CZ289411B6

CZ289411B6 - Orto-substituované benzoylguanidiny, způsob jejich výroby, jejich pouľití, jakoľ i léčivo, které je obsahuje

Info

Publication number: CZ289411B6
Application number: CZ19971696A
Authority: CZ
Inventors: Andreas Dr. Weichert; Joachim Dr. Brendel; Heinz-Werner Dr. Kleemann; Hans Jochen Dr. Lang; Jan Robert Dr. Schwark; Udo Dr. Albus; Wolfgang Dr. Scholz
Original assignee: Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date: 1996-06-04
Filing date: 1997-06-02
Publication date: 2002-01-16
Also published as: DE19622370A1; EP0811610A1; SI0811610T1; AU2465097A; US6011063A; HRP970304A2; NZ314973A; MX9704094A; TW429243B; HRP970304B1; CN1175572A; HUP9700989A3; PT811610E; KR980002019A; IL120988A0; CN1064956C; ID17038A; AR008761A1; ES2166487T3; HUP9700989A2

Abstract

Orto-substituovan benzoylguanidiny obecn ho vzorce I, ve kter m substituenty R.sup.1.n. a R.sup.5.n. maj specifick² v²znam, jsou vhodn jako antiarytmick l iva s kardioprotektivn komponentou k profylaxi infarktu a k terapii infarktu a rovn i k l en anginy pectoris. Uveden slou eniny tak preventivn inhibuj patofyziologick p° hody p°i vzniku ischemicky indukovan²ch po kozen , zejm na p°i vyvol v n ischemicky indukovan²ch srde n ch arytmi .\

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká orto-substituovaných benzoylguanidinů, způsobu jejich výroby, jejichž použití jako léčiva nebo diagnostika, jakož i léčiva, které je obsahuje. Zmíněné orto-substituované benzoylguanidiny, charakterizované obecným vzorcem I, který je uveden níže, jsou nové látky ze skupiny substituovaných acylguanidinů, vyznačující se svou mimořádně vysokou účinností při inhibici výměny Na⁺/H⁺, velmi dobrými antiarytmickými vlastnostmi, provázenými kardioprotektivní komponentou a dostatečnou rozpustností ve vodě.

Dosavadní stav techniky

Sloučeniny, které jsou podobné sloučeninám obecného vzorce I podle tohoto vynálezu, jsou známé z Evropské patentové přihlášky č. 612 723 A 1. Tyto sloučeniny mají již jako substituenty na benzenovém jádře hydroxylové skupiny, ale žádné substituenty v orto-poloze, čímž se liší od orto-substituovaných benzoylguanidinů podle vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu jsou tedy orto-substituované benzoylguanidiny obecného vzorce I

/1/, ve kterém

R¹ představuje atom vodíku, trifluormethylovou skupinu nebo terc.butylovou skupinu,

R² znamená atom vodíku nebo acetoxyskupinu,

R³ představuje atom halogenu, methoxyskupinu, trifluormethylovou skupinu, terc.butylovou skupinu nebo acetoxyskupinu,

R⁴ představuje atom vodíku, atom halogenu nebo methoxyskupinu, a

R⁵ znamená atom vodíku, atom halogenu nebo methoxyskupinu, jakož i jejich farmaceuticky přijatelné soli.

Pokud sloučenina obsahuje jedno nebo více center asymetrie, tak mohou mít tato centra konfiguraci jak S, tak i R. Sloučeniny se mohou vyskytovat jako optické isomery, jako diastereomery, jako racemáty nebo jako jejich směsi.

- 1 CZ 289411 B6

Vynález se dále týká způsobu výroby sloučenin obecného vzorce I, který se vyznačuje tím, že se sloučenina obecného vzorce II

/11/, ve kterém substituenty R¹ až R⁵ mají uvedený význam a L značí snadno nukleofílně substituovatelnou a lehce odstranitelnou skupinu, uvádí do reakce s guanidinem.

Aktivované deriváty kyselin obecného vzorce II, ve kterém L značí alkoxylovou skupinu, s výhodou methoxylovou skupinu, fenoxylovou skupinu, fenylthioskupinu, methylthioskupinu, 2-pyridylthioskupinu nebo dusíkatý heterocyklus, s výhodou 1-imidazolyl, lze s výhodou získávat známým způsobem zodpovídajících chloridů karboxylových kyselin /obecný vzorec II, L = atom chloru/, které se mohou připravovat opět známým způsobem zodpovídajících karboxylových kyselin /obecný vzorec II, L = hydroxylová skupina/, například působením thionylchloridu.

