KR20210097729A - 피부 병태를 개선하기 위한 폴리펩타이드 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 UV 노출과 연관된 피부 병태 및 피부 노화를 포함한 피부 병태를 예방 및/또는 치료하기 위한 폴리펩타이드, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

피부 병태를 개선하기 위한 폴리펩타이드 및 방법

본 개시내용은 UV 노출과 연관된 피부 병태 및 피부 노화를 포함한 피부 병태를 예방 및/또는 치료하기 위한 폴리펩타이드, 조성물 및 방법에 관한 것이다.

피부 노화, 피부 손상 및 피부 상처 치유의 세포 및 분자 메커니즘은 완전히 이해되지 않는다.

피부 노화는 탄력 상실, 건조함, 주름 및 색소침착과 연관된다. 피부에의 자외선(UV) 조사, 구체적으로 파장이 290 내지 320㎚인 UVB에의 노출은 조기 피부 노화 및 피부암의 유도를 포함하는 만성적인 피부 손상을 유발하는 것으로 알려져 있다. 피부암은 호주 보건 시스템이 매년 7억 달러 초과의 비용을 소요하게 하며, 2018년에 진단된 새로운 피부암 사례의 추정 수는 138,000건을 넘는다.

UVB 조사는 UVB-매개 종양 촉진에서 기능적 역할을 하는 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 상향 조절과 함께 COX-2의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 더욱이, 사이클릭 AMP 반응 요소 결합 단백질(cyclic AMP response element binding protein: CREB)은 UVB 처리시 인산화되고 활성화되며 UVB-유도 COX-2 발현을 담당한다.

광-손상된 DNA의 복구는 손상된 DNA에 대한 복구 효소의 접근을 가능하게 하기 위해 조밀한 염색질 구조를 풀고 리모델링하는 데 다량의 세포 에너지를 필요로 한다. 세포 내의 주요 에너지원은 아데노신 트라이포스페이트(ATP)이다. UV-복사에 피부가 노출되면 피부가 에너지 스트레스 상태에 놓이게 되고, 부분적으로 미토콘드리아 기능을 저해하는 산화 손상으로 인해 ATP의 생성이 감소한다. ATP 가용성의 감소는 또한 면역계의 효능을 감소시켜, UV 유도 면역억제로 이어진다. UV 노출 후 이러한 에너지-부족 상태에서는, 항원 노출에 의해 활성화되는 이펙터 및 기억 T 세포의 수가 적다. UVB의 면역-억제 효과는 수십년 동안 인식되어 왔다.

자외선 노출, 주로 UVB 노출은 또한 반응성 산소종(ROS)의 증가를 야기하며, 상기 반응성 산소종은 결국 세포 및 세포외 성분, 예컨대, DNA를 손상시킨다. UV 광자의 흡수는 세포 감광제, 예컨대, 포르피린, 빌리루빈, 멜라민, 및 프테린으로부터 산소 분자로 전자 및 에너지 전달을 유도하여 라디칼 단일항 O₂ 음이온을 생성한다. 결과적으로, 단일항 산소 음이온은 DNA의 구아닌 모이어티 산화, 그 다음 구조적 재배열과 8-하이드록시-2-데옥시구아노신 모이어티(8-OHdG)의 형성을 유도한다. 8-OHdG는 가장 중요한 DNA 부가물 중 하나이며, 세포 노화 및 발암현상과 연관된 산화 DNA 손상의 지표로서 사용된다.

또한 UV-조사는 DNA가 UVB 방사선으로부터 광자를 흡수할 때 DNA에 직접적으로 영향을 미친다. 이는 이후에 DNA 가닥에 결함을 일으키는 뉴클레오타이드의 구조적 재배열을 초래한다. 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD) 및 피리미딘 (6-4) 피리미돈(6-4 광생성물, 6-4 PP)은 UVB-유도 DNA 손상의 주요 생성물이다. 더욱이, CPD 형태의 UVB-유도 DNA 손상은 세포(예컨대, 표피 세포)에서 돌연변이를 유도하여 암의 발생을 야기할 수 있다. DNA 복구 효소의 적용을 통한 CPD의 감소는 UV-유도 피부암 및 아포토시스성 일광화상 세포의 위험을 방지한다.

인간 피부 조직 복구는 일반적으로 상처 치유로 알려져 있으며, 이는 피부(또는 또 다른 기관-조직)가 손상 후 스스로 복구하는 복잡한 과정이다. 정상 피부에서는, 표피(최외각층) 및 진피(내부 또는 심부층)는 정상-상태의 평형 상태로 존재하여, 외부 환경에 대한 보호 장벽을 형성한다. 보호 장벽이 부서지거나 손상되면, 상처 치유 과정이 즉시 실행되고, 중첩될 수 있으며 상호 배타적이지 않은 3 또는 4개의 순차적인 단계로 나뉠 수 있으며, 상기 단계는 지혈, 염증, 증식 및 리모델링이다.

이들 단계 내에서, 성장 인자는 세포 증식을 유발하여, 가용성 매개체, 혈액 세포, 세포외 기질의 생성, 및 실질 세포의 증식을 포함하는 동적 변화의 통합을 야기한다.

문제가 있는 환자에서는 종종 3개월의 기간 이내에 해부학적 및 기능적 완전성을 생성하기 위한 시기적절한 복구 과정을 통해 진행되지 못한 치유되지 않는 만성 상처가 생긴다. 이와 같은 상처는 이환된 환자에 대한 삶의 질의 현저한 감소와 함께 헬스케어 시스템에 상당한 경제적 부담을 준다. USA에서의 비용은 UK 보고서에 따르면 대략 200억 US 달러인 것으로 추산되며, 이는 만성 상처의 치료 및 관리는 선진국의 전체 헬스케어 비용의 3%를 차지함을 제시한다.

따라서 조직 복구 및 특히 인간 상처 치유를 도울 수 있는 작용제가 필요하다.

미용 목적을 위한 국소 치료는 특히 피부 ECM을 손상시키는 항산화 활성 또는 프로테아제 저해와 같은 미용 기능을 가지는 폴리펩타이드 서열을 이용하여, 지난 20년 동안 급성장하는 분야가 되었다. 개발된 수많은 스킨케어 제품 중, 많은 제품은 단순히 인간 피부의 외관을 개선하고 노화의 징후 및 증상을 치료하기 위한 것이다. 다른 관련 제품은 UV-방사선을 차단하는 스크린을 제공함으로써 피부를 보호하는 역할을 한다.

피부 광노화, 피부 손상을 포함하는 다양한 피부 병태를 치료 및/또는 예방할 수 있고 상처 치유를 촉진시키는 국소 조성물에 대한 요구가 여전히 존재한다.

본 발명자들은 폴리아르기닌 서열 영역(예를 들어, 이의 N-말단)에 인접할 때, 서열 RSKAKNPLYR을 포함하는 폴리펩타이드, 및 상기 폴리펩타이드의 상응하는 덱스트로-리버소(dextro-reverso) 형태(즉, rylpnkaksr)가 다양한 피부 병태를 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역에 인접한, 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(즉, rylpnkaksr - 서열번호 2)를 포함하는 단리 또는 정제된 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 단리 또는 정제된다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1)의 C-말단이거나 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(즉, rylpnkaksr - 서열번호 2)의 N-말단이다.

폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 임의의 적합한 길이일 수 있다. 그러나, 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 2 내지 20개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 영역은 4 내지 20개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 15개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 12개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 10개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 9개의 아르기닌 영역으로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 6 내지 8개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 7 또는 8개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 8개의 아르기닌 잔기로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아르기닌 잔기를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 8개의 아르기닌 잔기를 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드의 C-말단의 변형은 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 변화시킬 수 있고, 전형적으로 번역후 변형을 겪는 천연 폴리펩타이드를 보다 정확하게 반영할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 C-말단에서 변형되고, 바람직하게는 C-말단에서 아마이드화된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태는 C-말단에서 아마이드화된다(즉, rylpnkaksr-NH₂). 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 C-말단에서 아마이드화된다.

아미노산은 카복실기에 인접한 알파 탄소에서 키랄이고, 이에 따라 L- 및 D-이성질체로 존재한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 L 아미노산을 포함한다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 D 아미노산을 포함한다.

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩타이드가 상처 치유를 촉진시키는 것을 포함하여 생물학적 활성을 가지는 것을 확인하였다. 예를 들어, 실시예 1은 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3- RSKAKNPLYRRRRRRRRR) 및 덱스트로-리버소 서열 IK236770(서열번호 4 - rrrrrrrrrylpnkaksr)이 비치료 대조군과 비교하여 국소적으로 적용될 때 상처 치유를 촉진시킴을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 상처 치유를 촉진시키기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 상처 치유를 촉진시키기 위한 폴리펩타이드는 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 일부 실시형태에서, 상처 치유를 촉진시키기 위한 폴리펩타이드는 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)을 포함한다(또는 이로 이루어진다).

상기 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩타이드가 피부 병태를 치료 및/또는 예방할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 폴리펩타이드는 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)을 포함한다(또는 이로 이루어진다). 일부 실시형태에서, 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 폴리펩타이드는 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)을 포함한다(또는 이로 이루어진다).

일부 실시형태에서, 피부 병태는, 피부 노화; 산화 손상; 일광 노출에 의해 유도된 손상; 자외 방사선 유도 손상; UVB 유도 손상; 및/또는 DNA 손상 중 임의의 하나 이상이다.

일부 실시형태에서, 상기 피부 병태 중 하나 이상은 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하고, 바람직하게는 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하는 DNA 손상 또는 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하는 자외선 유도 손상이다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 대상체의 세포 또는 피부에서, CREB 인산화; 8-OHdG 형성; 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD) 형성; 기질 금속단백질분해효소 1(MMP1) 활성; 세포 또는 세포외 성분의 산화 손상; 및/또는 DNA 손상 중 임의의 하나 이상을 저해한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 대상체의 세포 또는 피부에서, 아데노신 트라이포스페이트(ATP) 수준; 및/또는 자외 방사선 손상 복구 중 임의의 하나 이상을 증가시킨다.

본 발명의 폴리펩타이드는 조성물로서 제형화될 때 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 및 국소적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 국소적으로 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 및 국소적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 국소 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 바람직하게는 상처 치유를 촉진시키고/시키거나 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 추가 활성제를 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 화장용으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 화장용으로 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 화장용으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 추가적으로, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 지질 및/또는 하나 이상의 추가 활성제를 추가로 포함한다. 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드는 항산화 활성을 가지는 것으로 확인되었으며, 따라서 일부 실시형태에서, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드는 하나 이상의 지질 및/또는 하나 이상의 추가 활성제를 산화 손상으로부터 보호한다.

또한 국소 조성물, 화장료 조성물, 및/또는 약제학적 조성물의 제조에 있어서 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드의 용도가 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물의 유효량을 포유동물, 상처, 또는 피부 병태 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 대상체(예컨대, 포유동물)에서 상처 치유를 촉진시키거나 피부 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 폴리펩타이드 또는 조성물은 대상체의 피부에 투여된다. 본 방법의 일부 실시형태에서, 본 발명은 피부 노화, 산화 손상; 일광 노출에 의해 유도된 손상; 자외 방사선 유도 손상; UVB 유도 손상; UVA 유도 손상; 및/또는 DNA 손상 중 하나 이상일 수 있다.

방법의 일부 실시형태에서, 상기 피부 병태 중 하나 이상은 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하고, 특히 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하는 DNA 손상 또는 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하는 자외선 유도 손상이다.

본 발명은 또한 대상체의 세포 또는 피부를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 치료하는 단계를 포함하는, 대상체의 세포 또는 피부에서 기질 금속단백질분해효소 1(MMP1) 활성을 저해하는 방법을 제공한다.

세포에서 CREB 인산화를 저해하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 치료하는 단계를 포함한다. 추가적으로, 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 세포에서 8-OHdG 형성을 저해하는 방법이 제공된다. 세포에서 CPD 형성을 저해하는 방법이 추가로 제공되며, 상기 방법은 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 치료하는 단계를 포함한다.

특정 실시형태는 다음 도면에 의해 예시된다. 다음 설명은 단지 특정 실시형태를 기재하기 위한 목적이며, 설명과 관련하여 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해하여야 한다.
도 1은 상처 치유에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3 - RSKAKNPLYRRRRRRRRR)의 효과를 나타내는 도면.
도 2는 상처 치유에 대한 폴리펩타이드 IK236770(서열번호 4 - rrrrrrrrrylpnkaksr)의 효과를 나타내는 도면.
도 3a는 사이클릭-AMP-반응 요소-결합 단백질(CREB)의 UV-조사 유도 인산화의 방지에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면이고, 도 3b는 TGFβ 수용체 II(TGFβRII)의 UV-유도 억제의 복원에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 4는 태양광 모의 UV-조사에 노출된 일차 각질형성세포에서 ATP 수준에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 5는 피부에서 UV-유도 산화 스트레스의 저해에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하는 면역조직학.
도 6은 피부에서 UV-유도 산화 스트레스의 저해에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 7은 시험관내에서 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD)의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하는 면역조직학.
도 8은 시험관내 CPD의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 9는 생체내 CPD의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하는 면역조직학.
도 10은 뮤린 모델에서 생체내 CPD의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 11은 UV-조사 후 세포 아포토시스에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하는 도면.
도 12는 인간 피부 외식편에서 CPD의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하는 면역조직학.
도 13은 인간 외식편에서 CPD의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 14는 UV-조사 3시간 후 인간 피부 외식편에서 아포토시스성 세포의 수에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하는 도면.
도 15는 UV-조사 24시간 후 인간 피부 외식편에서 아포토시스성 세포의 수에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하는 도면.
도 16은 MMP-1 활성에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 17은 UV-조사 3시간 후 인간 피부 외식편에서 MMP-1 양성 세포의 백분율에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 18은 UV-조사 3시간 후 인간 피부 외식편에서 MMP-1 양성 세포의 백분율에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 19는 일차 섬유아세포 용해물에서 티올 산화환원 상태(TRS)에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.
도 20은 세포의 멜라닌 함량에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 나타내는 도면.

본 명세서에서 언급되는 뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 서열 식별자 번호(서열번호)에 의해 표시된다. 서열 식별자의 요약은 표 1에 제공되어 있다. 서열 목록은 또한 본 명세서의 일부로 제공된다.

