CN112321723B - 一种抗皮肤光老化多肽类化合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，更具体地公开了一种抗皮肤光老化多肽FCC，通过基因工程重组表达技术进行表达纯化和规模化制备。本发明提供的多肽类产物FCC，其具有抗皮肤光老化的性能，并且有影响细胞粘附、修复受损皮肤细胞的能力，在护肤品、化妆品和细胞培养基质中具有广阔的应用前景。

Description

一种抗皮肤光老化多肽类化合物及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种抗皮肤光老化多肽类产物FCC及其应用。

背景技术

我国经济高速发展，人民群众对美好生活的需要日益增长。随着生活质量的提高与社交活动的增多，皮肤，作为人体最重要的天然屏障和最大的器官，日常保养与维护至关重要。皮肤分为表皮层和真皮层，表皮在皮肤的最外层，负责防异物、保水、防菌、阻挡紫外线作用；真皮层是致密的结缔组织，具有韧性和弹性，也具有丰富的血管和神经。胶原蛋白分子在真皮层与弹力纤维交互成网状以此起支撑作用。然而由于生活节奏的加快，人民群众容易忽略对自身肌肤保养的注重，皮肤过敏、油脂聚集、光老化、体内激素分泌混乱等一系列负面因素导致皮肤收到不同程度的伤害。当皮肤屏障受到破坏时，皮肤会出现因水分流失、干燥继而容易产生皱纹、起皮等症状；因黑色素沉着出现斑点影响外观；因油脂排泄不通畅而产生暗疮；因角质层功能受损产生敏感肌肤。尤其进入中年期的男性和女性，体内维持皮肤活力的胶原蛋白会逐渐流失，当发现皮肤受损时，人们便会倾向于寻找一种有效、安全、便捷的美容护肤品来修复自身皮肤。

细胞外基质ECM是由细胞分泌、分布于细胞外的蛋白质和多糖等大分子构成的网络结构，包括有胶原蛋白等对皮肤正常生理活性具有重要影响的物质。胶原蛋白是一种重要蛋白质，具有高效的生物活性，在皮肤修复，抗光老化方面有显著的功效。当人体皮肤受到日光紫外长时间照射后，体内胶原蛋白流失，会使皮肤萎缩、松弛、变皱等老化现象。而纤连蛋白广泛参与细胞迁移、粘附，具有促进皮肤组织修复的作用。目前，胶原蛋白的处理有化学法和酶法等，传统上的胶原蛋白多来自哺乳动物或家禽动物类的组织提取物，则纤连蛋白从血浆制品上获得。因此，利用传统技术获得的商品化的胶原蛋白和纤连蛋白容易产生免疫排斥反应，两者的有效性和安全性存有质疑。同时，胶原蛋白和纤连蛋白都是大分子物质，不容易穿过皮肤屏障，难以到达皮肤所需部位。

众多报道得知，多肽类物质对于人体皮肤具有良好的相容性和功效性。本申请人先前已经设计了一种类人胶原蛋白RHC((Recombinant Human-Like Collagen)，制备方法参见文献：“Hybrid Freeze-Dried Dressings Composed of Epidermal Growth Factorand Recombinant Human-Like Collagen Enhance Cutaneous Wound Healing in Rats”，Frontiers in Bioengineering and Biotechnology,July 2020,vol.8,Article 742)。经过实验论证，该RHC克服了部分动物来源胶原蛋白的缺点，并且可促进细胞生长，修复受损组织，但对光热敏感，稳定性存在缺陷。为此，我们从ECM中人源胶原蛋白的结构和特性入手，设计了系列新的分子并利用基因工程技术手段高效表达，获得一种具有抗皮肤光老化的功效，促进皮肤受损细胞恢复原有功能，继而修复皮肤组织的安全有效稳定的新型融合蛋白，并可以规模化生产并进一步开发为上市产品。

发明内容

为了满足上述需求，本发明人提供了一种多肽融合蛋白FCC，其中利用基因工程手段，将胶原片段与纤连蛋白片段结合，形成新的一种多肽融合蛋白，使其具有高渗透性、高修复性、高安全性等特点。

因此，本发明提供以下各项：

1.一种抗皮肤光老化多肽FCC，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列包括含有1)或2)的氨基酸序列：