Kromě chloridů karboxylových kyselin obecného vzorce II /L = atom chloru/ se mohou připravovat známým způsobem i další aktivované deriváty kyselin obecného vzorce II, a to přímo z odpovídajících derivátů benzoové kyseliny /obecný vzorec II, L = hydroxylová skupina/, jako jsou například methylesteiy obecného vzorce II, ve kterém L = methoxylová skupina, reakcí s plynným chlorovodíkem vmethanolu, imidazolidy obecného vzorce II reakcí skarbonyldiimidazolem /L - 1-imidazolyl; Staab, Angew, Chem. Int. Ed. Engl. 1, 351 až 367, 1962/, smíšené anhydridy obecného vzorce II reakcí s chlormravenčanem ethylnatým nebo stosylchloridem v přítomnosti triethylaminu v netečném rozpouštědle, rovněž tak i aktivací benzoových kyselin dicyklohexylkarbodiimidem /DCC/ nebo O-/(kyan(ethoxykarbonyl)methylen)amino/-l,l,3,3-tetramethyluroniumtetrafluorborátem /“TOTU“/ (viz Proceedings of the 21. European Peptide Symposium Peptides 1990, vydav. E. Giralt a D. Andreu, Escom, Leuden, 1991). Celá řada vhodných metod k přípravě aktivovaných derivátů karboxylových kyselin obecného vzorce II je popsána, i s uvedením literárních pramenů, v publikaci J. March, Advanced Organic Chemistry, Third Edition /John Wiley and Sons, 1985/, str. 350.

Reakce aktivovaného derivátu karboxylové kyseliny obecného vzorce Π s guanidinem probíhá známým způsobem v protickém nebo aprotickém polárním, ale netečném rozpouštědle. Při reakci methylesterů benzoových kyselin /obecný vzorec II, L = methoxylová skupina/ s guanidinem se osvědčil methanol, isopropylalkohol nebo tetrahydrofuran, a to při teplotách od 20 °C až k teplotě varu těchto rozpouštědel. Při většině reakcí sloučenin obecného vzorce Π s guanidinem ve formě fáze se s výhodou pracuje v aprotických netečných rozpouštědlech, jako je tetrahydrofuran, dimethoxyethan nebo dioxan. Ale také voda je upotřebitelná jako rozpouštědlo, když se přidává báze, jako například hydroxid sodný, při reakci sloučenin obecného vzorce II s guanidinem.

Když L = atom chloru, pracuje se s výhodou za přídavku činidla poutajícího kyselinu, například ve formě přebytečného guanidinu, který váže halogenvodíkovou kyselinu.

Výchozí deriváty benzoové kyseliny obecného vzorce II jsou částečně známy a v literatuře popsány. Neznámé sloučeniny obecného vzorce II lze připravovat metodami známými z literaCZ 289411 B6 tury. Získané benzoové kyseliny se potom převádějí některou z výše uvedených preparativních variant ve sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu.

Zavádění některých substituentů do polohy 2, 3, 4 a 5 se daří metodami známými z literatury, a to reakcemi s vytvořením příčné vazby /s pomocí paladia/ arylhalogenidů, popřípadě aiyltrifluormethanolfonátů, například s organostanany, organoborkyselinami nebo organoborany nebo s organickými sloučeninami mědi či zinku.

Benzoylguanidiny obecného vzorce I jsou obecně slabé báze a mohou vázat kyseliny za vzniku solí. Jako adiční soli s kyselinami přicházejí v úvahu soli všech farmakologicky přijatelných kyselin, například halogenidy, zejména hydrochloridy, mléčnany, sírany, citráty, vínany, octany, fosforečnany, methylsulfonany nebo p-toluensulfonany.

Sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu nemají nežádoucí a nevýhodné salidiuretické účinky. Naopak, ve srovnání se známými sloučeninami se vyznačují velmi dobrými antiaiytmickými vlastnostmi, které jsou například důležité při léčení takových onemocnění, která se vyskytují při projevech nedostatku kyslíku.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou mimořádně výhodné, díky svým farmakologickým vlastnostem, jako antiarytmicky účinná léčiva s kardioprotektivní komponentou, jak k profylaxi tak i k léčení infarktu a rovněž k léčení angíny pectoris, přičemž také preventivně inhibují nebo podstatně zmenšují patogyziologické děje při vzniku ischemicky indukovaných poškození, zejména při vývoji ischemicky indukovaných srdečních arytmií. Díky svému ochrannému působení proti patologickým hypoxickým a ischemickým situacím, a díky inhibici celulámího výměnného mechanismu Na7H⁺, mohou být sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu používány jako léčiva k terapii všech akutních nebo chronických poškození, která jsou způsobována ischemií, nebo následkem toho primárně nebo sekundárně vznikajících onemocnění. To se týká jejich použití jako léčiv při operativních zákrocích, například při transplantacích orgánů, při čemž sloučeniny podle vynálezu mohou být používány jednou k ochraně orgánů v dárci před odnětím a po něm, k ochraně odebraných orgánů, například při manipulaci nebo při jejich uložení ve fyziologických kapalinách, jednak také při převádění do organismu příjemce. Sloučeniny podle vynálezu jsou rovněž cenná, protektivně účinkující léčiva při provádění angioplastických operativních zákroků, například na srdci nebo též na periferních cévách. V souhlase s jejich protektivním účinkem proti ischemicky indukovaným poškozením jsou sloučeniny podle vynálezu vhodné rovněž jako léčiva k léčení ischemií nervového systému, zejména centrálního nervového systému, a při tom jsou též upotřebitelné například k léčení záchvatu mrtvice nebo edému mozku. Kromě toho jsou sloučeniny podle vynálezu obecného vzorce I také upotřebitelné při léčení různých forem šoku, jak například alergického, kardiogenního hypovolemického a bakteriálního šoku.

Kromě toho se sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu vyznačují ještě silným inhibičním účinkem na proliferaci buněk, například na buněčnou proliferaci fibroblastů a proliferaci buněk hladkého svalstva cév. Proto přicházejí sloučeniny obecného vzorce I v úvahu jako cenná terapeutika u takových onemocnění, u kterých proliferace buněk představuje primární nebo sekundární příčinu, a mohou být proto aplikovány jako antiaterosklerotika, jako prostředky proti pozdním diabetickým komplikacím, rakovinovým onemocněním, fibrotickým onemocněním, jako je plicní fíbróza, jatemí fíbróza nebo ledvinová fíbróza, hypertrofíe nebo hyperplazie orgánů, a především při hyperplazii prostaty, popřípadě při hypertrofíi prostaty.

Sloučeniny podle vynálezu jsou účinnými inhibitory buněčné výměny sodík-protony /měnič která je při mnoha onemocněních /esenciální hypertenze, ateroskleróza, diabetes apod./ zvýšena i v takových buňkách, které jsou snadno přístupné měření, jako například v erytrocytech, trombocytech nebo leukocytech. Sloučeniny podle vynálezu jsou proto vhodné jako vynikající a jednoduché vědecké pomůcky, například při jejich použití jako diagnostik k určování a rozlišování určitých forem hypertenze, ale také aterosklerózy, diabetů, proliferaktivních onemocnění

-3 CZ 289411 B6 atd. Nadto jsou sloučeniny obecného vzorce I podle vynálezu vhodné při preventivní terapii, kterou se zabraňuje vzniku vysokého krevního tlaku, například esenciální hypertenze.

