KR101027217B1

KR101027217B1 - 신규한 수용성 베툴린 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101027217B1
Application number: KR1020090020662A
Authority: KR
Inventors: 박명옥; 권영구
Original assignee: 주식회사 바이오폴리메드
Priority date: 2009-03-11
Filing date: 2009-03-11
Publication date: 2011-04-06
Also published as: KR20100102335A

Abstract

본 발명은 신규한 수용성 베툴린 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 수용성 베툴린 유도체는 화학적 안정성 및 용해도가 증가하여, 피부에 자극 없이 콜라겐 합성을 증가시켜 피부재생 및 주름 감소, 피부탄력 증대, 엘라스틴 분해 억제 등 피부노화 억제에 유용하게 사용될 수 있다.

베툴린, 폴리에틸렌글리콜, 유도체, 콜라겐, 주름

Description

신규한 수용성 베툴린 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물 {Novel water-soluble betulin derivatives, a preparation thereof and a cosmetic composition comprising the same for improving wrinkles}

본 발명은 수용성 베툴린 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부 주름은 외부 환경 및 내부 환경에 대한 면역작용 능력이 떨어지면서 생겨난다. 이때 주름을 감소시키는데 가장 중요한 역할을 하는 것은 콜라겐이다. 세포 사이 조직물인 콜라겐은 주름을 감소시키고 피부탄력을 증대시키는 효능이 있다. 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질 세포로서 세포외 간질에 존재하며, 생체 단백질 총 중량의 약 30%를 차지하는 중요한 단백질이다. 콜라겐은 나선구조를 가지고 있으며, 이 나선구조는 콜라겐이 단백질 분해에 대한 내성을 갖도록 해주는 기능이 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의해 감소된다고 알려져 있다. 이에 피부 내 콜라겐의 합성 촉진 및 원천적 콜라겐 층의 붕괴를 방지하여 주름이 생기는 것을 방지하는 연구가 진행되고 있다.

콜라겐 합성 촉진 물질로는 기존의 레티노익산, TGF-beta, 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산, 클로렐라 추출물, 율피 추출물 등이 알려져 있다. 그러나 레티노익산은 매우 불안정하여 빛, 수분, 열, 산소에 민감한 문제점과 피부 적용 시 피부 트러블이 발생하는 문제점이 있고, 기존의 베툴린 및 베툴린산 유도체들은 암성 세포를 죽이거나 또는 그의 증식을 억제(WO 01/18029), 특히 인간 흑색종 세포를 선택적으로 사멸(WO 96/29068)시키며, 최근엔 항-백혈병 및 항-림프종 활성, 그리고 항-전립선암, 항-폐암 및 항-난소암 활성을 보인다고 보고(미국특허 제09/251309호)되는 등 피부 및 다른 용도에도 우수한 성질이 있으나, 물에 용해되지 않아서 피부 및 체내에 적용하기 어려운 점이 있어 왔다.

이에, 본 발명은 비수용성인 베툴린에 생체적합성 고분자인 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 유도체를 결합시켜 새로운 베툴린 유도체를 제조하였으며, 상기 제조된 베툴린 유도체가 베툴린과 달리 물에 높은 용해성을 가져 수용적인 실험 조건에서 콜라겐 합성이 증가됨을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규한 수용성 베툴린 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 수용성 베툴린 유도체를 제공한다.

상기 화학식 1에서,

R₁은 수소 또는 C₁~C₆의 저급 알킬기이고,

R₂는 -COOH 또는 -CH₂OH 이며,

n은 4 내지 1000의 정수 중 어느 하나, 바람직하게는 10 내지 500의 정수 중 어느 하나이며,

X는 -CH₂O-, -COO-, 또는 -OCONH-이다.

바람직하게, 본 발명의 베툴린 유도체는 하기 화학식 1a, 1b 또는 1c로 표시되는 베툴린 유도체를 포함한다.

