SK13142003A3 - Core-glycosylated HCV envelope proteins - Google Patents

Core-glycosylated HCV envelope proteins Download PDF

Info

Publication number
SK13142003A3
SK13142003A3 SK1314-2003A SK13142003A SK13142003A3 SK 13142003 A3 SK13142003 A3 SK 13142003A3 SK 13142003 A SK13142003 A SK 13142003A SK 13142003 A3 SK13142003 A3 SK 13142003A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
hcv
protein
coat protein
proteins
seq
Prior art date
Application number
SK1314-2003A
Other languages
English (en)
Inventor
Erik Depla
Alfons Bosman
Geert Deschamps
Erwin Sablon
Manfred Suckow
Isabelle Samson
Gert Verheyden
Original Assignee
Innogenetics Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Innogenetics Nv filed Critical Innogenetics Nv
Publication of SK13142003A3 publication Critical patent/SK13142003A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/18—Togaviridae; Flaviviridae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24211—Hepacivirus, e.g. hepatitis C virus, hepatitis G virus
    • C12N2770/24223—Virus like particles [VLP]

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka oblasti expresie rekombinantných proteinov, diagnostiky infekcií HCV, liečby alebo prevencie infekcií HCV, prognózy/monitorovania klinickej účinnosti liečby jedinca s chronickou hepatitídou, alebo prognózy/monitorovania vlastného ochorenia.
Konkrétnejšie, predkladaný vynález sa týka expresie obalových proteinov vírusu hepatitídy C v kvasniciach, kmeňov kvasníc na expresiu obalových vírusových proteinov glykosylovaných s jadrom glykosylácie („core glykosylated) a použitia obalových proteinov podľa predkladaného vynálezu v diagnostike, profylaxii alebo terapii.
Doterajší stav techniky
Infekcia vírusom hepatitídy C (Hepatitis C vírus, HCV) je závažným zdravotným problémom ako v rozvinutých, tak v rozvojových krajinách. Odhaduje sa, že približne 1 až 5 % svetovej ľudskej populácie je zachvátených vírusom. Javí sa, že infekcia HCV je jednou z najvýznamnejších príčin hepatitídy spojenej s transfúziou a často sa vyvíja v chronické poškodenie pečene. Okrem toho existujú dôkazy, že HCV sa účastní v indukcii hepatocelulárneho karcinómu. Z tohto dôvodu existuje naliehavá potreba nájsť spoľahlivé diagnostické metódy a účinné terapeutické agens. Taktiež sú potrebné citlivé a špecifické metódy pre screening HCV-kontaminovaných krvných produktov a zdokonalené metódy kultivácie HCV.
HCV je vírus s RNA pozitívnym reťazcom s približne 9600 bázami, ktorý kóduje jediný polyproteínový prekurzor s približne 3000 aminokyselinami. Bolo preukázané, že proteolytické štiepenie prekurzora spojené s ko- a posttranslačnými modifikáciami vedie na aspoň tri štruktúrne a šesť neštruktúrnych proteínov. Na základe sekvenčnej homológie boli štruktúrne proteiny funkčne zaradené ako jeden proteín jadra vírusu a dva obalové glykoproteíny: E1 a E2. Proteín E1 sa skladá zo 192 aminokyselín a obsahuje 4 až 5 Nglykosylovaných miest v závislosti na genotype HCV. Proteín E2 sa skladá zo 363 až 370 aminokyselín a obsahuje 9 až 11 Nglykosylačných miest v závislosti na genotypu HCV (pre prehlad pozri: Major and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997). Proteín E1 obsahuje rôzne variabilné domény (Maertens and Stuyver, 1997). Proteín E2 obsahuje tri hypervariabilné domény, z ktorých hlavná doména je lokalizovaná na N-konci proteínu (Maertens and Stuyver, 1997) . HCV glykoproteíny sú lokalizované prevažne v ER (endoplazmatickom retikule), kde sú modifikované a upravované do oligomerných komplexov.
Pri eukaryontných organizmoch sú zvyšky cukrov bežne naviazané na štyri odlišné zvyšky aminokyselín. Tieto aminokyselinové zvyšky sú klasifikované ako 0-väzbové (serín, treonín a hydroxylysín) a N-väzbové (asparagín). Cukry viazané cez kyslík (O-linked sugars) sú syntetizované v Golgiho aparáte alebo v hrubom endoplazmatickom retikule (Endoplasmic Reticulum, (ER)) z cukrov nukleotidov. Cukry viazané cez dusík (N-linked sugars) sú syntetizované z bežného prekurzora a nasledovne sú spracovávané. Predpokladá sa, že obalové proteíny HCV sú N-glykosylované. V odbore je známe, že pridanie uhľovodanových reťazcov pripojených cez dusík (Nlinked chains) má význam na stabilizáciu priestorového usporiadania medziproduktov, a tým na účinné skladanie, zabránenie chybného skladania a degeneráciu proteínu v endoplazmatickom retikule, v oligomerizácii, biologickej aktivite a v transporte glykoproteínov (pozri prehľad Rose et al. , 1988; Doms et al. , 1993; Helenius, 1994). Tripeptidové sekvencie Asn-X-Ser a Asn-X-Thr (v ktorých X môže byť akákoľvek aminokyselina) sú v polypeptidoch takzvanými konsensus miestami pre väzbu N-viazaných oligosacharidov. Po pripojení N-viazaného oligosacharidu k polypeptidu je oligosacharid ďalej spracovávaný na komplexný typ (obsahujúci N-acetylglukozamín, manózu, fukózu, galaktózu a kyselinu „high-mannose (obsahujúci NPredpokladá sa, high mannose sialovú), alebo na typ acetylglukozamín a manózu) proteíny HCV sú typu „ že obalové kvasníc je úprava,) v posttranslačná úprava (processing, ďalej len zmysle pripojenia N-viazaných oligosacharidov celkom odlišná od úpravy v Golgiho aparáte pre cicavcov. U kvasníc sú oligosacharidové reťazce v Golgiho aparáte predlžované postupným nasadaním štruktúr manózy, vedúce na vytváranie štruktúr „high mannose, ktoré je označované ako hyperglykosylácia. V porovnaní s tým nie sú proteíny exprimované v prokaryotoch nikdy glykosylované.
Vzory glykosylácie typu „high mannose boli stanovené pre proteíny alebo peptidy z eukaryontných buniek. V cicavčích bunkách v typu glykosylačného oligosacharidu s jadrom (coreglycosylation-type oligosaccharide) je priemerne 5 až 9 jednotiek manózy pripojených na dva N-acetylglukozamínové podiely (štruktúra je skrátene uvádzaná ako Man(59)GlcNAc(2)). Glykosylačným jadrom sa myslí štruktúra' podobná boxovej štruktúre podľa Obrázku 3, uvedenom v Herscovics and Orleans (1993) .
Bolo zistené, že v metylotrofná kvasinca Pichlia pastoris sa pripojuje v priemere 8 až 14 manózových jednotiek, to je Man(8-14)GlcNAc(2) v jednom glykosylačnom mieste (Tschopp v EP 0256421) a približne 85 % z N-viazaných oligosacharidov spadá do rozsahu Man(8-14)GlcNAc(2) (Grinna and Tschopp 1989). Inými autormi boli publikované mierne odlišné oligosacharidové štruktúry, ktoré sú pripojené k heterologným proteínom exprimovaným v P. pastoris·. Man (8-9) GlcNAc (2) (Montesino et al.1998), Man(9-14)GlcNAc (2) alebo Man(9-15)GlcNAc(2) (Kalídas et al. 2001), a Man(8-18)GlcNAc(2) s prevahou Man(912)GlcNAc(2), a s tým, že celkovo najvýznamnejším oligosacharidom je Man(10)GlcNAc(2) (Miele et al. 1998). Trimble et al. (1991) opísali zhodnú distribúciu Man(8)GlcNAc(2) a Man(9)GlcNAc(2) u približne 75 % z Nviazaných oligosacharidov s ďalšími 17 % N-glykosylovaných miest, ktoré sú obsadené s Man(10)GlcNAc(2), a zostávajúcich 8 % miest je obsadených Man(11)GlcNAc(2). Hyperglykosylácia proteínov, exprimovaných v P. pastoris, bola opísaná ojedinele (Scorer et al. 1993) .
V Aspergillus niger je ku N-glykosylačným miestam pripájaný Man(5-10)GlcNAc(2) (Panchal and Wodzinski 1998).
Glykosylačne deficientný mutant Saccharomyces cerevisiae mrm9 sa líši od divokého typu S. cerevisiae tým, že bunky mnn9 produkujú miesto hyperglykosylovaných proteínov proteíny glykosylované s modifikovaným oligosacharidom, ktorým je Man (9-13) GlcNAc (2) (Mackay et al. V US patente č. 5 135 854 a Kniskem et al. vo WO94/01132) . Bol opísaný ďalší mutant S. cerevisiae, ochlmnn9, v ktorej je v glykosylačných miestach proteínov pripájaný Man(8)GlcNAc(2) (Yoshifumi et al. JP 06277086).
