KR101724409B1 - 하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법 - Google Patents

하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

강한 환원성은 유지하고, 물리적으로 안정하며, 생체 친화성 및 생체 활성을 높이며, 아미노산의 산화를 방지하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법을 제시한다. 그 유도체 및 방법은 아미노산에 제1 보호 그룹(protecting group)을 도입하여 변형된 제1 변형체 및 아스코르빈산에 제2 보호 그룹(protecting group)을 도입하여 변형된 제2 변형체를 bromoacetyl bromide 또는 bromoacetyl chloride를 매개체로 하여 결합된 3-(아미노)-L-아스코르빈산인 하이브리드 아스코르빈산 유도체이다.

Description

하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법{Hybrid ascorbic acid derivative and method of fabricating the same}
본 발명은 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 아스코르빈산과 아미노산류를 결합시킨 새로운 형태와 기능을 가진 하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
L-아스코르빈산(비타민 C)은 강한 항산화 작용 등을 가지므로, 의약품, 화장품, 식품 분야 등에서 다양하게 활용되고 있다. 생체에 대하여 비타민 C는 화학적 오염, 흡연, 자외선(UV) 등의 외부 환경에 의해 유발되는 활성산소(ROS, Reactive Oxygen Species)를 환원시키는 강력한 항산화제이다. 왜냐하면, 비타민 C는 두개의 전자를 받아들여 탈수소-L-아스코르빈산(Dehydro-L-ascorbic acid) 형태로 쉽게 산화될 수 있는 구조를 가지기 때문이다. 이와 같이, 비타민 C는 피부의 비효소적 항산화제 방어 시스템의 중요한 요소이다. 즉, 비타민 C가 고농도로 존재할 때, 싱글렛 산소(singlet oxygen), 수퍼옥사이드 음이온(superoxide anion), 히드록시 라디칼(hydroxy radical)과 같은 ROS 등이 단백질, 핵산, 세포막지질 등의 생체성분을 산화시키거나 변성시키기 전에 이들을 중화시키는 역할을 하는 것이다.
이러한 아스코르빈산은 불안정한 물성으로 인해 그 적용에는 제한이 있다. 특히, 파괴 정도에 따라 노란색에서 갈색을 거쳐 거의 암갈색까지 색상이 변화하게 되어 상품성을 감소시킨다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 국내등록특허 제10-0459679호, 국내공개특허 제2001-0109730호 등에서 아스코르빈산의 산화가 유도되는 부위에 다른 염들과의 화학반응에 의한 결합으로 다양한 유도체를 만드는 방법이 제시되었다. 상기 특허 등에 의하면, 아스코르빈산의 불안정성은 어느 정도 개선되었다. 하지만, 효능이 순수 아스코르빈산보다 떨어지고, 유도체화에 따른 합성 공정에서 유해한 용매들이 잔존하여 피부자극 등의 우려가 있다.
또한, 아스코르빈산은 분해가 쉽고, 친수성이기 때문에 세포에 대한 투과도가 매우 낮아서 생체 활성을 유도하기 위해서는 다량 사용해야 한다. 아미노산과 아스코르빈산의 결합은 직접 이루어지기 어렵고, 아미노산의 아민기에 의해, 아스코르빈산인 비타인 C가 쉽게 산화되어 반응하는 중에 산화가 일어난다. 또한 산화가 일어나면, 아미노산의 안정성에도 문제가 된다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 비타민 C의 강한 환원성은 유지하고, 물리적으로 안정하며, 생체 친화성 및 생체 활성을 높이고, 아미노산의 산화까지도 방지하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 과제를 해결하기 위한 하이브리드 아스코르빈산 유도체는 아미노산에 제1 보호 그룹(protecting group)을 도입하여 변형된 제1 변형체 및 아스코르빈산에 제2 보호 그룹(protecting group)을 도입하여 변형된 제2 변형체를 bromoacetyl bromide 또는 bromoacetyl chloride를 매개체로 하여 결합된 3-(아미노)-L-아스코르빈산인 하이브리드 아스코르빈산 유도체이다.
본 발명의 유도체에 있어서, 상기 아미노산은 L-Serine 또는 L-Valine 중의 어느 하나일 수 있다. 상기 제1 보호 그룹은 상기 L-Serine에는 아세탈 그룹이고, 상기 L-Valine은 메톡시 그룹 중의 어느 하나일 수 있다. 상기 3-(아미노)-L-아스코르빈산은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 아스코르빈산 유도체일 수 있다.
[화학식 1]
Figure 112015053867919-pat00001
[화학식 2]
Figure 112015053867919-pat00002
본 발명의 다른 과제를 해결하기 위한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 제조방법은 먼저 아미노산에 제1 보호 그룹(protecting group)을 도입하여 변형된 제1 변형체 및 아스코르빈산에 제2 보호 그룹(protecting group)을 도입하여 변형된 제2 변형체를 생성한다. 그후, 상기 제1 변형체 및 상기 제2 변형체를 bromoacetyl bromide 또는 bromoacetyl chloride를 매개체로 하여 3-(아미노)-L-아스코르빈산을 합성한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 아미노산은 L-Serine이고, 상기 제1 보호 그룹은 아세탈 그룹이며, 하기 반응식 1과 같이 히드록시 그룹(hydroxy group) 및 카르복시산 그룹(carboxylic acid group)을 보호하는 상기 제1 변형체가 생성된다.