1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经保守取代、缺失或添加一个以上(优选1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)且具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能(例如抗皮肤光老化功能、影响细胞粘附作用、修复受损皮肤细胞)的氨基酸序列，优选地，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能(例如抗皮肤光老化功能、影响细胞粘附作用、修复受损皮肤细胞)的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性不低于90％(优选不低于95％、96％、97％、98％或99％的同源性，或100％同源性)。

2.根据以上1所述的多肽FCC，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.编码以上1-2中任一项所述的多肽FCC的核酸分子。

4.根据以上3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的DNA序列包括含有1)或2)的DNA序列：

1)SEQ ID NO:2所示的DNA序列；

2)SEQ ID NO:2所示的DNA序列经保守取代、缺失或添加一个以上(优选1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碱基，且具有与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子，优选地，所述与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO:2所示的DNA序列的同源性不低于90％(优选不低于95％、96％、97％、98％或99％的同源性，或100％同源性)。

5.融合多肽，其包含：以上1或2所述的多肽FCC，和在所述多肽FCC的N端和/或C端的一个或多个(例如1-10个，特别是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)His标签，优选地所述融合多肽序列如SEQ ID NO:3所示，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO:4所示。

6.一种重组表达载体，其包含以上3或4所述的核酸分子。

7.以上1或2所述的多肽FCC、以上3或4所述的核酸分子编码的多肽、或以上5所述的融合多肽在制备用于细胞抗光老化的化妆品(护肤品)中的应用。

8.以上1或2所述的多肽FCC、以上3或4所述的核酸分子编码的多肽、或以上5所述的融合多肽在制备修复细胞的化妆品(护肤品)中的应用。

9.以上1或2所述的多肽FCC、以上3或4所述的核酸分子编码的多肽、或以上5所述的融合多肽在制备促细胞粘附的化妆品(护肤品)中的应用。

10.以上1或2所述的多肽FCC、以上3或4所述的核酸分子编码的多肽、或以上5所述的融合多肽在制备皮肤光老化损伤的组织再生和修复方面的产品中的应用。

11.根据以上10所述的应用，其特征在于，所述产品为护肤品或化妆品。

综上，本发明公开了一种抗皮肤光老化多肽FCC，通过基因工程的方法在体外进行表达纯化。本发明提供的一种多肽类化合物FCC，其具有抗皮肤光老化，并且有影响细胞粘附、修复受损皮肤细胞的功能，在护肤品和化妆品中具有广阔的应用前景。

发明详述

除非另外指出，本文中所用术语具有本领域技术人员理解的一般技术含义。对于本领域的定义和术语，特别推荐技术人员参考Sambrook等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor出版社，Plainsview，New York(1989)；以及Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(Supplement 47)，JohnWiley&Sons，New York(1999)。

本发明提供一种抗皮肤光老化多肽类蛋白FCC，其成分安全可靠，具有促细胞粘附，修复皮肤细胞，抗皮肤光老化等的功效。

本发明的第一方面提供一种多肽FCC，其氨基酸序列包括有1)或2)的氨基酸序列：

1)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经保守取代、缺失或添加一个以上且具有与SEQID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列，优选地，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性不低于90％。

本发明中，所述多肽FCC的氨基酸序列包括含有1)的氨基酸序列是指1)的氨基酸序列为多肽FCC的必须包含的氨基酸序列，且是连续的序列，除了1)的氨基酸序列外多肽FCC的氨基酸序列中还可以含有其他的氨基酸，但其他的氨基酸选择必须满足不影响多肽FCC的必须包含的氨基酸序列的生物学活性。

本发明的一些优选实施方式中，所述多肽FCC的氨基酸序列为含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC的氨基酸序列还可以是含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经保守取代、缺失或添加一个以上且具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能(例如抗皮肤光老化功能、影响细胞粘附作用、修复受损皮肤细胞)的氨基酸序列。