서열 목록표
서열 ID 번호(서열번호)	길이	서열
서열번호 1	10	RSKAKNPLYR
서열번호 2	10	rylpnkaksr
서열번호 3	18	RSKAKNPLYRRRRRRRRR
서열번호 4	18	rrrrrrrrrylpnkaksr

하기에서 보다 상세히 기재할 바와 같이, 본 발명자들은 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(즉, rylpnkaksr - 서열번호 2), 및 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역을 포함하는 폴리펩타이드가 상처 치유의 촉진, 노화의 치료 또는 예방과 같은 다양한 피부 병태를 치료할 수 있고, 또한 UV-유도 피부 변화 및 세포 손상의 효과를 치료 및/또는 예방할 수 있음을 입증하였다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IK34720", "IK" 또는 "IK-3"은 서열번호 3(RSKAKNPLYRRRRRRRRR)을 지칭하는 데 호환 가능하게 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "IK236770"은 서열번호 4(rrrrrrrrrylpnkaksr)를 지칭하는 데 호환 가능하게 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "피부"는 적어도 표피 및 진피를 지칭한다. 이에 따라, 피부 병태, 피부 손상 또는 피부 상처와 관련하여 사용될 때, 상기 용어는 표피 및 진피 이외에 추가적인 조직(예컨대, 피하 조직)을 포함하는 병태, 손상 또는 상처를 배제하지 않는 것으로 해석되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "폴리펩타이드"는, 전형적으로 아마이드 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체로 구성된 분자를 지칭한다. 상기 용어는 폴리펩타이드의 '전구 약물', 폴리펩타이드의 하전된 형태 및 비하전된 형태, 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용 가능한 염, 및 폴리펩타이드의 백본 및/또는 말단에 대한 변형을 포함하여 폴리펩타이드에 대한 임의의 다른 변이체, 유도체 또는 변형을 포함하며, 이들은 본 개시내용의 방법 및 용도에서 기능적 활성을 유지한다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 폴리펩타이드는 분자를 형성할 수 있는 아미노산 수의 최대 길이를 암시적으로 명시하는 것으로 해석되어서는 안된다. 그러나, 일부 실시형태에서, 명시될 때, 폴리펩타이드의 최대 길이는 50개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 최대 길이는 45개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드의 최대 길이는 40개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 최대 길이는 35개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 최대 길이는 30개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 최대 길이는 25개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 최대 길이는 20개 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 최대 길이는 18개 아미노산이다.

일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 단리 또는 정제된 폴리펩타이드이다.

천연 또는 재조합 기법에 의해 생성된 폴리펩타이드의 "단리" 및 "정제" 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[C-H Lee, A Simple Outline of Methods for Protein Isolation and Purification, Endocrinology and Metabolism; 2017, March; 32(1): 18]에 있다. 또한, 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 합성된 그리고 다른 인공적으로 생성된 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드를 합성하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드는 하나의 아미노산의 카복실기와 또 다른 아미노산의 아미노기의 축합 반응에 의해 화학적으로 합성된다. 폴리펩타이드의 화학적 합성은 용액상 기법 또는 고체상 기법을 사용하여 수행될 수 있다. 합성 기법은 비천연 아미노산 폴리펩타이드, 백본 변형 및 D-이성질체의 합성을 포함하는 폴리펩타이드의 생성을 가능하게 할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 폴리아르기닌은 인접한 아르기닌 아미노산의 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 2 내지 20개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 4 내지 20개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 15개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 12개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 10개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 5 내지 9개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 6 내지 8개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 7 또는 8개의 아르기닌 잔기로 이루어진다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 8개의 아르기닌 잔기로 이루어진다.

본 명세서에 기재된 단리 또는 정제된 폴리펩타이드의 일 양태에서, 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태 rylpnkaksr(서열번호 2)은 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역에 인접해 있다.

본 명세서에 기재된 단리 또는 정제된 폴리펩타이드의 또 다른 양태에서, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드는 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(rylpnkaksr; 서열번호 2)와, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역 사이에 링커 영역을 추가로 포함한다. 폴리펩타이드 링커와 같은 링커는 해당 분야에 알려져 있다.

일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(즉, rylpnkaksr - 서열번호 2)의 N-말단 및/또는 C-말단이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 RSKAKNPLYR(서열번호 1)의 C-말단이다. 일부 실시형태에서, 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 rylpnkaksr(서열번호 2)의 N-말단이다.

일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 아미노산 서열 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)로 이루어진다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형된다. 일부 실시형태에서, 변형은 폴리펩타이드의 약리학적 특성을 변경하는 변형일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 본 발명의 조성물 또는 폴리펩타이드의 반감기를 증가시킨다. 일부 실시형태에서, 변형은 폴리펩타이드(및/또는 본 발명의 조성물)의 생물활성을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물의 선택성을 증가시키는 변형일 수 있다.

일 실시형태에서, 변형은 보호기의 첨가이다. 보호기는 N-말단 보호기, C-말단 보호기 또는 측쇄 보호기일 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 이들 보호기 중 하나 이상을 가질 수 있다. 당업자는 아미노산을 이들 보호기와 반응시키는 적합한 기법을 알고 있다. 이들 기는 당업계에 알려진 제조 방법에 의해 첨가될 수 있다. 이들 기는 폴리펩타이드 상에 남아 있을 수 있거나 사용 또는 투여 전에 제거될 수 있다. 보호기는 합성 중에 첨가될 수 있다.

일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 C-말단에서 아마이드화된다. 아마이드화는 순차적 내부단백질가수분해(endoproteolysis) 및 외부단백질가수분해(exoproteolysis)에 의한 글리신-확장 기질의 N-산화 절단 과정을 지칭한다. 시험관내에서 아마이드화 폴리펩타이드를 생성하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대, 효소에 의한 아마이드화; 재조합으로 생성된 폴리펩타이드 및 단백질의 C-말단의 화학적 변형; 고체상 폴리펩타이드 합성에서 아마이드 수지의 사용; 암모니아의 존재 하에 카복시펩티다제의 사용; 및 폴리펩타이드의 C-말단의 메틸 에스터로의 전환 및 저온에서 암모니아의 첨가가 있다. 적합한 기법의 개시내용의 예는 문헌[DJ Merkler, C-terminal amidated polypeptides : production by the in vitro enzymatic amidation of glycine -extended polypeptides and the importance of the amide to bioactivity; Enzyme Microbial technology, 1994, June; 16(6): 450-6 및

and M-R Kula C-Terminal polypeptides Amidation Catalyzed by Orange Flavedo polypeptides Amidase; Angewandte Chemie, 1998, August; 37(13-14): 1885]을 포함한다.

C-말단의 아마이드화는 C-말단 단부가 하전되지 않게 하여, 변형된 폴리펩타이드가 천연 단백질을 더 가깝게 모방하게 한다. 이는 세포에 들어가는 폴리펩타이드 능력의 향상; 생체내 폴리펩타이드의 대사 안정성의 개선; 아미노펩티다제, 엑소펩티다제, 및 합성효소에 의한 폴리펩타이드의 생체내 효소에 의한 분해의 감소; 및 폴리펩타이드의 보관 수명의 개선을 포함하는 일련의 이점을 가질 수 있다.

당업계에 알려진 바와 같이, 알파 아미노산은 알파 위치에 키랄 탄소를 포함한다. 결과적으로, 글리신을 제외한 모든 알파 아미노산은 L- 또는 D-이성질체인 2개의 거울상이성질체 중 하나로 존재할 수 있다. 일반적으로, L-아미노산만 포유동물 세포에서 제조되어 단백질에 통합된다. D-아미노산은 인공적으로 합성될 수 있거나 박테리아 단백질에서 발견될 수 있다. L 및 D 관례는 아미노산의 입체화학을 직접적으로 지칭하는 데 사용되지 않지만, 아미노산이 합성될 수 있는 글리세르알데하이드의 이성질체의 광학적 활성을 지칭하는 데 사용된다(D-글리세르알데하이드는 우회전성이고; L-글리세르알데하이드는 좌회전성임).

일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 L-아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 L-아미노산만 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 D-아미노산을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 D-아미노산만 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 L-아미노산 및 D-아미노산을 포함한다.

조성물

폴리펩타이드의 적용을 용이하게 하기 위해, 폴리펩타이드는 조성물로 제형화될 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 조성물은 폴리펩타이드와 함께 성분의 임의의 혼합물을 포함한다. 일부 형태에서, 조성물은 폴리펩타이드를 안정화하고/하거나 폴리펩타이드를 보호하고/하거나 폴리펩타이드의 적용을 개선시키도록 구성된다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드는 조성물의 또 다른 성분을 안정화하고/하거나 조성물의 또 다른 성분을 보호하고/하거나, 조성물의 또 다른 성분의 적용을 개선시키는 것을 도울 수 있다.

많은 조성물은 생물학적 성분, 예컨대, 지질, 효소, 단백질, 폴리펩타이드, 엘라스틴, 콜라겐 및 피브린을 포함한다. 또한, 조성물은 일반적으로 수성 용매를 포함한다. 물의 존재 하에 생물학적 성분은 전형적으로 물의 가수분해 활성의 결과로 시간 경과에 따라 산화될 것이다. 이는 생물학적 성분의 분해로 이어지고 조성물 내에서 이들 성분의 기능을 감소시킨다. 따라서, 조성물에 이들 생물학적 성분, 예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드의 산화를 감소시킬 수 있는 추가적인 성분을 포함하는 것이 유리할 수 있다.

문제는 특히 스킨케어 조성물에서 가장 일반적으로 사용되는 수중유 담체에서 악화된다. 이러한 조성물의 물-오일 경계면에서 산소의 상당한 확산이 있어, 생물학적으로 활성인 성분, 특히 유상 중에 캡슐화된 민감한 화합물의 심각한 분해를 초래할 수 있다.

따라서, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 생물학적, 또는 산화가능 성분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 생물학적 또는 산화가능 성분은 지질, 효소, 단백질, 폴리펩타이드, 엘라스틴, 콜라겐 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 지질 또는 하나 이상의 추가 활성 화합물을 포함한다. 조성물의 일부 실시형태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드는 하나 이상의 지질 및/또는 하나 이상의 추가 활성 작용제, 또는 성분을 산화 손상으로부터 보호한다.

조성물은 임의의 적합한 조성물일 수 있으며, 당업자에 의해 특정 용도에 맞게 조정될 것이다. 예를 들어, 조성물은 시험관내 실험 또는 생체내 투여에 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 일부 바람직한 실시형태에서, 조성물은 국소 조성물이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적 조성물, 바람직하게는 국소 약제학적 조성물이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 화장료 조성물, 바람직하게는 국소 화장료 조성물이다.

국소 조성물

중요한 것은, 본 발명자들이 폴리펩타이드가 국소적으로 적용될 때 활성적임을 입증하였다는 것이다. 예를 들어, 본 발명자들은 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드가 생체내 또는 생체외에서 피부에 국소적으로 적용될 때 상처 치유를 촉진시키고, 피부 손상을 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 국소적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 또는 부형제를 포함하는 국소적으로 사용하기 위한 조성물, 또는 국소 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 국소적으로 사용하기 위한 조성물, 또는 국소 조성물의 제조에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도를 제공한다. 바람직하게는 국소적으로 사용하기 위한 조성물은 피부 병태, 예컨대, 본 명세서에 기재된 병태를 치료하는 데 사용된다.

용어 "국소 조성물" 또는 "국소적으로 사용하기 위한 조성물"은, 주로 각질 조직, 주로 피부에 적용되는, 국소 투여용으로 제형화된 조성물을 말하지만, 모발 및 손발톱을 포함할 수 있다. 국소는 일반적으로 피부로의 전달과 관련되지만, 또한 상피 세포로 막이 형성된 내강 공간, 예를 들어 점막 조직, 예컨대, 입술, 입 등에의 전달을 의미할 수 있다.

국소 전달용 제형은 문헌[D Osborne and A Aman (eds),1990, Topical drug delivery formulations, CRC press Taylor & Francis 및 D Bhowmik et al. (2012) Recent Advances In Novel Topical Drug Delivery System, the Pharma innovation, 1:9, 12-31]에 기재되어 있다. 치료용으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 제약 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[Tarun Garg, Goutam Rath & Amit K. Goyal (2015) Comprehensive review on additives of topical dosage forms for drug delivery, Drug Delivery, 22:8, 969-987]에 기재되어 있다.

국소 투여에 적합한 형태는 액체, 연고, 크림, 겔, 하이드로겔, 포마드, 도찰제, 로션, 에멀젼, 스프레이, 에어로졸, 점적액 또는 분말을 포함한다. 연고 및 크림은, 예를 들어 적합한 증점제 및/또는 겔화제를 첨가하여 수성 또는 유성 기제와 함께 제형화될 수 있다. 로션은 수성 또는 유성 기제와 함께 제형화될 수 있으며 일반적으로 또한 하나 이상의 유화제, 안정화제, 분산제, 현탁화제, 증점제 또는 착색제를 포함할 것이다.

점적액 또는 액체 스프레이는, 또한 분산제, 가용화제 또는 현탁화제 중 하나 이상을 포함하는 수성, 또는 비수성 기제 중 본 발명의 폴리펩타이드와 함께 제형화될 수 있다. 점적액은 간단한 뚜껑이 있는 점안기 병을 통해, 액체 내용물을 한방울씩 전달하도록 개조된 플라스틱 병을 통해, 또는 특수 모양의 마개를 통해 전달될 수 있다. 액체 스프레이는 펌핑되거나 가압된 에어로졸로부터 편리하게 전달될 수 있으며 조작가능한 튜브와 같은 표적 스프레이 개구부를 통해 전달될 수 있거나 균일한 영역에 액체를 퍼뜨리는 스프레이 구멍을 통해 전달될 수 있다. 또한, 폴리펩타이드의 가용화된 형태는 흡수성 매체에 포함될 수 있으며, 이는 이후 피부 상에 놓이거나 피부를 문지를 수 있다(예를 들어, 가용화된 폴리펩타이드를 포함하는 직물 티슈(wipe)).

본 발명의 일부 형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 피부 투여용 패치, 플라스터, 습포제 또는 붕대를 통해 전달될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 접착성 중합체, 예컨대, 폴리아크릴레이트 또는 아크릴레이트/비닐 아세테이트 공중합체의 일부가 되도록 제형화될 수 있다.

