CN109793703A - 一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，包括如下步骤：将包含以重量份数计的10‑15份人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体、0.15‑0.25份透明质酸钠、92‑95份水、1.0‑1.5份聚二甲基硅氧烷、2‑3份乳木果油、9‑10份辛酸/癸酸甘油三酯、4.5‑5.5份角鲨烷、2.8‑3.2份新戊酸异癸酯、0.8‑1.2份鲸蜡硬脂醇、8.8‑9.2份的乳化剂、20‑20.8份保湿剂混合均匀得到皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品。本发明制得的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品具有作用温和、无毒副作用、且功效持久稳定的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体的说，它涉及一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法。
背景技术
随着年龄的增长，环境污染的加剧，皮肤真皮层会变薄，真皮层中的胶原蛋白和弹性纤维结构网络也会开始退化，导致皮肤弹性丧失，出现皱纹。而，眼部肌肤问题更为突出。为了延缓眼周皮肤衰老，日常生活中除了保证充足睡眠、养成良好的生活习惯和用眼习惯外，常用方法就是使用眼部化妆品。
目前，化妆品领域普遍采用的除皱成分是在皮肤表面形成一层薄膜，而产生迅速拉紧的效果。经常使用的是动物来源的血清球蛋白，其作用短暂，依懒性较强。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其制得的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品具有作用温和、无毒副作用、且功效持久稳定的优点。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，包括如下步骤：将包含以重量份数计的10-15份人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体、0.15-0.25份透明质酸钠、92-95份水、1.0-1.5份聚二甲基硅氧烷、2-3份乳木果油、9-10份辛酸/癸酸甘油三酯、4.5-5.5份角鲨烷、2.8-3.2份新戊酸异癸酯、0.8-1.2份鲸蜡硬脂醇、8.8-9.2份的乳化剂、20-20.8份保湿剂混合均匀得到皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品。
进一步，所述乳化剂包括重量比为1.7-1.8：1.7-1.8：1的鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯和季戊四醇二硬脂酸酯。
进一步，所述保湿剂包括重量比为18-22：27-33：1的1,3-丁二醇、甘油和尿囊素。
进一步，还包括0.1-0.2份香精。
进一步，所述人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体采用下述方法制备：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于溶剂，再除去溶剂得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体。
进一步，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；
所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块；
所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液；
所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；
所述人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待Pe代人脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子；其中，e＝3、4、5、6、7、8、9、10。
进一步，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代人脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。
进一步，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
进一步，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代人脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代人脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代人脐带间充质干细胞悬液，将Pm代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养得Pm+1代人脐带间充质干细胞。
进一步，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明制得的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品具有作用温和、无毒副作用、且功效持久稳定的优点。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体的制备例1
一种人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2。
人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P3代人脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子。
人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于氯仿，再除去氯仿得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体。
人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体的制备例2
一种人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4、5。
人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P6代人脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子。
人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于氯仿，再除去氯仿得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体。
人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体的制备例3
一种促进人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导方法，包括如下步骤：包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4。