本发明的另一些实施方式中，所述多肽FCC的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经保守取代、缺失或添加一个以上且具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。保守取代针对氨基酸序列时是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的不同氨基酸残基取代，或者对那些对多肽的活性并非至关重要的氨基酸的取代。例如，可以在非极性侧链氨基酸残基间(例如Met、Ala、Val、Leu和Ile、Pro、Phe、Trp)、不带电的极性侧链残基间(例如Cys、Ser、Thr、Asn、Gly和Gln)、酸性侧链残基间(例如Asp、Glu)、碱性侧链氨基酸间(例如His、Lys和Arg)、β分支侧链氨基酸间(例如Thr、Val和Ile)、含硫侧链氨基酸间(例如Cys和Met)或芳香侧链残基间(例如Trp、Tyr、His和Phe)进行保守取代。在某些实施方式中，缺失或添加也可以认为是“保守取代”。缺失或添加的氨基酸的数量的范围可以为约1至10(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)。保守取代通常不引起蛋白构象结构上的显著变化，并且因此能保持蛋白的生物学活性。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC的氨基酸序列为含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经保守取代、缺失或添加一个以上且具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列，且所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的同源性不低于90-95％。

本发明中，关于核酸或氨基酸序列的术语“％同源性”表示在所述序列之间的同源性的水平，并且可以通过本领域本身已知的技术确定。各种各样的序列比对方法中的任一种可以用于确定同源性百分比，包括但不限于全局方法、局部方法和杂交方法。确定同源性百分比的方案是本领域技术人员范围内的常规程序。全局方法从分子的开始到结束比对序列，并通过将各个核苷酸对的分数相加以及通过施加空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W，参见例如Julie D.Thompson等，CLUSTAL W:Improving theSensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment Through SequenceWeighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680(1994)；和迭代细化。非限制性方法包括例如BLAST、Match-box，参见例如Align-M，参见例如，Ivo Van WaIIe等，Align-M-A New Algorithmfor Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences，20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。

本发明中，“多肽FCC”与“蛋白多肽FCC”均指本发明第一方面提供的多肽。

本发明中，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列是指将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列取代、缺失或添加一个以上氨基酸后，获得的多肽具有与SEQ ID NO:1所示的氨基酸获得的多肽同等生物学活性。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC可采用分子克隆或化学合成等常规方法获得。

本发明的一些优选实施方式中，所述多肽FCC可采用分子克隆或化学合成等常规方法获得。

本发明第二方面提供编码所述多肽FCC的核酸分子。

本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的DNA序列包括含有1)或2)的DNA序列：

1)SEQ ID NO:2所示的DNA序列；

2)SEQ ID NO:2所示的DNA序列经保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且具有与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子，优选地，所述与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO:2所示的DNA序列的同源性不低于90％。

本发明的一些优选的实施方式中，所述核酸分子的DNA序列包含SEQ ID NO:2所示的DNA序列。

本发明的另一些优选的实施方式中，所述核酸分子的DNA序列包含SEQ ID NO:2所示的DNA序列。

本发明的一些实施方式中，所述核酸分子DNA序列为含有SEQ ID NO:2所示的DNA序列经保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且具有与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子。

本发明的另一些实施方式中，所述核酸分子DNA序列为含有SEQ ID NO:2所示的DNA序列经保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且具有与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子。

本发明的一些实施方式中，所述核酸分子的DNA序列为SEQ ID NO:2所示的DNA序列经保守取代、缺失或添加一个以上碱基，且具有与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子，且所述与SEQ ID NO:2所示的DNA序列具有相同功能的DNA分子的DNA序列与SEQ ID NO:2所示的DNA序列的同源性不低于90％-95％。

本发明第三方面提供一种用于表达上述重组人胶原蛋白肽的载体(例如表达载体)，优选为pET-20b。

本发明第四方面提供的一种宿主细胞，其包括上述的表达载体，所述宿主细胞优选为BL21。

本发明第五方面提供的一种上述重组人胶原蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：(1)在宿主细胞中表达根据以上3或4或5所述的核酸；(2)收集和/或纯化所述重组人胶原蛋白肽。

本发明第六方面提供一种表达框，其包含编码所述的多肽FCC的核酸分子。

本发明第七方面提供一种在多肽FCC的N端和/或C端连接一个或多个HIS标签构成的多肽。

本发明第八方面提供所述的多肽FCC或所述的核酸分子编码的多肽FCC在促细胞粘附、改善细胞活力的应用。

本发明第九方面提供的多肽FCC或所述的核酸分子编码的多肽FCC在制备护肤品中的应用。

本发明第十方面提供的多肽FCC或所述的核酸分子编码的多肽FCC在制备化妆品中的应用。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC修复细胞的效果由促进正常Hacat细胞的粘附能力，迁移效果等情况来进行评价的。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC对于细胞抗光老化的效果由下调正常HSF细胞的降解细胞外基质的相关基因等情况进行评价的。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC对于稳定性的效果由FCC和类人胶原的对比实验等情况进行评价的。

