응에 의한 결합으로 다양한 유도체를 만드는 방법들이 사용되었다(대한민국 특허 제10-0459679-0000호 및 대한민국 특허공개 제2001-0109730호).

그러나 현재까지 만들어진 거의 모든 아스코르빈산 유도체는 그 효능에 있어서 순수 아스코르빈산보다 떨어지며 유도체화에 따른 합성 공정에서 유해한 용매들이 잔존함에 따른 피부자극 등의 우려가 있을 수 있어 문제되었다. 또한, 아스코르빈산은 분해가 쉽고, 친수성이기 때문에 세포에 대한 투과도가 매우 낮아 미백 효과를 위해서는 다량 사용해야 하는 단점이 있었다.

따라서 당업계에는, 미백제의 환원성은 유지하면서 생체 친화성과 안정성을 높일 수 있는 기술의 개발의 오랫동안 요구되어 왔다.

본 발명은 생체 친화적인 펩타이드를 기존의 미백 물질로 쓰이고 있는 아스코르빈산에 도입하여, 미백효과를 유지하며 피부에 부작용이 없고, 장기 보관에도 안정성을 유지할 수 있음을 구체적으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 기본적인 목적은 아스코르빈산에 펩타이드를 도입하여, 생체 친화적이고 미백효과를 유지하며 피부에 부작용이 없고 장기 보관에도 안정성을 유지하는 물질인, 하기 화학식 (I)의 화합물을 제공하는 것이다:

화학식 (I)

상기 식에서,

는 아미노산 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드; R¹은 아미노산 잔기의 곁가지; R²는 NH₂ 또는 OH; 그리고 n은 2 내지 5인 정수이다.

본 발명의 또 다른 목적은 3번 위치 히드록시기가 활성화된 아스코르빈산과 2 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 화학식 (Ⅰ)의 아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물을 포함하는 피부 미백제 및 이를 포함한 피부 미백 화장품 조성물을 제공하는 것이다.

전술한 본 발명의 기본적인 목적은 하기 화학식 (I)의 화합물을 제공함으로써 달성될 수 있다:

화학식 (I)

상기 식에서,

본 발명의 미백 화합물의 제조에 사용되는 아스코르빈산은 종래 기술에 따라 제조되는 아스코르빈산이다.

아스코르빈산

아스코르빈산(L-threo-2,3,4,5,6-pentahydroxy- 2-hexenoic acid-4-lactone)은, 인체의 필수 아미노산이며 주로 신선한 야채에 존재한다. 아스코르빈산은 환원력이 강한 화합물로서, L-아스코르빈산은 비타민 C 라고도 불리며, 산화형과 환원형은 가역적으로 변한다. 수용액이 산성을 나타냄은 엔올(enol)형 히드록시기의 하나가 해리하기 때문이며, 생체 내에서 산화-환원계에 관여하여 비타민으로서의 작용을 나타낸다.

아미노산은 대표적으로 20개의 종류가 있으며(페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W), 세린(S), 트레오닌(T), 아스팔틱산(D), 아스파라진(N), 글루타믹 산(E), 글루타민(Q), 라이진(K), 알지닌(R), 히스티딘(H), 시스테인(C), 메티오닌(M), 프롤린(P), 글라이신(G), 알라닌(A), 발린(V), 류신(L), 아이소류신(I)), 입체적으로는 L-과 D-구조가 있다. 아미노산은 친수성과 소수성으로 구분할 수 있는데, 탄화수소 사슬이나 고리를 갖는 아미노산은 소수성을 띠게 되며, 알라닌, 글라이신, 아이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 프롤린, 발린이 그 예이다.

펩타이드(Peptide)는 아미노산의 중합분자로 보통 소수의 아미노산이 연결된 형태로, 많은 아미노산이 연결되면 단백질로 부른다. 펩타이드 결합은 -COOH와 -NH₂ 사이에 물이 빠져나가고 -CO-NH- 형태를 이루는 결합이다. 즉, 펩타이드는 단백질을 구성하는 주요 성분인 아미노산이 2개 이상의 펩타이드 결합으로 연결된 형태의 화합물을 말한다. 보통 2 내지 50 개의 아미노산이 결합한 상태이고, 분자량은 100,000 이하이다. 구성 아미노산의 수가 2, 3, 4 등인 펩타이드는 그 수에 따라서 각각 디펩타이드(dipeptide), 트리펩타이드, 테트라펩타이드 등이라고 한다.