[반응식 1]
Figure 112015053867919-pat00003
본 발명의 방법에 있어서, 상기 아미노산은 L-Valine이고, 상기 제1 보호 그룹은 메톡시 그룹이며, 하기 반응식 2와 같이 카르복시산 그룹(carboxylic acid group)을 보호하는 상기 제1 변형체가 생성된다.
[반응식 2]
Figure 112015053867919-pat00004
본 발명의 하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법에 의하면, 하이브리드 비타민 C 유도체인 3-(아미노)-L-아스코르빈산을 제조함으로써, 강한 환원성은 유지하고, 물리적으로 안정하며, 생체 친화성 및 생체 활성을 높일 수 있으며, 아미노산을 보호하여, 아미노산의 산화를 방지할 수 있다. 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine(AA-Ser)의 경우 세포안정성 및 콜라겐 생합성 효과가 우수하였으며, 3-O-Ascorbyl acetyl L-Valine(AA-Val)의 경우 세포안정성, 콜라겐 생합성 효과 및 멜라닌 생성억제 효과가 동시에 나타나는 우수한 항노화 물질임을 확인하였다. 이는 아스코르빈산과 사용된 아미노산인 L-세린, L-발린에서는 나타나지 않거나 혹은 그 보다 높은 효과를 나타내고 있다. 일반적으로 아미노산인 L-세린, L-발린은 미백이나 콜라겐 효과가 직접적으로 나타나지 않으며, L-아스코르빈산인 비타민 C의 경우, 미백 및 콜라겐 효과가 갖고 있으나, 세포를 이용한 in-vitro test에서는 약 10~50ppm이하의 실험조건에서만 그 경향을 확인할 수 있고 그 이상의 농도범위에서는 자극을 나타내어 세포를 사멸시키는 경향을 보인다.
도 1은 본 발명에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체를 합성하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명에 의한 2,2-dimethyl-L-serine의 1H NMR Spectra의 결과를 나타내는 도표이다.
도 3은 본 발명에 의한 Bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-serine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다.
도 4는 본 발명에 의한 IAA acetyl-2,2-dimethyl-L-serine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다.
도 5는 본 발명에 의한 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine(AA-Ser)의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다.
도 6은 본 발명에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 세포 독성을 확인하는 그래프이다.
도 7은 본 발명에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 콜라겐 생합성 촉진효과를 확인하는 그래프이다.
도 8은 본 발명에 의한 Methoxy-L-Valine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다.
도 9는 본 발명에 의한 Bromoacetyl Methoxy-L-Valine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다.
도 10은 본 발명에 의한 IAA-acetyl Methoxy-L-Valine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다.
도 11은 본 발명에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 세포 독성을 확인하는 그래프이다.
도 12는 본 발명에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 콜라겐 생합성 촉진효과를 확인하는 그래프이다.
도 13은 본 발명에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 멜라민 생성억제 효과를 확인하는 그래프이다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 다음에서 설명되는 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술되는 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이다.
본 발명의 실시예는 하이브리드 비타민 C 유도체인 3-(아미노)-L-아스코르빈산을 제조함으로써, 강한 환원성은 유지하고, 물리적으로 안정하며, 생체 친화성 및 생체 활성을 높이는 하이브리드 아스코르빈산 유도체 및 그 제조방법을 제시한다. 이를 위해, 3-(아미노)-L-아스코르빈산을 합성하는 과정을 구체적으로 살펴보고, 상기 유도체의 물성을 상세하게 설명하기로 한다. 본 발명의 하이브리드 아스코르빈산 유도체는 하이드록시 아미노산류 중 하나인 L-세린(Serine)과 지방족아미노산류 중 하나인 L-발린(Valine) 등을 도입한 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체를 합성하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 1에 의하면, 본 발명의 하이브리드 아스코르빈산 유도체는 하이드록시 아미노산류 중 하나인 L-세린(Serine)과 지방족아미노산류 중 하나인 L-발린(Valine) 등을 도입한 것이다.
반응식 1의 Modified L-Ascorbic acid인 5,6-O-Isopropylidene-L-Ascorbic acid(IAA)의 합성
[반응식 1]
Figure 112015053867919-pat00005
반응식 1의 중간체(IAA)의 합성 과정을 살펴보면, 아스코르빈산의 불안정한 물성을 해결하기 위해, 아스코르빈산의 산화메카니즘의 시작인 2-OH와 3-OH의 결합을 유도할 목적으로 우선 아스코르빈산의 5과 6번 OH를 아세탈 그룹(acetal group)을 통한 보호하는(protecting) 반응을 진행하였다. 구체적으로, 반응물(reactants) 및 용매(solvent)의 역할을 하는 아세톤(acetone) 하에서 아스코르빈산과 산(acid) 촉매역할을 하는 아세틸클로라이드(Acetyl Chloride; AC)를 넣고 40℃ 온도에서 약 5시간 동안 교반하여 슬러리 반응(slurry reaction)을 한다.
