NO309468B1 - Fenylsubstituerte alkenylkarboksylsyreguanidider, en fremgangsmåte for deres fremstilling, deres anvendelse såvel som legemidler inneholdende dem - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fenylsubstituerte alkenylkarboksylsyre-guanidider i en fremgangsmåte for deres fremstilling, deres anvendelse så vel som legemidler inneholdende dem.

Foreliggende oppfinnelse angår fenylsubstituerte alkenylkarboksylsyre-guanidider med formel I

hvor T står for:

R(F) står for hydrogen, F, Cl, Br, I, (Ci-C8)-alkyl

R(E) er uavhengig definert som R(F);

R(l) er uavhengig definert som T;

eller

R(l) står for hydrogen, -OkCmH2m.i, F, Cl, Br, I, SOr2NR(31)R(32), -Ou(CH2)vC6H5, O-pyridyl;

k står for 0 eller 1;

m står for 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8;

p står for 0, 1, 2, 3 eller 4;

q står for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8;

r2 står for 0, 1 eller 2;

R(31) og R(32) er uavhengig av hverandre; H, (Ci-Cg)-alkyl eller (Ci-C8)-perfluoralkyl; eller R(31) og R(32) står sammen for 4 eller 5 metylgrupper av hvilke en CH2-gruppe kan være erstattet av O, S, NH, NCH3eller N-benzyl;

u er 0 eller 1;

ver 0, 1, 2, 3 eller 4;

hvor fenylkjernene er ikke-substituerte eller substituerte med 1-3 substituenter valgt blant gruppen bestående av F, Cl, metyl, metoksy, -(CH2)WNR(21)R(22);

R(21) og R(22) står uavhengig av hverandre for (d-C4)alkyl;

w står for 1, 2, 3 eller 4;

R(2), R(3), R(4) og R(5) er uavhengig av hverandre definert som R(l),

eller

R(l) og R(2) eller R(2) og R(3) står sammen for -CH-CH=CH-CH-;

hvor resten R i molekylet minst er tilstede to ganger, imidlertid høyst tre ganger; såvel som deres farmasøytiske akseptable salter.

Foretrukket er forbindelser med formel I, hvor,

T står for:

R(F) står for hydrogen, F, Cl, (CrC4)-alkyl;

R(E) er uavhengig definert som R(F);

R(l) er uavhengig definert som T;

eller

R(l) står for hydrogen, -OkCmH2ra+i, F, Cl, Br, I, -Ou(CH2)vC6H5;

k er 0 eller 1;

mer 0, 1, 2, 3 eller4;

q er 1, 2, 3 eller 4;

u er 0 eller 1;

v er 0, 1 eller 2;

hvor fenylkjernene er ikke-substituerte eller substituerte med 1-3 substituenter utvalgt blant gruppen bestående av F, Cl, metyl, metoksy, -(CH2)WN(21)R(22);

R(21) og R(22) står for H, (Ci-C4)-alkyl;

w står 1, 2, 3 eller 4;

R(2), R(3), R(4) og R(5) er uavhengig av hverandre definert som R(l),

eller

R(l) og R(2) eller R(2) og R(3) står sammen for -CH-CH=CH-CH-;

hvor resten R i molekylet imidlertid alltid er to ganger tilstede.

Spesielt foretrukket er forbindelser med formel I, hvor:

T står for

R(F) står for hydrogen, F, Cl, (Ci-C4)-alkyl;

R(E) er uavhengig definert som R(F);

R(l) er uavhengig definert som T;

eller

R(l) står for hydrogen, -OkCmH2m+1, F, Cl, -Ou(CH2)vC6H5;

k er 0 eller 1;

mer 0, 1, 2, 3 eller4;

q er 1,2, 3 eller 4;

u er 0 eller 1;

v er 0 eller 1;

hvor fenylkjernene er ikke-substituert eller substituert med 1-3 substituenter utvalgt blant gruppen bestående av F, Cl, metyl, metoksy, -(CH2)WN(21)R(22), R(21) og R(22) står uavhengig av hverandre for H, (Ci-C4)-alkyl;

w er 1, 2, 3 eller 4;

R(2), R(3), R(4) og R(5) er uavhengig av hverandre og definert som R(l);

eller

R(l) og R(2) eller R(2) og R(3) står sammen for -CH-CH=CH-CH-,

hvor resten T er tilstede kun to ganger i molekylet.

Helt spesielt foretrukket er de følgende forbindelsene: 1.2- bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, 1.3- bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, 1.4- bis[3 -(E-2-metyl-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, 2,3-bis[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]naftalin-dihydroklorid. 1.2- bis[3-(Z-2-fluor-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, l-[3-(Z-2-fluor-propensyreguanidid)]-2-[3-(E-2-metyl-propensyreguandid)]benzen-dihydrokloris,

1.3- bis-[3-(Z-lfuor-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid,

3-(4-klor-3-guanididkarbonyl-5-fenyl)fenyl-2-metyl-propensyreguanidid,

l,3-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguamdid)]2-metoks<y>-5-met<y>l-benzeri-hydroklorid,

l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-metyl-benzen-dihydroklorid,

1.2- bis-[(3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4,5-diklor-benzen-dihydroklorid,

1.3- bis-[3-(E-propensyreguanidid)]benzen dihydroklorid,

l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-brom-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreg^amdid)]-4-(4-rnetoksyfenoksy)-benzen-dihydroklorid,

1.2- bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguamdid)]-4-(4-metyl-fenoksy)-benzen-dihydroklorid, 1,3 -bis- [3 -(E-2-metyl-propensyreguanidid)] - 5 -metoksy-benzen-hydroklorid, 1.3- bis- [3 -(E-2-metyl-propensyreguanidid)] -5 -tert. -butyl-benzen-hydroklorid, 1.4- bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-2,5-diklor-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(fenoksy)-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguamdid)]-4-(rnetoksy)-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(etoksy)-benzen-dihydroklorid, og l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(3-pyridyloksyl)-benzen-dihydroklorid.

Inneholder forbindelsene i formel I en eller flere asymmetrisentre så kan disse være konfigurert såvel S som også R. Forbindelsene kan foreligge som optiske isomerer, som diastereomerer, som racematere eller som blandinger av disse.

Dobbelbindingsgeometrien til forbindelsene med formel I kan såvel være E som også Z. Forbindelsene kan også foreligge som dobbelbindingsisomerer i blanding.

De angitte alkyl- og perfluoralkylrestene kan være såvel rettkjedede som forgrenede.

Oppfinnelsen angår dessuten fremgangsmåter for fremstilling av forbindelser I, som er kjennetegnet ved at man omsetter en forbindelse med formel II med guanidin, hvor R(l), R(2), R(3), R(4), R(5), R(E) og R(F), har de ovenforangitte betydninger og L står for en lett nukleofil substituerbar avspaltbar gruppe.

De aktiverte syrederivater med formel II hvor L står for en alkoksy-, fortrinnsvis en metoksygruppe, en fenoksygruppe, fenyltio-, metyltio-, 2-pyridyltiogruppe, en nitrogenheterosyklus, fortrinnsvis 1-imidazolyl, oppnår man fordelaktig på kjent måte fra det til grunnliggende karboksylsyrekloridet (formel II, L = Cl), som man igjen videre kan fremstille på kjent måte fra den til grunnliggende karboksylsyren (formel II, L = OH) eksempelvis med tionylklorid.

Ved siden av karboksylsyreklorid med formel II (L = Cl) lar det seg også fremstille ytterligere aktiverte syrederivater med formel II på kjent måte direkte fra de til grunnliggende alkenylsyrederivater (formel IIL = OH), som eksempelvis metylester med formel II, hvor L = OCH3, ved behandling med gassformig HC1 i metanol, imidazolidet med formel II med behandling med karbonyldimidazol [L = 1-imidazolyl, Staab, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1, 351-367 (1962)], det blandede anhydrid II med Cl-COOC2H5eller tosylklorid i nærvær av trietylamin i et inert oppløsningsmiddel, som også aktiveringen av alkenylsyrer med dicyklokarbodimid (CDD) eller med O-[(cyano(etoksykarbonyl)metylen)amino]-1,1,3,3-tetrametyluronium-tetralfuorborat ("TOTU") [Proceedings of the 21. European Peptide Symposium, Peptides 1990, Editors E. Giralt and D., Andeu, Escom, Leiden, 1991]. En rekke egnede metoder for fremstilling av aktivert karboksylsyrederivater med formel II er angitt under angivelsen av kildelitteratur i J. March, Advanced Organic Chemistry, Third Edition (John Wiley & Sons, 1985), s. 350.

Omsettingen av et aktivert karboksylsyrederivat med formel II med guanidin skjer på en for seg kjent måte i et protisk eller aprotisk polart, men inert organisk oppløsnings-middel. Ved omsetningen av alkenylsyremetylesteren (II, L = OMe) med guanidin har metanol, isopropanol eller THF ved 20°C til kokepunktet til oppløsningsmiddelet vist seg å være hensiktsmessig. Ved de fleste omsetningene av forbindelser II med saltfri guanidin blir det fordelaktig arbeidet i aprotisk inert oppløsningsmiddel som THF, demetoksyetan, dioksan. Men også vann kan bli anvendt under bruk av en base som eksempelvis NaOH som oppløsningsmiddel ved omsetning av II med guanidin.