생체막을 구성하는 단백질에는 알라닌, 류신, 아이소류신 등의 소수성 아미노산이 많이 함유되어 있어 소수성이 강하다. 아스코르빈산은 친수성이기 때문에 생체막에 대한 투과도가 낮지만, 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드가 도입된 아스코르빈산 펩타이드 유도체는 높은 생체막 투과성을 갖는다.

또한, 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 라이신 및 아스파라긴산 중 선택된 아미노산 잔기를 포함하는 아스코르빈산 펩타이드 유도체는 높은 타이로시나제의 활성 저해도를 보이고, 특히 타이로신 아미노산 잔기를 포함하는 경우에 그 효과가 뛰어나다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 3번 위치 히드록시기가 활성화된 아스코르빈산과 2 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 화학식 (Ⅰ)의 아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

3번 위치의 히드록시기만 활성화시키기 위하여, 수득된 생성물과 카바메이트의 전구체인 카보닐 디이미다졸(CDI, 1,1'-Carbonyldiimidazole)을 무수의 THF 하에서 반응시켜 합성한다. 펩타이드는 고체상 합성법을 이용하여 합성하고, 이와 상기 특정 3 번 위치의 히드록시기만 활성화된 아스코르빈산을 커플링시켜 신규한 아스코르빈산 펩타이드 유도체를 제조한다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 또 다른 목적은 5번 및 6번 위치의 히드록시가 보호되어 있고, 3번 위치의 히드록시기가 활성화된 아스코르빈산과 2 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 반응시키는 단계를 포함하는, 상기 화학식 (Ⅰ)의 아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법을 제공함으로써 달성될 수 있다.

기존의 알려진 미백제인 아스코르빈산에 생체 친화적인 펩타이드를 도입하여 타이로시나제 활성 저해 능력을 증진시키고, 생체 친화성과 안정성을 향상시킬 수 있다. 아스코르빈산 유도체를 합성하기 위해 아스코르빈산을 아세톤과 아세틸 클로라이드를 가하여 반응시키고, 이를 아세톤/헥산으로 세척하여 5번 및 6번 위치에 아세탈 형태로 보호된 생성물(5,6-O-isopropylidene ascorbic acid)을 얻는다. 5번 및 6번이 아세탈의 형태로 결합되었음은 L-아스코르빈산의 ¹H-NMR과 5,6-O-이소프로필리딘-L-아스코브릭 애시드(5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid)의 ¹H-NMR 결과를 비교함으로써 확인한다.

또한, 3번 위치의 히드록시기만 활성화시키기 위하여, 수득된 생성물과 카바메이트의 전구체인 카보닐 디이미다졸(CDI, 1,1'-Carbonyl diimidazole)을 무수의 THF 하에서 반응시켜 합성한다.

상기 화학식 (I)의 R²가 NH₂인 경우, 펩타이드는 고체상 합성법을 이용하여 링크 아마이드 레진 위에서 합성하고, 이와 상기 특정 3 번 위치의 히드록시기만 활성화된 아스코르빈산을 커플링시켜 새로운 아스코르빈산 펩타이드 유도체를 제조한다.

상기 화학식 (I)의 R²가 OH인 경우, 펩타이드는 고체상 합성법을 이용하여 2-트리틸클로라이드 레진(2-tritylcholide resin) 위에서 합성하고, 이와 상기 특정 3 번 위치의 히드록시기만 활성화된 아스코르빈산을 커플링시켜 새로운 아스코르빈산 펩타이드 유도체를 제조한다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물을 포함하는 피부 미백제를 제공함으로써 달성할 수 있다. 상기 화합물은 피부 미백의 효과를 갖는다.

전술한 본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부 미백 화장품 조성물을 제공함으로써 달성될 수 있다.