상기 화학식 1a에서, R1, R2 및 n은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

상기 화학식 1b에서, R₁, R₂및 n은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

상기 화학식 1c에서, R₁, R₂ 및 n은 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

본 발명은 또한, 하기 화학식 2의 베툴린과 하기 화학식 3 또는 화학식 4에서 선택된 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 유기 용매 중에서 염기 존재 하에 반응시키는 것을 특징으로 하는, 상기 화학식 1의 베툴린 유도체의 제조방법을 제공한다.

화학식 2에서, R₂는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같다.

화학식 3에서, R₁ 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, X₂는 OH, 토실, 아민, 하이드라자이드 또는 할로겐이다.

화학식 4에서, R₁ 및 n은 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같고, X₃는 OH 또는 할로겐이다.

본 발명에 사용된 폴리에틸렌글리콜 유도체는 여러 유기용매에 쉽게 용해될 수 있고, 독성 없이 체내 지속성을 가지며 비항원성이다. 본 발명은 주로 선형의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 사용하여 본 발명에 따른 베툴린 유도체를 제조하였으나, 선형의 폴리에틸렌글리콜 뿐만 아니라, 당해 기술 분야에서 잘 알려진 가지달린 형태의 폴리에틸렌글리콜 유도체 또한 동일한 방법으로 베툴린과 결합시켜 유사한 효과를 나타내는 베툴린 유도체를 제조할 수 있을 것임은 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 그러한 베툴린 유도체 또한 본원 발명의 기술적 범위에 속한다.

본 발명의 제조방법에 대해 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

첫 번째 방법은, 화학식 2의 베툴린과 화학식 3의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매 중에서 염기 존재 하에 반응시켜 폴리에틸렌글리콜 유도체가 에테르 형태로 결합된 화학식 1a의 베툴린 유도체를 제조하는 방법이다.

여기서, 상기 유기용매는 무수 조건의 N-메틸-2-피롤리돈, 디클로로메탄, 디메틸포름아미드, 테트라히드로퓨란, 톨루엔, 1,4-디옥산 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 또는 그 혼합물을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 염기는 칼륨 t-부톡사이드(tert-butoxide), 수소화나트륨, 수산화나트륨, 수소화칼륨, 수산화칼륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨과 같은 금속염기와 피리딘, 트리에틸아민과 같은 유기염기 중에서 선택된 1종을 사용할 수 있다. 이때, 금속염기의 함량은 화학식 2의 베툴린 1몰에 대해 1.0 내지 2.0 몰당량(mole equivalent)이 바람직하며, 유기염기의 함량은 화학식 2의 베툴린 2.5 몰에 대해 2.5 내지 1.0 몰당량이 바람직하다.

두 번째 방법은, 화학식 2의 베툴린과 화학식 4의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매 중에서 염기 존재 하에 반응시켜 폴리에틸렌글리콜 유도체가 에스테르 형태로 결합된 화학식 1b의 레티놀 유도체를 제조하는 방법이다.

여기서, 축합제로는 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyPOB), N,N-디시클로헥실카보디이미드(DCC) 또는 1,3-디이 소프로필카보디이미드(DIC)가 바람직하고, 축합반응을 촉진시키는 촉매로는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBT) 또는 N,N-디메틸아미노피리딘(DMAP)이 바람직하다. 또한, 유기용매로는 상기 첫 번째 방법에서 사용된 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 테트라히드로퓨란 또는 디메틸포름아미드 중에서 선택된 1종을 사용할 수 있다. 또한 염기로는 N,N-디이소프로필에틸아민 또는 트리에틸아민을 사용하는 것이 바람직하다. 이때, 반응은 냉각 내지 실온에서 무수 조건에서 이루어진다.