Når L = Cl, arbeider man fordelaktig under tilsetting av syrefanger, for eksempel i form av overskudd av guanidin for binding av halogenhydrogensyren.

En del av de tilgrunnliggende alkenylsyrederivatene med formel II er kjent og beskrevet i litteraturen. De ukjente forbindelsene med formel II kan bli fremstilt ifølge metoder kjent fra litteraturen. Den dannede alkenylsyren blir omsatt ifølge en av de ovenfor beskrevne fremgangsmåtevariantene til oppfinnelsens forbindelser I.

Innføringen av noen substituenter gjøres ved metoder kjent i litteraturen som den palladium-formidlede tverrbindingen av arylhalogenider henholdsvis aryltriflater med eksempelvis organostannaner, organoboronsyrer eller organoboraner eller organokoppber - henholdsvis -sinkforbindelser.

Alkenylguanidin I er generelt svake baser og kan binde syrer under dannelse av salter. Aktuelle som syreaddisjonssalter er alle farmakologiske akseptable syrer, eksempelvis halogenider, spesielt hydroklorid, laktat, sulfat, sitrat, tartrat, asetat, fosfat, metylsulfonat, p-toluensulfonat.

Forbindelsene med formel I er substituerte asylguanidiner. Den fremste representant for asylguanidinen er pyrazinkarboksylsyre- og benzosyreguanidin med de generelle formlene V og VI.

Amilorid: R,R'=H

Dimetylamilorid: R, R', = CH3

Etylisopropylamilorid: R = CH(CH3)2, R' = C2H5

Forbindelser med formel V blir i litteraturen betegnet generelt som amilorid. Amilorid selv (R, R'= H) finner anvendelse som kaliumsparende diuretikum i terapien. Tallrike ytterligere forbindelser av amiloiridtype blir beskrevet i litteraturen, som eksempelvis dimetylamilorid eller etylisopropylamilorid.

Det eksisterer undersøkelser som viser til antiarrytmetiske egenskaper til amilorid (Circulation 79, 1257-63 (1989)]. En bred anvendelse som antiarrytmetikum støter imidlertid mot at denne effekten kun er svakt utpreget og er ledsaget av en blodtrykksenkende og saluretisk virkning og denne bivirkningen er uønsket ved behandling av hjerterytmeforstyrrelser.

Henvisninger til antiarrytmetiske egenskaper til amilorid har blitt oppnådd ved eksperimenter på isolerte dyrehjerter (Eur. Heart J. 9 (suppl. 1): 167 (1988) (book of abstracts)]. Således er det funnet på isolerte rottehjerter at et kunstig utløst kammerflimmer fullstendig kan bli undertrykket av amilorid. Enda mer patent enn amilorid var i denne modellen det ovenfornevnte amiloridderivatet etylisopropylamilorid.

Forbindelser med formel VI er selektive inhibitorer av den allestedsnærværende natrium/proton-utbytteren (Subtype 1, NHE-1). Representanter kjent fra litteraturen er HOE 694 og HOE 642 som er beskrevet som antiarytmetisk og under iskemiske betingelser som kardioprotektive [a) Scholz W, Albus U, Linz W, Martorana P, Lang HJ, Scholkens BA. Effects of Na+ /H+ exchange inhibitors in cardiac ischemia. J Mol Cardiol 1992; 24: 731-739; b) Scholz W, Albus U. Na<+>/Ff exchange and its inhibition in cardiac ischemia and reperfusion. Basic Res Cardiol 1993; 88: 443:455; c) Scholz W, Albus U, Counillon L, Gogelein H, Lang HJ, Linz W, Weichert A, Scholkens BA. Protective effects of HOE 642, a selective sodium-hydrogen exchange subtype 1 inhibitor, on cardiac ischaemia and reperfusion. Cardiovasc Res 1995; 29:260-268; d) Bugge, E. and Ytrehus, K. Inhibition of sodium-hydrogen exchange reduces infarct size in the isolated rat heart - A protective additive to ischaemic preconditioning.

Cardiovasc. Res. 29:269-274, 1995 ]

Dessuten er det fra litteraturen kjent 3-fenyl- og 3-tiofenylpropensyreguandiner VJJ som NHE-inhibitorer [US 2 734 904, WO 84/00875, DE-OS 44 21 536.3 (HOE 94/F 168)] imidlertid er det i disse beskrivelsene ikke beskrevet eller vist mot bisguanidin-forbindelser med formel I.

Det er overraskende funnet at oppfinnelsens forbindelser med formel I hemmer natrium/protonutbytteren av subtype 3. De tidligere kjente NHE-inhibitorene er knapt aktive på denne typen.

Foreliggende forbindelse med formel I virker blodtrykkssenkende og egner seg således som legemiddel for behandling av den primære og sekundære hypertonie. Den egner seg på grunn av sin salidiuretiske virkning som diuretika.

Dessuten virker forbindelsene antiskemisk alene eller i forbindelse med NHE-inhibitorer med annen subtypespesifisitet. De beskytter akutt eller kronisk oksygenmangelrammede organer ved reduksjon eller forhindring av iskemisk induserte skader og egner seg således som legemiddel eksempelvis ved tromboser, karspasmaer, aterosklerose eller ved operative inngrep (for eksempel ved organtransplantasjon av nyre og lever, hvor forbindelsene kan bli anvendt såvel for beskyttelse av organet i giveren før og under uttaking, for beskyttelse av det uttatte organet eksempelvis ved behandling med eller dets lagring i fysiologiske badevæsker, som også ved overføringen i mottaksorganismen) eller akutt nyresvikt.

Tilsvarende deres beskyttende virkning mot iskemisk induserte skader er forbindelsene også egnet som legemiddel for behandling av iskemi i nærvær av nervesystemet, spesielt sentralnervesystemet, hvor de for eksempel er egnet for behandling av slaganfall eller hjerneødem. Dessuten egner oppfinnelsens forbindelser med formel I seg også for behandling av former av sjokk som eksempelvis allergisk, kardiogent, hypovolumisk eller bakterielt sjokk.

Videre induserer forbindelsene en forbedring av åndedrettet og er derfor indikert for behandling av åndedrettstilstander ved følgende tilstander og sykdommer: forstyrret sentralt åndedrett (for eksempel sentralsøvnapnoe, krybbedød, postoperativ hypoksi), muskulært betingede åndedrettsforstyrrelser, åndedrettsforstyrrelser etter pustestans, åndedrettsforstyrrelser ved tilpasning til høyden, obstruktive og blandede former av søvnapnoer, akutte eller kroniske lungesykdommer som hypoksi og hyperkapni.

En kombinasjon av en NHE-inhibitor med en karboanydrase-hemmer (for eksempel asetosolamid), hvor den siste gir en metabolsk asidose og dermed øker åndedretts-hyppigheten, viser seg som gunstig kombinasjon med forsterket virkning og redusert virkestoffinnsats.

Dessuten utmerker oppfinnelsens forbindelser med formel I seg ved sterk inhiberende virkning på proliferasjonen av celler, eksempelvis fibroblastcelleproliferasjon og prolifersjon av glatte karmuskelceller. Derfor er forbindelsen med formel I aktuell som verdifulle terapeutika for sykdommer hvor celleproliferasjonen er en primær eller sekundær årsak og kan derfor bli anvendt som antiaterosklerotika, middel mot diabetiske senkomplikasjoner, kreftsykdommer, fibrotiske sykdommer som lungefibrose, leverfibrose eller nyrefibrose, endoteliale dysfunksjon, organhypertrofi og -hyperplasi, spesielt ved prostatahyperplasi henholdsvis prostatahypertrofi. Dessuten bevirker forbindelsene en senking av kolesterolspeilet og er således egnet som legemiddel for forhindring og behandling av aterosklerose.

Oppfinnelsens forbindelser er en verdifull hemmer av den cellulære natrium-proton-utbytteren (Na7H<+->Exhanger) subtype 1 og 3, som er for høy ved tallrike sykdommer (essensiell hypertoni, aterosklerose, diabetes osv.) også i slike celler hvor målingen er lett tilgjengelig, som eksempelvis i erytrosytter, trombosytter eller leukosytter. Oppfinnelsens forbindelser egner seg derfor som fremragende og enkle vitenskapelige verktøy, eksempelvis i deres anvendelse som diagnistika for bestemmelse og skilling av bestemte former for hypertoni, men også aterosklerose, diabetes, proliferative sykdommer osv. Dessuten er forbindelsene med formel I egnet for preventiv terapi for forhindring av genesen av høyt blodtrykk, eksempelvis essensiell hypertoni.