또한, 본 발명의 미백 화장품 조성물은 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니며, 제조하고자 하는 제형에 따라 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 피부 화장품 배합 성분을 포함할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 미백 화장품 조성물은 화장수(스킨), 유액, 크림, 팩, 미용액 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형에 따라 추가로 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 선택하여 적정량으로 첨가할 수 있다. 특히 멜라닌 형성의 주요한 요인이 자외선임을 고려할 때, 본 발명의 미백 화장품 조성물은 자외선 차단제, 광산란제 등을 포함할 수 있으며, 그 제형 및 첨가성분이 상기 내용에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 화학식 (Ⅰ)의 화합물은 비경구(피하) 투여용 약제 조성물에 포함될 수 있으며, 제제 및 사용방법에 따라 생리약학적으로 허용 가능한 담체를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 상기 약제 조성물에는 통상적으로 사용되는 피하 투여용 약제 조성물을 포함할 수 있다.

첫째, 본 발명에 따르면 아스코르빈산 펩타이드 유도체는 타이로시나제 효소 활성 억제작용을 통한 미백 효과를 상승시킨다. 또한, 아스코르빈산 펩타이드 유도체는 세포 내에서 멜라닌 합성 억제 효능을 갖는다.

둘째, 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 생체 친화적인 펩타이드로 인하여, 피부에의 침투가 용이하다.

셋째, 기존의 아스코르빈산 유도체보다 화합물의 안정성이 뛰어나다.

이하, 다음의 실시예를 들어 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 다음의 실시예에 대한 설명은 본 발명의 구체적인 실시 태양을 특정하여 설명하고자 하는 것일 뿐이며, 본 발명의 권리 범위를 이들 실시예에 기재된 내용으로 한정하거나 제한해석하고자 의도하는 것은 아니다.

실시예 1. 활성화된 아스코르빈산 유도체의 합성

미백 물질인 아스코르빈산의 3번 히드록시기에 펩타이드의 아민 말단을 결합시키기 위해, 먼저 아스코르빈산의 5번 및 6번에 위치한 두 개의 히드록시기를 아세탈의 형태로 보호하였다. 아스코르빈산(25 g, 142 mmol)을 200 ml의 아세톤에 현탁시킨 상태로 30분 교반해 준 후, 아세틸 클로라이드(acetyl chloride(2.81 ml))를 가한 다음에 12시간 반응을 진행시켜 흰색의 액체를 얻었다.

상기 용액을 4℃에서 24시간 방치하여 흰색의 침전물을 얻은 뒤, 여액을 여과하고 20% 아세톤/헥산으로 세척하여 5번 및 6번 위치가 아세탈의 형태로 보호된 생성물(5,6-O-isopropylidene ascorbic acid)을 얻었다.

여기에 3번 히드록시기만 활성화시키기 위하여, 상기에서 수득된 생성물(4 g, 19 mmol)과 카바메이트의 전구체인 카보닐디이미다졸(2.9 g, 18 mmol)을 무수의 THF(150 ml)에 녹인 다음 72시간 동안 반응시켜 주어 흰색의 고체를 침전으로 얻었다.

실시예 2. 아스코르빈산의 5번 및 6번 위치의 히드록시기가 보호되었는지 여부 확인 실험

아스코르빈산의 5번 및 6번 위치의 히드록시기를 아세톤을 이용하여 아세탈의 형태로 보호하기 위하여 정의 방법(Jung's method, M. E. Jung; T. J. Shaw; J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 6304)을 이용하였다. 5번 및 6번 위치의 히드록시기가 보호된 아스코르빈산이 시판되고 있으며, 이렇게 보호된 아스코르빈산의 ¹H-NMR 은 이미 알드리치(Aldrich) 시약회사 자료집에 공개되어 있고, 본 실험에서 합성한 것과 그 결과가 일치하였다. 아래의 ¹H-NMR 데이터는 보호되지 않은 아스코르빈산의 데이터와 5번 및 6번 위치의 히드록시기를 아세톤을 이용하여 아세탈 형태로 보호된 아스코르빈산의 ¹H-NMR 데이터를 나타낸다. 아래에 나타낸 바와 같이 1.33 ppm 부분에 아세탈 부분의 두 개의 CH₃의 피크가 나타남을 보아 합성이 되었음을 알 수 있었다:

¹H-NMR of L-ascorbic acid (300MHz, d6-DMSO) δ 3.44-3.85(4H, m), 4.54(1H, d, J = 3Hz))

¹H-NMR of 5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid (300MHz, d6-DMSO ) δ 1.33(6H, s), 3.90-4.45(4H, m), 4.61(1H, d, J = 3Hz).