Kromě toho bylo nalezeno, že sloučeniny obecného vzorce I vykazují příznivé působení na lipoproteiny v séru. Všeobecně se uznává, že pro vytvoření arteriosklerotických změn v cévách, především koronárního onemocnění srdce, představují příliš vysoké hodnoty lipidů v krvi, tzv. hyerlipoproteinemie, významný rizikový faktor. Pro profylaxi a regresi aterosklerotických změn má proto mimořádný význam snížení vysokých hodnot lipoproteinů v séru. Mimo redukci celkového obsahu cholesterolu v séru má mimořádný význam i pokles podílu specifických atero10 genních lipidových frakcí tohoto celkového obsahu cholesterolu, zejména lipoproeinů s nízkou hustotou /low density lipoproteins, LDL/ a lipoproteinů s velmi nízkou hustotou /very low density lipoproteins, VLDL/, poněvadž tyto lipidové frakce představují aterogenní rizikový faktor. Naproti tomu se lipoproteinům s vysokou hustotou /High density lipoproteins/ připisuje ochranná funkce proti koronárnímu onemocnění srdce. V souhlase s tím mají být hypolipidemika 15 schopna snižovat nejen celkový cholesterol, nýbrž především VLDL a frakce LDL v celkovém cholesterolu. Nyní bylo nalezeno, že sloučeniny obecného vzorce I, pokud se týká vlivu na hladinu lipidů v séru, vykazují cenné vlastnosti, které lze terapeuticky zhodnotit. Tak například signifikantně snižují zvýšené koncentrace LDL a VLDL v séru, které lze pozorovat například při zvýšeném dietetickém přijímání potravy bohaté na cholesterol a lipidy nebo při patologických 20 změnách látkové přeměny, jako jsou geneticky podmíněné hyperlipidemie. Mohou být proto přibírány při profylaxi a při regresi aterosklerotických změn, poněvadž vyžadují kauzální rizikový faktor, k tomu patří nejen primární hyperlipidemie, ale také určité sekundární hyperlipidemi, jaké se například vyskytují při diabetů. Navíc působí sloučeniny obecného vzorce I na zřetelné snížení výskytu infarktů, které jsou vyvolávány anomáliemi v látkové přeměně, 25 a zejména na zmenšení indukované velikosti infarktu a snížení stupně jeho závažnosti. Dále vytvářejí sloučeniny obecného vzorce I účinnou ochranu proti poškozením endotelu, indukovaným anomáliemi v látkové přeměně. Touto ochrannou cév proti syndromu endoteliální dysfunkce se sloučeniny obecného vzorce I stávají cennými léčivy k prevenci a terapii spazmů koronárních cév, aterogeneze a aterosklerózy, levostranné ventrikulámí hypertrofie a dilatované 30 kardiopatie, jakož i trombotických onemocnění.

Výše uvedené sloučeniny lze tedy výhodně používat pro výrobu léčiva k léčení hypercholesterolemie; pro výrobu léčiva k prevenci aterogeneze; pro výrobu léčiva k prevenci a léčení aterosklerózy; pro výrobu léčiva k prevenci a léčení onemocnění, která jsou vyvolávána zvýše35 nou hladinou cholesterolu, pro výrobu léčiva k prevenci a léčení onemocnění, která jsou vyvolávána endoteliální dysfunkcí; pro výrobu léčiva k prevenci a léčení hypertenze, která je vyvolána ateroskerózou, pro výrobu léčiva k prevenci a léčení aterosklerózou vyvolávaných trombóz; pro výrobu léčiva k prevenci a léčení hypercholesterolemií a dysfunkcí endotelu způsobovaných ischemických poškození a postischemických reperfuzních poškození, pro výrobu léčiv k prevenci 40 a léčení hypercholesterolemií a dysfunkcí endotelu indukovaných kardiálních hypertrofií a kardiomyopatií, pro výrobu léčiv k prevenci a léčení hypercholsterolemií a dysfunkcí endotelu indukovaných spazmů koronárních cév a infarktů myokardu, pro výrobu léčiva k léčení uvedených onemocnění v kombinaci s látkami snižujícími krevní tlak, především s inhibitory ACE /Angiotensin Converting Enzyme/ a antagonisty receptorů angiotenzinu; kombinace inhibitoru 45 NHE obecného vzorce I s účinnou látkou, která snižuje krevní hladinu lipidů, s výhodou s inhibitorem HMG-CoA-reduktázy /například sLovastinem nebo Pravastinem/, přičemž naposled jmenovaná látka způsobuje hypolipidemický účinek a tím stupňuje hypolipidemické vlastnosti inhibitoru NHE obecného vzorce I, se ukázala být příznivou kombinací se zesíleným účinkem a sníženou spotřebou účinné látky.

Je nárokováno podávání inhibitorů výměny sodík-protony obecného vzorce I jako novodobých léčiv ke snížení zvýšených krevních hladin lipidů, jakož i kombinace inhibitorů výměny sodíkprotony s léčivy, která snižují krevní tlak a/nebo účinkují hypolipidemicky.

-4CZ 289411 B6

Léčiva, která obsahují některou sloučeninu obecného vzorce I, mohou být aplikována perorálně, parenterálně, intravenózně, rektálně nebo inhalačně, přičemž způsob aplikace, kterému se dává přednost, závisí na momentálních projevech onemocnění. Sloučeniny obecného vzorce I mohou být při tom aplikovány buď samotné, nebo v kombinaci s galenickými pomocnými látkami, a to jak ve veterinární, tak i v humánní medicíně.