发明的一些实施方式中，所述多肽FCC对于安全性的效果由体外细胞和体外动物实验等情况进行评价的。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC修复损伤皮肤的效果由修复动物损伤皮肤实验等情况来进行评价的。

本发明的一些实施方式中，所述多肽FCC可与其他辅料混合制备成护肤品或化妆品或细胞培养基质。

本发明是从多肽类物质抗皮肤光老化的功效来获得发明思路。通过对不同的多肽类物质进行分析、筛选、组合，进而获得一种多肽类融合蛋白，FCC。所述的FCC具有较高的促细胞恢复能力，且具有较高的稳定性、可溶性、高吸收性，可作为原料应用于化妆品，护肤品，及细胞培养基质等领域中。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1为本发明实施例中所用的大肠杆菌重组表达质粒pET20b-FCC的构建图谱。

图2示出本发明的多肽FCC的核酸DNA序列的扩增片段的琼脂糖凝胶电泳图。

其中“M”指的是琼脂糖凝胶电泳marker，“-”指的是阴性对照，“+”指的是目的片段的扩增，约1800bp。

图3示出该FCC的蛋白菌种诱导聚丙烯酰胺凝胶电泳图。其中“M”指的是聚丙烯酰胺凝胶电泳marker，“1”指的是未诱导前的菌种的样品，“2”指的是诱导后的菌种生产蛋白的样品。

图4示出该FCC的蛋白进行蛋白免疫印迹实验的结果。其中，“M”指的是聚丙烯酰胺凝胶电泳marker，“1”指的是目的蛋白的样品。

图5示出该FCC对Hacat细胞粘附检测的结果。

图6及图7示出FCC与不同结构的类人胶原蛋白的Phalloidin免疫荧光的粘附实验结果，其中，图7示出FCC与FCC-1等蛋白的荧光对比图。图7中A示出各组间的细胞粘附数量。B示出不同组间的粘附细胞伸展面积。结果显示，在设计的一系列蛋白(FCC,FCC-1，FCC-2，FCC-3和FCC-4)之中，本发明的FCC具有最优的促粘附的效应。

图8示出FCC的Hacat细胞的结晶紫的粘附实验结果。本发明的FCC对细胞促粘附能力有明显作用，且与RHC的促粘附作用相似。

图9示出该FCC的Hacat细胞的Phalloidin免疫荧光的粘附实验结果。

图10示出FCC与RHC的Hacat细胞的荧光对比。A显示各组间的细胞粘附数量，B显示不同组间的粘附细胞伸展面积。本发明的FCC对细胞促粘附能力有明显作用，且与RHC的促粘附作用功效相似。

图11和图12示出该FCC的细胞划痕修复活性检测结果。图11显示细胞划痕实验给药48h后。1.给药前；2.给药48h的空白组；3.类人胶原RHC浓度：0.625μmol/L；4.FCC浓度：0.625μmol/L。结果显示，本发明的FCC的细胞划痕修复活性对于对照组有明显修复效果，且与类人胶原功效相似。

图13示出正常HSF细胞(A)；UVB照射后的HSF细胞(B)；正常添加FCC的HSF细胞(C)；UVB照射后添加FCC的HSF细胞(D)；UVB照射后添加类人胶原的HSF细胞(E)。

图14示出该FCC对于HSF细胞的抗光老化实验结果。结果显示，本发明的FCC对细胞具有抗光老化和抗衰老作用。

图15示出该FCC稳定性实验结果。结果显示，本发明FCC的稳定性比RHC高。

图16示出该FCC对体外眼刺激性实验结果。结果显示，本发明的FCC对兔角膜上皮细胞SIRC没有刺激性或微刺激性。

图17示出该FCC样品的GPS均值以及小鼠耳廓重量均值(mg)。结果显示，各组动物未见明显皮肤变态反应，证明FCC安全性高。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