Základnou charakteristikou pre oligosacharidy s jadrom zo S. cerevisiae (divokého typu a mutanty mnn9) je prítomnosť terminálnych α 1,3-viazaných zvyškov manózy (Montesino et al. 1998). Oligosacharidy pripojené ku N-glykosylačným miestam proteínov, exprimovaných v P.pastoris alebo v S. cerevisiae ochlmnnl, sú bez takýchto terminálne α 1,3-viazaných zvyškov manózy (Gellissen et al. 2000). Predpokladá sa, že α 1,3viazané zvyšky manózy sú alergenné (Jenkins et al. 1996). Z tohto dôvodu nie sú proteíny nesúce na svojich oligosacharidoch terminálne α 1,3-viazané zvyšky manózy vhodné pre diagnostické alebo terapeutické účely.
Až doposial neboli detailne študované glykosylačné vzory proteínov, exprimovaných v metylotrofné kvasince Hansenula polymorpha, bez ohladu na použitie tejto kvasnice na prípravu veľkého množstva heterologných proteínov (pozri Tabulka 3 v Gellissen et al. 2000) . Na základe pokusov Janowicz et al. (1991) a Diminsky et al. (1997) sa predpokladá, že H.polymorpha buď vôbec, alebo len velmi slabo glykosyluje veľký alebo malý povrchový antigén vírusu hepatitídy B (HBsAg) . Najpravdepodobnejšie je toto spôsobené tým, že HBsAg bol exprimovaný bez signálneho peptidu, a tým bolo zabránené, aby produkovaný HBsAg vstupoval do lumen endoplazmatického retikula (ER), a tým aj glykosylácii. Bolo opísané obmedzené nasadanie mono- alebo dihexóz ku G-CSF (faktor stimulujúci kolónie granulocytov, granulocyte colony stimulating factor), produkovanom v H. polymorpha (Fischer et al. vo WOOO/40727). Na druhej strane bola pozorovaná hyperglykosylácia heterológnej α-galaktosidázy, exprimovanej v bunkách H. polymorpha (Fellinger et al. 1991).
Až doposiaľ sa vakcinácia proti chorobám osvedčila ako z hladiska nákladov najefektívnejšia a súčasne účinná metóda na kontrolu ochorenia. Ale nepriek sľubným výsledkom sa úsilie o vyvinutie účinnej vakcíny proti HCV potýka s problémami. Základnou podmienkou úspešnosti vakcín (conditio sine qua non) je indukcia imunitnej odpovede u pacientov. Preto je treba identifikovať antigenné determinanty HCV, ktoré budú pacientom podávané vo vhodnom uskutočnení. Antigenné determinanty môžu byť rozdelené aspoň na dve formy, to je lineárne a konformačné epitopy. Konformačné epitopy sú výsledkom skladania molekuly v trojrozmernom priestore zahŕňajúcom ko- a posttranslačné modifikácie, ako je glykosylácia. Všeobecne sa predpokladá, že konformačné epitopy môžu predstavovať najúčinnejšie vakcíny, lebo sa jedná o epitopy, ktoré sa podobajú natívnym epitopom HCV a ktoré môžu byť lepšie konzervované, ako bežné lineárne aminokyselinové sekvencie. Z tohto dôvodu má konečný stupeň glykosylácie obalových proteinov HCV najväčší význam na generovanie antigenných determinánt HCV podobných natívnym determinantám. Existujú ale zdanlivo neprekonateľné problémy s kultiváciou HCV, v ktorej vznikajú len malé množstvá viriónov. Okrem toho existujú obrovské problémy s expresiou a purifikáciou rekombinantných proteinov, ktoré vedú buď na malé množstvo proteínov, na hyperglykosylované proteiny, alebo vedú k proteínom, ktoré nie sú glykosylované.
Obalové proteiny HCV boli pripravené rekombinantnými technikami v Escherichia coli, hmyzích bunkách, bunkách kvasníc a v cicavčích bunkách. Expresia vo vyšších eukaryotoch je ale charakterizovaná tým, že je obtiažne získať velké množstvá antigénu na skutočnú produkciu vakcíny. Expresia v prokaryotoch, ako je E. coli, vedie k obalovým proteínom HCV, ktoré nie sú glykosylované. Expresia obalových proteínov HCV v kvasniciach vedie na hyperglykosyláciu. Ako bolo už skôr preukázané (Maertens et al. , WO 96/04385), expresia obalového proteinu HCV E2 v Saccharomyces cerevisiae vedie k proteínom, ktoré sú intenzívne glykosylované. Hyperglykosylácia vedie na zakrytie proteínových epitopov. Aj keď Mustilli et al. (1999) nárokuje, že expresia HCV E2 v S. cerevisiae vedie ku glykosylácii s jadrom, výsledky týkajúce sa intracelulárne exprimovaného materiálu dokazujú, že aspoň časť je hyperglykosylovaná, zatial čo správna úprava zvyšku tohto materiálu nebola preukázaná. Okrem toho hyperglykosylácii pozorovanej Mustilli et al. (1999) mohlo byť zabránené len za prítomnosti tunicamycínu, inhibitoru glykosylácie, a nie je tak reflektovaná glykosylácia, prebiehajúca za normálnych, prirodzených, rastových podmienok. Potreba obalových proteínov HCV, získaných z intracelulárneho zdroja, je úplne akceptovaná (Maertens et al. vo WO 96/04385, Heile et al., 2000). Táto potreba je ďalej ilustrovaná nízkou reaktivitou E2, sekretovaného kvasnicami, so sérmi šimpanzov imunizovaných proteínmi E2, získanými z cicavčej bunkovej kultúry, ako je zrejmé z Obrázku 5 v Mustilli et al (1999). Táto skutočnosť je ďalej dokumentovaná v práci Rosa et al (1996), podľa ktorej sa ukazuje, že imunizácia s obalovými proteínmi HCV získanými z kvasníc zlyháva v zabránení napadnutia vírusom HCV.
Preto existuje potreba účinného systému expres, ktorý by viedol k veľkým a z hladiska nákladov efektívnym množstvám proteínov, ktoré súčasne majú glykosyláciu podobnú natívnemu vzoru glykosylácie bez terminálnych α 1,3-viazaných manóz. Najmä takéto systémy sú potrebné na produkciu obalových proteínov HCV.
Podstata vynálezu
Prvý aspekt predkladaného vynálezu sa týka izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje aspoň jedno N-glykosylačné miesto, pričom proteín alebo jeho fragment je charakterizovaný tým, že je produktom expresie v eukaryontnej bunke a ďalej je charakterizovaný tým že v priemere až 80 % N-glykosylačných miest je glykosylovaných s jadrom glykosylácie. Konkrétne, viac ako 70 % miest glykosylovaných s jadrom je glykosylovaných s oligomanózou so štruktúrou definovanou ako Man(8 až 10)GlcNAc(2). Ďalej, pomer oligomanózy so štruktúrou Man(7)GlcNAc(2) a oligomanózy so štruktúrou Man(8)GlcNAc(2) je menší ako alebo sa rovná 0,45. Konkrétnejšie, oligomanózy obsahujú menej ako 10 % terminálnej a. 1,3 manózy. Eukaryontnou bunkou, exprimujúcou uvedený izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť, môže byť bunka kvasníc, ako napríklad bunka Hansenula.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu, ktorý je derivovaný z proteínu, obsahujúceho vedúci peptid opičieho lysozýmu alebo jeho funkčný variant, ktorý je pripojený k uvedenému obalovému proteinu HCV alebo jeho fragmentu. Konkrétnejšie, izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť je získaný z proteinu charakterizovaného vzorcom
CL-[(Al)a- (PSI)b (A2)c ]-HCVENV-[(A3)d - (PS2)e- (A4)f], kde:
CL je vedúci peptid opičieho lysozýmu alebo jeho funkčný ekvivalent,
Al, A2, A3 a A4 sú adaptorové peptidy, ktoré môžu byť odlišné alebo rovnaké,
PSI a PS2 sú miesta úprav (processing sites) , ktoré môžu byť odlišné alebo rovnaké,
HCVENV je obalový proteín HCV alebo jeho časť, a, b, c, d, e, f sú 0 alebo 1, a kde prípadne sú Al a/alebo A2 časťou PSI, a/alebo kde A3 a/alebo A4 sú časťou PS2.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu zahŕňa izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho fragment podlá vynálezu, ktorý je obsiahnutý v štruktúre vybranej zo skupiny pozostávajúcej z monomérov, homodimérov, heterodimérov, homo-oligomérov a hetero-oligomérov. Prípadne je izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho fragment podľa vynálezu obsiahnutý v častici podobnej vírusu (virus-like particle). Konkrétnejšie, ktorýkoľvek obalový proteín HCV alebo jeho fragment podľa vynálezu môže obsahovať cysteíny, v ktorom sú tiólové skupiny cysteínu chemicky modifikované.
Špecifické aspekty vynálezu sa týkajú izolovaných obalových proteinov HCV alebo ich fregmentov podľa vynálezu, ktoré sú antigenné alebo imunogenné a/alebo ktoré obsahujú epitop stimulujúci T-bunky.
Ďalší aspekt sa týka kompozície obsahujúcej izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho fragment podľa vynálezu, Kompozícia môže ďalej obsahovať farmaceutický prijateľný nosič a môže byť liečivom alebo vakcínou.
Vynález sa tiež obalového proteínu HCV týka spôsobu prípravy izolovaného alebo jeho fragmentu podľa vynálezu.