Det er dessuten funnet at forbindelsene med formel I viser en gunstig påvirkning av serumlipoproteinet. Det er generelt kjent at dannelsen av ateriosklerotiske karforandringer, spesielt ved den koronare hjertesykdom, utgjør for høye blodlipidverdier, såkalt hyperlipoproteinemier, en vesentlig risikofaktor. For profylakser og regresjon av aterosklerotiske forandringer har således senkingen av for høye serum-lipoprotein en stor betydning. Ved siden av reduksjonen av serumtotalkolesterol, senking av andelen spesifikt aterogent lipidfraksjon i dette totalkolesterolet, spesielt lav densitet lipoproteinet (LDL) og meget lav densitets lipoproteinet (VLDL) en spesiell betydning, der denne lipidfraksjonen står for en aterogen risikofaktor. Derimot blir høy densitets lipoproteinet tilskrevet en beskyttelsesfunksjon mot koronare hjertelidelser. Tilsvarende skal hypolipidemika være i stand til ikke kun å senke totalkolesterol, men spesielt senke VLDL og LDL-serumkolesterolfraksjonen. Det er nå funnet at forbindelser med formel I viser verdifulle terapeutiske anvendbare egenskaper ved påvirking av serumlipidspeilet. Således reduserer det signifikant den forhøyede serumkonsentrasjon av LDL og VLDL, som eksempelvis ved forhøyet dietisk inntak av en kolesterol- og lipidrik kost og ved patologiske stoffskifteforandringer, eksempelvis genetisk betinget hyperlipidemi. De kan således bli benyttet for profylakse og for regresjon av aterosklerotiske forandringer, ved at de utelukker en kausal risikofaktor. Til dette teller ikke kun den primære hyperlipidemien, men også visse sekundære hyperlipidemi, som eksempelvis den som forekommer ved diabetes. Dessuten fører forbindelsene med formel I til en betydelig reduksjon av de av stoffskifteanomalinduserte infarkter og spesielt til en signifikant reduksjon av den induserte infarktstørrelse og dets alvorlighetsgrad. Dessuten fører forbindelsene med formel I til en virksom beskyttelse mot endotelskader indusert av stoffskifteanomalier. Med denne beskyttelsen av karene mot syndromet endotelialdysfunksjon er forbindelsen med formel I verdifull som legemiddel for forhindring og for behandling av koronare karspasmer, aterogenesen og aterosklerosen, den venstre ventrikulære hypertrofi og den dikterende kardiomyopati og trombotiske sykdommer.

De nevnte forbindelsene kan dessuten fordelaktig finne anvendelse for fremstilling av et medikament for behandling av hyperkolesterolemi; for fremstilling av et medikament for forhindring av aterogenesen; for fremstilling av et medikament for forhindring og behandling av sykdommer som blir utløst av et forhøyet kolesterolspeil, for fremstilling av et medikament for forhindring og behandling av sykdommer som blir utløst av endotelial dysfunksjon; for fremstilling av et medikament for forhindring og behandling av ateroskleroseindusert hypertoni; for fremstilling av et medikament for forhindring og behandling av aterosklerose-induserte tromboser, for fremstilling av et medikament for forhindring og behandling av iskemiske skader og postiskjemiske reperfusjonsskader indusert av hyperkolesterolemi og endotelial dysfunksjon; for fremstilling av et medikament for forhindring og behandling av kardial hypertrofi og kardiomyopati indusert av hyperkolesterolemi og endotelial dysfunksjon; for fremstilling av et medikament for forhindring og behandling av koronare karspasmer og myokardiale infarkter indusert av hyperkolesterolemi og endotelial dysfunksjon; for fremstilling av et medikament for behandling av de nevnte lidelsene i kombinasjon med blodtrykksenkende stoffer, fortrinnsvis med angiotensin omdannende enzym (ACE)-hemmere og angiotensin-reseptorantagonister, en kombinasjon av en NHE-inhibitor med formel I med et blodlipidspeilsenkende virkestoff, fortrinnsvis med en HMG-CoA-reduktaseinhibitor (for eksempel lovastatin eller pravastatin), hvor den siste gir en hypolipidemisk virkning, og derigjennom øker de hypolipidemiske egenskapene til NHE-inhibitoren med formel I, viser seg som en gunstig kombinasjon med forsterket virkning og redusert virkestofifnnsats.

Legemidler som inneholder en forbindelse med formel I, kan bli gitt oralt, parentalt, intravenøst, rektalt eller ved inhalering, hvor den foretrukne applikasjonen er avhengig av sykdomsbildet for sykdommmen. Forbindelsene med formel I kan her komme til anvendelse alene eller sammen med galenisk hjelpestoff, og såvel i veterinær som også i human medisin.

Hvilke hjelpestoffer som er egnet for de ønskede legemiddelformuleringene er nærliggende for fagmannen på grunn av hans fagkunnskap. Ved siden av oppløsningsmidler, geldannere, stikkpillegrunnmasse, tabletteringshjelpestoffer og andre virkestoffbærere, kan eksempelvis antioksydanter, dispergeringsmidler, emulgatorer, skummingsdempere, smakskorrigenter, konserveringsmidler, oppløsningsformidlere eller farvestoffer anvendes.

For en oral anvendelsesform blir de aktive forbindelsene blandet med de for disse egnede tilsettingsstoffer, som bærestoffer, stabilisatorer eller inert fortynningsmiddel, og ved vanlige metoder bragt i egnede leveringsformer som tabletter, drageer, stikkapsler, vandige, alkoholiske eller oljeformige oppløsninger. Som inerte bærere kan det bli anvendt eksempelvis gummiarabikum, magnesia, magnesiumkarbonat, kaliumfosfat, melkesukker, glukose eller stivelse, spesielt maisstivelse. Her kan tilberedningen skje såvel som tørr- som også fuktig granulat. Som oljeformig bærestoff eller som oppløsningsmiddel, eksempelvis vegetabilske og animalske oljer i betraktning, som solsikkeolje eller levertran.

For subkutan eller intravenøs applikasjon blir de aktive forbindelsene bragt i oppløsning, suspensjon eller emulsjon sammen med for dette vanlige stoffer som oppløsnings-formidlere, emulgatorer eller ytterligere hjelpestoffer. Aktuelle som hjelpestoffer er for eksempel vann, fysiologisk koksaltoppløsning eller alkoholer som for eksempel etanol, proapanol, glyserol, ved siden av sukkeroppløsninger som glukose- eller manittoppløsninger, eller også blandinger av de forskjellige nevnte oppløsningsmidlene.

Egnet som farmasøytiske formuleringer for levering i form av aerosoler eller sprayer, er for eksempel oppløsninger, suspensjoner eller emulsjoner av virkestoffer med formel I i et farmasøytisk akseptabelt oppløsningsmiddel, som spesielt etanol eller vann, eller en blanding av slike oppløsningsmidler.

Formuleringene kan etter behov også inneholde andre farmasøytiske hjelpestoffer som tensider, emulgatorer og stabilisatorer såvel som en drivgass. En slik tilberedning inneholder virkestoffer vanligvis i en konsentrasjon på 0,1 til 10, spesielt fra 0,3 til 3 vektprosent.

Doseringen av virkestoffet med formel I som skal gis, og hyppigheten av leveringen avhenger av virkestyrken og virkningstiden til den anvendte forbindelsen; dessuten av typen og styrken av sykdommen som skal behandles såvel som arten, alderen, vekten og individuell mottagelighet for pattedyret som skal behandles. Gjennomsnittlig utgjør en daglig dose av en forbindelse med formel I til en omkring 75 kg tung pasient, minst 0,001 mg/kg, fortrinnsvis 0,01 mg/kg, til maksimalt 10 mg/kg, fortrinnsvis 1 mg/kg kroppsvekt. Ved et akutt utbrudd av sykdommen kan det også være nødvendig med høyere og spesielt hyppige doseringer, for eksempel opp til 4 enkeltdoser pr. dag. Spesielt ved i.v. anvendelse slik som for en infarktpasient på intensivavdelingen, kan det være nødvendig med opp til 200 mg pr. dag.

Liste over forkortelser:

MeOH metanol

DMF N,N-dimetylformamid

EI elektron impact

DCI Desorption-Chemical Ionisation

RT romtemperatur

EE etylacetat (EtOAc)

mp smeltepunkt

HEP n-heptan

DME dimetoksyetan

ES elektronspray

F AB fast atom bombarment

CH2CI2diklormetan

THF tetrahydrofuran

Eq. Ekvivalent

Eksperimentell del

Generell fremgangsmåte for fremstilling av alkenylkarboksylsyre-guanidiner (I).

Variant I A: alkenylkarboksylsyrer (II, L = OH)

1,0 ekvivalent av karboksylsyrederivater med formel II ble oppløst henholdsvis suspendert i vannfri THF (5 ml/mmol) og så tilsatt 1,1 ekvivalent karbonyldimidzol. Etter omrøring i 2 timer ved RT ble 5,0 eq. guanidin tatt opp i reaksjonsoppløsningen. Etter omrøring over natten ble THF destillert av under redusert trykk (rotasjonsfordamper), blandingen ble tilsatt vann, innstilt med 2 N HC1 til pH 6 til 7 og tilsvarende guanididet (formel I) ble filtrert av. Det således oppnådde karboksylsyreguanidinet kan med behandling av vandig, metanolisk eller eterisk saltsyre eller andre farmakologisk akseptable syrer, bli overført til de tilsvarende salter.

Variant IB: alkenylkarboksylsyre-alkylestere (II, L = O-Alkyl)

1,0 eq. Av karboksylsyre-alkylestere med formel II såvel som 5,0 eq. guanidin (fri base) ble oppløst i isopropanol eller suspendert i THF og kokt med tilbakeløpskjøling til fullstendig omsetning (tynnsjikstkontroll) (typisk reaksjonstid 2 til 5 timer). Reaksjonsmidlet ble destillert av under redusert trykk (rotasjonsfordamper), tatt opp i EE og vasket tre ganger med NaHC03-oppløsning. Det ble tørket over Na2S04, oppløsningsmidlet avdestillert under vakuum og kromatografert på kiselgel med et egnet oppløsningsmiddel, for eksempel EE/MeOH 5:1.