下面通过具体的实施例对本发明作进一步的阐述：

实施例1

pET20b-FCC重组质粒构建与鉴定

本发明所述的多肽FCC，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明采用人工方法构建pET20b-FCC重组质粒。在编码核苷酸序列的5’端和3’端分别引入EcoR V和Hind III酶切位点(参见SEQ ID NO:4)。为方便后续纯化，在5’端和3’端分别加上6个组氨酸标签(参见SEQ ID NO:3)，通过EcoR V/Hind III双酶切将其连入pET20b载体(购自金唯智公司)，得到pET20b-FCC重组质粒(图1)。

FCC蛋白的表达

将基因表达载体进行转化，在LB固体培养基中(含100μg/mL的氨苄青霉素)挑选阳性克隆，并将阳性克隆接种于LB液体培养基中(含100μg/mL的氨苄青霉素)，37度培养3-5小时至OD₆₀₀为0.5，加入IPTG至终浓度为1mM，37摄氏度诱导培养4小时，离心收集菌体。

FCC蛋白的纯化

将发酵所得菌体加入pH＝7.0的PBS缓冲液，采用均质机400bar进行破碎，然后高速离心20分钟，将收集得到的上清经镍柱(Ni Sepharose 6Fast Flow，购自GE公司)纯化，上样流速0.6mL/min。再用pH＝7.0的PBS缓冲液平衡，采用咪唑梯度洗脱，在300mM时收集流出峰，洗脱样品经G25脱盐，即得到高纯度的蛋白。通过SDS-PAGE蛋白胶以及WesternBlotting对重组蛋白的分子量大小和免疫学验证(参见图2、图3和图4)。

实施例2

多肽FCC的Hacat细胞粘附实验。

于96孔板中加入每孔50μl不同浓度的以上制备的FCC蛋白溶液和空白水溶液对照无菌条件下吹干。调整Hacat细胞(人类永生化角质细胞，购自ATCC)浓度，按照每1ml含1.0*10^5～1.5*10⁵个细胞的细胞悬液铺板，每孔100μl，于37℃、5％二氧化碳条件下培养5～6小时，PBS清洗2次，培养数小时后每孔加入MTT 10ul，于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养4h，吸去培养液，加入终止液DMSO，每孔100μl，在酶标仪以630nm为参比波长，在波长570nm处测定吸光度，记录测定结果。见图5。

结论：多肽FCC促细胞粘附实验如图所示：在0.0024μmol/L～10μmol/L的浓度之间，FCC对Hacat细胞具有促进粘附作用。在0.625μmol/L的浓度下，FCC对Hacat细胞的促进粘附作用最佳。

实施例3

HSF细胞Phalloidin免疫荧光粘附实验筛选系列肽段并获得最优分子FCC

细胞黏附与细胞膜上的整合素受体密切相关。多肽(胶原蛋白)配体内的RGD结构域能与细胞膜上的整合素受体特异性结合，根据这一理论设计了系列蛋白(FCC,FCC-1，FCC-2，FCC-3和FCC-4)，并采用HSF细胞Phalloidin免疫荧光粘附实验进行筛选。FCC-1，FCC-2，FCC-3和FCC-4的制备方法同FCC。

FCC-1，FCC-2，FCC-3和FCC-4的氨基酸序列如下：

FCC-1的氨基酸序列

MTVVPDFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGVPGERVSLPASAHFPHRLVISHSAIRRFLPIRLVWQAQRGHGWPISRPIGAGQHQAEGRRGEKGPAGESGAPGEPGAPLFRGPAGPNGIPGEKGPAGERGAPGERGAPGFRGPAGPNGIPSSPTQRPTPAPTRPPTKKPDPPCKPSETVVQGVTSVCKGALH

FCC-2的氨基酸序列

LTVAYDIFTAFHFGLTRTRDWKPEKLVYGRGDEGGSEGSEGEGQSTVSDVPRDLEVVAATPTSTRGRRSRHQPSTTGAHGPLKTDG

FCC-3的氨基酸序列

MFGPSSRRGLLPIRLPWQDQLGAKLETIFDLSLVDICHGVARGPQSSVPTAKIEAIAPTGWLEVTLPDDGFSLFAFHGKLNEEMDGLEAGHWARDITKPKDGVWTFRDRAARLKVGDKVYFQRGDGWTRSGPLGLFPGHDYTVTVYAGTGRGHSPAHSKPISISFRTEVDKP