이때, 상기 슬러리 반응은 아스코르빈산이 산 촉매 하에서 아세톤에 소량씩 용해되면서 케톤기인 C=O 그룹이 아스코르빈산의 5번, 6번 OH와 결합하여 아세탈 그룹(Acetal group)을 형성하여 석출되는 반응이다. 반응이 종료되면, 저온으로 보관하여 차가운 acetone/hexane 혼합용액으로 세정(washing)하면서 필터링을 수행한다. 얻어진 파우더는 에탄올에 용해시킨 후, 냉동실에 보관해 재결정시킨다. 회수된 Isopropylidene Ascorbic Acid(IAA)를 메탄올(methanol)에 용해하여, MeOH:ethyl acetate(3:7)의 조건에서 TLC(Rf=약 0.35)로 확인하였다.
<3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine의 합성>
3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine은 구조적으로 불안정한 물성을 갖는 아스코르빈산의 안정성을 위해, 매개체인 bromo alkylic acid halide류 중에 선택된 bromoacetyl bromide 또는 bromoacetyl chloride를 이용하였다. 여기서는, bromoacetyl bromide를 예로 들었다. 상기 매개체에 의해, 아스코르빈산과 산화 메카니즘을 갖는 아미노산인 L-세린(L-Serine)의 아민기와 아마이드 결합을 시킨 변형체를 제조하였다. 그후, 상기 변형체에 반응식 1의 IAA를 결합시킨 후, 아스코르빈산과 L-세린에 적용시켰던 보호 그룹을 아세탈 탈보호(acetal de-protecting) 반응을 거치면, 상기 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine가 합성된다. 본 발명의 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine의 합성은 IAA를 합성하는 공정을 제외하고 총 4 단계로 진행된다. 이하에서는 각 단계별로 합성과정을 상세하게 살펴보기로 한다.
반응식 2의 2,2-Dimethyl-L-Serine의 합성(1 단계)
[반응식 2]
Figure 112015053867919-pat00006
반응식 2의 합성과정을 살펴보면, L-세린(L-Serine)의 아민기에, 매개체인 bromo acetyl bromide를 이용한 N-acetyl화를 시도하기 위해, 먼저 L-세린(L-Serine)의 히드록시 그룹(hydroxy group)과 카르복시산 그룹(carboxylic acid group)을 아세탈 그룹(acetal group)으로 보호(protecting)하는 공정을 수행하였다. 한편, L-세린은 히드록시 그룹을 갖는 아미노산으로서, 물을 제외한 유기 용매에 대한 용해도가 좋지 않아 유기 합성에 적용시킬 수 있는 반응 조건의 제약이 따른다. 그러나 산성 조건에서 유기 용매에 대한 용해도가 있는 아미노산의 특징을 이용하여, p-TsOH인 산 촉매 하에서 과량의 2,2-dimethoxypropane을 60℃, 12hr~24hr 반응시켜 반응식 2의 L-세린의 변형체인 2,2-dimethyl-L-Serine을 합성하였다.
반응이 종료된 후, 냉각시킨 다음, acetone/hexane 혼합용매로 세정(washing)하여 필터링 및 건조하여 파우더를 얻었다. 합성된 2,2-dimethyl-L-Serine을 DMF에 용해시켜 MeOH:chloroform:acetic acid:H2O(45:40:5:10)의 조건으로 TLC(Rf=4.5)로 확인하였다. 사용된 발색시약은 0.3% Ninhydrin 용액을 제조하여 적용하였다.(L-serine Rf=6.2)
도 2는 본 발명의 실시예에 의한 2,2-dimethyl-L-serine의 1H NMR Spectra의 결과를 나타내는 도표이다. 도 2에 따르면, L-serine의 methylene proton(CH2, C) 피크(peak)의 위치(4.66ppm→3.98ppm)가 2,2-dimethyl group이 생기면서 오른쪽으로 변위되었다는 것을 확인할 수 있었으며, 아세탈 그룹(acetal group)으로 인한 methyl proton(CH3, a) 피크를 확인할 수 있었다.
반응식 3의 2-Bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-Serine의 합성(2 단계)
[반응식 3]
Figure 112015053867919-pat00007
반응식 3의 합성과정을 살펴보면, 보호된 L-세린 변형체의 아미노 그룹(-NH2 group)에 상기 매개체인 bromoacetyl bromide을 반응시켜 아마이드결합을 유도한다. 구체적으로, THF에 L-Serine acetal을 넣고 교반한 다음, 약간의 과량의 TEA를 사용하여 2~4℃ 저온 하에서 bromoacetyl bromide 희석하여 천천히 부가한다. 약 1hr 정도 교반 후, 반응 용액을 상온에서 24hr 동안 반응시킨다. 이어서, 상기 반응물을 저온으로 보관한 후, 침전물을 제거하고 액을 농축한다. 얻어진 농축액을 THF에 용해시켜 MeOH:chloroform:acetic acid:H2O(45:40:5:10)하에서 TLC(Rf=3.7정도)로 확인할 수 있었다. 사용된 발색시약은 0.3% Ninhydrin 용액이었다.