국소 조성물은 선택적으로 물, 오일, 염, 향기, 향료, 착색제, 안정화제, 유화제, 추진제, 첨가제, 방부제 또는 보존제, 항산화제, 계면활성제, 증점제 및 국소 조성물에서 보통 사용되는 다른 부형제를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 국소적으로 사용하기 위한 조성물 또는 국소 조성물은 상처 치유를 촉진시키거나, 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 추가 활성제를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "치료" 및 관련 용어는 사실상 치료적인 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 예를 들어, 효과는 대상체의 상태를 개선시키거나, 대상체에서 하나 이상의 증상의 진행을 개선, 완화 및/또는 늦추거나, 대상체의 부분적 또는 완전한 안정화, 또는 대상체의 치료의 관점에서 치료적일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "예방" 및 관련 용어는 사실상 예방적인 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 예를 들어, 효과는 대상체에서 질환, 병태, 상태 또는 증상의 완전한 또는 부분적 예방, 또는 대상체에서 증상 또는 병리의 진행 또는 발생의 완전한 또는 부분적 예방일 수 있다.

본 발명에 따른 국소 조성물은 화장료 조성물(또는 오로지 화장용으로 사용하는 것으로 의도된 조성물), 및 약제학적 조성물(또는 특히 질환, 질병 또는 병태의 예방 또는 치료에 사용되도록 의도된 조성물)로 나뉠 수 있다.

화장료 조성물

본 명세서에서 사용될 때 용어 "화장료 조성물"은 미용 목적, 개인 관리 및/또는 위생 목적으로 사용될 수 있는 조성물을 지칭한다. 조성물은 하나 초과의 미용 목적을 가질 수 있고 동시에 이들 목적 중 하나 초과에 사용될 수 있음이 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 "화장료 조성물"은 보습 크림, 페이셜 및 바디 파우더 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 화장료 조성물은 매니큐어, 콤팩트, 고형물, 연필, 립스틱, 마스카라, 루즈, 파운데이션, 블러쉬, 아이라이너 등을 포함할 수 있다.

미국 식품 의약국(FDA)은 화장료 조성물을 연방 식품, 의약품, 화장품법(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act; FD&C Act)에 의해 정의된 것으로 간주하며, 상기 법은 "세정하거나, 꾸미거나, 매력을 증진시키거나, 외관을 변경하기 위해 ... 인체에 문지르거나, 붓거나, 뿌리거나, 또는 분사되거나, 인체에 도입되거나, 또는 다르게 적용되는 것으로 의도된 물품"으로서 의도된 용도에 의해 화장료를 정의한다[FD&C Act, sec. 201(i)]. 이 정의에 포함된 제품 중에는 피부 보습제, 향수, 립스틱, 매니큐어, 아이 및 페이셜 메이크업 준비물, 세정 샴푸, 퍼머넌트 웨이브, 모발 착색제 및 데오도란트뿐만 아니라, 화장료 제품의 성분으로서 사용이 의도된 임의의 물질이 있다.

일부 제품은 의도된 용도에 따라 화장료 및 의약품 둘 다로 간주될 수 있다. 이와 같은 상황에서, 용어 "화장료"는 조성물의 약학적 또는 치료적 적용을 배제하는 것으로 간주되어야 한다.

화장료 용도를 위한 허용 가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[AO Barel, M Payne and HI Mailbach (Eds) (2014) Handbook of Cosmetic Science and Technology, 4^th Edition, CRC Press Taylor & Francis Group, USA]에 기재되어 있다.

본 명세서 전반에 걸쳐 "비-치료적", 또는 "미용" 방법 및 조성물에 대한 언급은 달리 청구항(들)에 포함될 수 있는 임의의 잠재적인 치료 방법 또는 적용을 배제하는 것으로 간주되어야 한다. 일부 실시형태에서, "비-치료적" 또는 "미용" 방법에 대한 언급은 인간에 대해 수행되는 치료법에 의한 치료 방법, 또는 인간의 치료적 치료를 위한 조성물의 특정 부인을 허용할 수 있다. 본 출원의 조성물 및 방법은 광노화를 감소시키거나 프로테아제 또는 다른 효소의 분비를 감소시키는 것과 같이 생물학적으로 활성일 수 있지만, 치료적 적응증 또는 연관된 질환 상태가 없으므로 이들은 치료 방법, 또는 치료용 조성물로 간주되지 않아야 함이 이해되어야 한다.

약제학적 조성물

일 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 약학적으로 사용하기 위한 조성물, 또는 약제학적 조성물을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 국소적으로 사용하기 위한 약제, 또는 약제학적 조성물의 제조에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 용도를 제공한다.

미국 식품 의약국(FDA)은 제약을 연방 식품, 의약품, 화장품법(FD&C Act)에 의해, 부분적으로 "질환의 진단, 관리, 완화, 치료 또는 예방에서 사용하는 것으로 의도된 물품" 및 "사람 또는 다른 동물의 신체의 구조 또는 임의의 기능에 영향을 미치는 것으로 의도된 (식품 이외의) 물품"으로서 의도된 용도에 의해 정의된 것으로 간주한다[FD&C Act, sec. 201(g)(1)].

조성물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함한다. 어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 적절한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하여, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 또는 경우에 따라 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭하는 것으로 본 명세서에서 이용된다.

적합한 담체는 실질적으로 불활성인 고체, 반고체 또는 액체 충전제, 희석제, 부형제, 캡슐화 물질 또는 임의 유형의 제형 보조제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예는 생리 식염수 또는 포스페이트-완충 식염수(PBS)이다. 다른 생리학적으로 허용 가능한 담체 및 이의 제형은 당업계에 알려져 있다. 또한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말형 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 활석; 부형제, 예컨대, 코코아 버터 및 좌약 왁스; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유; 홍화유; 참기름; 올리브유; 옥수수유 및 대두유; 글라이콜, 예컨대, 프로필렌 글라이콜; 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 한천; 세제, 예컨대, 트윈(TWEEN) 80; 완충제, 예컨대, 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 무발열원 물; 등장성 식염수; 링거 용액; 에틸 알코올; 및 포스페이트 완충 용액뿐만 아니라, 다른 무독성 호환 윤활제, 예컨대, 소듐 라우릴 설페이트 및 마그네슘 스테아레이트를 포함할 뿐만 아니라, 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미료 및 가향제, 방부제 및 항산화제, 현탁화제(들) 및 가용화제(들)가 또한 존재할 수 있다. 적합한 결합제의 예는 전분, 젤라틴, 천연 당, 예컨대, 글루코스, 무수 락토스, 자유 유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미료, 천연 및 합성 검, 예컨대, 아카시아, 트래거캔스 또는 소듐 알지네이트, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글라이콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 예는 소듐 올레에이트, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 방부제 및/또는 안정화제를 제공한다. 방부제의 예는 소듐 벤조에이트, 솔빈산 및 p-하이드록시벤조산의 에스터를 포함한다. 항산화제 및 현탁화제가 또한 사용될 수 있다.

허용 가능한 담체는 당업계에, 예를 들어 문헌[A. R. Gennaro (ed) 2015, Remington's Pharmaceutical Sciences, 14^th Edition, Mack Publishing Co.]에 추가로 기재되어 있다. 약학적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 제약 실무와 관련하여 선택될 수 있다.

"약제학적 조성물"은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체와 조합한 본 발명의 폴리펩타이드의 혼합물을 지칭한다. 일부 형태에서, 혼합물의 성분은 활성 성분(들)(예컨대, 본 발명의 폴리펩타이드)의 기능이 향상되는 상호작용 관계를 형성한다. 예를 들어, 혼합물은 작용 부위, 예컨대, 표피, 진피 또는 상처와의 접촉을 개선하거나 연장시킴으로써; 약제학적 조성물의 증발을 감소시킴으로써; 폴리펩타이드의 안정성을 개선시킴으로써; 폴리펩타이드의 효소에 의한 분해 또는 산화를 방지함으로써; 및/또는 폴리펩타이드와 상호작용하여 상승적 관계를 생성하여 조합될 때 요소의 상호작용이 개별 요소의 합보다 더 큰 총 효과를 생성함으로써 폴리펩타이드의 생체이용률을 증가시킬 수 있다. 전형적으로, 이러한 상승적 관계는 단독으로 투여되는 2가지 성분의 합에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 큰 생물학적 효과로 나타낸다.

약제학적 조성물은 인간 의학 및 수의학에서 인간 또는 동물 사용을 위한 것일 수 있다. 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 다양한 여러 가지 형태에 대한 이와 같은 적합한 부형제의 예는 문헌[PJ Sheskey, WG Cook and CG Cable (eds) 2017, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 8th Edition, APhA/Pharmaceutical Press, USA]에서 찾을 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "유효량"(예를 들어, "치료적 유효량" 또는 "미용 유효량")은 고려되는 종말의 달성, 즉 상처의 치유, UV 관련 손상의 감소 및 광노화의 감소를 가능하게 하는 양을 지칭한다. 상기 "유효량"은 개체의 연령 및 일반 상태 및 치료될 특정 병태, 치료 기간, 이전 치료 및 병태의 성질 및 기존 기간(예를 들어, 급성 대 만성 상처)과 같은 요인에 따라 대상체마다 다를 것이다.

구체적으로, 작용제의 유효량은 합리적인 이익/위험 비율에 상응하여, 과도하거나 견딜수 없는 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 대상체에게 투여될 수 있는 양이지만, 적절한 기법, 예컨대, 본 명세서 전반에 걸쳐 개시된 것에 의해 평가될때 원하는 효과를 제공하기에 충분한 양을 정의한다. 따라서, 정확한 유효량을 명시하는 것은 가능하지 않지만, 당업자는 일상적인 실험 및 배경 일반 지식을 사용하여 임의의 개별 사례에서 적절한 "유효" 량을 결정할 수 있을 것이다. 이러한 맥락에서 치료 결과는 증상의 근절 또는 완화를 포함한다. 치료 결과는 병태의 완전한 개선(즉, 치료)일 필요는 없다.

본 발명의 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 투여되거나 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약제학적으로 허용 가능한 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성, 산성 또는 금속성 모이어티를 포함하는 모 폴리펩타이드로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 이와 같은 염은 폴리펩타이드의 산성 또는 염기성 형태를 수성 또는 유기 용매 중에서 화학량론적 양의 적절한 반대 염기 또는 산과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 비수성 용매, 예컨대, 에터, 에틸 아세테이트, 에탄올, 아이소프로판올, 또는 아세토나이트릴이 바람직하다. 산 부가염의 예는 유기산, 예컨대, 아세트산, 락트산, 팔모산(palmoic acid), 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 석신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타타르산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 또는 트라이플루오로아세트산 등; 중합체산, 예컨대, 탄닌산, 카복시메틸 셀룰로스 등; 및 무기산, 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 등을 포함한다. 금속 착물은 아연, 철 등을 포함한다. 다른 약제학적으로 허용 가능한 염이 고려된다. 적합한 염의 목록은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences,　17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., US, 1985, p. 1418 및 Stahl et al, Eds, "Handbook of Pharmaceutical Salts Properties Selection and Use" Verlag Helvetica Chimica Acta and Wiley-VCH, 2002]에서 확인된다.

피부 병태

상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩타이드 및 조성물이 피부 병태를 치료하는 데 유용함을 입증하였다. 특히, 폴리펩타이드 및 조성물은 일반적으로 피부에 대한 상해의 결과로서 피부에 대한 손상과 연관된 피부 병태를 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 특히 예시된 피부 병태는 상처 치유, 피부에 대한 UV 손상의 치료 또는 예방, 광노화를 포함한 피부 노화의 치료 또는 예방, 피부 세포에서 산화 스트레스 및 반응성 산소종의 치료 또는 예방, 피부의 세포외 기질(ECM)에 대한 손상의 치료 또는 예방 및 피부의 세포에 대한 DNA 손상의 치료 또는 예방을 포함한다.

예를 들어, 실시예 1은 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3- RSKAKNPLYRRRRRRRRR) 및 덱스트로-리버소 서열 IK236770(서열번호 4 - rrrrrrrrrylpnkaksr)이 비처리 대조군과 비교하여, 국소적으로 적용될 때 상처 치유를 촉진시킴을 입증한다. 실시예 2는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)이 태양광 모의 UV-조사에 각질형성세포가 노출된 후 적용될 때 일차 각질형성세포에서 CREB의 133번 위치에서 세린(CREB S-133)의 UV-유도 인산화를 저해함을 입증한다. 실시예 2는 또한 UV 처리가 TGFβRII 수준을 저해하고, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)이 UV 처리된 세포에서 TGFβRII 발현을 회복시킴을 나타낸다. 실시예 3은 폴리펩타이드 IK34720("IK", 서열번호 3)이 태양광 모의 UV에 대한 노출 후 일차 각질형성세포에서 ATP 수준을 칼시트리올과 유사한 수준으로 향상시켰음을 입증한다. 실시예 4는 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사에 의해 유도된 피부 세포에서의 산화 스트레스를 감소시킴을 입증한다. 실시예 5는 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사에 의해 유도된 피부 세포에서의 CPD 핵의 형성에 의해 측정될 때 DNA 손상을 감소시킴을 입증한다. 실시예 6은 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 국소 적용이 UV-조사 후 아포토시스성 각질형성세포의 수를 감소시킴을 입증한다. 실시예 7은 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 조사 3시간 후에 급성 UV-조사 후 인간 피부 외식편에서 CPD의 형성을 감소시킬 수 있음을 입증한다. 실시예 8은 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)이 용량 의존적 방식으로 MMP-1 활성화를 저해하고 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 UV-조사에 의해 유도된 MMP1 발현을 감소시킴을 입증하며, 이는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)이 시간 경과에 따른 광노화를 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다. 실시예 9는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 진피 피부 섬유아세포 세포 용해물에서 세포-유래 지질의 UV-유도 산화 손상을 감소시킴을 입증한다. 실시예 10은 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UVB에 의한 멜라닌 유도를 감소시킴을 입증한다.

따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물의 유효량을 피부, 또는 피부의 세포에 투여하는 단계를 포함하는 피부 병태를 치료하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여하는" 또는 "제공하는"은 대상체의 신체 내에서, 또는 표적 세포 내에서 유효량의 활성 폴리펩타이드의 전달을 초래할, 폴리펩타이드를 투여하는 것, 폴리펩타이드의 전구약물, 또는 유도체, 또는 상기 언급한 폴리펩타이드 중 임의의 하나를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

상처 치유

상기 논의된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명의 폴리펩타이드가 상처 치유를 촉진시키는 데 유용함을 입증하였다. 따라서, 본 발명의 일 양태에서, 상처 치유를 촉진시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 제공된다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 상처 치유를 촉진시키는 방법이 제공된다.