FCC-4的氨基酸序列

MGPIWHFPVTKNHYYANKVNEALAAPIGWLEVTLPDDGFSLFAFHGKLNEEMDGIEDGHWVREISKPKDGVRTLRDRTAGLK

具体实验如下：于24孔板中加入2.0*10^5～2.5*10⁵个细胞的细胞悬液铺板，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，然后加入0.625μmol/L的FCC-1，FCC-2，FCC-3，FCC-4和FCC，继续于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，然后用PBS洗2次，加入Phalloidin一抗(购自索莱宝公司，北京)，4摄氏度过夜孵育，加入免疫荧光二抗(购自碧云天公司，上海)，加入DAPI，封片，在荧光显微镜下观察细胞的荧光。实验结果见图6，统计结果见图7。

结论：如图6和图7所示，从荧光图上观测，在同等浓度下，FCC比FCC-1，FCC-2，FCC-3，FCC-4具有更好的促细胞粘附作用，这不能通过简单的分子设计预料到。

实施例4

多肽FCC的Hacat细胞的结晶紫的粘附实验。

于24孔板中加入2.0*10⁵～2.5*10⁵个细胞的细胞悬液铺板，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，然后加入0.625μmol/L的以上制备的FCC和同等浓度的类人胶原蛋白，继续于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，然后用PBS洗2次，加入结晶紫溶液，观察细胞染色形态。实验结果见图8。

结论：在同等浓度情况下，FCC对Hacat细胞的促进粘附作用与RHC对Hacat细胞的促进粘附作用相类似，证明FCC具有与RHC相类似的促进细胞粘附作用。

实施例5

多肽FCC的Hacat细胞的Phalloidin免疫荧光的粘附实验。

于24孔板中加入2.0*10^5～2.5*10⁵个细胞的细胞悬液铺板，于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，然后加入0.625μmol/L的上述FCC和RHC，继续于37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，然后用PBS洗2次，加入Phalloidin一抗(购自索莱宝公司，北京)，4摄氏度过夜孵育，加入免疫荧光二抗(购自碧云天公司，上海)，加入DAPI，封片，在荧光显微镜下观察细胞的荧光。实验结果见图9。统计结果见图10。

结论：Phalloidin免疫荧光的粘附实验如图所示：从荧光图上观测，在同等浓度下，FCC对细胞的促粘附作用与RHC的促粘附作用相类似。与对照组相比，统计结果表明，细胞的粘附数量和细胞延伸面积FCC也具有与RHC相同的有显著性增长的效果。结果表明，FCC具有与RHC同样的良好的促粘附效果。

实施例6

多肽FCC的Hacat细胞划痕实验。

培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记(方便拍照时定位同一个视野)。细胞消化后接入12孔板，数量以贴壁后铺满板底为宜(数量少时可培养一段时间至铺满板底，确保细胞达到100％融合的密度)。细胞长满板底后，用100μl枪头垂直于孔板，沿板背面划线的相同位置制造细胞划痕，尽量保证各个划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入含上述FCC蛋白(浓度0.625μmol/L)的含1％血清的培养基，拍照记录。(依据之前做细胞划痕实验结果所设置的浓度)将培养板放入培养箱培养48h取出拍照。根据收集图片，利用Image J软件(National Institutesof Health)分析得到划痕区域面积，整理数据得到实验结果。实验结果见图11和图12。

伤口愈合百分比(Wound Healing Percentage)的计算：根据最开始的划痕面积，跟某一时间愈合的那一部分面积(最开始面积-某时间点的面积)与最初面积的比值即可得到伤口愈合的百分比。即

结论：划痕试验结果由图表所示：给药48h后，与空白组相比，给予蛋白的组别均有促进划痕愈合的作用，不同的蛋白有其最适的促划痕愈合浓度，FCC蛋白在低浓度时的促划痕愈合效果较好。FCC组的最适促划痕愈合浓度的愈合率比类人胶原组的最适促划痕愈合浓度的愈合率要好。