Ďalšou prítomnosti v podozrení, spôsob zahŕňa metódou podľa vynálezu je spôsob detekcie anti-HCV protilátok vo vzorke, ktorá je že obsahuje anti-HCV protilátky, pričom tento (i) kontaktovanie obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 15 s uvedenou vzorkou za podmienok dovoľujúcich komplexáciu uvedeného obalového proteínu HCV alebo jeho časti s anti-HCV protilátkami, (ii) (ii) detekciu komplexu vytvoreného v stupni (i), a
(iii) vyvodenie záveru z (ii) o prítomnosti anti-HCV protilátok v uvedenej vzorke.
Konkrétnejšie, uvedený spôsob môže zahŕňať krok (i), v ktorom kontaktovanie prebieha za kompetitívnych podmienok. Uvedené metódy môžu špecificky používať pevný nosič, ku ktorému je obalový proteín HCV alebo jeho časť naviazaná.
Vynález sa ďalej týka diagnostickej súpravy (kitu) na detekciu prítomnosti anti-HCV protilátok vo vzorke, ktorá je v podozrení, že obsahuje anti-HCV protilátky, pričom uvedená súprava obsahuje obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu. Konkrétnejšie, súprava môže obsahovať uvedený obalový proteín HCV alebo jeho časť naviazanú na pevný nosič.
Vynález sa tiež týka liečiva alebo vakcíny obsahujúcej obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu.
Tiež je v tomto vynáleze zahrnutá farmaceutická kompozícia na indukciu špecifickej imunitnej odpovede proti HCV u cicavca, ktorá obsahuje účinné množstvo obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu a prípadne farmaceutický prijatelné adjuvans. Farmaceutická kompozícia môže byť alternatívne schopná indukovať HCV-špecifické protilátky u cicavca alebo indukovať T-bunkové funkcie u cicavca. Okrem toho, farmaceutická kompozícia môže byť profylaktickou kompozíciou alebo terapeutickou kompozíciou. Uvedeným cicavcom je konkrétne človek.
Opis obrázkov
Obrázok 1. Schematická mapa vektora pGEMT-ElsH6RB, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 6.
Obrázok 2. Schematická mapa vektora pCHH-Hir, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 9.
Obrázok 3. Schematická mapa vektora pFPMT121, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 12.
Obrázok 4. Schematická mapa vektora pFPMT-CHH-El-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 13.
Obrázok 5. Schematická mapa vektora pFPMT-MFa-El-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 16.
Obrázok 6. Schematická mapa vektora pUC18-FMD-MFa-El-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 17.
Obrázok 7. Schematická mapa vektora pUC18-FMD-CL-El-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 20.
Obrázok 8. Schematická mapa vektora pFPMT-CL-El-H6, ktorý má
sekvenciu definovanú v SEQ ID NO : 21.
Obrázok 9. Schematická mapa vektora pSP72E2H6, ktorý má
sekvenciu definovanú v SEQ ID NO : 22 .
Obrázok 10. Schematická mapa vektora pMPT121, ktorý má
sekvenciu definovanú v SEQ ID NO : 23 .
Obrázok 11. Schematická mapa vektora pFPMT-MFa-E2-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 24.
Obrázok 12. Schematická mapa vektora pMPT-MFa-E2-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 25.
Obrázok 13. Schematická mapa vektora pMF30, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 28.
Obrázok 14. Schematická mapa vektora pFPMT-CL-E2-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 32.
Obrázok 15. Schematická mapa vektora pUC18-FMD-CL-El, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 35.
Obrázok 16. Schematická mapa vektora pFPMT-CL-El, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 36.
Obrázok 17. Schematická mapa vektora pUC18-FMD-CL-H6-El-K-H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 39.
Obrázok 18. Schematická mapa vektora pFPMT-CL-H6-K-El, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 40.
Obrázok 19. Schematická mapa vektora pYIG5, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 41.
Obrázok 20. Schematická mapa vektora pYIG5ElH6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 42.
Obrázok 21. Schematická mapa vektora pSYl, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 43.
Obrázok 22. Schematická mapa vektora pSYlaMFElsH6a, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 44.
Obrázok 23. Schematická mapa vektora pBSK-E2sH6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 45.
Obrázok 24. Schematická mapa vektora pYIG5HCCL-22aH6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 46.
Obrázok 25. Schematická mapa vektora pYYIGSE2H6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 47.
Obrázok 26. Schematická mapa vektora pYIG7, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 48.
Obrázok 27. Schematická mapa vektora pYIG7El, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 49.
Obrázok 28. Schematická mapa vektora pSYlYIG7El, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 50.
Obrázok 29. Schematická mapa vektora pPICZalphaA, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 51.
Obrázok 30. Schematická mapa vektora pPICZalphaD', ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 52.
Obrázok 31. Schematická mapa vektora pPICZalphaE', ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 53.
Obrázok 32. Schematická mapa vektora pPICZalphaD'ElsH6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 58.
Obrázok 33. Schematická mapa vektora pPICZalphaE'ElsH6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 59.
Obrázok 34. Schematická mapa vektora pPICZalphaD'E2sH6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 60.
Obrázok 35. Schematická mapa vektora pPICZalphaE'E2sH6, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 61.
Obrázok 36. Schematická mapa vektora pUC18MFa, ktorý má sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 62.
Obrázok 37. Elučný profil z gélovej chromatografie (rozmerovo vylučovacia chromatografia, size exclusion chromatografie) IMAC-purifikovaného proteínu E2-H6, exprimovaného v Hansenula polymorpha exprimujúcej MFa-E2-H6 (pozri Príklad 15) . Os X uvádza elučný objem (v ml). Vertikálne línie cez elučný profil označujú odoberané frakcie. „PI = zmiešané (pooled) frakcie 4 až 9, „P2 = zmiešané frakcie 30 až 35, a „P3 = zmiešané frakcie 37 až 44. Os Y uvádza absorbanciu udávanú v mAU (mili jednotkách absorbancie). Os X uvádza elučný objem v ml.
Obrázok 38. Rôzne zmiešané vzorky (pools) a frakcie odobrané po gélovej chromatografii (pozri Obrázok 37) boli analyzované neredukčnou SDS-PAGE s následným farbením polyakrylamidových gélov striebrom. Analyzované pooly („PI, „P2, a „P3) a frakcie (16 až 26) sú uvedené v hornej časti zobrazenia striebrom farebného gélu. Vlavo (línia „M) sú uvedené veľkosti markerov molekulovej hmotnosti.
Obrázok 39. Frakcie 17 až 23 zo stupňa gélovej chromatografie uvedeného na Obrázku 37 boli zmiešané a alkylované. Potom bol proteínový materiál podrobený pôsobeniu Endo H na deglykosyláciu. Neošetrený materiál a materiál ošetrený Endo H boli oddelené na SDS-PAGE gélu a prenesené na membránu PVDF. Blot sa farbil s amidovou čerňou.
Línia 1: Alkylovaný E2-H6 pred pôsobením Endo H
Línia 2: Alkylovaný E2-H6 po pôsobením Endo H
Obrázok 40. Analýza Western-blotting bunkových lyzátov El, exprimovaného v Saccharomyces cerevisiae. Western-blotting bol uskutočnený s použitím El-špecifickej monoklonálnej protilátky IGH 201. Línie 1-4: produkt expresie po 2, 3, 5 alebo 7 dňoch expresie, v uvedenom poradí, v klone Saccharomyces transformovanom s pSYlYIG7Els (SEQ ID NO: 50, Obrázok 28), ktorý obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu kuraciu sekvenciu vedúceho peptidu pre lysozým pripojenú k E1-H6.
Línia 5-7: produkt expresie po 2, 3 alebo 5 dňoch expresie, v uvedenom poradí, v klone Saccharomyces transformovanom s pSYlaMFElsHSaYIGl (SEQ ID NO: 44, Obrázok 22), ktorý obsahuje nukleotidovú sekvenciu kódujúcu vedúci peptid apárovacieho faktora (α-mating factor) pripojenú k E1-H6.
Línia 8: markery molekulovej hmotnosti s velkosťami tak, ako j e uvedené.
Línia 9; purifikované Els, produkované cicavčími bunkami infikovanými HCV-rekombinantným vírusom vaccinia.
Obrázok 41. Analýza proteínu E2-H6 purifikovaného afinitnou chromatografiou na imobilizovaných iónoch kovov (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC, ďalej označovaná „chromatografia IMAC), ktorý bol exprimovaný a upravený (posttranslačne) s H.polymorpha (pozri Príklad 17) . Proteiny v rôznych frakciách z premývania (línia 2 až 4) a elučné frakcie (línia 5 až 7) boli analyzované SDS-PAGE za redukujúcich podmienok s následným farbením gélu striebrom.(A, horný obrázok) alebo s použitím Western blottingu za použitia špecifických monoklonálnych protilátok namierených proti E2 (B, spodný obrázok). Veľkosti markerov molekulovej hmotnosti sú uvedené vľavo.