도 3은 본 발명의 실시예에 의한 Bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-serine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다. 도 3에 따르면, 매개체인 bromoacetyl bromide가 L-Serine의 아민기와 결합함으로써, Serine의 amine group(d)과 그에 인접한 b의 methine proton에 영향을 준다. 이로 인해, 도시된 바와 같이, 아민(NH2, amine proton)의 아마이드 결합으로 인하여 생긴 NH, amide proton화로 인해 약 2.0ppm→약 8.0ppm(d) 근처로 변위되었다. 또한, 이와 인접하여 영향을 받을 것을 예상되었던 Serine의 methine proton(CH, b) 역시 3.6ppm에서 4.8ppm 근처로 변위됨을 확인할 수 있었다.
반응식 4의 Isopropylidene ascorbyl acetyl-2,2-Dimethyl-L-Serine (IAA-Acetyl-MS)의 합성(제3 단계)
[반응식 4]
Figure 112015053867919-pat00008
반응식 4의 합성과정을 살펴보면, L-Serine 보호 구조에 아스코르빈산을 결합하기 위한 매개체인 bromoacetyl group을 도입한 bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-Serine을 정제한다. 그후, 아스코르빈산의 아세탈(acetal) 보호 형태인 IAA(Isopropylidene-L-Ascorbic Acid)를 결합시킨다. 당량 이상의 커플링제(coupling agents)인 TEA(triethylamine)와 같은 유기아민 또는 NaHCO3를 사용하여 DMSO 하에서 50℃, 24hr 동안 반응을 수행한다. 반응이 종료되면, EA-탈이온수(distilled water)를 이용하여 EA 유상층을 세척하여 농축한 후, EtOH에 재결정하여 엷은 황갈색의 결정을 회수한다. 얻어진 생성물을 MeOH에 용해시켜 MeOH:chloroform:acetic acid:H2O(45: 40:5:10)의 조건으로 TLC(Rf=5.2정도)로 확인하였다. 이때, 자외선 검지기(UV detecter)를 활용하였다.
도 4는 본 발명의 실시예에 의한 IAA acetyl-2,2-dimethyl-L-serine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다. 도 4에 따르면, 매개체가 결합된 변형된(modified) L-Serine의 bromide group에 아스코르빈산의 아세탈 보호된 IAA(isopropylidene ascorbic acid)를 결합시킴으로써, 도시된 바와 같이, IAA의 acetal group의 methyl proton(CH3, i & i')의 double lay 형태의 특성 피크가 확인되며, 결합으로 인한 매개물질인 아세틸(acetyl) 부분의 methylene proton(CH2, e)의 왼쪽으로 변위됨을 확인할 수 있었다.
반응식 5의 3-O-Ascorbyl acetyl Serine(AA-Ser)의 합성(제4 단계)
[반응식 5]
Figure 112015053867919-pat00009
반응식 5의 합성과정을 살펴보면, 아세틸 그룹(acetyl group)을 매개체로 하여 IAA(Modified Ascorbic acid)와 Serine acetal 형태가 결합된 IAA-acetyl-IS의 가수분해 반응인 아세탈 탈보호 반응을 동시에 진행하였다. 우선, 용해도 검사 결과에 맞춰, IAA-acetyl-IS를 EtOH/H2O에 용해시킨 후, 트리플루오르아세트산(trifloroacetic acid)을 산 촉매로 하여 60℃에서 5hr 동안 반응하여 TLC(Rf=약 6.8)로 확인하였다. 반응이 종료되면, 반응 용액을 감압을 통해 제거하여 얻어진 미황색 내지 미백색 고체를 회수한다. 이를 다시 알콜(alcohol)에 용해시켜 저온에서 재결정화 시킨다. 이와 같이 재결정화된 반응식 5의 하이브리드 아스코르빈산 유도체인 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 의한 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine(AA-Ser)의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다. 도 5에 따르면, 최종 생성물인 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine은 전단계의 Serine 및 아스코르빈산 부분에 보호된 아세탈 그룹을 탈보호시킨 물질이다. 따라서 NMR spectra에서 아세탈 그룹의 methyl proton(CH3)의 존재 유무 및 인접하는 Serine 부분의 methylene(c) proton 피크 및 아스코르빈산 부분의 methylene(h), methine(g) proton 피크의 변화를 확인하였다. 그런데, 약간의 아세탈 그룹이 잔존하고 있다는 것으로써 약간 미반응 생성물이 잔존하고 있음을 확인할 수 있었다. 하지만, 전체적으로 히드록시 그룹(-OH group)인 a, j peak의 등장과 Serine의 methylene proton 피크의 약간의 변화, 그리고 아스코르빈산 부분의 탈보호로 인한 -OH proton(i)의 존재와 methylene(h), methine(g) proton 피크의 현저한 변위를 통해 최종 생성물의 구조를 확인할 수 있었다.
최종 생성물은 화학식 1과 같이 구조 및 그에 대한 정의가 이루어진다.
[화학식 1]
Figure 112015053867919-pat00010
화학식 1에 의하면, 본 발명의 실시예에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체는 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine(AA-Ser)이고, 평균중량(MW)은 321.24이다. 또한, 구조식은 C11H15NO10이며, E.A.는 C 41.13;H 4.71;N 4.36;O 49.81이다.
