CZ290320B6

CZ290320B6 - Alkaloidy z Mappia foetida, způsob jejich výroby, jejich pouľití k výrobě farmaceutických prostředků a farmaceutické prostředky s jejich obsahem

Info

Publication number: CZ290320B6
Application number: CZ19941718A
Authority: CZ
Inventors: Ezio Bombardelli; Giuseppe Mustich; Luisella Verotta
Original assignee: Indena S. P. A.
Priority date: 1994-05-30
Filing date: 1994-07-15
Publication date: 2002-07-17
Also published as: RU94026100A; FI943294A0; EP0685481A2; ITMI941112A1; JP3615240B2; CA2127763A1; IT1269862B; GR960300006T1; KR950032253A; ES2081783T1; HU9402089D0; KR0149723B1; RU2123005C1; JPH07330772A; EP0685481B1; ITMI941112A0; SK83494A3; PL177042B1; PL304577A1; HK1003833A1

Abstract

Alkaloidy z Mappia foetida, obecn ho vzorce I, kde R je vod k nebo methoxyskupina foetidin 1 a 2, s protirakovinn²mi a protivirov²mi · inky. Tyto alkaloidy, rozpustn ve vod , se vyskytuj ve v ech stech rostliny a jsou prekurzory camptothecinu a 9-methoxycamptothecinu.\

Description

Alkaloidy z Mappia foetida, způsob jejich výroby, jejich použití k výrobě farmaceutických prostředků a farmaceutické prostředky s jejich obsahem

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových alkaloidů z Mappia foetida, jejich terapeutického využití a farmaceutických prostředků, které je obsahují.

o

Dosavadní stav techniky

Alkaloidy podle předkládaného vynálezu mají následující obecný vzorec I:

Po působení kyseliny nebo bází, anebo hydrolytických enzymů, foetidiny 1 a 2 kvantitativně uvolňují jednak známý alkaloid camptothecin, molekulu, která byla široce farmakologicky i klinicky testována sama o sobě, nebo ve formě derivátů, pro použití v onkologii a pro léčení některých virových onemocnění, anebo 9-methoxycaptothecin se stejným využitím.

-1 CZ 290320 B6

Camptothecin vzorce II

(II) byl poprvé izolován, spolu s dalšími sloučeninami, z Camptoteca acuminate (Nyssaceae) a z jiných rostlin, včetně Mappia foetida (Olinaceae); i když byl později dlouhodobě studován, dalším chemickým testováním byly překvapivě nalezeny nové alkaloidy, z nichž může camptothecin vzniknout až při zpracování surových rostlinných extraktů.

Mezi sloučeninami, z nichž vzniká camptothecin, je díky svému poměrně vysokému obsahu v rostlině zvláště významný foetidin 1. Vyjasnění jeho struktury pomocí spektroskopické analýzy a chemickým odbouráváním vedlo k identifikaci sloučeniny, charakterizované přítomností spermidinové jednotky, dvojitě esterifikované kyselinou kumarovou, která je naopak sama esterifikována otevřenou camptothecinovou jednotkou [viz vzorec I]. Tato sloučenina je obsažena ve všech částech rostliny, ale zejména v semenech a v kořenech, v množství 0,1 až 0,5%. Ve srovnání s camtothecinem má výhodu snadné rozpustnosti ve vodě při slabě kyselém pH; camptothecin je naopak zcela nerozpustný ve vodě i ve všech biologicky přijatelných nosičích, proto bylo věnováno značné úsilí možnosti částečné syntézy k odstranění tohoto nedostatku.

Podstata vynálezu

Foetidin 1 je získáván extrakcí různých částí rostliny Mappia foetida alifatickými alkoholy a ketony o nízké molekulové hmotnosti, samotnými, anebo ve směsi s vodou při teplotě místnosti. Extrakty jsou při nízké teplotě, nejlépe pod 25 °C a ve vakuu, koncentrovány, organické rozpouštědlo je odstraněno a vodný koncentrát je extrahován chlorovanými rozpouštědly k extrakci slabě zásaditých alkaloidů, kromě jiných i camptohecinu, 9-methoxycamptothecinu a mappicinů. Vodná fáze je pak extrahována n-butanolem nebo s vodou nemísitelnými alkoholy, které jsou pak do sucha odpařeny ve vakuu za teploty nižší než 30 °C. Zbytek, získaný z butanolových extraktů, je vyčištěn na silikagelu či podobných adsorbentech za použití směsi chlorovaných rozpouštědel, nejlépe methylenchloridu, a alifatických alkoholů, nejlépe methanolu nebo ethanolu, jako eluentu. Přednostně se užívají směsi v poměru 4:1 až 1:1. Frakce, obsahující alkaloidy podle vynálezu, jsou spojovány, zahuštěny do sucha a vzniklý zbytek je dále čištěn pomocí preparativní HPLC, například za použití kolony s náplní C8 v reverzní fázi, jako LiChroprep RP8 a eluentu, tvořeného gradientem směsi methanol/voda, od poměru methanol/voda 1:1 až k čistému methanolu. Frakce, obsahující alkaloid, jsou za nízké teploty a ve vakuu zahuštěn a vodný koncentrát je lyofilizován. Čisté alkaloidy jsou získány krystalizací.