Obrázok 42. Elučný profil z prvého stupňa chromatografie IMAC na stĺpci Ni-IDA (Chelating Sepharose FF loaded with Ni+2, Pharmacia) na purifikáciu sulfónovaného proteínu H6-K-E1, produkovaného H. polymorpha (pozri Príklad 18) . Stĺpec bol ekvilibrovaný s pufrom A (50 mM fosfát, S M GuHCl, 1 % Empigen BB (objem/objem), pH 7,2), doplnený s 20 mM imidazolu. Po nanesení vzorky bol stĺpec premytý postupne s pufrom A obsahujúcim 20 mM a 50 mM imidazolu, v uvedenom poradí (ako je uvedené na chromatograme). Ďalšie premytie a stupeň elúcie His-označených (His-tagged) produktov bol uskutočnený postupnou aplikáciou pufru B (PBS, 1% Empigen BB, pH 7,2), doplneným s 50 mM imidazolu a 200 mM imidazolu, v uvedenom poradí (ako je uvedené na chromatograme). Zmiešali sa nasledujúce frakcie: pool z premytia 1 (frakcie 8 až 11, premytie s 50 mM imidazolu). Eluovaný materiál sa odoberal ako oddelené frakcie 63 až 72, alebo bol pripravený ako zmiešaná vzorka (frakcie 63 až 69) . Os Y uvádza absorbanciu uvedenú v mAU (milí jednotky absorbancie). Os X uvádza elučný objem v ml.
Obrázok 43. Analýza IMAC-purífikovaného proteínu H6-K-E1 (pozri Obrázok 42), exprimovaného a upraveného z CL-H6-K-E1 na
H6-K-E1 v H. polymorpha. Proteiny v poole z premytia 1 (línia 12) a elučné frakcie 63 až 72 (línie 2 až 11) boli analyzované so SDS-PAGE za redukujúcich podmienok s následným farbením gélu striebrom (A, horný obrázok) . Proteiny prítomné vo vzorke pred IMAC chromatografiou (línia 2), v poole z prietoku (flowthrough pool) (línia 4) , v poole z premytia 1 (línia 5) a v elučnom poolu (línia 6) boli anylyzované metódou Western blotting s použitím špecifických monoklonálnych protilátok namierených proti El (B, dolný obrázok; na dráhe 3 nebola nanesená žiadna vzorka). Veľkosti markerov molekulovej hmotnosti (línia M) sú uvedené vľavo.
Obrázok 44. Elučný profil z druhého stupňa chromatografie IMAC na stĺpci Ni-IDA (Chelating Sepharose FF loaded with Ni+2 , Pharmacia) na purifikáciu El, rezultujúceho z in vitro úpravy H6-K-E1 (purifikáciu pozri Obrázok 42) s Endo Lys-C. Pretekajúci eluát bol odoberaný do oddelených frakcií (1 až 40), ktoré boli testované na prítomnosť produktov Els. Frakcie (7 až 28), obsahujúce El produkovaný z H6-K-E1, boli spojené. Os Y uvádza absorbanciu uvedenú v mAU (mili jednotky absorbancie). Os X uvádza elučný objem v ml.
Obrázok 45. Analýza Western-bloting znázorňujúca pásy špecifických proteínov Els, ktoré reagujú s biotinylovaným heparínom (pozri tiež Príklad 19). Boli analyzované preparáty Els, purifikované z cicavčej bunkovej kultúry infikovanej HCV18 rekombinantným vírusom vaccinia alebo exprimovanej s H. polymorpha. Vpravo od zvislej čiary sú uvedené výsledky Western-blotu s biotinylovanou El špecifickou monoklonálnou protilátkou IGH 200. Vlavo od zvislej čiary sú uvedené výsledky Western-blotu získané s biotinylovaným heparinom. Z týchto výsledkov je možné odvodiť, že najmä menej glykosylované Els majú vysokú afinitu k heparínu.
Línia M: marker molekulovej hmotnosti (molekulové hmotnosti sú uvedené vlavo).
Línia 1: Els z cicavčích buniek a alkylované počas izolácie.
Línia 2: Els-H6 exprimované s H. polymorpha a sulfónované počas izolácie.
Línia 3: Els-H6 exprimované s H. polymorpha a sulfónované počas izolácie.
Línia 4: materiál zhodný s tým, ktorý bol nanášaný na dráhu 2, ale podrobený pôsobeniu ditiotreitolu na premenu sulfónovaných Cys-tiólových skupín na Cys-tiólové skupiny.
Obrázok 46. Profil z gélovej chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného E2-H6, exprimovaného v H polymorpha v sulfónovanéj forme, podrobeného pôsobeniu PBS, 3% betain na posilnenie tvorby častíc podobných vírusu zámenou Empigénu BB za betain. Zmiešané frakcie obsahujúce VLPs, ktoré boli použité na ďalšie testy, sú označené Os Y uvádza absorbanciu uvedenú v mAU (mili jednotky absorbancie). Os X uvádza elučný objem v ml. Pozri tiež príklad 20.
Obrázok 47. Profil z gélovej chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného E2-H6, exprimovaného v H polymorpha v alkylovanej forme, podrobeného pôsobeniu PBS, 3% betaín na posilnenie tvorby častíc podobných vírusu zámenou Empigénu BB za betaín. Zmiešané frakcie obsahujúce VLPs, ktoré boli použité na ďalšie testy, sú označené Os Y uvádza absorbanciu uvedenú v mAU (mili jednotky absorbancie). Os X uvádza elučný objem v ml. Pozri tiež príklad 20.
Obrázok 48. Profil z gélovej chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného El, exprimovaného v H polymorpha v sulfónovanej forme, podrobeného pôsobeniu PBS, 3% betaín na posilnenie tvorby častíc podobných vírusu zámenou Empigénu BB za betaín. Zmiešané frakcie obsahujúce VLPs, ktoré boli použité na ďalšie testy, sú označené „o. Os Y uvádza absorbanciu uvedenú v mAU (mili jednotky absorbancie). Os X uvádza Elučný objem v ml. Pozri tiež príklad 20.
Obrázok 49. Profil z gélovej chromatografie (Size exclusion chromatography, SEC) purifikovaného El, exprimovaného v H polymorpha v alkylovanej forme, podrobeného pôsobeniu PBS, 3% betaín na posilnenie tvorby častíc podobných vírusu zámenou Empigénu BB za betaín. Zmiešané frakcie obsahujúce VLPs, ktoré boli použité na ďalšie testy, sú označené Os Y uvádza absorbanciu uvedenú v mAU (mili jednotky absorbancie). Os X uvádza elučný objem v ml. Pozri tiež príklad 20.
Obrázok 50. SDS-PAGE (za redukčných podmienok) a analýza Western blotting VLPs tak, ako boli izolované po gélovej chromatografii (size exclusion chromatography, (SEC)), opísanej na Obrázkoch 48 a 49. Ľavá časť: farbenie gélu SDSPAGE striebrom. Pravá časť: Western blot s použitím špecifickej monoklonálnej protilátky namierenej proti El (IGH201). Línia 1: markér molekulovej hmotnosti (molekulové hmotnosti sú uvedené vľavo); línia 2: pool z VLPs obsahujúci sulfónovaný E1 (porovnaj Obrázok 48); línia 3: pool z VLPs obsahujúci alkylovaný El (porovnaj Obrázok 49) . Pozri tiež príklad 20.
Obrázok 51. El produkovaný v cicavčích bunkách („M), alebo El, produkovaný v H. polymorpha („H), boli zachytené na pevnú podložku ELISA na stanovenie konečných titrov (end point titer) protilátok prítomných v sére po vakcinácii myší s El, produkovanom v cicavčích bunkách ((horný panel), alebo po vakcinácii myší s El, produkovaným v H. polymorpha (dolný panel). Horizontálna čiara predstavuje stredný titer protilátok. Konečné titre (v násobnom riedení) sú uvedené na ose Y. Pozri tiež Príklad 22.
Obrázok 52. El produkované v Hansenula („A), alebo sulfónované El boli zachytené na pevnú podložku ELISA na stanovenie konečných titrov (end point titer) protilátok prítomných v sére po vakcinácii myší s El, produkovaným v Hansenula, ktorý bol alkylovaný (horný panel), alebo po vakcinácii myší s El, produkovaným v Hansenula, ktorý bol sulfónovaný (dolný panel). Horizontálna čiara predstavuje stredný titer protilátok. Konečné titre (v násobnom riedení) sú uvedené na ose Y. Pozri tiež Príklad 23.
Obrázok 53. HCV El, produkovaný v cicavčích bunkách infikovaných HCV-rekombinantným vírusom vaccinia, a HCV El, produkovaný v H. polymorpha, boli nenesené priamo na doštičky ELISA. Konečné titre protilátok boli stanovené v sére šimpanzov vakcinovaných s El, produkovaným v cicavčích bunkách (horný panel), a z myšacích monoklonálnych protilátok, vyvolaných proti El produkovanému cicavčími bunkami (spodný panel). Šimpanzi Yoran a Marti boli profylaktický vakcinovaní. Šimpanzi Ton, Phil, Marcel, Peggy a Femma boli vakcinovaní terapeuticky. Početne vyplnené stĺpce: ELISA platňa s naviazaným El, produkovaným v cicavčích bunkách. Prázdne stĺpce: ELISA platňa s naviazaným El, produkovaným v Hansenula. Konečné titre (v násobnom riedení) sú uvedené na ose Y. Pozri tiež Príklad 24.
Obrázok 54. Gélová elektroforéza s fluorescenčným označením cukru (Fluórophore-assisted carbohydrate gel Electrophoresis) oligosacharidov uvoľnených z El, produkovaného cicavčími bunkami infikovanými rekombinantným vírusom vaccinia, a z proteínu E1-H6, produkovaného Hansenula.