Které pomocné látky jsou vhodné pro žádanou lékovou formuje odborníkovi zřejmé na základě jeho odborných vědomostí. Kromě rozpouštědel, gelotvomých látek, čípkových základů, pomocných tabletovacích přísad a dalších nosičů účinných složek, mohou být používány například antioxidační látky, dispergační činidla, emulgátory, protipěnidla, chuťová korigencia, konzervační látky, zprostředkovadla rozpouštění nebo barviva.

Pro perorální aplikační formu se účinné látky mísí s vhodnými přísadami, jako jsou nosiče, stabilizátory nebo netečná zřeďovadla, a obvyklými metodami se zpracovávají do vhodných aplikačních forem, jako jsou tablety, dražé, tobolky, či vodné, alkoholické nebo olejové roztoky. Jako netečné nosiče mohou sloužit například arabská guma, magnézia, uhličitan hořečnatý, fosforečnan draselný, mléčný cukr, glukóza nebo škrob, zejména kukuřičný škrob. Příprava může probíhat formou suché nebo také vlhké granulace. Jako olejové nosiče nebo jako rozpouštědla jsou například upotřebitelné rostlinné nebo živočišné oleje, jako slunečnicový olej nebo rybí tuk.

Pro subkutánní nebo intravenózní aplikaci se účinné sloučeniny, pokud je to žádoucí, uvádějí s pomocí obvyklých substancí, jako jsou zprostředkovadla rozpouštění, emulgátory nebo další pomocné látky, do formy roztoku, suspenze nebo emulze, jako rozpouštědla přicházejí v úvahu například voda, fyziologický roztok chloridu sodného nebo alkoholy, například ethanol, propylalkohol nebo glycerol, kromě toho také roztoky cukrů, například roztoky glukózy nebo manitolu, nebo také směsi různých jmenovaných rozpouštědel.

Jako farmaceutické přípravky pro aplikaci ve formě aerosolů nebo sprejů jsou vhodné například roztoky, suspenze nebo emulze účinné látky obecného vzorce I ve farmaceuticky nezávadném rozpouštědle, zejména v ethanolu nebo ve vodě, nebo ve směsi těchto rozpouštědel.

Přípravek může podle potřeby obsahovat ještě i jiné farmaceutické pomocné látky, jako jsou tenzidy, emulgátory a stabilizátory, a také hnací plyn. Takový přípravek obsahuje účinnou látku obvykle v koncentraci asi od 0,1 až asi do 10 % hmotn., zejména asi od 0,3 až asi do 3 % hmot.

Jak veliké má být dávkování aplikované účinné látky obecného vzorce I a jak častá má být aplikace, závisí na síle účinku a na délce trvání účinku použitých sloučenin; kromě toho také na druhu a závažnosti onemocnění, které má být léčeno, a pochopitelně na pohlaví, věku, hmotnosti a individuální reaktivitě savce, který má být léčen.

Průměrně činí denní dávka sloučeniny obecného vzorce I u pacienta o hmotnosti asi 75 kg nejméně 0,001 mg/kg, s výhodou 0,01 mg/kg, až nejvýše 10 mg/kg, s výhodou 1 mg/kg tělesné hmotnosti. Při akutním propuknutí onemocnění, přibližně ihned po záchvatu srdečního infarktu, mohou být potřebné ještě vyšší a především častější dávky, například až do 4 jednotlivých dávek na den. Zejména při intravenózní aplikaci, například u pacienta s infarktem na jednotce intenzivní péče, může potřebná dávka činit až 200 mg na den.

Příklady provedení vynálezu

Experimentální část

Obecný předpis pro přípravu benzoylguanidinů obecného vzorce I

Varianta A: z benzoových kyselin /obecný vzorec II, 1 = hydroxylová skupina/

- 5 CZ 289411 B6

1,0 ekvivalentu derivátu benzoové kyseliny obecného vzorce II se rozpustí, popřípadě suspenduje v bezvodém tetrahydrofuranu /5 ml/mmol/ a ihned se přidá 1,1 ekvivalentu karbonyldiimidazolu. Po míchání po dobu 2 h při teplotě místnosti se do reakčního roztoku vnese 5,0 ekvivalentu guanidinu. Po míchání přes noc se tetrahydrofuran oddestiluje za sníženého tlaku /v rotační odparce/, odparek se rozloží vodou, upraví pomocí 2 N chlorovodíkové kyseliny na pH 6 až 7 a odpovídající benzoylguanidin /vzorec 1/ se odfiltruje. Takto získané benzoylguanidiny se mohou reakcí s vodným methanolickým nebo etherickým roztokem chlorovodíku nebo jiných farmakologicky snášenlivých kyselin převádět v odpovídající soli.