<3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine(AA-Ser.)의 보호 및 탈보호 반응 원리>
[반응식 6]
Figure 112015053867919-pat00011
반응식 6에 의하면, 아스코르빈산의 5,6-OH와 L-Serine의 카르복시산(carboxylic acid) 및 히드록시 그룹(hydroxy group)의 아세탈(acetal) 보호 및 탈보호 반응은 반응식 10과 같이 해석된다.
이하에서는 본 발명의 실시예인 3-O-Ascorbyl Acetyl-L-Serine의 효능을 알아보기 위해, 세포시험(cell-culture)을 통한 세포에서의 활성 및 효능 가능성을 알아보았다. 우선 NR 검사로 세포 안전성을 확인하였고, 콜라겐(collagen) 생합성 효과를 확인해보았다.
<세포안전성>
세포안전성 시험에는 primary cultured human dermal fibroblast(HDFN)을 사용하였다. FGM-2(LONZA) 배지로 배양한(subculture) HDFN 세포를 10% 우혈청을 함유한 DMEM으로 2*104cells/mL으로 현탁하고, 이 세포현탁액 135uL를 96well에 넣고 24hr 동안 배양한 다음, 미리 희석된 농도별 3-O-Ascorbyl Acetyl-L-Serine(AA-Ser)을 각각 15㎕를 넣고 3일 동안 다시 배양하였다. 세포 생존율의 확인은 NRU 검사를 통하여 확인하였으며 540nm 흡광도를 하기 식에 의해 계산하여 세포 생존율을 구하였다.
세포 생존율(%) = (시험군의 흡광도/공시료군의 흡광도)*100
도 6은 본 발명의 실시예에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 세포 독성을 확인하는 그래프이다. 도 6에 따르면, 고농도 범위 내에서도 세포독성이 나타나지 않는 높은 세포 안전성을 확인하였고, 이를 기반으로 다양한 세포 활성을 확인할 수 있는 기반과 가능성을 확인할 수 있었다.
<콜라겐 생합성 촉진효과>
콜라겐 생성촉진효과를 확인하기위해 사용된 세포는 피부에서의 현상을 가장 잘 모방할 수 있도록 초대 배양된 인간 섬유아세포(HDFN)를 이용하였다. 또한 세포배양 배지는 혈청에 의한 영향을 최소화하기 위해 세포 배양에서 사용하는 통상적인 혈청농도인 10% 대신 0.2%를 적용하였다. 실험방법을 간략히 소개하면, 0.2% FBS, 0.1% BSA를 함유한 DMEM 배지에 2.0*104cells /ML가 되도록 HDFN을 조절한 후, 이 세포액 135㎕를 96 microplate에 분주한 다음, 인큐베이터(incubator)에서 overnight pre-culture하고, 동일한 media로 교체한 후, 각 농도로 희석된 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Serine(AA-Ser)을 첨가하여 3일간 추가 배양하였다. 세포배양액을 이용하여 ELISA법으로 type-1 procollagen의 농도를 측정하였다.
도 7은 본 발명의 실시예에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 콜라겐 생합성 촉진효과를 확인하는 그래프이다. 도 7에 따르면, 비교적 저농도 범위까지도 높은 콜라겐(collagen)생합성 촉진을 효과를 나타내고 있음을 확인하였으며, 100ppm(㎍/mL)에서 206%이상의 생합성 촉진 효과를 확인할 수 있었다.
<3-O-Ascorbyl Acetyl Valine의 합성>
L-Valine은 필수아미노산이며 지방족 아미노산으로 가지(branch)를 갖고 있다. 3-O-Ascorbyl Acetyl Valine은 구조적으로 불안정한 물성을 갖는 아스코르빈산의 안정성을 위해, 매개체인 bromoalkylic acid halide류 중 하나인 bromoacetyl bromide를 이용하였다. 상기 매개체에 의해, 비타민 C와 산화 메카니즘을 갖는 아미노산 중 하나인 L-Valine과 아마이드 결합을 시킨 변형체를 제조하였다. 이를 아스코르빈산의 변형체인 IAA(isopropylidene-L-Ascorbic acid)과 결합시킨 후, 최종적으로 탈보호 반응을 거치면, 상기 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Valine이 합성된다. 본 발명의 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Valine의 합성은 IAA를 합성하는 공정을 제외하고, 총 4 단계로 진행된다. 이하에서는 각 단계별로 합성과정을 상세하게 설명하기로 한다.
반응식 7의 Methoxy L-Valine의 합성(제1 단계)
[반응식 7]
Figure 112015053867919-pat00012
반응식 7의 합성과정을 살펴보면, 먼저 L-Valine의 아민기에 매개체를 결합하기 위해, 경쟁 반응이 유도될 수도 있는 카르복시산(carboxylic acid)을 메톡시 그룹(methoxy group)화하는 보호 반응을 진행하였다. 도입된 L-Valine 역시 앞의 L-Serine과 마찬가지로 물을 제외한 유기 용매에 대한 용해도가 높지 않으며 결정성을 갖는 물질이다. 메탄올에 슬러리(slurry)시켜 HCl, p-TsOH과 같은 산(acid) 촉매 하에서 메톡시(methoxy) 보호 반응을 진행하였다. L-Valine 역시 다른 아미노산과 동일하게 산 조건하에서 용해도가 증가하였고, 이러한 특성을 이용하여 산 조건의 보호 반응을 수행하였다.