(Saltdannelse se variant A).

Eksempel 1: l,2-Bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid.

1 a) 1 eq. 2-fosfonopropiensyretrietylester ble deprotonert ved 0°C med 1 eq. N-butyllitium i heksan og deretter ble RT tilsatt med 0,5 eq. 1,2 ftaldialdehyd. Etter fullstendig avreaksjon ble dialdehydet opparbeidet med vann og tre ganger utristet med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenblivende råproduktet ble utskilt kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte l,2-Di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-benzen.

Farveløs olje: MS (DC1):303 (M+l<+>)

1 b) Esteren fra la) ble forsåpet ifølge en standard metode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-benzen.

Farveløst faststoff;

mp: > 187°C MS (DC1):246 (M<4>)

1 c) Dikarboksylsyre av lb) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid. Farveløst faststoff; mp:> 200°C MS (DC1):329 (M+l)<+>Eksempel 2: 1,3-bis-[E-2-metyl-propensyreguandid)]benzen-dihydroklorid 2 a) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. N-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt med 0,5 eq. 1,3-isoftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger utristet med toluen. Etter tørking av den gjenværende organiske fasen over magnesiumsulfat ble oppløsningsmidlet fjernet under vakuum og det gjenblivende råproduktet ble kromatografisk renset på kiselgel med EE/HEP-blandinger som elueringsmiddel.

Man isolerte: l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]benzen.

Farveløs olje: MS (DC1):303 (M+l<+>).

2 b) Esteren fra 2 a) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-benzen.

Farveløst faststoff;

mp > 190°C; MS (DC1): 247 (M+ 1<+>)

2 c) Dikarboksylsyren av 2 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid.

Farveløst faststoff;

mp: 175°C; MS (DC1): 329 (M + 1)<+>

Eksempel 3: l,4-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid

3 a) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble deprotonert ved 0°C med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 1,4-tereftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger rystet ut med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet skilt kromatografisk på kiselgal med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel.

Man isolerte: l,4-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-benzen.

Farveløst faststoff;

mp: 41°C; MS (DC1): 303 (M + f)

3 b) Esteren fra 3 a) ble forsåpet ifølge en standardmetode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,4-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-benzen.

Farveløst faststoff;

mp: > 190°C; MS (DC1) : 247 (M + 1<+>)

3 c) Dikarboksylsyren fra 3 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanididdihydroklorid. Gult faststoff; mp: 255°C; MS (DC1) : 329 (M + 1)<+>Eksempel 4: 2,3-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]naftalin-dihydroklorid 4 a) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 2,3-naftalindialdehyd. Etter fullstendig avreaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger ristet ut med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råstoffet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel.

Man isolerte: 2,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-natfalin.

Farveløs olje: MS (DC1): 353 (M + 1<+>)

4 b) Esteren fra 4 a) ble forsåpet ifølge en standardmetode (natrium-hydroksyd i metanol). Man isolerte: 2,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-naftalin.

Farveløst faststoff:

mp: > 210°C; MS (DC1): 295 (M-H)" 4 c) Dikarboksylsyref fra 4 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid.

Farveløst faststoff;

mp: > 200°C; MS (DC1): 379 (M + 1)<+>

Eksempel 5: l,2-bis-[3-(Z-2-fluor-propensyreguandid)]benzen-dihydroklorid 5 a) Ifølge en fremgangsmåte kjent fra litteraturen (Cousseau et al., Tetetrahedron Letters 34, 1993, 6903) ble det med utgangspunkt i 1,2-ftaldialdehyd fremstilt l,2-di-[3-(Z-2-fluor-propensyreetylester)]benzen og dette renset på kieselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel og isolert.

Farveløst faststoff

mp: amorft; MS (DC1): 311 (M + 1)<+>

5 b) Diesteren fra 5 a) ble omsatt ifølge variant 1 B til diguanidid og overført til dihydroklorid.

Mp: > 235°C; MS (DC1): 337 (M + 1)<+>

Eksempel 6: l-[3-(Z-2-fluor-propensyreguandid)]-2-[3-(E-2-metyl-propensyre-guanidid)]benzen-dihydroklorid.

6 a) Den ved fremstilling av 7 a) også isolerte monoaldehyd-monesteren 6 a) ble ifølge 4

a) overført til diesteren 6 b).

gul olje gul olje

MS (Cl): 223 (M + 1)<+>MS (Cl): 307 (M + 1)<+>

6 c) Diesteren fra 6 b) ble omsatt ifølge variant 1 B til diguanidid og overført til dihydroklorid. Schmp: > 200°C; MS (ES): 333 (M + 1)<+>Eksempel 7: 1,3-bis[3-(Z-2-(fluor-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid 7 a) Ifølge en fremgangsmåte kjent fra litteraturen (Cousseau et al., Tetetrahedron Letters 34, 1993, 6903) ble det med utgangspunkt i 1,3-isoftaldialdehyd fremstilt 1,3-di- [3-(Z-2-fluor-propensyreetylester)]benzen og dette renset på kieselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel og isolert.

Farveløst faststoff

mp: amorf; MS (Cl): 311 (M + 1)<+>

7 b) Diesteren fra 7 a) ble omsatt ifølge variant 1 B til diguanidid og overført til dihydroklorid. Oransje/gulfarvet faststoff; Schmp: > 180°C; MS (ES): 337 (M + 1)<+>Eksempel 8: 3-(4-klor-3-guanididkarboiryI-5-fenyl)fenyl-2-metyl-propensyreguanidid

8 a) 3-brom-2-klor-5-metyl-benzosyre

25 g 2-amino-3-brom-5-metyl-benzosyre ble oppløst i 500 ml 6 N vandig HC1-oppløsning, ved 0°C tilsatt 8,25 g NaN02og diazotert i 30 minutter ved denne

temperaturen. Denne diazoniumsaltoppløsningen ble deretter dryppet til en 40°C varm oppløsning av 22 g CuCl i 200 ml av en mettet vandig HCl-oppløsning og etterrørt i 20 minutter ved denne temperaturen. Produktet ble filtrert fra, vasket med 500 ml vann og tørket ved 40°C i finvakuum. Man oppnådde 23,3 g hvite krystaller,

mp 170-172°C; Rf(EE/MeOH 5:1) = 0^1; MS (DC1). 249 (M + H)<+>

8 b) 3-brom-2-klor-5-dibrornmetyl-benzosyre

10 g 3-brom-2-klor-5-metyl-benzosyre ble oppløst i 150 ml klorbenzen og oppvarmet med tilbakeløpskjøling. Ved denne temperaturen ble først 7,2 g N-bromsuksinimid og 0,5 g benzoyloksyd tilsatt og dette kokt med tilbakeløpskjøling i 30 minutter. Deretter ble det nok en gang tilsatt 7,3 g N-bromsuksinid og 0,5 g benzoylperoksyd og ytterligere omrørt i 3 timer med tilbakeløpskjøling. Etter avkjøling ble det tilsatt 200 ml EE, vasket med 50 ml mettet vandig Na2SO3-oppløsning/300 ml mettet vandig KH2P04-oppløsning og den vandig fasen ble to ganger ekstrahert, hver med 200 ml EE. Det ble tørket over Na2S04 og oppløsningsmiddelet ble fjernet under vakuum. Man fikk 14,1 g av en gul olje.

Rf (DIP/2% HO Ac) = 0,32

8 c) 3-brom-2-klor-5-formyl-benzosyre

11,7 g AgN03 ble oppløst i 150 ml vann og 150 ml MeOH og en oppløsning av 14 g 3-brom-2-klor-5-dibrommetyl-benzosyre ble dryppet til i MeOH. Det ble omrørt i 30 minutter ved RT, 100 ml av en mettet vandig NaCL-oppløsning ble tilsatt, sølvsaltet filtrert fra og oppløsningsmiddelet ble fjernet under vakuum. Resten ble tatt opp i 200 ml av en 5% vandig KHS04-oppløsning og ekstrahert 3 ganger hver med 200 ml i EE. Det ble tørket over Na2S04 og oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum. Kromatografi på kiselgel med DIP/2% HO Ac ga 3,6 g farveløse krystaller,

mp: 148°C; Rf (DIP/2% HOAc) = 0,12; MS (DC1): 263 (M + H)<+>

8 d) 3-brom-2-klor-formyl-benzonsyreetylester

3.6 g 3-brom-2-klor-formyl-benzonsyre ble oppløst i 100 ml EtOH, dryppet til 2,9 ml SOCl2 og kokt i 5 timer med tilbakeløpskjøling. Deretter ble de flyktige bestanddelene fjernet under vakuum og resten kromatografert på kiselgel med EE/HEP 1:8. Man fikk 2.7 g av en farveløs olje.

Rf (EE/HEP 1:8) = 0,24 ; MS (DC1) : 291 (M + H)<+>

8 e) 3-(3-brom-4-klor-5-etoksykarbonyl)fenyl-2-metyl-propensyre-etylester

2,7 g 3-brom-2-klor-5-formyl-benzosyreetylester ble analogt med eksempel 4 a) underkastet en Wittig-Horner-reaksjon og man oppnådde 3,4 g av en farveløs olje.