본 명세서에서, 용어 "상처 치유"는 상처의 치유에 관련된 상이한 모든 단계를 기재하는 데 사용되고 상처 치유의 증대 및 가속화를 포함한다. 따라서 결함을 메우는 혈전을 형성하는 단계, 염증 세포에 의해 혈전을 침범하는 단계 및 이후 섬유아세포 및 모세혈관이 침범하여 상처 가장자리를 함께 끌어당기는 수축성 육아 조직을 형성하는 단계, 및 절단된 표피 가장자리의 앞으로 이동하여 벗겨진 상처 표면을 덮는 단계를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "상처"는 신체 조직에 대한 임의의 상처를 지칭한다. 바람직한 형태에서, 용어 "상처"는 피부가 파괴되어 동물의 피부에서 찢어짐(tear), 자상(cut), 자창(puncture), 절창(incision), 열상(laceration), 찰과상(abrasion), 찢어짐(rip), 베임(slash), 생채기(scratch), 째짐(slit), 화상(burn), 파열(rupture) 또는 궤양을 형성하는 피부 상처와 관련된다.

이와 같은 상처는 급성 또는 만성으로 분류될 수 있다. 만성 상처는 적어도 3개월의 기간 동안 시기적절하고 정연한 복구 과정으로 복구하지 못한 상처로 정의된다. 만성 상처는 돋아진 과다증식이 있지만 진행되지 않는 상처 가장자리의 존재로 확인될 수 있다. 다양한 병인의 만성 상처의 상처 기저부로부터 유래된 섬유아세포는 노화, 조숙, 또는 분화된 표현형을 나타내며, 이는 정상적인 자극 메세지에 반응하지 않거나 비효율적으로 반응한다.

모든 상처 유형은 만성화될 가능성이 있다. 만성 상처는 전통적으로 병인으로 나누어지며, 이는 만성 상처의 치료에 대한 정보를 제공할 수 있다. 추가로, 만성 상처의 치료는 또한 정맥 부전, 동맥 관류, 당뇨병, 완화되지 않는 압력과 같은 상처뿐만 아니라 영양 상태(I형 또는 II형 당뇨병), 면역억제 및 감염과 같은 전신 인자의 형성을 유발하거나 이에 기여할 수 있는 기저 병태의 치료를 동반할 수 있다.

일반적인 만성 상처에는, 보통 다리에 발생하고 대부분 노인에게 영향을 미치는 정맥 궤양, 만성 상처의 또 다른 주요 원인인 당뇨병성 궤양, 일반적으로 발뒤꿈치, 견갑골 및 천골과 같이 압력을 받는 신체 기관의 움직임을 저해하는 마비와 같은 병태가 있는 사람에서 보통 일어나는 욕창, 가장 일반적으로 박테리아, 바이러스, 진균 또는 아메바 감염에 의해 유발되는 각막 궤양이 있다. 다른 유형의 만성 상처는 허혈 및 방사선 중독과 같은 원인으로 인한 것일 수 있다.

급성 상처는 만성 상처의 분류에 맞지 않는 임의의 상처로 분류될 수 있다. 이에 따라, 급성 상처는 상처 부위의 자극 이후로 3개월 미만의 상처로서 정의될 수 있으며, 이는 종종 자극 이후 처음 4주 이내에 상처 치유의 징후를 나타낸다.

급성 상처는 상처를 유발한 대상에 따라 다양한 유형으로 분류될 수 있다. 예를 들어, 절창 또는 절개된 상처, 열상, 찰과상 및 벗겨짐(graze), 화상, 자창 또는 관통 상처.

다양한 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 조성물은 보조 치료와 함께 사용될 수 있거나, 본 발명의 방법은 보조 치료를 추가로 포함할 수 있다. 보조 치료는 변연절제술 치료, 예컨대, 당업계에 알려진 파파인 또는 다른 변역절제술 작용제의 사용, 습윤 상처 기저부의 적용, 또는 항생제 또는 항진균제를 통한 미생물 부하의 관리를 포함할 수 있다.

상처 치유를 측정하기 위한 당업계에 알려진 다양한 기법이 존재한다. 이는 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

자 기법 - 최대 길이와 수직 폭 측정값을 곱함으로써 상처의 표면적을 근사화할 수 있다. 이 기법은 대부분의 상처 형상의 불균일한 성질에 의해 제한되며, 이에 따라 이 기법은 넓거나 깊은 불규칙한 형상을 가지는 상처 면적을 정확하게 예측하지 못한다. 이 기법의 변경은 또한 상처의 깊이를 측정하여 전체 상처 부피를 예측하는 것이다. 그러나, 이 기법의 정확도는 상기 논의된 바와 동일한 이유로 제한된다.

아세테이트 트레이싱 및 면적 측정 - 상처 면적을 추정하기 위한 대안적인 방법은 아세테이트 트레이싱 및 접촉 면적 측정이다. 이 기법은 상처 표면에 투명한 시트를 놓은 다음 이의 가장자리를 트레이싱하는 것을 포함한다. 그 다음 격자판 위에 트레이싱을 놓고 국한된 부위 내의 정사각형의 수를 셈으로써, 또는 컴퓨터 이미지 분석을 사용하여 정확하게 면적을 정량화함으로써 상처 면적을 수동으로 결정한다.

상처 부위 추정은 또한 비접촉 방식, 예컨대, 비접촉 면역 측정으로 추정될 수 있다. 이 기법에서 표적 플레이트 또는 스케일 게이지를 상처와 동일한 평면에 배치하고 이미지를 캡처한다. 디지털 이미지 분석을 수행하여 표적 플레이트/스케일을 참조하여 상처 부위를 추정한다.

상처의 3차원 추정 - 구조화된 빛 또는 레이저 광을 사용하여 상처의 보다 복잡한 3차원 지형 측정을 수행할 수 있다. 당업계에 알려진 이들 기법은 상처 표면의 곡률 및 깊이로 왜곡되는 디지털 카메라 및 투영된 레이저 빔을 사용한다.

피부 손상 및 피부 병태

중요한 것은, 본 발명자들이 본 발명의 폴리펩타이드가 피부에 대한 상해(예컨대, 비이온화 방사선 손상, 예를 들어 UV 손상)에 의해 또는 피부의 의학적 병태에 의해 피부에 대해 유발된 손상을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있음을 추가로 입증하였다는 것이다. 따라서, 일 양태에서, 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 제공된다. 또 다른 양태에서, 피부 병태를 치료 또는 예방하기 위한 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같인 폴리펩타이드, 또는 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 피부 병태를 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다.

더욱이, 또 다른 양태에서, 세포에서 손상을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드로 치료하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 피부 병태는 피부 손상이다. 일부 실시형태에서, 손상은 일광 노출에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서, 피부 병태는 자외(UV) 방사선 유도 손상이다. 일부 실시형태에서, UV-방사선은 UVB 방사선이고, 손상은 UVB 유도 손상이다. 일부 실시형태에서, UV-방사선은 UVA 방사선이고, 손상은 UVA 유도 손상이다. 일부 실시형태에서, 피부 병태는 DNA 손상이다. 일부 실시형태에서, DNA 손상은 UV-방사선, 예컨대, UVB 또는 UVA 방사선에 의해 유도된다. 일부 실시형태에서. DNA 손상은 UVB 방사선에 의해 유발된다. 일부 실시형태에서, DNA 손상은 UVA 방사선에 의해 유발된다.

일부 실시형태에서, 피부 병태는 산화 손상이다. 일부 실시형태에서, 손상은 세포 아포토시스 증가이다. 일부 실시형태에서, 손상은 피부의 세포외 기질(ECM)에 대한 손상이다. 일부 실시형태에서, ECM은 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌 또는 프로테오글리칸, 예컨대, 더마탄 설페이트 및 히알루로난이다.

일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 조성물 및 방법(들)은 DNA 손상을 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 조성물 및 방법(들)은 자외 방사선 유도 손상의 복구를 증가시킨다.

손상(예컨대, UV 노출에 의해 유발된 손상)과 관련하여 용어 "치료하는"은 상해(예를 들어, UV-조사) 후에 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물이 적용되거나, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법이 수행될 때, 손상을 유발한 상해의 결과로서 세포, 또는 조직에서 유발된 임의의 해로운 변화의 상대적 수준을 감소시키는 것을 지칭한다. 또한, 손상과 관련하여 용어 "예방"은 상해 전, 또는 상해의 결과로서 세포 또는 조직에서 유발된 해로운 변화의 유도 전에 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물이 적용되거나, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법이 수행될 때, 손상을 유발한 상해의 결과로서 세포, 또는 조직에서 유발된 임의의 해로운 변화의 상대적 수준을 감소시키는 것을 지칭한다.

UV 손상

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)이 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 DNA 손상을 감소시킴을 입증하였다.

자외 방사선은 전형적으로 파장이 10㎚ 내지 400㎚인 전자기 복사로 정의된다. 환경 UV-방사선의 가장 일반적인 공급원은 전체 광 출력의 10%를 차지하는 태양에서 유래되며, 이때 UV-방사선의 대부분은 지구의 대기에 의해 여과되어 지표 수준에서는 태양으로부터 전자기 복사의 약 3%가 UV-방사선이다.

태양으로부터 방출되는 UV는 주로 UVA, UVB 및 UVC 방사선으로 나뉠 수 있다. UVA는 파장이 315㎚ 내지 400㎚인 것으로 분류되고; UVB는 파장이 280㎚ 내지 315㎚인 것으로 분류되며; UVC는 파장이 100㎚ 내지 280㎚인 것으로 분류된다. 해수면에서 UV-방사선의 약 95%가 UVA이고, 약 5%가 UVB이며, UVC 방사선은 대기에 의해 여과된다.

동물 모델 및 인간 피부 외식편에서 UVB 및 UVA는 피부에 대해 광-손상을 유도하고, UVA는 UVB보다 더 깊숙하게 침투함이 입증되었다. UV-유도 DNA 광생성물은 민감한 유전자에서 특정 돌연변이(UV-시그니처)를 유발할 수 있으며, 이에 따라 기저 세포 암종 및 흑색종을 포함한 다양한 피부암의 유도에서의 작용물질이다.

이에 따라, 상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 피부에서, 구체적으로 피부 세포에서 또는 피부의 ECM에서 UV 손상을 치료 또는 예방하기 위한 폴리펩타이드, 조성물 및 방법을 제공한다.

UV 노출에 의해 유발된 손상의 유형은 당업계에 알려져 있으며, DNA 손상, 세포의 아포토시스, 세포 신호전달 분자, 예컨대, cAMP 반응 요소-결합 단백질(CREB)의 인산화 및 반응성 산소종(ROS)의 생성에 의한 세포내 신호전달 경로의 활성화를 포함한다(그러나 이에 제한되지 않음).

DNA 손상 및 CPD 형성

세포 내에서 DNA 손상을 평가하기 위해 당업계에 알려진 다양한 기법이 있다. 이들은 코메트검사(CometAssay)(등록상표), PARP 범용 비색 분석(Universal Colorimetric Assay), 세포 내 인산화 H2AX의 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 검정(Superoxide Dismutase Assay) 분석, 또는 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD)의 생성을 포함한다(그러나 이에 제한되지 않음).

각질형성세포가 UV-방사선에 노출되는 동안, 2가지 형태의 DNA 손상, 즉 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD), 및 피리미딘 광생성물 DNA 손상이 유도된다. CPD는 고도의 돌연변이유발성이고 UV-방사선, 특히 UVB 방사선에 의해 상당한 양으로 생성된다. 이러한 이량체는 임의의 2개의 인접한 피리미딘 사이에서 형성될 수 있으며, 티민, 사이토신, 또는 5-메틸사이토신을 포함할 수 있다. CPD의 돌연변이유발성은 피부 세포에서 오래 지속되는 것과 관련이 있다. 이는 탈아미노화 CPD가 DNA 중합효소에 의해 우회될 때 돌연변이유발 사건을 초래하는 CPD의 탈아미노화를 위한 시간을 가능하게 한다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)이 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 CPD 형성을 감소시킴을 입증하였다. 따라서, 일부 실시형태에서, 세포에서 CPD 형성을 특징으로 하는 손상, 특히 UV-유도 손상을 감소시키기 위한 폴리펩타이드, 조성물(들) 및 방법이 제공된다. 또한, 일부 실시형태에서, 세포에서 CPD 형성을 특징으로 하는 손상, 특히 UV-유도 손상을 예방하기 위한 폴리펩타이드, 조성물(들) 및 방법이 제공된다.

일부 실시형태에서, 손상은 세포에서 CPD 형성이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은, 특히 UV 노출 후, 세포에서 CPD 형성을 감소시킨다. 또한, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은, 특히 UV 노출 후, 세포에서 CPD 형성의 증가를 방지한다. 따라서, 세포를 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 세포(예컨대, 피부 세포)에서 CPD 형성을 저해하는 방법이 제공된다.

산화 손상

산화 스트레스는 반응성 산소종(ROS) 형성 및 효소 및 비효소 항산화제 사이의 불균형의 결과이다. 순 불균형은 세포 내에서 ROS의 축적, 및 세포로부터의 분비를 초래할 수 있다. ROS의 증가는 DNA 손상(예를 들어, 이중 가닥 DNA 파손) 및 세포 및 세포외 성분, 예컨대, 지질 및 콜라겐 둘 다에 대한 산화 손상을 포함하여 세포 및 조직(예컨대, 피부)의 세포외 기질에 대한 다양한 손상을 유발할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)이 UV 조사된 피부에 적용될 때 세포 내에서 산화 스트레스를 감소시킴을 입증하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)은 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 피부에서 8-OHdG 형성을 저해한다.

따라서, 본 발명은 세포에서의 산화 스트레스, 또는 피부에 대한 산화 손상을 치료 또는 예방하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물을 제공한다. 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 조성물의 유효량을 대상체에게 (바람직하게는 국소적으로) 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 피부에 대한 산화 손상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 산화 손상은 UV-방사선 유도 산화 손상이다. 방법의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 UV-조사 전에 투여된다. 방법의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 UV-조사 후에 투여된다.

본 발명은 또한 세포에서 ROS의 증가를 치료 및/또는 예방하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물을 제공한다. 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 조성물의 유효량을 대상체에게 (바람직하게는 국소적으로) 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 피부에서 ROS 농도의 증가를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, ROS의 증가는 피부 또는 세포의 UV-조사 후에 이루어진다. 방법의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 UV-조사 전에 투여된다. 방법의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 UV-조사 후에 투여된다.