세 번째 방법은, 화학식 2의 베툴린과 화학식 3의 폴리에틸렌글리콜 유도체중 X₂가 아민인 유도체를 유기용매 중에서 반응시켜, 연결기로 아미드기를 포함하는 폴리에틸렌글리콜 유도체가 카바메이트 형태로 결합된 화학식 1c의 베툴린 유도체를 제조하는 방법이다. 세 번째 방법의 반응 조건은 유기용매로는 상기 첫 번째 방법에서 사용된 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 테트라히드로퓨란 또는 디메틸포름아미드 중에서 선택된 1종을 사용할 수 있다. 축합제로는 N,N-디석시닐카보디이미드(DSC)가 바람직하다.

본 발명의 제조방법에서 출발물질로 사용되는 화학식 3의 화합물 중 토실 화합물은, 폴리에틸렌글리콜과 토실클로라이드를 반응시켜 제조할 수 있다. 이때 사용된 유기용매 및 염기는 상기 첫 번째 방법에서 사용된 유기용매 및 염기를 사용할 수 있다. 또한, 화학식 3의 화합물 중 X₂가 할로겐인 할라이드 화합물, 특히 클로라이드 화합물은 폴리에틸렌글리콜과 2,4,6-트리클로로-[1,3,5]-트리아진을 디메 틸포름아미드에 넣고 반응시키거나, 또는 폴리에틸렌글리콜, 티오닐클로라이드 및 피리딘을 디클로로메탄에 넣고 반응시켜 제조할 수 있으며, 상기와 같은 방법으로 소듐할라이드 또는 티오닐할라이드를 이용하여 화학식 3의 할라이드 화합물을 제조할 수도 있다.

또한, 본 발명의 제조방법에서 출발물질로 사용되는 화학식 4의 화합물 중, X3가 -OH인 카르복실산 화합물은 카복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜 화합물(mPEG-COOH)과 티오닐클로라이드를 반응시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서 사용된 염기, 축합제, 촉매 및 유기용매는 상기 열거된 것만으로 한정되지 않으며, 반응에 악영향을 끼치지 않는 범위 내에서 당 업계에 통상적으로 공지된 모든 것을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 베툴린 유도체를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 베툴린 유도체는 화학적 안정성 및 높은 수용성을 가져, 피부에 자극 없이 용이하고 안전하게 피부 내부로 침투될 뿐만 아니라, 피부 흡수력이 우수하여 콜라겐 합성을 증가시킴에 따라 피부재생 및 주름 감소, 피부탄력 증대, 엘라스틴 분해 억제 등 피부노화 억제 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명에 따른 베툴린 유도체는 주름 개선을 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 베툴린 유도체의 함량은 화장료 조성물의 총 중량에 대해 약 0.0001 내지 10.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 3 중량%의 양으로 포함될 수 있다.

본 발명의 주름 개선용 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형 화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용 가능한 담체는 제형에 따라 다양하다. 본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸 글리콜 오일이 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 담체 뿐만 아니라 보조제도 포함될 수 있으며, 예를 들어 보존제, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 및 이들의 혼합물이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 베툴린 유도체는 화학적 안정성 및 용해도를 증가시키며, 피부에 자극 없이 콜라겐 합성을 증가시켜 피부재생 및 주름 감소, 피부탄력 증대, 엘라스틴 분해 억제 등 피부노화 억제 효과가 우수하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 폴리에틸렌글리콜 유도체가 에테르 형태로 결합된 베툴린 유도체(화학식 1a)의 제조

1-1. 모노메톡시폴리(에틸렌글리콜)토실레이트 [Monomethoxypoly(ethylene glycol)tosylate, mPEG(1K)-OTs]의 제조

폴리에틸렌글리콜 모노메틸에테르(mPEG(1K)-OH, 100 mg, 0.1 mmol), 토실클로라이드(23 mg, 0.12 mmol) 및 트리에틸아민(0.07 ㎖, 0.5 mmol)을 디클로로메탄(DCM; 8 ㎖)에 녹이고, 질소 가스 하에서 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상기 반응액을 감압 농축시키고, 최소량의 디클로로메탄으로 녹여 디에틸에테르에 부어 침전시켰다. 감압 여과하여 고형물을 얻고 진공 건조시켰다(90 ㎎, 수율: 90%).