이어서, 70℃, 약 24hr 동안 환류를 시키면서 진행하였다. 반응이 종료되면, 용액을 감압 증류시켜 제거하고 백색의 잔류물을 차가운 아세톤(acetone)에 넣고 세정(washing) 하였다. 세정된 반응물을 저온상태로 보관 후, 필터 및 건조하여 Methoxy-L-Valine을 얻었다. 이동상은 MeOH:chloroform:acetic acid:H2O(45:45:5:5), 발색시약은 0.3% Ninhydrin 용액 조건에서 TLC(Rf=약 2.6)를 통해 반응 정도를 확인하였다.
도 8은 본 발명의 실시예에 의한 Methoxy-L-Valine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다. 도 8에 따르면, 아스코르빈산과의 결합을 위해, 도입된 아미노산인 Valine의 변형체를 합성하였다. 즉, 카르복시간(carboxylic acid) 부분에 메톡시 그룹(methoxy group)으로 보호를 하였고, 그 결과, NMR을 통해 세린(Serine)에 결합된 메톡시 그룹(methoxy group)의 methyl proton(CH3, e) 피크를 확인할 수 있었다.
반응식 8의 Bromoacetyl Methoxy-L-Valine의 합성(제2 단계)
[반응식 8]
Figure 112015053867919-pat00013
반응식 8의 합성과정을 살펴보면, 메톡시(methoxy) 보호된 L-Valine 변형체의 아미노 그룹(-NH2 group)에 매개체인 bromoacetyl bromide을 반응시켜 아마이드결합을 유도한다. 상기 L-세린과 동일한 반응 조건으로, THF 용매하에서 Methoxy-L-Valine을 용해시킨 후, 몰당량으로 약간의 과량의 TEA(TriEthylAmine) 사용하여 교반시킨다. 이때, 2~4℃ 이하의 저온 상태에서 THF로 희석시킨 매개체인 bromoacetyl bromide를 천천히 떨어뜨린다(dropping). 약 1hr 동안 부가한 후, 천천히 상온에서 TLC로 경향을 확인하면서 24hr 동안 반응시킨다.
상기 반응물을 저온 보관 후, 침전물을 제거하고 액을 농축한다. 얻어진 갈색의 농축액을 THF에 용해시켜 MeOH:chloroform:acetic acid:H2O(45:45:5:5)하에서 TLC(Rf=약 1.5)로 확인하였다. 적용된 발색시약은 동일한 0.3% Ninhydrin 용액을 이용하였다.
도 9는 본 발명의 실시예에 의한 Bromoacetyl Methoxy-L-Valine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다. 도 9에 따르면, 보호된 Valine의 아민 그룹(amine group)에 매개체인 bromoacetyl bromide를 amide 결합시킴으로써 그 생성물을 NMR을 측정하였다. 그 결과, 도시된 바와 같이 2.0ppm 부근의 NH2 proton 피크가 사라지고 8.0ppm 부근의 amine proton(NH, d)이 확인되었으며, 또한 이와 인접한 Valine의 methine proton(CH, b), methine proton(CH, c)이 각각 2.5에서 3.1ppm으로, 3.4에서 4.5 ppm 부근으로 변위되고 있음을 확인할 수 있었다.
반응식 9의 Isopropylidene ascorbyl acetyl Methoxy -L-Valine( IAA - Acetyl -MV)의 합성(제3 단계)
[반응식 9]
Figure 112015053867919-pat00014
반응식 9의 합성과정을 살펴보면, L-Valine의 보호 및 변형(modify) 반응에 따른 결과물의 구조에 아스코르빈산을 결합하기 위하여, 매개체인 bromoacetyl group을 도입한 Bromoacetyl-Methoxy-L-Valine을 정제하였다. 그후, 아스코르빈산의 아세탈(acetal) 보호 형태인 IAA(isopropylidene-L-Ascorbic acid)를 말단의 보론 그룹(-Br group)과 이써(ether) 결합을 유도시킨다. 몰당량 이상의 커플링제(coupling agents)인 TEA(triethylamine)와 같은 유기아민 또는 NaHCO3를 사용하여 DMSO 하에서 45℃, 24hr 동안 반응을 수행하였다.
반응이 종료되면, EA-탈이온수를 이용하여 EA 유상층을 세척하여 농축 후, EtOH에 재결정하여 엷은 황적색의 고상 파우더를 회수한다. 얻어진 생성물을 EA에 용해시켜 MeOH:chloroform:acetic acid:H2O(45: 45:5:5)의 조건으로 TLC(Rf=2.8-3.0 정도)로 확인할 수 있었다. 이때, 자외선 검지기(UV detecter)를 사용하였다.
도 10은 본 발명의 실시예에 의한 IAA-acetyl Methoxy-L-Valine의 1H NMR Spectra를 나타내는 도표이다. 도 10에 따르면, 변형된 형태의 Valine에 아스코르빈산의 아세탈 보호 형태인 IAA(Isopropylidene Ascorbic Acid)를 결합시킨 생성물이다. 도시된 바와 같이, 우선적으로 결합이 일어나 부근인 아세틸 그룹(acetyl group)의 methylene proton(CH2, f) peak의 왼쪽으로 변위되는 경향을 확인하였고, IAA part의 acetal group의 methyl proton(CH3, j) 피크가 나타남을 확인하였다.
