CZ20032853A3

CZ20032853A3 - Obalové proteiny HCV glykosylované s jádrem glykosylace

Info

Publication number: CZ20032853A3
Application number: CZ20032853A
Authority: CZ
Inventors: Deplaáerik; Bosmanáalfons; Deschampságeert; Sablonáerwin; Suckowámanfred; Samsonáisabelle; Verheydenágert
Original assignee: Innogeneticsán@Áv
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2004-08-18
Also published as: MXPA03009632A; CA2443781A1; US20030108561A1; EP1414942A2; SK13142003A3; KR100950104B1; JP2004532029A; AR035868A1; JP4261195B2; MXPA03009626A; NZ529019A; JP2004536052A; NZ529324A; KR20030094359A; US20030211597A1; WO2002085932A3; ZA200308274B; AR035869A1; HUP0303924A2; AU2002252856A1

Description

OBALOVÉ PROTEINY HCV GLYKOSYLOVANÉ S JÁDREM GLYKOSYLACE

OBLAST TECHNIKY

Předkládaný vynález se týká oblasti exprese rekombinantních proteinů, diagnostiky infekcí HCV, léčby nebo prevence infekcí HCV, prognózy/monitorování klinické účinnosti léčby jedince s chronickou hepatitidou, nebo prognózy/monitorování vlastního onemocnění.

Konkrétněji, předkládaný vynález se týká exprese obalových proteinů viru hepatitidy C v kvasinkách, kmenů kvasinek pro expresi obalových virových proteinů glykosylovaných s jádrem glykosylace („core glykosylated) a použití obalových proteinů podle předkládaného vynálezu v diagnostice, profylaxi nebo terapii.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Infekce virem hepatitidy C (Hepatitis C virus, HCV) je závažným zdravotním problémem jak v rozvinutých, tak v rozvojových zemích. Odhaduje se, že přibližně 1 až 5 % světové lidské populace je virem zachváceno. Jeví se, že infekce HCV je jednou z nejvýznamnějšleh příčin hepatitidy spojené s transfúzí a často se vyvíjí v chronické poškození jater. Kromě toho existují důkazy, že HCV se účastní v indukci hepatocelulárního karcinomu. Z tohoto důvodu existuje naléhavá potřeba nalezení spolehlivých diagnostických metod a účinných terapeutických agens.

Rovněž tak jsou potřebné citlivé a specifické metody pro sereening HCV-kontaminovaných krevních produktů a zdokonalené metody kultivace HCV.

HCV je virus s RNA pozitivním řetězcem o přibližně • · · · • ·

9600 bazích, který kóduje jediný polyproteinový prekursor o přibližně 3000 aminokyselinách. Bylo prokázáno, že proteolytické štěpení prekursoru spojené s ko- a posttranslačními modifikacemi vede k alespoň třem strukturním a šesti nestrukturním proteinům. Na základě sekvenční homologie byly strukturní proteiny funkčně zařazeny jako jeden protein jádra viru a dva obalové glykoproteiny: El a E2. Protein El sestává ze 192 aminokyselin a obsahuje 4 až 5 N-glykosylovaných míst v závislosti na genotypu HCV. Protein E2 sestává ze 363 až 370 aminokyselin a obsahuje 9 až 11 N-glykosylačních míst v závislosti na genotypu HCV (pro přehled viz: Major and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997). Protein El obsahuje různé variabilní domény (Maertens and Stuyver, 1997). Protein E2 obsahuje tři hypervariabilní domény, z nichž hlavní doména je lokalizována na N-konci proteinu (Maertens and Stuyver, 1997). HCV glykoproteiny jsou lokalizovány převážně v ER (endoplasmatickém retikulu), kde jsou modifikovány a upravovány do oligomerních komplexů.

U eukaryontních organismů jsou zbytky cukrů běžně navázané ke čtyřem odlišným zbytkům aminokyselin. Tyto aminokyselinové zbytky jsou klasifikovány jako O-vazebné (serin, threonin a hydroxylysin) a N-vazebné (asparagin). Cukry vázané přes kyslík (O-linked sugars) jsou syntetizovány v Golgiho aparátu nebo v hrubém endoplasmatickém retikulu (Endoplasmic Reticulum, (ER)) z cukrů nukleotidů. Cukry vázané přes dusík (N-linked sugars) jsou syntetizovány z běžného prekursoru a následně jsou zpracovávány. Předpokládá se, že obalové proteiny HCV jsou N-glykosylované. V oboru je známo, že přidání uhlovodanových řetězců připojených přes dusík (N-linked chains) má význam pro stabilizaci prostorového uspořádání • · • · • · · · · · ··· ·· · ····· ···· • · ··· ·· ··· · ···· ···· · · · · ·· · ·· ·· · · · · ·· · meziproduktů, a tím pro účinné skládání, zabránění chybného skládání a degeneraci proteinu v endoplasmatickém retikulu, v oligomerizaci, biologické aktivitě a v transportu glykoproteinů (viz přehled Rose et al., 1988; Doms et al., 1993; Helenius, 1994). Tripeptidové sekvence Asn-X-Ser a Asn-X-Thr (ve kterých X může být jakákoliv aminokyselina) jsou v polypeptidech tzv. konsensus místy pro vazbu Nvázaných oligosacharidů. Po připojení N-vázaného oligosacharidu k polypeptidu je oligosacharid dále zpracováván na komplexní typ (obsahující Nacetylglukosamin, manózu, fukózu, galaktózu a kyselinu sialovou), nebo na typ „high-mannose (obsahující Nacetylglukosamin a manózu). Předpokládá se, že obalové proteiny HCV jsou typu „high mannose. U kvasinek je posttranslační úprava (processing, dále jen „úprava,) ve smyslu připojení N-vázaných oligosacharidů zcela odlišná od úpravy v Golgiho aparátu u savců. U kvasinek jsou oligosacharidové řetězce v Golgiho aparátu prodlužovány postupným nasedáním struktur manózy, vedoucí k vytváření struktur „high mannose, které je označováno jako hyperglykosylace. Ve srovnání s tím nejsou proteiny exprimované v prokaryotech nikdy glykosylovány.

Vzory glykosylace typu „high mannose byly stanoveny u proteinů nebo peptidů z eukaryontních buněk. V savčích buňkách v typu glykosylačního oligosacharidu s jádrem (core-glycosylation-type oligosaccharide) je průměrně 5 až 9 jednotek manózy připojeno ke dvěma N-acetylglukosaminovým podílům (struktura je zkráceně uváděna jako Man(59)GlcNAc(2)). Glykosylačním jádrem je míněna struktura podobná boxové struktuře podle Obrázku 3, uvedeném v Herscovics and Orleans (1993).

• · · • · · ··· · · · • · · · · · · · ···· • · ··· · · ··· ····· ···· ···· ·· · • · · · ·· ·· ·· . ·

Bylo zjištěno, že v methylotrofni kvasince Pichlia pastoris se připojuje v průměru 8 až 14 manózových jednotek, tj. Man(8-14)GlcNAc(2) v jednom glykosylačnim místě (Tschopp v EP 0256421) a přibližně 85 % z N-vázaných oligosacharidů spadá do rozsahu Man(8-14)GlcNAc(2) (Grinna and Tschopp 1989). Jinými autory byly publikovány mírně odlišné oligosacharidové struktury, které jsou připojeny k heterologním proteinům exprimovaným v P. pastoris: Man(89)GlcNAc(2) (Montesino et al.1998), Man(9-14)GlcNAc(2) nebo Man(9-15)GlcNAc(2) (Kalidas et al. 2001), a Man(8-18)GlcNAc(2) s převahou Man(9-12)GlcNAc(2), a s tím, že celkově nejvýznamnějším oligosacharidem je Man(10)GlcNAc(2) (Miele et al. 1998). Trimble et al. (1991) popsali shodnou distribuci Man(8)GlcNAc(2) a Man(9)GlcNAc(2) u přibližně 75 % z N-vázaných oligosacharidů s dalšími 17 % Nglykosylovaných míst, která jsou obsazena s Man(10)GlcNAc(2), a zbývajících 8 % míst je obsazeno Man(11)GlcNAc(2). Hyperglykosylace proteinů, exprimovaných v P. pastoris, byla popsána ojediněle (Scorer et al. 1993).

V Aspergillus niger je k N-glykosylačním místům připojován Man(5-10)GlcNAc(2) (Panchal and Wodzinski 1998).

Glykosylačně deficientní mutanta Saccharomyces cerevisiae mnn9 se liší od divokého typu S. cerevisiae tím, že buňky mnn9 produkují místo hyperglykosylovaných proteinů proteiny glykosylované s modifikovaným oligosacharidem, jímž je Man(9-13)GlcNAc(2) (Mackay et al. v US patentu č. 5 135 854 a Kniskem et al. ve W094/01132). Byla popsána další mutanta S. cerevisiae, ochlmnn9, ve které je v glýkosylačních místech proteinů připojován Man(8)GlcNAc(2) (Yoshifumi et al. JP 06277086).

• · ···· ·· ·· ·· · • · · ··· ··· ·· · · · · · · · · · · • · · · · ·· ··· · · · · · • · · · ···· ·· · • · · · · · ·· ·· ·

Základní charakteristikou pro oligosacharidy s jádrem ze S. cerevisiae (divokého typu a mutanty mnn9) je přítomnost terminálních a 1,3-vázaných zbytků manózy (Montesino et al. 1998). Oligosacharidy připojené k Nglykosylačním místům proteinů, exprimovaných v P.pastoris nebo v S. cerevisiae ochlmnnl, takové terminální a 1,3vázané zbytky manózy postrádají (Géllissen et al. 2000). Předpokládá se, že a 1,3-vázané zbytky manózy jsou alergenní (Jenkins et al. 1996). Z tohoto důvodu nejsou proteiny nesoucí na svých oligosacharidech terminální a 1,3-vázané zbytky manózy vhodné pro diagnostické nebo terapeutické účely.

Až dosud nebyly detailně studovány glykosylační vzory proteinů, exprimovaných v methylotrofní kvasince Pansenula polymorpha, bez ohledu na použití této kvasinky pro přípravu značného množství heterologních proteinů (viz Tabulka 3 v Gellissen et al. 2000). Na základě pokusů Janowicz et al. (1991) a Diminsky et al. (1997) se předpokládá, že H.polymorpha buďto vůbec, nebo jen velice slabě glykosyluje velký nebo malý povrchový antigen viru hepatitidy B (HBsAg). Nejpravděpodobněji je toto způsobeno tím, že HBsAg byl exprimován bez signálního peptidu, a tím bylo zabráněno, aby produkovaný HBsAg vstupoval do lumen endoplasmatického retikula (ER), a tím i glykosylaci. Bylo popsáno omezené nasedání mono- nebo dihexóz ke G-CSF (faktor stimulující kolonie granulocytů, granulocyte colony stimulating factor), produkovaném v H. polymorpha (Fischer et al. ve WOOO/40727). Na druhé straně byla pozorována hyperglykosylace heterologní α-galaktosidasy, exprimované v buňkách H. polymorpha (Fellinger et al. 1991).

• · • · • · · · · · · · ·

9 9 9 9 999 9 9 9 9

9 999 99 999 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 9· ·

Až dosud se vakcinace proti nemocím osvědčila jako z hlediska nákladů nejefektivnější a současně účinná metoda pro kontrolu onemocnění. Nicméně, navzdory slibným výsledkům se úsilí o vyvinutí účinné vakcíny proti HCV potýká s obtížemi. Základní podmínkou úspěšnosti vakcín (conditio sine qua non) je indukce imunitní odpovědi u pacientů. Proto je třeba identifikovat antigenní determinanty HCV, které budou pacientům podávány ve vhodném provedení. Antigenní determinanty mohou být rozděleny alespoň na dvě formy, tj. lineární a konformační epitopy. Konformační epitopy jsou výsledkem skládání molekuly v trojrozměrném prostoru zahrnujícího ko- a posttranslační modifikace, jako je glykosylace. Obecně se předpokládá, že konformační epitopy mohou představovat nej účinnější vakcíny, neboť se jedná o epitopy, které se podobají nativním epitopům HCV a které mohou být lépe konzervovány, než běžné lineární aminokyselinové sekvence. Z tohoto důvodu má konečný stupeň glykosylace obalových proteinů HCV největší význam pro generování antigenních determinant HCV podobných nativním determinantám. Nicméně, existují zdánlivě nepřekonatelné problémy s kultivací HCV, ve které vznikají pouze nepatrná množství virionů. Kromě toho existují obrovské problémy s expresí a purifikací rekombinantních proteinů, které vedou buďto k malým množstvím proteinů, k hyperglykosylovaným proteinům, nebo k proteinům, které nejsou glykosylovány.

Obalové proteiny HCV byly připraveny rekombinantními technikami v Escherichia coli, hmyzích buňkách, buňkách kvasinek a v savčích buňkách. Nicméně, exprese ve vyšších eukaryotech je charakterizována tím, že je obtížné získat velká množství antigenu pro skutečnou produkci vakcíny. Exprese v prokaryotech, jako je E. coli, vede k obalovým • 9 • · proteinům HCV, které nejsou glykosylovány. Exprese obalových proteinů HCV v kvasinkách vede k hyperglykosylaci. Jak bylo již dříve prokázáno (Maertens et al., WO 96/04385), exprese obalového proteinu HCV E2 v Saccharomyces cerevisiae vede k proteinům, které jsou intenzivně glykosylované. Hyperglykosylace vede k zakrytí proteinových epitopů. Ačkoliv Mustilli et al. (1999) nárokuje, že exprese HCV E2 v S. cerevisiae vede ke glykosylaci s jádrem, výsledky týkající se intracelulárně exprimovaného materiálu dokazují, že alespoň část je hyperglykosylována, zatímco správná úprava zbytku tohoto materiálu nebyla prokázána. Kromě toho hyperglykosylaci pozorované Mustilli et al. (1999) mohlo být zabráněno pouze v přítomnosti tunicamycinu, inhibitoru glykosylace, a není tak není reflektována glykosylace, probíhající za normálních, přirozených, růstových podmínek. Potřeba obalových proteinů HCV, získaných z intracelulárního zdroje, je plně akceptována (Maertens et al. ve WO 96/04385, Heile et al., 2000). Tato potřeba je dále ilustrována nízkou reaktivitou E2, sekretovaného kvasinkami, se séry šimpanzů imunizovaných proteiny E2, získanými ze savčí buněčné kultury, jak je zřejmé z Obrázku 5 v Mustilli et al (1999). Tato skutečnost je dále dokumentována v práci Rosa et al (1996), podle které se ukazuje, že imunizace s obalovými proteiny HCV získanými z kvasinek selhává v zabránění napadení virem HCV.

Proto existuje potřeba účinného systému expres, který by vedl k velkým a z hlediska nákladů efektivním množstvím proteinů, jež současně mají glykosylaci podobnou nativnímu vzoru glykosylace bez terminálních a 1,3-vázaných manóz. Zejména takové systémy jsou potřebné pro produkci obalových proteinů HCV.

···· • * • · ♦ 4 ···· • · 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 ·· • 4 444 44 4 4 4 4

4444 «444 44

44 44 44 44

PODSTATA VYNÁLEZU i

První aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu, který obsahuje alespoň jedno N-glykosylační místo, přičemž protein nebo jeho fragment je charakterizován tím, že je produktem exprese v eukaryontní buňce a dále je charakterizován tím že v průměru až 80 % N-glykosylačních míst je glykosylováno s jádrem glykosylace. Konkrétně, více než 70 % míst glykosylovaných s jádrem je glykosylováno s oligomanózou se strukturou definovanou jako Man(8 až 10)GlcNAc(2). Dále, poměr oligomanózy se strukturou Man(7)GlcNAc(2) a oligomanózy se strukturou Man(8)GlcNAc(2) je menší než nebo roven 0,45. Konkrétněji, oligomanózy obsahují méně než 10 % terminální a 1,3 manózy.

Eukaryontní buňkou, exprimující uvedený izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část, může být buňka kvasinek, jako například buňka Hansenula.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu, který je derivován z proteinu, obsahujícího vedoucí peptid opičího lysozymu nebo jeho funkční variantu, jenž je připojen k uvedenému obalovému proteinu HCV nebo jeho fragmentu. Konkrétněji, izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část je získán z proteinu charakterizovaného vzorcem

CL-[(Al)_a- (PSl)_b (A2)_c ]-HCVENV-[(A3)_d - (PS2)_e- (A4)_f ] , kde:

·· ···· « · · • · · ♦ * · • · · · • · ft · ·· • · ·

9 999

9 9 9 9

9 9 ·

99 «

• · · • · · 9

9 9999

9 9

9

CL je vedoucí peptid opičího lysozymu nebo jeho funkční ekvivalent,

Al, A2, A3 a A4 jsou adaptorové peptidy, které mohou být odlišné nebo stejné,

PSI a PS2 jsou místa úprav (processing sites), která mohou být odlišná nebo stejná,

HCVENV je obalový protein HCV nebo jeho část, a, b, c, d, e , f jsou 0 nebo 1, a kde případně jsou Al a/nebo A2 částí PSI, a/nebo kde A3 a/nebo A4 jsou částí PS2.

Další aspekt předkládaného vynálezu zahrnuje izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment podle vynálezu, který je obsažen ve struktuře vybrané ze skupiny sestávající z monomerů, homodimerů, heterodimerů, homooligomerů a hetero-oligomerů. Případně je izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment podle vynálezu obsažen v částici podobné viru (virus-like particle). Konkrétněji, jakýkoliv obalový protein HCV nebo jeho fragment podle vynálezu může obsahovat cysteiny, ve kterém jsou thiolové skupiny cysteinu chemicky modifikovány.

Specifické aspekty vynálezu se týkají izolovaných obalových proteinů HCV nebo jejich fragmentů podle vynálezu, které jsou antigenní nebo imunogenní a/nebo které obsahují epitop stimulující T-buňky.

Další aspekt se týká kompozice obsahující izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment podle vynálezu, Kompozice může dále obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič a může být léčivem nebo vakcínou.

Vynález se rovněž týká způsobu přípravy izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu podle vynálezu.

Další metodou podle vynálezu je způsob detekce přítomnosti anti-HCV protilátek ve vzorku, který je v podezření, že obsahuje anti-HCV protilátky, přičemž tento způsob zahrnuje:

(i) kontaktování obalového proteinu HCV nebo jeho části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15 s uvedeným vzorkem za podmínek dovolujících komplexaci uvedeného obalového proteinu HCV nebo jeho části s anti-HCV protilátkami, (ii) (ii) detekci komplexu vytvořeného ve stupni (i) , a (iii) vyvození závěru z (ii) o přítomnosti anti-HCV protilátek v uvedeném vzorku.

Konkrétněji, uvedený způsob může zahrnovat krok (i), ve kterém kontaktování probíhá za kompetitivních podmínek. Uvedené metody mohou specificky používat pevný nosič, ke kterému je obalový protein HCV nebo jeho část navázána.

Vynález se dále týká diagnostické soupravy (kitu) pro detekci přítomnosti anti-HCV protilátek ve vzorku, který je v podezření, že obsahuje anti-HCV protilátky, přičemž uvedená souprava obsahuje obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu. Konkrétněji, souprava může obsahovat uvedený obalový protein HCV nebo jeho část navázanou na pevný nosič.

Vynález se rovněž týká léčiva nebo vakcíny obsahující obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu.

Rovněž je v tomto vynálezu zahrnuta farmaceutická kompozice pro indukci specifické imunitní odpovědi proti HCV u savce, která obsahuje účinné množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu a případně farmaceuticky přijatelné adjuvans. Farmaceutická kompozice může být alternativně schopná indukovat HCV-specifické protilátky u savce nebo indukovat T-buněčné funkce u savce. Kromě toho, farmaceutická kompozice může být profylaktickou kompozicí nebo terapeutickou kompozicí. Uvedeným savcem je konkrétně člověk.

POPIS OBRÁZKU

Obrázek 1. Schématická mapa vektoru pGEMT-ElsH6RB, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 6.

Obrázek 2. Schématická mapa vektoru pCHH-Hir, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 9.

Obrázek 3. Schématická mapa vektoru pFPMT121, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 12.

Obrázek 4. Schématická mapa vektoru pFPMT-CHH-El-H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 13.

Obrázek 5. Schématická mapa vektoru pFPMT-MFa-El-H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 16.

Obrázek 6. Schématická mapa vektoru pUC18-FMD-MFa-El-H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 17,

Obrázek 7. Schématická mapa vektoru pUCl8-FMD-CL-El-H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 20.

·· · · ·« · * · ♦ · • e · · · · · · 9

9 9 9 9 999 ···· • « ··· · · ··· · ···* • · · « 9 9 9 9 9 9 9

Obrázek 8. Schématická mapa vektoru pFPMT-CL-El-H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 21.

Obrázek 9. Schématická mapa vektoru pSP72E2H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 22.

Obrázek 10. Schématická mapa vektoru pMPT121, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 23.

Obrázek 11. Schématická mapa vektoru pFPMT-MFa-E2-H.6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 24.

Obrázek 12. Schématická mapa vektoru pMPT-MFa-E2-H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 25.

Obrázek 13. Schématická mapa vektoru pMF30, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 28.

Obrázek 14. Schématická mapa vektoru pFPMT-CL-E2-H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 32.

Obrázek 15. Schématická mapa vektoru pUC18-FMD-CL-El, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 35.

Obrázek 16. Schématická mapa vektoru pFPMT-CL-El, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 36.

Obrázek 17. Schématická mapa vektoru pUC18-FMD-CL-H6-El-KH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 39.

Obrázek 18. Schématická mapa vektoru pFPMT-CL-H6-K-El, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 40.

«· ····

I · «

I · · « ·· ·· ·· ·* · • φ · · ··« · · > · • · « · · ♦ ·«· • · · · · ·· ·*- *

Obrázek 19. Schématická mapa vektoru pYIG5, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 41.

Obrázek 20. Schématická mapa vektoru pYIG5ElH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 42.

Obrázek 21. Schématická mapa vektoru pSYl, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 43.

Obrázek 22. Schématická mapa vektoru pSYlaMFElsH6a, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 44.

Obrázek 23. Schématická mapa vektoru pBSK-E2sH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 45.

Obrázek 24. Schématická mapa vektoru pYIG5HCCL-22aH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 46.

Obrázek 25. Schématická mapa vektoru pYYIGSE2H6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 47.

Obrázek 26. Schématická mapa vektoru pYIG7, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 48.

Obrázek 27. Schématická mapa vektoru pYIG7El, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 49.

Obrázek 28. Schématická mapa vektoru pSYlYIG7El, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 50.

Obrázek 29. Schématická mapa vektoru pPICZalphaA, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 51.

• · ♦ · · • ··· • · · · · • · · • · · * ·· ··

Obrázek 30. Schématická mapa vektoru pPICZalphaD', který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 52.

Obrázek 31. Schématická mapa vektoru pPICZalphaE', který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 53.

Obrázek 32. Schématická mapa vektoru pPICZalphaD'ElsH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 58.

Obrázek 33. Schématická mapa vektoru pPICZalphaE'ElsH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 59.

Obrázek 34. Schématická mapa vektoru pPICZalphaD'E2sH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 60.

Obrázek 35. Schématická mapa vektoru pPICZalphaE'E2sH6, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 61.

Obrázek 36. Schématická mapa vektoru p(JC18MFa, který má sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 62.

Obrázek 37. Eluční profil z gelové chromatografie (rozměrově vylučovací chromatografie, size exclusion chromatografie) IMAC-purifikovaného proteinu E2-H6, exprimovaného v Hansenula polymorpha exprimující MFa-E2-H6 (viz Příklad 15). Osa X uvádí eluční objem (v ml). Vertikální linie přes eluční profil označují odebírané frakce. „Pl = smísené (pooled) frakce 4 až 9, „P2 = smísené frakce 30 až 35, a „P3 = smísené frakce 37 až 44. Osa Y uvádí absorbancí udávanou v mAU (milí jednotkách absorbance). Osa X uvádí eluční objem v ml.

• · « · ·· «· ·· ·· ·’

Obrázek 38. Různé smísené vzorky (pools) a frakce odebrané po gelové chromatografií (viz Obrázek 37) byly analyzovány neredukční SDS-PAGE s následným barvením polyakrylamidových gelů stříbrem. Analyzované pooly („Pl, „P2, a „P3) a frakce (16 až 26) jsou uvedeny v horní části zobrazení stříbrem barveného gelu. Vlevo (linie „M) jsou uvedeny velikosti markérů molekulové hmotnosti.

Obrázek 39. Frakce 17 až 23 ze stupně gelové chromatografie uvedeného na Obrázku 37 byly smíseny a alkylovány. Poté byl proteinový materiál podroben působení Endo H pro deglykosylaci. Neošetřený materiál a materiál ošetřený Endo H byly odděleny na SDS-PAGE gelu a přeneseny na membránu PVDF. Blot byl barven s amidovou černí.

Linie 1: Alkylovaný E2-H6 před působením Endo H

Linie 2: Alkylovaný E2-H6 po působením Endo H

Obrázek 40. Analýza Western-blotting buněčných lyzátů El, exprimovaného v Saccharomyces cerevislae. Western-blotting byl proveden s použitím El-specifické monoklonální protilátky IGH 201. Linie 1-4: produkt exprese po 2, 3, 5 nebo 7 dnech exprese, v uvedeném pořadí, v klonu

Saccharomyces transformovaném s pSYlYIG7Els (SEQ ID NO: 50, Obrázek 28), který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující kuřecí sekvenci vedoucího peptidu pro lysozym připojenou k E1-H6.

Linie 5-7: produkt exprese po 2, 3 nebo 5 dnech exprese, v uvedeném pořadí, v klonu Saccharomyces transformovaném s pSYlaMFElsH6aYIGl (SEQ ID NO: 44, Obrázek 22), který obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující vedoucí peptid apárovacího faktoru (α-mating factor) připojenou k E1-H6.

• · • ·

Linie 8: markéry molekulové hmotnosti o velikostech tak, jak je uvedeno.

Linie 9: purifikované Els, produkované savčími buňkami infikovanými HCV-rekombinantním virem vaccinia.

Obrázek 41. Analýza proteinu E2-H6 purifikovaného afinitní chromatografií na imobilizovaných iontech kovů (immobilízed metal ion affinity chromatography, IMAC, dále označovaná „chromatografie IMAC), který byl exprimován a upraven (posttranslačně) s H.polymorpha (viz Příklad 17). Proteiny v různých frakcích z promývání (linie 2 až 4) a eluční frakce (linie 5 až 7) byly analyzovány SDS-PAGE za redukujících podmínek s následným barvením gelu stříbrem. (A, horní obrázek) nebo s použitím Western blottingu za použití specifických monoklonálních protilátek namířených proti E2 (B, spodní obrázek). Velikosti markérů molekulové hmotnosti jsou uvedeny vlevo.

Obrázek 42. Eluční profil z prvního stupně chromatografie IMAC na sloupci Ni-IDA (Chelating Sepharose FF loaded with Ni⁺² , Pharmacia) pro purifikací sulfonovaného proteinu H6K-El, produkovaného H. polymorpha (viz Příklad 18). Sloupec byl ekvilibrován s pufrem A (50 mM fosfát, 6 M GuHCl, 1 % Empigen BB (objem/objem), pH 7,2), doplněn s 20 mM imidazolu. Po nanesení vzorku byl sloupec promyt postupně s pufrem A obsahujícím 20 mM a 50 mM imidazolu, v uvedeném pořadí (jak je uvedeno na chromatogramu). Další promytí a stupeň eluce His-značených (His-tagged) produktů byl proveden postupnou aplikací pufru B (PBS, 1% Empigen BB, pH 7,2), doplněným s 50 mM imidazolu a 200 mM imidazolu, v uvedeném pořadí (jak je uvedeno na chromatogramu). Byly • · • · • · · • ···· smíseny následující frakce: pool z promytí 1 (frakce 8 až 11, promytí s 50 mM imidazolu). Eluovaný materiál byl odebírán jako oddělené frakce 63 až 72, nebo byl připraven jako smísený vzorek (frakce 63 až 69). Osa Y uvádí absorbanci uvedenou v mAU (milí jednotky absorbance) Osa X uvádí Eluční objem v ml.

Obrázek 43. Analýza IMAC-purifikovaného proteinu H6-K-E1 (viz Obrázek 42), exprimovaného a upraveného z CL-H6-K-E1 na H6-K-E1 v H. polymorpha. Proteiny v poolu z promytí 1 (linie 12) a eluční frakce 63 až 72 (linie 2 až 11) byly analyzovány se SDS-PAGE za redukujících podmínek s následným barvením gelu stříbrem (A , horní obrázek). Proteiny přítomné ve vzorku před IMAC chromatografií (linie 2), v poolu z průtoku (flow-through pool) (linie 4), v poolu z promytí 1 (linie 5) a v elučním poolu (linie 6) byly anylyzovány metodou Western blotting s použitím specifických monoklonálních protilátek namířených proti El (B, dolní obrázek; na dráze 3 nebyl nanesen žádný vzorek). Velikosti markérů molekulové hmotnosti (linie M)jsou uvedeny vlevo.

Obrázek 44. Eluční profil z druhého stupně chromatografie IMAC na sloupci Ni-IDA (Chelating Sepharose FF loaded with Ni⁺² , Pharmacia) pro purifikaci El, rezultujícího z in vitro úpravy H6-K-E1 (purifikace viz Obrázek 42) s Endo Lys-C. Protékající eluát byl odebírán do oddělených frakcí (1 až 40), které byly testovány na přítomnost produktů Els. Frakce (7 až 28), obsahující El produkovaný z H6-K-E1, byly spojeny. Osa Y uvádí absorbanci uvedenou v mAU (míli jednotky absorbance). Osa X uvádí eluční objem v ml.

·· ····

·..··..· ·.... ’·· ^:

Obrázek 45. Analýza Western-bloting znázorňující pruhy specifických proteinů Els, které reagují s biotinylovaným heparinem (viz rovněž Příklad 19). Byly analyzovány preparáty Els, purifikované ze savčí buněčné kultury infikované HCV-rekombinantním virem vaccinia nebo exprimované s H. polymorpha. Vpravo od svislé čáry jsou uvedeny výsledky Western-blotu s biotinylovanou El specifickou monoklonální protilátkou IGH 200. Vlevo od svislé čáry jsou uvedeny výsledky Western-blotu získané s biotinylovaným heparinem. Z těchto výsledků lze odvodit, že zejména méně glykosylovanéEls mají vysokou afinitu k heparinu.

Linie M: markér molekulové hmotnosti (molekulové hmotnosti jsou uvedeny vlevo).

Linie 1: Els ze savčích buněk a alkylované během izolace. Linie 2: Els-H6 exprimované s H, polymorpha a sulfonované během izolace.

Linie 3: Els-H6 exprimované s H. polymorpha a sulfonované během izolace.

Linie 4: materiál shodný s tím, který byl nanášen na dráhu 2, avšak podrobený působení dithiothreitolu k přeměně sulfonovaných Cys-thiolových skupin na Cys-thiolové skupiny.

Obrázek 46. Profil z gelové chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného E2-H6, exprimovaného v H polymorpha v sulfonované formě, podrobeného působení PBS, 3% betain k posílení tvorby částic podobných viru záměnou Empigenu BB za betain. Smíšené frakce obsahující VLPs, které byly použity pro další testy, jsou ožnačeny

Osa Y uvádí absorbanci uvedenou v mAU (mili jednotky ·· ·· ·· ·· absorbance). Osa X uvádí eluční objem v ml. Viz také příklad 20.

Obrázek 47. Profil z gelové chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného E2-H6, exprimovaného v H polymorpha v alkylované formě, podrobeného působení PBS, 3% betain k posílení tvorby částic podobných viru záměnou Empigenu BB za betain. Smíšené frakce obsahující VLPs, které byly použity pro další testy, jsou označeny

Osa Y uvádí absorbanci uvedenou v mAU (mili jednotky absorbance). Osa X uvádí eluční objem v ml. Viz také příklad 20.

Obrázek 48. Profil z gelové chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného El, exprimovaného v H polymorpha v sulfonované formě, podrobeného působení PBS,

3% betain k posílení tvorby částic podobných viru záměnou Empigenu BB za betain. Smíšené frakce obsahující VLPs, které byly použity pro další testy, jsou označeny Osa

Y uvádí absorbanci uvedenou v mAU (mili jednotky absorbance). Osa X uvádí Eluční objem v ml. Viz také příklad 20.

Obrázek 49. Profil z gelové chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného El, exprimovaného v H polymorpha v alkylované formě, podrobeného působení PBS, 3% betain k posílení tvorby částic podobných viru záměnou Empigenu BB za betain. Smíšené frakce obsahující VLPs, které byly použity pro další testy, jsou označeny Osa

9· · ··♦«

9« ·· » 9 9 fr 9 999

Obrázek 50. SDS-PAGE (za redukčních podmínek) a analýza Western blotting VLPs tak, jak byly izolovány po gelové chromatografií (size exclusion chromatography, (SEC)), popsané na Obrázcích 48 a 49. Levá část: barvení gelu SDSPAGE stříbrem. Pravá část: Western blot s použitím specifické monoklonální protilátky namířené proti El (IGH201). Linie 1: markér molekulové hmotnosti (molekulové hmotnosti jsou uvedeny vlevo); linie 2: pool z VLPs obsahující sulfonovaný El (srovnej Obrázek 48); linie 3: pool z VLPs obsahující alkylovaný El (srovnej Obrázek 49). Viz také příklad 20.

Obrázek 51. El produkovaný v savčích buňkách („M), nebo El, produkovaný v H. polymorpha („H), byly zachyceny na pevnou podložku ELISA ke stanovení konečných titrů (end point titer) protilátek přítomných v séru po vakcinaci myší s El, produkovaném v savčích buňkách ((horní panel), nebo po vakcinaci myší s El, produkovaném v H. polymorpha (dolní panel). Horizontální čára představuje střední titr protilátek. Konečné titry (v násobném ředění) jsou uvedeny na ose Y. Viz také Příklad 22.

Obrázek 52. El produkovaný v Hansenula („A), nebo sulfonovaný El byly zachyceny na pevnou podložku ELISA ke stanovení konečných titrů (end point titer) protilátek přítomných v séru po vakcinaci myší s El, produkovaném v Hansenula, který byl alkylován (horní panel), nebo po vakcinaci myší s El, produkovaném v Hansenula, který byl sulfonován (dolní panel). Horizontální čára představuje střední titr protilátek. Konečné titry (v násobném ředění) jsou uvedeny na ose Y. Viz také Příklad 23.

·· ··*· * · · · ·· ·· • · • ♦ ·

• · • ·

Obrázek 53. HCV El, produkovaný v savčích buňkách infikovaných HCV-rekombinantním virem vaccinia, a HCV El, produkovaný v H. polymorpha, byly neneseny přímo na destičky ELISA. Konečné titry protilátek byly stanoveny v séru šimpanzů vakcinovaných s El, produkovaným v savčích buňkách (horní panel), a z myších monoklonálních protilátek, vyvolaných proti El produkovanému savčími buňkami (spodní panel). Šimpanzové Yoran a Marti byly profylakticky vakcinováni. Šimpanzové Ton, Phil, Marcel, Peggy a Femma byly vakcinováni terapeuticky. Černě vyplněné sloupce: ELISA plotna s navázaným El, produkovaným v savčích buňkách. Prázdné sloupce: ELISA plotna s navázaným El, produkovaným v Hansenula. Konečné titry (v násobném ředění) jsou uvedeny na ose Y. Viz také Příklad 24 .

Obrázek 54. Gelová elektroforéza s fluorescenčním značením cukru (Fluorophore-assisted carbohydrate gel Electrophoresis) oligosacharidů uvolněných z El, produkovaného savčími buňkami infikovanými rekombinantním virem vaccinia, a z proteinu E1-H6, produkovaného Hansenula.

Linie 1: Glukózová standardní stupnice uvádějící vlevo počet monosacharidů (3 až 10, označeno jako G3 až G10). Linie 2: 25 pg N-vázaných oligosacharidů uvolněných z (alkylovaného) El, produkovaného v savčích buňkách.

Linie 3: 25 μg N-vázaných oligosacharidů uvolněných z (alkylovaného) El, produkovaného v Hansenula.

Linie 4: maltotetraóza 100 pmol.

Viz také Příklad 25.

Obrázek 55. Obrázek uvádí zjednodušené struktury referenčních oligomanóz Man-9 (Obrázek 55.A), Man-8 ·* * ·· • · ·

9

9 * • · · • ·*·· _Λ

9 9 9 9 9

9 9 9

Φ· ·· ·* < · • · ·

Φ 9999 Φ >

(Obrázek 55.Β), Man-7 (Obrázek 55.C), Man-6 (Obrázek 55.D) a Man-5 (Obrázek 55.E). „Man = manóza; „GlcNAc = Nacetylglukosamin; „a = a-vazba mezi 2 manózami; „β = βvazba mezi 2 manózami; „(1-3), „(1-4) a „(1-6) = (1-3), (1-4) a (1-6) vazby mezi 2 manózami, v uvedeném pořadí. Závorky na Obrázku 55.B a 55.C znamenají, že v uvedeném pořadí jsou 2 a 1 zbytky (zbytek) manózy vlevo od závorky jsou spojeny (je spojen) vazbou (1-2) ke 2 a 1 ze 3 manéžových zbytků uvedených vpravo od závorek. Viz také příklad 26.

Obrázek 56. Obrázek uvádí vyšší oligomanózu sestávající z 10 manózových molekul připojených k chitobióze. Každý koncový zbytek manózy je připojen vazbou α 1-3 k neterminálnímu zbytku manózy. Tenká šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení, s α 1-2 manozidázou (pro tuto oligomanózu není žádná), tlustá šipka směřující vzhůru nebo vlevo označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s α manozidázou po odstranění 1-2-vázaných manóz (neplatí pro tuto oligomanózu) a prázdná dolu směřující šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s β manozidázou po odstranění α-vázaných manóz. Viz také Příklad 26.

Obrázek 57. Obrázek zobrazuje vyšší oligomanózu sestávající z 9 manózových molekul připojených k chitobióze. V této oligomanóze je jeden koncový zbytek manózy připojen vazbou α 1-2 k neterminálnímu zbytku manózy. Tenká šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s a 1-2 manozidázou, tlustá šipka směřující vzhůru nebo vlevo označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s α manozidázou po *· odstranění α 1-2-vázaných manóz, a prázdná dolu směřující šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s β manozidázou po odstranění α-vázaných manóz. Viz také Příklad 26.

Obrázek 58. Obrázek zobrazuje vyšší oligomanózu Man-9 sestávající z 9 manózových molekul připojených k chitobióze. V této oligomanóze jsou všechny koncové manózové zbytky připojeny vazbou a 1-2 k neterminálnímu zbytku manózy. Tenká šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s a 1-2 manozidázou, tlustá šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s a manozidázou po odstranění a 1-2-vázaných manóz, a prázdná dolu směřující šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s β manozidázou po odstranění avázaných manóz. Viz také Příklad 26.

Obrázek 59. Obrázek zobrazuje vyšší oligomanózu Man-8 sestávající z 8 manózových molekul připojených k chitobióze. V této oligomanóze jsou všechny koncové manózové zbytky připojeny vazbou a 1-3 nebo a 1-6 k neterminálnímu zbytku manózy, což činí tuto strukturu zcela rezistentní ke štěpení s a 1-2 manozidázou. Tenká šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s a manozidázou, a prázdná dolu směřující šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s β manozidázou po odstranění avázaných manóz. Viz také Příklad 26.

Obrázek 60. Obrázek zobrazuje vyšší oligomanózu Man-7 sestávající ze 7 manózových molekul připojených k chitobióze. V této oligomanóze jsou všechny koncové • · · · • · · · · · • · ···· · · · · • · · · · ··· ····· ·· · · · · ·· · ·· ·· ·· ·· · manózové zbytky připojeny vazbou α 1-3 k neterminálnímu zbytku manózy, což činí tuto strukturu zcEla rezistentní ke štěpení s α 1-2 manozidázou. Tenká šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s α manozidázou, a prázdná dolu směřující šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s β manozidázou po odstranění α-vázaných manóz. Viz také Příklad 26.

Obrázek 61. Obrázek zobrazuje vyšší oligomanózu sestávající z 9 manéžových molekul připojených k chitobióze. V této oligomanóze je jeden manéžový zbytek připojen vazbou α 1-2 k neterminálnímu zbytku. Tenká šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s α 1-2 manozidázou, tlustá šipka směřující vzhůru nebo vlevo označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s a manozidázou po odstranění a. 1-2vázaných manóz, a prázdná dolu směřující šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s β manozidázou po odstranění α-vázaných manóz. Viz také Příklad 26.