Línia 1: Glukózová štandardná stupnica uvádzajúca vlavo počet monosacharidov (3 až 10, označené ako G3 až G10).
Línia 2: 25 pg N-viazaných oligosacharidov uvolnených z (alkylovaného) El, produkovaného v cicavčích bunkách.
Línia 3: 25 gg N-viazaných oligosacharidov uvolnených z (alkylovaného) El, produkovaného v Hansenula.
Línia 4: maltotetraóza 100 pmol.
Pozri tiež Príklad 25.
Obrázok 55. Obrázok uvádza zjednodušené štruktúry referenčných oligomanóz Man-9 (Obrázok 55.A), Man-8 (Obrázok 55.B), Man-7 (Obrázok 55.C), Man-6 (Obrázok 55.D) a Man-5 (Obrázok 55.E). „Man = manóza; „GlcNAc = N-acetylglukozamín; „a = a-väzba medzi 2 manéžami; „β = β-väzba medzi 2 manéžami; „(1-3), „(1-4) a „(1-5) = (1-3), (1-4) a (1-6) väzby medzi 2 manéžami, v uvedenom poradí. Zátvorky na Obrázku 55. B a 55. C znamenajú, že v uvedenom poradí sú 2 a 1 zvyšky (zvyšok) manózy vľavo od zátvorky sú spojené (je spojený) väzbou (1-2) ku 2 a 1 zo 3 manéžových zvyškov uvedených vpravo od zátvoriek. Pozri tiež príklad 26.
Obrázok 56. Obrázok uvádza vyššiu oligomanózu pozostávajúcu z 10 manéžových molekúl pripojených k chitobióze. Každý koncový zvyšok manózy je pripojený väzbou a 1-3 k neterminálnemu zvyšku manózy. Tenká šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a 1-2 manozidázou (pre túto oligomanózu nie je žiadna), hrubá šípka smerujúca hore alebo vľavo označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a manozidázou po odstránení 1-2-viazaných manóz (neplatí pre túto oligomanózu) a prázdna dole smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s β manozidázou po odstránení cc-viazaných manóz. Pozri tiež Príklad 26.
Obrázok 57. Obrázok zobrazuje vyššiu oligomanózu pozostávajúcu z 9 manózových molekúl pripojených k chitobióze. V tejto oligomanóze je jeden koncový zvyšok manózy pripojený väzbou a 1-2 k neterminálnemu zvyšku manózy. Tenká šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a 1-2 manozidázou, hrubá šípka smerujúca hore alebo vlavo označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a manozidázou po odstránení a 1-2-viazaných manóz, a prázdna dole smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s β manozidázou po odstránení α-viazaných manóz. Pozri tiež Príklad 26.
Obrázok 58. Obrázok zobrazuje vyššiu oligomanózu Man-9 pozostávajúcu z 9 manózových molekúl pripojených k chitobióze.
V tejto oligomanóze sú všetky koncové manózové zvyšky pripojené väzbou a 1-2 na neterminálny zvyšok manózy. Tenká šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a 1-2 manozidázou, hrubá šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a manozidázou po odstránení a 1-2viazaných manóz, a prázdna dole smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s β manozidázou po odstránení a-viazaných manóz. Pozri tiež Príklad 26.
Obrázok 59. Obrázok zobrazuje vyššiu oligomanózu Man-8 pozostávajúcu z 8 manózových molekúl pripojených k chitobióze.
V tejto oligomanóze sú všetky koncové manózové zvyšky pripojené väzbou a 1-3 alebo a 1-6 na neterminálny zvyšok manózy, čo robí túto štruktúru celkom rezistentnú na štiepenie s a 1-2 manozidázou. Tenká šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a manozidázou, a prázdna dole smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s β manozidázou po odstránení α-viazaných manóz. Pozri tiež Príklad 26.
Obrázok 60. Obrázok zobrazuje vyššiu oligomanózu Man-7 pozostávajúcu zo 7 manózových molekúl pripojených k chitobióze. V tejto oligomanóze sú všetky koncové manózové zvyšky pripojené väzbou a 1-3 na neterminálny zvyšok manózy, čo robí túto štruktúru celkom rezistentnú na štiepenie s a 1-2 manozidázou. Tenká šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a manozidázou, a prázdna dole smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s β manozidázou po odstránení α-viazaných manóz. Pozri tiež Príklad 26.
Obrázok 61. Obrázok zobrazuje vyššiu oligomanózu pozostávajúcu z 9 manózových molekúl pripojených k chitobióze. V tejto oligomanóze je jeden manózový zvyšok pripojený väzbou a 1-2 na neterminálny zvyšok. Tenká šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a 1-2 manozidázou, hrubá šípka smerujúca hore alebo vlavo označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a manozidázou po odstránení a 1-2-viazaných manóz, a prázdna dole smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s β manozidázou po odstránení aviazaných manóz. Pozri tiež Príklad 26.
Obrázok 62. Obrázok zobrazuje myslený oligosacharid obsahujúci glukózu pozostávajúcu 1 alebo 2 z glukózových molekúl a 8 manózových molekúl pripojených k chitobióze. V tomto oligosacharide každý z koncových a 1-2 viazaných zvyškov manózy v reťazci A alebo B („A a „B -> na Obrázku) nesie jeden alebo dva glukózové zvyšky tak, ako je vyznačené s (Glc)Glc vľavo od zátvorky. Tenká šípka smerujúca hore označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a 1-2 manozidázou, za predpokladu, že ku koncovému manéžovému zvyšku nie je pripojená žiadna glukóza. Hrubá hore alebo vľavo smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s a manozidázou po odstránení a 1-2 viazaných manóz, a prázdna dole smerujúca šípka označuje oligosacharidové väzby, ktoré sú náchylné na štiepenie s β manozidázou po odstránení a viazaných manóz. Prehľad možných reakčných produktov uvádza Tabulka 10 v príklade 26.
Obrázok 63. Reakčné produkty z inkubácie Man-9 s alebo bez exoglykosidázy cez noc boli oddelené na stĺpci TSK gel-Amide80 (0,46 x 25 cm, Tosoh Biosep), pripojenom k zariadeniu Waters Alliance HPLC. Oddeľovanie oligosacharidov prebiehalo za teploty prostredia pri prietoku 1,0 ml/min. Rozpúšťadlo A bolo zložené z 0,1% kyseliny octovej v acetonitrile a rozpúšťadlo B bolo zložené z 0,2% kyseliny octovej - 0,2% trietylamínu vo vode. Oddeľovanie 2-AB označených oligosacharidov bolo uskutočňované s použitím izokratickej elúcie 28 % B na 5 objemov stĺpca s nasledujúcim lineárnym zvýšením na 45 % B počas pätnástich objemov stĺpca. Zloženie elučného rozpúšťadla je uvedené na pravej ose Y ako % rozpúšťadla B v rozpúšťadle A (objem/objem). Doba elúcie je uvedená v minútach na ose X. Ľavá os Y uvádza fluorescenciu eluovaných oligosacharidov označených 2-amínobenzamidom (2AB) . Excitačná vlnová dĺžka 2-AB je 330 nm, emisná vlnová dĺžka je 420 nm.
Man-9
Signál 1 („1) v chromatograme označuje elúciu inkubovaného cez noc s exoglykosidázami. Signál 2 („2) označuje elúciu zmesi Man-5 a Man-6 po inkubácii Man-9 s α 1-2 manozidázou cez noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označujú elúciu 4'-β-mannosyl chitobiózy po inkubácii Man-9 počas 1 hodiny alebo cez noc s α manozidázou, v uvedenom poradí. Signál 5 („5) označuje elúciu chitobiózy po inkubácii Man-9 s a- a βmanozidázou cez noc. Signály 1-5 sú uvedené ako prekrývajúce sa, vzhľadom na to, že ich príslušné základné úrovne nie sú všetky na nulovej úrovni. Signál 6 („6) označuje použitý gradient rozpúšťadla.
Piky, keď sú prítomné, označené písmenami A až K v hornej časti obrázku, znamenajú A, chitobióza; B, 4'-β-mannosyl-
chitobióza; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; Man-10. Pozri tiež Príklad
H, Man-7; I, Man-7 ; J, 26 . Man-8; a K,
Obrázok 64. Reakčné produkty oligosacharidov z Els,
produkovaných v Saccharomyces, po inkubácii s alebo bez
exoglykosidáz cez noc boli oddeľované na stĺpci TSK gel-Amide80 (0,46 x 25 cm, Tosoh Biosep), pripojenom k zariadení Waters Alliance HPLC. Oddeľovanie oligosacharidov prebiehalo za teploty prostredia pri prietoku 1,0 ml/min. Rozpúšťadlo A bolo zložené z 0,1% kyseliny octovej v acetonitrile a rozpúšťadlo B bolo zložené z 0,2% kyseliny octovej - 0,2% trietylamínu vo vode. Oddelovanie 2-AB označených oligosacharidov bolo uskutočňované s použitím izokratickej elúcie 28 % B na 5 objemov stĺpca s nasledujúcim lineárnym zvýšením na 45 % B počas pätnástich objemov stĺpca. Zloženie elučného rozpúšťadla je uvedené na pravej ose Y ako % rozpúšťadla B v rozpúšťadle A (objem/objem) . Doba elúcie je uvedená v minútach na ose X. Ľavá os Y uvádza fluorescenciu eluovaných 2-aminobenzamidom (2-AB)-označených oligosacharidov. Excitačná vlnová dĺžka 2-AB je 330 nm, emisná vlnová dĺžka je 420 nm.