Rf (EE/HEP 1:8) = 0,27; MS (DC1) : 374 (M + H)<+>

8 f) 3-(4-klor-3-etoksykarbonyl-5-fenyl-2-metyl-propensyre-etylester

3.3 g 3-(3-brom-4-klor-5-etoksykarbonyl)fenyl-2-metyl-propensyre-etylester, 1,23 g fenylboronsyre, 2,14 g Na2C03, 576 mg trifenylfosfin og 227 mg Pd(OAc)2ble oppløst i 150 toluen og 40 ml vann og kokt i 7 timer med tilbakeløpskjøing. Deretter ble det avkjølt ved RT, tilsatt 100 ml EE og vasket to ganger hver gang med en 100 ml vandig mettet Na2CC>3-oppløsning såvel som 100 ml mettet vandig NaCl-oppløsning, tørket over Na2SC>4 og oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum. Kromatografi på kiselgel med EE/HEP 1:8 ga 800 mg av en farveløs olje

Rf (EE/HEP 1:8) = 0,25; MS (DC1): 372 (M + H)<+>

8 g) 3-(4-klor-3-guanididkarbonyl-5-fenyl)fenyl-2-metyl-propensyreguanidid

1,8 g kalium-t-butylat ble oppløst i 100 ml DMF, tilsatt 1,82 g guanididhydroklorid og omrørt i 1 time ved RT. Deretter ble det tilsatt 700 mg 3-(4-klor-3-etoksykarbonyl-5-fenyl)fenyl-2-metylpropensyreetylester og omrørt i 5 timer ved 100°C. Reaksjonsblandingen ble helt på 200 ml vann og ekstrahert tre ganger hver med 200 ml EE. Det ble tørket over Na2S04og oppløsningsmiddelet ble fjernet under vakuum. Kromatografi på kiselgel med aseton/vann 10:1 ga 170 mg av et amorft skum.

Rf (Aseton/vann 10:1) = 0,23; MS (FAB) : 399 (M + H)<+>

Eksempel 9: l,3-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-2-metoksy-5-metyl-benzen-hydro klorid 9 a) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 2-metoksy-5-metyl-l,3-isoftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon ble dialdehydet opparbeidet med vann og tre ganger ristet ut med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet ble renset kromatografisk over kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-2-metoksy-5-metyl-benzen.

Farveløs olje: MS (Cl): 347 (M + 1<+>)

9 b) Diesteren fra 9 a) ble forsåpet ifølge en standardmetode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)-2-metoksy-5-metyl-benzen. Farveløst faststoff:

mp: 196°C; MS (DC1): 290

9 c) Dikarboksylsyren fra 9 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid og isolert som hydroklorid. Farveløst faststoff; mp:279°C; MS (NBA):373 (M + 1)<+>Eksempel 10: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-metyl-benzen-dihydroklord 10 a, b) 4-metyl-ftalsyrediester ble ifølge standardmetode (for eksempel reduksjon med litiumaluminiumhydrid) overført til dalkohol 10a). Deretter ble alkoholen oksydert under standard betingelser til dialdehyd 10 b) (for eksempel Swern oksydasjon). Dialkohol 10 a): farveløs olje; MS (DC1): 153 (M + f) og 135 (M + 1-H20). Dialdehyd 10 b): mørk olje, MS (Cl): 149 (M + 1<+>) 10 c) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 4-metyl-l,2-ftaldialdehyd 10 b). Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råprodukt ble kromatografisk renset på kiselgel med EE/HEP-blandingen som elueringsmiddel. Man isolerte: 4-metyl-l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-benzen.

Farveløs olje; MS (Cl): 317 (M + f)

10 d) Esteren fra 10 c) ble forsåpet ifølge en standardmetode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: 4-metyl-l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-benzen. Farveløst faststoff; mp: 194 - 198°C; MS (Cl): 260 (M<+>) 10 e) Dikarboksylsyren fra 10 d) ble overført ifølge variant 1 A til diguanididhydroklorid, farveløst faststoff;

mp : 190°C; MS (ES) : 342 (M + 1)<+>

Eksempel 11: l,2-bis[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4,5-diklor-benzen-dihydro klorid 11 a, b) 4,5-diklor-ftalsyredietylester ble ifølge standardmetode (for eksempel reduksjon med litiumaluminiumhydrid) overført til dialkoholen lia). Deretter ble alkoholen oksydert under standardbetingelser til dialdehyd 11 (for eksempel Swern oksydering).

Dialkohol 11 a) farveløst faststoff, mp 147°C; MS (Cl): 207 (M + l<+>)

Dialdehyd 11 b) amorft faststoff, MS (Cl): 203 (M + 1<+>).

11 c) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 4,5-diklor-l,2-ftaldialdehyd 11 b). Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenblivende råproduktet ble kromatografisk renset på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: 4,5-diklor-1,2-di-[3 -(E-2-metyl-propensyreetylester)-benzen. Farveløst faststoff; mp: > 230°C; MS (Cl): 371 (M + 1<+>) lid) Diesteren fra 11 c) ble overført til diguanididdihydrokloridet ifølge variant 1 B. Farveløst faststoff; mp: > 220°C; MS (ES): 397 (M + 1)<+>Eksempel 12: l,3-bis-[3-(E-propensyreguanidi)]benzen-dihydroklorid 12 a) 1 eq. trietylfosfonasetat ble deprotonert ved 0°C med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved romtemperatur tilsatt 0,5 eq. 1,3-isoftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon av aldehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råstoffet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,3-di-[3-(E-propensyreetylester)]-benzen.

Farveløs olje; MS (Cl): 275 (M + 1<+>)

12 b) Diesteren fra 12 a) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,3-di-[3-(E-propensyre)-benzen. Farveløst faststoff;

mp: > 200°C; MS (DC1): 217 (M-l<+>)

12 c) Dikarboksylsyre fra 12 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanididdihydrokloridet. Farveløst faststoff; mp: 296°C; MS (ES):301 (M + 1)<+>Eksempel 13: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-brom-benzen-dihydroklorid 13 a, b) 4-brom-ftalsyredimetylester ble ifølge standardfremgangsmåte (for eksempel ved reduksjon med litiumaluminiumhydrid) overført til dialkohol 13 a). Deretter ble alkoholen oksydert under standardbetingelser til dialdehydet 13 b) (for eksempel Swern oksydering).

Dialkohol 13 a): farveløs olje; MS (DC1):217 (M+l<+>) og 199 (M+1-H20).

Dialdehydr 13 b): amorft faststoff, MS (Cl): 213 (M + 1<+>)

13 c) 1 eq. 2-fosfonpropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved romtemperatur tilsatt 0,5 eq. 4-brom-l,2-ftaldialdehyd 13b). Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet ble kromatografisk renset med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: 4-brom-l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-benzen.

Farveløs olje; MS (Cl): 3 81 (M + 1<+>)

13 d) Esteren fra 13 c) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: 4-brom-l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-benzen.

Farveløst amorft faststoff; MS (ES): 325 (M + 1<+>)

13 e) Dikarboksylsyren fra 13 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydrokloridet. Farveløst faststoff; mp: 240°C; MS (FAB):407 (M + 1)<+>Eksempel 14: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(4-metoksyfenoksy)-benzen-dihydroklorid 14 a) 4-nitro-ftalsyredimetylester ble omsatt analogt med en litteraturkjent fremgangsmåte (J. Org. Chem. Vol. 42, No. 21, 1977, 3419-3425) i DMF med 4-metoksyfenolat natriumsalt til 4-(4-metoksyfenoksy)tfalsyredimetylester. Etter standardopparbeiding og kromatografi med heksan/EE isolerte man diesteren som brunlig olje.

MS (Cl): 316 (M<*>); 317 (M + 1<+>). 14 b, c) Diesteren 14 a) ble ifølge standard fremgangsmåte (for eksempel reduksjon med litiumaluminiumhydrid) til dialkohol 14b). Deretter ble alkoholen oksydert under standardbetingelser til dialdehydet 14 c) (for eksempel Swern oksydering).

Dialkohol 14b): brunlig olje; MS (Cl): 260 (M<*>).

Dialdehyd 14 c): brunlig olje; MS (Cl): 257 (M + 1<+>).

14 d) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 1,2-ftaldialdehyd 14 c). Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet ble renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-4-(4-metoksy)benzen.

Lett brunlig olje; MS (NBA):424 (M<*>)

14 e) Diesteren fra 14 d) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksy i metanol). Man isolerte: l,2-di-'[3-(E-2-metyl-propensyre)-4-(4-metoksyfenoksy)benzen.

Lysegult faststoff;

mp: 112°C; MS (ES):368 (M<*>)

14 f) Dikarboksylsyren fra 14 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid.

Farveløst faststoff;

mp: 212°C; MS (ES):451 (M+ 1)<+>

Eksempel 15: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(metyl-fenoksy)-benzen-dihydroklorid 15 a) 4-nitro-ftalsyredimetylester ble analogt med en fremgangsmåte kjent fra litteraturen (J. Org. Chem. Vol. 42, No. 21, 1977, 3419-3424) i DMF omsatt med 4-metylfenolat natriumsalt til 4-(4-metylfenoksy)tfalsyredimetylester. Etter standard opparbeiding og kromatografi med heksan/EE isolerte man diesteren som gulaktig olje.