Obrázek 62. Obrázek zobrazuje domnělý oligosacharid obsahující glukózu sestávající z 1 nebo 2 glukózových molekul a z 8 manéžových molekul připojených k chitobióze.

V tomto oligosacharidu každý z koncových α 1-2 vázaných zbytků manózy v řetězci A nebo B („A a „B na Obrázku) nese jeden nebo dva glukózové zbytky tak, jak je vyznačeno s (Glc)Glc vlevo od závorky. Tenká šipka směřující vzhůru označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s α 1-2 manozidázou, za předpokladu, že ke koncovému manózovému zbytku není připojena žádná glukóza. Tlustá vzhůru nebo vlevo směřující • · · ·

šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné k štěpení s a manozidázou po odstranění a 1-2 vázaných manóz, a prázdná dolů směřující šipka označuje oligosacharidové vazby, které jsou náchylné ke štěpení s β manozidázou po odstranění a vázaných manóz. Přehled možných reakčních produktů uvádí Tabulka 10 v Příkladu 26.

Obrázek 63. Reakční produkty z inkubace Man-9 s nebo bez exoglykosidázy přes noc byly odděleny na sloupci TSK gelAmide-80 (0,46 x 25 cm, Tosoh Biosep), připojeném k zařízení Waters Alliance HPLC. Oddělování oligosacharidů probíhalo za teploty prostředí při průtoku 1,0 ml/min. Rozpouštědlo A bylo složeno z 0,1% kyseliny octové v acetonitrilu a rozpouštědlo B bylo složeno z 0,2% kyselina octová-0,2% triethylamin ve vodě. Oddělování 2-AB značených oligosacharidů bylo prováděno s použitím izokratické eluce 28 % B na 5 objemů sloupce s následujícím lineárním zvýšením na 45 % B během patnácti objemů sloupce. Složení elučního rozpouštědla je uvedeno na pravé ose Y jako % rozpouštědla B v rozpouštědle A (objem/objem). Doba eluce je uvedena v minutách na ose X. Levá osa Y uvádí fluorescenci eluovaných oligosacharidů značených 2aminobenzamidem (2-AB). Excitační vlnová délka 2-AB je 330 nm, emisní vlnová délka je 420 nm.

Signál 1 („1) v chromatogramu označuje elucí Man-9 inkubovaného přes noc s exoglykosidázami. Signál 2 („2) označuje eluci směsi Man-5 a Man-6 po inkubaci Man-9 s a 1-2 manozidázou přes noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označují eluci 4'-β-mannosyl chitobiózy po inkubaci Man-9 po dobu 1 hodiny nebo přes noc s a manozidázou, v uvedeném pořadí. Signál 5 („5) označuje eluci chitobiózy po inkubaci Man-9 s a- a β-manozidázou přes noc. Signály 1-5 • ·

jsou uvedeny jako překrývající se, vzhledem k tomu, že jejich příslušné základní úrovně nejsou všechny na nulové úrovni. Signál 6 („6) označuje použitý gradient rozpouštědla.

Píky, jestliže jsou přítomny, označené písmeny A až K v horní části obrázku, znamenají A, chitobióza; Β, 4'-βmannosyl-chitobióza; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7 ; J, Man-8; a K, Man-10. Viz také Příklad 26.

Obrázek 64. Reakční produkty oligosacharidů z Els, produkovaných v Saccharomyces, po inkubaci s nebo bez exoglykosidáz přes noc byly oddělovány na sloupci TSK gelAmide-80 (0,46 x 25 cm, Tosoh Biosep), připojeném k zařízení Waters Alliance HPLC. Oddělování oligosacharidů probíhalo za teploty prostředí při průtoku 1,0 ml/min. Rozpouštědlo A bylo složeno z 0,1% kyseliny octové v acetonitrilu a rozpouštědlo B bylo složeno z 0,2% kyselina octová-0,2% triethylamin ve vodě. Oddělování 2-AB značených oligosacharidů bylo prováděno s použitím izokratické eluce 28 % B na 5 objemů sloupce s následujícím lineárním zvýšením na 45 % B během patnácti objemů sloupce. Složení elučního rozpouštědla je uvedeno na pravé ose Y jako % rozpouštědla B v rozpouštědle A (objem/objem). Doba eluce je uvedena v minutách na ose X. Levá osa Y uvádí fluorescenci eluovaných 2-aminobenzamidem (2-AB)-značených oligosacharidů. Excitační vlnová délka 2-AB je 330 nm, emisní vlnová délka je 420 nm.

Signál 1 („1) v chromatogramu označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných v Saccharomyces, inkubovaných přes noc bez exoglykosidáz. Signál 2 („2) označuje eluci oligosacharidů odvozených • · · · • · z Els produkovaných v Saccharomyces, po inkubaci Man-9 s a 1-2 manozidázou přes noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označuji eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných v Saccharomyces, po inkubaci po dobu 1 hodiny nebo přes noc s a manozidázou, v uvedeném pořadí. Signál 5 („5) označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných v Saccharomyces, po inkubaci s a- a βmanozidázou přes noc. Signály 1-5 jsou uvedeny jako překrývající se, vzhledem k tomu, že jejich příslušné základní úrovně nejsou všechny na nulové úrovni. Signál 6 („6) označuje použitý gradient rozpouštědla.

Píky, jestliže jsou přítomny, označené písmeny A až K v horní části obrázku, znamenají A, chitobióza; Β, 4'-βmannosyl-chitobióza; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7 ; J, Man-8; a K, Man-10.

Viz také Příklad 26.

Obrázek 65. Reakční produkty oligosacharidů z Els, produkovaných v savčích buňkách transfekovaných virem vaccinia, po inkubaci s nebo bez exoglykosidáz přes noc byly oddělovány na sloupci TSK gel-Amide-80 (0,46 x 25cm, Tosoh Biosep), připojeném k zařízení Waters Alliance HPLC. Oddělování oligosacharidů probíhalo za teploty prostředí při průtoku 1,0 ml/min. Rozpouštědlo A bylo složeno z 0,1% kyseliny octové v acetonitrilu a rozpouštědlo B bylo složeno z 0,2% kyselina octová-0,2% triethylamin ve vodě. Oddělování 2-AB značených oligosacharidů bylo prováděno s použitím izokratické eluce 28 % B na 5 objemů sloupce s následujícím lineárním zvýšením na 45 % B během patnácti objemů sloupce. Složení elučního rozpouštědla je uvedeno na pravé ose Y jako % rozpouštědla B v rozpouštědle A (objem/objem). Doba eluce je uvedena v minutách na ose X. Levá osa Y uvádí fluorescenci eluovaných 2-aminobenzamidem • · ···· · · * · • · · · · · • · · · · ··· ·· ······ ···· ···· (2-AB)-značených oligosacharidů. Excitační vlnová délka 2AB je 330 nm, emisní vlnová délka je 420 nm.

Signál 1 („1) v chromatogramu označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných savčími buňkami transfekovanými virem vaccinia, inkubovaných přes noc bez exoglykosidáz. Signál 2 („2) označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných savčími buňkami transfekovanými virem vaccinia, po inkubaci Man-9 s α 1-2 manozidázou přes noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označují eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných savčími buňkami transfekovanými virem vaccinia, po inkubaci po dobu 1 hodiny nebo přes noc s α manozidázou, v uvedeném pořadí. Signál 5 („5) označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných savčími buňkami transfekovanými virem vaccinia, po inkubaci s a- a β-manozidázou přes noc. Signály 1-5 jsou uvedeny jako překrývající se, vzhledem k tomu, že jejich příslušné základní úrovně nejsou všechny na nulové úrovni. Signál 6 („6) označuje použitý gradient rozpouštědla.

Viz také Příklad 26.

Obrázek 66. Reakční produkty oligosacharidů z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubaci s nebo bez exoglykosidáz přes noc byly oddělovány na sloupci TSK gelAmide-80 (0,46 x 25cm, Tosoh Biosep), připojeném k zařízení Waters Alliance HPLC. Oddělování oligosacharidů probíhalo za teploty prostředí při průtoku 1,0 ml/min. Rozpouštědlo A bylo složeno z 0,1% kyseliny octové v acetonitrilu a • · · · · • · · · ··· · ·· · • · ·· ····· ·· · · ·· ·· rozpouštědlo B bylo složeno z 0,2% kyselina octová-0,2% triethylamin ve vodě. Oddělování 2-AB značených oligosacharidů bylo prováděno s použitím izokratické eluce 28 % B na 5 objemů sloupce s následujícím lineárním zvýšením na 45 % B během patnácti objemů sloupce. Složení elučního rozpouštědla je uvedeno na pravé ose Y jako % rozpouštědla B v rozpouštědle A (objem/objem). Doba eluce je uvedena v minutách na ose X. Levá osa Y uvádí fluorescenci eluovaných 2-aminobenzamidem (2-AB)-značených oligosacharidů. Excitační vlnová délka 2-AB je 330 nm, emisní vlnová délka je 420 nm.

Signál 1 („1) v chromatogramu označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných v Hansenula, inkubovaných přes noc bez exoglykosidáz. Signál 2 („2) označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubaci Man-9 s oc 1-2 manozidázou přes noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označují eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubaci přes noc s a manozidázou. Signál 5 („5) označuje eluci oligosacharidů odvozených z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubaci s a- a β-manozidázou přes noc. Signály 1-5 jsou uvedeny jako překrývající se, vzhledem k tomu, že jejich příslušné základní úrovně nejsou všechny na nulové úrovni. Signál 6 („6) označuje použitý gradient rozpouštědla.

Viz také Příklad 26.

• · • · *«·· ···· ·· ·

Obrázek 67. Analýza SDS-PAGE a barvení proteinů El, produkovaných v Hansenula a savčími buňkami infikovanými HCy-rekombinantním virem vaccinia, s modří Coomassie Brilliant Blue.

Linie 1: markéry molekulových hmotn.ostí s uvedením molekulových hmotn.ostí vlevo;

Linie 2: alkylované Els, produkované v Hansenula polymorpha (10 μς);

Linie 3: alkylované Els, produkované v Hansenula polymorpha (5 gg) ;

Linie 4: alkylované Els, produkované v Hansenula polymorpha (2,5 gg) ;

Linie 5: alkylované Els, produkované v buňkách vero infikovaných HCV-rekombinantním virem vaccinia (10 μg); Linie 6: alkylované Els, produkované v buňkách vero infikovaných HCV-rekombinantním virem vaccinia (5 μg);

Linie 7: alkylované Els, produkované v buňkách vero infikovaných HCV-rekombinantním virem vaccinia (2,5 μg).

Viz také Příklad 27.

Obrázek 68. Sekvence proteinu HCV E2-H6 (SEQ ID NO: 5) s vyznačením tryptických fragmentů (sekvence v rámečcích boxed sequences) deglykosylovaného proteinu. Glykosylované zbytky Asn jsou přeměňovány na zbytky Asp enzymem PNGázou F a jsou vyznačeny pod sekvencí. Zbytky Asn jsou náchylné k proteolytickému štěpení s Asp-N endoproteázou. Možnými Nglykosylačními místy v E2-H6 (SEQ ID NO: 5) jsou N417, N₄₂₃ , N430, N₄48, N478, N532, N540, N₅₅6ř N576, Νβ23 a Νδ₄5 podle číslování v polyproteinu HCV; na obrázku jsou polohy těchto míst označeny jako N₃₄, N₄₀, N₄₇, N₆5/ N₉₅, Ν_Χ49, Ni₅₇, Ni₇₃,

N193, N₂₄o a N₂62 · Viz také Příklad 28.

AAA· • A <

·· ···· • ·

AAA

PODROBNÝ POPIS VYNÁLEZU

Ve studiích, které vedly k tomuto vynálezu, bylo pozorováno, že exprese glykosylovaných obalových proteinů HCV v Saecharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Hansenula polymorpha byla možná jako exprese uvedených obalových proteinů HCV obsahujících signální peptidovou sekvenci připojenou k uvedeným obalovým proteinům HCV. Nicméně, vzory glykosylace obalových proteinů HCV, exprimovaných v těchto třech kvasinkových druzích, jsou však velice odlišné (viz Příklady 6, 10, 13 a 25). Konkrétněji, obalové proteiny HCV, exprimované v S. cerevisiae (glykosylačně deficientní mutantě) a v H. polymorpha byly glykosylovány způsobem napodobujícím glykosylaci s jádrem glykosylace. Obalové proteiny HCV, exprimované v Píchla pastoris, byly hyperglykosylovány při uvádění protichůdných údajů v předchozích zprávách o tom, že proteiny exprimované v kvasinkách nejsou normálně hyperglykosylovány (Gellissen et al. 2000, Sugrue et al. 1997).

Po další analýze vzorů glykosylace u proteinů HCV, produkovaných v S. cerevisiae (glykosylačně deficientním kmenu), H. polymorpha a v savčích buňkách infikovaných HCVrekombinantním virem vaccinia, bylo překvapivě zjištěno, že obalové proteiny HCV produkované v Hansenula vykazovaly vzor glykosylace, který je velice příznivý pro diagnostické, profylaktické a terapeutické aplikace těchto obalových proteinů HCV (viz Příklady 21-24 a 26-29). Toto neočekávané zjištění se odráží v různých aspektech a v provedeních předkládaného vynálezu tak, jak je uvedeno níže.

9999

99

9

9 9

9 9 9 • 99999

9 9

První aspekt vynálezu se týká izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu, který obsahuje alespoň jedno N-glykosylační místo, kde uvedený protein nebo jeho fragment je charakterizován tím, že je produktem exprese v eukaryontní buňce a dále tím, že průměrně až 50 %, 51 %,

52	Q. 0 r	53	O, 0 z	54 %,	55 %,	56	O O Z	57	Q, θ Z	58 %	, 59 %,60 %, 61 %,
62	Q. o r	63	o, O z	64 %,	65 %,	66	Q, o Z	67	O θ Z	68	%, 69 %, 70 %, 71 %,
72		73	o. ° z	74 %,	75 %,	76	O o Z	77	0, ⁰ z	78	%, 79 %, nebo 80 %

N-glykosylovaných míst jsou místa glykosylovaná s jádrem glykosylace. Konkrétněji, více než 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64% , 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, %, 85 %, 86 %,87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, % nebo 95 % N-glykosylovaných míst je glykosylováno s oligomanózou o struktuře definované jako Man(8 až 10)GlcNAc(2). Konkrétněji, ke kterékoliv z výše uvedených Nglykosylačních charakteristik, je další charakteristikou to, že poměr míst glykosylovaných s jádrem s oligomanózou o struktuře Man(7)-GlcNAc(2) a počet míst glykosylovaných s jádrem s oligomanózou o struktuře Man(8)-GlcNAc(2) je menší než nebo roven 0,15 ,0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, nebo 0,50. Další, konkrétnější charakteristikou N-glykosylace k výše uvedeným charakteristikám je skutečnost, že uvedené oligomanózy obsahují méně než 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14%, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, %, 8 %, 7 %, 6 %, nebo 5 % terminální a 1,3 manózy.

Výrazem „N-glykosylovaná místa glykosylovaná s oligomanózou o struktuře definované jako Man(8 až 10)GlcNAc(2) je míněno, že uvedená N-glykosylovaná místa jsou glykosylována s kteroukoliv z Man(8)-GlcNAc(2), Man (9)GlcNAc(2), nebo Man(10)-GlcNAc(2).

• · ···· ·« · · · · » · * • · · · · ··· * · · · • · ·.···♦··· ···♦ • · · · ···· ·· · • 4 ·· ·· ·· ·· ·

Je zřejmé, že shodná N-glykosylační místa ve dvou proteinech mohou být obsazena odlišnou oligomanózou.

Výraz „protein se týká polymeru z aminokyselin a nevztahuje se ke specifické délce produktu; proto jsou v definici proteinu zahrnuty peptidy, oligopeptidy a polypeptidy. Uvedený termín se netýká nebo nevylučuje modifikace proteinu po expresi (post-expression modifications), jakými jsou například glykosylace, acetylace, fosforylace a podobně. V definici jsou zahrnuty například polypeptidy obsahující jeden nebo více analogů aminokyselin (včetně, například nepřirozených aminokyselin, PNA, atd.), polypeptidy se substituovanými vazbami, stejně jako další modifikace známé v oboru, a to jak přirozeně, tak nepřirozeně se vyskytující.

Jestliže je zde použit výraz „pre-pro-protein nebo „pre-protein, je míněn protein obsahující pre-pro-sekvenci připojenou k proteinu, který je předmětem zájmu, nebo protein obsahující pro—sekvenci připojenou k proteinu, který je předmětem zájmu, v uvedeném pořadí. Jako alternativní označení pro „pre-sekvenci, jsou používány výrazy „signální sekvence, „signální peptid, „vedoucí peptid, nebo „vedoucí sekvence; všechny se vztahují k aminokyselinové sekvenci, která zavádí pre-protein do hrubého endoplasmatického retikula (rough endoplasmic reticulum, ER) , což je nezbytnou podmínkou pro (N) glykosylaci. „Signální sekvence, „signální peptid, „vedoucí peptid, nebo „vedoucí sekvence je odštěpována , tj. je „odstraněna z proteinu obsahujícího signální sekvenci připojenou k proteinu, který je předmětem zájmu, na luminální straně tohoto ER hostitelskými specifickými proteázami, které jsou označovány jako signální peptidázy.

Φ·

Φ Φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φφ φ

Podobně je pre-pro-protein přeměňován na pro-protein po přemístění do lumen ER. V závislosti na podstatě této pro-aminokyselinové sekvence, může nebo nemusí být tato sekvence odstraněna hostitelskou buňkou, která exprimuje pre-pro-protein. Velmi dobře známou pre-proaminokyselinovou sekvencí je pre-pro-sekvence a pérovacího faktoru ze S. cerevisiae.

Výrazem obalové proteiny HCV jsou míněny obalové proteiny HCV El nebo HCV E2, nebo jejich část, přičemž uvedené proteiny mohou být odvozeny z kmene HCV jakéhokoliv genotypu. Konkrétněji, je HCVENV vybrán ze skupiny aminokyselinových sekvencí sestávající ze sekvencí SEQ ID NO: 85 až 98, aminokyselinových sekvencí, které jsou alespoň z 90 % identické se sekvencemi SEQ ID NO: 85 až 98, a z fragmentů kterékoliv z uvedených sekvencí. Za identické aminokyseliny jsou považovány skupiny konzervovaných aminokyselin tak, jak bylo popsáno výše, tj. skupiny sestávající z Met, Ile, Leu a Val; skupiny sestávající z Arg, Lys a His; skupiny sestávající z Phe,

Trp a Tyr; skupiny sestávající z Asp a Glu; skupiny sestávající z Asn a Gin; skupiny sestávající z Cys, Ser a Thr; a skupiny sestávající z Ala a Gly.

Konkrétněji, výraz „obalový protein HCV se týká polypeptidu nebo jeho analogu (např, mimotopů), obsahujícího aminokyselinovou sekvenci (a/nebo aminokyselinový analogů), která představuje alespoň jeden epitop HCV buď z oblasti El, nebo z oblasti E2, vedle glykosylačního místa. Tyto obalové proteiny mohou být jak monomerními, hetero-oligomerními, tak homo-oligomerními formami rekombinantně exprimovaných obalových proteinů. Sekvence definující epitop běžně odpovídá aminokyselinovým ·· · • 9 9

9 9 9

9 9999

9 9 • 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 · 9 9 9 9 9 9 « · · 9 9 9 9 9 99 99 99 99 sekvencím buďto oblasti HCV El, nebo oblasti HCV E2 (buďto identicky nebo se substitucemi s analogy nativních aminokyselinových zbytků, které nenarušují epitop).

Je třeba rozumět, že epitop HCV může být kolokalizován s glykosylačním místem.

Obecně, sekvence definující epitop má délku 3 nebo 4 aminokyselin, běžněji má délku 5, 6, nebo 7 aminokyselin, častěji je délka 8 nebo 9 aminokyselin a nejtypičtěji je délka epitopu 10 nebo více aminokyselin. Pokud se jedná o konformační epitopy, délka sekvence definující epitop může být ovlivněna různými rozsáhlými obměnami, neboť se předpokládá, že tyto epitopy jsou vytvářeny v trojrozměrném uspořádání epitopu (například skládání). A tak počet aminokyselin definujících epitop může být relativně malý, avšak tyto aminokyseliny mohu být obecně rozptýleny podél délky molekuly, přičemž do správné konformace epitopu jsou uspořádány prostřednictvím skládání molekuly. Části antigenu, které se nacházejí mezi zbytky definujícími epitop, nemusí být kritické pro konformační strukturu epitopu. Tak například, delece nebo substituce těchto intervenujících sekvencí nemusí mít vliv na konformaci epitopu, za předpokladu, že jsou zachovány sekvence, které jsou kritické pro konformační strukturu epitopu (například cysteiny zúčastněné v tvorbě disulfidových vazeb, glykosylační místa atd.). Konformační epitop mohou také tvořit 2 nebo více základních oblastí podjednotek homooligomeru nebo hetero-oligomeru.

Tak, jak je zde použito, „epitop jmenovaného polypeptidu znamená epitopy se shodnou aminokyselinovu sekvencí, jako má epitop jmenovaného polypeptidu, a jejich

Β* ΒΒ»Β

Β Β Β » · Β Β Β Β · * ···· %·* ΒΒ βΒ ΒΒ ♦· » imunologické ekvivalenty. Takové ekvivalenty rovněž zahrnuji kmen, subtyp (=genotyp), nebo typově(skupinově)specifické varianty, například v současné době známé sekvence nebo kmeny, které náleží ke genotypům la, lb, lc,

ld,

le,

lf,

2a,

2b,

2c,

2d,

2e,

2f,

2g,

2h,

2i,

3a,

3b,

3c,

3d,

3e,

3f,

3g,

4a,

4b,

4c,

4d,

4e,

4f,

4g,

4h,

4i,

4j,

4k,

41,

5a,

5b,

6a,

6b,

6c,

7a,

7b,

7c,

8a,

8b,

9a,

9b,

10a,

11

(a jeho sybtypů), 12 (a jeho subtypů) nebo 13 (a jeho subtypů), nebo dalších nově popsaných (sub)typů HCV. Je třeba rozumět, že aminokyseliny, které vytvářejí epitop, nemusí být částí lineární sekvence, ale mohou být rozptýleny v jakémkoliv počtu aminokyselin, a tak vytvářejí konformační epitop·.

Antigeny HGV podle předkládaného vynálezu zahrnují konformační epitopy z El a/nebo E2 (obalových) domén HCV. Doména El, o které se předpokládá, že odpovídá virovému obalovému proteinu, je v současnosti odhadována v rozsahu aminokyselin 192-383 v polyproteinu HCV (Hijikata et al., 1991). Předpokládá se, že po expresi v savčím systému (glykosylovaný) má El přibližnou molekulovou hmotnost 35 kDa při stanovení s SDS-PAGE. Předpokládá se, že protein E2, dříve nazývaný NS1, zahrnuje aminokyseliny 384-809 nebo 384-746 (Grakoui et al., 1993) v polyproteinu HCV a rovněž se jedná o obalový protein. Předpokládá se, že po expresi v systému vaccinia (glykosylovaný) má zjevnou molekulovou hmotn.ost stanovenou v gelu přibližně 72 kDa. Je třeba si uvědomit, že umístění konců těchto proteinů jsou odhadováno (například karboxykonec E2 může ležet někde v rozmezí oblasti aminokyselin 730-820, a tak končí například aminokyselinou 730, 735, 740, 742, 744, 745, výhodně aminokyselinou 746, 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820). Protein E2 může být rovněž exprimován ·* ····

• « ♦ · ·« ·· • · · « · · ··· • · · · · · • · · · · ·» ·· ·· * · · • · · · • ····· • · · • t » společně s El, a/nebo s jaderným proteinem viru (aa 1-191), a/nebo P7 (aa 747-809), a/nebo NS2 (aa 810-1026), a/nebo NS3 (aa 1027-1657), a/nebo NS4A (aa 1658-1711), a/nebo NS4B (aa 1712-1972), a/nebo NS5A (aa 1973-2420), a/nebo NS5B (aa 2421-3011), a/nebo s částí z kteréhokoliv z těchto proteinů HCV, které jsou od E2 odlišné. Podobně, protein El může také být exprimován společně s proteinem E2, a/nebo s jaderným proteinem (aa 1-191), a/nebo P7 (aa 747-809), a/nebo NS2 (aa 810-1026), a/nebo NS3 (aa 1027-1657), a/nebo NS4A (aa 1658-1711), a/nebo NS4B (aa 1712-1972), a/nebo NS5A (aa 1973-2420), a/nebo NS5B (aa 2421-3011), a/nebo s částí z kteréhokoliv z těchto proteinů HCV, které jsou od El odlišné. Exprese společně s těmito dalšími proteiny může být významná pro dosažení správného poskládání proteinu.

Výraz „El tak, jak je zde použit, rovněž zahrnuje analogy a zkrácené formy, které jsou imunogenně křížově reaktivní s přirozeným El, a zahrnuje proteiny El vybrané z genotypů 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nebo 13, nebo jakýkoliv další nově identifikovaný typ HCV nebo subtyp. Výraz „E2 tak, jak je zde použit, rovněž zahrnuje analogy a zkrácené formy, které jsou imunogenně křížově reaktivní s přirozeným E2, a zahrnuje proteiny E2 vybrané z genotypů 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nebo 13, nebo jakýkoliv další nově identifikovaný typ HCV nebo subtyp. Tak například, Kato et al. (1992) popsal mnohonásobné inzerce kodónu mezi kodón 383 a 384, stejně jako delece aminokyselin 384-387. Je třeba rozumět, že izoláty použité v části Příkladů provedení podle předkládaného vynálezu, nebyly zamýšleny jako omezující rozsah vynálezu, a že jakýkoliv izolát HCV vybraný z typů 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 nebo 13, nebo jakýkoliv z dalších nových genotypů HCV je vhodným zdrojem • · ·

sekvence El a/nebo E2 pro provedení předkládaného vynálezu. Podobně, tak jak bylo výše popsáno, proteiny HCV, které jsou ko-exprimovány s obalovými proteiny HCV podle předkládaného vynálezu mohou být odvozeny od jakéhokoliv typu HCV, tedy i od shodného typu, jako jsou obalové proteiny HCV podle předkládaného vynálezu.

„E1/E2, tak, jak je zde použito, se týká oligomerní formy obalových proteinů obsahující alespoň jednu složku El a alespoň jednu složku E2.

Výraz „specifický oligomerní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 obalové proteiny se týká všech možných oligomerních forem rekombinatně exprimovaných El a/nebo E2 obalových proteinů, které nejsou agregáty.El a/nebo E2.Specifické oligomerní obalové proteiny se rovněž týkají homooligomerních El nebo E2 obalových proteinů (viz níže).

Výraz „jednoduché nebo specifické oligomerní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 obalové proteiny se týká jednotlivých monomerních proteinů El nebo E2 (jednotlivý v přísném slova smyslu), stejně jako specifických oligomerních rekombinantně exprimovaných proteinů El a/nebo E2 a/nebo E1/E2. Tyto jednotlivé nebo specifické oligomerní obalové proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být dále definovány následujícími vzorci (El)_x(E2)_y, kde x může být číslo mezi 0 a 100, a y může být číslo mezi 0 a 100, za předpokladu, že x a y nejsou oba 0. Jestliže x=l a y=0, pak řečené obalové proteiny představují monomerní El.

Výraz „homo-oligomer tak, jak je zde použit se týká komplexního El nebo E2, obsahujícího více než jeden monomer El nebo E2, například El/El dimery, El/El/El trimery nebo E1/E1/E1/E1 tetramery a E2/E2 dimery, E2/E2/E2 trimery nebo • · • · · · . ; ;.......

: i ...... ·: : ··;·

·.. .. .......

E2/E2/E2/E2 tetramery, El pentamery a hexamery, E2 pentamery a hexamery, nebo jakékoliv vyšší homo-oligomery El nebo E2 jsou „homo-oligomery spadající do rozsahu definice. Oligomery mohou obsahovat jeden, dva nebo více odlišných monomerů El nebo E2, získaných z odlišných typů nebo subtypů viru hepatitidy C, včetně například těch, které byly popsány v Maertens et al. ve W094/25601 a ve W096/13590, tj . v přihláškách vynálezu, které jsou od shodných přihlašovatelů, jako je předkládaný vynález.

Takové smísené oligomery jsou pořád homo-oligomery spadající do rozsahu tohoto vynálezu a mohou umožnit univerzální diagnostiku, profylaxi nebo léčbu HCV.

Antigeny El a E2 , použité v předkládaném vynálezu, mohou být virové proteiny o úplné délce, jejich verze v podstatě o úplné délce, nebo jejich funkční fragmenty (například fragmenty obsahující alespoň jeden epitop a/nebo glykosylační místo). Kromě toho, antigeny HCV podle předkládaného vynálezu rovněž zahrnují další sekvence , které neblokují nebo nebrání tvorbě konformačního epitopu, který je předmětem zájmu. Přítomnost nebo nepřítomnost konformačního epitopu může být snadno stanovena pomocí screeningu předmětného antigenu s protilátkou (polyklonální sérová nebo monoklonální proti konformačnímu epitopu) a z porovnání reaktivity s reaktivitou denaturované verze antigenu, kterou si uchovávají pouze lineární epitopy (pokud vůbec nějakou mají). Ve screeningu, ve kterém jsou použity polyklonální protilátky, může být výhodné adsorbovat polyklonální sérum nejprve s denaturovaným antigenem a pozorovat, zda sérum obsahuje protilátky k antigenu, který je předmětem zájmu.

• · • · • · · ·· ··

Proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být glykosylovány. Glykosylovanými proteiny jsou míněny proteiny, které obsahují jednu nebo více uhlovodanových skupin, konkrétně zbytků cukrů. Všechny eukaryontní buňky jsou obecně schopny glykosylovat proteiny. Z porovnání sekvencí obalových proteinů odlišných genotypů HCV je možné odvodit, že nikoliv všech 6 glykosylačních míst v proteinu HCV El je nezbytných pro řádné skládání a reaktivitu proteinu. Dále je známo, že glykosylační místo v pozici 325 není N-glykosylací modifikováno (Fournillier-Jacob et al. 1996, Meunier et al. 1999). Kromě toho, subtyp proteinu lb El obsahuje 6 glykosylačních míst, avšak některá z těchto glykosylačních míst nejsou-v určitých jiných (sub)typech přítomna. Čtvrtý uhlovodanový motiv (na Asn250), který je přítomen u typů lb, 6a, 7, 8, a 9 chybí ve všech dalších dnes známých typech. Tento adiční cukerný motiv může být mutován za poskytnutí proteinu typu lb El, který má zlepšenou reaktivitu. Sekvence typu 2b také vykazují další glykosylační místo v oblasti V5 (na Asn299). Izolát S83, který náleží ke genotypu 2c, dokonce postrádá první uhlovodanový motiv v oblasti VI (na Asn), zatímco tento motiv je přítomen u všech dalších izolátů (Stuyver et a,l., 1994). Nicméně, i u kompletně konzervovaných adičních cukerných motivů nemusí být přítomnost uhlovodanů pro skládání požadována, ale může hrát roli v úniku před imunitním dozorem. Z tohoto důvodů může být identifikace role glykosylace dále testována mutagenezí motivů glykosylace. Mutageneze motivu glykosylace (NXS nebo NXT sekvencí) může být dosaženo buďto mutací v kodónech pro N,

S, nebo T takovým způsobem, že tyto kodóny kódují aminokyseliny odlišné od N v případě N, a/nebo aminokyseliny odlišné od S nebo T, v případě S a v případě

T. Nebo může být pozice X mutována na P, neboť je známo, že

• φ · · • · · · »··· • · · · ·· ·

NPS nebo NPT nejsou často modifikovány s uhlovodany. Po stanovení toho, které uhlovodanové adiční motivy jsou nezbytné pro skládání a/nebo reaktivitu proteinu, a které nikoliv, mohou být provedeny kombinace takových mutací. Takové pokusy byly popsány v Maertens et al. v Příkladu 8 ve W096/04385, který je zde zahrnut formou konkrétního odkazu.

Výraz glykosylace, použitý v předkládaném vynálezu, se týká N-glykosylace, pokud není specifikováno jinak.

Konkrétně se předkládaný vynález týká obalových proteinů HCV, nebo jejich částí, které jsou glykosylovány s jádrem glykosylace („core-glyčosylated). V tomto smyslu výraz „glykosylovány s jádrem glykosylace se týká struktury „podobné struktuře, která je zobrazena na obrázku 3 s vyznačenými rámečky v práci Herscovics and Orlean (1993). Uváděná struktura cukru obsahuje 10 až 11 monosacharidů. Zejména je důležité poznamenat, že uvedená práce je zde zahrnuta formou odkazu. Výraz „podobný znamená, že ne více než 4 další monosacharidy mohou být přidány ke struktuře, nebo, že ne více než přibližně 3 monosacharidy byly ze struktury odstraněny. Proto uhlovodanová struktura glykosylačního jádra podle vynálezu obsahuje minimálně 7 a maximálně 15 monosacharidů a může obsahovat 8, 9, 10, 11, 12, 13 nebo 14 monosacharidů. Jako monosacharidy jsou míněny zejména glukóza, manóza nebo Nacetylglukosamin.

Podle dalšího aspektu se předkládaný vynález týká izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu, který obsahuje alespoň jedno N-glykosylační místo, přičemž uvedený protein nebo fragment je charakterizován tím, že je

4

4 · · <4 · 4444

4 4 ·

···· • · · • · · • · · • · · · ·· ·* · · • · · · · • 4 · · · • · · ·

44 produktem exprese v eukaryontní buňce a dále je charakterizován tím, že více než 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64

O. O Z	65	O, o r	66	O. ° f	67	O. θ z	68 %,	69 %,	70 %,	71	O. O z	72 %,	73 %,	74
O. o t	75	o, O r	76	Q, o r	77	o. z	78 %,	79 %,	80 %,	81	O. ° Z	82 %,	83 %,	84
o, O t	85	o. o r	86	o. O z	87	o O z	88 %,	89 %,	90 %,	91	O, O Z	92 %,	93 %,	94

% nebo 95 % glykosylačních míst je glykosylováno s oligomanózou definovanou jako Man(8 až 10)-GlcNAc(2). Konkrétněji, k výše uvedeným glykosylačním charakteristikám je další charakteristikou poměr mezi počtem míst glykosylovaných s jádrem glykosylace s oligomanózou o struktuře Man(7)-GlcNAc(2) a počtem míst glykosylovaných s jádrem glykosylace s oligomanózou o struktuře Man (8)GlcNAc(2), který je menší než nebo roven 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, nebo 0,50. Další specifičtější charakteristikou k výše uvedeným Nglykosylačním charakteristikám je , že uvedené oligomanózy obsahují méně než 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, nebo 5 % terminální a 1,3 manózy.

Další alternativní aspekt vynálezu se týká izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu, který obsahuje alespoň jedno N-glykosylační místo, přičemž uvedený protein nebo fragment je produktem exprese v eukaryontní buňce a je dále charakterizován tím ,že N-glykosylační místa jsou obsazena oligomanózami, kde poměr oligomanóz se strukturou Man(7)-GlcNAc(2) k oligomanózám se strukturou Man (8)GlcNAc(2) je menší než nebo roven 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, nebo 0,50. Další konkrétnější charakteristikou k výše uvedeným charakteristikám je, že uvedené oligomanózy obsahují méně než 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %,9 %, 8 %, 7 %, %, nebo 5 % terminální a 1,3 manózy.

• · · • · · · • · · • ··· • · • · · ·

Podle dalšího alternativního aspektu se předkládaný vynález týká izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu, který obsahuje alespoň jedno N-glykosylační místo, přičemž uvedený protein nebo fragment je charakterizován tím, že je produktem exprese v eukaryontní buňce a nikoliv savčí savčí buňky, a dále charakterizován tím, že počet N-glykosylačních míst je alespoň o 5 %, 6 %, %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, nebo 15 % menší, než je počet N-glykosylačních míst ve shodném proteinu nebo jeho fragmentu, který byl exprimován v eukaryontní buňce vystavené infekci viru vaccinia. Konkrétněji, vedle výše uvedených N-glykosylačních charakteristik je až 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %,71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, nebo 80 % uvedených N-glykosylačních míst glykosylováno s jádrem glykosylace. Konkrétněji, více

než 60 %,61	o O r	62	O. O t	63	O. O z	64
%, 70 %, 71	O. ° f	72	0. 0 z	73	g. o z	74
%, 80 %, 81	O O f	82	%,	83	o -s f	84
%, 90 %, 91	O. O !	92	O. ° Z	93	Q, ° z	94

o ° Z	65	O. ° z	66	O. ° z	67	o. θ z	68	Q. ° Z	69
O. θ z	75	0, θ z	76	0, O z	77	0 O z	78	O ° Z	79
o, ⁰ Z	85	O. ⁰ Z	86	o. ° z	87	O, ⁰ Z	88	O, O Z	89

% nebo 95 % N-glykosylačních míst je glykosylováno s oligomanózou o struktuře definované jako Man(8 až 10)GlcNAc(2). Ještě více konkrétně, k jakékoliv z výše uvedených N-glykosylačních charakteristik přistupuje další, tj. že poměr počtu míst glykosylovaných s jádrem glykosylace s oligomanózou o struktuře Man(7)-GlcNAc(2) k počtu míst glykosylovaných s jádrem glykosylace s oligomanózou o struktuře Man(8)GlcNAc(2) je menší než nebo roven 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, nebo 0,50. Další, konkrétnější charakteristikou k jakékoliv z výše uvedených Nglykosylačních charakteristik, je že uvedené oligomanózy • · • · • · · • · · · · ·· · obsahují méně než 20 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, terminální α 1,3 manózy.

%,18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 9%, 8%, 7%, 6%, nebo 5 %

Podle dalšího aspektu vynálezu je izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu produktem exprese v buňce kvasinky. Konkrétněji, izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu je produktem exprese v buňce kmenů Saccharomyces, jako je Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, nebo Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces, jako je Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, jako je Kluyveromyces lactis, Yarrowia, jako je Yarrowia lipolytica, Hansenula, jako je Hansenula polymorpha, Pichia, jako je Pichia pastoris, Aspergillus species, Neurospora, jako je Neurospora crassa, nebo Schwanniomyces, jako je Schwanniomyces occidentalis, nebo mutantní buňka odvozená z kteréhokoliv výše uvedených kmenů. Konkrétněji, izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu je produktem exprese v buňce Hansenula. Ještě více specificky, izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu je produktem exprese v buňce kvasinky, například rodu Hansenula, v nepřítomnosti glykosylačních inhibitorů, jako je tunicamycin.

Podle dalšího aspektu vynálezu je izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu získán z proteinu, který obsahuje vedoucí peptid opičího lysozymu nebo jeho funkční variantu, připojený k řečenému obalovému proteinu HCV nebo jeho fragmentu. Konkrétněji, izolovaný obalový protein nebo jeho část podle vynálezu je získán z proteinu, který je charakterizovaný strukturou vzorce

CL-HCVENV-[ (A3)_d-(PS2)e-(A4)_f] , • · • · · · · · · · · • · « ····· ···· • · ··· · · ··· ····· kde:

CL vedoucí peptid opičího lysozymu nebo jeho funkční ekvivalent,

Al, A2, A3 a A4 jsou adaptorové peptidy , které mohou být odlišné nebo shodné,

PSI a PS2 jsou místa úpravy, která mohou být odlišná nebo shodná,

HCVENV je obalový protein HCV nebo jeho část, a, b, c, d, e a f je 0 nebo 1, a kde jsou případně Al a/nebo A2 částí PSI, a/nebo kde

A3 a/nebo A4 jsou částí PS2.

„Opičím vedoucím peptidem nebo jeho částí, připojeným k obalovému proteinu HCV nebo jeho části je míněno, že Ckoncová aminokyselina uvedeného vedoucího peptidu je kovalentně připojena prostřednictvím peptidové vazby k Nkoncové aminokyselině uvedeného obalového proteinu HCV nebo k jeho části. V alternativním provedení je C-koncová aminokyselina uvedeného vedoucího peptidu oddělena od Nkoncové aminokyseliny obalového proteinu HCV nebo jeho části peptidem nebo proteinem. Uvedený peptid nebo protein může mít strukturu CL-HCVENV- [ (A3) _d- (PS2 ) _e- (A4 ) _f] tak, jak je definována výše.