Signál 1 („1) v chromatograme označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných v Saccharomyces, inkubovaných cez noc bez exoglykosidáz. Signál 2 („2) označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els produkovaných v Saccharomyces, po inkubácii Man-9 s a 1-2 manozidázou cez noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označujú elúcu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných v Saccharomyces, po inkubácii počas 1 hodiny alebo cez noc s a manozidázou, v uvedenom poradí. Signál 5 („5) označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných v Saccharomyces, po inkubácii s a- a β-manozidázou cez noc. Signály 1-5 sú uvedené ako prekrývajúce sa, vzhľadom na to, že ich príslušné základné úrovne nie sú všetky na nulovej úrovni. Signál 6 („6) označuje použitý gradient rozpúšťadla.
Piky, keď sú prítomné, označené písmenami A až K v hornej časti obrázku, znamenajú A, chitobióza; B, 4'-β-mannosylchitobióza; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7 ; J, Man-8; a K, Man-10. Pozri tiež Príklad .
Obrázok 65. Reakčné produkty oligosacharidov z Els, produkovaných v cicavčích bunkách transfekovaných vírusom vaccinia, po inkubácii s alebo bez exoglykosidáz cez noc boli oddeľované na stĺpci TSK gel-Amide-80 (0,46 x 25cm, Tosoh Biosep), pripojenom k zariadeniu Waters Alliance HPLC.
Oddelovanie oligosacharidov prebiehalo za teploty prostredia pri prietoku 1,0 ml/min. Rozpúšťadlo A holo zložené z 0,1% kyseliny octovej v acetonitrile a rozpúšťadlo B bolo zložené z 0,2% kyseliny octovej - 0,2% trietylamínu vo vode. Oddeľovanie 2-AB označených oligosacharidov bolo uskutočňované s použitím izokratickej elúcie 28 % B na 5 objemov stĺpca s nasledujúcim lineárnym zvýšením na 45 % B počas pätnástich objemov stĺpca. Zloženie elučného rozpúšťadla je uvedené na pravej ose Y ako % rozpúšťadla B v rozpúšťadle A (objem/objem) . Doba elúcie je uvedená v minútach na ose X. Ľavá os Y uvádza fluorescenciu eluovaných 2-amínobenzamidom (2-AB)-označených oligosacharidov. Excitačná vlnová dĺžka 2-AB je 330 nm, emisná vlnová dĺžka je 420 nm.
Signál 1 („1) v chromatograme označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných cicavčími bunkami transfekovanými vírusom vaccinia, inkubovaných cez noc bez exoglykosidáz. Signál 2 („2) označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných cicavčími bunkami transfekovanými vírusom vaccinia, po inkubácii Man-9 s α 1-2 manozidázou cez noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označujú elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných cicavčími bunkami transfekovanými vírusom vaccinia, po inkubácii počas 1 hodiny alebo cez noc s a manozidázou, v uvedenom poradí. Signál 5 („5) označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných cicavčími bunkami transfekovanými vírusom vaccinia, po inkubácii s a- a β-manozidázou cez noc. Signály 1-5 sú uvedené ako prekrývajúce sa, vzhladom na to, že ich príslušné základné úrovne nie sú všetky na nulovej úrovni. Signál 6 („6) označuje použitý gradient rozpúšťadla.
Piky, keď sú prítomné, označené písmenami A až K v hornej časti obrázku, znamenajú A, chitobióza; B, 4'-β-mannosylchitobióza; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7 ; J, Man-8; a K, Man-10. Pozri tiež Príklad 26 .
Obrázok 66. Reakčné produkty oligosacharidov z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubácii s alebo bez exoglykosidáz cez noc boli oddeľované na stĺpci TSK gel-Amide80 (0,46 x 25cm, Tosoh Biosep), pripojenom k zariadeniu Waters Alliance HPLC. Oddeľovanie oligosacharidov prebiehalo za teploty prostredia pri prietoku 1,0 ml/min. Rozpúšťadlo A bolo zložené z 0,1% kyseliny octovej v acetonitrile a rozpúšťadlo B bolo zložené z 0,2% kyseliny octovej - 0,2% trietylamínu vo vode. Oddeľovanie 2-AB označených oligosacharidov bolo uskutočňované s použitím izokratickej elúcie 28 % B na 5 objemov stĺpca s nasledujúcim lineárnym zvýšením na 45 % B počas pätnástich objemov stĺpca. Zloženie elučného rozpúšťadla je uvedené na pravej ose Y ako % rozpúšťadla B v rozpúšťadle A (objem/objem) . Doba elúcie je uvedená v minútach na ose X. Ľavá os Y uvádza fluorescenciu eluovaných 2-amínobenzamidom (2-AB)-označených oligosacharidov. Excitačná vlnová dĺžka 2-AB je 330 nm, emisná vlnová dĺžka je 420 nm.
Signál 1 („1) v chromátograme označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných v Hansenula, inkubovaných cez noc bez exoglykosidáz. Signál 2 („2) označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubácii Man-9 s α 1-2 manozidázou cez noc. Signály 3 a 4 („3 a „4) označujú elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubácii cez noc s α manozidázou. Signál 5 („5) označuje elúciu oligosacharidov odvodených z Els, produkovaných v Hansenula, po inkubácii s aa β-manozidázou cez noc. Signály 1-5 sú uvedené ako prekrývajúce sa, vzhladom na to, že ich príslušné základné úrovne nie sú všetky na nulovej úrovni. Signál 6 („S) označuje použitý gradient rozpúšťadla.
Piky, keď sú prítomné, označené písmenami A až K v hornej časti obrázku, znamenajú A, chitobióza; B, 4'-β-mannosylchitobióza; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7 ; J, Man-8; a K, Man-10. Pozri tiež Príklad
26.
Obrázok 67. Analýza SDS-PAGE a farbenie proteínov El, produkovaných v Hansenula a cicavčími bunkami infikovanými HCV-rekombinantným vírusom vaccinia, s modravou Coomassie Brilliant Blue.
Línia 1: markery molekulových hmotnosti s uvedením molekulových hmotností vľavo;
Línia 2: alkylované Els, produkované v Hansenula polymorpha (10 pg);
Línia 3: alkylované Els, produkované v Hansenula polymorpha (5 pg) ;
Línia 4: alkylované Els, produkované v Hansenula polymorpha (2,5 pg) ;
Línia 5: alkylované Els, produkované v bunkách vero infikovaných HCV-rekombinantným vírusom vaccinia (10 μ9);
Línia 6: alkylované Els, produkované v bunkách vero infikovaných HCV-rekombinantným vírusom vaccinia (5 pg);
Línia 7: alkylované Els, produkované v bunkách vero infikovaných HCV-rekombinantným vírusom vaccinia (2,5 pg) . Pozri tiež Príklad 27.
Obrázok 68. Sekvencie proteínu HCV E2-H6 (SEQ ID NO: 5) s vyznačením tryptických fregmentov (sekvencie v rámčekoch boxed sequences) deglykosylovaného proteínu. Glykosylované zvyšky Asn sú premieňané na zvyšky Asp enzýmom PNGázou F a sú vyznačené pod sekvenciou. zvyšky Asn sú náchylné na proteolytické štiepenie s Asp-N endoproteázou. Možnými Nglykosylačnými miestami v E2-H6 (SEQ ID NO: 5) sú N417, N423 , N430/ N44g, Ν47θ, N532/ ^540, N556, N576, Ng23 3 Ng45 podľa číslovania v polyproteíne HCV; na obrázku sú polohy týchto miest označené ako N34, N40, N47, N55, N95, N349, N157, N173, N393, N24o a N262 · Pozri tiež Príklad 28.
Podrobný opis vynálezu
V štúdiách, ktoré viedli k tomuto vynálezu, bolo pozorované, že expresia glykosylovaných obalových proteínov HCV v Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Hansenula polymorpha bola možná ako expresia uvedených obalových proteínov HCV obsahujúcich signálnu peptidovú sekvenciu pripojenú na uvedené obalové proteíny HCV. Vzory glykosylácie obalových proteínov HCV, exprimovaných v týchto troch kvasnicových druhoch, sú ale velmi odlišné (pozri Príklady 6, 10, 13 a 25). Konkrétnejšie, obalové proteíny HCV, exprimované v S. cerevisiae (glykosylačne deficientnom mutante) a v H. polymorpha boli glykosylované spôsobom napodobňujúcim glykosyláciu s jadrom glykosylácie. Obalové proteíny HCV, exprimované v Pichia pastoris, boli hyperglykosylované pri uvádzaní protichodných údajov v predchádzajúcich správach o tom, že proteíny exprimované v kvasniciach nie sú normálne hyperglykosylované (Gellissen et al. 2000, Sugrue et al. 1997) .
Po ďalšej analýze vzorov glykosylácie u proteinov HCV, produkovaných v S. cerevisiae (glykosylačne deficientnom kmeni), H. polymorpha a v cicavčích bunkách infikovaných HCVrekombinantným vírusom vaccinia, bolo prekvapivo zistené, že obalové proteíny HCV produkované v Hansenula vykazovali vzor glykosylácie, ktorý je velmi priaznivý pre diagnostické, profylaktické a terapeutické aplikácie týchto obalových proteinov HCV (pozri Príklady 21-24 a 26-29) . Toto neočakávané zistenie sa odráža v rôznych aspektoch a v uskutočneniach predkladaného vynálezu tak, ako je uvedené nižšie.