세포에서 산화 손상을 평가하는 방법 및 기법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[I. Marrocco et al. Measurement and Clinical Significance of Biomarkers of Oxidative Stress in Humans. Oxidative Medicine and Cellular Longevity, 2017, Article ID 6501046]에 있다. 이들 기법은 ROS 및 ROS 유도 질소 종의 검출을 위한 형광 프로브(예를 들어, DHR123, DCFH-DA, HE 및 C11-BODIPY); ROS-유도 변형, 예컨대, 지질 산화를 기반으로 하는 마커(예를 들어, HNE, F2-IsoPs, MDA, 알켄알 및 알카다이엔알), DNA의 산화(예를 들어, 8-OHdG, 5-클로로사이토신, 5-클로로우라실, εdA 및 εdC) 및 지질의 산화(예를 들어, 카보닐, 3-NO-Tyr, AOPP, ALE, AGE 및 oxLDL)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

상기 개시된 바와 같이, 본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 UV 노출, 및 UV-유도 손상 후 세포에서 8-OHdG의 농도를 감소시킬 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 발명은 세포에서 8-OHdG를 감소시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 8-OHdG는 세포의 UV-조사(자외선 스트레스)에 의해 유도된다. 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 세포에서 8-OHdG를 감소시키는 방법이 추가로 제공된다. 방법의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 UV-조사 전에 투여된다. 방법의 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 조성물은 UV-조사 후에 투여된다. 일부 실시형태에서, 방법은 8-OHdG 형성을 특징으로 하는 UVB 유도 손상을 저해하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 방법은 UVA 유도 손상을 저해하거나 감소시킨다.

DNA 손상 및 세포 아포토시스

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)이 UV-조사 후 인간 피부를 포함하여 피부에 국소적으로 적용될 때 아포토시스성 일광화상 세포의 수를 감소시킴을 입증하였다.

상해, 예컨대, UV-조사 후 세포에 유발된 손상은 아포토시스를 통해 세포가 세포예정사를 겪게 할 수 있다. 상해, 예컨대, UV-조사 및 반응성 산소종에 의해 유발된 DNA 손상은 여러 아포토시스성 인자, 예컨대, p53, Ku70 및 Ku86(Ku 복합체) 및 MNR 복합체의 기능 및 활성을 조절할 수 있다. 이는 결국 세포에서 아포토시스를 유도할 수 있으며, 이때 아포토시스 증가는 피부 노화와 상관관계가 있다.

따라서, 일 양태에서 본 발명은 피부에서(예를 들어, 피부의 하나 이상의 세포에서) 아포토시스를 감소시키거나, 세포에서 아포토시스를 예방하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드, 조성물을 제공한다. 추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 조성물의 유효량을 대상체에게 (바람직하게는 국소적으로) 투여하는 단계를 포함하는, 피부에서 아포토시스를 감소시키거나, 세포에서 아포토시스를 예방하는 방법을 제공한다.

세포에서 아포토시스를 평가하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 문헌[G Banfalvi, Methods to detect apoptotic cell death, Apoptosis, 2017 Feb;22(2):306-323]에 있다. 이는 막 변경, DNA 단편화, 세포독성 및 세포 증식 및 미토콘드리아 손상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가 기법은 광-산란 유세포분석, 시간-경과 현미경 관류 분석 및 유전독성 특이적 염색질 변화의 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

세포 에너지 및 DNA 복구

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)이 UV-조사 후 인간 피부를 포함하여 피부에 국소적으로 적용될 때 세포에서 ATP의 수준을 증가시킴을 입증하였다.

UV-조사 후 세포에서 생성되는 비타민 D는 국부적으로 수산화되어 UV-유도 손상에 대하여 세포를 보호한다. 또한, 비타민 D 스테로이드 호르몬인 1알파,25-다이하이드록시비타민 D₃(1,25(OH)₂D₃; 칼시트리올)은 다양한 모델에서 비타민 D의 보호 효과를 증가시키고 DNA 손상을 감소시키며, DNA 복구를 개선시키는 것으로 나타났다.

더욱이, 최근에 1,25(OH)₂D₃은 에너지-보존 과정으로 이어지는 해당과정을 향상시키는 것으로 나타났다. 결정적으로, DNA 복구는 에너지 의존적이므로 따라서 아데노신 트라이포스페이트(ATP)의 증가를 통해 세포내 에너지가 증가하면 CPD의 복구 증가 및 산화 손상의 감소를 초래할 수 있다. 따라서, UV-조사 후 세포에서 ATP 농도를 증가시키는 능력은 DNA 복구의 개선을 용이하게 할 것이다.

따라서, 일 양태에서 본 발명은 세포에서 ATP 수준을 증가시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 세포에서 ATP의 증가는 UV 노출 이후이다. 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 세포에서 ATP 수준을 증가시키는 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, 세포는 UV-방사선에 대한 노출 전에 처리된다. 일부 실시형태에서, 세포는 UV-방사선에 대한 노출 후에 처리된다.

CREB 활성화

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)이 각질형성세포가 태양광 모의 UV-조사에 노출된 후에 적용될 때, 일차 각질형성세포에서 인산화된 cAMP 반응 요소-결합 단백질(pCREB)의 형성을 저해함을 입증하였다.

CREB는 세포 전사 인자이다. 이는 cAMP 반응 요소(CRE)라고 하는 특정 DNA 서열에 결합하여, 유전자의 전사를 증가 또는 감소시키고 세포 증식, 세포 주기 진행, 대사, DNA 복구, 세포 분화 및 세포 생존을 포함한 다양한 세포 경로에서 역할을 한다. CREB 활성화는 133번 위치의 세린에서의 인산화에 의해 표시된다. 133번 위치에서의 인산화는 UV-조사의 결과로 증가하며 세포에 대한 UV-유도 손상의 마커 및 기여 인자로 간주된다. 이에 따라, CREB 인산화의 저해는 각질형성세포에 대한 UV-유도 손상을 감소시키고, 따라서 피부에 대한 UV 손상을 감소시킬 수 있다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 CREB 인산화를 감소시키기 위한 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 조성물을 제공한다. 세포를 본 발명에 따른 폴리펩타이드 또는 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 세포에서 CREB 인산화를 저해하는 방법이 추가로 제공된다.

TGF베타RII 및 프로콜라겐 합성

자외선차단 보호를 TGFB/Smad 신호전달 및 프로콜라겐 합성의 자극과 연결하는 다수의 보고가 있다(Rittie L & Fisher GJ, Ageing Res Reviews, 2002, 1(4): 705-720; Choi MS et al, J Dermatol Sci, 2007, 146(2): 127-137; Bora NS et al, Eur J Pharm Sci, 2018, 127: 261-275).

더욱이, UV 조사 8시간 후 TGFB2 및 TGFBRII 둘 다 감소되는 것이 또한 보고되었으며, 이는 동일한 시간 동안 감소된 프로콜라겐 합성이 적어도 부분적으로 TGFB2-TGFBRII-Smad 경로에서 관찰된 변경에 의해 매개될 가능성을 높이는 프로콜라겐 합성 감소와 일치하는 것으로 보고되었다(Quan TH et al, J Invest Dermatol, 2002, 119(2): 499-506). 따라서, 태양 자외선 조사는 TGF-베타 II형 수용체를 하향조절함으로써 광노화 인간 피부에서 콜라겐을 감소시키고(Quan T et al, Am J Pathol, 2004, 165(3): 741-51), 산화 스트레스는 또한 TGFB II형 수용체의 감소를 통해 TGF 베타 경로를 손상시킨다(He T et al, Age (Dordr), 2014, doi: 10.1007/s11357-014-9623-6). 특히, TGFB2와 대조적으로, TGFB1 및 TGFB3 발현은 UV 노출시 증가한다(Quan TH et al, 상기 참조). 결국, TGF-베타 II형 수용체의 손실은 TGF-베타에 의한 Smad2/3의 하류 활성화를 방지하여, I형 프로콜라겐의 발현을 감소시킨다(He T et al, 상기 참조).

본 발명자들은 일차 섬유아세포(FERATONIC(FERATONIC)-p5)에서 UV 처리 5시간 후에 TGFBRII 발현이 UV 조사에 의해 명확하게 억제되고 IK34720(서열번호 3; IK)으로 재확립되었음을 입증하였다.

따라서, 프로콜라겐 합성을 증가시키고/시키거나 TGFβRII의 UV-유도 억제를 회복시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물(들)이 제공된다.

노화

순 피부 노화는 동시에 발생하는 2가지 과정의 결과이다. "선천적" 또는 "내인성" 노화로 지칭될 수 있는 첫 번째 노화는 피부에 천천히 영향을 미쳐 결합 조직의 부분적으로 가역성인 퇴화를 유도한다. "외인성 노화" 또는 "광노화"로 지칭될 수 있는 두 번째 노화는 주로 피부의 조기 노화에 상당히 기여하는 자외 방사선에 의한 것이다. 이들 2가지 경로의 독립성은 UV-방사선에 노출되지 않더라도 피부가 시간 경과에 따라 여전히 노화한다는 것을 입증하는 동물 모델에 의해 예시된다. 피부 노화의 과정은 복잡하고 무수히 많은 세포내 변화, 및 ECM에 대한 변화를 수반하며, 이는 특히 피부 탄성, 톤 및 색소의 손실을 초래한다. 피부 노화의 주요 원인 중 2가지는 세포내 손상 축적 및 피부 ECM의 파괴이다.

UV-조사는 표피 및 진피에 손상을 유도하여 광노화와 같은 장기적인 영향을 초래할 수 있다. 광노화 피부는 진피에서 무질서한 엘라스틴과 피브릴린의 증가 및 이의 축적과 함께 세포 성분 및 세포외 기질의 변경을 나타낸다. 또한, 광노화는 진피 결합 조직의 주요 구조 단백질인 간질성 콜라겐의 손실을 초래할 수 있다.

따라서, 피부 노화를 치료 또는 예방하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물이 제공된다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물의 유효량을 포유동물에게 (바람직하게는 국소적으로) 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물의 피부 노화를 치료 및/또는 예방하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 노화는 내인성 노화이다. 일부 실시형태에서, 노화는 외인성 노화이다. 일부 실시형태에서, 외인성 노화는 광노화이다.

본 발명은 피부의 세포 또는 세포외 성분의 손상을 저해하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 손상은 산화 손상, 예컨대, ROS(상기 논의된 바와 같음)에 의해 유발된 손상이며, 이는 피부의 광노화를 초래할 수 있다. 일부 실시형태에서, 손상은 UV-조사에 의해 유도된다.

일부 실시형태에서, 손상은 ECM의 효소적 분해이다. 따라서, 본 발명은 ECM의 분해 및/또는 피부의 광노화, 특히 세포가 UV-방사선에 노출된 후의 분해를 감소시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물을 제공한다. 피부, 또는 피부 내의 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 치료하는 단계를 포함하는, ECM의 분해 및/또는 피부의 광노화를 저해하는 방법이 추가로 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "피부 노화"는 포유동물 피부의 노화의 출현을 의미한다. 이는 내인성 노화, 및 주로 피부의 UV의 노출에 의해 유발되는 외인성 노화를 둘 다 포함한다. 따라서, 노화를 "치료 및/또는 예방하는 것" 또는 "항노화"는 피부 노화 출현을 늦추거나 또는 저해하고/하거나 반전시키는 것을 지칭한다.

이러한 변화를 유도하는 기저 작용물질은 주로 UV-생성 ROS인 반응성 산소종(ROS)이다. 이러한 ROS는 피부의 비-효소적 및 효소적 항산화 방어 시스템을 둘 다 고갈시키고 손상시킨다. 결과적으로, 고갈된 ROS 방어 시스템이 존재하는 경우, 항산화제는 주로 세포막, 지질 및 구조 단백질, 예컨대, 엘라스틴 및 콜라겐에 세포 손상을 유발한다. 또한 기저 작용물질은 기질 금속단백질분해효소(MMP)를 포함한다.

MMP

기질 금속단백질분해효소(MMP)는 세포외 기질(ECM) 단백질의 다양한 성분, 예컨대, 콜라겐, 피브로넥틴, 엘라스틴, 및 프로테오글리칸을 분해할 수 있는 아연-포함 엔도펩티다제이다. UV-조사는 피부에서 MMP의 발현 및 분비를 증가시키는 것으로 나타났으며, 이는 ECM의 분해를 통해 광노화에 기여할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 폴리펩타이드, 예컨대, 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3)이 세포 기질 금속단백질분해효소 1(MMP1)의 활성화를 감소시킬 수 있음을 입증하였다.

따라서, 본 발명은 세포가 UV-방사선에 노출된 후에 MMP의 농도를 감소시키기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 및 조성물을 제공한다. 세포 또는 조직을 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 조성물로 (바람직하게는 국소적으로) 처리하는 단계를 포함하는, 세포 또는 조직에서 MMP 활성을 저해하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시형태에서, MMP는 MMP1이다.

피부에서 MMP의 활성을 감소시킴으로써, 피부 ECM의 분해, 및 피부의 광노화를 감소시킬 수 있다.

노화의 측정

노화의 징후는 코, 뺨 및 목의 거미양정맥류; 색소반, 예컨대, 주근깨, 일광흑자(검버섯 또는 간반으로 알려짐), 및 고르지 않은 피부색; 피부 톤의 일반적인 손실; 주름 수의 증가; 주름 깊이의 증가; 주름 길이의 증가; 이마 주름과 같은 선의 증가; 양성 광선 각화증의 존재를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이에 따라, 이들 피부 특징의 평가를 사용하여 노화를 평가할 수 있다.

이론에 의해 구속되고자 하지 않지만, 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및 방법은 상기 제공된 노화 징후 중 하나의 형성을 예방하거나 감소시키는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 코, 뺨 및 목의 거미양정맥류의 형성을 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 색소반의 형성을 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 주근깨의 형성을 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 일광흑자의 형성을 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 고르지 않은 피부색의 형성을 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 피부톤의 일반적인 손실 형성을 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 주름 수를 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 주름의 증가를 예방하거나, 주름의 깊이를 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 주름 길이의 증가를 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 이마 주름의 증가를 예방하거나 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 폴리펩타이드, 조성물 및 방법은 양성 광선 각화증의 형성을 예방하거나 감소시킨다.

또한, 상이한 피부-유형에 대한 피부 노화를 평가하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[R Bazin, E Doublet. Skin Aging Atlas. Volume 1. Caucasian Type. Med'Com; 2007; R Bazin and F Flament 2010 Skin Aging Atlas. Volume 2. Asian Type. Editions Med'Com, France; R Bazin, F Flament and F Giron 2012 Skin Aging Atlas. Volume 3. African-American Type. Editions Med'Com, France; R Bazin, F Flament and V Rubert, 2015, Skin Aging Atlas. Volume 4: Asian Type, Editions Med'Com, France; R Bazin, F Flament and H Qiu, 2017, Skin Aging Atlas. Volume 5: Photo-aging Face & Body Editions Med'Com, France].