MS (Cl): 301(M+1+).

15 b, c) Diesteren 15 a) ble ifølge standardmetode (for eksempel reduksjon med litiumaluminiumhydrid) overført til dialkoholen 15b). Deretter ble alkoholen oksydert under standardbetingelser til dialdehydet 15 c) (for eksempel Swern oksydering).

Dialkohol 15 b): gulaktig olje; MS (Cl): 244 (M<*>), 245 (M + 1<+>).

Dialdehyd 15 c): brunaktig olje; MS (Cl): 241 (M"), 245 (M + 1<+>).

15 d) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 1,2-ftaldialdehyd 15 c). Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet og det gjenværende råproduktet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-4-(4-metyl-fenoksy)benzen. Lett brunaktig olje; MS (NBA):408 (Tvf), 409 (M + 1<+>)

15 e) Diesteren fra 15 d) ble forsåpet ifølge standardmetode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-4-(4-metyl-fenoksy)benzen. Farveløst faststoff;

mp; 185°C: MS (NBA):352 (M*)

15 f) Dikarboksylsyren fra 15 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid.

Farveløst faststoff;

mp: 186°C; MS (ES): 435 (M + 1)<+>

Eksempel 16: l,3-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-5-metoksy-benzen-hydroklorid 16 a) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 5-metoksy-l,3-isoftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet renset kromatografisk med kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-5-metoksy-benzen.

Farveløs olje; MS (Cl): 333 (M + f)

16 b) Diesteren fra 16 a) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-5-metoksy-benzen.

Farveløst faststoff;

mp: > 200°C; MS (DC1): 276 (NT)

16 c) Dikarboksylsyren fra 16 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid og isolert som hydroklorid.

Farveløst faststoff;

mp: 124°C; MS (NBA):359 (M + 1)<+>

Eksempel 17:1,3-bis- [3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-5-tert-butyl-benzen-hydroklorid 17 a) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 5-tert.butyl-l,3-isoftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-5-metoksy-benzen.

Farveløs olje; MS (Cl): 359 (M + 1<+>)

17 b) Diesteren fra 17 a) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte l,3-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-5-tert.-butyl-benzen.

Farveløst faststoff;

mp: > 200°C; MS (DC1): 302 (M<*>)

17 c) Dikarboksylsyren fra 17 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanididet og isolert som hydroklorid.

Farveløst faststoff;

mp: 115°C; MS (NBA):385 (M+ 1)<+>

Eksempel 18: l,4-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-2,5-diklor-benzen-dihydroklorid 18 a) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. l,4-(2,5-diklor)-tereftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,4-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-2,5-diklor-benzen.

Farveløst faststoff;

mp: amorf; MS (DC1): 371 (M + 1<+>)

18 b) Esteren fra 18 a) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte l,4-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-2,5-diklor-benzen. Farveløst faststoff; MS (DC1): 302 (M1) 18 c) Dikarboksylsyren fra 18 b) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydrokloridet.

Gult faststoff;

mp: 200°C; MS (DC1):397 (M + 1)<+>

Eksempel 19: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(fenoksy)-benzen-dihydroklorid 19 a) 4-nitro-ftalsyredimetylester ble analogt med en fremgangsmåte kjent fra litteraturen (J. Org. Chem. Vol. 42, No. 21, 1977, 3419-3425) i DMF omsatt med fenolat natriumsaltet til 4-fenoksy-ftalsyredimetylester. Etter standard opparbeiding og kromatografi med heksan/EE isolerte man diesteren som gulaktig olje.

MS (Cl): 287 (M+ 1+)

19 b, c) Diesteren fra 19 a) ble ifølge en standardfremgangsmåte (for eksempel reduksjon med litiumaluminiumhydrid) overført til dialkoholen 19b). Deretter ble alkoholen oksydert under standard betingelser til dialdehyd 19 c)(for eksempel Swern oksydering).

Dialkohol 19 b): gulaktig olje; MS (Cl): 230 (M<*>), 231 (M + 1<+>).

Dialdehyd 19 c): brunaktig olje: MS (Cl): 227 (M + 1<+>).

19 d) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 1,2-ftaldialdehyd 19 c. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råstoffet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-4-(fenoksy)-benzen.

Lett brunaktig olje; MS (NBA): 394 (M*) (M + 1<+>)

19 e) Diesteren fra 19d) ble forsåpet ifølge en standardfremgangsmåte (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-4-(fenoksy)-benzen. Farveløst faststoff;

mp: > 160°C; MS (NBA): 338 (M<*>) 19 f) Dikarboksylsyren fra 19 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydrokloridet. Farveløst faststoff; mp: 170°C; MS (ES):421 (M + 1)<+>Eksempel 20: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(metoksy)-benzen-dihydroklorid

Analogt med eksempel 19 ble eksempel 20 fremstilt ved nukleofil aromatisk substitusjon av 4-nitroftalsyreesteren med natriummetylat, deretter reduksjon/oksydasjon/ olefiniseringsreaksjon, forsåping og guanidering av disyren.

20 a) 4-metoksy-ftalsyrediester MS (Cl): 225 (M + 1<+>).

Dialkohol 20 b): gulbrunlig olje; MS (Cl): 169 (M + 1<+>).

Dialdehyd 20 c): mørk olje, MS (Cl): 165 (M + T).

Diester 20 d): mørk olje; MS (NBA): 333 (M + 1<+>)

20 e) l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)-4-metoksy)benzen

Farveløst faststoff;

mp: > 200°C; MS (NBA):276 (M<f>)

20 f) Dikarboksylsyren fra 20 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydrokloridet. Farveløst faststoff; mp: > 170°C MS (ES):359 (M + 1)<+>Eksempel 21: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(etoksy)-benzen-dihydroklorid

21a) 4-etoksy-ftalsyredietylester ble fremstilt ved etylering av 4-hydroksy-ftalsyren med 3,5 eq. etyliodid og 3,1 eq. kaliumkarbonat i DMF ved 70°C. Deretter ble diesteren fremstilt ved reduksjon/oksydasjon/olefinieringsreaksjon av diesteren, som ble overført til diguanidid 21 ifølge variant 1 B.

21 a) 4-etoksy-ftalsyredietylester; mørk olje; MS (Cl): 267 (M + 1<+>).

Dialkohol 21 b): gulbrunlig olje: MS (Cl): 183 (M + 1<+>).

Dialdehyd 21 c): mørk olje: MS (Cl): 179 (M + 1<+>).

Diester 21 d): gulaktig olje: MS (NBA): 347 (M + 1<+>).

21 f) Diesteren 20 d) ble ifølge variant 1 b) overført til diguanidid-dihydrokloridet. Farveløst faststoff:

mp: 245°C MS (ES):373 (M + 1)<+>

Eksempel 22: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(3-pyridyloksy)-benzen-dihydroklorid 22 a) 4-nitro-ftalsyredimetylester ble analogt med en fremgangsmåte kjent i litteraturen (J. Org. Chem. Vol. 42, No. 21, 1977, 3419-3425) i DMF omsatt med 3-hydroksypyridin natriumsalt til 4-(3-pyirdyloksy)-ftalsyredimetylester. Etter standardopparbeidelse og kromatografi med heksan/EE isolerte man diesteren som gulaktig olje. MS:288(M+ 1+). 22 b, c) Diesteren 22 a) ble ifølge standardmetode (for eksempel reduksjon med litiumaluminiumhydrid) overført til dialkoholen 22 b). Deretter ble alkoholen oksydert under standardbetingelser til dialdehyd 22 c) (for eksempel Swern oksydering).

Dialkohol 22 b) gulaktig olje; MS 232 (M + T).

Dialdehyd 22 c) gul-brunlig olje: MS: 228 (M + 1<+>).

22 d) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 1,2-ftaldialdehyd 22 c. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-4-(3-pyirdyloksy)-benzen.

Lett brunaktig olje; MS : 396 (M*) (M + 1<+>)

22 e) Diesteren fra 22 d) ble forsåpet ifølge en standard metode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-4-(3-pyridyloksy)-benzen. Farveløst faststoff;

mp: 210°C; MS: 339 (M<*>)

22 f) Dikarboksylsyren fra 22 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid. Farveløst faststoff; mp: 176°C; MS: 422 (M + 1)+ Eksempel 23: l,2-bis-[3-(E-2-metyI-propensyreguanidid)]-4-[4-(2-dimetylamonetyl)-fenoksyl]-benzen-dihydroklorid 23 a) 4-nitro-ftalsyredimetylester ble analogt med en fremgangsmåte kjent i litteraturen (J. Org. Chem. Vol. 42, No. 21, 1977, 3419-3425) i DMF omsatt med 3-hydroksypyridin natriumsalt til 4-(2-dimetylaminoetylen)-fenol natriumsalt til 4-[4-(2-dimetylenaminoetylen)-fenoksyl]-ftalsyredimetylester. Etter standardopparbeidelse og kromatografi med heksan/EE isolerte man diesteren.

MS:358 (M+ 1<+>).