Prvý aspekt vynálezu sa týka izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje aspoň jedno N-glykosylačné miesto, kde uvedený proteín alebo jeho fragment je charakterizovaný tým, že je produktom expresie v eukaryontnej bunke a ďalej tým, že priemerne až 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %,58 %, 59 %,60 %, 61 %, 62
%, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 % , 69 %, 70 %, 71 %, 72 %,
73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, alebo 80 % N-
glykosylovaných miest sú miesta glykosylované s j adrom
glykosylácie. Konkrétnejšie, viac ako 60 0, o t 61 %, 62 0. O t 63 O, 0 /
64% , 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 O. O / 71 0. t 72 0, / 73 Q, o / Ί4
%, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 g, 1 82 O. t 83 O. ’C / 84 a /
85 %, 86 %,87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 a 'O t 92 o, O t 93 o ό , 94 o -a
alebo 95 % N-glykosylovaných miest je glykosylovaných s oligomanózou so štruktúrou definovanej ako Man(8 až 10)GlcNAc(2). Konkrétnejšie, ku ktorejkoľvek z vyššie uvedených N-glykosylačných charakteristík, je ďalšou charakteristikou to, že pomer miest glykosylovaných s jadrom s oligomanózou so štruktúrou Man(7)-GlcNAc(2) a počet miest glykosylovaných s jadrom s oligomanózou so štruktúrou Man(8)-GlcNAc(2) je menši ako alebo sa rovná 0,15 ,0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, alebo 0,50. Ďalšou, konkrétnejšou charakteristikou N-glykosylácie k vyššie uvedeným charakteristikám je skutočnosť, že uvedené oligomanózy obsahujú menej ako 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14%, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, alebo 5 % terminálnej a 1,3 manózy.
Výrazom „N-glykosylované miesta glykosylované s oligomanózou so štruktúrou definované ako Man(8 až 10)GlcNAc(2) sa myslí, že uvedené N-glykosylované miesta sú glykosylované s ktoroukolvek z Man(8)-GlcNAc(2), Man(9)GlcNAc(2), alebo Man(10)-GlcNAc(2).
Je zrejmé, že zhodné N-glykosylačné miesta vo dvoch proteínoch môžu byť obsadené odlišnou oligomanózou.
Výraz „proteín sa týka polyméru z aminokyselín a nevzťahuje sa ku špecifickej dĺžke produktu; preto sú v definícii proteínu zahrnuté peptidy, oligopeptidy a polypeptidy. Uvedený termín sa netýka alebo nevylučuje modifikácie proteínu po expresii (post-expression modifications), akými sú napríklad glykosylácia, acetylácia, fosforylácia a podobne. V definícii sú zahrnuté napríklad polypeptidy obsahujúce jeden alebo viacej analógov aminokyselín (vrátane, napríklad neprirodzených aminokyselín, PNA, atď.), polypeptidy so substituovanými väzbami, rovnako ako ďalšie modifikácie známe v odbore, a to ako prirodzene, tak neprirodzene sa vyskytujúce.
Keď je tu použitý výraz „pre-pro-proteín alebo „preprotein, myslí sa tým proteín obsahujúci pre-pro-sekvenciu pripojenú na proteín, ktorý je predmetom záujmu, alebo proteín obsahujúci pro-sekvenciu pripojenú na proteín, ktorý je predmetom záujmu, v uvedenom poradí. Ako alternatívne označenie pre „pre-sekvenciu, sú používané výrazy „signálna sekvencia, „signálny peptid, „vedúci peptid, alebo „vedúca sekvencia; všetky sa vzťahujú k aminokyselinovej sekvencii, ktorá zavádza pre-proteín do hrubého endoplazmatického retikula (rough endoplasmic reticulum, ER) , čo je nevyhnutnou podmienkou pre (N)-glykosyláciu. „Signálna sekvencia, „signálny peptid, „vedúci peptid, alebo „vedúca sekvencia sa odštiepuje, to znamená je „odstránená z proteínu obsahujúceho signálnu sekvenciu pripojenú na proteín, ktorý je predmetom záujmu, na luminálnej strane tohto ER hostiteľskými špecifickými proteázami, ktoré sú označované ako signálne peptidázy. Podobne sa pre-pro-proteín premieňa na pro-proteín po premiestnení do lúmen ER. V závislosti na podstate tejto pro-aminokyselinovej sekvencii, môže alebo nemusí byť táto sekvencia odstránená hostiteľskou bunkou, ktorá exprimuje prepro-proteín. Veľmi dobre známou pre-pro-aminokyselinovou sekvenciou je pre-pro-sekvencia a párovacieho faktora zo S. cerevisiae.
Výrazom obalové proteíny HCV sa myslia obalové proteíny HCV El alebo HCV E2, alebo ich časť, pričom uvedené proteíny môžu byť odvodené z kmeňa HCV akéhokoľvek genotypu. Konkrétnejšie, je HCVENV vybraný zo skupiny aminokyselinových sekvencií pozostávajúci zo sekvencií SEQ ID NO: 85 až 98, aminokyselinových sekvencií, ktoré sú aspoň z 90 % identické so sekvenciami SEQ ID NO: 85 až 98, a z fregmentov ktorejkoľvek z uvedených sekvencií. Za identické aminokyseliny sú považované skupiny konzervovaných aminokyselín tak, ako bolo opísané vyššie, to je skupiny pozostávajúce z Met, íle, Leu a Val; skupiny pozostávajúce z Arg, Lys a His; skupiny pozostávajúce z Phe, Trp a Tyr; skupiny pozostávajúce z Asp a Glu; skupiny pozostávajúce z Asn a Gin; skupiny pozostávajúce z Cys, Ser a Thr; a skupiny
pozostávajúce z Ala a Gly.
Konkrétnej šie, polypeptidu alebo výraz j eho „obalový analógu proteín HCV sa týka (napríklad mimotopov),
obsahujúceho aminokyselinovú sekvenciu (a/alebo aminokyselinový analógov), ktorá predstavuje aspoň jeden epitop HCV buď z oblasti El, alebo z oblasti E2, vedia glykosylačného miesta. Tieto obalové proteíny môžu byť ako monomernými, hetero-oligomernými, tak homo-oligomernými formami rekombinantne exprimovaných obalových proteínov. Sekvencia definujúca epitop bežne zodpovedá aminokyselinovým sekvenciám buď oblasti HCV El, alebo oblasti HCV E2 (buď identicky alebo so substitúciami s analógmi natívnych aminokyselinových zvyškov, ktoré nenarušujú epitop).
Je tretia myslieť na to, že epitop HCV môže byť kolokalizovaný s glykosylačným miestom.
Všeobecne, sekvencia definujúca epitop má dĺžku 3 alebo 4 aminokyseliny, bežnejšie má dĺžku 5, 6, alebo 7 aminokyselín, častejšie je dĺžka 8 alebo 9 aminokyselín a najtypickejšie je dĺžka epitopu 10 alebo viacej aminokyselín. Pokial sa jedná o konformačné epitopy, dĺžka sekvencie definujúca epitop môže byť ovplyvnená rôznymi rozsiahlymi obmenami, lebo sa predpokladá, že tieto epitopy sú vytvárané v trojrozmernom usporiadaní epitopu (napríklad skladaní). A tak počet aminokyselín definujúcich epitop môže byť relatívne malý, ale tieto aminokyseliny mohu byť všeobecne rozptýlené pozdĺž dĺžky molekuly, pričom do správnej konformácie epitopu sú usporiadané prostredníctvom skladania molekuly. Časti antigénu, ktoré sa nachádzajú medzi zvyškami definujúcimi epitop, nemusia byť kritické pre konformačnú štruktúru epitopu. Tak napríklad, delécia alebo substitúcia týchto intervenujúcich sekvencií nemusí mať vplyv na konformáciu epitopu, za predpokladu, že sú zachované sekvencie, ktoré sú kritické pre konformačnú štruktúru epitopu (napríklad cysteíny zúčastnené v tvorbe disulfidových väzieb, glykosylačné miesta atď.). Konformačný epitop môžu tiež tvoriť 2 alebo viacej základných oblastí podjednotiek homo-oligoméru alebo heterooligoméru.
Tak, ako je tu použité, „epitop menovaného poiypeptidu znamená epitopy so zhodnou aminokyselinovu sekvenciou, ako má epitop menovaného poiypeptidu, a ich imunologické ekvivalenty. Takéto ekvivalenty tiež zahŕňajú kmeň, subtyp (=genotyp), alebo typovo(skupinovo)-špecifické varianty, napríklad. v súčasnej dobe známe sekvencie alebo kmene, ktoré patria ku
genotypom la, lb, lc, Id, le, if, 2 a, 2b, 2c, 2d, 2 e, 2f, 2g,
2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f,
4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 41, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a,
8b, 9a, 9b, 10a, 11 (a jeho subtypov) , 12 (a jeho subtypov) alebo 13 (a jeho subtypov), alebo ďalších novo opísaných (sub)typov HCV. Je treba myslieť na to, že aminokyseliny, ktoré vytvárajú epitop, nemusia byť časťou lineárnej sekvencie, ale môžu byť rozptýlené v akomkoľvek počte aminokyselín, a tak vytvárajú konformačný epitop.