1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 7.80(d, 2H), 7.34(d, 2H), 4.16(t, 2H), 3.64 (PEG), 3.38(s, 3H), 2.45(s, 3H)

1-2. 모노메톡시폴리(에틸렌글리콜) 토실레이트 [Monomethoxypoly(ethylene glycol)tosylate, mPEG(2K)-OTs]의 제조

폴리에틸렌글리콜 모노메틸에테르(mPEG(2K)-OH, 200 mg, 0.1 mmol), 토실클로라이드(23 mg, 0.12 mmol) 및 트리에틸아민(0.07 ㎖, 0.5 mmol)을 디클로로메탄(DCM; 8 ㎖)에 녹이고, 질소 가스 하에서 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후 상기 반응액을 감압 농축시키고, 최소량의 디클로로메탄으로 녹여 디에틸에테르에 부어 침전시켰다. 감압 여과하여 고형물을 얻고 진공 건조시켰다(190 ㎎, 수율: 95%).

1-3. 화학식 1a의 베툴린 유도체의 제조

1-3-1. PEG(1K)-베툴린 에테르 제조

포태슘 t-부톡사이드(Potassium tert-butoxide)(47 mg, 0.3 mmol)와 베툴린(100 mg, 220 μmol)을 테트라히드로퓨란(2 ㎖)에 녹이고, 질소가스 하에 상온에서 5분 동안 교반시켰다. 상기 용액에 상기 1-1에서 제조한 mPEG(1K)-OTs(220 mg, 187 μmol)를 1,4-다이옥산(2 ㎖)에 녹인 용액을 천천히 가하고, 반응 온도를 100℃ 로 올려 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 디클로로메탄으로 추출하고 소금물(brine)로 씻어주었다. 유기층은 마그네슘설페이트 무수물로 건조시키고 감압 여과한 후 감압 농축시키고, 디에틸에테르에 부어 침전시켰다. 감압 여과하여 고형물을 얻고 진공 건조시켰다.(104 ㎎, 수율: 39%).

1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.66(s, 1H), 0.74(s, 3H), 0.80(s, 3H), 0.95(s, 3H), 0.96(s, 3H), 1.0(s, 3H), 1.66 (s, 3H), 2.36(m, 1H), 3.6(PEG), 3.38(s, 3H), 4.56(s, 1H), 4.66(s, 1H), 2.7(dd, 1H), 4.23(br s, 1H), 3.88(br s, 1H)

1-3-2. PEG(2K)-베툴린 에테르 제조

포태슘 t-부톡사이드(potassium tert-butoxide)(47 mg, 0.3 mmol)와 베툴린(38 mg, 85 μmol)을 테트라히드로퓨란(2 ㎖)에 녹이고, 질소 가스 하에 상온에서 5분 동안 교반시켰다. 상기 용액에 상기 1-2에서 제조한 mPEG(2K)-OTs(100 mg, 50 μmol)를 1,4-다이옥산(2 ㎖)에 녹인 용액을 천천히 가하고, 반응 온도를 100℃ 로 올려 24시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 디클로로메탄으로 추출하고 소금물(brine)로 씻어주었다. 유기층은 마그네슘설페이트 무수물로 건조시키고 감압 여과한 후 감압 농축시키고, 디에틸에테르에 부어 침전시켰다. 감압 여과하여 고형물을 얻고 진공 건조시켰다(49 ㎎, 수율: 41%).