Odvození obalového proteinu HCV, který je předmětem zájmu, z proteinu obsahujícího vedoucí peptid opičího lysozymu nebo. jeho funkční ekvivalent připojený k obalovému proteinu HCV nebo k jeho části, nebo z proteinu charakterizovaném strukturou CL-HCVENV-[ (A3)_d-(PS2)_e-(A4 ) _f] může být provedeno in vivo proteolytickým štěpením v buňkách, ve kterých je tento pre-protein exprimován. Konkrétněji, stupeň odstranění opičího vedoucího peptidu je • · · · • · · · · · · · · · · · • · ··· · · ··· · ···· ···· ···· · · · • · ·· ·· · · · · · výhodně prováděn in vivo proteolytickým aparátem buněk, ve kterých je pre-protein exprimován. Nicméně, odvození může být také provedeno pouze in vitro po a/nebo během izolace a/nebo purifikace pre-proteinu, a/nebo proteinu z buněk exprimujících pre-protein, a/nebo z kultivační kapaliny, ve které byly pěstovány buňky exprimující pre-protein. Alternativně je uvedené odvození in vivo prováděno kombinací s uvedeným získáním in vitro. Odvození proteinu HCV, který je předmětem zájmu, z rekombinantně exprimovaného pre-proteinu může dále zahrnovat použití proteolytického enzymu (proteolytických enzymů) v čistícím stupni, kde všechny nebo většina kontaminujících proteinů, jež jsou společně přítomny s proteinem, který je předmětem zájmu, je degradována, a kde protein zájmu je rezistentní k čištění s proteolytickým enzymem (proteolytickými enzymy). Odvození a čištění nejsou vzájemně se vylučující procesy a může jich být dosaženo s použitím jediného proteolytického enzymu. Jako příklad se zde uvádí protein HCV Els genotypu HCV lb (SEQ ID NO: 2), který postrádá zbytky Lys. Při štěpení proteinového extraktu, který obsahuje uvedené El proteiny HCV, s endoproteázou Lys-C (endo-Lys), nejsou proteiny El degradovány, zatímco kontaminující proteiny obsahující jeden nebo více zbytků Lys jsou degradovány. Takový proces může významně zjednodušit izolaci/nebo nebo zvýšit účinnost purifikace proteinů HCV El. Kromě toho lze dosáhnout další výhodné možnosti správného in vitro oddělení vedoucího peptidu z HCV El pre-proteinu tím, že je zaveden další zbytek lysinu, například mezi vedoucí peptid a protein HCV El.

Jiné proteiny HCV El mohou obsahovat zbytek Lys v jedné, nebo ve více z pozic 4, 40, 42, 44, 61, 65 nebo 179 (kde pozicí 1 je první N-koncová přirozená aminokyselina proteinu El, tj. pozice 192 v polyproteinu HCV). Aby bylo • · · umožněno použití endo-lys C tak, jak je popsáno výše, mohou uvedené zbytky Lys být mutovány na jiné aminokyselinové zbytky, výhodně na zbytek Arg.

„Správně odstraněným vedoucím peptidem je míněno, že uvedený vedoucí peptid je z proteinu, obsahujícího signální sekvenci připojenou k proteinu zájmu, odstraněn s vysokou účinností, tj. velké množství pre-(pro-)proteinů je přeměněno na (pro-)proteiny, a s vysokou fidelitou, tj. že pouze pre-aminokyselinová sekvence je odstraněna a není odstraněna žádná z aminokyselin proteinu, který je předmětem zájmu a je připojen k uvedené pre-aminokyselinové sekvenci. „Odstraněním vedoucího peptidu s vysokou účinností je míněno, že alespoň přibližně 40 %, výhodněji přibližně 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % nebo dokonce 99 % pre-proteinů je přeměněno na protein, ze kterého je pre-sekvence odstraňována. Alternativně, jestliže část exprimovaných pre-proteinů není přeměněna na protein, ze kterého je presekvence odstraňována, tyto pre-proteiny mohou i tak být purifíkovány nebo mohou být odstraněny během purifikace.

Výrazem „funkční ekvivalent vedoucího peptidu opičího lysozymu (CL) je míněn vedoucí peptid CL, ve kterém jedna nebo více aminokyselin byla substituována za jinou aminokyselinu, přičemž uvedená substituce je konzervativní aminokyselinovou substitucí. Výrazem „konzervativní aminokyselinová substituce je míněna substituce aminokyselin příslušejících ke skupině konzervovaných aminokyselin za jinou aminokyselinu, která přísluší do stejné skupiny konzerovovaných aminokyselin. Skupinami konzervovaných aminokyselin jsou míněny: skupina sestávající z Met, Ile, Leu a Val; skupina sestávající z • · • « • · · · · · · · ·

9 9 · · · · · · 9 9 · • · ··· ·· «·· 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 9

Arg, Lys a His; skupina sestávající z Phe, Trp a Tyr; skupina sestávající z Asp a Glu; skupina sestávající z Asn a Gin; skupina sestávající z Cys, Ser a Thr; a skupina sestávající z Ala a Gly. Příkladnou konzervativní aminokyselinovou substitucí ve vedoucím peptidu CL je přirozená variace v pozici 6, kde aminokyselinou v této pozici je buďto Val nebo Ile; další variace se objevuje v pozici 17, kde aminokyselinou v této pozici, mimo jiné, je Leu nebo Pro (viz SEQ ID NO:1). Rezultující vedoucí peptidy CL jsou tak považovány za funkční ekvivalenty. Jiné funkční ekvivalenty vedoucích peptidů CL zahrnují ty vedoucí peptidy, které vykazují shodné technické vlastnosti, jako mají vedoucí peptidy CL, tak, jak se popisují v předkládaném vynálezu, včetně delečních a inzerčních variant.

Označením „A nebo „adaptorový peptid je míněn peptid (například o 1 až 30 aminokyselinách), nebo protein, který může sloužit jako linker (spojovník) mezi například vedoucím peptidem a místem úpravy (processing site, PS), vedoucím peptidem a proteinem, který je předmětem zájmu, a PS a proteinem, který je předmětem zájmu, a/nebo proteinem, který je předmětem zájmu, a PS; a/nebo může sloužit jako linker na N- nebo C-konci, například vedoucího peptidu, PS nebo proteinu zájmu. Adaptorový peptid „A může mít určitou trojrozměrnou strukturu, například α-šroubovicovou nebo βlistovou strukturu, nebo jejich kombinaci. Alternativně není trojrozměrná struktura zcela definována, například se jedná strukturu svinuté smyčky „coiled-coil. Adaptor A může být součástí například pre-sekvence, pro-sekvence, proteinu, který je předmětem zájmu, nebo místa úpravy. Adaptor může sloužit jako identifikátorová značka (tag), která zvyšuje nebo umožňuje detekci a/nebo purifikaci • A ···· • · A A A · AAA ·· * A A A A A A A A A • A AAA AA A A A · ···· a/nebo úpravu proteinu, jehož je A součástí. Jedním z příkladů peptidu A je peptid „his-tag (HHHHHH; SEQ ID NO: 63) Hn, kde n je obvykle rovno 6, ale může též být 7,

8, 9, 10, 11, nebo 12. Jiné z příkladů peptidů A zahrnují peptidy EEGEPK (Kjeldsen et al. ve W098/28429; SEQ ID NO:

64) nebo EEAEPK (Kjeldsen et al. ve W097/22706; SEQ ID NO:

65) , o kterých je známo, že jestliže jsou přítomny na Nkonci proteinu zájmu, zvyšují fermentační výtěžek, ale rovněž chrání N-konec proteinu zájmu proti úpravám s dipeptidyl aminopeptidázou, a tak vzniká homogenní Nkonec polypeptidu. Současně může být zrání proteinu zájmu in vitro, například odstranění uvedených peptidů EEGEPK (SEQ ID NO: 64) a EEAEPK (SEQ ID NO: 65) z proteinu zájmu, dosaženo s použitím například endo-lys C, která štěpí Ckonec zbytku Lys v uvedených peptidech. Uvedené peptidy tak mohou sloužit jako adaptorový peptid (A), stejně jako místo úpravy (PS) (viz níže). Adaptorové peptidy jsou popsány v sekvencích SEQ ID NO: 63 až 65, 70 až 72 a 74 až 82.

Jiným příkladem adaptorového peptidu je imunologicky tichý (immunosilent) linker G4S. Jiné příklady adaptorových peptidů nebo adaptorových proteinů jsou uvedeny v Tabulce 2 práce Stevense (Stevens et al. 2000).

Označením „PS nebo „místo úpravy (processing site) je míněno místo specifické úpravy proteinu nebo upravitelné místo. Taková úprava může nastat enzymaticky nebo chemicky. Příklady míst úpravy náchylných ke specifické enzymatické úpravě zahrnují IEGlUx (SEQ ID NO: 66), IDGR^X (SEQ ID NO: 67), AEGR^X (SEQ ID NO: 68), přičemž ve všech je proteázou hovězího faktoru Xa rozpoznáváno a štěpeno místo mezi zbytkem Arg a Xaa (jakákoliv aminokyselina) označená výše jako „i (Nagai, K. and Thogersen, H. C. 1984). Jiným příkladem místa PS je dibazické místo, například Arg-Arg,

9999 • · 9 999 9 9 9

9 9 9 9999 «999 • · 999 99 9 9 9 9 999· • · · · 9999 99 ·

9 · 99 99 99 ·

Lys-Lys, Arg-Lys nebo Lys-Arg, které je štěpitelné s kvasinkovou Kex2 proteázou (Julius, D. et al. 1984). Místem PS může rovněž být monobazické místo Lys. Uvedené monobazické místo Lys (Lys-PS-site) může být také obsaženo na C-konci peptidu A. Příklady adaptorových peptidů A, které obsahují na C-konci monobazické Lys-PS-místo, jsou uvedeny v sekvencích SEQ ID NO: 64 až 65 a 74 až 76. Exoproteolytické odstranění His-tag (HHHHHH; SEQ ID NO: 63) je možné s použitím dipeptidyl aminopeptidázy I (DAPase) samotné, nebo v kombinaci s glutamin cyklotransferázou (glutamine cyclotransferase, Qcyclase) a pyroglutamovou aminopeptidázou (pyroglutamic aminopeptidase, pGAPase) (Pedersen,J. et al. 1999). Uvedené exopeptidázy obsahující rekombinantní značku His-tag (která umožňuje odstranění peptidázy z reakční směsi pomocí afinitní chromatografie na imobilizovaných iontech kovů (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC) jsou komerčně dostupné, například jako TAGZyme System, Unizyme Laboratories (Horsholm, DK). „Úpravou je tak obecně myšlena metoda nebo způsob, při kterém je protein specificky štěpen, nebo je protein štěpitelný v alespoň jednom místě úpravy, přičemž uvedené místo úpravy je přítomno v řečeném proteinu. PS může být náchylné k endoproteolytickému štěpení nebo může být náchylné k exoproteolytickému štěpení, v každém případě je štěpení specifické, například nezasahuje místa, která jsou odlišná od míst rozpoznávaných proteolytickými enzymy účastněnými v úpravě proteinu (processing proteolytíc enzyme). Řada míst PS je uvedena v sekvencích SEQ ID NO: 66 až 68 a 83 až 84.

Všestrannost struktury [(Al/3)_a/d~ (PSl/2)_b/e~ (A2/4)_c/f] tak, jak byla popsána výše, byla prokázána pomocí některých příkladů. V prvním příkladu je uvedená struktura ·· ·· ·· · • · · · · · · · · • · · · · ··· · · · · • · *·· · · ··· · · · · · • · · · ···· ·· · • · «· ·· · · ·· · přítomna na C-terminálním konci proteinu zájmu, který je obsažen v pre-proteinu, a kde A3 je peptid „VIEGR (SEQ ID NO : 69), který se vzájemně přesahuje s PS místem faktoru Xa „IEGRX (SEQ ID NO: 66), a kde X=A4 je značka histidintag (SEQ ID NO: 63) (d, e a f jsou tak v daném případě všechny 1). Protein HCV, který je předmětem zájmu, může být (případně) purifikován s IMAC. Po úpravě s faktorem Xa, ponese protein zájmu HCV (případně purifikovaný) na svém Ckonci místo úpravy PS, kterým je „IEGR (SEQ ID NO: 70). Jinou variantou místa úpravy upravovaného faktorem Xa může být IDGR (SEQ ID NO: 71) nebo AEGR (SEQ ID NO: 72).

V dalším příkladu je struktura [(Al/3)_a/_d- (PSl/2)_b/_e ~ (A2/4)_c/f] přítomna na N-konci proteinu zájmu HCV. Dále, Al je histidin-tag (SEQ ID NO: 63), PS je rozpoznávací místo faktoru Xa (jakákoliv ze sekvencí SEQ ID NO: 66 až 68), přičemž X je protein zájmu, a a=b=l a c=0. Po správném odstranění vedoucího peptidu, například hostitelskou buňkou, může být rezultující protein zájmu HCV purifikován s IMAC (případně). Po úpravě s faktorem Xa, postrádá protein zájmu strukturu [ (Al) _a- (PSl)_b- (A2) _c] ·

Dále je zřejmé, že kterýkoliv z Al, A2, A3, A4, PSI a PS2, jestliže jsou přítomny, pak mohou být přítomny v opakované struktuře. Jestliže jsou přítomny takové opakující se struktury, jsou v tomto kontextu stále počítány jako 1, například a, b, c, d, e, nebo f jsou rovny 1, i když například Al se vyskytuje například jako 2 opakováni (Al-Al).

Další aspekt tohoto vynálezu se týká jakéhokoliv izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu podle vynálezu, ve kterém thiolové skupiny cysteinu jsou chemicky modifikovány.

•4 4444 • 4 4444 44

4 4 4 · ··· 4 ·

4 444 44 444 4

4444 4444 44 4

44 44 44 44 4

Další aspekt tohoto vynálezu se týká jakéhokoliv izolovaného obalového proteinu.HCV nebo jeho fragmentu podle vynálezu, který je antigenní.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká jakéhokoliv izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu podle vynálezu, který je imunogenní.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká jakéhokoliv izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu podle vynálezu, který zahrnuje epitop stimulující T-buňky.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká jakéhokoliv izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu podle vynálezu, který je obsažen ve struktuře vybrané ze skupiny sestávající z monomerů, homodimerů, heterodimerů, homo-oligomerů a hetero-oligomerů.

Další aspekt tohoto vynálezu se týká jakéhokoliv izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu podle vynálezu, který je'obsažen v částici podobné viru.

V obalových proteinech HCV nebo v jejich částech, tak jak jsou zde pospány, jež obsahují alespoň jeden zbytek cysteinu, výhodně však 2 a více zbytků cysteinu, mohou být thiolové skupiny cysteinu ireversibilně chráněny s chemickými nebo enzymatickými prostředky. Konkrétně, „ireversibilní ochrana nebo „ireversibilní blokování s chemickými prostředky se týkají alkylace, výhodně alkylace obalových proteinů HCV s použitím alkylačních činidel, jako jsou například aktivní halogeny, ethylenimin nebo ·· «·«· ·· ·· ·♦ · «· · · · · ··· • · · · · ··« · · · ♦ • · ··· · · ··· ····· • · · · · · · · · · · ·· ·· ·♦ ·· ·· ·

N-(jodethyl)trifluor-acetamid. Z tohoto hlediska je třeba alkylaci thiolových skupin cysteinu chápat jako záměnu vodíku v thiolové skupině skupinou (CH₂)_nR, ve které n je 0, 1, 2, 3 nebo 4 a R = H, COOH, NH₂, CONH₂, fenyl, nebo jakýkoliv jejich derivát. Alkylace může být prováděna jakoukoliv metodou známou v oboru, jako například aktivními halogeny X(CH₂)_nR/ ve kterých X je halogen jako I, Br, Cl nebo F. Příklady aktivních halogenů jsou methyljodid, jodoctová kyselina, jodacetamid a 2-bromethylamin. Jiné způsoby alkylace zahrnují použití NEM (N-ethylmaleimid) nebo Biotin-NEM, jejich směsi, nebo ethyleniminu nebo N-(jodethyl)trifluoroacetamidu, které oba vedou k substituci -H za -CH₂-CH₂-NH2 (Hermanson, G. T. 1996). Výraz „alkylační činidla tak, jak je zde použit, se týká sloučenin, které jsou schopné provádět zde popsanou alkylaci. Takové alkylace vedou k modifikovanému cysteinu, který může napodobovat jiné aminokyseliny. Alkylace s ethyleniminem vede ke struktuře napodobující lysin takovým způsobem, že jsou zaváděna nová štěpící místa pro trypsin (Hermanson, G. T. 1996). Podobně, použití methyljodidu vede k aminokyselině napodobující methionin, zatímco použití jodacetátu a iodacetamidu vede k aminokyselinám napodobujícím kyselinu glutamovou a glutamin, v uvedeném pořadí. Analogicky jsou tyto aminokyseliny výhodně použity v přímé mutaci cysteinu.

Z tohoto důvodu se předkládaný vynález týká obalových proteinů HCV tak, jak jsou zde popsány, ve kterých alespoň jeden zbytek cysteinu v obalových proteinech HCV tak, jak jsou zde popsány, je mutován na přirozenou aminokyselinu, výhodně na methionin, kyselinu glutamovou, glutamin nebo lysin. Termín „mutovaný se týká místně-řízené mutageneze nukleových kyselin kódujících tyto aminokyseliny, tj. velmi dobře známých metod v oboru, jako je například místně9« 9··· 99 99 99 9 • 9 9 999 999

9 9 9 · ··* · 9 9 9

9 999 99 999 99999

99 9 · 9 .9 9 9 9 9

99 99 99 99 9 řízená mutageneze (site-directed mutagenesis) s použitím PCR nebo via mutageneze zprostředkované oligonukleotidy (oligonucleotide-mediated mutagenesis), jak jsou popsány v (Sambrook,J. et al. 1989). Je třeba uvést, že v příkladové části tohoto vynálezu se alkylace týká použití jodacetamidu jako alkylačního činidla, pokud není specifikováno jinak.

Dále je třeba uvést, že v purifikačním postupu mohou být thiolové skupiny cysteinu, obsaženého v proteinech HCV nebo jejich částech podle předkládaného vynálezu, reversibilně chráněny. Účelem reversibilní ochrany je stabilizovat protein HCV nebo jeho část. Zejména, po reversibilní protekci je funkční skupina obsahující síru (například thioly a disulfidy) udržována v nereaktivních podmínkách. Funkční skupina obsahující síru je tak neschopna reagovat s jinými sloučeninami, které tak například ztratily svoji tendenci k tvorbě nebo záměně disulfidových vazeb, jako například

R_X-SH + R₂-SH X---> Ri-S-S-R₂ ;

R_x—S-S—R₂ + R3-SH X---> R_x-S-S“R3 + R₂-SH;

r_x-s-s-r₂ + r₃-s-s-r₄ —x— > r_x-s-s-r₃ + r₂-s-s-r₄.

Popsané reakce mezi thioly a/nebo disulfidovými zbytky nejsou omezeny na intermolekulární procesy, ale mohou se objevovat též intramolekulárně.

Termín „reversibilní ochrana nebo „reversibilní blokování tak, jak je zde použit, předpokládá kovalentní vazbu modifikujících činidel na thiolové skupiny cysteinu, stejně jako úpravu prostředí obklopujícího protein HCV tak, že redoxní stav thiolových skupin cysteinu zůstává během následujících kroků purifikačního postupu nedotčen (stínění). Reversibilní ochrana thiolových skupin cysteinu může být provedena chemicky nebo enzymaticky.

·· ·*<· »9 9« 99 ·

9 ···· »·· • 9 « · · 999 · * · · • 9 · 9 · 99 9·* · 9···

9 9 9 9 9 99 9 9 «

-55.........

Výraz „reversibilní ochrana s enzymatickými prostředky tak, jak je zde použit se týká reversibilní ochrany zprostředkované enzymy, jakými jsou acyltransferázy, např. acyltransferázy, které jsou zúčastněny v katalýze thioesterifikace, jako je palmitoyl acyltransferáza (viz níže).

Termín „reversibilní ochrana s chemickými prostředky tak, jak je zde použit se týká reversibilní ochrany:

1. s modifikačními činidly, které reversibilně modifikují cysteinyly, například sulfonací a thioesterifikácí;

Sulfonace je reakce, ve které thioly nebo cysteiny zúčastněné v disulfidových můstcích jsou modifikovány na S-sulfonát:RSH —> RS-SO3“ (Darbre, A. 1986) nebo na RS-SR -> 2 RS-SO3' (sulfitolýza; (Kumar, N. et al. 1986)). Reagenciemi pro sulfonaci jsou například Na2SO₃, nebo tetrathionát sodný. Druhý z činidel pro sulfonaci je používáno v koncentraci 10 až 200 mM, a výhodněji v koncentraci 50 až 200 mM. Případně může být sulfonace prováděna v přítomnosti katalyzátoru, jakým je například Cu²⁺ (100 μΜ až 1 mM) nebo cystein (1 až 10 mM).

Reakce může být prováděna za podmínek, které denaturují protein, stejně jako za přirozených podmínek (Kumar, N. et al. 1985, Kumar, N. et al.

1986) .

Tvorba thioesterových vazeb, nebo thioesterifikace je charakterizována jako:

RSH + R'COX -» COR', kde ve sloučenině je X je výhodně halogen.

•4 4444 **56*·

4* 44 ·* * • · * »44

4 444 4 4 4 4 « 4 44 4 · · 4 444«

4 4 4 4 4 4 <4 44 4

2. s modifikačními činidly, které reversibilně modifikují cysteinyly podle předloženého vynálezu, jakými jsou například těžké kovy, konkrétně Zn²⁺, Cd²⁺, mono-, dithio- a disulfidové sloučeniny (např.aryl- a alkylmethanthiosulfonát, dithiopyridin, dithiomorfolin, dihydrolipoamid, Ellmann reagens, aldrothiol™ (Aldrich) (Rein, A. et al. 1996), dithiokarbamáty, nebo thiolační činidla (např.glutathion, N-acetyl cystein, cysteinamin). Dithiokarbamát zahrnuje širokou třídu molekul, které mají funkční skupinu RiR₂NC (S) SR3, která jim poskytuje schopnost reagovat se sulfhydrylovými skupinami. Sloučeniny obsahující thiolovou skupinu jsou s výhodou používány v koncentracích 0,1 až 50 mM, výhodněji v koncentracích 1 až 50 mM, a nejvýhodněji v koncentracích 10 až 50 mM;

3. s přítomností modifikačních činidel, která zachovávají stav thiolu (stabilizují ho), konkrétně antioxidační látky, jako jsou například DTT, dihydroaskorbát, vitaminy a deriváty, manitol, aminokyseliny, peptidy a deriváty (např. histidin, ergothionein, carnosin, methionin), galláty, hydroxyanisol, hydoxytoluen, hydrochinon, hydroxymethylfenol a jejich deriváty v rozmezí koncentrací 10 μΜ až 10 mM; výhodněji v koncentraci 1 M až 10 mM;

4. za podmínek stabilizujících thiolové skupiny, jako jsou například (i) kofaktory, jako kovové ionty (Zn²⁺, Mg²⁺) , ATP, (ii) řízení pH (např. pro proteiny ve většině případů pH ~5 nebo je pH výhodně thiol pKa-2;

• · · · · · • · ·· · · · · ··· • · · · · · · · · ··· • · ··· · · ··· ····· ’^7 *’ *··”··· ’*·* ^: např. pro peptidy purifikované chromatografií na reverzní fázi při pH 2).

Kombinace reversibilní ochrany tak, jak je popsána v bodech (1), (2), (3) a (4) může vést k obdobně čistým a znovu poskládaným (refolded) proteinům HCV. V podstatě mohou být použity kombinované sloučeniny, jako například Z103 (Zn carnosin), výhodně v koncentraci 1 až 10 mM. Je třeba uvést, že reversibilní ochrana se mimo modifikace skupin a stínění, popsaných výše, také týká jakékoliv metody ochrany cysteinylu, která může být vrácena zpět enzymaticky nebo chemicky bez narušení páteře peptidu.

V tomto smyslu se předkládaný vynález specificky týká peptidů, připravených klasickou chemickou syntézou (viz výše), ve které například thioesterové vazby jsou štěpeny thioesterázou, za bazických pufrovacích podmínek Beekman, N. J. et al. 1997), nebo působením hydroxylaminu (Vingerhoeds, Μ. H. et al. 1996) .

Proteiny HCV obsahující thiolové skupiny mohou být purifikovány například na pryskyřicích afinitní chromatografie, které jako imobilizovaný ligand obsahují (1) štěpitelné spojovací raménko obsahující disulfidovou vazbu (např. imobilizovaný 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina) (Jayabaskaran, C. et al. 1987) a kovalentní chromatografie na aktivované thiol-Sepharose 4B (Pharmacia)), nebo (2) aminohexanoyl-4-aminofenylarsin. Druhá z afinitních matrix byla použita pro purifikaci proteinů, které jsou předmětem redoxní regulace a dithiolových proteinů, které jsou cíli pro oxidační stres (Kalef ,E. et al. 1993).

• · • ·

9 9 9 9 9 9 • · · · · ··· · • · ··· · · · · ·

Ke zvýšení rozpustnosti a extrakce peptidů může rovněž být použita reversibilní ochrana (Pomroy, N. C. and Deber, C. M. 1998).

Sloučeniny pro reversibilní ochranu a stabilizaci thiolových skupin mohou být v monomerní, polymerní formě, nebo ve formě liposomů.

Odstranění stavu reversibilní ochrany cysteinových zbytků může být dosaženo chemicky nebo enzymaticky s pomocí

- reduktans, konkrétně s DTT, DTE, 2-merkaptoethanolem, dithionitem, SnCl₂, borohydridem sodným, hydroxylaminem, TCEP, a to konkrétně v koncentraci 1 - 200 mM, výhodněji v koncentraci 50 - 200 mM;

- odstranění podmínek stabilizujících thiolové skupiny nebo reagens stabilizujících thiolové skupiny, jako je např. zvýšení pH;

- enzymů, konkrétně thioesteráz, glutaredoxinu, thioredoxinu, konkrétně v koncentraci 0,01 - 5 μΜ, ještě konkrétněji v rozmezí koncentrací 0,1-5 μΜ;

- kombinace výše popsaných chemických a/nebo enzymatických podmínek.

Odstranění stavu reversibilní ochrany cysteinových zbytků může být prováděno in vitro nebo in vivo, například v buňce nebo v živém jedinci.

Je třeba zdůraznit, že v postupu purifikace mohou ríebo nemusí být cysteinové zbytky ireversibilně blokovány, nebo nahrazeny jakýmkoliv reversibilně modifikačním agens tak, jak je popsáno výše.

• ·

‘59

Reduktans podle předkládaného vynálezu je jakékoliv činidlo, které umožní redukci síry ve zbytcích cysteinu, např. „S-S disulfidových můstků, desulfonaci cysteinových zbytků (RS-SO3^- -> RSH). Antioxidantem je jakékoliv činidlo, které chrání thiolový stavu, nebo minimalizuje tvorbu „S-S a/nebo jejich změn. Redukce „S-S disulfidových můstků je chemickou reakcí, při které jsou disulfidy redukovány na thiolové skupiny (-SH). Činidla, která štěpí disulfidově můstky a způsoby tohoto štěpení jsou popsány v Maertens et al. ve WO 96/04385, a jsou v předkládaném popise zahrnuty formou odkazu. Redukce „S-S může být dosaženo s (1) enzymatickou kaskádovou dráhou, nebo s (2) redukčními sloučeninami. Je známo, že enzymy, jako jsou thioredoxin a glutaredoxin, jsou zúčastněny v redukci disulfidů in vivo,a rovněž bylo prokázáno, že jsou účinné v redukci můstků „SS in vitro. Disulfidově můstky jsou rychle štěpeny s redukovaným thioredoxinem při pH 7,0, s rychlostí druhého řádu, která je přibližně 10⁴krát vyšší, než je odpovídající rychlostní konstanta s DTT. Kinetika redukce může být dramaticky zvýšena preinkubací proteinového roztoku s 1 mM DTT nebo dihydrolipoamidu (Holmgren, A. 197 9) . Thiolovými sloučeninami, které jsou schopny redukovat disulfidově můstky, jsou například dithiothreitol (DTT), dithioerythritol (DTE), β-merkaptoethanol, thiokarbamáty, bis(2-merkaptoethyl)sulfon a Ν,N'-bis(merkaptoacetyl)hydrazin, a dithionit sodný. Rovněž mohou být pro redukci proteinů HCV použita redukční činidla bez thiolových skupin, jako je askorbát nebo chlorid ciničitý (SnCl₂) , o kterých bylo prokázáno, že jsou velice vhodné pro redukci disulfidových můstků v monoklonálních protilátkách (Thakur, M. L. et al. 1991). Kromě toho mohou změny v hodnotách pH ovlivňovat redoxní stav proteinů HCV. Bylo prokázáno, že působení borohydridu sodného je účinné pro redukci • · • · ···· φφφ ·· · · φ · · φ ···· • · ··· · · φ φ · · · · · · β · · · · · · · · · * ·· ·· ·· · · < · φ disulfidových můstků v peptidech (Gailit, J. 1993). Tris (2-karboxyethyl) fosfin (TCEP) je schopen redukovat disulfidy při nízkém pH (Burns, J. et al. 1991). Selenol katalyzuje redukci disulfidu na thioly, jestliže je DTT nebo borohydrid sodný použit jako reduktans. Selenocysteamin, komerčně dostupný diselenid, byl použit jako prekursor katalyzátoru (Singh, R. and Kats, L. 1995).

Výraz „imunogenní se týká schopnosti proteinu nebo látky vyvolat imunitní odpověď. Imunitní odpovědí je celková odpověď těla na zavedení antigenu, která zahrnuje tvorbu protilátek, buněčnou imunitu, přecitlivělost (hypersensitivitu), nebo imunologickou toleranci. Buněčná imunita se týká odpovědi T-pomocných buněk a/nebo CTLodpovědi.

Výraz „antigenní se týká schopnosti proteinu nebo látky způsobit tvorbu protilátky nebo vyvolat buněčnou odpověď.

Výraz epitop stimulující T-buňky podle předkládaného vynálezu se týká epitopu schopného stimulovat T-buňky nebo CTL-buňky, v uvedeném pořadí. Epitop stimulující T-pomocné buňky může být vybrán na základě monitorování lymfoproliferativní odpovědi k polypeptidům obsahujícím ve své aminokyselinové sekvenci (domnělý) epitop stimulující T-buňky. Uvedená lymfoproliferativní odpověď může být měřena zkouškou „T-helper assay, která zahrnuje stimulaci in vitro mononukleárních buněk periferní krve (peripheral blood mononuclear cells, PMBCs) ze sér pacientů s různými koncentracemi peptidů, jež jsou testovány na aktivitu stimulace T-buněk, a stanovením množství příjmu radioaktivně značeného thymidinu. CTL-stimulující epitop • · • · • · φ · · φ φ · · • · · · φφφφ φ · · · φ φ φφφ φφ φφφ φ φφφφ může být vybrán pomocí zkoušky CTL (cytotoxic T-cell assay), ve které se měří lytická aktivita cytotoxických buněk s použitím uvolňování ⁵¹Cr. Proliferace je hodnocena jako pozitivní, jestliže index stimulace (průměr cpm kultur stimulovaných antigenem/průměr cpm kontrolních kultur) (cpm - impuls per minuta) je větší než 1, výhodně vyšší než 2, nejvýhodněji pak větší než 3.

Další aspekt vynálezu se pak týká kompozice obsahující izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment podle vynálezu. Uvedená kompozice může dále obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič a může být léčivem nebo vakcínou.

Další aspekt vynálezu zahrnuje léčivo nebo vakcínu obsahující obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu.

Ještě další aspekt vynálezu zahrnuje farmaceutickou kompozici pro indukci imunitní odpovědi specifické k HCV u savce, která obsahuje účinné množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu a případně farmaceuticky přijatelné adjuvans. Farmaceutická kompozice zahrnující účinné množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu může být také schopna indukovat HCVspecifické protilátky u savce, nebo je schopna indukovat fuknci T-buněk u savce. Farmaceutická kompozice zahrnující účinné množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu může být profylaktickou kompozicí nebo terapeutickou kompozicí. V konkrétním provedení je uvedeným savcem člověk.

• 9 99·· • 9 9 · 9 9 9 9 99 9

99 99 99 9· ·

Výraz „savec je třeba chápat jako příslušníka třídy vyšší obratlovci. Savci, včetně člověka, jsou charakterizováni rozením živých mláďat, osrstěním těla, mléčnými žlázami u samic, které sekretují mléko pro výživu mláďat. Savci tak také zahrnují primáty jiné, než je člověk, a myši (Zauberman et al. 1999).

„Vakcínou nebo „léčivem je kompozice schopná vyvolat ochranu proti onemocnění, ať už částečnou nebo úplnou, jakož i proti akutnímu nebo chronickému onemocnění; v tomto případě je vakcína nebo léčivo profylaktickou vakcínou nebo profylaktickým léčivem. Vakcína nebo léčivo mohou být také vhodné pro léčbu již nemocných jedinců, v tomto případě jsou nazývány léčebnou vakcínou nebo léčivem. Podobně může být farmaceutická kompozice použita buďto pro profylaktické a/nebo terapeutické účely, v tomto případě se jedná o profylaktickou a/nebo terapeutickou kompozici, v uvedeném pořadí.

Obalové proteiny HCV podle předkládaného vynálezu mohu být použity jako takové, v biotinylované formě (jak je vysvětleno ve WO 93/18054) a/nebo komplexované s Neutralitě Avidin (Molecular Probes lne., Eugene, OR, USA), avidinem nebo streptavidinem. Rovněž je třeba uvést, že „vakcína nebo „léčivo mohou kromě účinné látky obsahovat „farmaceuticky přijatelný nosič nebo „farmaceuticky přijatelné adjuvans, kterým může být vhodný excipient, ředidlo, nosič a/nebo adjuvans, které samy o sobě neindukují tvorbu protilátek škodlivých pro jedince, jemuž byla kompozice podávána, ani nevyvolávají ochranu.

Typickými vhodnými nosiči typicky obrovské pomalu metabolizované makromolekuly, jako například proteiny, polysacharidy, poly-mléčné kyseliny, poly-glykolové • · 4

44 ·· · · 4 4 4

4444 4 444

444 44444

4444 4444 44 4

44 44 44 44 4 kyseliny, poly-aminokyseliny, aminokyselinové kopolymery a inaktivní virové částice. Odborníkům v oboru jsou takové nosiče velmi dobře známy. Výhodná adjuvans pro zvýšení účinnosti kompozice zahrnují, bez omezení: hydoxid hlinitý, aluminium v kombinaci s 3-0-deacylovaným monofosforyl lipidem A tak, jak se popisuje ve WO 93/19780, aluminium fosfát tak, jak byl popsán ve WO 93/24148, N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamin tak, jak byl popsán v U.S. patentu č. 4 606 918, N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-Disoglutamin, N-acetylmuramyl-L-alanyl-isoglutamyl-Lalanine-2-(1'2'dipalmitoyl-sn-glycero-3hydroxyfosforyloxy)ethylamin, RIBI (ImmunoChem Research lne., Hamilton, MT, USA), který obsahuje monofosforyl lipid A, detoxifikovaný endotoxin, trehalosa-6,6-dimykolát, a skelet buněčných stěn (MPL + TDM + CWS) v emulsi 2% skvalen/Tween 80. Jakákoliv ze tří složek MPL, TDM nebo CWS může také být použita samostatně nebo v kombinaci s druhou složkou. MPL může také být zaměněna svým syntetickým analogem, který je označován jako RC-529. Kromě toho mohou být použity adjuvans, jako například Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA), SAF-1 (Syntex) nebo adjuvans na bázi bakteriální DNA, jako je ISS (Dynavax) nebo CpG (Coley Pharmaceuticals), stejně jako adjuvans, kterými jsou například kombinace mezi QS21 a 3-0deacetylovaným monofosforyl lipidem A (W094/00153), nebo MF-59 (Chiron), adjuvans na bázi póly[di(karboxylátfenoxy)fosfazenu] (Virus Research

Institute), nebo adjuvans na bázi blokových polymerů, jako je Optivax (VaxcEl, Cythx), nebo adjuvans na bázi inulinu, jako je Algammulin a Gammalnulin (Anutech), neúplné Freundovo adjuvans (Incomplete Freunďs Adjuvant, IFA) nebo přípravky Gerbu (Gerbu Biotechnik). Je třeba uvést, že neúplné Freundovo adjuvans (CFA) může stejně dobře být ···· ·· ·· ·· · ·· · 4 · 4 «··

4 4 4 4 444 4 4 4 4

4 444 44 4·4 44444 4444 4444 44 4

4444 44 44 44 · použito pro aplikace mimo člověka a pro výzkumné účely. „Kompozice vakcíny může dále obsahovat excipienty a ředidla, které jsou ve své podstatě netoxické a neterapeutické, jakými jsou například voda, fyziologický roztok, glycerol, ethanol, zvlhčující emulsifikační látky, látky pufrující pH, konzervační látky, a podobně. Typicky jsou vakcíny připravovány v injektovatelné formě buďto jako kapalné roztoky, nebo jako suspenze. Injekce mohou být subkutánní, intramuskulární, intravenózní, intraperitoneální, intrathekální, intradermální. Jiné způsoby podání zahrnují implantaci, čípky, orální polknutí, enterickou aplikaci, inhalaci, aerosoly nebo nosní sprej, nebo kapky. Rovněž mohou být připraveny pevné formy vhodné pro přípravu roztoků nebo suspenzí v kapalných nosičích před vlastní injekční aplikací. Přípravek může být také emulsifikován nebo uzavřen do liposomů pro zvýšení adjuvantního účinku. Polypeptidy mohou také být včleněny do „Immune Stimulating Complexes společně se saponiny, například s Quil A (ISCOMS). Kompozice vakcín obsahují účinné množství aktivní látky, stejně jako jakoukoliv z výše uvedených složek. „Účinné množství aktivní látky znamená, že podání tohoto množství jedinci buďto v jednotlivé dávce, nebo jako součásti řady podání, je účinné pro zabránění nebo léčbu onemocnění, nebo pro vyvolání požadovaného účinku. Toto množství je proměnlivé v závislosti na zdraví a fyzické kondici jedince, který má být ošetřen, v závislosti na taxonomické skupině jedinců, kteří mají být ošetřeni (např. člověk, primáti mimo člověka, primáti atd.), v závislosti na kapacitě imunitního systému jedince k dosažení imunitní odpovědi, na stupni požadované ochrany, na složení vakcíny, posouzení ošetřujícího lékaře, kmenu infekčního patogenu a jiných relevantních faktorech. Předpokládá se, že toto účinné ·* · · • · · · · · ··« • · * · · ··· · ♦ · · • · · · · ·« ··· · ···· • · · · ···· ·· · •· ·· · · · · ·· * množství bude spadat do relativně širokého rozmezí, které může být stanoveno na základě rutinních pokusů. Zpravidla, se účinné množství mění od 0,01 do 1000 pg/dávka, konkrétněji od 0,1 do 100 pg/dávka. Dávkovači režim může být režimem jednotlivých dávek, nebo režimem opakovaných dávek. Vakcína může být podávána ve spojení s dalšími imunoregulačními agens.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu.

Způsob přípravy izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu zahrnuje například transformaci hostitelské buňky s rekombinantní nukleovou kyselinou nebo s vektorem, který obsahuje otevřený čtecí rámec kódující uvedený obalový protein HCV nebo jeho část, přičemž hostitelská buňka je schopna exprimovat uvedený obalový protein HCV nebo jeho část. Způsob dále zahrnuje kultivaci hostitelských buněk ve vhodném médiu tak, aby bylo dosaženo exprese uvedeného proteinu, izolaci exprimovaného proteinu z kultury hostitelských buněk, nebo izolaci z vlastních hostitelských buněk. Postup izolace může zahrnovat jeden nebo více z kroků (i) lyže hostitelských buněk v přítomnosti chaotropního agens, (ii) chemické modifikace thiolových skupin cysteinu v izolovaných proteinech, přičemž uvedené chemické modifikace mohou být reversibilní nebo ireversibilní a (iii) heparinové afinitní chromatografie.

Příkladnými „chaotropními činidly jsou guanidinium chlorid a močovina. Obecně je chaotropním agens chemická látka, která může rušit strukturu vazeb vodíku ve vodě.