干细胞的冻存步骤包括待P5代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P5代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整P5代人脐带间充质干细胞浓度为1×107个/mL，将P5代人脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P5代人脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P5代人脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得P5代人脐带间充质干细胞悬液，将P5代人脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养得P6代人脐带间充质干细胞。
人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P6代人脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子。
人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于氯仿，再除去氯仿得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体。
人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体的制备例4
一种促进人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的诱导方法，包括如下步骤：包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤、干细胞的冻存步骤、干细胞的复苏与培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤。
脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt％双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt％双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt％双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块。
干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中静置1-2h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液，调整P1代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL。
干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，调整Pn代人脐带间充质干细胞悬液浓度为1×107个/mL，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；其中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8。
干细胞的冻存步骤包括待P9代人脐带间充质干细胞达80-90％汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt％的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对P9代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，调整P9代人脐带间充质干细胞浓度为1×107个/mL，将P9代人脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的P9代人脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待P9代人脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基中重悬得P9代人脐带间充质干细胞悬液，将P9代人脐带间充质干细胞悬液接种于T-175细胞培养瓶，并将T-175细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养得P10代人脐带间充质干细胞。
人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待P10代人脐带间充质干细胞达80-90％时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入HYSTEMCELL人间充质干细胞无血清培养基，放置于37℃体积分数为5％的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子。
人脐带间充质干细胞分泌因子注射液的制备：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于氯仿，再除去氯仿得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体。
实施例1
将包含10g人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体制备例1提供的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体、0.25g透明质酸钠、92g水、1.3g聚二甲基硅氧烷、2g乳木果油、9.5g辛酸/癸酸甘油三酯、5.5g角鲨烷、3g新戊酸异癸酯、1g鲸蜡硬脂醇、8.8g的乳化剂、20.8g保湿剂混合均匀得到皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品。乳化剂包括重量比为1.7：1.8：1的鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯和季戊四醇二硬脂酸酯。保湿剂包括重量比为18：33：1的1,3-丁二醇、甘油和尿囊素。
实施例2
将包含15g人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体制备例2提供的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体、0.2g透明质酸钠、95g水、1.2g聚二甲基硅氧烷、3g乳木果油、9.5g辛酸/癸酸甘油三酯、4.5g角鲨烷、3g新戊酸异癸酯、1.2g鲸蜡硬脂醇、9g的乳化剂、20g保湿剂混合均匀得到皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品。乳化剂包括重量比为1.75：1.75：1的鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯和季戊四醇二硬脂酸酯。保湿剂包括重量比为20：30：1的1,3-丁二醇、甘油和尿囊素。
实施例3