1H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ 0.66(s, 1H), 0.74(s, 3H), 0.80(s, 3H), 0.95(s, 3H), 0.96(s, 3H), 1.0(s, 3H), 1.66 (s, 3H), 2.36(m, 1H), 3.6(PEG), 3.38(s, 3H), 4.56(s, 1H), 4.66(s, 1H), 2.7(dd, 1H), 3.88(br s, 1H), 4.23(br s, 1H)

실시예 2 : 폴리에틸렌글리콜 유도체가 에스테르 형태로 결합된 베툴린 유도체(화학 식 1b)의 제조

카르복실기를 갖는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜 (Monomethoxypolyethyleneglycol, mPEG-COOH) (100 mg, 100 μmol), PyPOB ((benzotriazol-1-yloxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate) (130 mg, 250 μmol) 및 1-히드록시벤조트리아졸(38 mg, 250 μmol)을 디메틸포름아미드 (DMF, 5 ㎖)에 넣고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 용액에 베툴린(55 mg, 122 μmol)을 THF(3 ㎖)에 녹인 용액을 넣고, N,N-디이소프로필에틸아민(44 ㎕, 250 μmol)을 가한 후, 질소 가스 하에 실온에서 24시간 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 과량의 디에틸에테르에 부어 침전시켰다. 감압 여과하여 고형물을 얻고 진공 건조시켰다(68 ㎎, 수율: 47%).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 0.66(s, 1H), 0.74(s, 3H), 0.80(s, 3H), 0.95(s, 3H), 0.96(s, 3H), 1.0(s, 3H), 1.66 (s, 3H), 2.36(m, 1H), 3.6(PEG), 3.38(s, 3H), 4.56(s, 1H), 4.66(s, 1H), 4.0(dd, 1H), 4.23(br s, 1H), 3.88(br s, 1H)

실시예 3 : 폴리에틸렌글리콜 유도체가 카바메이트 형태로 결합된 베툴린 유도체(화학식 1c)의 제조

mPEG1K-NH2 (67 mg, 67 μmol), 베툴린(38 mg, 67 μmol) 및 DSC(86 mg , 33 mmol)를 THF(4 ㎖)에 녹이고 24시간 동안 교반시켰다. 상기 반응물을 과량의 디에틸에테르에 부어 침전시켰다. 감압 여과하여 고형물을 얻었다. 이 화합물의 추출을 시행하였다. 얻어진 고형물은 진공 건조시켰다(45 ㎎, 수율: 48%).

실시예 4. PEG-베툴린 유도체의 고성능 액체크로마토그라피(HPLC)

상기 실시예 1-3-1 및 실시예 2에 따른 본 발명의 PEG-베툴린 에테르 및 PEG-베툴린 에스테르를 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)로 분리 정제한 그래프를 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다. 상기 고성능 액체 크로마토그래피는 하기의 조건 및 장치를 사용하여 수행하였다.

조건: 장치(system): Varian 220nm

컬럼: 캅셀 팩(Capcell pak)C8 Lichrosherⓡ100RP-8(5㎛). MERCK

이동상: 증류수(DW)+0.1%TFA(Trifluoroacetic acid)/ 아세토니트릴(Acetonitile) 0.1% TFA

온도: 40°C,

주입 부피량(Injection Vol.): 20㎕

유속: 0.8㎕/분

실행 시간(Run Time): 20 분

실시예 5: PEG-베툴린 유도체의 콜라겐 합성 효과

본 발명에 따른 베툴린 유도체의 콜라겐 합성 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

인간 섬유아세포(ATCC CLR-1947)를 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM 배지로 부유시킨 후, 96-웰 마이크로 플레이트에 동일한 세포수(2×10⁴ cell/well)로 접종시켜 37℃, 5% CO₂에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 FBS를 함유하지 않은 DMEM 배지로 교체해주고, 상기 실시예 1-3-1, 실시예 1-3-2 및 실시예 2에서 제조한 베툴린 유도체를 각각 농도별(10000~0.0001 ㎍/㎖)로 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 웰을 FBS가 함유되어있지 않은 DMEM 배지로 씻어주고, 동일 배지를 첨가하여 24시간 더 배양하였다. 배양 후 각 웰의 상등액을 모아 프로콜라겐 타입(procollagen type) IC-Peptide(PICP)의 양을 효소-결합된 면역 검정 키트(Enzyme-linked immuno assay kit)(TAKARA, Japan)를 사용하여 측정하였으며, PICP 양을 ng/1.8×10⁴세포로 환산하였다(Dermatol surg, 1998;24:1054-1058).