Výsledné sloučeniny byly podrobeny biologickému testování na liniích lidských nádorových buněk (z vaječníků, mléčné žlázy, tlustého střeva, plic, odolným i neodolným vůči protinádorovým lékům a podobně) a na některých kmenech virů. O campthotecinu, nebo lépe o některých z jeho derivátů, je ve skutečnosti známo, že projevují cytotoxickou aktivitu, která je spojována s inhibicí topoizomerázy I a Π:

-2CZ 290320 B6

Cytotoxicita, například vůči buněčné linii karcinomu tlustého střeva, je zřejmá přibližně v koncentraci 25 nM. Protivirová aktivita foetidinu 1, i když v závislosti na různé odolnosti kmenů, se projevuje v koncentracích od 1 do lOOng/ml. Foetidin 2, lišící se od foetidinu 1 přítomností

Methoxylové skupiny v poloze 9, působí obdobně. Jako citlivé vůči alkaloidům podle vynálezu se projevily virus oparu, cytomegalovirus a viry HTV.

Antiproliferační účinnost (cytotoxicita) pro ovariální buněčnou linii A2780 WT:

foetidin I: IC₅₀ = 4,4 x 10'⁷ mol dm³camptothecin: IC₅o = 2.6,4 x 10'⁸ mol dm³

Protivirová účinnost proti herpetickému viru:

foetidin I: IC50 - 0,6 mikrogramů cm'³acyclovir: IC₅₀ = 1,2 mikrogramů cm'³

Sloučeniny podle vynálezu mohou být součástí všech druhů farmaceutických přípravků, ale především mohou být snadno podávány parenterálně ve vodném roztoku a při pH slučitelném s krví, aniž by působily obtíže jako srážlivost či neslučitelnost. V přípravcích mohou být použity všechny běžné pomocné látky. Dávkování těchto nových alkaloidů může být v rozmezí od 0,5 mg do 200 mg v jedné dávce a léčebném cyklu. Dávky přibližně 50 mg/m² byly předběžně ověřeny jako účinné.

Dále uvedené příklady dokládají vynález, aniž by však omezovaly jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Příprava foetidinu 1 ze semen Mappia foetida kg jemně umletých semen Mappia foetida se třikrát extrahuje vždy 50 1 acetonu za míchání a při teplotě místnosti spojené acetonové extrakty jsou zahuštěny ve vakuu na 10 1 a výsledný koncentrát je zředěn 10 1 1% roztoku kyseliny citrónové. Nerozpustné složky jsou odstraněny filtrací, zatímco vodná acetonová fáze je extrahována methylenchloridem až do vyčerpání látek, z nichž lze extrahovat alkaloidy (camptothecin, methoxycamptothecin a podobně). Vodná acetonová fáze je koncentrována na vodný roztok a po neutralizaci při pH 7,5 se extrahuje nbutanolem do úplné extrakce foetidinů 1 a 2. Roztok n-butanolu je odpařen do sucha a vzniklý zbytek je vysušen se ziskem přibližně 200 g butanolové frakce, která je frakcionována tak, že se 30 g butanolové frakce chromatografuje za použití 500 g silikagelu tak, že je kolona nejprve promyta směsí methylenchlorid/methanolu v poměru 4:1 a pak směsí týchž látek v poměru 7:3. Produkt, obsažený ve frakci, eluované směsí o poměru 7:3, je čištěn na koloně s náplní C8 v reverzní fázi, jako LiChroprep RP8 elucí gradientem methanol/voda. Frakce, obsahující foetidiny 1 a 2 jsou spojeny, odpařeny do sucha ve vakuu při teplotě nižší než 30 °C a zbytek je překrystalován ze směsi aceton/hexan. Získá se tak 5,1 g foetidinu 1 o následujících charakteristikách: teplota tání 157 až 158 °C, aj = -37,9 (c = 0,31, MeOH).