반응식 10의 3-O-Ascorbyl acetyl L-Valine(AA-Val)의 합성(제4 단계)
[반응식 10]
Figure 112015053867919-pat00015
반응식 10의 합성과정을 살펴보면, 제3 단계에서 정제된 IAA-acetyl Methoxy-L-Valine의 끈적끈적한(skicky) 고체 분말을 취하여 아스코르빈산의 아세탈 그룹(acetal group)과 L-Valine 부분의 메톡시(methoxy group)의 탈보호 반응을 동시에 반응을 진행시킨다. 용해도 검사(solubility test) 및 튜브(tube) 반응성 검사 등을 통해, THF/DW에 용해시켜 적용할 수 있는 산촉매 하에서 반응성을 확인하였다. IAA-acetyl-MV 용액에 트리플루오르아세트산(trifluoroacetic acid)를 부가하여 60℃에서 6hr 동안 반응하여 탈보호 반응을 진행하였다. 반응 종료 후, 감압 농축하여 얻어진 잔류물을 다시 적합한 용매를 이용하여 재결정하였다. 이와 같이 재결정화된 반응식 10에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체인 3-O-Ascorbyl acetyl L-Valine(AA-Val)이다.
<3-O-Ascorbyl Acetyl Valine(AA-Val.)의 보호 및 탈보호 반응 원리>
[반응식 11]
Figure 112015053867919-pat00016
반응식 11에 의하면, 아미노산을 이용한 하이브리드형 아스코르빈산 유도체를 합성을 위해 먼저 보호 반응과 같이 각각의 반응물의 변형된(modified) 형태가 필요하다. 이를 위해, 아미노산 부분인인 L-Valine의 변형 반응이 필요하다. 반응식 11에서와 같이 본 합성에서는 L-Valine의 구조에서 카르복시산(carboxylic acid)의 보호 및 탈보호 반응이 진행된다.
최종 생성물은 화학식 2와 같이 구조 및 그에 대한 정의가 이루어진다.
[화학식 2]
Figure 112015053867919-pat00017
화학식 2에 의하면, 본 발명의 실시예에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체는 3-O-Ascorbyl Acetyl Valine(AA-Val.)이고, 평균중량(MW)은 333.29이다. 또한, 구조식은 C13H19NO9이며, E.A.는 C 46.85;H 5.75;N 4.20;O 43.20이다.
이하에서는 본 발명의 실시예인 3-O-Ascorbyl Acetyl-L-Valine의 효능을 알아보기 위해, 세포시험(cell-culture)을 통한 세포에서의 활성 및 효능 가능성을 알아보았다. 우선 NR 검사로 세포 안전성을 확인하였고, 콜라겐(collagen) 생합성 효과 및 멜라닌 생성 억제 효과를 통한 미백 효능을 확인해보았다.
<세포안전성>
세포안전성 시험에는 primary cultured human dermal fibroblast(HDFN)을 사용하였다. FGM-2(LONZA) 배지로 배양한(subculture) HDFN 세포를 10% 우혈청을 함유한 DMEM으로 2*104cells/mL으로 현탁하고, 이 세포현탁액 135uL를 96well에 넣고 24hr 동안 배양한 다음, 미리 희석된 농도별 3-O-Ascorbyl Acetyl-L-Valine(AA-Val)을 각각 15㎕를 넣고 3일 동안 다시 배양하였다. 세포 생존율의 확인은 NRU 검사를 통하여 확인하였으며 540nm 흡광도를 하기 식에 의해 계산하여 세포 생존율을 구하였다.
세포 생존율(%) = (시험군의 흡광도/공시료군의 흡광도)*100
도 11은 본 발명의 실시예에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 세포 독성을 확인하는 그래프이다. 도 11에 따르면, 고농도 범위 내에서도 세포독성이 나타나지 않음을 확인하였고, 이를 토대로 다양한 세포 활성을 확인할 수 있는 기반과 가능성을 확인할 수 있었다.
<콜라겐 생합성 촉진효과>
AA-Val의 콜라겐 생성촉진효과를 확인하기위해, 앞에서와 동일한 방법으로 초대 배양된 인간 섬유아세포(HDFN)를 이용하였다. 또한 세포배양 배지는 혈청에 의한 영향을 최소화하기 위해 세포 배양에서 사용하는 통상적인 혈청농도인 10% 대신 0.2%를 적용하였다. 실험방법을 간략히 소개하면, 0.2% FBS, 0.1% BSA를 함유한 DMEM 배지에 2.0*104cells /ML가 되도록 HDFN을 조절한 후, 이 세포액 135㎕를 96 microplate에 분주한 다음, 인큐베이터(incubator)에서 overnight pre-culture하고, 동일한 media로 교체한 후, 각 농도로 희석된 3-O-Ascorbyl acetyl-L-Valine(AA-Val)을 첨가하여 3일간 추가 배양하였다. 세포배양액을 이용하여 ELISA법으로 type-1 procollagen의 농도를 측정하였다.