본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다. 하기 설명은 단지 특정 실시형태를 설명하기 위한 목적일 뿐이며, 상기 설명과 관련하여 제한하려는 의도가 아님을 이해하여야 한다.

실시예 1: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR 및 rrrrrrrrrylpnkaksr은 상처 치유를 촉진시킨다 .

도 1 및 도 2는 하기 프로토콜에 따라 뮤린 상처 모델에서 10일에 걸친 상처 치유에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3 - RSKAKNPLYRRRRRRRRR)(도 1) 및 덱스트로-리버소 서열 IK236770(서열번호 4 - rrrrrrrrrylpnkaksr)(도 2)의 영향을 예시한다.

평균 체중이 22g(± 2g)인 8마리의 수컷 ICR 마우스의 3개 그룹을 본 연구에서 사용하였다. 동물을 연구 동안 개별 우리에 수용하였다. 아이소플루란 가스 마취 하에, 각각의 동물의 어깨와 등 부위를 면도하고 날카로운 펀치(ID 12㎜)를 사용하여 제1일에 피부밑근육층 및 부착 조직을 포함한 피부를 제거함으로써 상처를 유도하였다.

상처 유도 후, 폴리펩타이드 IK34720 및 IK236770을 동물당 10㎍의 투약량으로 상처 부위에 국소적으로 투여하였다. 또한, 양성 대조군에는 상처 치유를 개선시키는 것으로 나타난 알파 2A 효현제(CGS-21680)를 동물당 10㎍ 투여하였다(Montesinos MC et al, J. Exp. Med., 1997, 186: 1615-1620). pH 7.4의 포스페이트 완충 식염수(PBS)의 투여를 포함한 추가 그룹을 음성 대조군으로 사용하였다.

투명한 플라스틱 시트 상으로 상처의 주변을 트레이싱함으로써 제5일, 제7일, 제9일 및 제11일에 상처 치유를 분석하고, 이때 상처 면적은 Image analyzer ProPlus(Media Cybernetics, 버전 4.5.0.29)에 의해 계산하였다. 상처의 봉합률(%)을 계산하였다. 상처의 봉합률을 제5일, 제7일, 제9일 및 제11일에 결정하였다. 아노바(ANOVA) 및 던넷 검정(Dunnett's test)을 적용하여 각각의 측정 시점에서 처리군(펩타이드 및 양성 대조군) 및 음성 대조군 간의 상당한 유의성을 테스트하였다. 차이는 P<0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주하였으며, *로 표시하였다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 마우스당 IK34720(서열번호 3 - RSKAKNPLYRRRRRRRRR) 10㎍ 연속 10일 동안 매일 국소 적용하는 것은 제5일부터 제11일까지 상처 봉합률에서 통계적으로 유의한 증가(P<0.05)와 연관이 있었다. 또한, 예상한 바와 같이, 아데노신 A2a 효현제 CGS-21680(양성 대조군)을 10㎍/마우스로 국소 적용하는 것은 동일한 연구 기간 동안 음성 대조군과 비교하여 상처 치유의 증가와 연관이 있었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 마우스당 폴리펩타이드 IK236770(서열번호 4) 10㎍을 연속 10일 동안 매일 국소 적용하는 것은 음성 대조군과 비교하여 제5일에 상처 치유에서(상처 봉합률(%)로 측정됨) 통계적으로 유의한 증가와 연관이 있었다.

도 1 및 도 2에서 모든 값은 지정된 시점에서 평균 ± SEM을 나타낸다.

이 데이터는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3 - RSKAKNPLYRRRRRRRRR) 및 덱스트로-리버소 서열 IK236770(서열번호 4 - rrrrrrrrrylpnkaksr)이 비처리 대조군과 비교하여 국소적으로 적용될 때 상처 치유를 촉진시킴을 예시한다.

실시예 2: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 각질형성세포가 태양광 모의 UV-조사에 노출된 후 적용될 때 일차 각질형성세포에서 pCREB 형성을 저해하고, TGFβ 수용체( TGFβRII )의 UV-유도 억제를 복원한다.

CREB는 UV-조사에 대한 세포 노출에 반응하여 133번 위치의 세린(Ser-133)에서 인산화된다. CREB 인산화의 증가는 세포 증식, 세포 주기, 대사, DNA 복구, 분화, 염증, 혈관형성, 면역 반응 및 세포 생존을 포함한 다양한 기능과 연관되어 있다. 결과적으로, 비정상적인 CREB 인산화는 종양 발생, 악성 종양 및 생존과 연관이 있다(Steven. A and Seliger B., Oncotarget. 2016 Jun 7; 7(23): 35454-35465).

CREB 인산화에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 영향을 하기 프로토콜을 사용하여 평가하였다.

이전에 기재된 바와 같이 각질형성세포를 수확하고 배양하였다(Gupta et al., J Invest Dermatol, 2007, 127(3):707-215). 3명의 독립적인 공여체 유래의 각질형성세포(계대 1 내지 5)를 도 3에 예시된 실험에 사용하였다.

100% 분광 에탄올(Merck, 독일 다름슈타트 소재)에 칼시트리올(1,25-다이하이드록시비타민 D3(1,25(OH)₂D₃) - Cayman Chemical, 미국 미시간주 소재)을 용해시킴으로써 양성 대조군 처리(도 3에서 "D"로 표시됨)를 제조하였고 최종 농도를 분광학(NanoDrop 2000, Thermo Fisher Scientific, 미국 매사추세츠주 소재)에 의해 결정하였다. 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)을 pH 7.2에서 1mM의 농도로 포스페이트 완충 식염수(PBS)에 용해시켰다. 0.1%(v/v) 분광 에탄올 및 0.1%(v/v) PBS로 구성된 비히클(도 3에서 "V"로 표시됨)을 음성 대조군으로 사용하기 위해 준비하였다.

Oriel 1000W 크세논-아크 램프(미국 코네티컷주 스트랫퍼드 소재)를 사용하여 태양광 모의 UV-조사에 의해 배양된 세포를 조사하였다. UVB에 대하여 400 mJ/cm² 그리고 UVA에 대하여 3600 mJ/cm²(총 4000 mJ/cm²)의 에너지 수준으로 방사선을 투사하고, 에너지는 OL754 방사계(Optronics Laboratories Inc., 미국 플로리다주 올랜도 소재)에 의해 측정하였다. 이 선량은 호주 시드니에서 10월 12시 정오에 태양을 대략 4분 조사하는 것과 같다. 비-조사 대조군 세포(모의)를 조사된 세포와 동시에 처리하였지만 ssUV로부터 보호하였다. 조사 용액은 5mM D-글루코스를 포함하는 PBS였다. 각질형성세포를 6-웰 플레이트에 도말하였다.

1nM의 1,25(OH)₂D₃의 조사 직후, 음성 대조군(비히클) 또는 0.1μM, 1μM 및 5μM의 IK34720(도 3에서 "IK"; 서열번호 3)을 세포 배양물에 첨가하였다. 이후 세포를 용해시키고 웨스턴 블롯(문헌[Rybchyn et al., 상기 참조, 2017], [Rybchyn et al., JBC, 2011:286(27):23771-9]에서 이전에 기재된 바와 같음)을 사용하여 ERK1/2-T202/Y204, GSK3α/β-S21/9, mTOR-S2448, CREB-S133 및 a-튜불린(로딩 대조군)의 인산화를 분석하였다. 웨스턴 블롯에서 사용된 모든 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(미국 매사추세츠주 소재)의 것이었다.

도 3a는 사이클릭-AMP-반응성 요소-결합 단백질(CREB)의 UV-조사 유도 인산화 방지에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)은 각질형성세포가 태양광 모의 UV-조사에 노출된 후 적용될 때 일차 각질형성세포에서 CREB의 133번 위치의 세린(CREB S-133)의 UV-유도 인산화를 저해한다.

내인성 피부 노화 및 UV-유도 피부 노화는 둘 다 제1형 프로콜라겐 합성에 필요한 TGFβRII의 감소로 이어진다. 또한, 자외선차단제 보호에 의한 프로콜라겐 합성의 자극은 TGFβ 신호전달과 관련이 있다.

TGFβRII 인산화에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 영향을 하기 프로토콜을 사용하여 평가하였다.

인간 피부 진피 섬유아세포를 건강한 성인 인간 피부의 각막도(keratome) 생검으로부터 배양하였다. 세포는 3 내지 6회 계대에 있었다. UV 조사를 위해, 하위융합(subconfluent) 세포를 포스페이트-완충 식염수(PBS)로 1회 세척하고 UV로 조사하였다. 조사 직후, 음성 대조군(비히클) 또는 1μM, 2.5μM, 5μM 및 10μM의 IK34720(도 3b에서 "IK", 서열번호 3)을 세포 배양물에 첨가하였다.

웨스턴 분석을 위해, 핵 추출물을 준비하고, 막 분획물을 준비한 다음 8% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동 상에서 분리하고, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막으로 옮긴 다음, 일차 항체와 반응시켰다. 블롯을 시각화하고 정량화하였다.

도 3b는 TGFβ 수용체(TGFβRII)의 UV-유도 억제를 회복시키는 것에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다. 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이, UV 처리는 TGFβRII 수준을 저해하고, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)은 UV 처리 세포에서 TGFβRII 발현을 회복시켰다. 일차 섬유아세포(FERATONIC-p5)에서 UV 처리 5시간 후에 TGFBRII 발현이 UV 조사에 의해 명확하게 억제되고 IK34720(서열번호 3; IK)으로 재확립되었다.

이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사 후 적용될 때 TGFβRII의 UV-유도 억제를 회복시킴을 나타낸다.

실시예 3: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 태양광 모의 UV-조사에 노출된 일차 각질형성세포에서 ATP 수준을 증가시킨다.

도 4는 태양광 모의 UV-조사에 노출된 일차 각질형성세포에서 ATP 수준에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다. UV 노출 후 부적절하게 복구된 DNA 손상은 피부암 발생의 원인 요소인 것으로 입증되었다. DNA 복구는 에너지를 필요로 하지만, UV 노출 후 피부 세포는 에너지의 주요 공급원인 ATP를 생성하는 능력이 제한된다.

UV 노출 후 세포내 ATP에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 영향을 하기 프로토콜을 사용하여 평가하였다.

상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 일차 각질형성세포를 수확하고, 실시예 2에 기재된 농도로 칼시트리올(양성 대조군) 또는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3; RSKAKNPLYRRRRRRRRR)의 존재 또는 부재 하에, 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 ssUV-조사(UVR)에 노출시키거나, 조사하지 않았다(모의). 칼시트리올((1α,25-다이하이드록시비타민 D3)은 다양한 모델에서 UV-유도 DNA 손상 및 광발암을 감소시키는 것으로 입증되었다.

이전에 기재된 바와 같이(Rybchyn et al., 상기 참조, 2017), CellTiter-Glo® 2.0 검정(Promega사, 미국 위스콘신주 소재)을 사용하여 UVR 1.5시간 후에 ATP 수준을 결정하였다. 도 4의 모든 데이터는 평균±SD로 표시되어 있다. * p<0.05, **p<0.01. 상기 기재한 바와 같이 세포를 준비하고 조사하였다.

도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리펩타이드 IK34720("IK", 서열번호 3)은 태양광 모의 UV에 노출된 후 일차 각질형성세포에서 ATP 수준을 칼시트리올과 유사한 수준으로 향상시켰다. ATP 수준의 증가는 UV-유도 손상 후 DNA의 복구를 돕는 것으로 제안된다.

이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사 후 적용될 때 태양광 모의 UV에 노출된 후 ATP 수준을 증가시킴을 나타낸다.

실시예 4: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 피부의 산화 스트레스를 감소시킨다.

도 5 내지 도 6은 피부에서 UV-유도 산화 스트레스에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다.

8-하이드록시-2'-데옥시구아노신 또는 8-옥소-7,8-다이하이드로-2'-데옥시구아노신(8-OHdG/8-oxodG)은 산화 스트레스의 측정법인 세포 내 8-OHdG의 농도로 자유 라디칼 유도된 산화성 병변의 주요 형태 중 하나이다. UV-유도 산화 스트레스에서 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 역할을 하기 프로토콜을 사용하여 평가하였다.

6개의 UVA 튜브(Hitachi 40W F40T 10/BL, 일본 도쿄 소재)와 함께 1개의 형광 UVB 튜브(Philips TL40W 12R/S, 네덜란드 아인트호벤 소재)에 노출시킴으로써 암컷 Skh:hr1 무모 마우스를 태양광 모의 UV-조사(UVR)에 노출시켰다. UVA 및 UVB 조사를 이전에 기재된 바와 같이(Dixon KM et al., Biochem Mol Biol, 2007, 103(3-5):451-6) 0.125㎜ 셀룰로스 아세테이트 시트(Grafix Plastics, 미국 오하이오주 클리블랜드 소재)를 통해 여과하였다. UV-조사한 마우스에 최소 홍반 용량(MED) 3배의 UVR(3.98 kJ/m2 UVB 및 63.8 kJ/m2 UVA)에 해당하는 단일 노출을 처리하였다. 조사된 동물을 5개의 처리 그룹으로 무작위로 할당하였다(그룹당 n=3).

조사 직후, 산화 스트레스를 평가하기 위해 각각의 처리 그룹의 마우스를 비히클(에탄올, 프로필렌 글라이콜 및 물을 각각 2:1:1의 최종 용매 비율로 포함하는 베이스 로션), 11.4 pmol/cm2의 칼시트리올("1,25(OH)₂D₃), 또는 100㎕의 수용액 중 20㎍, 100㎍ 또는 200㎍의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 처리로 등쪽 표면에서 국소적으로 처리하였다.

UVR 3시간 후 UV-조사된 등쪽 피부로부터 생검을 채취하고 6시간 동안 Histochoice 고정액(Amresco, 미국 오하이오주 솔론 소재)으로 고정시켰다. 피부 샘플을 파라핀으로 포매시키고, 모든 분석을 위해 5 마이크로미터 절편으로 절단하였다. 40× 배율에서 일광화상 세포의 시각화를 위해 절편에 일상적인 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하고, 피부 절편의 선형 밀리미터당 일광화상 세포의 수를 기록하였다.