Obecný předpis pro přípravu benzoylguanidinů obecného vzorce I

Varianta B: z alkylesterů benzoových kyselin /obecný vzorec II, L = O-alkylová skupina/

Směs 1,0 ekvivalentu alkylesterů benzoové kyseliny obecného vzorce II a 5,0 ekvivalentu guanidinu /volné báze/ se rozpustí v isopropylalkoholu nebo suspenduje v tetrahydrofuranu a vaří pod zpětným chladičem tak dlouho, až reakce dokonale proběhne /kontrola na tenké vrstvě/. Typická reakční doba je 2 až 5 h. Rozpouštědlo se oddestiluje za sníženého tlaku /v rotační odparce/, odparek se vyjme do ethylacetátu a 3x promyje roztokem hydrogenkarbonátu sodného. Po vysušení pod síranem sodným se rozpouštědlo oddestiluje ve vakuu a odparek se chromatografiije na křemelině s použitím vhodného elučního činidla, například směsi ethylacetát-methanol v poměru 5:1.

/Příprava solí viz varianta A/

Příklad 1

Hydrochlorid 4-acetyloxy-2-chlor-5-trifluormethyl-benzoylguanidinu

Bezbarvé krystaly M⁺ + H = 324

Z 2-chlor-4-hydroxy-5-trifluormethyl-benzoylguanidinu acetylací acetylchloridem v přítomnosti uhličitanu česného v prostředí NMP a následující přípravou hydrochloridu podle varianty A.

Příklad 2

Hydrochlorid 4-acetoxy-2-methoxy-5-triflormethyl-benzoylguanidinu

Bezbarvé krystaly Μ* + H = 320

Ze 4-hydroxy-2-methoxy-5-trifluormethyl-benzoylguanidinu acetylací acetylchloridem v přítomnosti uhličitanu česného v prostředí NMP a následující přípravou hydrochloridu podle varianty A.

Příklad 3

Hydrochlorid 3-acetoxy-2-methoxy-5-terc .butyl-benzoylguanidinu

Bezbarvé krystaly M⁺ + H = 308

Ze 3-hydroxy-2-methoxy-5-terc.butyl-benzoylguanidinu acetylací acetylchloridem v přítomnosti uhličitanu česného v prostředí NMP a následující přípravou hydrochloridu podle varianty A.

-6CZ 289411 B6

Zkratka NMP znamená ve všech příkladech N-methylpyrrolidon.

Farmakologické údaje:

Metoda

a) Látky

BCECF-AM (acetoxymethylester 2‘,7‘-bis-(2-karboxyethyl)-5,6-karboxyfluoresceinu) byl získán od firmy Molecular Probes (Eugene, OR, USA) a připraven jeho zásobní roztok o koncentraci 1 mmol/1 v DMSO (dimethylsulfoxidu).

Reaktanty pro buněčnou kulturu byly získány od firmy Seromed Biochrom KG (Berlín, SRN), s výjimkou BSA (albuminu hovězího séra), dispasy II a geneticinu, které byly získány od firmy Boehringer Mannheim (SRN). Geneticin byl připraven jako zásobní roztok v koncentraci 80 mg/ml vHEPES-pufru (100 mmol/1, pH 7,3; HEPES = 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonová kyselina).

Všechny ostatní chemikálie byly v analytické čistotě a byly získány od firem Riedel-de-Haen (Seelze, SRN), Měrek (Darmstadt, SRN) a Sigma (Diesenhofen, SRN).