• « ·* « · • ··· • ·

V koncentrovaných roztocích mohou tato činidla denaturovat proteiny, neboť snižují hydrofobní účinek.

Výrazem „rekombinantní nukleová kyselina je míněna nukleová kyselina přirozeného nebo syntetického původu, která byla podrobena alespoň jedné úpravě technikou rekombinace DNA, jako je štěpení restrikčním enzymem, PCR, ligace, defosforylace, fosforylace, mutageneze, úpravy kodónů pro expresi v heterologní buňce atd. Obecně je rekombinantní nukleovou kyselinou přirozeně se vyskytující fragment nukleové kyseliny, nebo rekombinantní nukleová kyselina obsahuje alespoň dva fragmenty nukleové kyseliny vzájemně propojené, nebo se jedná o plně syntetickou nukleovou kyselinu.

Jestliže jsou použity výrazy „polynukleotid, „polynukleová kyselina „sekvence nukleové kyseliny, „nukleotidová sekvence, „molekula nukleové kyseliny, „oligonukleotid, „sonda nebo „primer, týkají se nukleotidů, buďto ribonukleotidů, deoxyribonukleotidů, nebo peptidových nukleotidů nebo uzamčených (locked) nukleotidů, nebo jejich kombinací, v polymerní formě o jakékoliv délce nebo tvaru (např. rozvětvená DNA). Uvedené termíny dále zahrnují dvouřetězcové (double-stranded, ds) a jednořetězcové (single stranded, ss) polynukleotidy, stejně jako troj řetězcové polynukleotidy. Rovněž zahrnují známé modifikace nukleotidů, jako je methylace, cyklizace, a vytváření čepiček („caps) a substituce jednoho nebo více přirozeně se vyskytujícího nukleotidu za analog, jakým je například inosin, nebo modifikace s neamplifikovatelnými monomery, jako je například HEG (hexaethylen glykol). Ribonukleotidy jsou označovány jako NTPs, deoxyribonukleotidy jako dNTPs a dideoxyribonukleotidy jako ddNTPs.

·««· 99 ·· ·· · • 9 · · · · · » 9

9 9 99 999 9 999

9 999 99 999 99999

99 99 99

Nukleotidy mohou být obecně značeny radioaktivně, chemiluminiscenčně, fluorescenčně, fosforescenčně nebo s infračervenými barvivý, nebo s povrchem-zesílenou Ramanovou značkou nebo plasmonovou resonanční částicí (plasmon resonant particle, PRP) .

Uvedené termíny „polynukleotid, „polynukleová kyselina „sekvence nukleové kyseliny, nukleotidová sekvence, „molekula nukleové kyseliny, „oligonukleotid, „sonda nebo „primer rovněž zahrnují peptidové nukleové kyseliny (peptide nucleic acids, PNAs), DNA analogy, ve kterých je páteří pseudopeptid, sestávající spíše z N-(2aminoethyl)-glycinových jednotek než z cukru. PNAs napodobují chování DNA a vážou komplementární řetězce nukleových kyselin. Neutrální páteř PNA vede k silnější vazbě a k větší specifičnosti, než jaké je běžně dosahováno. Kromě toho byly jedinečné chemické, fyzikální a biologické vlastnosti PNA využity pro přípravu mocných biomolekulárních prostředků, antisense a antigenních agens, molekulárních sond a biosensorů. PNA sondy mohou obecně být' kratší než sondy DNA a obecně mají délku od 6 do 20 baží, výhodněji pak od 12 do 18 baží (Nielsen, Ρ. E. 2001) .

Uvedené termíny dále zahrnují uzamčené nukleové kyseliny (locked nucleic acids ,LNAs), kterými jsou deriváty RNA, v nichž je ribózový kruh fixován methylenovou vazbou mezi 2'-kyslíkem a 4'-uhlíkem. LNAs vykazují mimořádnou vazebnou afinitu k cílovým sekvencím DNA nebo RNA. Nukleotidy LNA mohou být oligomerizovány a mohou být včleněny do chimérických nebo smíšeně-chimérických molekul LNA/DNA nebo LNA/RNA. Jeví se, že LNAs nejsou toxické pro kultivované

4·44 •4 ·· 44 · «4 4 444 4 4 4

4 4 4 4 444 4 4 4 4 • 4 444 44 444 4 4 44 4 «••4 4 4 4 4 44 4

44 44 44 44 4 buňky (Orum, H. and Wengel, J. 2001, Wahlestedt, C. et al. 2000). Obecně jsou míněny chiméry nebo smíšené-chiméry jakýchkoliv DNA, RNA, PNA a LNA, stejně jako jakékoliv z nich, ve kterých je thymin zaměněn uracilem.

Z výše uvedeného je zřejmé, že předkládaný vynález se rovněž týká použití obalových proteinů HCV glykosylovaných s jádrem glykosylace, nebo kompozic podle vynálezu pro přípravu kompozice vakcíny proti HCV. Konkrétně, předkládaný vynález se týká použití obalového proteinu HCV glykosylovaného s jádrem glykosylace podle vynálezu k indukci imunity proti HCV u chronických přenašečů HCV. Konkrétněji, předkládaný vynález se týká použití obalových proteinů HCV glykosylovaných s jádrem glykosylace tak, jak Zde byly definovány, pro indukci imunity proti HCV u chronických přenašečů HCV, a to před, simultánně nebo po jakékoliv jiné terapii, jakou je například velmi dobře známá léčba s interferonem v kombinaci nebo bez kombinace s podáváním malých sloučenin k léčbě HCV, jakou je například ribavirin. Takovéto kompozice mohou být použity před a nebo po transplantaci jater , nebo po předpokládané infekci, jako je například infekce jehlou injekční stříkačky.

Další aspekt vynálezu se týká způsobu detekce přítomnosti anti-HCV protilátek ve vzorku, o kterém se předpokládá, že tyto anti-HCV protilátky obsahuje, přičemž uvedený způsob zahrnuje:

(i) kontaktování obalového protein HCV nebo jeho části podle vynálezu s uvedeným vzorkem za podmínek, které umožňují komplexaci obalového proteinu HVC nebo jeho části s anti-HCV protilátkami, • A AA ·Α A «· · A · · AAA • A · A · ··* AAAA

A A AA· · · AAA · AAAA £§··’ ’··”··’ *··* ^: (ii) (ii) detekci komplexu vytvořeného v bodě (i), a

(iii) (iii) dedukci na základě výsledku podle (ii) přítomnosti uvedených anti-HCV protilátek ve vzorku.

V konkrétním provedení se kontaktování v kroku (i) uvedeného postupu provádí za kompetitivních podmínek.

V jiném specifickém provedení uvedeného způsobu je obalový protein HCV nebo jeho část připojena k pevnému nosiči.

V dalším provedení je uvedeným vzorkem, o kterém se předpokládá, že obsahuje anti-HCV protilátky, biologický vzorek.

Další aspekt vynálezu se týká diagnostické soupravy (kitu) pro detekci přítomnosti anti-HCV protilátek ve vzorku, o kterém se předpokládá, že obsahuje anti-HCV protilátky, přičemž uvedený kit obsahuje obalový protein HCV nebo jeho část podle vynálezu. V konkrétním provedení je obalový protein HCV nebo jeho část připojen k pevnému nosiči. V jiném provedení je vzorek, o kterém se předpokládá, že obsahuje anti-HCV protilátky, biologickým vzorkem.

Výraz „biologický vzorek, tak jak je zde používán, se týká vzorku tkáně nebo tekutiny izolované z jedince, který je vybrán, bez omezení, například ze séra, plasmy, lymfatické tekutiny, externích částí kůže, respiračních, střevních nebo genitálně-urinálních traktů, oocytů, slz, slin, mléka, krevních buněk, nádorů, orgánů, sekretů žaludku, slizu, míšního moku, externích výměšků, jakými jsou například exkrementy, moč, sperma, a podobně. · ·· ····» ·« ·· ·· * • « · · · 9 · · · • · · · · ··· · · · · • · · · « · · · · · · ··<· • · « 9 · · · · · · · ·« »· «« ·· ·· «

Obalové protein HCV podle předkládaného vynálezu , nebo jejich části, jsou obzvláště vhodné pro použití v metodách, kterými jsou imunozkoušky pro detekci HCV, a/nebo genotypizace HCV pro prognózu/monitorování onemocnění způsobené HCV, nebo jako terapeutické látky.

V postupech, jakými jsou imunozkoušky podle předkládaného vynálezu, jsou používány obalové proteiny HCV podle vynálezu, které mají lineární (v případě peptidu) a konformační epitopy, jež jsou rozpoznávány protilátkami v sérech jedinců, infikovaných s HCV. Antigeny HCV El a E2 podle překládaného vynálezu mohou být fakticky použity v jakékoliv zkoušce, která používá známý antigen pro detekci protilátek. Samozřejmě, forma, ve kterém je HCV konformační epitop denaturován, není použitelná, nebo je třeba ji přizpůsobit. Obecným znakem všech těchto zkoušek je, že antigen je kontaktován se složkou těla, o které se předpokládá, že obsahuje HCV protilátky, za podmínek, jež umožňují vazbu antigenu k jakékoliv takové protilátce, přítomné ve složce. Takovými podmínkami jsou typicky fyziologická teplota, pH a iontová síla s použitím nadbytku antigenu. Inkubace antigenu se vzorkem je následována detekcí imunitních komplexů, jež obsahují antigen.

Způsob provedení imunozkoušek je předmětem mnoha způsobů obměn, a řada provedení je v oboru známá. Postupy mohou například používat pevné nosiče, nebo imunoprecipitaci. Většina postupů používá značené protilátky nebo značený poplypeptid; jako značky mohou být například použiy enzymatické, fluorescenční, chemiluminiscenční a radioaktivní molekuly, nebo molekuly barviv. Rovněž jsou známé zkoušky, ve kterých je zesilován signál imunitního komplexu; příklady takových zkoušek jsou • · • · ·· · ··· · · · • · · ····· · · · · • · ··· · · ··· · · · · * · · · · ···· · · · •· ·· „ ·· ·· ·· · testy, ve kterých je použit avidin nebo streptavidin, a imunozkoušky s enzymatickým značením a zprostředkování, jakými jsou zkoušky ELISA a RIA.

Imunozkouška může být, bez omezení, prováděna v heterogenním nebo homogenním a ve standardním nebo kompetitivním uspořádání. V heterogenním provedení je polypeptid běžně navázán na pevnou matrix nebo nosič tak, aby po inkubaci byla usnadněna separace vzorku od polypeptidu. Příklady pevných nosičů, které mohou být použity, jsou nitrocelulóza (např. nanesená na membránu nebo na jamky mikrotitračních destiček), polyvinylchlorid (např. v podobě folií nebo na jamkách mikrotitračních destiček), polystyrénový latex (např. v perličkách nebo na mikrotitračních destičkách), polyvinylidinfluorid (známý jako Immunolon™), diazotizovaný papír , nylonové membrány, aktivované kuličky a kuličky s navázaným Proteinem A. Tak například, v heterogenním provedení mohou být použity mikrotitrační destičky Dynatech Immunolon™ 1 nebo Immunlon™ 2. Pevný nosič, obsahující antigenní polypeptidy, je běžně po oddělení od testovaného vzorku promyt před detekcí navázaných protilátek. Jak standardní, tak kompetitivní provedení zkoušky je v oboru dobře známo.

V homogenním provedení je testovaný vzorek inkubován s kombinací antigenů v roztoku. Tak například, je možné provedení za podmínek, při kterých dochází k precipitaci jakýchkoliv vytvářených komplexů antigen-protilátka. Jak standardní, tak kompetitivní provedení těchto zkoušek jsou v oboru známá.

Ve standardním provedení je v komplexech protilátkaantigen přímo monitorováno množství protilátek, kterými • · ···· ·· ·· · · · • · · ··· ··· • · · · · ··· · · · · • · ··· · · ··· ····· • · · · · · · · ·· · ·· ·· · · ·· ·· · jsou například anti-HCV protilátky. Toto může být provedeno stanovením, zda se značené anti-xenogenní (například protilidské) protilátky, které rozpoznávají epitop k uvedeným protilátkám, tj. předmětné anti-HCV protilátky, budou vázat díky tvorbě komplexu. V kompetitivním provedení je ve vzorku množství protilátek, jakými jsou anti-HCV protilátky, stanoveno monitorováním kompetičního účinku na vazbu známého množství (značené) protilátky (nebo jiného soutěžícího ligandu), nebo antigenu v komplexu.

Komplexy antigen-protilátka mohou být detekovány jakoukoliv z řady metod známých v oboru, v závislosti na způsobu provedení. Tak například, neznačené protilátky, jako jsou například anti-HCV protilátky v komplexu, mohou být detekovány s použitím konjugátu anti-xenogenní Ig komplexovaném se značkou (například enzymatickou značkou).

V provedení zkoušky jako imunoprecipitační nebo aglutinační vytváří reakce mezi antigenem a protilátkou proteinový shluk (cluster), který precipituje v roztoku nebo v suspenzi a tvoří viditelnou vrstvu nebo film precipitátu. Jestliže v testovaném vzorku žádná protilátka není přítomna, žádný takový precipitát se nevytváří.

Obalové proteiny HCV nebo jejich specifické části podle vynálezu obsahující konformační epitopy jsou běžně baleny do soupravy pro použití v těchto imunozkouškách. Souprava normálně obsahuje v oddělených nádobkách přirozený antigen HCV, preparáty kontrolních protilátek (pozitivních a/nebo negativních), značenou protilátku, jestliže provedení zkoušky vyžaduje shodné a signál vytvářející reagencie (například enzymový substrát), pokud značka negeneruje signál přímo. Přirozený antigen HCV může již být • 9 • · 9 99 9 ·· 9 · · · 9 9 9 ·· 9 99999 9999 • · 999 99 999 99999 •999 ···· 99 9 ·· 99 99 99 99 9 navázán k pevnému nosiči, nebo je od látek vytvářejících vazbu k nosiči oddělen. Zpravidla jsou instrukce pro provedení zkoušky (např. v písemné formě, nebo jako záznam na pásce, CD-ROMu atd.) v soupravě přiloženy.

Vybraná pevná fáze může zahrnovat polymerní nebo skleněně kuličky, nitrocelulózu, mikročástice, mikrojamky reakční destičky, testovací zkumavky a magnetické kuličky. Sloučenina vytvářející signál může být vybrána ze skupiny zahrnující enzym, luminiscenční sloučeninu, chromogen, radioaktivní prvek a chemiluminiscenční sloučeninu.

Příklady enzymů zahrnují alkalickou fosfatázu, křenovou peroxidázu, a beta galaktosidázu. Příklady zesilujících sloučenin zahrnují biotin, anti-biotin a avidin. Příklady látek vázajících zesilující sloučeniny zahrnují biotin, anti-biotin a avidin. Pro blokování účinků látek podobných revmatoidnímu faktoru, je testovaný vzorek podroben podmínkám, které jsou dostatečné pro blokování účinku látek podobných revmatoidnímu faktoru. Tyto podmínky zahrnují kontaktování testovaného vzorku s množstvím anti-lidského IgG za vytváření směsi, a inkubaci směsi po dobu a za podmínek, které jsou dostatečné pro vytvoření produktu reakční směsi, jenž je v podstatě prostý od látek podobných revmatoidnímu faktoru.

Konkrétné, předkládaný vynález se týká obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu pro přípravu diagnostické soupravy (kitu).

Vzhledem k tomu, že obalové proteiny HCV glykosylované s jádrem glykosylace podle předkládaného vynálezu jsou vysoce imunogenní a stimulují jak humorální, tak buněčnou odpověď, týká se předkládaný vynález rovněž soupravy pro detekci T-buněčné odpovědi na HCV, přičemž souprava obsahuje oligomerní částice nebo purifikovaný jednotlivý obalový protein HCV podle předmětného vynálezu. T-buněčná odpověď na HCV může například být měřena tak, jak je popsáno v Leroux-Roels et al. ve W095/12677.

Podle dalšího aspektu se vynález týká způsobu indukce HCV-specifické imunitní odpovědi u savce, kde uvedená metoda zahrnuje podání účinného množství obalového Protein HCV nebo jeho části podle vynálezu savci, případně s obsahem farmaceuticky přijatelného adjuvans. Uvedená metoda zahrnující podání účinného množství obalového Protein HCV nebo jeho části podle vynálezu savci může být rovněž použita pro indukci HCV-specifických protilátek u savce, nebo pro indukci specifických T-buněčných funkcí u savce. V uvedených způsobech může být podání určeno pro profylaktické účely, například jako profylaktické podání, nebo pro terapeutické účely, například jako terapeutické podání.

Další aspekt vynálezu se týká způsobu imunizace savce který zahrnuje podání účinného množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle vynálezu savci, případně s obsahem farmaceuticky přijatelného adjuvans.

Předmětný vynález se také týká způsobu léčby savce infikovaného s HCV, kde uvedený způsob zahrnuje podání účinného množství obalového proteinu HCV nebo jeho částí podle vynálezu savci, případně s obsahem farmaceuticky přijatelného adjuvans.

Jakýkoliv z výše popsaných aspektů vynálezu, nebo z jeho provedení specifických pro uvedené aspekty, je

9 · • · • · · rovněž aplikovatelný obecně na předmětné proteiny, které jsou produkty exprese v eukaryontních buňkách, a které jsou dále charakterizovány shodnými glykosylačními vlastnostmi, jaké byly výše popsány pro dva odlišné obalové proteiny HCV.

Konkrétněji, vynález se tak týká izolovaného proteinu, který je předmětem zájmu, nebo jeho fragmentu, jenž obsahuje alespoň jedno N-glykosylační místo, přičemž uvedený protein nebo jeho fragment je charakterizován tím, že je produktem exprese v eukaryontní buňce, a dále je charakterizován tím, že v průměru až 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 64 %,74 í %, 76 , 56 %, , 66 %, %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 78 %, 79 %, nebo 80 %

N-glykosylovaných míst je glykosylováno s glykosylačním

jádrem. Ještě	konkrétněji,	více než	60	g, ° /	61	%,	62	O ° r
64 %, 65 %, 66	%, 67 %, 68	%, 69 %,	70	o, ° r	71	O, ° r	72	o ° r
74 %, 75 %, 76	%, 77 %, 78	%, 79 %,	80	O ⁰ r	81	O Q f	82	o O f
84 %, 85 %, 86	%, 87 %,88	%, 89 %,	90 %	r	91 %	r	92 %	t

% nebo 95 % N-glykosylovaných míst je glykosylováno s

I oligomanózou o struktuře definované jako Man(8 až 10)GlcNAc(2). Konkrétněji, vedle jakékoliv z výše uvedených Nglykosylačních charakteristik, platí, že poměr počtu míst glykosylovaných s glykosylačním jádrem s oligomanózou o struktuře Man(7)-GlcNAc(2) k počtu míst glykosylovaných s jádrem glykosylace s oligomanózou o struktuře Man(8)GlcNAc(2) je menší než nebo roven 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, nebo 0,50. Kromě toho další specifičtější charakteristikou, vedle jakékoliv z výše uvedených charakteristik, je, že uvedené oligomanózy obsahují méně než 20 %, 19 %, 18 %,17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 • Φ ···· ·» ·» «* ♦

9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 9 9

9 999 99 999 9 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 · %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, nebo 5 % terminální α 1,3 manózy.

Další alternativní aspekt vynálezu se týká izolovaného proteinu zájmu nebo jeho fragmentu, který obsahuje alespoň jedno N-glykosylační místo, přičemž uvedený protein nebo jeho fragment je charakterizován tím, že je produktem exprese v eukaryontní buňce a dále tím, že N-glykosylační místa jsou obsazena oligomanózami, přičemž poměr oligomanóz o struktuře Man(7)-GlcNAc(2) k oligomanózám o struktuře Man(8)-GlcNAc(2) je menší nebo roven 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, nebo 0,50. Další, specifičtější charakteristikou vedle výše uvedených N-glykosylačních charakteristik je, že uvedené oligomanózy obsahují méně než 20 %, 19 %, 18 %,17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, nebo 5 % terminální α 1,3 manózy.

Konkrétně, uvedený izolovaný protein zájmu nebo jeho fragment je produktem exprese v buňce kvasinky, jakou je například buňka Hansenula. Takovým izolovaným proteinem zájmu nebo jeho fragmentem může být například virový obalový protein nebo jeho fragment, jakým je obalový protein HCV nebo obalový protein HBV (hepatitis B), nebo jeho fragmenty. Další příkladné obalové proteiny virů zahrnují obalový protein HIV (human immunodeficiency virus) gpl20 a virové obalové proteiny virů, které příslušejí k rodu Flavirideae. Obecně, uvedeným izolovaným proteinem zájmu nebo jeho fragmenty může být jakýkoliv protein, který má N-glykosylační charakteristiky podle předkládaného vynálezu.

• 9 · · 9

9 9 9 9 • 9 · ·γ··..· ·..··..· ·..· :

Výrazem „HCV-rekombinantní vaccinia virus je míněn virus vaccinia obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující protein HCV nebo jeho část.

Termíny „částice podobná viru HCV tvořená z obalového proteinu HCV a „oligomerní částice tvořené obalovými proteiny HCV jsou zde definovány jako struktury specifické podstaty a tvaru, obsahující několik základních jednotek obalových proteinů HCV El a/nebo E2, o kterých se předpokládá, že nezávisle sestávají z jednoho nebo dvou El a/nebo E2 monomerů, v uvedeném pořadí. Je třeba uvést, že částice podle předkládaného vynálezu jsou definovány tak, že neobsahují infekční HCV RNA genomy. Částicí podle předkládaného vynálezu mohou být částice vyššího řádu sférické povahy, které mohou být prázdné, sestávající z proteinů vnějšího obalu, ve kterém mohou být uzavřeny lipidy, detergenty, jaderný protein HCV, nebo molekuly adjuvans. Tyto částice mohou být opouzdřeny s liposomy nebo apolipoproteiny, jakými jsou například apolipoprotein B nebo lipoproteiny o nízké hustotě, nebo s jakýmikoliv prostředky, které zacilují uvedené částice ke specifickému orgánu nebo tkáni. V tomto případě jsou takovéto prázdné sférické částice často nazývány jako „částice podobné viru (virus-like particles, VLPs). V jiném provedení mohou částicemi vyššího řádu být pevné sférické struktury, ve kterých úplný obal sestává z oligomerů obalových proteinů HCV El nebo E2 oligomerů, do kterých mohou být dodatečně vneseny lipidy, detergenty, jaderný protein HCV, nebo molekuly adjuvans, nebo které naopak samy o sobě mohou být zapouzdřeny v liposomech nebo apolipoproteinech, jakými jsou například apolipoprotein B, lipoproteiny o nízké hustotě, nebo v jakýchkoliv prostředcích, které zacilují uvedené částice ke specifickému orgánu nebo tkáni, např.

• · • « « ··· · · · • « · ····· · · · · • · · · · ·· · · · ····· asialoglykoproteiny. Částice mohou rovněž sestávat z menších struktur (v porovnání s prázdnými nebo pevnými sférickými strukturami popsanými výše), které jsou zaobleného tvaru (viz dále) a zpravidla neobsahují více než jednu vrstvu obalových proteinů HCV. Typickým příkladem menší částice jsou struktury podobné rosetám, které jsou tvořeny menším počtem obalových proteinů HCV, obvykle mezi 4 a 16. Specifický příklad takové částice zahrnuje menší částice získané z proteinů El (Els) v 0,2% CHAPS tak, jak je zde doloženo příkladem, které zjevně obsahují 8 až 10 monomerů Els. Takové rosetám podobné struktury jsou obvykle organizovány v rovině a mají zaoblený tvar, například ve formě kola. Opětovně mohou být lipidy, detergenty, jaderný protein HCV, nebo molekuly adjuvans dodatečně inkorporovány do takovýchto částic, nebo mohou být menší částice opouzdřeny v liposomech nebo s apolipoproteiny, jakými jsou například apolipoprotein B nebo lipoproteiny o nízké hustotě, nebo v jakýchkoliv prostředcích, které zacilují uvedené částice ke specifickému orgánu nebo tkáni. Menší částice mohou také vytvářet malé sférické nebo globulární struktury sestávající z podobně menšího počtu obalových proteinů HCV El nebo E2, ve kterých mohou být dodatečně uzavřeny lipidy, detergenty, jaderný protein HCV, nebo molekuly adjuvans, nebo které naopak mohou být opouzdřeny v liposomech nebo s apolipoproteiny, jakými jsou například apolipoprotein B nebo lipoproteiny o nízké hustotě, nebo v jakýchkoliv prostředcích, které zacilují uvedené částice ke specifickému orgánu nebo tkáni. Velikost (tj. průměr) výše definovaných částic, měřená v oboru dobře známou technikou dynamického rozptylu světla (dynamic light scattering), (viz dále v části Příklady provedení) je zpravidla mezi 1 až 100 nm, výhodněji mezi 2 až 70 nm, • · · nejvýhodněji mezi 2 a 40 nm, mezi 3 až 20 nm, mezi 5 až 16 nm, mezi 7 až 14 nm nebo mezi 8 až 12 nm.

Předkládaný vynález se konkrétně dále týká způsobu purifikace obalových proteinů viru hepatitidy C (HCV) glykosylovaných s jádrem glykosylace, nebo jakékoliv jejich části, které jsou vhodné pro použití v imunozkoušce nebo ve vakcíně, přičemž tento způsob zahrnuje:

(i) (ii) (iii) pěstování glykosylačně negativních kmenů Hansenula nebo Saccharomyces transformovaných s genem kódujícím obalový protein HCV El a/nebo HCV E2, nebo jakoukoliv jeho část, ve vhodném kultivačním médiu;

vyvolání exprese uvedeného genu pro HCV El a/nebo HCV E2, nebo jeho část; a purifikací uvedeného proteinu HCV El a/nebo HCV E2 glykosylovaného s jádrem glykosylace, nebo jakékoliv jeho části z uvedené buněčné kultury.

Vynález se dále týká způsobu purifikace obalových proteinů viru hepatitidy C (HCV) glykosylovaných s jádrem glykosylace, nebo jakékoliv jejich části, které jsou vhodné pro použití v imunozkoušce nebo ve vakcíně, přičemž tento způsob zahrnuje:

(i) pěstování glykosylačně negativních kmenů Hansenula nebo Saccharomyces transformovaných s genem kódujícím obalový protein HCV El a/nebo HCV E2, nebo jakoukoliv jeho část, ve vhodném kultivačním médiu;

(ii) vyvolání exprese uvedeného genu pro HCV El a/nebo HCV E2, nebo jejich část; a • · · · 4 ·

4 4· 4

4 4 4 4 (iii) purifikaci uvedeného intracelulárně exprimovaného proteinu HCV El a/nebo HCV E2 glykosylovaného s jádrem glykosylace, nebo jakékoliv jeho části, po lyži transformované hostitelské buňky.

(i) pěstování glykosylačně negativních kmenů Hansenula nebo Saccharomyces transformovaných s genem kódujícím obalový protein HCV El a/nebo HCV E2, nebo jakoukoliv jeho část, ve vhodném kultivačním médiu, kde uvedený protein HCV El a/nebo HCV E2, nebo jakákoliv jeho část, obsahuje alespoň dvě aminokyseliny Cys ;

(ii) vyvolání exprese uvedeného genu pro HCV El a/nebo HCV E2, nebo jejich část; a (iii) purifikaci uvedeného proteinu HCV El a/nebo HCV E2 glykosylovaného s jádrem glykosylace, nebo jakékoliv jeho části, z kultury, přičemž uvedené aminokyseliny Cys jsou reversibilně chráněny chemickými a/nebo enzymatickými prostředky.

• · • · · · • · · · · · • · · · • · · · « · · · · « · · · 9

9 9 9 9 9 9 9 9

99. 99 99 (i) pěstování glykosylačně negativních kmenů Hansenula nebo Saccharomyces transformovaných s genem kódujícím obalový protein HCV El a/nebo HCV E2, nebo jakoukoliv jeho část, ve vhodném kultivačním médiu, kde uvedený protein HCV El a/nebo HCV E2, nebo jakákoliv jeho část, obsahuje alespoň dvě aminokyseliny Cys;

(ii) vyvolání exprese uvedeného genu pro HCV El a/nebo HCV E2, nebo jejich část; a (iii) purifikaci uvedeného intracelulárně exprimovaného proteinu HCV El a/nebo HCV E2 glykosylovaného s jádrem glykosylace, nebo jakékoliv jeho části, po lyži transformované hostitelské buňky, přičemž uvedené aminokyseliny Cys jsou reversibilně chráněny chemickými a/nebo enzymatickými prostředky.

Předkládaný vynález se specificky týká způsobu purifikace rekombinantních proteinů HCV z kvasinek, nebo jakýchkoliv jejich částí, tak, jak jsou zde popsány, ve kterém uvedená purifikace zahrnuje použití afinitní chromatografií s heparinem.

Stejně tak se předkládaný vynález specificky týká způsobu purifikace rekombinantních proteinů HCV z kvasinek, nebo jakýchkoliv jejich částí, tak, jak jsou zde popsány, ve kterém chemickým prostředkem je sulfonace.

Stejně tak se předkládaný vynález specifický týká způsobu purifikace rekombinantních proteinů HCV z kvasinek, nebo jakýchkoliv jejich částí, tak, jak jsou zde popsány, ve kterém reversibilní ochrana aminokyselin Cys je zaměněna • · · · · · • · · ♦ · · · · · • · · » · ··· · · · · • · · · · · · ··· ····· ···· · · · · · · · •· · · ·· ·· ·· · za ireversibilní ochranu chemickými a/nebo enzymatickými prostředky.

Stejně tak se předkládaný vynález specifický týká způsobu purifikace rekombinantních proteinů HCV z kvasinek, nebo jakýchkoliv jejich částí, tak, jak jsou zde popsány, ve kterém ireversibilní ochrana chemickými prostředky je provedena s jodacetamidem.

Stejně tak se předkládaný vynález specifický týká způsobu purifikace rekombinantních proteinů HCV z kvasinek, nebo jakýchkoliv jejich částí, tak, jak jsou zde popsány, ve kterém ireversibilní ochrana chemickými prostředky je provedena s NEM nebo Biotin-NEM, nebo s jejich směsí.

Předkládaný vynález se rovněž týká kompozice tak, jak byla definována výše, která rovněž obsahuje jaderný protein HCV, El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/nebo NS5B protein, nebo jeho části. Proteiny El, E2, a/nebo E1/E2 glykosylované s jádrem glykosylace podle předkládaného vynálezu mohou být například kombinovány s jinými antigeny HCV, jakými jsou například jaderný protein, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/nebo NS5B protein. Purifikace těchto proteinů NS3 výhodně zahrnuje reversibilní modifikace zbytků cysteinu, a ještě výhodněji sulfonaci cysteinu. Způsoby, jak dosáhnout takovýchto reversibilních modifikací, byly pro proteiny NS3 popsány v Maertens et al.

(PCT/EP99/02547). Je třeba zdůraznit, že celý obsah včetně všech definic, uvedených v tomto dokumentu, je v předkládané přihlášce vynálezu zahrnut formou odkazu.

Předkládaný vynález se rovněž týká použití obalového proteinu glykosylovaného s jádrem glykosylace tak, jak byl ·· ΒΒΒΒ ·· ·· ·· Β • Β · Β · · Β · Β

ΒΒ Β ΒΒΒΒ* ΒΒΒΒ

Β Β ΒΒΒ ΒΒ Β Β Β Β ΒΒΒΒ

zde popsán, pro indukci imunity proti HCV, která se vyznačuje tím, že obalový protein glykosylovaný s jádrem glykosylace je použit jako součást podání sloučenin v časovém sledu. V tomto smyslu je třeba výraz „podání sloučenin v časovém sledu chápat jako podání sloučenin jedinci v časových intervalech, které vyvolává imunitní odpověď. Tyto sloučeniny mohou zahrnovat kteroukoliv z následujících komponent: obalový protein glykosylovaný s jádrem glykosylace, kompozici vakcíny obsahující DNA HCV, polypeptidy HCV. V tomto smyslu časový sled zhrnuje podání buďto:

(i) antigenu HCV, jakým je například obalový protein glykosylovaný s jádrem glykosylace v časových intervalech, nebo (ii) antigenu HCV, jakým je například obalový protein glykosylovaný s jádrem glykosylace, v kombinaci s kompozici vakcíny obsahující HCV DNA, kde oligomerní částice uvedeného proteinu glykosylovaného s jádrem glykosylace a uvedená kompozice vakcíny s DNA HCV mohou být podávány simultánně, nebo v různých časových intervalech, včetně měnících se časových intervalů, nebo (iii) podle bodu (i) nebo (ii), případně v kombinaci s dalšími peptidy HCV v časových intervalech.

V tomto smyslu je třeba uvést, že kompozice vakcíny obsahující DNA HCV obsahuje nukleové kyseliny kódující obalový peptid HCV, zahrnující Ε1-, E2-, El/E2-peptidy, NS3 peptid, jiné peptidy HCV, nebo části uvedených peptidů. Kromě toho je třeba chápat, že uvedené peptidy HCV zahrnují obalové peptidy HCV, včetně E1-, E2-, El/E2-peptidů, NS3 ·· ···· • 4 4 · · 4 4 4 4 ·· 4 4 4444 4 44·

4 444 44 444 4 4444

4444 4444 4 4 4 · 4 44 44 ·· · peptidu, jiné peptidy HCV, nebo části uvedených peptidů. Výraz „jiné peptidy HCV se týká jakéhokoliv peptidu HCV nebo jeho fragmentu. V bodě (ii) výše uvedeného postupu obsahuje kompozice vakcíny s DNA HCV výhodně nukleové kyseliny kódující obalové peptidy HCV. Podle bodu (ii) výše uvedeného postupu sestává kompozice vakcíny s DNA HCV ještě výhodněji z nukleových kyselin kódujících obalové peptidy HCV, případně v kombinaci s kompozicí vakcíny obsahující HCV-NS3 DNA. V tomto smyslu je třeba uvést, že kompozice vakcíny s DNA HCV obsahuje plasmidový vektor zahrnující polynukleotidovou sekvenci kódující peptid HCV tak, jak byl popsán výše, operabilně spojenou s regulačními prvky transkripce. Zde používaný výraz „plasmidový vektor se týká molekuly nukleové kyseliny schopné přenášet jinou nukleovou kyselinu, ke které je tato připojena. Výhodnými vektory jsou ty, které jsou schopny autonomní replikace a/nebo exprese nukleových kyselin, k nimž jsou připojeny. Bez jakéhokoliv omezení lze obecně uvést, že plasmidovými vektory jsou cirkulární dvouřetězcové smyčky DNA, které ve formě vektoru nejsou připojeny k chromosomu. Tak, jak je zde použit, znamená výraz „polynukleotidová sekvence polynukleotidy, jakými jsou například deoxyribonukleová kyselina (DNA), a tam, kde je to vhodné, též ribonukleovou kyselinu (RNA). Tento výraz by měl být rovněž chápán tak, že zahrnuje analogy buďto RNA, nebo DNA, jako ekvivalenty, které byly připraveny z analogů nukleotidů, a jednořetězcové (sense nebo antisense) a dvouřetězcové polynukleotidy. Tak, jak je zde výraz „regulační prvky transkripce použit, týká se nukleotidové sekvence, která obsahuje základní regulační prvky, a to takové, které po zavedení do živé buňky obratlovců jsou schopny řídit buněčný aparát k produkci translačních produktů kódovaných polynukleotidem. Výraz „operabilně připojený se týká ·

• · · 9 9 9 99 99 · 999 999

9 9 9 9 999 9 9 9 9

9 9 9 9 99 999 9 9999 9999 9999 99 9

99 99 99 ·9 9 juxtapozice ve které jsou složky konfigurovány tak, že umožňují svoji běžnou funkci. Proto jsou regulačními prvky transkripce operabilně připojené nukleotidové sekvence, schopné provádět expresi uvedené nukleotidové sekvence. Pro odborníka v oboru je pro úspěšnému provedení zcela zřejmé použití různých transkripčních promotorů, terminátorů, vektorů nebo specifických genových sekvencí

Alternativně může být DNA vakcína podána prostřednictvím živého vektoru, jakým je například adenovirus, virus neštovic kanárů (canary pox virus), MVA, a podobně.

Předkládaný vynález je ilustrován Příklady provedení tak, jak jsou uvedeny níže. Příklady jsou pouze ilustrativní a nejsou žádným způsobem zamýšleny jako omezující pro rozsah vynálezu.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ

PŘÍKLAD 1

KONSTRUKCE KYVADLOVÉHO VEKTORU pFPMT-MFa-El-H6

Plasmldy pro transformaci Hansenula polymorpha byly zkonstruovány následujícím způsobem. Kyvadlový vektor pFPMT-MFa-El-H6 byl zkonstruován ve vícestupňovém postupu. Nejprve byla sekvence nukleové kyseliny kódující protein HCV Els (SEQ ID NO: 2) klonována za vedoucí sekvenci CHH (CHH = Carcinus maenas hyperglykemický hormon), která byla následně zaměněna za vedoucí sekvenci MFa (MFa = Saccharomyces cerevisiae α-mating (pérovací) faktor).

•4 ·♦·«

44

4 4

4 4 4 4

4 4 4 • 4 • · · • ·

4 4 _ 44 4 4 « 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4

Nejprve byl zkonstruován derivát pUC18, nesoucí jednotku CHH-E1-H6 jako BcoRI/BamHI fragment, s nepřerušovanou metodou klonování (Padgett, K. A. and Sorge,

J. A. 1996). Navíc byly fragment DNA kódující Els-H6 a od pCHH-Hir odvozený akceptorový plasmid připraveny s PCR tak, jak je popsáno níže.

Příprava fragmentu DNA kódujícího Els-H6.

Fragment DNA E1-H6 (kódující protein HCV typu lb Els sestávající z aminokyselin Els 192 až 326, prodloužený o 6 zbytků His; SEQ ID NO:5) byl izolován s PCR z plasmidu pGEMTElsH6 (SEQ ID NO: 6; Obrázek 1). K tomu byly použity následující primery :

- CHHE1-F:5'-agttactcttca.aggtatgaggtgcgcaacgtgtccg-3' (SEQ ID NO: 7);

Místo EamllO4I je podtrženo, tečka označuje místo štěpení. Tučně vytištěné baze jsou komplementární k bažím primeru CHH-links. Neoznačené baze se připojují v sense směru uvnitř oblasti start El (192-326); a

- CHHE1-R:

5'-gttactcttca.cagggatcctccttaatggtgatggtggtggtgcc-3' (SEQ ID NO: 8);

Místo Eamll04l je podtrženo, tečka označuje místo štěpení. Tučně vytištěné baze jsou komplementární k bažím primeru MF30-rechts. Baze tvořící místo pro BamHI vhodné pro další klonovací postupy jsou vytištěny kurzívou. Neoznačené baze se připojují v antisense směru uvnitř konce jednotky E1-H6, který obsahuje stop kodón a tři další baze mezi stop kodónem a místem BamHI.

Reakční směs sestávala z následujících složek: celkový objem 5Ό μΐ obsahující 20 ng Bco311-linearizovaného • · · *· A • A A A A · · * A • A A A A A A A A AAA

A A A A A AA AAA A AAAA

AAAA AAAA AA A

AA AA AA AA AA A ⁸⁷ pGEMTElsH6, po 0,2 μΜ každého z primerů CHHE1-E a CHHE1-R, dNTP's (každý v množství 0,2 μΜ), 1 x pufr 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázové směsi (polymerase mix, Expand Long Template PCR System; Boehringer ; Cat No 1681 834).

Byl použit Program 1, který sestával z následujících kroků:

1. denaturace: 5 min 95°C ;

2. 10 cyklů denaturace 30 s při 95° C, 30 s nasedání při 65° C a 130 s prodlužování při 68° C;

3. terminace při 4° C.

Pak bylo ke vzorku získaného podle Programu 1 přidáno 5 μΐ 10 x pufru 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 40 μΐ H₂O a 5 μΐ [dATP, dGTP a dTTP (každý 2mM); 10 mM 5-methyl-dCTP] a byla prováděna další amplifikace podle Programu 2 sestávajícího z následujících stupňů:

1. denaturace: 5 min při 95°C;

2. 5 cyklů 45 s denaturace při 95° C, 30 s nasedání při 65° C a 130 s při 68° C;

3. terminace při 4° C.