산화 스트레스를 나타내는 8-옥소-2'-데옥시구아노신(8oxodG)의 수준을 하기 설정된 바와 같이 면역조직화학 및 이미지 분석(Dixon KM et al., Cancer Prev Res 2011, 4(9):1485-94)에 의해 검출하였다.

슬라이드를 탈파라핀화하고 일련의 등급화된 에탄올 용액 중에서 재수화시켰다. 37℃에서 30분 동안 프로테이나제 K를 사용하여 항원 회수를 수행한 다음, 15분 동안 2 N HCl(70% 에탄올 중)로 절편을 처리한 후, 추가 15분 동안 50mM 트리스 완충액으로 절편을 처리하였다. 8oxodG의 경우, 슬라이드를 37℃에서 30분 동안 200 ㎍/㎖의 RNase A(Amresco, 미국 오하이오주 소재)로 추가 처리하였다. 다코 애니멀 리서치 키트(Dako Animal Research Kit)를 사용하여 제조업체(다코(Dako), 덴마크 글로스트럽 소재)가 규정한 방법을 사용함으로써 후속 단계를 수행하였다. 항-티민 이량체 항체(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미국 미주리주 소재)를 10 ㎍/㎖로 사용하여 CPD 형태의 DNA 손상을 나타낸 한편, 8oxodG 항체(트레비겐(Trevigen), 미국 메릴랜드주 소재)를 2.5 ㎍/㎖로 사용하여 산화 스트레스를 시각화하였다.

도 5에 제시된 면역조직에서 볼 수 있고, 도 6에 정량화된 바와 같이, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)은 급성 UV-조사 후 Skh:hr1 마우스의 피부에서 8-OHdG 형성을 저해한다. 도 5에서, 핵의 어두운 염색은 8-oxo-dG의 존재를 나타낸다.

8oxodG에 대한 면역조직학적 데이터의 정량화는 비히클(음성) 대조군과 비교하여 UV-조사에 노출된 모든 처리 그룹에서 통계적으로 유의한 감소가 있었음을 입증하였다(** p<0.01, ****p<0.0001). 아이소타입 염색 대조군으로 사용된 모노클로날 마우스 IgG 아이소타입으로는 유의한 염색이 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때, 피부 세포에서 UV-조사에 의해 유도된 산화 스트레스를 감소시킴을 나타낸다.

실시예 5: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 DNA 손상을 감소시킨다.

도 7 및 도 8은 시험관내 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD)의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3; "IK")의 효과를 예시한다.

UV-방사선에 대한 노출은 일련의 화학반응을 촉발시키고, 중합효소를 저해하거나, DNA의 전사 또는 복제 동안 오독(misreading)을 유발하거나, 복제를 저지시킬 수 있는 많은 분자 생성물(광병변)이 형성된다. 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD)는 UV 노출의 일반적인 생성물이며 이의 농도로 DNA 손상을 정량화할 수 있다.

UV 조사 3시간 후 각질형성세포에서 IHC에 의한 CPD 검출의 밀도측정 분석을 가능하게 하는 시험관내 분석을 하기 프로토콜에 따라 수행하였다.

각질형성세포를 수확하고 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 배양하였다. 샘플을 UV 조사(UVR) 그룹과 비-UV 조사(모의) 그룹의 2개 그룹으로 분할하였다. 또한 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 태양광 모의 UV-조사에 의해 세포에 대해 UV-조사를 수행하였다. 조사 용액은 5mM D-글루코스를 포함하는 PBS였다.

조사 후, 칼시트리올, 비히클 대조군(Veh) 또는 0.5μM, 1μM, 2.5μM 또는 5μM 농도의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3; "IK")으로 각질형성세포를 처리하였다.

수확한 각질형성세포를 96 웰 플레이트에서 폴리-D-리신이 코팅된 커버슬립에 도말하고 5mM D-글루코스를 포함하는 PBS에서 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 조사(또는 모의 처리)하였다. UV-조사 3시간 후에 각질형성세포를 고정하였다. 이전에 기재된 바와 같이 면역조직화학 및 이미지 분석을 수행하였다(Gordon-Thomson et al., Photochem Photobiol Sci, 2012, 11(12):1837-47; Gupta et al., 상기 참조, Rybchyn MS et al., J Invest Dermatol,　2018;138(5):1146-1156). 10 ㎍/㎖의 항-티민 이량체 항체(시그마-알드리치, 미국 미주리주 소재)를 사용하여 티민 이량체를 검출하고, 이전에 기재된 바와 같이 CPD 지수로 정량화하였다(Douki T and Cadet J, Biochemistry,2001, 40(8):2495-501).

도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3 - 각각 "IK")은 태양광 모의 UV-조사에 노출된 일차 각질형성세포에서 CPD 수준을 용량 의존적 방식으로 감소시킨다. 5μM의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리된 각질형성세포는 칼시트리올로 처리된 각질형성세포와 CPD 수준에서 비슷한 감소를 보였고, 비히클-처리 UV-조사 각질형성세포와 비교하여 CPD 수준에서 통계적으로 유의한(*p<0.05) 감소를 보였다.

이 데이터는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3; "IK")이 UV-조사에 노출된 후 일차 각질형성세포에서 DNA 손상을 감소시킴을 입증한다.

도 8b에서, CPD 염색의 평균 강도 측면에서 CPD를 계산하였다. 중요한 것은, 도 8b는 10μM에서, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3; "IK")이 양성 대조군 1,25D보다 CPD 형성을 저해하는 데 더 효과적임을 입증한다는 것이다.

도 9 및 도 10은 하기 프로토콜에 따라 시험관내에서 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD)의 형성에 의해 입증된 바와 같이, UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3; "IK")의 효과를 예시한다.

상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 암컷 Skh:hr1 무모 마우스를 태양광 모의 UV-조사(UVR)에 노출시켰다. 조사 직후 마우스를 또한 실시예 4에 기재된 바와 같이 등쪽 표면에 국소적으로 처리하였다. 이후, UVR 3시간 후에 피부를 고정시키고, 상기 기재된 티민 이량체(CPD)에 대하여 10 ㎍/㎖으로 항체를 사용하여 면역-조직화학 염색을 수행하였다. 모노클로날 마우스 IgG 아이소타입 대조군으로는 유의한 염색이 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음). 도 9에서, 핵의 어두운 염색은 티민 이량체(CPD)의 존재를 나타내고, 염색된 면적 %가 제시되어 있다. 실시예 4에 따라 면역조직을 정량화하였다.

도 9a에 제시된 면역조직에서 볼 수 있고, 도 10에 정량화된 바와 같이, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)은 급성 UV-조사 후 Skh:hr1 마우스의 피부에서 CPD 형성을 저해한다.

CPD 핵에 대한 면역조직학적 데이터의 정량화는 비히클(음성) 대조군과 비교하여 UV-조사에 노출된 모든 처리 그룹에서 통계적으로 유의한 감소가 있었음을 입증하였다(** p<0.01, ****p<0.0001). 아이소타입 염색 대조군으로 사용된 모노클로날 마우스 IgG 아이소타입으로는 유의한 염색이 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때, 피부 세포에서 UV-조사에 의해 유도된 CPD 핵의 형성에 의해 측정된 바와 같이, DNA 손상을 감소시킴을 나타낸다.

실시예 6: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 아포토시스성 세포의 수를 감소시킨다.

도 11은 UV-조사 후 세포 아포토시스에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다.

상승된 CPD 형태의 UV-유도 DNA 손상은 표피 세포에서 돌연변이를 유도하여 암 세포의 발달을 야기할 수 있다. DNA 복구 효소의 적용을 통한 CPD의 감소는 UV-유도 손상 후 UV-유도 피부암의 위험을 예방하고 아포토시스성 세포의 수준을 감소시킨다. UV-조사 후 아포토시스성 피부 세포의 수를 하기 프로토콜에 따라서 평가하였다.

실시예 4의 방법에 따라 암컷 Skh:hr1 무모 마우스를 준비하고, 조사한 다음 생검하였다. 생검 전과, 조사 직후, 마우스를 베이스 로션 비히클(음성 대조군), 비히클 중 11.4 pmol/cm2의 칼시트리올(양성 대조군), 및 총 부피 100㎕ 중 20㎍, 100㎍ 또는 200㎍의 수 중 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리하였다.

UVR 3시간 후 UV-조사된 등쪽 피부로부터 생검을 채취하고 6시간 동안 Histochoice 고정액(Amresco, 미국 오하이오주 솔론 소재)으로 고정시켰다. 피부 샘플을 파라핀으로 포매시키고, 모든 분석을 위해 5 마이크로미터 절편으로 절단하였다. 일광화상 세포의 시각화를 위해 절편(UV 24시간 후)에 일상적인 헤마톡실린 및 에오신 염색을 수행하였다. 40× 배율의 Zeiss-Axioplan 광학 현미경 하에서 염색한 절편을 검사하고, 피부 절편의 선형 밀리미터당 일광화상 세포의 수를 기록하였다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 국소 적용은 UV-조사 후 아포토시스성 각질형성세포의 수를 감소시켰다.

이 데이터는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)이 UV-조사에 노출된 후 각질형성세포 아포토시스를 감소시킴을 입증한다.

실시예 7: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRRR은 UV-조사 손상 후 인간 피부에 국소적으로 적용될 때 DNA 손상을 감소시키고, 아포토시스성 일광화상 세포의 수를 감소시킨다.

도 12 및 도 13은 하기 프로토콜에 따라서, 인간 외식편에서 CPD의 형성에 의해 입증된 바와 같이 UV-유도 DNA 손상에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다.

선택적 수술에서 제거된 인간 피부를 세정하고, 절개한 다음 대략 5㎜×5㎜의 조각으로 절단하였다. 각각의 조각을 96 웰 플레이트의 웰에 배치하고, 개별 플레이트를 준비하여 처리 3시간 후 효과를 평가하였다. 각각의 처리에 대해 3중으로 모든 샘플을 수행하였다. 피부에 태양광-모의 UV 공급원으로부터의 UV-방사선을 1.5시간(UVR) 동안 처리하거나, 비-조사(모의)하였다. 인간 피부가 마우스 피부보다 더 두꺼운 것을 고려하여, 인간 피부 외식편을 마우스 피부에 사용된 것보다 3배 더 높은 방사선 선량, 즉 각각 20 J/cm2 대 7 J/cm2에 노출시켰고, 실험실 태양광 시뮬레이터의 출력 스펙트럼은 이전에 보고되었으며(Rybchyn MS et al, J Invest Dermatol. 2018 May;138(5):1146-1156), 직후에 비히클 대조군, 칼시트리올(1nM) 또는 50μM, 250μM 또는 500μM 농도의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리하였다.

3시간째에 수확한 샘플을 실시예 5에 기재된 바와 같이 고정시키고, 절편화한 다음, 염색하고 정량화하였다.

도 12에 제시된 면역조직에서 알 수 있는 바와 같이, UV-조사는 조사/처리 3시간 후 모든 조사된 그룹에서 CPD를 가지는 세포(어두운 점으로 예시됨)의 수를 증가시키며, 이때 칼시트리올 또는 다양한 농도의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리된 샘플은 염색된 세포가 더 적다. 이 데이터는 500μM의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리될 때 CPD 양성 세포의 백분율이 통계적으로 유의하게 감소된 두 개체에 대해 도 13a 및 도 13b에서 정량화되어 있다.

이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 조사 3시간 후에 급성 UV-조사 후 인간 피부 외식편에서 CPD의 형성을 감소시킬 수 있음을 나타낸다. 이는 또한 도 9 및 10에 제시된 마우스 결과를 확인시켜준다.

도 14 및 도 15는 인간 피부 외식편에서 아포토시스성 세포의 수에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다.

CPD에 대해 상기 기재된 바와 같이 피부 외식편을 배양하고, 조사하고, 처리한 다음, 처리 후에 실시예 6에 기재된 바와 같이 염색하고 정량화하였다.

도 14는 다양한 처리 그룹에서 UV-조사 3시간 후 인간 피부 외식편의 표피㎜당 일광화상 세포의 수를 나타낸다. 도 15는 다양한 처리 그룹에서 UV-조사 24시간 후 인간 피부 외식편의 표피㎜당 일광화상 세포의 수를 나타낸다.

도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 500μM의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 처리는 UV-조사 3시간 및 24시간 후에 아포토시스성 세포의 수를 통계적으로 유의하게 감소시킨다.

이 데이터는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)이 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 아포토시스성 일광화상 세포의 수를 감소시킴을 나타낸다.

실시예 8: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 시험관내 및 인간 피부 외식 편에서 기질 금속단백질분해효소-1(MMP-1) 활성을 저해한다.

UV-유도 피부 손상은 인간 피부 세포에서 MMP-1의 상승을 시작하여 광노화의 특징인 콜라겐의 파괴로 이어질 수 있다. 콜라겐 I 분해를 담당하는 주요 효소인 기질 금속단백질분해효소 1(MMP-1)은 햇빛에의 노출에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다(Dong KK et al, Exp Dermatol, 2008, 17(12): 1037-44).

MMP-1 활성에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 하기 프로토콜을 사용하여 평가하였다.

60분 동안 37℃에서 APMA로 활성화된 인간 류마티스 활막 섬유아세포 MMP-1 효소전구체를 활성 효소로 사용하였다. 5μM, 10μM, 800μM 및 1000μM 농도의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)을 pH 7.2의 변형된 MPOS 완충액 중에서 60분 동안 37℃에서 8nM 활성화 효소와 함께 사전 인큐베이션하였다. 4mM Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dap-Ala-Arg을 첨가한 다음 2시간의 인큐베이션 기간에 의해 반응을 개시하였다. 형성된 Mca-Pro-Leu-Gly 양의 결정을 340㎚/400㎚에서 분광형광법으로 판독하였다.

도 16은 시험관내 MMP-1의 활성에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시하고, 도 17 및 도 18은 UV-유도 피부 손상 후 인간 피부 외식편에서 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다.

도 16에서 볼 수 있는 바와 같이, 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)은 MMP-1 활성화를 용량 의존적 방식으로 저해한다. 이 데이터는 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)이 시간 경과에 따라 광노화를 감소시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.

인간 피부에서 MMP-1 활성에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 하기 프로토콜을 사용하여 평가하였다.

도 17 및 도 18은 하기 프로토콜에 따라서, MMP1 발현에 대한 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)의 효과를 예시한다.