실시예 3. 링크 아마이드 레진을 이용한 고체상 펩타이드 합성

고체상 합성법을 이용하여 펩타이드를 링크 아마이드 링커(Rink amide linker)가 도입된 아미노메틸 레진 상에서 N-메틸피롤리돈(NMP, N-methylpyrrolidone) 하의 2당량 Fmoc-아미노산을 2시간 반응시켜서 도입하였다. 그 다음에 Fmoc 아미노산과 BOP (benzotriazole-1-yloxy-tris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorophosphate)와 DIPEA(Diisopropylethylamine) 커플링 시약을 이용하여 아미노산을 더 도입하여 펩타이드를 합성하였다. 이때 커플링 시간은 2시간으로 하였고, Fmoc을 떼어내는 조건은 20% 피페리딘/NMP(piperidine/NMP)로 각각 3분, 7분씩 2회 처리하였다.

실시예 4. 펩타이드가 도입된 새로운 아스코르빈산 유도체 미백제의 제조

실시예 3에서 제조된 펩타이드가 합성되어 있는 링크 아마이드 레진 상에서 실시예 1에서 합성한 활성화된 아스코르빈산 유도체를 커플링 시켜 신규한 아스코르빈산 펩타이드 유도체를 제조하였다. 위에서 제조한 N-말단 보호기가 제거된 레진에 NMP 하에서 아스코르빈산 유도체 2당량을 가한 다음 72시간 반응시켰다. 그 다음 20% TFA/MC로 처리하여 목표하는 물질을 레진에서 떼어낸 뒤, 에테르를 이용하여 침전시켜서 아스코르빈산 펩타이드 생성물을 얻어내었다.

실시예 5. 아스코르빈산의 3번 히드록 시 위치에 카보닐디이미다졸의 결합 여부 확인

아스코르빈산의 3번 위치의 히드록시기에만 선택적으로 카바메이트의 전구체인 카보닐디이미다졸을 도입하는 반응은, ¹³C-NMR로 확인하였다. 아래에 나타낸 ¹³C-NMR의 결과를 분석하여 보면 5,6-O-이소프로필리딘-L-아스코르빅 애시드(5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid)와 최종 생성물의 C-3의 위치가 각각 152.92와 153.09로 나타난 것으로 보아 최종 생성물은 3번 위치에만 카보닐 디이미다졸이 도입되었음을 확인할 수 있다. C뒤쪽에 숫자에 아무 표시도 없는 것은 아스코르빈산의 카본이고, ' 표시가 하나 있는 것은 5번과 6번이 묶여 있는 아세탈 부분의 카본이며, ' 표시가 두 개 있는 것은 3번 위치에 도입된 카보닐 디이미다졸의 카본이다:

¹³C-NMR of 5,6-O-Isopropylidene-L-ascorbic acid (75MHz, d6-DMSO ) δ 61.97(C-2'), 64.82(C-3'), 68.39(C-6), 73.38(C-5), 74.20(C-1'), 74.60(C-4), 118.13(C-2), 152.92(C-3), 170.65(C-1)

¹³C-NMR of Activated-L-ascorbic acid (75MHz, d6-DMSO) δ 64.91(C-2'), 67.05(C-3'), 67.43(C-6), 73.73(C-5), 74.38(C-1'), 75.48(C-4), 77.45(C-2''), 108.93(C-3''), 120.22(C-2), 134.68(C-4''), 153.09(C-3), 170.52(C-1), 175.04(C-1'').

실시예 6. 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 확인

아스코르빈산 펩타이드 유도체는 HPLC로 순도를 확인한 뒤에 LC-Mass를 통해 원하는 생성물임을 확인하였다. HPLC로 분석한 결과 이 물질은 하나의 물질임을 확인할 수 있고, LC-Mass로 질량 분석 결과 아스코르빈산 펩타이드 유도체임을 확인하였다. 아래의 그림에 결과가 원래의 분자량보다 2가 많은 것은 양이온화 된 상태이기 때문이다.