Příprava akceptorového plasmidu odvozeného od pCHH-Hir

Akceptorový fragment byl připraven s PCR z plasmidu pCHH-Hir (SEQ ID NO: 9; Obrázek 2) a sestává z téměř úplného plasmidu pCHH-Hir, s tou výjimkou, že sekvence kódující Hir není v produktu PCR přítomna. Pro tuto PCR byly použity následující primery:

1. CHH-links: 5-agttactcttca. cctcttttccaacgggtgtgtag-3' (SEQ ID NO: 10);

Φ· φφφφ φ · φφ φ φφφ φφφ φφ φ φφφφφ φφφφ φ · φφφ φφ φφφ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φ φφ φφ φφ φφ φφ φ

Místo EamllO4I je podtrženo, tečka označuje místo štěpení. Tučně vytištěné baze jsou komplementární k bažím primeru CHHE1-F. Neoznačené baze se připojují v antisense směru uvnitř konce sekvence CHH; a

2. MF30-rechts: 5-agtcactcttca.ctgcaggcatgcaagcttggcg-3' (SEQ ID NO:II);

Místo EamllO4I je podtrženo, tečka označuje místo štěpení. Tučně vytištěnébaze jsou komplementární k bažím primeru CHHE1-R. Neoznačené baze se připojují uvnitř sekvencí pUC18 za klonovaný CHH-Hirudin HL20 plasmidu pCHH-Hir, vně od inzertu.

Reakční směs sestávala z následujících složek: celkový objem 50 μΐ obsahující 20 ng Asp718I-linearizovaného pCHHHir, po 0,2 μΜ každého z primeru CHH-links a MF30-rechts, dNTP's (každý v množství 0,2 μΜ), 1 x pufr 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázové směsi (polymerase mix, Expand Long Template PCR System; Boehringer ; Cat No 1681 834).

Byl použit Program 1 tak, jak je popsán výše.

Pak bylo ke vzorku získaného podle Programu 1 přidáno 5 μΐ 10 x pufru 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 40 μΐ H₂O a 5 μΐ [dATP, dGTP a dTTP (každý 2mM); 10 mM 5-methyl-dCTP] a byla prováděna další amplifikace podle Programu 2 tak, jak je popsán výše.

Příprava vektoru pCHHEl

Fragment DNA kódující Els-H6 a akceptorový plasmid odvozený z pCHH-Hir, který byl připraven s PCR tak, jak je popsáno výše, byly purifikovány s použitím purifikační soupravy PCR (PCR product purification kit, Qiagen) podle ·· ···* • « · · · · ··· • « · · · ♦ ·· » · · 9 • · · · · 9 9 9 9 9 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 · doporučení výrobce. Následně byly purifikované fragmenty odděleně štěpeny s Bamll04l. Poté byl fragment DNA Els-H6 ligován do akceptorového plasmidu odvozeného z pCHH-Hir s použitím T4 ligázy (Boehringer) podle instrukcí výrobce.

Buňky E. coli XL-Gold byly transformovány s ligační směsí a byla analyzována plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních k ampicilinu štěpením s BcoRI a BamHI. Pozitivní klony byly vybrány a označeny jako pCHHEl.

Příprava vektoru pFPMT-CHH-ElH6

Fragment pCHHEl, získaný působením BcoRI/BamHI byl ligován s vektorem pFPMTl21, který byl štěpen s BcoRI/BamHI (SEQ ID NO: 12; Obrázek 3). Byla použita T4 ligáza (Boehringer) podle instrukcí výrobce. Ligační směs byla použita k transformaci buněk E. coli DH5ocF'.

U řady transformantů byla provedena analýza restrikčních vzorků z plasmidové DNA a pozitivní klon byl odebrán a pojmenován pFPMT-CHH-ElH6 (SEQ ID NO: 13; Obrázek 4).

Příprava pFPMT-MFoc-El-H6

Nakonec byl připraven kyvadlový vektor pFPMT-MFa-El-Ηβ ligací třech fragmentů, kde uvedenými fragmenty byly:

1. 6961kb z pFPMT121, štěpeného s BcoRI/BamHI (SEQ ID NO:

12; Obrázek 3),

2. 0,245 EcoRI/HindlII fragment z pUC18-MFa (SEQ ID NO:

62; Obrázek 36), a

3. 0,442kb fragment z 0,454kb produktu PCR, odvozeného z pFPM CHH-E1H6 a štěpeného s HindiII/BamHI

AAA A

AAAA

A· A

AA AAAA

AA A· • · A A • AAA· A A · A A

A AAA

A A A A

A A AAAA

Produkt PCR o 0,454 kb, který poskytl fragment, byl získán s PCR s použitím následujících primerů:

1. primer MFa-El f-Hi:

5-aggggtaagcttggataaaaggtatgaggtgcgcaacgtgtccgggatgt-3' (SEQ ID NO: 14); a

2. primer El back-Bam:

5'-agttacggatccttaatggtgatggtggtggtgccagttcat-3' (SEQ ID NO: 15).

Reakční směs měla následující složení: Objem reakční směsi 50 μΐ, pFPMT-CHH-El-H6 (EcoRI-linearizovaný; 15 ng/μΐ), 0,5 μΐ; primer MFa-El f-Hi (50 μΜ), 0,25 μΐ; primer El back-Bam(50 μΜ), 0,25 gl;dNTP's (všechny 2mM) , 5μ1;

DMSO, 5 μΐ; H₂ O, 33,5 μΐ; Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim; Cat No 1681 834) pufr 2 (10 x koncentrovaný), 5 μΐ; Expand Long Template PCR System Polymerase mixture(l U/μΙ), 0,5 μΐ.

Byl použit program PCR sestávající z následujících stupňů:

1. denaturace:5 min při 95° C

2. 29 cyklů denaturace 45 s při 95° C, 45 s nasedání při 55° C, a 40 s elongace při 68° C

3. terminace při 4° C.

Na základě použitých primerů obsahoval výsledný 0,454kb produkt PCR kodóny z El (192-326), následovanými šesti histidinovými kodóny a stop kodónem „taa, lemovanými proti směru s 22 3'-terminálními páry baží z MFa pre-pro sekvence (obsahující relevantní klonovací místo HindlII plus šest vyčnívajících párů baží) a po směru lemovanými s (pro klonování relevantním) místem BamHI a šesti vyčnívajícími páry baží.

• · • ·

Pro ligační reakci byla použita T4 DNA ligáza (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce (objem vzorku 20 μΐ).

Buňky E. coli HB101 byly transformovány s ligační směsí a pozitivní klony byly odebrány po restrikční analýze plasmidů, izolovaných z několika transformantů. Byl vyselektován pozitivní plasmid a pojmenován jako pFPMTMFa-El-H6 (SEQ ID NO: 16; Obrázek 5).

PŘÍKLAD 2

KONSTRUKCE KYVADLOVÉHO VEKTORU pFPMT-CL-El-H6

Plasmidy pro transformaci Hansenula polymorpha byly zkonstruovány následovně. Kyvadlový vektor pFPMT-CL-El-H6 byl zkonstruována během tří kroků z výchozího pFPMT-MFaE1-H6 (SEQ ID NO: 16, Obrázek 5).

V prvém kroku byl čtecí rámec MFa-El-H6 z pFPMT-MFaE1-H6 subklonován do vektoru pUC18. Proto byl l,798kb Sall/BamHI fragment z pFPMT-MFa-El-H6 (obsahující promotor FMD plus MFa-El-H6) ligován do vektorového Sall/BamHI fragmentu z pUC18 s ligázou T4 (Boehringer) podle doporučení výrobce. Výsledkem byl plasmid, který je zobrazen na Obrázku 6 (SEQ ID NO: 17), a který je dále označován jako pMal2-l (pUC18-FMD-MFa-El-H6).

K transformaci buněk £. coli DH5ctF'byla použita ligační směs. Bylo odpíchnuto několik kolonií rezistentních k ampicilinu a plasmidová DNA z izolovaných klonů byla analyzována restrikčním štěpením. Pozitivní klony byly dále analyzovány stanovením sekvence DNA pro kódující sekvenci MFa-El-H6. Správný klon byl použit pro řízenou PCR mutagenezi k záměně pre-pro-sekvence MFa za kodóny presekvence opičího lysozymu („CL; odpovídající aminokyselinám 1 až 18 opičího lysozymu; SEQ ID NO: 1). Princip aplikované PCR-řízené mutageneze je založen na amplifikaci celého plasmidu s požadovanými změnami umístěnými na 5'-koncích primerů. V krocích po směru jsou pak lineární produkty PCR modifikovány před vlastní ligací, což vede k požadovanému pozměněnému plasmidu.

Pro reakci PCR byly použity následující prímery:

1. primer CL hin :

5'-tgcttcctaccactagcagcactaggatatgaggtgcgcaacqtqtccqqq-3' (SEQ ID NO: 18);

2. primer CL her neu:

5'-tagtactagtattagtaggcttcgcatgaattcccqatqaaqqcaqaqaqcq-3' (SEQ ID NO: 19).

Podtržené 5'oblasti primerů obsahují kodóny, které pocházejí přibližně z jedné poloviny z pre-sekvence opičího lysozymu. Primer CL her neu obsahuje restrikční místo Spěl (kurzíva). Nepodtržené oblasti primerů se připojují ke kodónům pro aminokyselinové zbytky 192 až 199 z El (CL hin), nebo ke start kodónu „atg promotoru FMD za místo EcoRI až k pozici -19 (počítáno od místa EcoRI). Záměna kodónů pre-pro-sekvence MFa za kodóny pre-sekvence opičího lysozymu byla provedena proto, že prímery jsou určeny k amplifikaci úplného pMal2-l.

Reakční směs měla následující složení: pUC18-FMD-MfaE1-H6 (pMal2-l; 1,3 ng/μΐ), 1 μΐ; primer CL hin(100 μΜ), 2 μΐ; primer CL her neu (100 μΜ), 2 μΐ; dNTP's (každý 2,5mM), μΐ; H₂0, 76 μΐ; Expand Long Template PCR System (Boehringer; Cat No 1681 834) Pufr 2 (10 x koncentrovaný), • ·

μΐ; Expand Long Template PCR System Polymerase mixture (polymerázová směs, 1 U/μΙ), 0,75μ1.

Byl použit program PCR sestávající z následujících stupňů:

1. denaturace: 15 min při 95° C

2. 35 cyklů denaturace 30 s při 95° C, 1 min nasedání při 60° C, a 1 min elongace při 72° C

3. terminace při 4° C.

Správná velikost výsledného produktu PCR byla kontrolována elektroforézou v agarózovém gelu (3,5 kb).

Poté byly vyčnívající konce 3'-A odstraněny z produktu PCR reakcí s T4 polymerázu tak, aby měly zarovnané konce 3'- a 5'-OH skupiny. Proto bylo na produkt PCR působeno s T4 polymerázou (Boehringer; 1 U/μΙ): ke zbývajícím 95 μΐ reakční směsi PCR byly přidány 1 μΐ T4 polymerázy a 4 μΐ dNTP's (každý 2,5 mM). Vzorek byl inkubován po dobu 20 minut při 37° C. Následně byla DNA precipitována s ethanolem a převedena do 16 μΐ H₂O.

Následně byly přidány 5-'fosfáty k produktu PCR pro zarovnání konců kinázovou reakcí. Proto byl k 16 μΐ produktu PCR se zarovnanými konci přidány 1 μΐ T4 polynukleotid kinázy (Boehringer; 1ϋ/μ1), 2 μΐ lOkrát koncentrovaného reakčního pufru pro T4 polynukleotid kinázu (T4 polynucleotide kinase reaction buffer, Boehringer), a 1 μΐ ATP (lOmM). Vzorek byl inkubován po dobu 30 minut při 37° C. Poté byla DNA nanesena na 1% agarózový gel, pruh s odpovídajícím produktem byl izolován pomocí gelové extrakční soupravy (gel extraction kit, Qiagen) podle doporučení výrobce. Padesát (50) ng purifikovaného produktu bylo samoligováno s použitím.T4 ligázy (Boehringer) za • · · · ► · · « » · · « ·· ·· podmínek podle doporučení výrobce. Po inkubaci 72 hodin při 16° C byla DNA v ligační směsi precipitována s ethanolem a rozpuštěna ve 20 μΐ vody.

Následně byly buňky E. coli DH5cc-F' transformovány s 10 μΐ ligačního vzorku. Plasmidová DNA z několika klonů rezistentních na ampicilin byla kontrolována s použitím štěpení s restrikčními enzymy. Pozitivní klon byl izolován a pojmenován jako p27d-3 (pUC18-FMD-CL-El-H6, SEQ ID NO: 20, Obrázek 7). Poté byl ověřen čtecí rámec pro CL-E1-H6 sekvenováním DNA.

V posledním kroku byl zkonstruován kyvadlový vektor pFPMT-CL-El-H6 tak, jak je popsáno níže. Fragment BcoRI/BamHI o 0,486 kb z p27d-3 (obsahující CL-E1 (192326)-H6) byl ligován s pFPMT121 (SEQ ID NO: 12, Obrázek 3) , štěpeným s BcoRI/BamHI. Pro reakci byla použita T4 ligáza (Boehringer) podle doporučení výrobce. DNA v ligačním vzorku byla precipitována s ethanolem a rozpuštěna v 10 μΐ H2O. Buňky B. coli DH5a'-F'byly transformovány s 10 μΐ ligačního vzorku a plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních k ampicilinu byla analyzována štěpením s BcoRI a BamHI. Plasmidový klon p37-5 (pFPMT-CL-El-H6; SEQ ID NO: 21, Obrázek 8) vykazoval požadované velikosti fragmentů o 0,486 kb a 9,961 kb. Správnost sekvence CL-E1H6 v p37-5 byla ověřena sekvenováním.

PŘÍKLAD 3

KONSTRUKCE KYVADLOVÝCH VEKTORŮ pFPMT-MFa-E2-H6 a pMPT-MFaE2-H6

Plasmidy pro transformaci Hansenula polymorpha byly zkonstruovány následujícím způsobem. Sekvence DNA kódující

MFot-E2s ( (aminokyseliny 384-673 z HCV E2)-VIEGR-His6 (SEQ ID NO: 5) byla izolována jako l,331kb EcoRI/BglII-fragment z plasmidu pSP72E2H6 (SEQ ID NO: 22, Obrázek 9). Tento fragment byl ligován buďto s FcoRI/BglII-štěpeným vektorem pFPMT121 (SEQ ID NO: 12, Obrázek C+2), nebo s EcoRI/BglIIštěpeným vektorem pMPT121 (SEQ ID NO: 23, Obrázek 10) s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer Mannheim) podle doporučení výrobce. Po transformaci E.coli a kontrole plasmidové DNA izolované z různých transformantů pomocí štěpení s restrikčními enzymy, byly pozitivní klony odebrány a výsledné kyvadlové vektory byly pojmenovány a jako pFPMT-MFa-E2-H6 (SEQ ID NO: 22, Obrázek 11) a pMPTMFct-E2-E6 (SEQ ID NO: 23, Obrázek 12) v uvedeném pořadí.

PŘÍKLAD 4

KONSTRUKCE KYVADLOVÉHO VEKTORU pFPMT-CL-E2-H6

Kyvadlový vektor pFPMT-CL-E2-H6 byl sestaven ve troj stupňovém postupu. Byl připraven meziproduktový konstrukt, ve kterém byla sekvence kódující E2 klonována za signální sekvenci α-amylázy z Schwanniomyces occidentalis. Toto bylo provedeno nepřerušovanou metodou klonování (Padgett, K. A. and Sorge, J. A. 1996).

Příprava DNA fragmentu kódujícího E2s-H6

Nejprve byla sekvence DNA kódující E2-H6 (aminokyseliny 384 až 673 z E2 HCV s prodloužením o linkerový peptid „VIEGR a 6 zbytků His, SEQ ID NO: 5) amplifikována z plasmidu pSP72E2H6 (SEQ ID NO: 24, Obrázek 11) metodou PCR. Použité primery byly označeny MF30E2/F a MF30E2/R a měly následující sekvence:

- primer MF30E2/F:

• φ φ φ · φ φ φ φ φ • φ φ φ

5'-agtcactcttca.aggcatacccgcgtgtcaqqaqqq-3' (SEQ ID NO. 26; místo EamllO4I je podtrženo, tečka označuje místo enzymatického štěpení; poslední kodón signální sekvence ze 5. occidentalis je vytištěn tučně; nepodtržené baze se připojují ke kodónům z E2 (aminokyseliny 384-390 z E2 HCV); - primer MF30E2/R:

5'-agtcactcttca.cagggatccttagtgatqqtqqtqatq-3' (SEQ ID NO: 27; místo Eamll04I je podtrženo, tečka označuje místo enzymatického štěpení; tučně vytištěné baze jsou komplementární k tučně vytištěným bažím primeru MF30-Rechts (viz níže); místo BamHI, které má být zavedeno do konstruktu, je vytištěno kurzívou; neoznačené sekvence se připojují ke stop kodónu a ke kodónům pro šest terminálních His z E2 (384-673)-VIEGR-H6 (SEQ ID NO: 5).

Reakční směs měla následující složení: v celkovém objemu 50 μΐ bylo obsaženo 20 ng l,33kb BcoRI/BglII fragmentu z pSPO72E2H6, 0,2 μΜ každého z primerů MF30E2/F a MF30E2/R, dNTP's (všechny 0,2 μΜ), lx Pufr 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázové směsi (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834).

Byl použit program PCR 3 sestávající z následujících stupňů:

1. denaturace: 5 min při 95° C

2. 10 cyklů denaturace 30 s při 95° C, 30 s nasedání při 65° C, a 1 min elongace při 68° C

3. terminace při 4° C.

Pak bylo ke vzorku získaného podle Programu 3 přidáno 10 μΐ 10 x pufru 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 40 μΐ H₂O a 5 μΐ [dATP, dGTP a dTTP • · ·*·«

4 ·

4 · • · <

• · · « • · 4 4 « 4 4 4 · · · ·*·<

4 4 · · · · (každý 2mM); 10 mM 5-methyl-dCTP] a bylo pokračováno s programem PCR 4, sestávajícím z následujících stupňů:

1. denaturace: 5 min při 95° C;

2. 5 cyklů 45 s denaturace při 95° C, 30 s nasedání při 65° C a 1 min elongace při 68° C;

3. terminace při 4° C.

Příprava akceptorového plasmidu odvozeného z pMF30

Druhý fragment pochází z plasmidu pMF30 (SEQ ID NO:

28, Obrázek 13), amplikonem byl téměř kompletní plasmid pMF30 s výjimkou kodónů pro zralou α-amylázu ze S. occidentalis, modifikace, významné pro klonování, byly zavedeny pomocí úpravy primerů. Byla použita následující sada primerů:

- primer MF30-Links:

5'-agtcactcttca.cctcttgtcaaaaataatcggttgag-3(SEQ ID NO:

29; ; místo Farní1041 je podtrženo, tečka označuje místo enzymatického štěpení; tučně vytištěné „cct je komplementární k tučně vytištěnému „aag v primerů MF30E2/F (viz výše); neoznačené baze se připojují k 26 koncovým bažím z kodónů α-amylázy ze S. occidentalis v pMF30;

-primer MF30-Rechts:

5'-agtcactcttca.ctgcaggcatgcaagcttggcg-3' (SEQ ID NO: 11; místo FamllO4I je podtrženo, tečka označuje místo enzymatického štěpení; tučně vytištěné „ctg je komplementární k tučně vytištěnému „cag v primerů MF30E2/R (viz výše); neoznačené baze se připojují k sekvencím pUC18 po směru od stop kodónů α-amylázy ze S. occidentalis v pMF30).

Reakční směs měla následující složení: v celkovém objemu 50 μΐ bylo obsaženo 20 ng BglII-linearizovaného

ΒΒ Β·Β«

Β· Β

ΒΒ ΒΒ ·· ·· ·’ pMF30, 0,2 μΜ každého z primerů MF30-Links a' MF30-Rechts, dNTP's (všechny 0,2 μΜ), lx Pufr 1 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázové směsi (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834). Byly použity shodné programy (Program 3 a 4) tak, jak jsou popsány výše, s výjimkou doby elongace, která byla v obou programech prodloužena z 1 minuty na 4 minuty.

Příprava vektoru pAMY-E2

Fragment DNA kódující E2s-H6 a z PCR získaný akceptorový plasmid odvozený z pMF30 byly z hlediska jejich velikostí zkontrolovány pomocí gelové elektroforézy na 1% agarózovém gelu. Produkty PCR byly purifikovány s purifikační soupravou pro produkty PCR (Qiagen) podle doporučení výrobce. Poté byly purifikované fragmenty odděleně štěpeny s Eam 11041. Ligace fragmentu E2s-H6 s akceptorovým plasmidem odvozeným z pMF30 byla prováděna s použitím T4 ligázy (Boehringer) podle doporučení výrobce. Ligační směs byla použita k transformaci buněk E. coli DH5ctF^z a plasmidová DNA z několika klonů byly analyzována EcoRI/BamHI štěpením. Byl vybrán pozitivní klon, jeho plasmid byly dále pojmenován jako pAMY-E2, a byl použit pro další modifikace tak, jak je popsáno níže.

Příprava vektoru pUC18-CL-E2-H6

Plasmid pAMY-E2 byl podroben PCR-řízené mutagenezi tak, aby byly kodóny pro signální sekvenci a-amylázy zaměněny s kodóny pro pre-sekvenci opičího lysozymu. Tato je dále označována jako „CL, a odpovídá prvním 15

99

9 9

9 999

9 9

9 99 ·· ···· • · · • · · ·

9 9 9

99

9

9 9 • 9 9 9

9 9999

9 9 aminokyselinám opičího lysozymového ORF (SEQ ID NO: 1). Pro mutagenezi byly použity následující primery:

- primer CL2 hin:

5'-tgcttcctaccactagcagcactaggacatacccqcqtqtcaqqaqqqqcaq-3' (SEQ ID NO: 30); a

- primer CL2 her:

5' -tagtactagtattagtaggcttcgcatggraattcactggccgtcgttttacaacgtc-3' (SEQ ID NO: 31).

Podtržené 5'-oblasti primerů obsahují sekvence DNA přibližně z jedné poloviny pre-sekvence opičího lysozymu. Primer CL2 her obsahuje restrikční místa Spěl (kurzíva) a FcoRI (tučně vytištěná kurzíva). Nepodtržené oblasti primerů se připojují ke kodónům aminokyselinových zbytků 384 až 392 z E2 (CL2 hin) nebo k „atg start kodónu za místo FcoRI až do pozice -19 (počítáno od místa FcoRI) promotoru FMD. Primery byly navrženy tak, aby byl amplifikován celý vektor pAMY-E2, a proto byly zaměněny kodóny signální sekvence α-amylázy za kodóny pre-sekvence opičího lysozymu.

Reakce PCR byla prováděna podle následujícího programu:

1. denaturace: 15 min při 95° C;

2. 35 cyklů 35 s denaturace při 95° C, 1 min nasedání při 60° C a 1 min elongace při 72° C;

3. terminace při 4° C.

Byla použita následující reakční směs: pAMY-E2 (1 ng/μΐ), 1 μΐ; primer CL2 hin (100 μΜ), 2 μΐ; primer CL2 her (100 μΜ) 2 μΐ; dNTP's (všechny 0,2 μΜ), 8 μΐ; H₂O , 76 μΐ; Pufr 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834) (10 x koncentrovaný), 10 μΐ; polymerázová směs

Expand Long Template PCR System (1 ϋ/μΐ), 0,75 μΐ.

$ • · 4

•4 ·· • · 444 • · · «

• 4 4 • · · ·

4 4 4 4444 · ♦ · • 4 ·

100

Výsledný produkt PCR byl kontrolován gelovou elektroforézou na 1% agarózovém gelu. Před ligací byl PCR fragment modifikován následovně. Vyčnívající konce 3'-A byly odstraněny s T4 polymerázou, což vedlo k zarovnání konců se 3'- a 5'-OH skupinami. Proto byl 1 μΐ polymerázy T4 (Boehringer, 1 U/μΙ) přidán ke zbývajícím 95 μΐ PCR reakční směsi společně se 4 μΐ dNTP's (každý 2,5 mM).

Vzorek byl inkubován po dobu 20 minut při 37° C. Následně byla DNA precipitována s ethanolem a rozpuštěna v 16 μΐ deionizované vody. Poté následovalo působení kinázy tak, aby byly připojeny 5'-fosfáty k produktu PCR se zarovnanými konci. K 16 μΐ rozpuštěného produktu PCR se zarovnanými konci byly přidány 1 μΐ T4 polynukleotid kinázy (Boehringer, 1 U/μΙ), 2 μΐ lOkrát koncentrovaného reakčního pufru pro polynukleotid kinázu (Boehringer) a 1 μΐ ATP (10 mM). Vzorek byl inkubován po dobu 30 minut při 37° C.

Vzorek podrobený působení kinázy byl následně oddělen na 1% agarózovém gelu. Pruh produktu byl izolován. DNA byla extrahována z agarózových řezů pomocí gelové extrakční soupravy (Gel Extraction kit Qiagen) podle doporuční výrobce. Padesát (50) ng purifikovaného produktu bylo samoligováno s použitím T4 ligázy (Boehringer) podle doporučení výrobce. Po inkubaci 16 hodin při 16° C byla DNA v ligační směsi precipitována s ethanolem a rozpuštěna ve 20 μΐ H₂O (ligační vzorek).

Buňky E. coli DH5aF'byly transformovány s 10 μΐ ligačního vzorku. Několik klonů rezistentních k ampicilinu bylo dále charakterizováno s restrikční analýzou izolované plasmidové DNA. Pozitivní klon byl označen jako pUC18-CL• 4 4

4 44 44 44 44 4

101

E2-H6 a byl použit pro další modifikace tak, jak je popsáno níže.

Příprava kyvadlového vektoru pFPMT-CL-E2-H6

Fragment EcoRI/BamHI o 0,966 kb byl izolován z pUC18CL-E2-H6 (nesoucí CL-E2(384-673)-VIEGR-H6) a byl ligován do plasmidu pFPMT121 (SEQ ID NO: 12, Obrázek 3) štěpeného s EcoRI/BamHI. Pro reakci byla použita ligáza T4 (Boehringer) podle doporučení výrobce. Ligační vzorek byl precipitován s ethanolem a rozpuštěn v 10 μΐ vody. Takto připravený vzorek byl použit k transformaci buněk E. coli DH5aF', pozitivní klony byly odebrány po restrikční analýze a příslušný plasmid byl označen jako pFPMT-CL-E2-H6 (SEQ ID NO: 32, Obrázek 14).

PŘÍKLAD 5

KONSTRUKCE KYVADLOVÉHO VEKTORU pFPMT-CL-K-H6-El

Konstrukce tohoto kyvadlového vektoru sestávala ze dvou stupňů.

V prvém stupni byl konstrukt pUC18-FMD-CL-H6-K-El-H6 sestaven místně řízenou mutagenezí. Plasmid pUC18-FMD-CLE1-H6 byl použit jako templát (SEQ ID NO: 20, Obrázek 7). Byly použity následující primery:

-Primer H6KRK hin neu:

5'-catcacaaatatgaggtgcgcaacgtgtccgggatgtac-3' (SEQ ID NO:

37) .

-Primer H6KRK her neu:

5'-gtgatggtggtgtcctagtgctgctagtggtaggaagcatag-3' (SEQ ID NO:

38) .

(Baze poskytující přídavné kodóny jsou podtrženy).

• · · · · · · · · • · · · ···· · · · · • · ··· ·· ··· ·'···· • · · · ···· · · · ·· ·· ·· · · ·· ·

102

Reakční směs měla následující složení: pUCl8-FMD-CLE1-H6 (2 ng/μΐ), 1 μΐ; primer HCK hin neu (100 μΜ) , 2 μΐ; primer H6KRK her neu (100 μΜ), 2 μΐ; dNTP's (každý 2,5mM), μΐ; H₂0, 76 μΐ; Expand Long Template PCR System (Boehringer; Cat No 1681 834) Pufr 2 (10 x koncentrovaný), 10 μΐ; Expand Long Template PCR System Polymerase mixture (polymerázová směs, 1 U/μΙ), 0,75μ1.

Byl použit program PCR sestávající z následujících stupňů:

1. denaturace: 15 min při 95° C

3. terminace při 4° C.

Alikvot vzorku z PCR byl analyzován na 1% agarózovém gelu ke kontrole velikosti, která byla správná (~ 4,2 kb).

Poté byly z produktu PCR odštěpeny přečnívající konce 3'-A reakcí s T4 polymerázou, což vedlo k zarovnání konců se skupinami 3^Z- a 5'- OH. Proto byl 1 μΐ polymerázy T4 (Boehringer, 1 U/μΙ) přidán ke zbývajícím 95 μΐ PCR reakční směsi společně se 4 μΐ dNTP's (každý 2,5 mM). Vzorek byl inkubován po dobu 20 minut při 37° C. Následně byla DNA precipitována s ethanolem a rozpuštěna v 16 μΐ H₂O. Poté následovalo působení kinázy tak, aby byly připojeny 5'fosfáty k produktu PCR se zarovnanými konci. K 16 μΐ rozpuštěného produktu PCR se zarovnanými konci byly přidány 1 μΐ T4 polynukleotid kinázy (Boehringer, 1 U/μΙ), 2 μΐ lOkrát koncentrovaného reakčního pufru pro polynukleotid kinázu (Boehringer) a 1 μΐ ATP (10 mM). Vzorek byl inkubován po dobu 30 minut při 37° C.

• · · · · · ·· ·· ·· · • · · · · · · · · • · · · ···· · ··· • · · · · ·· ··· · ···· • · · · · · · · ·· · • · · · · · 9 9 · · ·

103

Vzorek byl následně nanesen na 1% agarózový gel a správný pruh produktu byl izolován pomocí gelové extrakční soupravy (Qiagen) podle doporuční výrobce. Padesát (50) ng purifikovaného produktu bylo samoligováno s použitím T4 ligázy (Boehringer) podle doporučení výrobce. Po inkubaci 72 hodin při 16° C byla DNA v ligační směsi precipitována . s ethanolem a rozpuštěna v 10 μΐ vody.

Buňky E. coli DH5aF'byly transformovány s 5 μΐ ligačního vzorku. Plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních k ampicilinu byly analyzována štěpením s restrikčními enzymy a pozitivní klon byl odebrán a odpovídající plasmid byl pojmenován jako pUC18.FMD.CL-H6E1-K-H6 (SEQ ID NO: 39, Obrázek 17).

Ve druhém kroku byl zkonstruován přenosový vektor pomocí dvoufragmentové ligace. V následujícím způsobu konstrukce byly použity fragmenty s Bell kohezivními konci. Vzhledem k tomu, že Bell může štěpit svoje místo pouze na nemethylované DNA, byl kmen E. coli dam' transformován s plasmidy pUC18-FMD-CL-H6-K-El-H6 (SEQ ID NO: 39, Obrázek 17) a pFPMT-CL-El (SEQ ID NO: 36, Obrázek 16). Z každé transformace byly odpíchnuty kolonie rezistentní na ampicilin, pěstovány v tekuté kultuře a nemethylované plasmidové DNAs byly připraveny pro další použití. Byly připraveny fragment Bcll/Hindlll o 1,273 kb z nemethylovaného plasmidu pUC18-FMD-CL-H6-K-El-H6 (nesoucí promotor FMD, kodóny z jednotky CL-H6-K a start z El) a fragment Bcll/Hindlll o 6,057 kb z plasmidu pFPMT-CL-El (nesoucí chybějící část čtecího rámce El začínající od místa Bell, bez C-koncové identifikátorové značky (tag)

His, stejně tak, jako prvky umístěné v pFPMT121 s výjimkou promotoru FMD), které byly společně ligovány po dobu 72 • · • · ·*»9 ·♦ · • · · 9 9 · 9 9 9

9 · ····· ···· • · · 9 9 9 9 9 9 9 · 99*9

9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 •9 99 99 99 99 9

104 hodin při 16° C s použitím ligázy T4 (Boehringer) v celkovém objemu 20 μΐ podle doporučení výrobce. Následně byla ligační směs nanesena na kousek nitrocelulózové membrány plovoucí na sterilní deionizované vodě tak, aby došlo k odsolení ligační směsi (inkubace po dobu 30 minut při teplotě místnosti). . Buňky E.coli TOP10 byly transformovány elektroporací 5 μΐ odsoleného vzorku. Plasmidová DNA z několika výsledných kolonií rezistentních k ampicilinu byla analyzována štěpením s restrikčními enzymy. Pozitivní klon byl odebrán a pojmenován jako pFPMTCL-H6-K-E1 (SEQ ID NO: 40, Obrázek 18).

PŘÍKLAD 6

TRANSFORMACE HANSENULA POLYMORPHA A SELEKCE TRANSFORMANT

Kmen H. polymorpha RB11 byl transformován (postupem „PEG-Mediated DNA uptake protocol v podstatě tak, jak je popsán v Klebe, R J. et al. 1983, s modifikací podle Roggenkamp, R. et al. 1986) s odlišnými základními vektory, které jsou popsány v Příkladech 1 až 5. Pro každou transformaci bylo vybráno 72 uracil-prototrofních kolonií a použito pro přípravu kmene následujícím postupem. Každá kolonie byla inokulována do 2 ml tekuté kultury a pěstována v testovacích zkumavkách po dobu 48 hodin (37° C; 160 otáček za minutu, úhel 45° ) v selekčním médiu (YNB/glukóza, Difco). Tento stupeň je označen jako první stupeň pasážování. Alikvoty kultur o 150 μΐ z prvního stupně pasážování byly použity k inokulaci 2 ml čerstvého YNB/glukózového média. Opětovně byly kultury inkubovány tak, jak je popsáno výše (druhý stupeň pasážování). Celkem bylo provedeno osm takových stupňů pasážování. Alikvoty kultur po třetím a osmém stupni pasážování byly použity k inokulaci 2 ml neselektivního média YPD (Difco). Po ·· 99 9

9 9 9 · · 9 9 9

9 9 9 9 9 99 9 9 9 9

9 999 9 9 999 99999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 9 9 99 9

105 inkubaci 48 hodin při 37° C (160 otáček za minutu; úhel 45°; takzvaný první stabilizační krok) byly 150μ1 alikvoty těchto YPD kultur použity pro inokulaci čerstvých 2ml YPD kultur, které byly inkubovány tak, jak je popsáno výše (druhý stabilizační krok). Alikvoty kultur z druhého stabilizačního kroku byly pak rozetřeny na plotny obsahující selekční YNB/agar. Plotny byly inkubovány po dobu čtyř dnů, dokud nebyly pozorovatelné makroskopické kolonie. Jednotlivé kolonie z každé separace, přenesené do jamek kultivačních destiček, byly označeny jako kmen a použity pro další analýzu exprese.

Analýza exprese byla provedena v kulturách pěstovaných v třepaných, maloobjemových nádobách. Byla odpíchnuta kolonie z výše uvedených YNB/agarových ploten a inokulována do 2 ml YPD a inkubována po dobu 48 hodin tak, jak je popsáno výše. Tento 2ml alikvot byl použit jako inokulační kultura do 20ml třepané lahvové kultury. YPGlycerol (1%) byl použit jako médium a třepané láhve byly inkubovány na rotační třepačce (200 otáček za minutu, 37° C) . Po 48hodinovém růstu bylo ke kultuře přidáno 1 % MeOH pro indukci expresní kazety. V různých časových intervalech byly odebírány buněčné pelety z lml alikvotů a tyto pak byly uchovávány při -20° C do další analýzy. Specifická exprese proteinů byly analyzována s SDS-PAGE/Western blottingem. K tomu byly buněčné pelety rozpuštěny ve vzorkovém pufru (TrisHCl-SDS) a inkubovány po dobu > 15 minut při 95° C. Proteiny byly separovány na 15% polyakrylamidovém gelu a přeneseny (blotovány) (wet-blot; bikarbonátový pufr) na nitrocelulózové membrány. Bloty byly vyhodnoceny s použitím specifických myších anti-El (IGH 201) nebo myších anti-E2 (IGH 216, popsaných v Maertens et al. ve W096/04385) protilátek, jako první protilátkou, a

9 • · A

A AAA • A A AAAA

AAA AA A ·* ··

A 9 9

9 999

9 9 9 9

9 9 A ·· AA

Α· ···· • · ·

AAA • A 9

9 9 9

99

106 králičí anti-myší AP byla použita jako druhá protilátka. Barvení bylo provedeno s NBT-BCIP. Pozitivní kmeny byly odebrány pro další pokusy.

Pět z těchto pozitivních klonů bylo použito v pokusu vyhodnocujícím expresi v třepaných lahvových kulturách. Kolonie příslušného kmene byla odpíchnuta z plotny YNB a byla použita k inokulaci 2 ml YPD. Takovéto kultury byly inkubovány tak, jak je popsáno výše. Buněčné suspenze byly použity k inokulaci druhé zdrojové kultury, která byla v 500 ml třepaných lahvích s obsahem 100 ml média YPD. Třepané láhve byly inkubovány na rotační třepačce po dobu 48 hodin při 37° C a 200 otáčkách za minutu. Alikvoty o objemu 25 ml z této druhé zdrojové kultury byly použity k inokulaci 250 ml YPGlycerolového (1%) média a byly inkubovány ve dvoulitrových třepaných lahvích za výše popsaných podmínek. 48 hodin po inokulaci bylo přidáno 1 % MeOH (k indukci promotoru) a třepané láhve byly dále inkubovány za výše popsaných podmínek. 24 h po indukci byl pokus zastaven a buněčné pelety byly shromážděny centrifugací. Hladina exprese v pěti odlišných klonech byla analyzována s SDS-PAGE/Western blottingem (za výše uvedených podmínek). Titrační řady z každého klonu byly naneseny na gel a nejproduktivnější klon byl vybrán pro další fermentační a purifikační zkoušky.

Bylo s překvapením zjištěno, že H. polymorpha, kvasinkový kmen velice blízce příbuzný s Pichia pastoris (Gellissen, G. 2000), je schopen exprimovat proteiny HCV v podstatě bez hyperglykosylace, tedy se sloučeninami cukrů o srovnatelnému rozsahu, jaký mají obalové proteiny HCV, exprimované savčími buňkami infikovanými s HCV rekombinantním virem vaccinia.

• * · · · · ·· · » ·· ·· ·· ·

107

Kmen Hansenula polymorpha RB 11 byl uložen 19. dubna 2002 za podmínek Budapešťské smlouvy v Mycothěque de l'UCL (MUCL), Universitě Catholique de Louvain, Laboratoire de mycologie, Plače Croix du Sud 3 bte 6, B-1348 Louvain-laNeuve, Belgium, a má MUCL přírůstkové číslo MUCL43805.

PŘÍKLAD 7

KONSTRUKCE VEKTORU pSYlaMFElsH6a

Plasmid pro expresi v S. cerevisiae byl zkonstruován následovně. Sekvence kódující El byla izolována jako Nsll/Eco521 fragment z plasmidu pGEMT-ElsH6 (SEQ ID NO: 6, Obrázek 1), u kterého bylo provedeno zarovnání konců (s použitím T4 DNA polymerázy) a byl klonován do vektoru pYIG5 (SEQ ID NO: 41, Obrázek 19) s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer) podle doporučení výrobce. Klonování bylo provedeno tak, že fragment kódující Els-H6 byl připojen přímo a ve čtecím rámci sekvence kódující aMF. Ligační směsí byly transformovány buňky E. coli DH5aF'. Následně byla plasmidová DNA z několika klonů rezistentních na ampicilin analyzována s restrikčním štěpením a pozitivní klony byly odebrány a pojmenovány jako pYIG5ElH6 (ICCG3470; SEQ ID NO: 42, Obrázek 20).

Expresní kazeta (obsahující aMF-sekvenci a oblast kódující Els s His-identifikátorovou značkou) byla přenesena jako BamHI fragment (2790 bp) z pYIG5ElH6 do kyvadlového vektoru psYl pro E. coli/S. cerevisiae štěpeného s BamHI (SEQ ID NO: 21, Obrázek 43). Ligace byla prováděna s T4 DNA ligázou (Boehringer.) podle doporučení výrobce. Buňky E. coli DH5aF' byly transformovány s ligační směsí a plasmidová DNA z několika kolonií

A A · · · · AAA • · · A AAAA « A · A

A A AAA AA AAA ΑΑΑΑΑ

A AA A A AA A A A A

AA AA AA AA AA A

108 rezistentních na ampicilin byla analyzována štěpením s restrikčními enzymy. Pozitivní klon byl odebrán a pojmenován jako pSYlaMFElsH6a (ICCG3479; SEQ ID NO: 44, Obrázek 22).