将包含14g人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体制备例3提供的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体、0.2g透明质酸钠、93g水、1.0g聚二甲基硅氧烷、2.5g乳木果油、9g辛酸/癸酸甘油三酯、5g角鲨烷、3.2g新戊酸异癸酯、0.8g鲸蜡硬脂醇、9.2g的乳化剂、20.4g保湿剂混合均匀得到皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品。乳化剂包括重量比为1.8：1.7：1的鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯和季戊四醇二硬脂酸酯。保湿剂包括重量比为22：27：1的1,3-丁二醇、甘油和尿囊素。
实施例4
将包含12g人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体制备例4提供的人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体、0.15g透明质酸钠、92g水、1.5g聚二甲基硅氧烷、2.5g乳木果油、10g辛酸/癸酸甘油三酯、5g角鲨烷、2.8g新戊酸异癸酯、1g鲸蜡硬脂醇、9g的乳化剂、20g保湿剂混合均匀得到皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品。乳化剂包括重量比为1.7：1.8：1的鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯和季戊四醇二硬脂酸酯。保湿剂包括重量比为18：33：1的1,3-丁二醇、甘油和尿囊素。
对比例1
与实施例1相比，未添加人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体。
对于实施例1-4和对比例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品进行感官(外观、色泽)以及理化(耐寒、耐热)指标的测定，测定结果见表1。
感官性能评定:取样品在室温和非阳光直射下目测观察外观是否细腻，色泽是否光亮。
耐热、耐寒测试：取2份样品分别置于40℃的恒温烘箱及-10℃的冰箱冷冻室中，24h后取出恢复至室温后观察是否有油水分离现象或明显性状差异。
表1皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品感官以及理化指标的测定结果
从表1可以看出，实施例1-4和对比例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品感官(外观、色泽)以及理化(耐寒、耐热)指标均符合QB/T1857-2013行业标准的要求。
针对实施例1-4和对比例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品进行保湿性能分析，分析数据见表2和表3。
吸湿率测试：称取2份5g样品置于直径为4cm的称量瓶中，20℃下分别在相对湿度43％和75％的环境中放置8h，每隔1h称量一次并记录样品质量的变化计算吸湿率。吸湿率计算公式为：吸湿率＝(mi-m0)/m0，式中mi为第i小时的样品质量(g)；m0为试验前的样品质量(g)。
表2皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品于20℃下在相对湿度43％的环境中吸湿率测试结果
表3皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品于20℃下在相对湿度75％的环境中吸湿率测试结果
从表2和表3可以看出，实施例1-4和对比例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的吸湿率均为负值，说明较长时间放置眼霜都会失水，但失水非常缓慢。说明该眼霜具有较好的保湿能力。
针对实施例1-4和对比例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品进行抗氧化测试，测试结果见表4。
称取皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品各0.5g，用纯水超声分散后转入100mL容量瓶中定容，配制质量浓度为5毫克/mL的样品溶液并测定其抗氧化性。
对DPPH·的清除率：分别量取上述样品溶液和2.00×10-4mol/L的DPPH·无水乙醇溶液各3mL加入同一具塞试管中，摇匀，避光放置30min后用紫外-可见分光光度计测定混合溶液在517nm处的吸光度Ai1，同时测定3mL的蒸馏水和3mL的2.00×10-4mol/L的DPPH·无水乙醇溶液混合再避光放置30min后的吸光度A01和3mL样品溶液与3mL无水乙醇混合再避光放置30min后的吸光度Aj1。清除率P1计算公式为：P1＝[1－(Ai1－Aj1)/A01]×100％，式中P1为样品对DPPH·的清除率；Ai1为加入样品后DPPH·溶液的吸光度；A01为纯水与DPPH·溶液的吸光度；Aj1为样品在测定波长时的吸光度。
对·OH的清除率：取2mL的1.00×10-2mol/L的水杨酸-乙醇溶液、2mL的9.00×10-3mol/L的FeSO4溶液和上述样品溶液加入同一个具塞试管中，然后加入2mL的8.8×10-2mol/L的H2O2溶液，摇匀后放置于37℃水浴中反应30min，在510nm处测定吸光度Ai2；以2mL蒸馏水代替水杨酸溶液测定吸光度Aj2；用2mL蒸馏水代替样品溶液来测定吸光度A02。清除率P2计算公式为：P2＝[1－(Ai2－Aj2)/A02]×100％，式中P2为样品对·OH的清除率；Ai2为加样品清除自由基后的吸光度；A02为未加样品时溶液的吸光度；Aj2为样品在测定波长时的吸光度。
对·O2 -的清除率：取pH为8.2的Tris-HCl缓冲溶液5mL于具塞试管中，在25℃水浴中预热20min后依次加入样品溶液2mL和5.00×10-3mol/L邻苯三酚溶液0.5mL(用1.00×10-2mol/L的HCl溶液配制)，立即摇匀于25℃水浴中反应4min，立即在320nm处测定其吸光度Ai3；以1.00×10-2mol/L的HCl溶液0.5mL代替邻苯三酚溶液测定吸光度Aj3；用2mL纯水代替样品溶液测定吸光度A03。清除率P3计算公式为：P3＝[1－(Ai3－Aj3)/A03]×100％，式中P3为样品对·O2 -的清除率；Ai3为加样品清除自由基的吸光度；A03为未加样品时溶液的吸光度；Aj3为样品在测定波长时的吸光度。
表4皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的抗氧化性测试结果
| 测定项目 | DPPH·的清除率P<sub>1</sub> | ·OH的清除率P<sub>2</sub> | ·O<sub>2</sub><sup>-</sup>的清除率P<sub>3</sub> |
| 实施例1 | 80.9％ | 55.6％ | 50.6％ |
| 实施例2 | 81.1％ | 55.8％ | 50.7％ |
| 实施例3 | 81.0％ | 55.7％ | 50.5％ |
| 对比例1 | 70.1％ | 45.5％ | 49.9％ |
从表4可以看出，实施例1-4提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品在质量浓度为5毫克/mL时测得对DPPH·、·OH和·O2 -的清除率较好，说明该眼霜具有较好的抗氧化能力。
通过比对实施例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品和对比例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品可知，人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体的加入显著提高其抗氧化能力。