(HPLC 분석 결과)

(LC-Mass 분석 결과)

실시예 7. 본 발명의 아스코르빈산 폴리펩타이드 유도체의 미백 활성 테스트

포스페이트 완충용액(pH 6.8, 0.1M)에 타이로시나제와 타이로신을 넣은 것과 실시예 3에서 얻은 물질을 첨가한 것을 37℃에서 10분 간 반응시킨 뒤, 얼음 중탕으로 옮겨서 반응을 중단시킨다. 그 다음 475nm에서 흡광도를 각각 측정하고 하기의 식에 의해 타이로시나제의 활성 저해도를 측정한다.

% 활성 저해도 = (A-B)/A ×100

상기의 식에서 A는 실시예 3의 물질을 넣지 않은 것의 흡광도이고, B는 넣은것의 흡광도이다. 이 식에 의해 도입한 펩타이드의 종류에 따라 각각의 타이로시나제 활성 저해 정도를 비교하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 이때 아무런 개질도 하지 않은 아스코르빈산의 경우에 약 675μmol의 농도에서 50%의 활성 저해도를 보이므로, 반응액에서의 미백 물질의 농도는 500μmol로 하였다.

[표 1]

상기의 표에서 보면 타이로신을 포함하고 있는 펩타이드를 기존의 미백제인 아스코르빈산에 도입하였을 때 효소의 활성 저해도의 상승이 있었다. 또한 페닐알라닌을 비롯한 몇몇 다른 아미노산들도 본래의 아스코르빈산보다 향상되거나 혹은 비슷한 정도의 효소 활성 저해도를 보였다.

실시예 8. 제조한 미백제의 안정성 테스트

제조한 미백제와 기존의 미백제인 아스코르빈산을 상온의 대기 중에서 한 달 동안 보관하면서 실시예 6과 같은 머쉬룸 타이로시네이즈 억제 분석을 통한 미백활성 테스트를 실시하였다. 도 3의 그래프를 보면 제조한 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 안정성에 확연히 차이가 있음을 알 수 있다. 도 3의 그래프에 따르면, 펩 타이드가 도입되지 않은 종래의 미백제인 아스코르빈산은 물에 용해된 채 50℃의 고온에 저장되어 있을 때 효소 활성 저해도가 계속적으로 감소하지만, 펩타이드가 도입된 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 효소 활성 저해도는 약 한 달이 지난 뒤에도 유지됨을 알 수 있었다. 이와 같이, 본 발명에 따르면 종래 기술의 미백제인 아스코르빈산에 생체 친화적인 펩타이드를 도입함으로써 효소 활성 저해도를 향상시킴과 동시에 안정성까지 부여할 수 있었다.

실시예 9. 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 셀 내에서의 멜라닌 합성 억제 효능 테스트

본 발명의 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 생체 내에서의 멜라닌 합성 억제 효능을 테스트하기 위하여 두 종류의 세포 시스템을 이용하여 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 세포 내에서 멜라닌 색소 생성 억제 효능을 테스트하였다.

[표 2]

구분	Sample	농도 (μM)	억제율 (%)
			타이로시나세 효소 저해율	멜라닌 합성 억제 효능
			타이로시나세 효소 저해율	B16 Cells	Mel-Ab Cells
양성대조군	ASA	100	-9.2	27.1	-0.4
아스코르빈산- 펩타이드 유도체	ASA-FWA-OH	10	11.4	9.7	5.9
	ASA-FWA-OH	10	14.4	27.8	7.9
	ASA-FWA-NH₂	10	16.4	58.5	8.4
	ASA-FWA-NH₂	100	8.0	66.6	-5.2