PŘÍKLAD 8

KONSTRUKCE VEKTORU pSYYIGSE2H6

Plasmid pro expresi v S. cerevisiae pSYYIGSE2H6 byl zkonstruován následovně. Sekvence kódující E2 byla izolována jako Sáli/KpríL fragment z pBSK-E2sH6 (SEQ ID NO: 45, Obrázek 23), který byl připraven jako fragment se zarovnanými konci (s použitím T4 DNA polymerázy) a následně byl klonován do vektoru pYIG5 (SEQ ID NO: 41, Obrázek 19) s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer) podle doporučení výrobce. Vlastní klonování bylo provedeno tak, že fragment kódující E2-H6 byl připojen přímo a do čtecího rámce aMFkódující sekvence. Buňky E. coli DH5aF' byly pak transformovány s ligační směsí, plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních na ampicilin byla analyzována s restrikčním štěpením a pozitivní klon byl odebrán a pojmenován jako pYIG5HCCL-22aH6 (ICCG2424; SEQ ID NO: 46, Obrázek 24).

Kazeta pro expresi (obsahující aMF-sekvenci a oblast kódující E2 (384-673) s identifikátorovou značkou His) byla přenesena jako BamHI fragment (3281 bp) z pYIG5HCCL-22aH6 do kyvadlového vektoru pSYl pro E. coli/S. cerevisiae, otevřeného s BamHI (SEQ ID NO: 43, Obrázek 21). Ligace byla provedena s T4 DNA ligázou (Boehringer) podle doporučení výrobce. Buňky E. coli DH5aF' byly pak transformovány s ligační směsí, plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních na ampicilin byla analyzována s restrikčním • · • · · · • ·

109 štěpením a pozitivní klon byl odebrán a pojmenován jako pSYYIGSE2H6 (ICCG2466; SEQ ID NO: 47, Obrázek 25).

PŘÍKLAD 9

KONSTRUKCE VEKTORU pSYlYIG7Els

Plasmid pSYlYIG7Els pro expresi v S. cerevisiae byl zkonstruován následujícím způsobem. Sekvence kódující El byla izolována jako Nsll/Eco52l fragment z pGEMT-Els (SEQ ID NO: 6, Obrázek 1), který byl připraven jako fragment se zarovnanými konci, a byl klonován do vektoru pYIG7 (SEQ ID NO: 48, Obrázek 26) s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer) podle doporučeni výrobce. Vlastní klonování bylo provedeno tak, že fragment kódující El byl připojen přímo a do čtecího rámce aME-kódující sekvence. Buňky E. coli DH5aF' byly pak transformovány s ligační směsí, plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních na ampicilin byla analyzována s restrikčním štěpením a pozitivní klon byl odebrán a pojmenován jako pYIG7El (SEQ ID NO: 49, Obrázek 27).

Kazeta pro expresi (obsahující vedoucí sekvenci CL a oblast kódující El (192-326) byla přenesena jako BamHI fragment (2790 bp) z pYIG7El do kyvadlového vektoru pSYl pro E. coli/S. cerevisiae, štěpeného s BamHI (SEQ ID NO: 43, Obrázek 21). Ligace byla provedena s T4 DNA ligázou (Boehringer) podle doporučení výrobce. Buňky E. coli DH5aF' byly pak transformovány s ligační směsí, plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních na ampicilin byla analyzována s restrikčním štěpením. Pozitivní klon byl odebrán a pojmenován jako pSYlYIG7Els (SEQ ID NO: 50, Obrázek 28).

• · • ·

110

PŘÍKLAD 10

TRANSFORMACE SACCHAROMYCES CEREVISIAE A SELEKCE

TRANSFORMANT

Proto, aby byly překonány problémy hyperglykosylace, které jsou často popisovány pro proteiny zvýšeně exprimované v Saccharomyces cerevisiae, byl použit screening mutant. Tento screening vycházel z metody popsané Ballou (Ballou, L. et al. 1991), ve které jsou selektovány spontánní recesivní mutanty rezistentní k orthovanadičnanu. Počáteční selekce kmenů byla provedena na základě glykosylačního vzoru po působení invertázy tak, jak byl pozorován po základní gelové elektroforéze. Pro další pokusy pro expresi rekombinantních proteinů byl odebrán kmen, který měl sníženou schopnost glykosylace a který byl pojmenován jako IYCC155. Podstata mutace nebyla dále zkoumána.

Uvedený glykosylačně-deficientní kmen IYCC155 byl transformován s plasmidy, tak jak je popsáno v Příkladech 7 až 9, konkrétně metodou s lithium acetátem popsanou Elble (Elble, R. 1992). Několik Ura-komplementovaných kmenů bylo odpíchnuto ze selektivní plotny obsahující YNB + 2% agar (Difco) a použito k inokulaci 2 ml YNB + 2 % glukózy. Kultury byly inkubovány po dobu 72 hodin při 37° C, 200 otáčkách za minutu na kruhové třepačce, a supernatanty z kultury á vnitrobuněčné frakce byly analyzovány z hlediska exprese El Western blottingem, prováděným se specifickou myší anti-El monoklonální protilátkou (IGH 201). Pro další pokusy byl odebrán klon o nejvyšší produkci.

···· • · · · · · ··· • · · · · · · · · · · · • · ··· ·· · 4 · 4 4 4 4 4 • 444 4 4 4 4 4 4 ·

4 ·· 4 4 4 4 4 4 *

111

Expresi proteinů ve zde použité glykosylačně deficientní mutantě S cerevisiae omezují suboptimální růstové charakteristiky takovýchto kmenů, což vede k nižšímu výtěžku biomasy a tím k nižšímu výtěžku požadovaných proteinů ve srovnání s divokými typy kmenů S. cerevisiae. Přesto výtěžek požadovaných proteinů byl podstatně vyšší než v savčích buňkách.

PŘÍKLAD 11

KONSTRUKCE VEKTORU pPICZalphaD'ElsH6 A pPICZalphaE'ElsH6

Kyvadlový vektor pPICZalphaE'ElsH6 byl zkonstruován z výchozího vektoru pPICZalphaA (Invitrogen; SEQ ID NO: 51, Obrázek 29). V prvém kroku byl uvedený vektor upraven tak, aby umožnil klonování sekvence kódující El přímo za štěpící místo KEX2 nebo STE13 proteáz (posttranslační úpravové proteázy), v uvedeném pořadí. Proto byl pPICZalphaA štěpen s Xhol a Notl. Produkt štěpení byl separován na 1% agarózovém gelu a fragment o 3519 kb (větší část vektoru) byl izolován a purifíkován s použitím soupravy pro gelovou extrakci (gel extraction kit, Qiagen). Poté byl fragment ligován s použitím T4 polymerázy (Boehringer) podle doporučení výrobce, a to v přítomnosti specifických oligonukleotidů poskytujících pPICZalphaD' (SEQ ID NO: 52, Obrázek 30) nebo pPICZalphaE' (SEQ ID NO: 53, Obrázek 31).

Byly použity následující oligonukleotidy:

- pro konstrukci pPICZalphaD':

8822: 5'-TCGAGAAAAGGGGCCCGAATTCGCATGC-3' (SEQ ID NO: 54); a 8823: 5 ' -GGCCGCATGCGAATTCGGGCCCCTTTTC-3' (SEQ ID NO: 55)., které po připojení poskytují linkerový oligonukleotid:

······ ·· ·· ·· · ·· · · · · · · · • · · ····· · · · · • · ··· ·· · · · · ···· • · · · · · · · · · · «· ·· ·· ·· «· ·

112

TCGAGAAAAGGGGCCCGAATTCGCATGC (SEQ ID NO: 54)

CTTTTCCCCGGGCTTAAGCGTACGCCGG (SEQ ID NO: 55)

- pro konstrukci pPICZalphaE':

8649: 5'-TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCCTGCAGCATATGC-3' (SEQ ID NO:56)

8650: 5'-GGCCGCATATGCTGCAGGCTTCAGCCTCTCTTTTC-3' (SEQ ID NO 57), které po připojení poskytují linkerový oligonukleotid

TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCCTGCAGCATATGC (SEQ ID NO:56)

CTTTTCTCTCCGACTTCGGACGTCGTATACGCCGG (SEQ ID NO: 57).

Uvedené kyvadlové vektory pPICZalphaD'a pPICZalphaE' mají nově zavedená klonovací místa za štěpícím místem příslušných úpravových proteáz KEX2 a STE13. Sekvence kódující E1-H6 byly izolovány jako Nsll/Eco52I fragment z plasmidů pGEMT-ElsH6 (SEQ ID NO: 6, Obrázek 1). Fragment byl purifikován s použitím soupravy pro gelovou extrakci (Qiagen) po separaci produktu štěpení na 1% agarózovém gelu. Výsledný fragment byl připraven se zarovnanými konci (použitím T4 DNA polymerázy) a byl ligován buďto do pPICZalphaD'nebo do pPICZalphaE'přímo za příslušné místo štěpení úpravové proteázy.

Buňky E. coli TOP10F'byly transformovány s ligačními směsmi a plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních k zeocinu byla analyzována štěpením s restrikčními enzymy. Pozitivní klony byly odebrány a pojmenovány jako pPICZalphaD'ElsH6 (ICCG3694; SEQ ID NO: 58, Obrázek 32) a pPICZalphaE'ElsH6 (ICCG3475; SEQ ID NO: 59, Obrázek 33), v uvedeném pořadí.

• · · • · · · · • · · · · • · · · ·

113

PŘÍKLAD 12

KONSTRUKCE VEKTORU pPICZalphaD'E2sH6 A pPICZalphaE'E2sH6

Kyvadlové vektory pPICZalphaD'a pPICZalphaE' byly zkostruovány způsobem popsaným v Příkladu 11.

Sekvence kódující E2-H6 byla izolována jako Sall/Kpnl fragment z plasmidu pBSK-E2sH6 (SEQ ID NO: 45, Obrázek 23). Fragment byl purifikován s použitím soupravy pro gelovou extrakci (Qiagen) po separaci produktu štěpení na 1% agarózovém gelu. Výsledný fragment byl připraven se zarovnanými konci (použitím T4 DNA polymerázy) a ligován do buďto pPICZalphaD' nebo do pPICZalphaE'přímo za příslušné štěpící místo úpravové proteázy.

Buňky E. coli TOPIOF' byly transformovány s ligační směsí a plasmidová DNA z několika kolonií rezistentních k zeocinu byla analyzována štěpením s restrikčními enzymy. Pozitivní klony byly odebrány a pojmenovány jako pPICZalphaD'E2sH6 (ICCG3692; SEQ ID NO: 60, Obrázek 34) a pPICZalphaE'E2sH6 (ICGG3476; SEQ ID NO: 61, Obrázek 35), v uvedeném pořadí.

PŘÍKLAD 13

TRANSFORMÁTICE PICHIA PASTORIS A SELEKCE TRANSFORMANT

Kyvadlové plasmidy pro P. pastoris, popsané v Příkladech 11 a 12, byly transformovány do buněk P. pastoris podle doporučení výrobce (Invitrogen). Kmeny produkující El a E2 byly odebrány pro další charakterizaci.

Obalové proteiny HCV byly exprimovány v P. pastoris, což je kvasinkový kmen, o kterém je dobře známo, že u něho je normálně hyperglykosylace nepřítomna (Gellissen, G.

• · «··· ·· · · .·· » · · ♦ · * · • · · · ···· · ··· • · ·«· · · · · · ····· ···· ···· * · · • · · · ·· ·· ·· *

114

2000) a již dříve byl použit pro expresi proteinu E z viru tropické horečky v podobě fúzního proteinu GST (Sugrue, R. J. et al. 1997). Obalové proteiny HCV, rezultující z exprese v P. pastoris, pozoruhodně vykazovaly srovnatelnou glykosylaci, jaká je pozorována u divokých typů kmenů Saccharomyces. Konkrétněji, obalové proteiny HCV, produkované v P. pastoris, jsou hyperglykosylované (podle molekulové hmotnosti produktů exprese stanovené ve Western-blottingu proteinů izolovaných z transformovaných buněk P. pastoris) .

PŘÍKLAD 14

PODMÍNKY KULTIVACE PRO SACCHAROMYCES CEREVISIAE, HANSENULA POLYMORPHA A PICHIA PASTORIS

Saccharomyces cerevisiae

Příprava buněčné banky

Z vybraného rekombinantního klonu byla připravena základní buněčná banka a pracovní buněčná banka.

Zmražené vzorky ve fiólách byly připraveny ze střední exponenciální fáze růstu kultury, pěstované v třepaných lahvích (podmínky inkubace byly shodné jako u inokulačních kultur, viz níže). Jako kryoprotektivní látka byl přidán glycerol (na konečnou 50% koncentraci).

Fermentace

Inokulační kultury byly získány z lahviček se zmraženými buňkami z pracovní banky a byly pěstovány v 500 ml média (YNB doplněné s 2 % sacharózy, Difco) ve 21itrových Erlenmeyerových třepaných baňkách při 37° C, 200 otáčkách za minutu a po dobu 48 hodin.

9999 99 99 99 · • 9 9 99« · * 9 • 9 9 9 9 ··· · 9 · 9 • · 9 · · 99 999 99999

9999 9999 «9 ·

99 99 99 <9 9

115

Fermentace byly běžně prováděny ve fermentorech Biostat C s pracovním objemem 15 litrů (B. Braun Int., Melsungen, Germany). Fermentační médium obsahovalo 1 % kvasničného extraktu (Yeast Extract), 2 % Peptonu a 2 % sacharózy jako zdroje uhlíku. Jako protipěnící činidlo byl použit polyethylenglykol.

Teplota, pH a rozpuštěný kyslík byly běžně během fermentace kontrolovány a řízeny, použitelné parametry jsou souhrnně uvedeny v Tabulce 1. Rozpuštěný kyslík byl kaskádovitě řízen pomocí míchání/provzdušnění. Hodnota pH byla řízena přídavky NaOH (0,5M) nebo roztoku H3PO4 (8,5%).

Tabulka 1. Specifické parametry pro fermentace S.

cerevisiae

Parametr	Rozmezí
teplota	33 - 37° C
pH	4,2 - 5,0
DO (fáze růstu)	10 - 40 % nasycení vzduchem
DO (indukce)	0-5 %
aerace	0,5 -1,8 vvm*
míchání	150 - 900 rpm

* výměna objemu za minutu rpm - otáčky za minutu

Fermentace byla zahájena přidáním 10 % inokulační kultury. Během fáze růstu byla sledována koncentrace sacharózy analýzou HPLC off-line (Polysphere Column OAKC Merck) . :

Během fáze růstu byl obsah rozpuštěného kyslíku řízen kaskádovým řízením (míchání/provzdušnění). Po úplném · 9 · ··

9 zmetabolizování sacharózy byla produkce heterologních proteinů řízena endogenně produkovaným ethanolem doplněným s postupně přidávaným EtOH tak, aby byla koncentrace udržována přibližně na hodnotě 0,5 % (HPLC analýza offline, sloupec „polyshper OAKC) Během této indukční fáze byl rozpuštěný kyslík kontrolován a udržován pod 5% nasycením vzduchem, ruční úpravou nebo úpravou rychlosti provzdušňování a rychlosti míchání.

Fermentační produkty byly typicky sklízeny 48 až 72 hodin po indukci zakoncentrováním s tangenciální průtokovou filtrací, následovanou centrifugací zakoncentrovaných buněčných suspenzí tak, aby byly získány buněčné pelety. Pokud nebyly buněčné pelety analyzovány bezprostředně, byly uchovávány při -70° C.

Hansenula polymorpha

Příprava buněčné banky

Zmražené vzorky ve fiólách byly připraveny ze střední exponenciální fáze růstu kultury, pěstované v třepaných lahvích (podmínky inkubace byly shodné jako u inokulačních kultur, viz níže). Jako kryoprotektivní látka byl přidán glycerol (na konečnou 50% koncentraci) .

Fermentace

Inokulační kultury byly získány z lahviček se zmraženými buňkami (-7 0° C) z pracovní banky a byly pěstovány v 500 ml média (YNB, Difco) ve 21itrových Erlenmeyerových třepaných baňkách při 37° C, 200 otáčkách za minutu a po dobu 48 hodin.

·· ··*· ·· ·· * • · 9 9 9 9 9 * 9

9 9 9 9 99· 9 9 9 9

9 9 · 9 99 999 9 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

117

Fermentace byly běžně prováděny ve fermentorech Biostat C s pracovním objemem 15 litrů (B. Braun Int., Melsungen, Germany). Fermentační médium obsahovalo 1 % kvasničného extraktu (Yeast Extract), 2 % Peptonu a 1 % glycerolu jako zdroje uhlíku. Jako protipěnící činidlo byl použit polyethylenglykol.

Teplota, pH , přívod vzduchu a rozpuštěný kyslík byly běžně během fermentace kontrolovány a řízeny, použitelné parametry jsou souhrnně uvedeny v Tabulce 2. Rozpuštěný kyslík byl řízen mícháním. Hodnota pH byla řízena přídavky NaOH (0,5M) nebo roztoku H3PO₄ (8,5%).

Tabulka 2. Specifické parametry pro fermentace H.

polymorpha

Parametr	Rozmezí
teplota	30 - 40° C
pH	4,2 - 5,0
DO (fáze růstu)	10 - 40 % nasycení vzduchem
aerace	0,5 - 1,8 vvm*
míchání	150 - 900 rpm

* výměna objemu za minutu rpm - otáčky za minutu

Fermentace byla zahájena přidáním 10 % inokulační kultury. Během fáze růstu byla sledována koncentrace glycerolu offline (Polysphere Column OAKC Merck) a 24 hodin po úplném spotřebování glycerolu bylo přidáno 1 % methanolu, aby byla indukována exprese heterologních proteinů. Fermentační produkty byly sklízeny 24 hodin po indukci zakoncentrováním s tangenciální průtokovou filtrací, následovanou φφ φφφφ ·· ·« φ· · φ φ φ * · • φ · φ · · · · φ φ·· φ φ φφφ φφ φφφ φ φφφφ • ΦΦΦ φφφφ φφ φ φφ φφ φφ φφ ·· ♦

118 centrifugací zakoncentrovaných buněčných suspenzí tak, aby byly získány buněčné pelety. Pokud nebyly buněčné pelety analyzovány bezprostředně, byly uchovávány při -70° C.

Pichia pastoris

Pokusy s produkcí proteinů v rekombinantní Pichia pastoris byly v malém měřítku prováděny v kulturách ve třepaných lahvích. Inokulační kultury byly pěstovány přes noc v médiu YPD (Difco). Výchozí pH média bylo upraveno na 4,5. Třepané láhve byly inkubovány na rotační třepačce při 200 - 250 otáčkách za minutu a 37° C.

Produkce v malém měřítku byla typicky prováděna v objemu 500 ml ve 21itrových baňkách a byla zahájena s 10% inokulací do média pro expresi, obsahujícím 1 % kvasničného extraktu (Yeast extract), 2 % Peptonu (oba Difco) a 2 % glycerolu jako zdroje uhlíku. Podmínky pro inkubaci byly shodné jako pro inokulační kulturu. Indukce byla zahájena přidáním 1 % MeOH přibližně 72 hodin po inokulaci. Buňky byly sklizeny 24 hodin po indukci pomocí centrifugace.

Pokud nebyly buněčné pelety analyzovány bezprostředně, byly uchovávány při -70° C.

PŘÍKLAD 15

ODSTRANĚNÍ VEDOUCÍHO PEPTIDU Z PROTEINŮ MFa-El-H6 A MFaE2-H6, EXPRIMOVANÝCH VE VYBRANÝCH KMENECH KVASINEK

Dále byly analyzovány produkty exprese proteinových konstruktů HCV El a E2 s vedoucí sekvencí a-párovacího faktoru (a MF) ze S. cerevisiae v Hansenula polymorpha a v glykosylačně negativním kmenu Saccharomyces cerevisiae. Protože jak genotyp lb HCV Els (aminokyseliny 192-326), tak •9 99*9 • 9 99 99 9 · 999 9 99 • 9 · 99999 9999

9 99· 99 999 9 9999

9999 9999 99 9

99 99 ·· 99 9

119

HCV E2s (aminokyseliny 383-673, prodloužený se sekvencí VIEGR (SEQ ID NO: 69)) byly exprimovány s „his identifikátorovou značkou na C-konci (H6, HHHHHH, SEQ ID NO: 63 - tyto proteiny jsou dále v tomto Příkladu označovány jako aMF-El-H6 a aMF-E2-H6), rychlá a účinná purifikace produktů exprese po solubilizaci buněk kvasinek s guanidinium chloridem(GuHCl) byla prováděna na Ni-IDA (Ni-iminodioctová kyselina). Stručně řečeno, buněčné pelety byly resuspendovány v 50 mM fosfátu, 6 M GuHCl, pH 7,4 (9 objemů/g buněk). Proteiny byly sulfonovány přes noc při teplotě místnosti (room temperature, RT) v přítomnosti 320 mM (4% hmotn./objem) siřičitanu sodného a 65 mM (2% hmotn./objem) tetrathionátu sodného. Lyzát byl po jednom cyklu zmražení-roztátí vyčištěn centrifugací (10 000 g, 30 min , 4° C) a k supernatantu byly přidány Empigen (Albright & Wilson, UK) a imidazol na konečnou koncentraci 1 %(hmotn./objem) a 20 mM, v uvedeném pořadí. Vzorek byl filtrován (0,22 μΜ) a nanesen na sloupec Ni-IDA Sepharose FF, který byl ekvilibrován s 50 mM fosfátem, 6 M GuHCl, 1% Empigen (pufr A) doplněným s 20 mM imidazolu. Sloupec byl postupně promyt s pufrem A obsahujícím 20 mM a 50 mM imidazolu, v uvedeném pořadí, dokud absorbance při 280 nm nedosáhla základní úrovně. Produkty s His-značkou byly eluovány působením pufru D, 50 mM fosfát, 6M GuHCl, 0,2 % (pro El) nebo 1 % (pro E2) Empigen, 200 mM imidazol. Eluované materiály byly analyzovány s SDS-PAGE a Westernblottingem s použitím specifických monoklonálních protilátek namířených proti El (IGH201), nebo E2 (IGH212).

Produkty El byly bezprostředně analyzovány Edmanovým odbouráváním.

· · • · • · ···· • φ · · · • · · · • 99 ··

9 · « · · · • 99999

9 ·

120

Vzhledem k tomu, že SDS-PAGE odhalila už velice komplexní obraz proteinových pruhů pro E2, byla prováděna další frakcionace s gelovou chromatografií (size exclusion chromatography). Eluát Ni-IDA byl zkoncentrován ultrafiltraci (MWCO 10 kDa, centriplus, Amicon, Millipore) a nanesen na Superdex G200 (10/30 nebo 16/60; Pharmacia) v PBS, 1% Empigen nebo PBS, 3 % Empigen. Eluční frakce, obsahující produkty E2, s molekulovou hmotností Mr mezi ~80 kDa a ~45 kDa, například frakce 17-23 z elučního profilu podle Obrázku 37 vzniklé migrací na SDS-PAGE (Obrázek 38), byly spojeny a alkylovány (inkubací s 10 mM DTT, 3 hodiny při teplotě místnosti, následovanou inkubací s 30 mM jódacetamidu po dobu 3 hodin při teplotě místnosti). Vzorky pro aminoterminální sekvenování byly podrobeny působení Endo H (Roche Biochemicals), nebo byly ponechány bez jejího působení. Glykosylované a deglykosylované produkty E2 byly naneseny na PVDE-membrány pro aminoterminální sekvenování. Biot glykosylovaného a deglykosylovaného E2 obarvený amidovou černí je znázorněn na Obrázku 39.

Sekvenování obou purifikovaných produktů El a E2 vedlo k překvapujícímu zjištění, že odstranění signální sekvence z obalových proteinů HCV se objevuje pouze částečně (viz Tabulka 3). Kromě toho je většina vedlejších produktů (produkty degradace a produkty dosud obsahující vedoucí sekvenci nebo její část) glykosylovaných. Tato glykosylace je dokonce i v části na neodštěpeném fragmentu signální sekvence, která též obsahuje N-glykosylační místo. Glykosylační místa mohou být mutována tak, aby bylo dosaženo méně glykosylovaných vedlejších produktů. Nicméně, mnohem více závažným je zjištění, že některé alternativně štěpené produkty mají odlišnost pouze v 1 až 4 aminokyselinách ve srovnání s požadovaným intaktním

9

9 9

9 9 9

• ·

999 9 999·

9 9 9 obalovým proteinem. Z tohoto důvodu je purifikace správně upravených produktů fakticky nemožná vzhledem k tomu, že neexistují dostatečné rozlišovací biochemické charakteristiky mezi různými produkty exprese. Několik z degradačních produktů může být výsledkem štěpení podobnému Kex-2 (například štěpení pozorované za aminokyselinou 196 v El, což je štěpení za argininem), které je rovněž požadováno pro odštěpení vedoucího peptidu α-párovacího faktoru a které tak nemůže být blokováno, aniž by byl narušen tento nepostradatelný proces.

Byl porovnáván klon o vysoké produkci El, získaný transformací S. cerevisiae IYCC155 s pSYlYIG7Els (SEQ ID NO: 50; Obrázek 28) s klonem o vysoké produkci, který byl získán transformací S cerevisiae IYCC155 s pSYlaMEElsH6aYIGlEls (SEQ ID NO: 44; Obrázek 22). Vnitrobuněčná exprese proteinu El byla hodnocena 2 až 7 dnů po indukci, to znamená, že byl použit Western-blotting se specifickou monoklonální protilátkou proti El (IGH 201).

Jak lze usuzovat z Obrázku 40, maximální exprese byla pozorována u obou kmenů po 2 dnech, avšak vzory exprese pro oba kmeny jsou úplně odlišné. Exprese s vedoucím peptidem α-párovacího faktoru vede k velice komplexnímu vzoru pruhů, který je důsledkem skutečnosti, že úprava (odštěpení) vedoucího proteinu není účinná. Tato skutečnost vede k několika produktům exprese s odlišnými aminokonci, z nichž některé jsou modifikovány s 1 až 5 N-glykosylacemi. Nicméně, pro El, exprimovaný s vedoucím peptidem CL, je pozorovatelný omezený počet odlišných pruhů, což reflektuje vysokou úroveň správného odstranění vedoucího peptidu a skutečnost, že pouze takto správně upravený materiál může být modifikován s N-glykosylací (1 až 5 řetězců) tak, jak »··«<►· · · ·· ·· 9 • · · · · · · · · • · · · · · · · · ··· • · · · · · · · · · · ···* • ·· · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 ·«·· ·« ·

122 bylo pozorováno u proteinu El, exprimovaném v Hansenula se stejným vedoucím peptidem CL (viz Příklad 16).

Hybridomová buněčná linie produkující monoklonální protilátku namířenou proti El (IGH201) byla uložena 12. března 1998 podle podmínek Budapešťské dohody v European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK, a má přírůstkové číslo ECACC 98031216. Monoklonální protilátka namířená proti E2 (IGH212) byla popsána jako protilátka 12D11F2 v Příkladu 7.4 v Maertens et al. ve W096/04385.

«· ·»»·

99 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 999 9 9 9 9

9 999 99 999 9 ···*

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 9

123

Tabulka 3. Identifikace N-konců proteinů aMF-El-Ηβ a aMFE2-H6, exprimovaných v S. cerevisiae nebo H.polymorpha. Na základě N-terminálního sekvenování bylo možné odhadnout množství N-konců ve zralých proteinech E1-H6 a E2-H6 („zralost indikuje správné odstranění signální sekvence a MF). Celkové množství proteinových produktů bylo vypočteno jako pmol proteinu na základě intenzity píku získaných Edmanovým odbouráváním. Následně bylo pro každý specifický protein (tj. pro každý „detekovaný N-konec) stanoveno % mol versus celkové množství.

Kvasinka	OMF-E1-H6	OMF-E2-VIEGR-H6
S. cerevisiae	Pokus 1: - 16% proteinů stále obsahujících sekvence aMF -18 % proteinů štěpených mezi aa 195 a 196 proteinu El - 66 % proteinů se správně odstraněnou sekvencí a MF Pokus 2 - 18 % proteinů stále obsahujících sekvence aMF - 33 % proteinů štěpených mezi aa 195 a 196 proteinu El - 8 % jiných proteinů jiných produktů štěpení El - 44 % proteinů se správně odstraněnou sekvencí a MF	/ /
H. polymorpha	- 64 % proteinů stále obsahujících sekvence aMF - 6 % proteinů štěpených mezi aa 192 a 193 proteinu El - 30 % proteinů se správně odstraněnou sekvencí a MF	- 75 % proteinů stále obsahujících sekvence a MF - 30 % proteinů se správně odstraněnou sekvencí a MF

999· • 9 ·

124

PŘÍKLAD 16

EXPRESE KONSTRUKTU El V KVASINKÁCH, VHODNÝCH PRO PRODUKCI A PURIFIKACI VE VELKÉM MĚŘÍTKU

Bylo použito několik dalších vedoucích sekvencí k záměně vedoucího peptidu a MF ze S. cerevisiae za sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující CHH (vedoucí sekvence hyperglykemického hormonu z Carcinus maenas), Amyl (vedoucí sekvence amylázy ze S. occidentalis), Gam 1 (vedoucí sekvence glukoamylázy ze S. occidentalis) , Phy5 (vedoucí sekvence houbové fytázy), phol (vedoucí sekvence kyselé fosfatázy z Pichia pastoris) a CL (vedoucí sekvence opičího lysozymu C, 1,4-beta-N-acetylmuramidáza C), které byly připojeny k E1-H6 (např. El s C-koncovým his-tag). Všechny konstrukty byly exprimovány v Hansenula polymorpha a každý z výsledných buněčných lyzátů byl podroben analýze Western blot. Na základě výsledků bylo možné uzavřít, že rozsah odstranění vedoucí nebo signální sekvence nebo peptidu byl extrémně nízký s výjimkou konstruktu, ve kterém je použit jako vedoucí peptid CL. Toto zjištění bylo potvrzeno pro konstrukt CHH-E1-H6 Edmanovým odbouráváním materiálu purifikovaného na Ni-IDA: nebylo možné detekovat žádný správně štěpený produkt, ačkoliv bylo získáno několik odlišných sekvencí (viz Tabulka 4).

Tabulka 4. Identifikace N-konců proteinů CHH-E1-H6, exprimovaných v H. polymorpha, na základě sekvenování aminokyselin od N-konce u různých proteinových pruhů po separaci s SDS-PAGE a nanesení na PVFD membráně

Molekulová hmotnost	Identifikovaný N-konec
45 kD	začíná u aminokyseliny 37 vedoucího peptidu

•4 ···· ·♦ ·« ·* 4 • 4 · 4 4 4 4 4 4 • · · · · ··· · · · · • 4 4 4 4 ·· 4 · 4 4 4··· • 4 4 · 4 4 4 4 4 · 4 • 4 44 44 4 4 44 *

125

	CHH = pouze pre-sekvence je odštěpena, pro- -sekvence je stále připojena
26 kD	- částečně začíná u aminokyseliny 1 vedoucího peptidu CHH = nebyla odstraněna pre-pro- -sekvence - částečně začíná u aminokyseliny 9 vedoucího peptidu CHH = produkt alternativní translace začínající u druhého kodónu AUG
24 kD	- částečně začíná u aminokyseliny 1 vedoucího peptidu CHH - nebyla odstraněna pre-pro- -sekvence - částečné začíná u aminokyseliny 9 vedoucího peptidu CHH = produkt alternativní translace začínající u druhého kodónu AUG

Jak již bylo výše uvedeno, Western-bloty z buněčných lyzátů odhalily vzory El specifických proteinových pruhů, naznačující, že byl proveden vysoký stupeň správného odstranění vedoucího peptidu CL. Toto je překvapující, neboť vedoucí peptid není odvozen z kvasinek. Sekvenování aminokyselin Edmanovým odbouráváním materiálu, který byl solubilizován s GuHCl a purifikován na Ni-IDA, vskutku potvrdilo, že 84 % proteinů El je správně štěpeno a materiál je v podstatě prostý od degradačních produktů. Ještě 16 % neupraveného materiálu je přítomno, avšak vzhledem k tomu, že tento materiál není glykosylován, může být snadno ze směsi odstraněn, čímž je umožněno specifické obohacení správně štěpeného a glykosylovaného El. Metodou takového obohacení může být afinitní chromatografie na • ·

126 lektinu, jiné alternativy jsou rovněž uvedeny v Příkladu 19. V jiném provedení může být použito materiálu o vyšší hydrofobicitě pro výběr a optimalizaci jiných obohacovacích postupů. Správné odstranění vedoucího peptidu CL z proteinu CL-E1-H6 bylo dále potvrzeno hmotovou spektroskopií, která také potvrdila, že až 4 z 5 N-glykosylačních míst genotypu lb Els může být obsazeno, zatímco sekvence NNSS (aminokyseliny 233 až 236; SEQ ID NO: 73) je považována za osamělé N-glykosylační místo.

PŘÍKLAD 17

PURIFIKACE A BIOCHEMICKÁ CHARAKTERIZACE PROTEINU HCV E2, EXPRIMOVANÉM V HANSENULA POLYMORPHA Z KONSTRUKTU KÓDUJÍCÍM CL-E2-H6

Byla analyzována účinnost odstranění vedoucího peptidu CL z proteinu CL-E2-VIEGR-H6 (dále v tomto příkladu označován jako „CL-E2-H6), exprimovaného v Hansenula polymorpha. Vzhledem k tomu, že HCV E2s (aminokyseliny 383673) byl exprimován jako his-značený (his-tagged) protein, byla prováděna rychlá a účinná purifikace exprimovaného proteinu na Ni-IDA po GuHCl solubilizaci sebraných buněk. Stručně řečeno, buněčné pelety byly resuspendovány ve 30 mM fosfátu, 6 M GuHCl, pH 7,2 (9 ml pufru/g buněk). Protein byl sulfonován přes noc při teplotě místnosti v přítomnosti 320 mM (4 % hmotn./objem) siřičitanu sodného a 65 mM (2 % hmotn./objem) tetrathionátu sodného. Lyzát byl po jednom cyklu zmražení-roztátí vyčištěn centrifugací (10 00.0 g, 30 minut, 4° C) . Byly přidány Empigen BB (Albright & Wilson) a imidazol na konečnou koncentraci 1 % (hmotn./objem) a 20 mM, v uvedeném pořadí. Všechny další chromatografické kroky byly prováděny na zařízení Akta FPLC workstation (Pharmacia). Vzorek byl filtrován přes membránu o velikosti • · · • · · · ·

127 pórů 0,22 μιη (celulózo acetát) a nanesen na sloupec Ni-IDA (chelatační Sepharosa FF nasycená s Ni²⁺, Pharmacia), který byl ekvilibrován s 50 mM fosfátu, 6 M GuHCl, 1 % Empigen BB, pH 7,2 (pufr A) s doplňkem 20 mM imidazolu. Sloupec byl postupně promyt s pufrem A obsahujícím 20 mM a 50 mM imidazolu, v uvedeném pořadí, dokud nedosáhla absorbance při 280 nm základní úrovně.His-značené produkty byly eluovány aplikací pufru D, 50 mM fosfát, 6 M GuHCl, 0,2 % Empigen BB (pH 7,2), 200 mM imidazolu. Purifikované materiály byly analyzovány s SDS-PAGE a Western blottingem s použitím specifické monoklonální protilátky namířené proti E2(IGH212) (Obrázek 41). Protein E2-H6 purifikovaný přes IMAC byl rovněž podroben N-terminálnímu sekvenování Edmanovým odbouráváním. Proto bylo na proteiny působeno Nglykosidázou F (Roche) (0,2 U/^g E2, 1 hodina inkubace při 37° C v PBS/3 % Empigen BB), nebo byly ponechány bez jakéhokoliv působení. Glykosylované a deglykosylované proteiny E2-H6 byly podrobeny SDS-PAGE a naneseny (blotovány) na membránu PVDF pro stanovení sekvence aminokyselin (analýza byla prováděna na proteinovém sekvenátoru PROCISE™ 492, Applied Biosystems). Vzhledem k tomu, že v tomto stupni byly metodou SDS-PAGE zjištěny nějaké produkty degradace, byla prováděna další fakcionace pomocí gelové chromatografie. K tomu byl Ni-IDA eluát koncentrován ultrafiltrací (MWCO 10 kDa, centriplus,

Amicon, Millipore) a nanesen na Superdex G200 (Pharmacia) v PBS, 1 % Empigen BB. Eluční frakce, obsahující zejména intaktní produkty příbuzné s E2s se zjevnou molekulovou hmotností Mr mezi ~30 kD a ~70 kDa, stanovenou migrací na SDS-PAGE, byly spojeny a případně alkylovány (inkubací s 5 mM DTT po dobu 30 minut při 37° C, následovanou inkubací s 20 mM jodacetamidu po dobu 30 minut při 37° C) . Možná přítomnost degradačních produktů po purifikaci IMAC může • · ·· · ··· ·· • · · · · ·

tak být překonána další frakcionací intaktního produktu s použitím gelové chromatografie. Bylo dosaženo neočekávaně dobrého výsledku. S využitím N-terminálního sekvenování je možné stanovit množství produktu E2, ze kterého byl odstraněn vedoucí peptid CL. Celkové množství proteinových produktů je počítáno v pmol proteinu podle intenzity píků získaných v Edmanově odbourávání. Následně je pro každý specifický protein (např. pro každý „detekovaný N-konec) stanoveno % mol versus celkové množství. V tomto pokuse byl detekován pouze správný N-konec proteinu E2-H6 a jiné varianty E2-H6 postrádající aminokyseliny z proteinu E2, nebo obsahující N-terminální aminokyseliny, jež nejsou součástí proteinu E2, nebyly přítomny. Lze shrnout, že protein E2-H6, exprimovaný v H. polymorpha jako protein CLE2-H6, byl izolován bez jakékoliv další úpravy in vitro jako z > 95 % správně štěpený protein. Toto zjištění je v příkrém protikladu s přesností odstranění vedoucího peptidu s H. polymorpha při úpravě proteinu α MF-E2-H6 na protein E2-H6, u které bylo stanoveno, že se vyskytuje u 25 % izolovaných proteinů (viz Tabulka 3).

PŘÍKLAD 18

PURIFIKACE A BIOCHEMICKÁ CHARAKTERIZACE PROTEINU HCV El, EXPRIMOVANÉM V HANSENULA POLYMORPHA Z KONSTRUKTU KÓDUJÍCÍM CL-H6-K-E1 A IN VITRO ÚPRAVA PROTEINŮ OBSAHUJÍCÍCH H6

Byla analyzována účinnost odstranění vedoucího peptidu CL z proteinu CL-H6-K-E1, exprimovaného v Hansenula polymorpha, stejně jako účinnost následné úpravy in vitro tak, aby byl odstraněn H6 (his-tag)-adaptorový peptid a místo úpravy Endo Lys-C. Vzhledem k tomu, že HCV Els (aminokyseliny 192-326) byl exprimován jako protein značený s his-K značkou na N-konci (his-K-tagged), tj. CL-H6-K-E1, • · ·· ·· ·· ·· ·· ·

129 mohla být provedena rychlá a účinná purifikace tak, jak je popsáno v Příkladu 17. Eluční profil z IMACchromatografické purifikace proteinů H6-K-E1 (a případných residuálních CL-H6-K-E1 proteinů) je znázorněn na Obrázku 42. Po SDS-PAGE a barvení gelu stříbrem a analýze Westernblotting, používající monoklonální protilátku namířenou proti El (IGH201) (Obrázek 43), byly eluční frakce (63-69) obsahující rekombinantní produkty Els, spojeny („IMAC pool) a podrobeny přes noc působení endoproteinázy Lys-C (Roche) (poměr enzym/substrát 1/50 (hmotn./hmotn.), 37° C) ) tak, aby bylo odstraněno fúzované prodloužení H6-K. Odstranění neupravených fúzních produktů bylo provedeno krokem negativní IMAC chromatografie na sloupci Ni-IDA, ve které jsou proteiny upravené s endo-Lys-C sbírány do protékající frakce. K tomu byl vzorek proteinu štěpený s endoproteinázou Lys-C nanesen na sloupec Ni-IDA po lOnásobném ředění s 10 mM NaH₂PO₄.3H₂O, 1 % (objem/objem), Empigen B, pH 7,2 (pufr B) , s následným promýváním s pufrem B, dokud absorbance při 280 nm nedosáhla základní úrovně. Protékající proud byl odebírán do různých frakcí(1-40), které byly screenovány na přítomnost produktů Els (Obrázek 44). Frakce (7-28), obsahující intaktní El, ze kterého bylo N-koncové prodloužení H6-K (a eventuálně residuální CL-H6K) odstraněno (se zjevnou molekulovou hmotností Mr mezi ~ 15 kDa a ~ 30 kDa, stanovenou SDS-PAGE po barvení stříbrem nebo analýzou Western blotting s použitím specifické monoklonální protilátky namířené proti El (IGH201)), byly spojeny a případně alkylovány (inkubací s 5 mM DTT po dobu 30 minut při 37° C, s následnou inkubací s 20 mM jodacetamidu po dobu 30 minut při 37° C) .