选取实施例1提供的皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品进行功效测试。
即时测试：对一位年龄为55岁、干性皮肤的试用者在使用皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品前和使用15分钟和30分钟的眼周皮肤拍照后进行对比。由对比结果可知，使用前眼周皮肤纹路较深，皱纹明显；使用皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品15分钟后，皱纹明显变浅；使用皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品30分钟后，皮肤纹路持续变浅。
长期测试：两位试用者的年龄分别为42岁和26岁，受试人员每天早晚于洁面后取大约黄豆粒大小的用量在眼周涂抹皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品，共使用90天。两位分别在使用前和使用90天后用皮肤测试仪测定的眼周皮肤各项指标的变化情况，测定结果见表5。
表5使用眼霜前后眼周皮肤各指标变化情况
由表5可知，连续使用该皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品90天后的眼周皮肤的油分和色素含量都有所下降，水分、胶原纤维和弹性指标都得到提高。
应该理解的是，本发明实施例所述制备方法仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，包括如下步骤：将包含以重量份数计的10-15份人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体、0.15-0.25份透明质酸钠、92-95份水、1.0-1.5份聚二甲基硅氧烷、2-3份乳木果油、9-10份辛酸/癸酸甘油三酯、4.5-5.5份角鲨烷、2.8-3.2份新戊酸异癸酯、0.8-1.2份鲸蜡硬脂醇、8.8-9.2份的乳化剂、20-20.8份保湿剂混合均匀得到皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品。
2.根据权利要求1所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述乳化剂包括重量比为1.7-1.8：1.7-1.8：1的鲸蜡硬脂醇橄榄油酸酯、山梨坦橄榄油酸酯和季戊四醇二硬脂酸酯。
3.根据权利要求1所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述保湿剂包括重量比为18-22：27-33：1的1,3-丁二醇、甘油和尿囊素。
4.根据权利要求1所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，还包括0.1-0.2份香精。
5.根据权利要求1所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体采用下述方法制备：将重量比为10：1的胆固醇和卵磷脂溶解于溶剂，再除去溶剂得脂质体薄膜，加入与脂质体薄膜等重量的人脐带间充质干细胞分泌因子基置于摇床上进行水化3小时，待脂质体薄膜脱落，获得大粒径脂质体，将大粒径脂质体超声均质，制得人脐带间充质干细胞分泌因子囊泡脂质体。
6.根据权利要求5所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，包括脐带组织块的获取步骤、干细胞的原代培养步骤、干细胞的传代培养步骤和人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤；
所述脐带组织块的获取步骤包括两端结扎的脐带经消毒后，置于内含1wt%双抗的生理盐水中；去除脐带两结扎端，脐带中间段剪成0.8-1.2cm长的脐带组织段，采用内含1wt%双抗的生理盐水对脐带组织段反复漂洗去除血迹；剖开脐带组织段，去除血管及表皮组织，获得华通氏胶组织，采用内含1wt%双抗的生理盐水对华通氏胶组织反复漂洗，剪碎得1mm×1mm×1mm的脐带组织块；
所述干细胞的原代培养步骤包括将脐带组织块贴壁接种至培养皿中，温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中静置1-2 h，向培养皿中加入完全培养液培养，每隔3天半量更换完全培养液，静置培养14天后，弃掉培养液及脐带组织块，采用生理盐水清洗细胞，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，温度为37℃静置2-3分钟，待伪足完全回缩，细胞变圆，加入完全培养液终止消化，吹打得到P1代人脐带间充质干细胞悬液；
所述干细胞的传代培养步骤包括待Pn代人脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pn代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清培养基中重悬得Pn代人脐带间充质干细胞悬液，将Pn代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，得Pn+1代人脐带间充质干细胞；
所述人脐带间充质干细胞分泌因子的获取与纯化步骤包括待Pe代人脐带间充质干细胞达80-90%时，轻轻倾倒培养基，用无菌PBS清洗3次，吸除残留的PBS洗液，加入无血清培养基，放置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养3天，收集上清，用0.22um的过滤器过滤，得人脐带间充质干细胞分泌因子；其中，e=3、4、5、6、7、8、9、10。
7.根据权利要求6所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述人脐带间充质干细胞分泌因子的制备方法，还包括干细胞的冻存步骤和干细胞的复苏与培养步骤；所述干细胞的冻存步骤包括待Pm代人脐带间充质干细胞达80-90%汇合度时，弃去上清液，加入0.5wt%的Tryple-Express消化液，待消化完全后，加入完全培养液终止消化，离心并弃去上清液，用生理盐水对Pm代人脐带间充质干细胞清洗，并在无血清间充质干细胞冻存液中重悬，将Pm代人脐带间充质干细胞悬液分装于冻存管中并封口，立即将冻存管放置于程序降温盒后并立即将程序降温盒放置于-80℃的冰箱中冻存12-24小时，之后将冻存管取出并立即放置于液氮中冻存。
8.根据权利要求7所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述无血清间充质干细胞冻存液包括以质量份数计的无血清培养基80份、二甲基亚砜10份、L-薄荷基吡喃糖苷5份、甘油4份、N-乙酰葡萄糖胺1份。
9.根据权利要求7所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述干细胞的复苏与培养步骤包括从液氮中取出待复苏的Pm代人脐带间充质干细胞冻存管，放入温度为37℃水浴中，待Pm代人脐带间充质干细胞融化后转移至生理盐水中，离心并弃去上清液，并在无血清培养基中重悬得Pm代人脐带间充质干细胞悬液，将Pm代人脐带间充质干细胞悬液接种于细胞培养瓶，并将细胞培养瓶置于温度为37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养得Pm+1代人脐带间充质干细胞。
10.根据权利要求6或8或9所述的一种皮肤抗老化细胞分泌因子化妆品的制备方法，其特征在于，所述无血清培养基为HY STEMCELL人间充质干细胞无血清培养基。
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