由此可见，本发明所述FCC多肽对皮肤创面具有高效的修复能力，具有广阔的应用前景。

实施例7

多肽FCC的抗光老化实验。

将HSF细胞(人皮肤成纤维细胞，购自ATCC)接种于6孔板内，每孔接种50万细胞，分为正常对照组：Ctrl(正常培养基培养的细胞)和FCC；UVB照射组：UVB-Ctrl和UVB-FCC和UVB-RHC，并且将培养基更换为10％FBS的DMEM完全培养基。接种24小时后，将细胞的UVB-Ctrl和UVB-FCC组暴露于64mJ/cm²的UVB照射中，然后Ctrl和UVB-Ctrl组更换新鲜培养基，FCC和UVB-FCC组更换含有FCC的新鲜培养基。给药24小时后，弃去上清，收集细胞，进行细胞RNA提取(HiPure Total RNA Mini Kit，购自美基生物科技有限公司)，RNA反转录为cDNA，再进行荧光定量QPCR检测基因MMP1和MMP3和SMP30的表达。MMP1是基质金属蛋白酶1，MMP3是基质金属蛋白酶3，两者表达上调时，能促进细胞外基质ECM的降解。而SMP30是细胞衰老标记蛋白，当细胞发生衰老时，SMP30的表达就会上调。MMP1的检测引物(5’→3’，以下同)是F：AGATTCTACATGCGCACAAATC(SEQ ID NO:5)；R：CCTTTGAAAAACCGGACTTCAT(SEQ ID NO:6)。MMP3的检测引物是F：GGGTCTCTTTCACTCAGCCAACAC(SEQ ID NO:7)；R：ACAGGCGGAACCGAGTCAGG(SEQ ID NO:8)。SMP30的检测引物是F：CTGTGCTTTGAACTGGAAAGAA(SEQ ID NO:9)；R：CCCATCATTGAAGCGATTGTTT(SEQ ID NO:10)。实验结果见图13和图14。

结论：FCC抗光老化实验结果如图所示，当正常细胞受到UVB照射后，细胞外基质ECM降解相关基因MMP1和MMP3会呈现上调趋势，说明细胞受到损伤，细胞外基质ECM的合成受到抑制。当加入FCC后，正常对照组没有显著性差异，说明FCC对细胞外基质的分泌合成没有抑制作用；UVB照射组间内存在显著性差异，FCC的加入能显著降低MMP1和MMP3的表达，说明FCC对于细胞外基质ECM的合成具有保护作用。另外，SMP30呈现显著的下调趋势，由此可见，FCC的加入能提高皮肤抗光老化的能力，相与类人胶原的抗光老化实验相比较，FCC有更好的实验结果，证明FCC能降低皮肤受到UVB的损伤。

实施例8

FCC稳定性实验

将液态状的FCC和RHC压盖密封后分别放置于-20℃，25℃(相对湿度60％)、40℃(相对湿度75％)的环境中，于0天，5天，10天，30天取样，通过12％SDS-PAGE电泳检测结果，通过软件分析电泳条带深浅，评估各时间点蛋白剩余百分比。实验结果见图15。

结论：该实验通过FCC与RHC在不同条件下进行稳定性对比，发现在相同温度下，随着天数的增加，样品RHC的蛋白剩余量的比例下降幅度比RHC要大，证明本发明FCC具有比RHC更好的稳定性。

实施例9

多肽FCC体外眼刺激性实验

兔角膜上皮细胞SIRC(购自ATCC)接种于96孔板，融合度达80％以上时暴露于200μL 5％和0.05％受试物溶液，作用5min，每个样品做3个复孔，同时空白对照、培养基对照、溶剂对照和阳性对照(0.01％SLS(十二烷基硫酸钠)，购自Sigma-aldrich)做相应的处理。之后，用200μL磷酸盐缓冲液冲洗2～3次。然后在每孔中加入100μL培养基和10μL增强型CCK-8溶液(cell counting kit-8试剂，购自同仁化学研究所)，放入37℃、5％CO2培养箱中培养4h，培养结束在多功能酶标仪中测定450nm处吸光度值(OD450值)。根据OD值计算细胞存活率。每个样品需重复三次试验。实验结果见图16。

结论：FCC蛋白原液(0.353mg/ml)稀释成5％和0.05％浓度的受试物经STE试验，细胞存活率均大于70％，根据《化妆品安全技术规范》(2015版)附件3的“化妆品用化学原料体外兔角膜上皮细胞短时暴露试验(STE)”的表1中STE刺激反应分级表，判断该受试物眼刺激强度为无刺激性或微刺激性。