대조군으로는 레티놀 및 시료를 첨가하지 않고 배양한 것을 사용하였다.

결과는 표 1에 나타내었다.

첨가량 (㎍/㎖)	콜라겐 합성량 (ng/1.8×10⁴ cell)
첨가량 (㎍/㎖)	레티놀	실시예 1-3-1의 화합물	실시예 1-3-2의 화합물	실시예 2의 화합물	대조군
1000	x	858	600	923	209
100	x	949	327	1064	209
10	455	444	735	857	209
1	453	651	295	895	209
0.1	307	650	248	913	209
0.01	301	1322	642	832	209
0.001	369	791	374	916	209

표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 베툴린 유도체는 레티놀과 대조군에 비해 합성을 증가시켰다. 또한 시료 농도가 100 ug/ml 인 레티놀인 경우에는 세포 사멸(cell death)이 나타났으나, 베툴린 유도체의 경우에는 세포 사멸이 보이지않았다.

도 1은 실시예 1-3-1에 따른 본 발명의 PEG-베툴린 에테르를 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)로 분리 정제한 그래프이다.

도 2는 실시예 2에 따른 본 발명의 PEG-베툴린 에스테르를 고성능 액체 크로마토그라피(HPLC)로 분리 정제한 그래프이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 베툴린 유도체:

<화학식 1>

상기 화학식 1에서,

R₁은 수소 또는 C₁~C₆의 저급 알킬기이고,

R₂는 -COOH 또는 -CH₂OH 이며,

n은 4 내지 1000의 정수 중 어느 하나이며,

X는 -CH₂O-, -COO-, 또는 -OCONH-이다.
제 1 항에 있어서, 상기 베툴린 유도체는 하기 화학식 1a, 1b 또는 1c로 표시되는 화합물 중 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 베툴린 유도체:

<화학식 1a>

<화학식 1b>

<화학식 1c>

상기 화학식 1a 내지 1c 에서, R₁ 및 R₂는 제1항의 화학식 1에 대해 정의한 바와 같고, n은 10 내지 500의 정수 중 어느 하나이다.
하기 화학식 2의 베툴린과 하기 화학식 3의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매 중에서 염기 존재 하에 반응시키는 것을 특징으로 하는, 폴리에틸렌글리콜 유도체가 에테르 형태로 결합된 화학식 1a의 베툴린 유도체의 제조방법:

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 1a>

상기 화학식에서, R₁, R₂ 및 n은 제1항의 화학식 1에 대해 정의한 바와 같고, X₂는 OH, 토실 또는 할로겐이다.
하기 화학식 2의 베툴린과 하기 화학식 4의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매 중에서 염기 존재 하에 반응시키는 것을 특징으로 하는, 폴리에틸렌글리콜 유도체가 에스테르 형태로 결합된 화학식 1b의 베툴린 유도체의 제조방법:

<화학식 2>

<화학식 4>

<화학식 1b>

상기 화학식에서, R₁, R₂및 n은 제1항의 화학식 1에 대해 정의한 바와 같고, X₃는 OH 또는 할로겐이다.
하기 화학식 2의 베툴린과 하기 화학식 3의 폴리에틸렌글리콜 유도체를 유기용매 중에서 염기 존재 하에 반응시키는 것을 특징으로 하는, 폴리에틸렌글리콜 유도체가 카바메이트 형태로 결합된 화학식 1c의 베툴린 유도체의 제조방법:

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 1c>

상기 화학식에서, R₁, R₂ 및 n은 제1항의 화학식 1에 대해 정의한 바와 같고, X₂는 아민 또는 하이드라자이드이다.
제1항 또는 제2항의 베툴린 유도체를 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.
제6항에 있어서, 상기 베툴린 유도체의 함량은 화장료 조성물의 총 중량에 대해 0.0001 내지 10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 피부 주름개선용 화장료 조성물.