Tento materiál byl podroben N-terminálnímu sekvenování (Edmanovo odbourávání). Proto bylo na proteinové vzorky • 9 · ·

130 působeno N-glykosidázou F (Roche) (0,2 U/ýg El, 1 hodina inkubace při 37° C v PBS/3 % Empigen BB), nebo byly ponechány bez jakéhokoliv působení. Glykosylované a deglykosylované proteiny El byly odděleny s SDS-PAGE a naneseny (blotovány) na membránu PVDF pro další analýzu Edmanovým odbouráváním (analýza byla prováděna na proteinovém sekvenátoru PROCISE™ 492, Applied Biosystems). Na základě N-terminálního sekvenování mohlo být stanoveno množství správně upraveného produktu El (úprava zahrnuje správné odštěpení sekvence H6-K). Celkové množství proteinových produktů je vypočteno v pmol proteinu podle intenzity piků získaných v Edmanově odbourávání. Následně je pro každý specifický protein (např. pro každý „detekovaný N-konec) stanoveno % mol versus celkové množství. V tomto pokuse byl detekován pouze správný Nkonec proteinu El a nikoliv N-konce jiných variant H6-K-E1. Pak bylo stanoveno, že úprava proteinu H6-K-E1 (případně residuálního CL-H6-K-E1) in vitro s Endo-Lys-C na protein El se vyskytuje s přesností větší než 95 %.

PŘÍKLAD 19

SPECIFICKÉ ODSTRANĚNÍ FOREM HCV El S „LOW-GLYKOSYLACÍ POMOCÍ HEPARINU

K nalezení specifických purifikačních kroků pro obalové proteiny HCV z buněk kvasinek byla stanovena jejich vazba s heparinem. Je známo, že heparin se váže s řadou virů, a proto již bylo doporučeno stanovení vazby obalu HCV (Garson, J. A. et al. 1999). Aby mohla být analyzována tato potenciální vazba, byl heparin biotinylován a byla analyzována interakce s HCV El na mikrotitračních destičkách potažených s buďto sulfonovaným HCV El z

H.polymorpha, alkylovaným HCV El z H. polymorpha (oba :: ·····:*:: ··:· «· ·· ·· ·· ·· *

131 produkované tak, jak je popsáno v Příkladu 16), nebo s alkylovaným HCV El z kultury savčích buněk, transfekovaných s vektorem pro expresi ve viru vaccinia. Překvapivě silná vazba mohla být pozorována pouze se sulfonovaným HCV El z H.polymorpha, zatímco vazba s HCV El z kultury savčích buněk byla zcela nepřítomna. S použitím metody Western-blotting bylo možné prokázat, že tato vazba byla specifická pro pruhy s nižší molekulovou hmotností v proteinové směsi HCV El (Obrázek 45), což koresponduje s nízce glykosylovanou podstatou HCV Els. Obrázek 45 rovněž ukazuje, že sulfonace není nezbytná pro vazbu s heparinem, neboť po odstranění této sulfonace je stále pozorována vazba u El s nízkou molekulovou hmotností (linie 4). Jinak řečeno, alkylace podstatně redukuje tuto vazbu, nicméně, toto může být způsobeno specifickým alkylačním činidlem (jodacetamidem), použitým v daném příkladu. Tento nález dále demonstroval průmyslovou využitelnost obalových expresivních kazet pro kvasinky CL-HCV, neboť je možné specificky obohatit preparáty HCV El ve smyslu získání preparátů s proteiny HCV El s vyšším stupněm glykosylace (například tím, že je obsazeno více glykosylačních míst).

PŘÍKLAD 20

TVORBA A ANALÝZA ČÁSTIC PODOBNÝCH VIRU (VIRUS-LIKE

PARTICLES, VLPs)

Přeměna obalových proteinů HCV El a E2, exprimovaných v H. polymorpha (Příklady 16 až 18) na VLPs byla prováděna v podstatě tak, jak popisují Depla et al. ve W099/67285 a Bosman et al. ve W001/30815. Stručně řečeno, po kultivaci transformovaných buněk H.polymorpha, během které jsou exprimovány obalové proteiny HCV, byly buňky sklizeny, lyžovány v GuHCl a sulfonovány tak, jak je popsáno ·· · • · · • · · ·

• · » ·· « v Příkladu 17. Proteiny značené His-tag byly následně purifikovány s IMAC a koncentrovány s ultrafiltrací tak, jak je popsáno v Příkladu 17.

Tvorba VLP z obalových proteinů HCV se sulfonovanými Cys—thiolovými skupinami

Koncentrované obalové proteiny HCV sulfonované během izolačního postupu nebyly podrobeny redukci a byly naneseny na sloupec gelové chromatografie (Superdex G200, Pharmacia) ekvilibrovaný s PBS, 1 % (objem/objem) Empigen. Eluované frakce byly analyzovány s SDS-PAGE a Western blottingem. Frakce s relativní molekulovou hmotností Mr ~ 29-15 kD (stanovenou na základě migrace v SDS-PAGE) byly spojeny, zakoncentrovány a naneseny na Superdex G200, ekvilibrovaný s PBS, 3 % (hmotn./objem) betain, k posílení tvorby částic podobných viru (virus like particle, VLP). Frakce byly spojeny, zakoncentrovány a odsoleny do PBS, 0,5% (hmotn./objem) betain.

Tvorba VLP z obalových proteinů HCV s ireversibilně modifikovanými Cys—thiolovými skupinami

Koncentrované obalové proteiny HCV sulfonované během izolačního postupu byly podrobeny redukčnímu působení (inkubace v přítomnosti 5 mM DTT v PBS) k přeměně sulfonovaných Cys-thiolových skupin na volné Cys-thiolové skupiny. Ireversibilní modifikace Cys-thiolových skupin byla provedena (i) inkubací pod dobu 30 minut v přítomnosti 20 mM jodacetamidu, nebo (ii) inkubací po dobu 30 minut v přítomnosti 5 mM N-ethylmaleimidu (NEM) a 15 mM biotin-Nethylmaleimidu. Následně byly proteiny naneseny na sloupec gelové chromatografie (Superdex G200, Pharmacia) • · · · • · · ·

133 ekvilibrovaný s PBS, 1 % (objem/objem) Empigen v případě blokování s jodacetamidem, nebo s PBS, 0,2 % CHAPS v případě blokování s NEM a biotin-NEM. Eluované frakce byly analyzovány s SDS-PAGE a Western blottingem. Frakce s relativní molekulovou hmotností Mr ~ 29 - ~15 kD (stanovenou na základě migrace v SDS-PAGE) byly spojeny, zakoncentrovány a pro posílení tvorby částic podobných viru byly naneseny na sloupec Superdex G200 ekvilibrovaný s PBS, 3% (hmotn./objem) betain. Frakce byly spojeny, zakoncentrovány a odsoleny do PBS, 0,5% (hmotn./objem) betain v případě blokování s jodacetamidem, nebo s PBS,

0,05 % CHAPS v případě blokování s NEM a biotin-NEM.

Tvorba VLP z obalových proteinů HCV s reversibilně modifikovanými Cys—thiolovými skupinami

Koncentrované obalové proteiny HCV sulfonované během izolačního postupu byly podrobeny redukčnímu působení (inkubace v přítomnosti 5 mM DTT v PBS) k přeměně sulfonovaných Cys-thiolových skupin na volné Cys-thiolové skupiny. Reversibilní modifikace Cys-thiolových skupin byla provedena inkubací po dobu 30 minut v přítomnosti dithiodipyridinu (DTDP), dithiokarbamátu (DTC) nebo cysteinu. Následně byly proteiny neneseny na sloupec gelové chromatografie (Superdex G200, Pharmacia) ekvilibrovaný s PBS, 1 % (objem/objem) Empigen. Eluované frakce byly analyzovány s SDS-PAGE a Western blottingem. Frakce s relativní molekulovou hmotností ~29 - ~15 kD (stanovenou na základě migrace v SDS-PAGE) byly spojeny, zakoncentrovány a neneseny na Superdex G200, ekvilibrovaný s PBS, 3 % (hmotn./objem) betain, k posílení tvorby částic podobných viru (VLP). Frakce byly spojeny, zakoncentrovány a odsoleny do PBS, 0,5% (hmotn./objem) betain.

• · ·

134

Eluční profily z gelové chromatografie v PBS, 3 % (hmotn./objem) betain pro VLPs získané z E2-H6, exprimovaného v H. polymorpha jsou uvedeny na Obrázku 46 (sulfonovaný protein) a Obrázku 47 (z protein alkylovaného s jodacetamidem).

Eluční profily z gelové chromatografie v PBS, 3 % (hmotn./objem) betain pro VLPs získané z El, exprimovaného v H. polymorpha, jsou uvedeny na Obrázku 48 (sulfonovaný protein) a Obrázku 49 (z proteinu alkylovaného s jodacetamidem). Výsledné VLPs byly analyzovány s SDS-PAGE a Western blottingem tak, jak uvádí Obrázek 50.

Analýza velikosti VLPs, vytvořených z obalových protein HCV exprimovaných v H. polymorpha

Velikost částice VLP byla stanovena metodou Dynamic Light Scattering. V těchto pokusech s použitím rozptylu světla, byl použit analyzátor velikosti částic (Particlesize analyzer, ModEl Zetasizer 1000 HS, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcester UK), který byl řízen softwarem pro fotonovou korelační spektroskopií (photon correlation spectroscopy, PCS). Fotonová korelační spektroskopie nebo dynamický rozptyl světla (dynamic light scattering, DLS) je optická metoda, která měří Brownův pohyb a uvádí ho do vztahu k velikosti částic. Světlo u kontinuálního, viditelného laserového paprsku směřuje přes soubor makromolekul nebo částic v suspenzi, které se pohybují Brownovým pohybem. Některý z laserových světelných paprsků je částicemi rozptýlen a tento rozptýlený světelný paprsek je měřen s fotonásobičem. Fluktuace v intenzitě rozptýleného světla jsou přeměňovány na elektrické impulsy,

135 které jsou vkládány do korelátoru. Korelátor generuje autokorelační funkci, která se přenáší na počítač, ve kterém je prováděna příslušná analýza dat. Použitý laser byl 10 mW monochromatický koherentní He-Ne laser s fixovanou vlnovou délkou 633 nm. Pro každý vzorek bylo provedeno tři až šest následných měření.

Výsledky těchto pokusů jsou shrnuty v Tabulce 5.

Tabulka 5. Výsledky analýzy dynamického světelného rozptylu uvedených kompozic VLP, které byly připraveny z obalových Protein HCV exprimovaných v H. polymorpha. Velikost částic VLP je uvedena jako střední hodnota průměru částic.

Modifikace Cys-thiolových skupin	E1-H6	E2-VIEGR-H6	El
sulfonace	25 - 45 nm	20 nm	20 - 26 nm
alkylace (j odacetamidem)	23 - 56 nm	20 - 56 nm	21 - 25 nm

Zjištění, že sulfonovaný HCV El, odvozený z H. polymorpha, ještě vytváří částice o velikosti ve shodném rozmezí velikostí, jako alkylovaný HCV El z Hansenula, je překvapující. Takovýto účinek nebyl očekáván, neboť bohatá síť zvýšení negativních nábojů (až 8 Cys-thiolových skupin může být modifikováno v HCV El), jako důsledek sulfonace, může indukovat iontové odpuzování mezi podjednotkami. Jiná činidla reversibilně modifikující cystein, která byla testována, rovněž umožnila tvorbu částic z HCV El připraveného tímto způsobem, nicméně, bylo prokázáno, že jsou tyto částice méně stabilní než částice ze sulfonovaného materiálu, který vzniká z agregace na základě disulfidových můstků v HCV El. Pro použití těchto jiných

136 reversibilních blokátorů je nezbytná další optimalizace podmínek.

PŘÍKLAD 21

ANTIGENNÍ EKVIVALENCE HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO V HANSENULA, A HCV El, PRODUKOVANÉHO V SAVČÍCH BUŇKÁCH INFIKOVANÝCH VIREM VACCINIA

Reaktivita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, se sérem chronických přenašečů HCV byla porovnána s reaktivitou HCV El, produkovaného savčími buňkami infikovanými s HCV-rekombinantním virem vaccinia tak, jak bylo popsáno v Depla et al. ve WO99/67285. Oba testované preparáty HCV-El sestávaly z VLPs, ve kterých byly proteiny HCV El alkylovány s NEM a biotin-NEM. Reaktivita obou preparátů VLP s HCV El se sérem od chronických přenašečů HCV byla stanovována metodou ELISA. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v Tabulce 6. Jak lze odvodit z Tabulky 6, nebyly zaznamenány žádné rozdíly v reaktivitě mezi HCV El, exprimovaným v savčích buňkách infikovaných HCVrekombinantním virem vaccinia, a HCV El, exprimovaným v H. polymorpha.

Tabulka 6. Antigenita El, produkovaného v savčí buněčné kultuře, nebo produkovaného v H. polymorpha, byla hodnocena na panelu sér z lidských chronických přenašečů HCV. Pro tento účel byl biotinylovaný El navázán na destičky ELISA potažené streptavidinem. Pak byla přidána lidská séra ve zředění 1/20 a byly detekována imunoglobuliny ze sér navázané k El s pomocí, králičí specifické sekundární protilátky proti lidskému IgG-Fc značené peroxidázou. Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnoty OD. Průměrné hodnoty jsou průměry hodnot OD ze všech testovaných vzorků sér!

• · • · · ·

• · · ·

137

Sérum	Hansenula	savčí	Sérum	Hansenula	Savčí
17766	1,218	1,159	55337	1,591	1,416
17767	1,513	1,363	55348	1,392	1,261
17777	0,806	0, 626	55340	1,202	0, 959
17784	1, 592	1, 527	55342	1,599	1, 477
17785	1,508	1,439	55345	1, 266	1, 428
17794	1,724	1, 597	55349	1,329	1,137
17798	1,132	0, 989	55350	1,486	1,422
17801	1, 636	1,504	55352	0,722	1,329
17805	1, 053	0, 944	55353	1,065	1,157
17810	1,134	0, 999	55354	1,118	1,092
17819	1,404	1,24	55355	0,754	0, 677
17820	1,308	1,4	55362	1,43	1,349
17826	1, 163	1, 009	55365	1, 612	1, 608
17827	1,668	1,652	55368	0, 972	0, 959
17849	1,595	1,317	55369	1,506	1,377
55333	1,217	1, 168	průměr	1,313	3,245

PŘIKLAD 22

IMUNOGENNÍ EKVIVALENCE HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO

V HANSENULA, A HCV El, PRODUKOVANÉHO V SAVČÍCH BUŇKÁCH INFIKOVANÝCH VIREM VACCINIA

Imunogenita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, byla porovnána s imunogenitou HCV El, produkovaného v savčích buňkách infikovaných HCV-rekombinantním virem vaccinia tak, jak popsali Depla et al. ve W099/67285. Oba testované preparáty HCV-E1 sestávaly z VLPs, přičemž proteiny HCV El byly alkylovány s jodacetamidem. Oba preparáty VLP byly upraveny s kamencem a injikovány myším Balb/c (3 intramuskulární/subkutánní injekce s třítýdenním intervalem mezi každou z injekcí a každá z injekcí obsahovala 5 μς El

138 ve 125 μΐ obsahujících 0,13% Alhydrogel, Superfos, Denmark). Krev byla myším odebrána (vykrvácením) 10 dnů po třetí imunizaci.

Výsledky těchto pokusů jsou znázorněny na Obrázku 51.

V horní části Obrázku 51 byly stanovovány protilátky vzniklé po imunizaci s VLPs z El, produkovaného v savčích buňkách. Titry protilátek byly stanovovány metodou ELISA (viz Příklad 21), přičemž jak El, produkovaný v savčích buňkách („M), tak El, produkovaný v Hansenula („H), byly přímo naneseny na pevný nosič ELISA a destičky ELISA byly blokovány s kaseinem. V dolní části Obrázku 51 byly stanovovány protilátky vzniklé po imunizaci s VLPs z El, produkovaného v Hansenula. Titry protilátek byly stanovovány metodou ELISA (viz Příklad 21), přičemž jak El, produkovaný v savčích buňkách („M), tak El, produkovaný v Hansenula („H), byly přímo naneseny na pevný nosič ELISA a destičky ELISA byly blokovány s kaseinem.

Titry protilátek byly stanovovány jako konečné titry (end point titers). Konečný titr je určen jako ředění séra vedoucí k OD (stanovené s ELISA) rovné dvojnásobku průměrné hodnoty pozadí v dané zkoušce.

Obrázek 51 uvádí, že nebyly pozorovány žádné signifikantní rozdíly mezi imunogenními vlastnostmi obou kompozic obsahujících El a to, že stanovené titry protilátek jsou nezávislé na antigenu, použitém v ELISA zkoušce k provedení titrace ke konečným titrům.

HCV El získaný z kvasinek indukoval po vakcinaci obrannou odpověď podobnou obranné reakci, které bylo dosaženo po vakcinaci s alkylovaným HCV El, získaným ze

4 4 •4 ·· ·· ·*

139 savčí buněčné kultury. Posledně jmenovaná odpověď byla schopna zabránit chronickému vývoji HCV po akutní infekci.

PŘÍKLAD 23

ANTIGENNÍ A IMUNOGENNÍ PROFIL HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO V HANSENULA, KTERÝ JE SULFONOVÁN

Reaktivita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, se sérem od chronických přenašečů HCV byla porovnávána s reaktivitou HCV El, produkovaného v savčích buňkách infikovaných s HCV-rekombinantním virem vaccinia tak, jak popsali Depla et al. ve W099/67285. Oba testované preparáty HCV-E1 sestávaly z VLPs, přičemž proteiny HCV-E1, produkované v Hansenula, byly sulfonovány a proteiny HCV El, produkované v savčích buňkách, byly alkylovány.

Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 7. Ačkoliv celková (průměrná) reaktivita byla identická, u jednotlivých sér byly zjištěny určité významné rozdíly. Toto vede k závěru, že sulfonovaný materiál poskytuje alespoň některé ze svých epitopů způsobem odlišným od alkylovaného HCV El.

Imunogenita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, který byl sulfonován, byla porovnávána s imunogenitou HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, který byl alkylován. Oba testované preparáty HCV-E1 obsahovaly VLPs. Oba preparáty VLP byly upraveny s kamencem a injikovány myším Balb/c (3 intramuskulární/subkutánní injekce s třítýdenním intervalem mezi každou z injekcí a každá z injekcí obsahovala 5 μς El ve 125 μΐ obsahujících 0,13% Alhydrogel, Superfos,

Denmark). Krev byla myším odebrána (vykrvácením) 10 dnů po třetí imunizaci.

·« ·· ·♦ · • · · · · · • · ··· · · · * • · · · · · · ♦ ·♦· • · · · · · * ·· ···· • · · • · · • · · • · · · «· · ·

140

Titry protilátek byly stanovovány podobně, jak je popsáno v Příkladu 22. Imunizace se sulfonovaným materiálem vedla překvapivě k vyšším titrům protilátek, bez ohledu na antigen, který byl použit ve zkoušce ELISA k určení těchto titrů (Obrázek 51; horní panel: titrace protilátek vyvolaných proti alkylovanému El ; dolní panel: titrace protilátek vyvolaných proti sulfonovanému El; „A: alkylovaný El nanesený na destičku ELISA; „S: sulfonovaný El nanesený na destičku ELISA). Nicméně jsou v tomto pokuse jednotlivé titry odlišné v závislosti na použitém antigenu, což potvrzuje zjištění uvedená pro séra od pacientů s HCV. Proto HCV El, ve kterém jsou thiolové skupiny cysteinu modifikovány reversibilním způsobem, mohou být více imunogenní, a tak mají vyšší účinnost jako vakcína chránící proti HCV (chronické infekci). Kromě toho se s menší pravděpodobností objevuje indukce odpovědi k neo-epitopům, vyvolaná ireversibilním blokováním.

Tabulka 7. Antigenita alkylovaného El (produkovaného v savčí buněčné kultuře) nebo sulfonovaného E1-H6 (produkovaného v H. polymorpha) byla určena na panelu sér od lidských chronických přenašečů HCV („séra pacientů) a na panelu kontrolních sér („krevní.donorová séra) Pro tento účel byl El navázán na destičky ELISA a poté byly destičky dále saturovány s kaseinem. Byla přidána lidská séra v ředění 1/20 a navázané imunoglobuliny byly detekovány se sekundární králičí protilátkou proti lidskému IgG-Fc, značenou s peroxidázou. Výsledky jsou vyjádřeny jako hodnoty OD. Průměrné hodnoty jsou průměry hodnot OD ze všech testovaných vzorků sér.

4· ····

141

4« · · 4 4 4 · « 4 · «

4 444 4 444

4 4 4 · · · ·**· • 4 · 4 4 4 * •4 ·4 44 4

séra pacientů	krevní donorová séra
Číslo séra	Hansenula	savčí	Číslo séra	Hansenula	savčí
17766	0, 646	0, 333	F500	0,055	0,054
17777	0,46	0,447	F504	0,05	0, 05
17785	0,74	0,417	F508	0,05	0,054
17794	1,446	1,487	F510	0,05	0, 058
17801	0,71	0, 902	F511	0, 05	0,051
17819	0,312	0, 539	F512	0,051	0, 057
17827	1,596	1,576	F513	0,051	0,052
17849	0,586	0, 964	F527	0, 057	0,054
55333	0,69	0,534	průměr	0, 052	0,0 5-1
55338	0,461	0,233
55340	0,106	0,084
55345	1,474	1,258
55352	1, 008	0, 68
55355	0, 453	0,444
55362	0,362	0,717
55369	0,24	0,452
průměr	o;-7O6	0,691

PŘIKLAD 24

IDENTICKÁ ANTIGENNÍ REAKTIVITA HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO V HANSENULA, A HCV El, PRODUKOVANÉHO V SAVČÍCH BUŇKÁCH INFIKOVANÝCH VIREM VACCINIA, SE SÉRY OD VAKCINOVANÝCH ŠIMPANZŮ

Byla porovnávána reaktivita El, produkovaného savčími buňkami infikovanými HCV-rekombinantním virem vaccinia, a E1-H6, produkovaného v Hansenula, (oba alkylované) se sérem z vakcinovaných šimpanzů a s monoklonálními protilátkami. Proto byly uvedené proteiny El naneseny přímo na destičky ELISA a následovala saturace destiček s kaseinem. Konečné •9 999»

9* 99 ·

9 ·

9 9 9 9 •9999999 • 9*9 9999 99 ·

99 99 99 »9 ·

142 titry protilátek vázajících se s proteiny El navázanými na destičky ELISA byly stanoveny pro sérum šimpanzů a pro specifické myší monoklonální protilátky, přičemž všechny byly získány imunizací s El, produkovaným v savčích buňkách. Stanovení konečných titrů bylo provedeno tak, jak je popsáno v Příkladu 22. Použitými myšími monoklonálními látkami byly IGH201 (viz Příklad 15), IGH198 (IGH198 =

23C12 v Maertens et al. ve W096/04385), IGH203 (IGH203 = 15G6 v Maertens et al. ve W096/04385) a IGH202 (IGH202 =

3F3 v Maertens et al. ve W099/50301).

Jak je možné odvodit z Obrázku 53, reaktivity 7 odlišných šimpanzích sér jsou identické, jestliže jsou testovány s proteinem El, produkovaným jak v Hansenula, tak v savčích buňkách. Reaktivity monoklonálních protilátek proti HCV El jsou rovněž téměř shodné. Dva ze šimpanzů (Yoran a Marti) byli zahrnuti v profylaktické vakcinační studii a byli schopni vyloučit akutní infekci po imunizaci, zatímco kontrolní zvíře infekci nevyloučilo. Pět dalších šimpanzů (Ton, Phil, Marcel, Peggy, Femma) bylo zahrnuto do terapeutické vakcinační studie a po imunizacích s HCV El vykázalo snížení poškození jater, měřené s ALT v séru a/nebo indexem histologické aktivity jaterní biopsie.

Výsledky získané v tomto pokuse jsou zřetelně odlišné od nálezů Mustilliho a spolupracovníků (Mustilli, A. C. et al. 1999), kteří exprimovali protein HCV E2 jak v Saccharomyces cerevisiae, tak v Kluyveromyces lactis, Purifikovaný E2, produkovaný v kvasince, byl nicméně odlišný od HCV E2, produkovaného v savčích (CHO) buňkách v tom, že u něho byla pozorována nižší reaktivita se sérem šimpanzů imunizovaných s HCV E2, produkovaným savčími ·· · · · · · · ·· ·· · • · · ··· · · · • · · · ···· · · · · • · ··· · · ··· · ···· • · · · · · · · * · · • · · · · · · · · · ·

143 buňkami, zatímco reaktivita s monoklonálními protilátkami byla vyšší u HCV E2 produkovaného kvasinkami.

PŘÍKLAD 25

STANOVENÍ GLYKOSYLAČNÍHO PROFILU HCV El ELEKTROFORÉZOU S FLUORESCENČNÍM ZNAČENÍM CUKRU (FLUOROPHORE-ASSISTED CARBOHYDRATE ELECTROPHORESIS, FACE)

Byly porovnávány glykosylační profily pro HCV El, produkovaný v Hansenula, a pro HCV El, produkovaný savčími buňkami infikovanými HCV-rekombinantním virem vaccinia. tak, jak bylo popsáno v Depla et al. ve W099/67285. Porovnání bylo provedeno metodou elektroforézou s fluorescenčním značením cukrů (fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis, FACE). Za tímto účelem byly oligosacharidy uvolněny z Els, produkovaných v savčích buňkách nebo v Hansenula, s peptid-N-glykosidázou (PNGázou)(peptide-N-glycosidase, PNGase F) a značeny s ANTS (proteiny El byly před štěpením s PNGázou alkylovány s jodacetamidem). Oligosacharidy značené s ANTS byly separovány metodou PAGE na 21% polyakrylamidovém gelu při proudu 15 mA, 4° C po dobu 2-3 hodin. Z Obrázku 54 bylo dovoženo, že oligosacharidy na El, produkovaném savčími buňkami, a oligosacharidy na E1-H6, produkovaném v Hansenula, migrují podobně jako oligomaltóza se stupněm polymerizace mezi 7 a 11 monosacharidy. Toto potvrzuje, že Hansenula expresivní systém překvapivě vede k proteinu El, který není hyperglykosylován a který má řetězce cukrů o délce podobné řetězcům cukrů, jež jsou připojeny k proteinům El, produkovaným v savčích buňkách.

AAAA • A ·

AA AA AA AA AA A

144

PŘÍKLAD 26

STANOVENÍ SEKVENCE N-VÁZANÉHO OLIGOSACHARIDŮ, KTERÝ BYL ZÍSKÁN Z Els, PRODUKOVANÝCH V SACCHAROMYCES A V HANSENULA,

A Z Els, PRODUKOVANÝCH SAVČÍMI BUŇKAMI INFIKOVANÝMI S HCVREKOMBINANTNÍM VIREM VACCINIA

Proteiny Els (225 μg), purifikované z kultury Saccharomyces nebo Hansenula (viz Příklady 15-16), nebo z kultury buněk RK13 infikovaných s HCV-rekombinantním virem vaccinia (viz Maertens et al. ve W096/04385) a přítomné v PBS, 0,5% betainu byly zředěny s inkubačním pufrem pro deglykosylaci (50 mM Na₂HPO₄, 0,75 % Nonidet p-40) na konečnou koncentraci 140 μς/πιΐ. Hodnota pH roztoku byla upravena na pH 5,5 s koncentrovanou H₃PO₄. K uvedenému roztoku byly přidány 2 U PNGázy F(Peptid-N4-(acetyl-beta-glukosaminyl)-asparagin amidáza z F1avobacteri um meningosepticum ; EC 3.5.1.52 /získaná od Roche) a vzorek byl přes noc inkubován při 37° C. Po inkubaci přes noc bylo pH roztoku upraveno na pH 5,5 s koncentrovanou H₃PO₄Proteiny a oligosacharidy byl následně precipitovány přidáním 4 objemů acetonu (při -20° C) a směsi byly inkubovány při -20° C po dobu 15 minut. Vzorky byly centrifugovány při 4° C, 13 000 otáčkách za minutu, po dobu 5 minut. Acetonový supernatant byl odstraněn a pelet byl po přidání 150 μΐ ledové chladného 60% methanolu inkubován při -20° C po dobu 1 hodiny. Methanolový supernatant obsahující uvolněné oligosacharidy byl odebrán a vysušen na rotační odparce (SpeedVac)<

Vysušené glykany z El, stejně jako referenční oligosacharidy (všechny od Glyko, Bicester, UK; viz Obrázek 55) Man-9 (11 monosacharidových jednotek), Man-8 (10 monosacharidových jednotek), Man-7 (9 monosacharidových

9 999 999

9 9 9 9999 9 999

9 999 99 999 99999

9999 9999 99 ·

99 99 99 99 9

145 jednotek), Man-6 (8 monosacharidových jednotek) a Man-5 (7 monosacharidových jednotek) byly rozpuštěny v 5 μΐ 2-aminobenzamidu (2-AB), jako značícímu reagens(± 0,35 M 2-AB ± 1 M NaCNBH₃ ve 30 % HOAc/70 % DMSO) tak, že byly získány konečné koncentrace glykanů mezi 5 a 100 μΜ. Roztok glykanů byl poté inkubován po dobu 2 hodin při 65° C. Po 30 minutách byl vzorek promíchán míchadlem Vortex. Po navázání byl přebytek 2-AB odstraněn následovně. Vzorek byl zředěn se 16 μΐ purifikované vody (MilliQ) a nanesen na sloupec Sephadex G-10 (o průměru 1 cm, výšce l,2cm, Amersham Biosciences; propojený se systémem VacElut systém, Varian), který byl vysušen.

Značené oligosacharidy byly eluovány nanesením 2 x 100 μΐ purifikované vody (MilliQ) na sloupec. Eluáty referenčních cukrů (Man-9, Man-8, Man-7 a Man-6) byly vysušeny a do analýzy HPLC uchovávány při -70° C. Eluáty ze vzorků Els, stejně jako referenční glykan Man-9, byly rozděleny do 4 očíslovaných zkumavek PCR a vysušeny. Byly provedeny reakce tak, jak jsou popsány v Tabulce 4, přičemž všechny reakce probíhaly přes noc při 37° C s výjimkou reakce ve zkumavce 3, která byla ukončena po 1 hodině. Použité koncentrace exoglykosidázových enzymů (všechny byly získány od Glyko, Bicester, UK) byly následující: a 1-2 manozidáza (Aspergillus saitoi}: 2 mU/ml; a-manozidáza (Jack Beán): 50 U/ml; a β-manozidáza (Helix pomatia}: 4 U/ml.

9 9 9

9 • •9 · · · · · 9 9 9 9 • 9 999 99 999 9 9 9 9 9

9999 9999 9 9 9

99 99 99 99 ·

146

Tabulka 8. Přehled reakčních směsí pro stanovení sekvence oligosacharidů.

	Zkumavka 1	Zkumavka 2	Zkumavka 3	Zkumavka 4	Zkumavka 5
Els (pmol)	400	400	400	400	400
al-2 mano- zidáza (μΐ)	-	4	-	-	-
α-manozidáza (μΐ)	-	-	5	5	5
β-mano- zidáza (μΐ)	-	-	-	-	4
inkubační pufr 4x (μΐ)	5	5	5	5	5
MilliQ H₂O (μΐ)	15	11	10	10	6

Obrázek 56 uvádí vyšší oligomanózu sestávající z 10 molekul manózy připojených k chitobióze. Každý terminální zbytek manózy je propojen vazbou a 1-3 k neterminálnímu zbytku manózy. Oligomanóza z Obrázku 56 je zcela rezistentní ke štěpení s exoglykosidázou a 1-2 manozidázou. Dlouhodobá inkubace (přes noc) oligomanózy podle Obrázku 56 s exoglykosidázou α-manozidázou vede ke štěpení všech α-vazeb (a 1-2, a 1-3, a 1-6), nikoliv však β-vazeb. Výsledným oligosacharidem je tak 4'^-manosyl chitobióza. Tato molekula 4'^-manosyl chitobiózy může být přeměněna na manózu a chitobiózu působením exoglykosidázy β-manozidázy. Podle specifikace dodavatele (Glyko) α-manozidáza zcela přeměňuje referenční oligosacharid Man-6 (viz Obrázek 55.

D) na 4'^-manosyl chitobiózu , jejíž další konverze na ·· φ φ · · • φ • · · · · · · ♦ · • · · · φ · · φ φ φφφ • · ··· · · φφφ φφφφφ • · · · · · · · ·· · •· ·· ·· ·· φ · φ

147 manózu a chitobiózu s β-manozidázou byla rovněž popsána jako kompletní.

Obrázek 57 uvádí vyšší oligomanózu sestávající z 9 molekul manózy připojených k chitobióze..V této oligomanóze je jeden terminální zbytek manózy propojen a 1-2 vazbou s neterminálním zbytkem manózy. Po působení exoglykosidázy a 1-2 manozidázy je uvedená 1-2-vázaná manóza odstraněna.

Po následném působení a manozidázy a β manozidázy je získán reakční produkt popsaný pro oligomanózu z Obrázku 56. Podle specifikace dodavatele (Glyko) je a 1-2 manozidáza schopna přeměnit referenční oligosacharidy Man-9 a Man-6 na Man-5 (viz Obrázek 55) s účinností > 90 %.

Obrázek 58 uvádí referenční vyšší oligomanózu Man-9 sestávající z 9 molekul manózy připojených k chitobióze.

V této oligomanóze jsou všechny terminální manózové zbytky připojeny vazbou a 1-2 k neterminálnímu zbytku manózy. Po působení exoglykosidázy a 1-2 manozidázy je tak Man-9 přeměněn na Man-5, a to podle specifikace výrobce z > 90 %. Následné štěpení s α-manozidázou konvertuje Man-5 na 4'-βmannosyl chitobiózu.

Obsahy odlišných reakčních zkumavek, jak jsou uvedeny v Tabulce 8, byly vysušeny v odstředivé vakuové odparce nebo v lyofilizačním zařízení a uchovávány při -70° C do analýzy HPLC. Před nanesením na sloupec byl každý vzorek (Els a referenční vzorek) rozpuštěn ve 25 μΐ vody a nanesen na sloupec TSK gel-Amide-80 (0,46 x 25 cm, Tosoh Biosep) propojený se zařízením Waters Alliance HPLC station.

Separace oligosacharidů byla prováděna při teplotě prostředí při průtoku 1,0 ml/min. Rozpouštědlo A sestávalo • · ·

z 0,1 % kyseliny octové v acetonitrilu a rozpouštědlo B sestávalo z 0,2 % kyselina octová-triethylamin vévodě. Separace oligosacharidů značených s 2-AB byla prováděna s použitím izokratické eluce 28 % B na 5 objemů sloupce s následujícím lineárním zvýšením na 45 % B během patnácti objemů sloupce.

Referenční oligosacharid Man-6 je eluován v 53 ± 1 min, Man-7 je eluován v 59 ± 1 min, Man-8 v 67 ± 2 min a Man-9 v 70 ± 1 min; 4'-β-mannosyl chitobióza se eluuje v 10 ± 1 min a chitobióza v 6 ± 1 min (neznázorněno). Výsledky jsou ilustrovány pro reakční produkty z Man-9 po inkubaci přes noc bez exoglykosidáz (stopa 1 na chromatogramu uvedeném na Obrázku 63; pouze Man-9), po inkubaci přes noc s α 1-2 manozidázou (stopa 2 na chromatogramu uvedeném na Obrázku 63 ; směs Man-5 a Man-6) po 1 hodinové inkubaci, nebo po inkubaci přes noc s α manozidázou (stopy 3 a 4, v uvedeném pořadí, znázorněné na chromatogramu ‘uvedeném na Obrázku 63; pouze 4'-β- mannosyl chitobióza), a po inkubací přes noc s a- a β-manozidázou (stopa 5 chromatogramu na Obrázku 63; pouze chitobióza). Stopa 6 chromatogramu uvedeném na Obrázku 63 zobrazuje gradient použitého rozpouštědla.

Oligosacharidovými produkty z reakce Els, produkovaných v Saccharomyces, (získané po působení PNGázy F) bez působení exoglykosidáz byly převážně čtyři cukry, přítomné v eluátu z 59 ± 1 min (15%), 67 ± 1 min (45%), 70 ± 1 min (25%) a 75 ± 1 min (15%). Celkový obsah

Man(8)GlcNAc(2) a Man(9)GlcNAc(2) v Els, produkovaných v Saccharomyces, byl ~ 65 %. V reakci s α 1-2 manozidázou vymizely pouze karbohydráty s retenčním časem 70 ± 1 min. Intenzita cukru s retenčním časem 75 ± 1 min zůstávala • · • ·

149 stejná a intenzita cukru s retenčním časem 67+1 min byla zvýšena. To znamená, že ne všechny terminální manózové jednotky mají konfiguraci a(l-2). Po inkubaci přes noc s a manozidázou byly všechny řetězce cukrů redukovány na sloučeninu 4'-β-mannosyl chitobiózy. To znamená, že cukrem je vyšší manóza a všechny zbytky manózy, s výjimkou jediného, mají konfiguraci a. Redukce této 4'-β-mannosyl chitobiózové sloučeniny na chitobiózu byla zřejmá po inkubaci přes noc s β manozidázou. Výsledné chromatogramy, znázorněné na Obrázku 64, byly získány za shodných podmínek, jaké byly popsány pro chromatogramy z Obrázku 63. Výsledky souhrnně uvádí Tabulka 9.

Shodné pokusy byly opakovány s Els, produkovanými v buňkách infikovaných virem vaccinia, a překvapivě ukázaly zcela odlišný výsledek. V reakci bez enzymů byla přítomna komplexní směs cukrů (viz Obrázek 65 a Tabulka 9). Celkový obsah monosacharidu (8)-GlcNAc(2) a monosacharidu (9)-GlcNAc(2) byl 37 %. Po reakci s a 1-2 manozidázou vymizely cukry s retenčními časy 70 + 1 a 59 ± 1 min. Po inkubaci přes noc s a manozidázou přetrvávalo významné množství monosacharidu(6)-GlcNAc(2) vedle 4'β-mannosyl chitobiózového produktu. Toto je důkazem pro to, že jedna z oligosacharidových větví je k degradaci s a manozidázou rezistentní. Lze to vysvětlit přítomností 1 nebo 2 zbytků glukózy připojených k Mana(1-2)-ukončené větvi N-vázaného oligosacharidu. Domnělá struktura takovýchto oligosacharidů obsahujících glukózu je uvedena na Obrázku 62. Možné produkty reakce z oligosacharidů obsahujících glukózu jsou uvedeny v Tabulce 10. Vzhledem k tomu, že žádný oligosacharid ekvivalentní k Man-7 (např. oligosacharid sestávající z 9 monosacharidu) nepřetrvává po reakci s • · · · · · · · · • · · · · · · · · · · · • · ··· ·· ··· · ···· • · · · · · · · ·· · • · · * · · · · · · ·

150 α 1-2 manozidázou, jsou tyto glukózové zbytky s největší pravděpodobností připojen k B-větvi oligosacharidové struktury uvedené na Obrázku 62. Nicméně, nelze vyloučit, že jak A-, tak B-vštev oligosacharidu na Obrázku 62 nejsou částečně ukončeny glukózou.

Redukce 4'-β-mannosyl chitobiózové sloučeniny na chitobiózu byla zřejmá po inkubaci přes noc s β manozidázou. Výsledné chromatogramy, znázorněné na Obrázku 65, byly získány za shodných podmínek, jaké byly popsány pro chromatogramy z Obrázku 63. Výsledky souhrnně uvádí Tabulka 9.