선택적 수술에서 제거된 인간 피부(2× 인간 외식편 조직)를 세정하고, 절개한 다음 대략 5㎜×5㎜의 조각으로 절단하였다. 각각의 조각을 96 웰 플레이트의 웰에 배치하고, 개별 플레이트를 준비하여 처리 3시간 후 효과를 평가하였다. 피부에 태양광-모의 UV 공급원으로부터의 UV-방사선을 1.5시간(UVR) 동안 처리하거나, 비-조사(모의)하고, 직후에 비히클 대조군, 칼시트리올(1nM) 또는 50μM, 250μM 또는 500μM 농도의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리하였다. 도 17에서,μM 농도로 IK50, IK250 및 IK500은 각각 120㎕ 배양 배지/외식편당 15㎍, 75㎍ 및 150㎍의 IK34720을 지칭한다.

3시간째에 수확한 샘플을 고정시키고, 절편화한 다음, MMP1에 대하여 면역조직화학적으로 염색하고, 조사된 총 표피 영역의 함수로서 MMP1에 대해 염색된 표피 영역을 표현함으로써 MMP1 발현에 대하여 정량화하였다.

도 17에 제시된 면역조직에서 알 수 있는 바와 같이, UV-조사는 조사/처리 3시간 후 모든 조사된 그룹에서 MMP-1 활성에 대해 염색한 세포(어두운 점으로 예시됨)의 수를 증가시키며, 이때 칼시트리올 또는 다양한 농도의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리된 샘플은 염색된 세포가 더 적다. 아이소타입 염색 대조군으로 사용된 모노클로날 마우스 IgG 아이소타입으로는 유의한 염색이 관찰되지 않았다(데이터는 나타내지 않음).

이 데이터는 500μM의 폴리펩타이드 IK34720(서열번호 3)으로 처리될 때 MMP1 양성 세포의 백분율이 통계적으로 유의하게 감소된 외식편에 대해 도 18에서 정량화되어 있다. 이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 UV-조사에 의해 유도된 MMP1 발현을 감소시킴을 나타낸다.

실시예 9: 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 진피 피부 섬유아세포 세포 용해물에서 UV-유도 지질 과산화를 저해한다.

포화 지질과 대조적으로 다중불포화 지방산(지질)은 피부의 천연 오일 장벽을 유지하는 데 도움을 주기 때문에, 다중불포화 지방산(지질)은 비누, 스킨 케어 로션 및 크림, 애프터쉐이브, 메이크업 리무버 등으로서 화장료에 자주 사용된다. 더욱이, 지질 포화도가 낮을수록 지질의 유동성은 더 높아진다. 그러나, 불포화 지질은 UV-조사와 같은 작용물질에 의해 산화되기가 더 쉬우므로 항산화제, 예를 들어 비타민이 종종 스킨 케어 제형에 첨가된다.

산화제는 지질 구조를 변경하여 티오바비투르산-반응성 물질(TBARS)로 측정될 수 있는 말론다이알데하이드의 형성을 초래하는 지질 과산화물을 생성할수 있다.

실시예 4에 나타낸 바와 같이, 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR은 UV-조사 후 피부에 국소적으로 적용될 때 피부에서 UV-유도 산화 스트레스를 감소시킨다.

세포-유래 지질의 UV-유도 산화 손상을 변경시키는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR의 능력을 TBARS 티오바비투르산-반응성 물질(TBARS) 지질 과산화 분석을 사용하여 조사하였다.

진피 섬유아세포의 조사 또는 모의-조사 후, 상청액(900㎕)을 수집하였다. 간단히 말해서, 90㎕의 뷰틸화 하이드록시톨루엔(에탄올 중 2% w/w)을 첨가하고 TBARS 분석을 할 때까지 샘플을 냉동(-20℃) 유지하였다. 페트리 접시를 1㎖의 HBSS로 2회 세척하고, 세포를 600㎕의 물에서 긁어낸 다음 60㎕의 0.5% 수성 Triton X100을 이 용액에 첨가하여, 로리(Lowry) 방법에 의해 단백질 측정을 수행하였다(Lowry OH et al, J. Biol. Chem., 1951, 193:265 - 275). 기재된 바와 같이 TBARS를 형광분석으로 분석하였다(

P et al, Biochim. Biophys. Acta, 1991, 1084:261-268). 간단히 말해서, 산성 조건에서 티오바비투르산의 존재 하에 해동한 샘플을 가열시키고, TBARS를 1-뷰탄올로 추출한 다음 형광분석으로 정량화하였다(λexc = 515㎚ 및 λem = 550㎚). 분석 조건에서 말론다이알데하이드-티오바비투르산 부가물을 정량적으로 산출하는 테트라에톡시프로판을 보정에 사용하였다. 말론다이알데하이드(MDA) 등가물로 표현된 TBARS 값을 각각의 페트리 접시에 대한 세포 단백질에 대하여 정규화하였다. 각각의 TBARS 결정을 3중으로 수행하였다(예를 들어, 데이터 포인트당 3개의 페트리 접시 이용).

도 19에서 볼 수 있는 바와 같이, UV-조사는 조사/처리 후 모든 조사된 그룹에서 TBA 반응성 물질(TRS)의 수를 증가시킨다. 처리의 부재 하에 모의와 UV 조사 사이의 TRS의 유의한 차이는 더 낮은 용량의 RSKAKNPLYRRRRRRRRR과 비교하여 가장 높은 농도(5μM)의 1,25D 또는 RSKAKNPLYRRRRRRRRR("IK-3")의 존재 하에서 보이지 않는다.

이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 진피 피부 섬유아세포 세포 용해물에서 세포-유래 지질의 UV-유도 산화 손상을 감소시킴을 나타낸다.

실시예 10: 멜라닌 생성에 대한 IK14800의 효과.

UVA에 의한 흑색종 유도는 멜라닌 색소를 필요로 하며 UVB 조사로 흑색종을 개시하게 된다. 스킨 케어 제품의 바람직한 효과는 일광 노출로 인해 생기는 피부 색소침착을 감소시키는 것이다.

실시예 2는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 각질형성세포가 태양광 모의 UV-조사에 노출된 후 적용될 때 일차 각질형성세포에서 pCREB 형성을 저해함을 나타낸다. 인산화된 CREB는, 멜라닌 세포에서 티로시나제 및 다른 색소 생합성 효소의 발현을 유도하는 myc-유사 마스터 전사 인자인 소안구증(MITF) 전사 인자의 활성화를 유도한다.

멜라닌 생성을 변경시키는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR의 능력을 조사하였다.

간단히 말해서, MM1418-C1 옅은 색소 흑색종 세포를 24 웰 배양 플레이트에서 성장시키고 10μM RSKAKNPLYRRRRRRRRR("IK-3")로 24시간 동안 처리한 후 2 kJ/m2 UVB 방사선에 노출시켰다. "Con" 및 "UVB"로 각각 표지된 대조군(RSKAKNPLYRRRRRRRRR로 처리하지 않음)을 0 또는 2 kJ/m2 UVB 방사선에 노출시켰다. 세포 그룹을 24시간 동안 인큐베이션으로 되돌린 다음, 세포의 멜라닌 및 단백질 수준을 분광광도법으로 측정하였다. 각각의 실험에서 3개의 샘플을 측정하였다. 도 19에 나타낸 데이터는 UVB 방사선에 노출되기 전 0 또는 10μM의 RSKAKNPLYRRRRRRRRR로 24시간 동안 사전 처리한 0 또는 2 kJ/m2 UVB에 노출된 평균 값 ± SEM(멜라닌㎍/세포 단백질㎎)을 나타낸다. t-검정(양측 검정)을 사용하여 통계적 유의성을 결정하였으며, *p<0.05, ***p<0.001이었다.

도 20에서 볼 수 있는 바와 같이, UVB-조사는 세포의 멜라닌 함량을 상당히 증가시킨다. 중요한 것은, UVB 처리 전에 RSKAKNPLYRRRRRRRRR로 처리한 세포는 RSKAKNPLYRRRRRRRRR로 처리하지 않은 세포에 비해 멜라닌 함량의 현저한 감소를 나타낸다는 것이다.

이는 폴리펩타이드 RSKAKNPLYRRRRRRRRR이 UVB에 의한 멜라닌 유도를 감소시킴을 나타낸다.

본 명세서에 기재된 모든 방법은 본 명세서에서 달리 나타내지 않거나 문맥이 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 임의의 및 모든 실시예, 또는 예시적인 언어(예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 예시적인 실시형태를 더 잘 설명하시 위한 것으로 의도되며 달리 청구되지 않는 한 청구된 발명의 범주에 제한을 두지 않는다. 명세서에서 어떤 언어도 어떠한 비-청구 요소를 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석하여서는 안 된다.

본 명세서에서 제공되는 설명은 일반적인 특징 및 특성을 공유할 수 있는 여러 실시형태와 관련된다. 하나의 실시형태의 하나 이상의 특성은 다른 실시형태의 하나 이상의 특성과 결합가능할 수 있음을 이해하여야 한다. 추가적으로, 실시형태의 단일 특성 또는 특성의 조합은 추가적인 실시형태를 구성할 수 있다.

당업자는 본 명세서에 기재된 본 발명이 구체적으로 기재된 것 이외의 변화 및 변형에 민감하다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 이와 같은 모든 변화 및 변형을 포함함을 이해하여야 한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 개별적으로 또는 집합적으로 언급되거나 표시된 모든 단계, 특성, 조성물 및 화합물, 및 임의의 둘 이상의 단계 또는 특성의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 주제 표제는 독자의 참조 편의를 위해서만 포함되며, 본 개시내용 또는 청구범위 전체에 걸쳐 발견되는 주제를 제한하는 데 사용되어서는 안된다. 주제 표제는 청구범위 또는 청구범위 제한의 범주를 해석하는 데 사용되어서는 안된다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 이미 달리 지시하지 않는 한 복수 양태를 포함한다는 것에 유의해야 한다. 이에 따라, 용어 하나, "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.

Claims (53)

1. 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(rylpnkaksr; 서열번호 2), 및 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역을 포함하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(rylpnkaksr; 서열번호 2)는 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역에 인접한, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 상기 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1), 또는 상기 아미노산 서열의 덱스트로-리버소 형태(rylpnkaksr; 서열번호 2)의 N-말단 및/또는 C-말단인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열 RSKAKNPLYR(서열번호 1)은 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역에 대한 N-말단인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아미노산 서열(rylpnkaksr; 서열번호 2)은 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역에 대한 C-말단인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 4 내지 20개의 아르기닌 잔기를 포함하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아르기닌 아미노산 서열 영역은 8개의 아르기닌 잔기를 포함하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 C-말단에서 변형된, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 상기 폴리펩타이드의 C-말단에서 아마이드화된, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 D 아미노산을 포함하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
11. 아미노산 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3), 또는 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)을 포함하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
12. 아미노산 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3), 또는 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)로 이루어진, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 CREB 인산화를 저해하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 8-OHdG 형성을 저해하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 사이클로부탄 피리미딘 이량체(CPD) 형성을 저해하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 ATP 수준 및/또는 TGFβRII 발현을 증가시키는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 기질 금속단백질분해효소 1(MMP1) 발현 및/또는 MMP1 활성을 저해하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 세포 또는 세포외 성분의 산화 손상을 저해하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 자외 방사선 손상 복구를 증가시키는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 DNA 손상을 저해하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상처 치유를 촉진시키거나, 피부 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
22. 상처 치유를 촉진시키거나, 피부 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 단리 또는 정제된 폴리펩타이드로서,
    아미노산 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3), 또는 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)을 포함하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
23. 상처 치유를 촉진시키거나, 피부 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 단리 또는 정제된 폴리펩타이드로서,
    아미노산 서열 RSKAKNPLYRRRRRRRRR(서열번호 3), 또는 rrrrrrrrrylpnkaksr(서열번호 4)로 이루어진, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드
24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 산화 손상인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 DNA 손상인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 일광 노출에 의해 유도된 손상인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 자외 방사선 유도 손상인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
28. 제27항에 있어서, 상기 자외 방사선 유도 손상은 UVB 유도 손상 또는 UVA 유도 손상인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
29. 제21항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하는, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
30. 제21항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 피부 노화 및/또는 피부 주름인, 단리 또는 정제된 폴리펩타이드.
31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드 및 국소적으로 적용가능한 담체를 포함하는 국소적으로 사용하기 위한 조성물.
32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드 및 국소적으로 적용가능한 담체를 포함하는, 국소 조성물.
33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상처 치유를 촉진시키거나, 피부 병태를 치료 및/또는 예방하기 위한 하나 이상의 추가 활성제를 포함하는, 조성물.
34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 지질 및/또는 하나 이상의 추가 활성제를 추가로 포함하는, 조성물.
35. 제34항에 있어서, 상기 단리 또는 정제된 폴리펩타이드는 하나 이상의 지질 및/또는 하나 이상의 추가 활성제를 산화 손상으로부터 보호하는, 조성물.
36. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드 및 화장용으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 화장료 조성물.
37. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드 및약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
38. 국소 조성물, 화장료 조성물, 및/또는 약제학적 조성물의 제조에 있어서 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드의 용도.
39. 포유동물에서 상처 치유를 촉진시키거나, 피부 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
    제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 포유동물에서 상처 치유를 촉진시키거나, 피부 병태를 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
    제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 포유동물, 상처, 또는 피부 병태 부위에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 피부 병태는 산화 손상인, 방법.
42. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 피부 병태는 DNA 손상인, 방법.
43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 일광 노출에 의해 유도된 손상인, 방법.
44. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 자외 방사선 유도 손상인, 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 자외 방사선 유도 손상은 UVB 유도 손상 또는 UVA 유도 손상인, 방법.
46. 제39항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 CPD 및/또는 8-OHdG 형성을 특징으로 하는, 방법.
47. 제39항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피부 병태는 피부 노화 및/또는 피부 주름인, 방법.
48. 세포에서 기질 금속단백질분해효소 1(MMP1) 발현 및/또는 MMP1 활성을 저해하는 방법으로서,
    세포를 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
49. 대상체의 피부에서 기질 금속단백질분해효소 1(MMP1) 발현 및/또는 MMP1 활성을 저해하는 방법으로서,
    피부를 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
50. 세포에서 CREB 인산화를 저해하는 방법으로서, 세포를 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
51. 세포에서 8-OHdG 형성을 저해하는 방법으로서,
    세포를 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
52. 세포에서 CPD 형성을 저해하는 방법으로서, 세포를 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물로 처리하는 단계를 포함하는, 방법.
53. 피부의 세포외 기질에 대한 손상을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서,
    제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 단리 또는 정제된 폴리펩타이드, 또는 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 피부에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.

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