23 b, c) Diesteren 23 a) ble ifølge standardmetode (reduksjon med

litiumaluminiumhydrid) overført til dialkoholen 23 b). Deretter ble alkoholen oksydert ifølge Dess-Martin (se Dess-Martin Oxidation: JOC, 1994, 59, 7549-7552) til dialdehyd 23 c).

Dialkohol 23 b) gulbrun olje; MS 340 (M + 1<+>).

Dialdehyd 23 c) gul olje: MS: 269 (M + 1<+>).

23 d) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 1,2-ftaldialdehyd. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-4-(4-(2-dimetylaminoetylen)-benzen. Gulaktig olje; MS : 466 (M + 1<+>) 23 e) Diesteren fra 23 d) ble forsåpet ifølge en standard metode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-4-(4-(2-dimetylamino-etylen)-fenoksy]-benzen.

Farveløst faststoff;

mp: 220°C, MS: 466 (M- T)

23 f) Dikarboksylsyren fra 23 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid. MS: 410 (M+ 1)+ Eksempel 24 og 25: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-[4-metoksybensyloksyj-benzen-dihydroklorid og l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyre-guanidid)]-4-hydroksy-benzen-dihydroklorid 24 a) 1 eq. 4-hydroksyftalsyredimetylester, 1,1 eq. kalumkarbonat og 1,1 eq. 4-metoksy-bensylklorid ble omrørt i DMF ved RT. Etter 4 dager ble det opparbeidet ifølge standardfremgangsmåte. Man isolerte 4-(4-metoksybensyloksy)-ftalsyredimetylester som farveløs olje.

MS: 331 (M+1+).

24 b, c) Diesteren 24 a) ble ifølge standardmetode (reduksjon med litiumaluminium-

hydrid) overført til dialkoholen 24 b). Deretter ble alkoholen oksyder ifølge standardfremgangsmåte (Swern-oksydering) til dialdehyd 24 c).

Dialkohol 24 b): amorft faststoff: MS: 275 (M + 1<+>).

Dialdehyd 24 c): gulaktig olje: MS: 271 (M + T).

24 d) 1 eq. 2-fosfonopropionsyretrietylester ble ved 0°C deprotonert med 1 eq. n-butyllitium i heksan og deretter ved RT tilsatt 0,5 eq. 1,2-ftaldialdehyd 24 c. Etter fullstendig reaksjon av dialdehydet ble det opparbeidet med vann og tre ganger skilt med toluen. Etter tørking av de sammenslåtte organiske fasene over magnesiumsulfat ble oppløsningsmiddelet fjernet under vakuum og det gjenværende råproduktet renset kromatografisk på kiselgel med EE/HEP-blanding som elueringsmiddel. Man isolerte: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreetylester)]-4-[4-metoksybesyloksy]-benzen som gulaktig olje. MS:438 (M+1+) 24 e) Diesteren fra 24 d) ble forsåpet ifølge en standard metode (natriumhydroksyd i metanol). Man isolerte: l,2-di-[3-(E-2-metyl-propensyre)]-4-[4-metoksybensyloksy]-fenoksy] -benzen, farveløst stoff.

Mp: 206 - 220°C; MS: 382 (M1-)

24 f) Dikarboksylsyren fra 24 e) ble ifølge variant 1 A overført til diguanidid-dihydroklorid.

Mp: 210°C; MS: 465 (M + 1)<+>

Eksempel 25: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-hydroksy-benzendihydroklorid

Dikaroboksylsyren fra 24 e) ble omsatt ifølge variant 1 A til diguanidid-dihydroklorid. Foruten eksempel 24 ble produktet 25 isolert.

MS:345 (M+1)+

Farmakologiske data:

Inhibitorer av Na7Ff-utbytterne i kaninerytrosytter (subtype 1, NHE-1):

Hvite New Zealand-kaniner (Ivanonas) fikk en standard diett med 2% kolesterol i 6 uker for å aktivere Na<+>/H<+->utbyttingen og således kunne bestemme Na<+->innstrømningen i erytrosyttene i Na<+>/H<+->utbyttingen flammefotometrisk. Blodet ble tatt ut av ørearterien og tørkingen hindret med 25 IE/ml kalium-heparin. En del av hver prøve ble benyttet for dobbelbestemmelse av hematokrit ved sentrifugering. Prøver på 100 ul tjente for målinger av Na<+->utbyttingsmengden i erytrosyttene.

For å bestemme den amilorid-sensitive natriuminnstrømmingen, ble 100 |j.l av hver blodprøve inkubert i 5 ml av et hyperosmolart salt-sukrosemedium (mmol/1: 140 NaCl, 3 KC1, 150 sukrose, 0,1 ouabain, 20 tris-hydroksymetyl-aminometan) ved pH 7,4 og 37°C. Erytrosyttene ble deretter vasket tre ganger med iskald MgCk,- ouabain-oppløsning (mmol:l_ 112 MgCk, 0,1 ouabain) og hemolysert i 2 ml. Destillert vann. Det intrasellulære natriuminnholdet ble bestemt flammefotometrisk. Na<+>netto-innstrømmingen ble beregnet fra forskjellen mellom natriumutgangsverdien og natriuminnholdet i erytrosyttene etter inkubering. Den amilorid-hemmende natriuminn-strømmingen ble funnet fra differansen av natriuminnholdet til erytrosyttene etter inkubering med og uten amilorid 3 x IO"<4>mol/l. På denne måten ble det også gått frem ved forbindelsene ifølge oppfinnelsen.

Resultater for hemming av Na<+>/H<+->utbyttere (subtype 1; NHE-1):

De fleste molekylær-biologiske teknikker følger protokoller fra verkene "Current Protocols in Molecular Biology (eds. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G. Smith, J A. und Struhl, K.: John Wiley & Sons)" hhv. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrock, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, R.: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))". Innen rammen av arbeidene ble det oppnådd en stabil transfisert cellelinje som alltid uttrykte en av de følgende NHE-subtypene: NHE1 fra mennesker (Sardet et al.; Cell 56-271-280 (1989), NHE2 fra kaniner (Tse et al.; J. Biol. Cheim. 268, 11917 - 11924 (1993)) hhv. NHE3 fra rotte (Orlowski et al.; J. Biol. Chem. 267, 9331 - 9339 (1992).

CDNA-klonen for NHE-subtypene fremskaffet fra prof. Pousségur ble etter tilføyelse av egnede linker sekvenser klonet inn slik i ekspresjonsplasmidet pMAMneo (tilgjengelig i for eksempel fra CLONTECH, Heidelberg), at NHEl-gjenkjennelsessekvensen til plasmidet ligger omkring 20-100 basepar før startkodonet til den enkelte NHE-subtypen og at den totale kodende sekvensen et tilstede i konstruktet.

Med den såkalte "Kalsumfosfat-metoden" (beskrevet i kapittel 9.1 i "Current Protocols in Molecular Biology") ble den NHE-defisiente cellelinjen LAPI (Franchi et al.; Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 9388 - 9392 (1986)) transfisert med plasmider som inneholdt de forskjellige kodende sekvensene av NHE-subtypen. Etter seleksjon av transfiserte celler ved vekst i G418-holdig medium (kun celler som ved transfeksjon har fått et neo-gen, kan overleve under disse betingelsene) ble selektert fra en funksjonell NHE-ekspresjon. Dertil ble den av Sardet beskrevne "Acid Load"-teknikken anvendt (Sardet et al.; Cell 56, 271-280 (1989)). Celler som uttrykker en funksjonsdyktig NHE-subtype, kan også i nærvær av C02og HCO3" ved denne testen kompensere for den foretatte surgjøringen, i motsetning til ikke-transfiserte LAPI-celler. Etter flere gangers gjentagelse av "Acid load"-seleksjon ble de overlevende cellene sådd ut på mikrotiterplater slik at det statistisk skulle være en celle pr. brønn. Under mikroskopet ble dette etter omkring 10 dager undersøkt hvor mange kolonier det var pr. brønn. Cellepopulasjoner av enkeltkolonier ble så undersøkt med XTT-proliferasjonssettet (Boehringer Mannheim) vedrørende deres overlevelsesevne mot "Acid load". De bestemte cellelinjene ble anvendt for de videre tester og for unngåelse av et tap av den transfiserte sekvens dyrket under konstant seleksjonstrykk i G418-holdig medium.

For bestemmelse av ICso-verdier for hemming av de enkelte NHE-subtypene av spesifikke stoffer, ble det anvendt en av S. Faber utviklet test (Faber et al.; Cell. Pysiol. Biochem. 6, 39 - 49 (1996)), som bygger på en lett omdannet "Acid load"-teknikk.