도 12는 본 발명의 실시예에 의한 하이브리드 아스코르빈산 유도체인 AA-Val의 콜라겐 생합성 촉진효과를 확인하는 그래프이다. 도 12에 따르면, 또 다른 아스코르빈산 유도체인 AA-Ser보다는 다소 낮으나, 100ppm(㎍/mL)에서 약 145%이상의 생합성 촉진 효과를 나타내었을 뿐만아니라, 전체적으로 저농도 범위까지도 콜라겐(collagen)생합성 촉진 효과를 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
<멜라닌 생성억제 효과>
AA-Val의 미백효과를 알아보기 위해, 멜라노사이트를 이용한 멜라닌 생성억제 효과를 확인하였다. Test에 이용된 Cell-line은 C57BL6의 마우스 종양세포에서 유래된 B16F10 Melanoma로써 일반 미백 시험에서 많이 통용되고 있는 시험법이라 할 수 있다. Subculture한 B16F10 cell-line을 5*104cells/mL으로 맞춰진 solution 150㎕를 96well에 넣고 24시간 배양한 다음, AA-Val 농도별 시료 15㎕를 넣고 3~4일 동안 다시 배양하였다. 이 후 상등액을 새로운 96well에 넣고 405nm에서의 흡광도를 측정하여 생성된 melanin으로 인한 흑화도를 계산하였다.
시험결과, AA-Val은 도 13에서와 같이, 저농도 범위까지도 우수한 멜라닌 생성억제 효과를 확인할 수 있었고, 또 다른 아스코르빈산 유도체인 AA-Ser와는 달리, 우수한 미백 효능 효과를 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명의 serine과 Valine을 이용한 하이브리드 아스코르빈산 유도체인 AA-Ser와 AA-Val은 모두 세포 안정성을 가지며, 콜라겐 생합성 촉진 효과를 갖고 있어 주름 개선 효능을 기대할 수 있으며, AA-Val의 경우, 콜라겐 생합성 촉진효과 뿐만 아니라, 피부 미백 기능인 멜라닌 생성억제효과도 동시에 갖고 있어 이중적인 기능을 갖는 하이브리드형 아스코르빈산 유도체임을 확인할 수 있었다.
이상, 본 발명은 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 3-(아미노)-L-아스코르빈산인 것을 특징으로 하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체.
    [화학식 1]
    Figure 112016113335894-pat00035

    [화학식 2]
    Figure 112016113335894-pat00036
  2. 제1항에 있어서, 상기 3-(아미노)-L-아스코르빈산의 합성을 위하여, L-serine에 보호기(protecting group)인 아세탈 그룹이 도입된2,2-dimethy-L-serine에 bromoacetyl bromide 혹은 bromoacetyl chloride와 합성된 중간생성물인 2-bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-Serine를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 3-(아미노)-L-아스코르빈산의 합성을 위하여, L-Valine에 보호기(protecting group)인 메톡시 그룹이 도입된 Methoxy-L-Valine에 bromoacetyl bromide 혹은 bromoacetyl chloride와 합성된 중간생성물인 Bromoacetyl Methoxy-L-Valine를 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체.
  4. 삭제
  5. L-Serine에 아세탈 그룹인 보호기(protecting group)를 도입하여 2,2-dimethy-L-serine을 형성하는 단계; 및
    상기 2,2-dimethy-L-serine에 bromoacetyl bromide 혹은 bromoacetyl chloride와 합성된 중간생성물인 2-bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-Serine을 형성하는 단계; 및
    상기 중간생성물인 2-bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-Serine를 매개체로 하여 3-(아미노)-L-아스코르빈산을 합성하는 단계를 포함하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 보호기는 하기 반응식 1과 같이 히드록시 그룹(hydroxy group) 및 카르복시산 그룹(carboxylic acid group)을 보호하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 제조방법.
    [반응식 1]
    Figure 112016113335894-pat00037
  7. 삭제
  8. 제5항에 있어서, 상기 2-bromoacetyl-2,2-dimethyl-L-Serine을 형성하는 단계 이후에, 아스코르빈산 또는 아세탈 보호기를 갖는 아스코르빈산 변형체인 Isopropylidene ascorbic acid와 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 제조방법.
  9. L-Valine에 메톡시 그룹인 보호기(protecting group)를 도입하여 Methoxy-L-Valine을 형성하는 단계;
    상기 Methoxy-L-Valine에 bromoacetyl bromide 혹은 bromoacetyl chloride와 합성된 중간생성물인 Bromoacetyl Methoxy-L-Valine을 형성하는 단계; 및
    상기 중간생성물인 Bromoacetyl Methoxy-L-Valine을 매개체로 하여 3-(아미노)-L-아스코르빈산을 합성하는 단계를 포함하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 보호기는 하기 반응식 2와 같이 카르복시산 그룹(carboxylic acid group)을 보호하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 제조방법.
    [반응식 2]
    Figure 112016113335894-pat00038
  11. 제9항에 있어서, 상기 Bromoacetyl Methoxy-L-Valine을 형성하는 단계 이후에, 아스코르빈산 또는 아세탈 보호기를 갖는 아스코르빈산 변형체인 Isopropylidene ascorbic acid와 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 아스코르빈산 유도체의 제조방법.
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