b) Buněčná kultura

Linii myších plicních fibroblastových L-buněk defektní na antiportovou aktivitu Na⁺/H⁺ (LAPÍ) poskytl prof. J. Pouysségur (University of Nice, Francie), stejně jako cDNA kódující lidský měnič sodík-vodík subtype 1 (NHE1). Tato cDNA kódující NHE1 byla vnesena do savčího expresního vektoru pMAMweo. Expresní plazmid byl transfektován do myších plicních fibroblastových buněk deficitních na NHE (LAPÍ). V buněčné kultuře za přítomnosti geneticinu byly vyselektovány buňky stabilně transfektované expresním plazmidem. Selekce buněk exprimujících funkční NHE1 byla prováděna pomocí postupu používajícího kyseliny (acid load technique), který popsal prof. Pouysségur a jeho spolupracovníci (Franchi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1986) 83: 9388 - 9392). Buňky exprimující NHE1 byly klonovány a dále charakterizovány pokud jde o expresi NHE1. Transfektované fibroblasty byly kultivovány vlscově médiu doplněném gentimicinem (50 pg/ml), penicilinem (100 jednotek/ml), streptomycinem (100 pg/ml), L-glutaminem (2 mmol/1), glutathionem a L-(+)-askorbovou kyselinou (obě tyto látky byly použity v koncentraci 5 pg/ml; ochranné medium Biotect), selekčním činidlem geneticinem (400 pg/ml) a tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem (10%).

c) Test

Měření pHj

Měření pHj bylo provedeno za použití pH-senzitivního fluorescenčního barviva 2‘,7‘-bis-(2karboxyethyl)-5,6-karboxyfluoresceinu (BCECF). Transfektované buňky exprimující NHE1 byly jemně seškrábnuty z kultivačních misek pomocí nářadí od firmy Falcon. Oddělené buňky byly centrifugovány (100 g po dobu 5 minut při teplotě místnosti) a resuspendovány vHBS (HEPESem pufrovaném fyziologickém roztoku o složení: 135 mmol/1 NaCl, 5 mmol/1 KC1, 1 mmol/1 CaCl₂, 1 mmol/1 MgSO₄, 20 mmol/1 HEPS (4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinethansulfonové kyseliny), 5 mmol/1 glukózy a 1 g/1 albuminu hovězího séra; pH 7,4). Buněčná suspenze byla inkubována s 5 μΜ acetoxymethylesteru 2‘,7‘-bis-(2-karboxyethyl)-5,6-karboxyfluoresceinu po dobu 20 minut při teplotě 37 °C. Buňky byly poté promyty pro odstranění extracelulámího barviva, resuspendovány v HBS a získaná suspenze buněk obsahující asi 8x10⁶fibrolastových buněk na ml byla použita pro zkoumání. Pro zajištění rovnoměrného rozmístění buněk byla suspenze uvedena do rotačního pohybu za použití míchacího zařízení od firmy Ktihn

-7CZ 289411 B6 & Bayer (Nidderau, SRN) při teplotě místnosti. Fluorescence intracelulámího BCECF byla měřena za použití duálně síťovaného jednofotonového sčítacího fluorimentu Deltascan (Photon Technology Intemational, Suth Brunswick N.J., USA) s excitační vlnovou délkou 505 a 440 nm a emisní vlnovou délkou 535 nM (šíře štěrbiny 5 nm). Držák kyvety termostaticky udržoval teplotu 37 °C.

Pro kalibraci pHj vs. úrovně fluroescence byly vzorky buněčné suspenze obsahující BCECF o objemu 25 μΐ přidány k 955 μΐ kalibračního pufru (složení: 25 mmol/1 NaCl, 120 mmol/1 KC1, 1 mmol/1 MgCl₂, 1 mmol/1 CaCl₂, 10 mmol/1 glukózy, 10 mmol/1 4-morfolinpropansulfonové kyseliny (MOPS), pH upraveno hydroxidem draselným na hodnotu v rozmezí od 6,6 do 7,4) a ošetřeny 20 μΐ 5% dispergátoru Triton X-100 pro lyžování buněk (Asterie a kol., 1989). Kalibrace byla prováděna na konci každé série pokusů.