表1 STE刺激反应分级

实施例10

多肽FCC的急性眼刺激性腐蚀性实验

取特定浓度受试溶液，轻轻拉开家兔(新西兰兔，购自广东省动物中心，合格证号：No.44411600006645)一侧眼睛的下眼睑，将FCC受试物0.1mL(100mg)滴入(或涂入)结膜囊中，使上、下眼睑被动闭合30s，以防止受试物丢失。滴入受试物后24h内不冲洗眼睛。在滴入受试物后1、24、48、72h对动物眼睛进行检查拍照记录、并根据《化妆品安全技术规范》(2015版)中“急性经皮毒性试验标准”(见表2)进行眼损害评分，按表3眼刺激反应分级判定受试物对眼的刺激强度。如样品具有刺激性，可在第4d和第7d追加观察。

表2眼损害的评分标准

表3产品眼刺激性反应分级

注：当角膜、虹膜、结膜积分为0时，可判为无刺激性。

表4样品对家兔眼球刺激性/腐蚀性评分结果

结论：在观察期内受试家兔未出现死亡或异常，样品组观测期内，给药后1h、24h动物积分均值分别为1分，其余为0分。依据《化妆品安全技术规范》(2015版)急性经皮毒性试验标准判断得出本次实验的数据(见表4)，结果表明受试物FCC溶液无急性眼刺激。

实施例11

多肽FCC皮肤变态反应的实验。

选用20只KM小鼠(昆明小鼠，购自广东省实验动物中心，No.44007200075594)，18～22g，雌雄各半，第1天，动物分组、标记、称重、记录临床症状。将1％十二烷基硫酸钠(SDS)均匀涂抹到小鼠双侧耳朵背部皮肤。刷子或棉签应浸泡在SDS溶液中，并在小鼠每个耳朵背部重复涂抹4～5次。1h后再涂抹受试物或对照25μL/耳。第2d、第3d、第7d操作同第1d，重复1％SLS溶液预处理和受试物或对照涂抹。第4～6d不做任何处理。第8d记录小鼠体重和出现的任何临床症状，第7d作用后约24～30h人道处死动物，摘取小鼠双侧颌下淋巴结，同时分离耳廓打孔(直径：6mm)称重。

将取出的淋巴结至于裂解液内剪碎，冰上裂解。裂解完成后离心取上清液得到待测样品，待测样品上机进行化学发光分析，得出GPS(每秒荧光计数)值。具体操作方法参考ATP试剂盒说明。统计方法采用使用SPSS13.0软件进行t检验。P<0.05为有统计学意义，P<0.01为有显著性差异。统计结果见图17。

表5 FCC样品GPS均值

与阳性对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

表6 FCC样品小鼠耳廓重量均值

与阳性对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

结论：根据《化妆品安全技术规范》(2015版)附件4的“皮肤变态反应：局部淋巴结试验DA”，在观察期内受试小鼠未出现死亡或异常，样品组观测期内，各组动物未见明显皮肤变态反应(见表5和表6)，证明FCC安全性高。

本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。

Claims (11)

1.一种抗皮肤光老化多肽FCC，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.编码权利要求1所述的多肽FCC的核酸分子。

3.融合多肽，其包含：权利要求1所述的多肽FCC，和在所述多肽FCC的N端和/或C端的一个或多个His标签。

4. 根据权利要求3所述的融合多肽，所述融合多肽的序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种重组表达载体，其包含权利要求2所述的核酸分子。

6.权利要求1所述的多肽FCC、权利要求2所述的核酸分子编码的多肽、或权利要求3或4所述的融合多肽在制备用于细胞抗光老化的化妆品中的应用。

7.权利要求1所述的多肽FCC、权利要求2所述的核酸分子编码的多肽、或权利要求3或4所述的融合多肽在制备促细胞修复的化妆品或细胞培养基质中的应用。

8.权利要求1所述的多肽FCC、权利要求2所述的核酸分子编码的多肽、或权利要求3或4所述的融合多肽在制备促细胞粘附的化妆品或细胞培养基质中的应用。

9.权利要求1所述的多肽FCC、权利要求2所述的核酸分子编码的多肽、或权利要求3或4所述的融合多肽在制备皮肤光老化损伤的组织再生和修复方面的产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其中所述产品为化妆品。

11.根据权利要求9所述的应用，其中所述产品为护肤品。

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