*(주) ASA: 아스코르빈산, F: 페닐알라닌, W: 트립토판, Y: 타이로신

이때, 아스코르빈산 펩타이드 유도체의 C-말단이 카복실기인 경우와 아마이드인 경우를 합성하여 비교 테스트하였다. 아스코르빈산-페닐알라닌-트립토판-타이로신 (ASA-FWY-OH)의 경우 아스코르빈산에 비해 타이로시나제 효소저해율과 Mel-Ab 세포를 이용한 멜라닌 생성 억제 효능 테스트에서 향상된 효과를 보였고, 아스코르빈산-페닐알라닌-트립토판-타이로신-아마이드(ASA-FWY-NH₂)의 경우 타이로시나제 효소저해율과 B16 세포를 이용한 멜라닌 합성 억제 테스트에서 증가된 효능을 보였다. 특히 말단이 아마이드인 아스코르빈산-페닐알라닌-트립토판-타이로신-아마이드(ASA-FWY-NH₂)의 경우 저 농도에서도 아스코르빈산에 비해 타이로시나제 효소 저해율과 두 개의 세포를 이용한 시스템에서 모두 뚜렷하게 증진된 미백효과를 가지고 있음을 확인하였다.

도 1은 아스코르빈산에 펩타이드의 아민 말단을 결합시키기 위해 활성화시키는 과정을 나타내는 반응 개략도이다.

도 2는 고체상 합성법을 이용하여 펩타이드를 링크 아마이드 레진 (Rinkamide-resin) 위에서 합성하고, 활성화된 아스코르빈산과 결합시키는 과정을 나타내는 반응 개략도이다.

도 3는 종래 기술에 따른 아스코르빈산 미백제의 안정성과 본 발명의 아스코르빈산 유도체 미백제의 안정성을 비교한 그래프이다.

Claims

하기 화학식 (I)의 펩타이드 결합 아스코르빈산 유도체:

화학식 (I)

상기 식에서,
는 아미노산 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드; R¹은 아미노산 잔기의 곁가지; R²는 NH₂ 또는 OH; 그리고 n은 2 내지 5인 정수이다.
제1항에 있어서, 상기 R¹이 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기의 곁가지를 포함하는 것임을 특징으로 하는, 아스코르빈산 유도체.
제1항에 있어서, 상기 R¹이 페닐알라닌, 트립토판, 타이로신, 라이신 및 아스파라긴산으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 잔기의 곁가지를 포함하는 것임을 특징으로 하는, 아스코르빈산 유도체.
제1항에 있어서, 상기 R¹이 타이로신 아미노산 잔기의 곁가지를 포함하는 것임을 특징으로 하는, 아스코르빈산 유도체.
3번 위치 히드록시기가 활성화된 아스코르빈산과 2 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (Ⅰ)의 아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법:

화학식 (I)

상기 식에서,
는 아미노산 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드; R¹은 아미노산 잔기의 곁가지; R²는 NH₂ 또는 OH; 그리고 n은 2 내지 5인 정수이다.
5번 및 6번 위치의 히드록시가 보호되어 있고, 3번 위치의 히드록시기가 활성화된 아스코르빈산과 2 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 (Ⅰ)의 아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법:

화학식 (I)

상기 식에서,
는 아미노산 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드; R¹은 아미노산 잔기의 곁가지; R²는 NH₂ 또는 OH; 그리고 n은 2 내지 5인 정수이다.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 3번 위치의 히드록시가 카보닐 디이미다졸를 도입하여 활성화된 것임을 특징으로 하는, 아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 링크 아마이드 레진 상에서 합성된 펩타이드인 것임을 특징으로 하는, R²가 NH₂인아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 펩타이드는 2-트리틸클로라이드 레진 상에서 합성된 펩타이드인 것임을 특징으로 하는, R²가 OH인 아스코르빈산 펩타이드 유도체 제조 방법.
하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물을 포함하는 피부 미백제:

화학식 (I)

상기 식에서,
는 아미노산 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드; R¹은 아미노산 잔기의 곁가지; R²는 NH₂ 또는 OH; 그리고 n은 2 내지 5인 정수이다.
하기 화학식 (Ⅰ)의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 화장품 기제를 포함하는 피부 미백 화장품 조성물:

화학식 (I)

상기 식에서,
는 아미노산 중에서 선택되는 동일하거나 상이한 아미노산 잔기가 아미드 결합된 펩타이드; R¹은 아미노산 잔기의 곁가지; R²는 NH₂ 또는 OH; 그리고 n은 2 내지 5인 정수이다.
제11항에 있어서, 상기 조성물이 화장수, 유액, 크림, 팩 및 미용액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것임을 특징으로 하는 피부 미백 화장품 조성물.