-3CZ 290320 B6

H-13'+H-15'), 2,02 (1H, m, H-19A), 1,96 (3H, s, CH₃CO), 1,90 (1H, m, H-19B), 1,74 (2H, m,

H-12'), 1,55 (2H, m, H-16'), 1,46 (2H, m, H-17'), 0,84 (3H, t, J=7,2, H-18).

ⁿC-NMR (78.1 Mhz, DMSO d6) δ: 175,23 (s, C-21), 170,81 (s, CH₃CO), 166,27 (s, C-9'),

165.83 (s, C-20'), 161,43 )s, C-16a), 159,40 (s, C-l'), 159,14 (s, C-15), 153,50 (s, C-2), 148,36 (s, C-13), 143.56 (s, C-3), 139,37 (d, C-7), 139,06 (d, C-22'), 131,74 (d, C-7), 130,58 (d, C-l 1), 130,33 (s, C-6), 129,63 (s, C-3'+C-5'), 129,56 (d, C-24'+ C-28'), 129,40 (d, C-12),

128.83 (d, C-9), 128,23 (s, C-8), 127,78 (d, C-10), 126,23 (d, C-4'), 126,13 (s, C-23'), 123,42 (s, C-16), 119,01 (d, C-8'), 118,68 (d, C-21'), 116,18 (d, C-2'+C-6'+C-25'+C-27'), 100,68 (d, C-14), 80,28 (d, C-20), 59,87 (t, C-17), 50,45 (t, C-5), 47,23 (t, C-13'), 45,36 (t, C-15'), 38,41 (t, C-18), 36,36 (t, C-ΙΓ), 33,40 (t, C-19), 26,99 (t, C-12'), 26,87 (t, C-17'), 24,4 (t, C-16'), 21,22 (q, CH₃CO), 9,29 (q, C-18).

Foetidin 2 (1,2 g), získaný krystalizací z matečných louhů foetidinu 1 čištěním na reverzní fázi za použití stejného chromatografíckého eluentu, má následující charakteristiky:

teplota tání 172 až 174 °C, a<j = -44,6 (c = 0,35, MeOH). NMR spektrum je kopií spektra foetidinu 1, kromě signálu -OCH₃ na aromatickém kruhu při 3,2 ppm.

Příklad 2 - Příprava lyofilizovaných lékovek s foetidinem 1 g foetidinu 1 je rozpuštěno v 500 ml destilované vody, obsahující 1,2 g kyseliny citrónové. Roztok je zfíltrován, sterilizován a v sterilní místnosti naplněn do 100 lékovek, které jsou rychle zmraženy a lyofilizovány.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Alkaloidy z Mappia foetida obecného vzorce I kde R je vodík nebo methoxyskupina.
2. Foetidin 1, alkaloid z Mappia foetida podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R je vodík.
3. Foetidin 2, alkaloid z Mappia foetida podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R je methoxyskupina.
4. Způsob výroby alkaloidů z Mappia foetida obecného vzorce I podle nároku 1,vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

a) extrakci různých částí rostliny Mappia foetida alifatickými alkoholy a ketony o nízké molekulové hmotnosti, samotnými nebo ve směsi s vodou při teplotě místnosti,

b) zahuštění extraktů ve vakuu při teplotě nižší než 25 °C,

c) extrakci vodného acetonového koncentrátu, získaného částečným odstraněním organického rozpouštědla, chlorovanými rozpouštědly, k extrahování slabě zásaditých alkaloidů,

d) extrakci vodné fáze n-butanolem nebo s vodou nemísitelnými alkoholy,

-5CZ 290320 B6

e) čištění butanolových extraktů, získaných zahuštěním při teplotě nižší než 30 °C ve vakuu, chromatografií na silikagelu nebo podobných adsorbentech, za použití směsi chlorovaných rozpouštědel a alifatických alkoholů jako rozpouštědel,

f) odpaření frakcí, obsahujících alkaloidy, do sucha a vyčištění zbytku pomocí preparativní HPLC, používající jako eluent gradient methanol/voda od poměru methanol/voda 1:1 až po čistý methanol,

g) lyofilizaci vzniklých vodných extraktů a krystalizaci čistých alkaloidů.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že v kroku e) jsou methylenchlorid a methanol nebo ethanol jednotlivě použity jako chlorovaná rozpouštědla a alifatické alkoholy, a to ve směsích o poměru 4:1 až 1:1.
6. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že v kroku f) se alkaloidy čistí na sloupci s náplní C8 v reverzní fázi.
7. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že jako aktivní přísadu obsahuje jeden alkaloid podle nároků 1 až 3.
8. Použití alkaloidů podle nároků 1 až 3 k výrobě léčiv, působících protivirově.