Shodné pokusy byly provedeny s Els, produkovanými v Hansenula, a překvapivě bylo zjištěno, že byl získán zcela odlišný výsledek. V reakci bez enzymů byly převážně přítomny dva cukry s retenčními časy 67+2 min a 70 ± 1 min, které odpovídají Man-8 a Man-9, v uvedeném pořadí. Celkový obsah Man(8)-GlcNAc(2) a Man(9)-GlcNAc(2) v Els, produkovaných v Hansenula, byl ~ 90 %. Po reakci s α 1-2 manozidázou byly cukry redukovány převážně na Man-5 s retenčním časem 45 ± 1 min a na Man-6 s retenčním časem 53+1 min. Po inkubaci přes noc Po inkubaci přes noc s α manozidázou byly všechny řetězce cukrů redukovány na sloučeninu 4'-β-mannosyl chitobiózy. To znamená, že cukrem je vyšší manóza a všechny zbytky manózy, s výjimkou jediného, mají konfigurací a. Redukce této 4'-β-mannosyl chitobiózové sloučeniny na chitobiózu byla zřejmá po inkubaci přes noc s β manozidázou. Výsledné chromatogramy, znázorněné na Obrázku 66, byly získány za shodných podmínek, jaké byly popsány pro chromatogramy z Obrázků 6365. Výsledky souhrnně uvádí Tabulka 9.

• · ·· • · · ···!

• ··· • · ·

151

Tabulka 9. Oligomanózy vznikající ze štěpení oligomanóz získaných z Els, produkovaných v Saccharomyces („Sc) a Hansenula („Hp), stejně jako z Els, produkovaných savčími buňkami infikovanými HCV-rekombinantním virem vaccinia („Vac). Jsou uvedeny odlišné oligomanózy s jejich chromatografickými retenčními časy („Rt, v minutách) a procento dané oligomanózy vzhledem k celkovému obsahu oligomanóz (horní řádky), jakož i nejpravděpodobnější struktura pro každou zjištěnou oligomanózu, uvedená odkazem na některý z Obrázků 55-62. Oligomanózy s terminálními α 1-3 manózami jsou označeny symbolem . Oligomanózy s terminálními glukózami jsou označeny symbolem „*, u některých odkazů poznámka „od 62* znamená, že tato struktura může být odvozena ze struktury uvedené na Obrázku 62. Číslo „1 znamená reakci bez exoglykosidáz, číslo „2 znamená reakci s α 1-2 manozidázou. Předpokládá se, že oligomanóza s retenčním časem 45 ± 1 min je oligomanózou, která obsahuje 5 zbytků manózy připojených k chitobióze. Předpokládá se, že oligomanóza s retenčním časem 75 ± 1 min je oligomanózou, která obsahuje 10 zbytků manózy připojených k chitobióze.

	(Man- 5 Rt: 5±1	Man-6 Rt: 53±1	Man-7 Rt: 5±1	Man-8 Rt: 67±1	Man-9 Rt: 70±l	(Man-10) Rt: 75±1
Sc 1	/	1 %	14 %	42 %	23 %	18 %
struk-		55.D	55.C	59°	57°	56°
tura					61°
Sc 2	17 %	/	8 %	50 %	6 %	16 %
struk-	55.E		60°	59°	57°	56°
tura					61°
Vac 1	3 %	32 %	20	23 %	14 %	5 %

·· ·*« ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 · ···· · ··· • · 9 9 9 9.9 9 9 9 9 999 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 9

152

struk- tura	55.E	od 62* & Tabulka 10	55.C	od 62* & Tabulka 10	od 62* & Tabulka 10	od 62* & Tabulka 10
Vac 1	74 %	2 %	/	20 %	4 %	/
struk-	55.E	od 62*		od 62*	od 62*	od 62*
tura		&		&	&	&
		Tabulka		Tabulka	Tabulka	Tabulka
		10		10	10	10
Hp 1	/	2 %	7 %	54 %	36 %	/
struk-		55.D	55.C	55. B	58
tura
Hp 2	80 %	20 %	/	/	/	/
struk-	55.E	55.D
tura

Tabulka 10. Produkty z N-vázaných oligosacharidů obsahujících glukózu po reakci s a 1-2 manozidázou, nebo s a 1-2 manozidázou a a manozidázou.

	Man- ekvivalent	Produkt a 1-2	Produkt a manozidázy (po (1))·
manozidázy	(1)
Větev A + 2 Glc	Man-10	Man-8		Man-6
Větev A + 1 Glc	Man-9	Man-7		Man-6
Větev A + žádný Glc	Man-8	Man-5		4'-β-manosyl chitobióza
Větev B + 2 Glc	Man-10	Man-9		Man-6
Větev B + 1 Glc	Man-9	Man-8		Man-6

· ·< 9999

9 9 9 9 9 • · 9 9 9*99

9 999 99 ·

9

9 9

9 9 9

99999

153

Větev B +	Man-8	Man-5	4'~P~manosyl
žádný Glc			chitobióza

PŘÍKLAD 27

OBSAZENOST N-GLYKOSYLAČNÍCH MÍST V REKOMBINANTNÍM HCV El

V závislosti na množství obsazených N-glykosylačních míst vykazují Els odlišné migrační chování v analýze SDSPAGE. Na základě této vlastnosti je možné stanovit průměrné množství obsazených N-glykosylačních míst v produktu El. Za tímto účelem byly vzorky purifikovaného produktu El podrobeny SDS-PAGE a barvení s modří Coomassie Brilliant Blue (Obrázek 67), a. dále byly analyzovány s použitím softwaru ImageMaster ID Prime Software packet (Pharmacia). Stručně řečeno, gel byl skenován a pro každý proteinový pruh bylo stanoveno % výskytu (jeho intenzita v porovnání s celkovou intenzitou odlišných pruhů, zatímco součet všech pruhů je 100 %) (Tabulka 11). Je třeba uvést, že každý specifický proteinový pruh představuje molekuly Els se stejným počtem obsazených N-glykosylačních míst.

Získané výsledky potvrzují, že hlavní podíl (> 90 %) produktu El, produkovaného v Hansenula, má 1 nebo více Nglykosylačních míst méně obsazených, než Els, získaný z vaccinia expresivního systému (jaký popsal Maertens et al. ve W096/04385). Za předpokladu, že v produktu El z vaccinia jsou všechna N-glykosylační místa obsazena (přičemž v El je sekvence „NNSS (SEQ ID NO: 73) v pozici 233-236 považována za jedno glykosylační místo), lze téměř s jistotou usuzovat, že průměrný počet obsazených Nglykosylačních míst v proteinu El, exprimovaném v Hansenula, nepřesahuje 80 % všech dostupných Nglykosylačních míst.

ΒΒ ···· ·« ··

154 ♦ Β Β

Β Β Β • Β • Β

Β *

ΒΒΒΒ

Tabulka 11. Stanovení průměrného počtu obsazených Nglykosylačních míst v proteinech El, získaných z Hansenula polymorpha a vaccinia/vero expresivních systémů, s SDS-PAGE a analýzou intenzity barvení s modří Coomassie Brilliant Blue. Proteinové pruhy jsou označeny molekulovou hmotností. Viz Obrázek 67.

Alkylováné Els	% výskytu (relativní intenzita)
Hansenula polymorpha	Pokus 1	Pokus 2
MW 2 9	9	8
MW 25	25	27
MW 21	38	42
MW 18	27	22
MW 14-15	nestanovováno	nestanovováno
Vacclnia/Vero
MW 29	100	100

PŘÍKLAD 28

OBSAZENOST N-GLYKOSYLAČNCH MÍST V REKOMBINANTNÍM HCV E2

Dvě sta (200) gg proteinu E2-H6, produkovaného v Hansenula, bylo deglykosylováno s PNGázou F. Deglykosylované proteiny E2-H6 byly naneseny na mini-gel (10 gg/dráha). Proteinové pruhy byly štěpeny s trypsinem a endo Asp-N. Hmotnost výsledných proteinů byla stanovena metodou Maldi-MS (dried droplet and thin layer method).

Tato metoda může být použita ke stanovení stupně Nglykosylace: během deglykosylace s enzymem PNGázou F je úplný řetězec cukrů odštěpen a současně je asparagin (N) hydrolyzován na kyselinu asparagovou (D). Hmotnostní rozdíl «» ···· ·« ·» ·· » • v * · « · ♦ · r • · t · · ··· · · · · « 9 · · » ·· 999 9 ♦ ···

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 9

155 mezi těmito dvěma aminokyselinami je 1 Da, který může být stanoven hmotnostní spektrofotometru. Kromě toho hydrolýza N na D vytváří nové štěpící místo pro enzym Asp-N.

Možnými místy glykosylace v E2 jsou N₄₁₇, N₄₂₃, N₄₃₀,

N₄₄8, N₄7s, N₅32, N5₄o, N556, N576, Νβ23 ^a Νβ₄5 (viz Obrázek 68). Analýza Maldi-MS prokázala, že v každém z těchto glykosylačních míst nebyla N-glykosylace úplná, protože po deglykosylaci s PNGázou F byly nalézány peptidy buďto s N nebo D glykosylačním místem (s hmotnostním rozdílem 1 Da). Poměr počtu zbytků D a počtu zbytků N uvádí průměrné obsazení jednoho N-glykosylačního místa řetězcem cukrů ve všech proteinech E2, exprimovaných v Hansenula, a přítomných v analyzovaném vzorku. Uvedené výsledky jsou sumarizovány v Tabulkách 12 až 14.

Z výsledků bylo vypočteno, že v průměru každé glykosylační místo bylo glykosylováno přibližně z 54 %.

Tabulka 12. Procento glykosylace stanovené v peptidu štěpeném trypsinem a obsahujícím jedno N-glykosylační místo.

N-glykosylační místo	Glykosylováno	Neglykosylováno
N430	60 %	40 %
N448	50 %	50 %
N556	80 %	20 %
N576	90 %	10 %
N623	20 %	80 %
N645	10 %	90 %

• · ·

9 9 9 • 9 9991 »9 ·· ♦· • · · · • · 9 9 · • · · · · · ·

9 9 9

156

Tabulka 13. Procento glykosylace stanovené v peptidu štěpeném trypsinem a obsahujícím dvě N-glykosylační místa.

N- glykosylační místo	Obě místa glykosylována	1 ze 2 míst glykosylováno	Žádné místo glykosylováno	Vypočteno pro jednotlivé N
N417 a N423	70 %	25 %	5 %	85 %
N532 A n540	0 %	80 %	20 %	40 %

Tabulka 14.Procento glykosylace stanovené pro N478 v produktu štěpení s Asp-N.

N-glykosylační místo	Glykosylováno	Neglykosylováno
N478	35 %	65 %

PŘÍKLAD 29

REAKTIVITA DARCOVSKÝCH KREVNÍCH SÉR S HCV El, PRODUKOVANÝCH V SACCHAROMYCES NEBO V HANSENULA

Els-H6, produkované v Saccharomyces (exprimovaných s α-MF vedoucí sekvencí) a Els-H6, produkovaných v Hansenula (exprimovaných s vedoucí sekvencí CL) byly oba purifikovány tak, jak bylo popsáno v Příkladech 15 a 16, a na závěr byly podrobeny alkylaci a tvorbě VLP, tak jak bylo popsáno v Příkladu 20. Oba proteiny byly přímo adsorbovány na mikrotitrační destičky v množství 0,5 μg/ml (1 hodina, 37° C), a po blokování destičky (PBS-0,1 % kasein, 1 hodinu,

37° C) byla séra testovaná na HCV a séra z negativních dárcovských krví inkubována ve zředění 1/20 (PBS-0,5 % kasein, 10 % (hmotn./objem) sacharóza, 0,2% (objem/objem) Triton X-705, 1 hodinu, 37° C) . Nakonec bylo detekováno navázání s použitím sekundárního králičího antiséra se specifickými protilátkami proti lidskému IgG-Fc, spojeným s • · « ·

157 peroxidázou (Dako, Denmark) ve zředění 1/50 000 (PBS-0,1 % kasein, 1 hodina, při teplotě místnosti), a následovalo barvení. Mezi všemi stupni byly destičky 3krát promyty s PBS-0,05% (hmotn./objem) Tweenem-20. Pro srovnání byla také stejným způsobem analyzována séra s Els, získanými ze savčích buněk, které byly připraveny a purifikovány tak, jak popsal Depla et al. ve W099/67285.

Mezní hodnoty pro tuto zkoušku ELISA byly stanoveny jako dvojnásobek průměru pozadí (např. reaktivita všech sér ve shodném provedení, avšak se streptavidinem navázaným na jamky).

Z Tabulky 15 je možné usuzovat, že mnohé ze sér (75 %) vykazují reaktivitu nad mezní hodnotou vůči El, produkovaným v Saccharomyces, zatímco pouze několik sér (6 %) vykazuje nějakou reaktivitu nad mezní hodnotu vůči El, produkovaným v Hansenula. Uvedený rozdíl v reaktivitě je přičítán přítomnosti terminálních a 1-3 manóz spojených s a 1-2 manózami na El, produkovaném v Saccharomyces, jak bylo zaznamenáno v Příkladu 26. Young et al. (1998) již dříve naznačili, že tento typ manóz je také zodpovědný za reaktivitu lidských sér s mananem, získaným ze Saccharomyces. Aby bylo dále potvrzeno, že reaktivita El, získaného ze Saccharomyces, může být přičítána tomuto typu manózy, byla opakována zkouška ELISA na El, produkovaném v Saccharomyces, se zředěním dárcovských krevních sér preinkubovaných (1 hodinu při 37° C) s 1 nebo 5 mg/ml mananu (Sigma), který byl přidán do ředícího pufru. Jak lze usoudit z Tabulky 16, preinkubace s mananem redukovala aktivitu tohoto El s dárcovskými krevními séry, a to způsobem závislým na koncentraci k hodnotám pozadí ke všem sérům (s výjimkou jediného (F556) analyzovaného séra) • · ·

158

Průměrná hodnota je snížena z 0,24 bez kompetice s mananem na 0,06 při použití 5 mg mananu/ml).

Tabulka 15. Reaktivita El, produkovaného v Hansenula, Saccharomyces a V savčích buňkách. Reaktivity nad mezní hodnotu jsou uvedeny ve zvýrazněných polích.

číslo séra	Hansenula El	Saccharo- myces El	Savčí El	Slepý vzorek
F552	0, 18 ....rt.i». 'i í		0,056	0,05
F553	0,062	0, 449	0,056	0,052
F555	0, 06	0,079	0,054	0,051
F556	0,073	0, 679	0,054	0,051
F557	0,059	\|,173	0, 053	0,05
F558	0,066	C,	0,06	0,058
F559	0,084	0,309	0,056	0,053
F560	0,062	0,338	0,052	0,052
F562	0,056	0,128	0, 053	0,053
F563	0, 064	0, 181	0,059	0,056
F570	0,056	0,135	0,054	0,055
F571	0, 06	0,209	0,054	0,055
F572	0,061		0,055	0,056
F575	0,079	0,104	0,062	0,056
F576	0, 061		0,058	0,057
F577	0,063	0,224	0,055	0,058
F578	0,089	0,131	0,057	0,061
F581	0,064	0,098	0, 061	0, 057
F594	0, 055	,	0,056	0,057
F595	0, 059	0,539	0,057	0,058
F598	0,076	0,311	0,056	0,059
F450	0,205	0, 078	0,099	0,059
F453	0, 059		0,057	0,06
F456	0,058	0,121	0, 056	0,06

• · • ··< • ·

159

F458	0, 055	0,088	0,054		0,054
F459	0,054	0,069	0,056		0,054
F463	0, 055	0, 083	0,054		0,056
F466	0,086	0,208		0,071		0,094
F467	0, 066	0,3-44		0,055		0,055
F469	0, 059	0,074	0,057		0,057
F470	0,074	0,222		0,056		0,056
F473	0,094	0,807		0,054		0,057
F479	0,06	0,075	0,06		0, 051
F480	0,053	88B		0,056		0,053
F481	0,059	0,395		0,071		0,052
F488	0, 063	0,467		0,059		0,053
průměr	0,072	0,242	0,058	i
# sér nad mezní hodnotou	2/36	27/36
% sér nad mezní hodnotou	6	75

Tabulka 16. Reaktivita El, produkovaného v buňkách

Saccharomyces, tak jako v Tabulce 15, avšak v přítomnosti 5 mg mananu/ml. Reaktivity nad mezní hodnotu jsou uvedeny ve zvýrazněných polích.

Číslo séra	Koncentrace mananu
0 mg/ml	1 mg/ml	5 mg/ml
F552	0,207	0,128	0,103
F553	0,487	0,098	0,050
F555	0,066	0,044	0,041
F,556	0,769	0,540	0,372

• Β · Β · ·

Β Β Β Β · · · ·

Β ΒΒ Β · Β Β ΒΒ

160

Β Β

F557	0,158	0,094	0,088
F558	0,250	0,076	0,046
F559	0,300	0,077	0, 066
F560	0,356	0, 088	0,044
F562	0,122	0,106	0,089
F563	0, 164	0,091	0, 049
F570	0,110	0,043	0,040
F571	0,212	0, 057	0,042
F572	0,464	0,087	0,043
F575	0,095	0,081	0,062
F576	0,138	0,042	0,043
F577	0,216	0, 042	0,041
F578	0, 125	0,100	0,093
F581	0,083	0,064	0,042
F594	0, 102	0,044	0,041
F595	0,520	0, 088	0,044
F598	0,340	0,054	0, 042
F450	0,053	0,060	0,053
F453	0,116	0,049	0, 044
F456	0,112	0,050	0,043
F458	0,086	0,051	0, 042
F459	0,054	0,044	0,042
F463	0,078	0, 043	0, 041
F466	0,172	0,111	0,085
F467	0,420	0,117	0,049
F469	0,053	0,043	0, 041
F470	0,220	0, 070	0,061
F473	0, 924	0,183	0,063
F479	0,059	0,049	0,043
F480	0,281	0,155	0,054
F481	0,355	0,042	0,046
F488	0,474	0,090	0, 046
průměr	0,243	0,089	0,062

·· ·· ·· ·· ·

161

SEZNAM ODKAZŮ

Agaphonov, M. O., Beburov, Μ. Y., Ter Avanesyan, M. D., and Smirnov, V. N. (1995) A disruption-replacement approach for the targeted integration of foreign genes in Hansenula polymorpha. Yeast 11: 1241-1247.

Agaphonov, M. O., Trushkina, Ρ. M., Sohn, J.H., Choi, E.

S., Rhee, S. K., and Ter Avanesyan, M. D. (1999) Vectors for rapid selection of integrants with different plasmid copy numbers in the yeast Hansenula polymorpha DLI. Yeast 15: 541-551.

Alber, T. and Kawasaki, G. (1982) Nucleotide sequence of the triose phosphate isomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol Appl. Genet 1: 419-434.

Ammerer, G.(1983) Expression of genes in yeast using the ADCI promotér. Methods Enzymol. 101: 192-201.

Ballou, L.,Hitzeman, R. A., Lewis, M. S., and Ballou, C. E.

(1991) Vanadate-resistant yeast mutants are defective in protein glycosylation. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A 88: 3209-3212.

Beekman, N. J., Schaaper, W. M., Tesser, G. I., Dalsgaard,

K., Kamstrup, S., Langeveld, J. P., Boshuizen, R. S., and Meloen, R. H. (1997) Synthetic peptide vaccines:

palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity. J. Pept. Res. 50: 357-364.

·· ·· ·· ·· ··

162

Burns, J. , Butler, J., and Whitesides, G. (1991) Selective reduction of disulfides by Tris (2carboxyethyl) phosphine. J. Org. Chem. 56: 2648-2650.

Cox, H., Mead, D., Sudbery, P., Eland, R. M., Mannazzu,I., and Evans, L. (2000) Constitutive expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha using the PMA1 promotér. Yeast 16: 1191-1203.

Cregg, J. M. (1999) Expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. In Gene expression systems: using nátuře for the art of expression, J. M. Fernandez and J. P. Hoeffler, eds (San Diego: Academie Press), pp. 157-191.

Darbre, A.(1986) Practical protein chemistry: a handbook. Whiley & Sons Ltd.

Diminsky, D., Schirmbeck, R., Reimann, J., and Barenholz,

Y. (1997) Comparison between hepatitis B surface antigen (HBsAg) partlcles derived from mammalian cells (CHO) and yeast cells (Hansenula polymorpha): composition, structure and immunogenicity. Vaccine 15: 637647.

Doms, R. W., Lamb, R. A., Rose, J. K., and Helenius, A.

(1993) Folding and assembly of viral membrane proteins. Virology 193: 545-562.

Elble, R. (1992) A simple and efficient proceduře for transformation of yeasts. Biotechniques 13: 18-20.

Fellinger, A. J. , Verbakel, J. M. , Veale, R. A., Sudbery,

P. E,, Bom, I. J., Overbeeke, N., and Verrips, C. T. (1991) Expression of the alpha-galactosidase from Cyamopsis ·· · tetragonoloba (guar) by Hansenula polymorpha. Yeast 7: 463

473.

Fournier, J. A., Cahour, A., Escriou, N. , Girad, M. , and Wychowski, C. (1996) Processing of the El glycoprotein of hepatitis C virus expressed in mammalian cells. J. Gen Virol. 77 (Pt 5): 1055-1064.

Gailit, J. (1993) Restoring free sulfhydryl groups in synthetic peptides. Anal. Biochem. 214: 334-335.

Garson, J. A., Lubach, D., Passas, J. , Whitby,K., and Grant, P. R. (1999) Suramin blocks hepatitis C binding to human hepatoma cells in vitro. J. Med. Virol. 57: 238-242.

Gatzke, R., Weydemann, U., Janowicz, Z. A., and Hollenberg,

C. P. (1995) Stable multicopy integration of vector sequences ín Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:844-849.

GELlissen, G. (2000) Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741-750.

Grakoui, A., Wychowski, C., Lin, C., Feinstone, S. M., and Rice, C. M. (1993) Expression and Identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J. Virol. 67: 1385-1395.

Grinna, L. S. and Tschopp, J. F. (1989) Size distribution and generál structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast 5: 107-115.

·* ·

« φ • · « φ ·»··

164

Heile, J. Μ., Fong, Υ. L. , Rosa, D., Berger,Κ., Saletti, 6., Campagnoli, S.,Bensi, 6., Čapo, S., Coates, S., Crawford, Κ., Dong, C., Wininger, Μ., Baker, 6., Cousens,

L., Chien, D.,Ng, P., Archangel, P., 6randi, G.,Houghton

Μ., and Abrignani, S. (2000) Evaluation of hepatitis C virus glycoprotein E2 for vaccine design: an endoplasmic reticulum-retained recombinant protein is superior to secreted recombinant protein and DNA-based vaccine candidates. J. Virol. 74: 6885-6892.

Helenius, A. (1994) How N-linked oligosaccharides affect glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Biol. Cell 5: 253-265.

Hermanson, 6. T. (1996) Bioconjugate techniques. San Diego Academie Press.

Herscovics, A. and Orlean, P. (1993) Glycoprotein biosynthesis in yeast. FASEB J. 7: 540-550.

Hijikata, Μ., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, Μ., and Shimotohno, K. (1991) Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A 88 5547-5551.

Hitzeman, R. A., Clarke, L., and Carbon, J. (1980) Isolation and characterization of the yeast 3phosphoglycerokinase gene(PGK) by an immunological sereening technique. J. Biol. Chem. 255: 12073-12080.

·* · • · · • · · ·

···· ♦ · • · · • · • · · ·· · · ·· ·· • · · · • · ··· • · · · · • · · · ·· ·»

165

Hollenberg, C. P. and GELlissen, G. (1997) Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 554-560.

Holmgren, A. (1979) Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chem. 254: 9627-9632.

Janowicz, Z. A., Melber, K., Merckelbach, A., Jacobs, E., Harford, N., Comberbach, M. , and Hollenberg, C.P. (1991) Simultaneous expression of the S and L surface antigens of hepatitis B, and formation of mixed particles in the methylotrophic yeast, Hansenula polymorpha. Yeast 7: 431443.

Jayabaskaran, C., Davison, P. F. , and Paulus, H. (1987) Facile preparation and some applications of an affinity matrix with a cleavable connector arm containing a disulfide bond. Prep. Biochem. 17: 121-141.

Jenkins, N., Parekh, R. B. , and James, D. C. (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat. Biotechnol. 14:975-981.

Julius, D., Brake, A., Blair, L., Kunisawa, R., and Thorner, J. (1984) Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine-cleaving endopeptidase required for Processing of yeast prepro-alpha-factor. Cell 37: 1075-1089.

Kalef, E., Walfish, P. G., and Gitler, C. (1993) Arsenicalbased affinity chromatography of vicinal dithiol-containing proteins: purification of L1210 leukemia cytoplasmic • · ·· · ··· · · · ·· · ····* ♦ · · · • · ··· ·· ··· ····· ···· · · · · ·..* :

·· ·· ·· ·· ·· ·

166 proteins and the recombinant rat c-erb A beta 1 T3 receptor. Anal. Biochem. 212: 325-334.

Kalidas, C., Joshi, L., and Batt, C. (2001)

Characterization of glycosylated variants of betalactoglobulin expressed in Pichia pastoris. Protein Eng 14: 201-207.

Kato, N.,0otsuyama, Y. , Tanaka, T., Nakagawa, M., Nakazawa, T., Muraiso, K., Ohkoshi, S., Hijikata, M., and Shimotohno,

K. (1992) Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses. Virus Res. 22: 107-123.

Kawasaki, G. and Fraenkel, D. G. (1982) Cloning of yeast glycolysis genes by complementation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 108: 1107-1122.

Klebe, R. J., Harriss, J.V., Sharp, Z. D., and Douglas, M.

G. (1983) A generál method for polyethylene-glycol-induced genetic transformation of bacteria and yeast. Gene 25: 333341.

Kumar, N. , Kella, D., and Kinsella, J. E. (1985) A method for the controlled cleavage of disulfide bonds in proteins in the absence of denaturants. J. Biochem. Biophys. Methods 11: 251-263.

Kumar, N., Kella, D., and Kinsella, J. E. (1986) Anomalous effects of denaturants on sulfitolysis of protein disulfide bonds. Int. J. Peptide Prot. Res. 28: 586-592.

• · • · · ·

167

Maertens, G. and Stuyver, L. (1997) Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In The molecular medicine of viral hepatitis, T. J. Harrison and A. J. Zuckerman, eds John Wiley & Sons), pp. 183-233.

Major, Μ. E. and Feinstone, S. M. (1997) The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 25: 1527-1538.

Miele, R. G. , Nilsen, S. L., Brito, T., Bretthauer, R. K. , and Castellino, F. J. (1997) Glycosylation properties of the Pichia pastoris-expressed recombinant kringle 2 domain of tissue-type plasminogen activator. Biotechnol. Appl. Biochem. 25 (Pt 2): 151-157.

Meunier, J. C., Fournillier, A., Choukhi, A., Cahour, A., Cocquerel, L., Dubuisson, J. , and Wychowski, C. (1999) Analysis of the glycosylation sites of hepatitis C virus (HCV) glycoprotein El and the influence of El glycans on the formátion of the HCV glycoprotein complex. J. Gen Virol. 80 (Pt 4): 887-896.

Montesino, R., Gatcía, R., Quintero, O., and Cremata, J. A.

(1998) Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 14: 197-207.

Mustilli, A. C., Izzo, E., Houghton, M. , and Galeotti, C.

L. (1999) Comparison of secretion of a hepatitis C virus glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae andKluyveromyces lactis. Res. Microbiol. 150: 179-187.

·· · ·» ···· ·· ·· ·· ·· ··

168

Nagai, Κ. and Thogersen, H. C. (1984) Generation of betaglobin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli. Nátuře 309: 810-812.

Nielsen, P. E. (2001) Targeting double stranded DNA with peptide nucleic acid (PNA). Curr. Med. Chem. 8: 545-550.

Okabayashi, K., Nakagawa, Y., Hayasuke, Ν., Ohi, H., Miura, Μ., Ishida, Y.,Shimizu, Μ., Murakami, K., Hirabayashi, K. , Minamino, H., and (1991) Secretory expression of the human. sérum albumin gene in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. J. Biochem. (Tokyo) 110: 103-110.

Orum, H. and Wengel, J. (2001) Locked nucleic acids: a promising molecular family for gene-function analysis and antisense drug development. Curr. Opin. Mol. Ther. 3: 239243.

Padgett, K. A. and Sorge, J. A. (1996) Creating seamless junctions independent of restriction sites in PCR cloning. Gene 168: 31-35.

Panchal, T. and Wodzinski, R. J. (1998) Comparison of glycosylation patterns of phytase from Aspergillus niger (A. ficuum) NRRL 3135 and recombinant phytase. Prep.

Biochem. Biotechnol. 28: 201-217.

Pedersen, J., Lauritzen, C., Madsen, Μ. T., and Weis, D. S.

(1999) Removal of N-terminal polyhistidine tags from recombinant proteins using engineered aminopeptidases. Protein Expr. Purif. 15: 389-400.

·· ·· ·* ·· ·

169 (1998) Solubilization of • · • · • · • ·

Pomroy, N. C. and Deber, C. M.

hydrophobic peptides by reversible cysteine PEGylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 618-621.

Raymond, C. K. (1999) Recombinant protein expression in Pichia methanolica. In Gene expression systems: using nátuře for the art of expression, J. M. Fernandez and J. P.Hoeffler, eds (San Diego: Academie Press), pp. 193-209.

Rein, A., Ott, D. E., Mirro, J. , Arthur, L. O., Rice, W. , and Henderson, L. E. (1996) Inactivation of murine leukemia virus by compounds that react with the zinc finger in the viral nucleocapsid protein. J. Virol. 70: 4966-4972.

Roggenkamp, R., Hansen, H., Eckart, M., Janowicz, Z., and Hollenberg, C. P. (1986) Transformation of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors. Mol.Gen. Genet. 202: 302-308.

Rosa, D., Campagnoli, S., Moretto, C., Guenzi, E., Cousens, L., Chin, M. , Dong, C., Weiner, A. J. , Lau, J. Y., Choo, Q. L., Chien, D., Pilaři, P., Houghton, M. , and Abrignani, S.

(1996) A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A 93: 1759-1763.

Rose, J. K and Doms, R. W. (1988) Regulation of protein export from the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell.

Biol. 4: 257-288.

• * • · · ··· ··· • · · · · · · · · · · · • · ··· · · ··· ····· • · ·· ·· ·· · * ·

170

Russell, D. W., Smith, M. , Williamson, V. M. , and Young, E.

T. (1983) Nucleotide sequence of the yeast alcohol dehydrogenase II gene. J. Biol. Chem. 258: 2674-2682.

Russell, P. R. (1983) Evolutionary divergence of the mRNA transcription initiation mechanism in yeast. Nátuře 301: 167-169.

Russell, P. R. (1985) Transcription of the triosephosphate-isomerase gene of Schizosaccharomyces pombe initiates from a start point different from that in Saccharomyces cerevisiae. Gene 40: 125-130.

Russell, P. R. and Halí, B. D. (1983) The primary structure of the alcohol dehydrogenase gene from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Biol. Chem. 258: 143-149.

Sambrook, J., Fritsch, E. F., andManiatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Scorer, C. A., Clare, J. J., McCombie, W. R., Romans, M.

A., and Sreekrishna, K. (1994) Rapid selection using G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high level foreign gene expression. Biotechnology (N. Y.)

12: 181-184.

Singh, R. and Kats, L. (1995) Catalysis of reduction of disulfide by selenol. Anal. Biochem. 232: 86-91.

Sohn, J.H., Choi, E. S., Kang, H. A., Rhee, J. S., and Rhee, S. K. (1999) A family of telomere-associated autonomously replicating sequences and their functions in • · · · • « • · · • · · ··· · · · • · · · ···· · ··· • · · · · ·· ··· ····· targeted recombination in Hansenula polymorpha DL-1. J. Bacteriol. 181: 1005-1013.

Stuyver, L. , van Arnhem, W. , Wyseur, A., Hernandez, F., Delaporte, E., and Maertens, G. (1994) Classification of hepatitis C viruses based on phylogenetic analysis of the envelope 1 and nonstructural 5B regions and Identification of five additional subtypes. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A 91: 10134-10138.

Sugrue, R. J., Cui, T., Xu, Q., Fu, J., and Chán, Y. C.

(1997) The production of recombinant dengue virus E protein using Escherichia coli and Pichia pastoris. J. Virol. Methods 69: 159-169.

Thakur, M. L., DeFulvio, J., Richard, M. D., and Park, C.H.

(1991) Technetium-99m labeled monoclonal antibodies: evaluation of reducing agents. Int. J. Rad. Appl. Instrum.B 18: 227-233.

Trimble, R. B., Atkinson, P.H., Tschopp, J.F., Townsend, R. R., and Maley, F. (1991) Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Biol. Chem. 266: 22807-22817.

Vingerhoeds, M.H., Haisma, H. J., Belliot, S. O., Smit, R. H., CroxnmElin, D. J. , and Storm, G. (1996) Immunoliposomes as enzyme-carriers(immuno-enzymosomes) for antibodydirected enzyme prodrug therapy (ADEPT): optimization of prodrug activating capacity.Pharm. Res. 13: 604-610.

Wahlestedt, C., Salmi, P., Good, L., Kela, J., Johnsson,

T., Hokfelt, T.,Broberger, C., Porreca,F., Lai, J., Ren, ······ ·· ·· · · · • · · ··· ··· • · · · · ··· · · · · • · ··· · · · · · ····· ·*·· · · · · ··· ·· ·· ·· ·· ·· ·

172

Κ., Ossipov, Μ., Koshkin, A., Jakobsen, N.,Skouv, J., Oerum, H., Jacobsen, Μ. H., and Wengel, J. (2000) Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A 97: 5633-5638.

Weydemann, U., Keup, P.,Piontek, M., Strasser, A. W., Schweden, J. , GELlissen, G. , and Janowicz, Z. A. (1995) High-level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha-authentic processing of three different preprohirudins. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 377-385.

Young, M., Davies, M. J., Bailey, D., Gradwell, M. J. , Smestad-Paulsen, B., Wold, J. K., Barnes, R. M. R., Hounsell, E. (1998) Characterization of oligosaccharides from an antigenic mannan of Saccharomyces cerevisiae. Glyfcoconjugate Journal 15: 815-822.

Zauberman, A., Nussbaum, O., Han, E., Eren, R., Ben-Moshe O., Arazi, Y. , Berre, S., Lubin, I., Shouval, D., Galun, E., Reisner, Y., and Dagan, S. (1999) The trimera mouše systém: a mouše model for hepatitis C infection and evaluation of therapeutic agents. 6th International Symposium on hepatitis C and related viruses. Bethesda 6-9 June, 1999.

•· ·· ·· ·· ·· ·

173

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment zahrnující alespoň jedno N-glykosylační místo, přičemž uvedený protein nebo jeho fragment je produktem exprese v eukaryontní buňce a dále je charakterizován tím, že v průměru až 80 % jeho N-glykosylačních míst je glykosylováno s jádrem glykosylace.
2. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment podle nároku 1, ve kterém je více než 70 % míst glykosylovaných s jádrem glykosylace s oligomanózou obsahující 8 až 10 manóz.
3. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, ve kterém poměr míst glykosylovaných s jádrem glykosylace obsahujícím oligomanózu o struktuře definované jako Man(7)-GlcNAc(2) počtu míst glykosylovaných s jádrem glykosylace obsahujícím oligomanózu o struktuře definované jako Man(8)-GlcNAc(2) je menší nebo roven 0,45.
4. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho fragment podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, ve kterém uvedené oligomanózy obsahují méně než 10 % terminálni a 1,3 manózy.
5. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který je produktem exprese v buňce kvasinky.
6. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle nároku 5, kde uvedenou buňkou kvasinky je buňka Hansenula.

• · • ·

174
7. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, který byl získán z proteinu obsahujícího vedoucí peptid opičího lysozymu nebo jeho funkční variantu, které jsou připojeny k obalovému proteinu HCV nebo jeho fragmentu.
8. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle nároku 7, který byl získán z proteinu charakterizovaného vzorcem

CL-[(Al)_a- (PSl)_b (A2)_c ]-HCVENV-[(A3)_d - (PS2)_e- (A4)_f], kde:

CL je vedoucí peptid opičího lysozymu nebo jeho funkční ekvivalent,

Al, A2, A3 a A4 jsou adaptorové peptidy, které mohou být odlišné nebo stejné,

PSI a PS2 jsou místa úprav, která mohou být odlišná nebo stejná,

HCVENV je obalový protein HCV nebo jeho část, a, b, c, d, e , f jsou 0 nebo 1, a kde případně jsou Al a/nebo A2 částí PSI, a/nebo kde A3 a/nebo A4 jsou částí PS2.
9. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle nároku 8, kde uvedený vedoucí peptid opičího lysozymu CL má aminokyselinovou sekvenci definovanou v SEQ ID NO: 1.
10. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle nároku 8, ve kterém A má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze sekvencí SEQ ID NO: 63 - 65, 70 - 72 a 74 - 82, PS má aminokyselinovou sekvenci vybranou ze sekvencí SEQ ID NO:

4 4 4 4 « 4 4 4 44 44 4

44 4444 444

4 4 4 4 4444 4 444

4 4 444 44 444 44444

4444 4444 44 4

44 44 44 44 44 4

175

66 - 68 a 83 - 84, nebo je PS dibazickým místem, jakým je Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg a Arg-Lys, nebo monobazickým místem, jakým je Lys, a ve kterém je HCVENV vybrán ze sekvencí SEQ ID NO: 85 - 98 a jeho fragmentů.
11. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, který je obsažen ve struktuře vybrané ze skupiny sestávající z monomerů, homodimerů, heterodimerů, homo-oligomerů a heterooligomerů.
12. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, který je obsažen v částici podobné viru.
13. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, ve kterém jsou thiolové skupiny cysteinu chemicky modifikovány.
14. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, který je antigenní.
15. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, který je imunogenní.
16. Izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, který obsahuje epitop pro Τ'buňky.
17. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje izolovaný obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.

·· · · · · · · · • · · · · ··· · · · · • · ··· ·· · · · · ···· ···· · · · · ·· · • · ·· ·· ·· · · ·

176
18. Kompozice podle nároku 17, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič, a která je léčivem.
19. Kompozice podle nároku 17, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič, a která je vakcínou.
20. Způsob přípravy izolovaného obalového proteinu HCV nebo jeho fragmentu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.
21. Způsob detekce přítomnosti protilátek proti HCV ve vzorku, o němž se předpokládá, že obsahuje protilátky antiHCV, vyznačující se tím, že sestává z:

(i) kontaktování obalového proteinu HCV nebo jeho části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 se vzorkem za podmínek dovolujících komplexaci obalového proteinu HCV nebo jeho části s uvedenými anti-HCV protilátkami (ii) detekci komplexu vytvořeného v (i), a (iii) vyvození závěru z (ii) o přítomnosti anti-HCV protilátek v uvedeném vzorku.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený stupeň kontaktování (i) probíhá za kompetitivních podmínek.
23. Způsob' podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený obalový protein HCV nebo jeho část jsou navázány na pevný nosič.
24. Diagnostickou souprava pro detekci přítomnosti protilátek anti-HCV ve vzorku, o němž se předpokládá, že *· ·♦·· ·· ·· ·· · • ♦ · · · · · · · * · · ····· ·>·· • · · · · ·· ··· ····· • · · · · · · · · · · • · · · · · 9 9 9 9 9

177 obsahuje protilátky anti-HCV, vyznačující se tím, že obsahuje obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.
25. Diagnostická souprava podle nároku, vyznačující se tím, že obalový protein HCV nebo jeho část jsou navázány na pevný nosič.
26. Léčivo, vyznačující se tím, že obsahuje obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.
27. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje obalový protein HCV nebo jeho část podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16.
28. Farmaceutická kompozice pro indukci HCV-specifické imunitní odpovědi u savce, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 a případně farmaceuticky přijatelné adjuvans.
29. Farmaceutická kompozice pro vyvolání HCVspecifických protilátek u savce, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 a případně farmaceuticky přijatelné adjuvans.
30. Farmaceutická kompozice pro indukci funkce T-buněk u savce, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství obalového proteinu HCV nebo jeho části podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 a případně farmaceuticky přijatelné adjuvans.

• · 4 4 4 4 4 4 · · 4 4 4

44 4 444 444

9 4 4 4 4 4 4· 4 · · ·

4 4 444 44 444 44444

4 44 4 4 44 4 4 4 4

44 44 44 44 44 4

178
31. Farmaceutická kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30, která je profylaktickou kompozicí.
32. Farmaceutická kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 30, která je terapeutickou kompozicí.
33. Farmaceutická kompozice podle kteréhokoliv z nároků 28 až 32, kde uvedeným savcem je člověk.

A A A

A A A

A AAA

A A ΑΑΑΑΑ

PCT/BE02/00064

A a AAAA

WO 02/086101

A A · AAA • A A · A · · A • A AAA · A

A . A A A A A A