I denne testen blir gjenvinningen av den intracellulære pH (pH;) etter en surgjøring målt, som for funksjonsdyktige NHE også skjer under bikarbonatfrie betingelser. For dette blir pH; målt med pH-sensitive fluoresensfarvestoffer (BCECF) (biokalkjem, innsatt som forløperne BCECF-AM). Cellene blir først lastet med BCECF. BCECF-fluoresensen blir bestemt i et "Ratio Fluorescence Spectrometer" (Photon Technology International, South Brunswick, N.J., USA), med eksitasjonsbølgelengde fra 505til 440 nm og en emisjonsbølgelengde på 535 nm og omregnet ved hjelp av vibreringskurver til pH;. Til forskjell fra den beskrevne protokoll blir cellene allerede ved BCECF-lastingen inkubert i NFLjCl-buffer (pH 7,4) (MLCl)-buffer; 115 mM NaCl, 20 mM NH4CI, 5 mM KC1, 1 mM CaCl2, 1 mM MgS04, 20 mM Hepes, 5 mM glukose, 1 mg/ml BSA: innstilt med 1 M NaOH til en pH på 7,4). Den intracellulære surgjøringen blir indusert ved tilsetting av 975 (j.1 av en NHtCl-fri buffer til 25 ul prøver til celler inkubert i NrLCl-buffer. Den etterfølgende hastigheten til gjenvinning av pH ble registrert ved NHE1 ved 2 minutter, for NHE2 ved 5 minutter og ved NHE3 ved 3 minutter. For beregning av den inhibitoriske kraft til de testede stoffene ble cellene først undersøkt i buffere hvor det ikke fant sted noen fullstendig eller henholdsvis ingen gjenvinning av pH. For fullstendig gjenvinning av pH (100%) ble cellene inkubert i Na<+->holdig buffer (133,8 nM NaCl, 4,7 mM KC1, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 0,97 mM Na2HP02, 0,23 mM NaH2P04, 5 mM Hepes, 5 mM glukose, innstilt til pH på 7,0 med 1 mM NaOH). For bestemmelse av 0-verdien ble cellene inkubert i en Na<+->fri buffer (133,8 mM kolinklorid, 4,7 mM KC1, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 0,97 mM K2HP02, 0,23 mM KH2P04, 5 mM glukose med 1 mM NaOH). Stoffene som skulle testes ble satt til den Na<+->holdige bufferen. Gjenvinningen av den intracellulære pH ved de testede konsentrasjonen for hvert stoff ble uttrykt som prosent av maksimal gjenvinning. Fra prosentverdien til pH-gjenvinning ble det ved hjelp av programmet SigmaPlot beregnet ICso-verdien til de forskjellige stoffene for de enkelte NHE-subtypene.

Claims (19)

1. Fenylsubstituerte alkenylkarboksylsyreguanidider,karakterisert vedformel I

hvor T står for: R(F) står for hydrogen, F, Cl, Br, I, (Ci-C<g>)-alkyl R(E) er uavhengig definert som R(F); R(l) er uavhengig definert som T; eller R(l) står for hydrogen, -OkGnFWi, F, Cl, Br, I, SOr2NR(31)R(32), -Ou(CH2)vC6H5, O-pyridyl; k står for 0 eller 1; m står for 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8; p står for 0, 1, 2, 3 eller 4; q står for 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 eller 8; r2 står for 0, 1 eller 2; R(31) og R(32) er uavhengig av hverandre; H, (Ci-C8)-alkyl eller (Ci-C8)-perfluoralkyl; eller R(31) og R(32) står sammen for 4 eller 5 metylgrupper av hvilke en CH2-gruppe kan være erstattet av O, S, NH, NCH3eller N-benzyl; u er 0 eller 1; v er 0, 1, 2, 3 eller 4; hvor fenylkjernene er ikke-substituerte eller substituerte med 1-3 substituenter valgt blant gruppen bestående av F, Cl, metyl, metoksy, -(CH2)WNR(21)R(22); R(21) og R(22) står uavhengig av hverandre for (Ci-C4)alkyl; w står for 1, 2, 3 eller 4; R(2), R(3), R(4) og R(5) er uavhengig av hverandre definert som R(l), eller R(l) og R(2) eller R(2) og R(3) står sammen for -CH-CH=CH-CH-; hvor resten R i molekylet minst er tilstede to ganger, imidlertid høyst tre ganger; såvel som deres farmasøytiske akseptable salter.

2. Forbindelser med formel I ifølge krav 1,karakterisertv e d at Ter R(F) står for hydrogen, F, Cl, (CrC4)-alkyl; R(E) er uavhengig definert som R(F); R(l) er uavhengig definert som T; eller R(l) står for hydrogen, -OkCmH2m+1, F, Cl, Br, I, -Ou(CH2)vC6H5; k er 0 eller 1; merO, 1, 2, 3 eller 4; q er 1, 2, 3 eller 4; u er 0 eller 1; v er 0, 1 eller 2; hvor fenylkjernene er ikke-substituerte eller substituerte med 1-3 substituenter utvalgt blant gruppen bestående av F, Cl, metyl, metoksy, -(CH2)WN(21)R(22); R(21) og R(22) står for H, (C,-C4)-alkyl; w står 1, 2, 3 eller 4; R(2), R(3), R(4) og R(5) er uavhengig av hverandre definert som R(l), eller R(l) og R(2) eller R(2) og R(3) står sammen for -CH-CH=CH-CH-; hvor resten R i molekylet imidlertid alltid er to ganger tilstede.

3. Forbindelse med formel I ifølge krav 1 eller 2,karakterisertved at: Ter R(F) står for hydrogen, F, Cl, (CrC4)-alkyl; R(E) er uavhengig definert som R(F); R(l) er uavhengig definert som T; eller R(l) står for hydrogen, -OkCmH2m+1, F, Cl, -Ou(CH2)vC5H5; k er 0 eller 1; m er 0, 1, 2, 3 eller 4; q er 1, 2, 3 eller 4; u er 0 eller 1; v er 0 eller 1; hvor fenylkjernene er ikke-substituert eller substituert med 1-3 substituenter utvalgt blant gruppen bestående av F, Cl, metyl, metoksy, -(CH2)WN(21)R(22), R(21) og R(22) står uavhengig av hverandre for H, (Ci-C4)-alkyl; w er 1, 2, 3 eller 4;

R(2), R(3), R(4) og R(5) er uavhengig av hverandre og definert som R(l); eller R(l) og R(2) eller R(2) og R(3) står sammen for -CH-CH=CH-CH-, hvor resten T er tilstede kun to ganger i molekylet.

4. Forbindelser med formel I ifølge ett eller flere av kravene 1-3,karakterisert vedat de er: l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, 1,3 -bis- [3 -(E-2-metyl-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, l,4-bis[3-(E-2-metyl-propensyreguarudid)]benzen-dihydroklorid, 2,3-bis[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]naftalin-dihydroklorid. l,2-bis[3-(Z-2-fluor-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, l-[3-(Z-2-fluor-propensyreguamdid)]-2-[3-(E-2-metyl-propensyreguandid)]benzen^ dihydrokloris, 1,3 -bis- [3 -(Z-fluor-propensyreguanidid)]benzen-dihydroklorid, 3-(4-Wor-3-guamdidkarbonyl-5-fenyl)fenyl-2-metyl-propensyreguanidid, 1,3 -bis- [3 -(E-2-metyl-propensyreguanidid)] 2-metoksy-5 -metyl-benzen-hydroklorid, l,2-bis-[3-(B-2-metyl-propensyregyanidid)]-4-rnetyl-benzen-dihydroklorid, 1.2- bis-[(3-(Ti-2-metyl-propensyreguariidid)]-4,5-diklor-berizen-dihydroklorid, 1.3- bis-[3-(E-propensyreguanidid)]benzen dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-brorn-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguarddid)]-4-(4-metoksyfenoksy)-benzen-dihydroklorid, 1.2- bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguamdid)]-4-(4-metyl-fenoksy)-benzen-dihydroklori 1,3 -bis- [3 -(E-2-metyl-propensyreguanidid)] -5 -metoksy-benzen-hydroklorid, 1.3- bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-5-tert.-butyl-benzen-hydroklorid, 1.4- bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-2,5-diklor-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(fenoksy)-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguarudid)]-4-(metoksy)-benzen-dihydroklorid, l,2-bis-[3-(E-2-metyl-propensyreguanidid)]-4-(etoksy)-benzen-dihydroklorid, og 1,2-bis- [3 -(E-2-metyl-propensyreguanidid)] -4-(3 -pyirdyloksyl)-benzen-dihydroklorid.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse I,karakterisert vedat man omsetter en forbindelse II:

med guanidin, hvor R(l), R(2), R(3), R(4), R(5), R(E) og R(F) har de angitte betydninger og L står for en lett nukleofil substituerbar avspaltbar gruppe..

6. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av arytmier.

7. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling eller profylakse av hjerteinfarkt.

8. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling eller profylakse av agina pektoris.

9. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av medikament for behandling eller profylakse av iskemiske tilstander i hjertet.

10. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling eller profylakse av iskemiske tilstander i det perifere og sentrale nervesystem, og slaganfall.

11. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling eller profilakse av iskemiske tilstander i perifere organer og lemmer.

12. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av sjokktilstander.

13. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for anvendelse ved kirurgiske operasjoner og organtransplantasjoner.

14. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for konservering og lagring av transplantater for kirurgiske formål.

15. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av sykdommer hvor celleprolifersjonen er en primær eller sekundær årsak.

16. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling eller profilakse av forstyrrelser av stoffskiftet.

17. Anvendelse av en forbindelse I ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling eller profilakse av forstyrrelser av forstyrret åndedrett.

18. Anvendelse av en forbindelse I for fremstilling av et medikament for behandling eller profilakse av akutte og kroniske nyresykdommer, spesielt akutt eller kronisk nyresvikt.

19. Legemiddel,karakterisert vedat det innholder en virksom mengde av en forbindelse I ifølge ett eller flere av kravene 1-4.