Test na měnič Na⁺/H⁺ subtypu 1 a stanovení IC₅₀

Intracelulámí acidifikace transfektovaných fíbroblastových buněk byla provedena pomocí prepulsní techniky používající chlorid amonný. Ve stručnosti byly buňky ošetřeny jak je popsáno výše s tím rozdílem, že HBS obsahoval 20 mmol/1 chloridu amonného (přidání chloridu amonného do HBS bylo vyrovnáno ekvivalentním snížením množství chloridu sodného). Intracelulámí acidifikace byla vyvolána přidáním 975 μΐ pufru bez chloridu amonného ke vzorkům (25 μΐ) buněčné suspenze obsahující chlorid amonný. Následující úrovně obnovy pH byly sledovány v roztoku obsahujícím Na⁺ (složení: 133,8 mmol/1 NaCl, 4,7 mmol/1 KC1, 1,25 mmol/1 CaCl2, 1,25 mmol/1 MgCl2, 0,97 mmol/1 Na2HPO4, 0,23 mmol/1 NaH2PO4, 5 mmol/1 glukózy a 5 mmol/1 HEPES, pH 7,0) nebo v roztoku neobsahujícím Na⁺ (složení: 133,8 mmol/1 cholinchloridu, 4,7 mmol/1 KC1, 1,25 mmol/1 CaCl2, 1,25 mmol/1 MgCl₂, 0,97 mmol/1 K₂HPC>4, 0,25 mmol/1 KH₂PO₄, 5 mmol/1 glukózy a 5 mmol/1 HEPES, pH 7,0). Pro test byly rychlosti obnovy zaznamenávány 2 minuty. Křivka obnovy pH, v roztoku obsahujícím Na⁺ byla definována jako 100% aktivita NHE a křivka obnovy pHj v roztoku neobsahujícím Na⁺ byla definována jako 0% aktivita NHE.

Testované sloučeniny byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) ve 100-násobně vyšší koncentraci a přidány k roztoku obsahujícímu Na⁺, před přidáním buněk. Pro stanovení residuální aktivity byly sloučeniny testovány při koncentraci 3 μΜ.

Sloučeniny z výše uvedených příkladů vykazovaly ve výše uvedených testů následující hodnoty: sloučenina z příkladu 1: reziduální aktivita 5 % sloučenina z příkladu 2: reziduální aktivita 14 % sloučenina z příkladu 3: hodnota IC₅₀ 0,24 pmol/l.

Průmyslová využitelnost

Orto-substituované benzoylguanidiny podle vynálezu jsou díky svým příznivým farmakodynamickým a fyzikálním vlastnostem (dostatečná rozpustnost ve vodě) vhodnými výchozími látkami pro výrobu léčiv, jejichž indikacemi jsou onemocnění oběhového a nervového systému a navíc i onemocnění, která jsou vyvolána zvýšenou hladinou cholesterolu v organismu. V kombinaci s obvyklými pomocnými farmaceutickými látkami je lze zpracovávat do různých lékových forem, které jsou používány při běžných způsobech aplikace.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Orto-substituované benzoylguanidiny obecného vzorce I ve kterém

R¹ představuje atom vodíku, trifluormethylovou skupinu nebo terc.butylovou skupinu,

R² znamená atom vodíku nebo acetoxyskupinu,

R³ představuje atom halogenu, methoxyskupinu, trifluormethylovou skupinu, terc.butylovou skupinu nebo acetoxyskupinu,

R⁴ představuje atom vodíku, atom halogenu nebo methoxyskupinu, a

R⁵ znamená atom vodíku, atom halogenu nebo methoxyskupinu, jakož i jejich farmaceuticky přijatelné soli.
2. Způsob výroby orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že se sloučenina obecného vzorce II ve kterém mají symboly R¹ až R⁵ významy uvedené v nároku 1 a L znamená snadno nukleofilne substituovatelnou a lehce odstranitelnou skupinu, podrobí reakci s guanidem.
3. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení nebo profylaxi onemocnění, která jsou vyvolána ischemickými stavy.
4. Orto-substituovaný benzoylguanidin obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití k léčení a profylaxi onemocnění, která jsou vyvolána ischemickými stavy.

-9CZ 289411 B6
5. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení nebo profylaxi srdečního infarktu a arytmie.
6. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení nebo profylaxi angíny pectoris.
7. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení nebo profylaxi ischemických stavů srdce.
8. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení nebo profylaxi ischemických stavů periferního a centrálního nervového systému a záchvatu mrtvice.
9. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení nebo profylaxi ischemických stavů periferních orgánů a končetin.
10. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení stavů šoku.
11. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu prostředku upotřebitelného při chirurgických operacích a transplantacích orgánů.
12. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu prostředku ke konzervování a ukládání transplantátů pro chirurgické zákroky.
13. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení onemocnění, jejichž primární nebo sekundární příčinou je buněčná proliferace, a tedy jeho použití pro výrobu antiaterosklerotika, prostředku proti pozdním diabetickým komplikacím, proti rakovinným onemocněním, proti fibrotickým onemocněním jako je fibróza plic, fibróza jater nebo fibróza ledvin, a proti hyperplazii prostaty.
14. Použití orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu léčiva k léčení nebo profylaxi poruch metabolismu tuků.
15. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství orto-substituovaného benzoylguanidinu obecného vzorce I podle nároku 1.