Antigény HCV podľa predkladaného vynálezu zahŕňajú konformačné epitopy z El a/alebo E2 (obalových) domén HCV. Doména El, o ktoré sa predpokladá, že zodpovedá vírusovému obalovému proteínu, je v súčasnosti odhadovaná v rozsahu aminokyselín 192-383 v polyproteíne HCV (Hijikata et al. , 1991) . Predpokladá sa, že po expresii v cicavčom systéme (glykosylovaný) má El približnú molekulovú hmotnosť 35 kDa pri stanovení s SDS-PAGE. Predpokladá sa, že proteín E2, skôr nazývaný NS1, zahŕňa aminokyseliny 384-809 alebo 384-746 (Grakoui et al. , 1993) v polyproteíne HCV a tiež sa jedná o obalový proteín. Predpokladá sa, že po expresii v systéme vaccinia (glykosylovaný) má zrejmú molekulovú hmotnosť stanovenú v géli približne 72 kDa. Je treba si uvedomiť, že umiestnenie koncov týchto proteínov je odhadované (napríklad karboxy koniec E2 môže ležať niekde v rozmedzí oblasti aminokyselín 730-820, a tak končí napríklad aminokyselinou 730, 735, 740, 742, 744, 745, výhodne aminokyselinou 746, 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820) . Proteín E2 môže byť tiež exprimovaný spoločne s El, a/alebo s jadrovým proteínom vírusu (aa 1-191), a/alebo P7 (aa 747-809), a/alebo NS2 (aa 810-1026) , a/alebo NS3 (aa 1027-1657) , a/alebo NS4A (aa 1658-1711), a/alebo NS4B (aa 1712-1972), a/alebo NS5A (aa 1973-2420), a/alebo NS5B (aa 2421-3011), a/alebo s časťou z ktoréhokoľvek z týchto proteínov HCV, ktoré sú od E2 odlišné. Podobne, proteín El môže tiež byť exprimovaný spoločne s proteínom E2, a/alebo s jadrovým proteínom (aa 1-191), a/alebo P7 (aa 747-809), a/alebo NS2 (aa 810-1026), a/alebo NS3 (aa 1027-1657), a/alebo NS4A (aa 1658-1711), a/alebo NS4B (aa 1712-1972), a/alebo NS5A (aa 1973-2420), a/alebo NS5B (aa 2421-3011), a/alebo s časťou z ktoréhokolvek z týchto proteínov HCV, ktoré sú od El odlišné. Expresia spoločne s týmito ďalšími proteínmi môže byť významná na dosiahnutie správneho poskladania proteínu.
Výraz „El tak, ako je tu použitý, tiež zahŕňa analógy a skrátené formy, ktoré sú imunogenné krížovo reaktívne s prirodzeným El, a zahŕňa proteíny El vybrané z genotypov 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 alebo 13, alebo ktorýkoľvek ďalší nový identifikovaný typ HCV alebo subtyp. Výraz „E2 tak, ako je tu použitý, tiež zahŕňa analógy a skrátené formy, ktoré sú imunogenné krížovo reaktívne s prirodzeným E2, a zahŕňa proteíny E2 vybrané z genotypov 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 alebo 13, alebo ktorýkoľvek ďalší nový identifikovaný typ HCV alebo subtyp. Tak napríklad, Kato et al. (1992) opísal mnohonásobné inzercie kodónu medzi kodón 383 a 384, rovnako ako delécie aminokyselín 384-387. Je treba myslieť na to, že izoláty použité v časti Príkladov uskutočnenia podľa predkladaného vynálezu, neboli myslené ako obmedzujúci rozsah vynálezu, a že ktorýkolvek izolát HCV vybraný z typov 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 alebo
13, alebo ktorýkolvek z ďalších nových genotypov HCV je vhodným zdrojom sekvencie El a/alebo E2 na uskutočnenie predkladaného vynálezu. Podobne, tak ako bolo vyššie opísané, proteíny HCV, ktoré sú ko-exprimované s obalovými proteínmi HCV podlá predkladaného vynálezu môžu byť odvodené od akéhokoľvek typu HCV, teda aj od zhodného typu, ako sú obalové proteíny HCV podlá predkladaného vynálezu.
„E1/E2, tak, ako je tu použité, sa týka oligomernej formy obalových proteinov obsahujúcej aspoň jednu zložku El a aspoň jednu zložku E2.
Výraz „špecifický oligomerný El a/alebo E2 a/alebo E1/E2 obalové proteíny sa týka všetkých možných oligomerných foriem rekombinatne exprimovaných El a/alebo E2 obalových proteinov, ktoré nie sú agregátmi El a/alebo E2. Špecifické oligomerné obalové proteíny sa tiež týkajú homo-oligomerných El alebo E2 obalových proteinov (pozri nižšie). Výraz „jednoduché alebo špecifické oligomerné El a/alebo E2 a/alebo E1/E2 obalové proteíny sa týka jednotlivých monomerných proteinov El alebo E2 (jednotlivý v prísnom slova zmysle), rovnako ako špecifických oligomerných rekombinantné exprimovaných proteinov El a/alebo E2 a/alebo E1/E2. Tieto jednotlivé alebo špecifické oligomerné obalové proteíny podlá predkladaného vynálezu môžu byť ďalej definované nasledujúcimi vzorcami (El)x(E2)y, kde x môže byť číslo medzi 0 a 100, a y môže byť číslo medzi 0 a 100, za predpokladu, že x a y nie sú obidva 0. Keď x=l a y=0, potom zmienené obalové proteíny predstavujú monomerný El.
Výraz „homo-oligomér tak, ako je tu použitý sa týka komplexného El alebo E2, obsahujúceho viac ako jeden monomér El alebo E2, napríklad Ε1/Ξ1 diméry, El/El/El triméry alebo E1/E1/E1/E1 tetraméry a E2/E2 diméry, E2/E2/E2 triméry alebo E2/E2/E2/E2 tetraméry, El pentaméry a hexaméry, E2 pentaméry a hexaméry, alebo akékoľvek vyššie homo-oligoméry El alebo E2 sú „homo-oligoméry spadajúce do rozsahu definície. Oligoméry môžu obsahovať jeden, dva alebo viacej odlišných monomérov El alebo E2, získaných z odlišných typov alebo subtypov vírusu hepatitídy C, vrátane napríklad tých, ktoré boli opísané v Maertens et al. vo WO94/25601 a vo WO96/13590, to je v prihláškach vynálezu, ktoré sú od zhodných prihlasovateľov, ako je predkladaný vynález. Takéto zmiešané oligoméry sú stále homo-oligoméry spadajúce do rozsahu tohto vynálezu a môžu umožniť univerzálnu diagnostiku, profylaxiu alebo liečbu HCV.
Antigény El a E2 , použité v predkladanom vynáleze, môžu byť vírusové proteíny s úplnou dĺžkou, ich verzie v podstate s úplnou dĺžkou, alebo ich funkčné fragmenty (napríklad fragmenty obsahujúce aspoň jeden epitop a/alebo glykosylačné miesto). Okrem toho, antigény HCV podía predkladaného vynálezu tiež zahŕňajú ďalšie sekvencie, ktoré neblokujú alebo nebránia tvorbe konformačného epitopu, ktorý je predmetom záujmu. Prítomnosť alebo neprítomnosť konformačného epitopu môže byť jednoducho stanovená pomocou screeningu predmetného antigénu s protilátkou (polyklonálna sérová alebo monoklonálna proti konformačnému epitopu) a z porovnania reaktivity s reaktivitou denaturovanej verzie antigénu, ktorú si uchovávajú len lineárne epitopy (pokiaľ vôbec dáku majú). V screeningu, v ktorom sú použité polyklonálne protilátky, môže byť výhodné adsorbovať polyklonálne sérum najprv s denaturovaným antigénom a pozorovať, či sérum obsahuje protilátky k antigénu, ktorý je predmetom záujmu.
Proteiny podlá predkladaného vynálezu môžu byť glykosylované. Glykosylovanými proteínmi sú myslené proteiny, ktoré obsahujú jednu alebo viacej uhlovodanových skupín, konkrétne zvyškov cukrov. Všetky eukaryontné bunky sú všeobecne schopné glykosylovať proteiny. Z porovnania sekvencii obalových proteínov odlišných genotypov HCV je možné odvodiť, že vôbec nie všetkých 6 glykosylačných miest v proteíne HCV El je potrebných na riadne skladanie a reaktivitu proteínu. Ďalej je známe, že glykosylačné miesto v pozícii 325 nie je N-glykosyláciou modifikované (FournillierJacob et al. 1996, Meunier et al. 1999). Okrem toho, subtyp proteínu 1b El obsahuje 6 glykosylačných miest, ale niektoré z týchto glykosylačných miest nie sú v určitých iných (sub)typoch prítomné. Štvrtý uhľovodanový motív (na Asn250), ktorý je prítomný u typov lb, 6a, 7, 8, a 9 chýba vo všetkých ďalších dnes známych typoch. Tento adičný cukrový motív môže byť mutovaný za poskytnutia proteínu typu lb El, ktorý má zlepšenú reaktivitu. Sekvencie typu 2b tiež vykazujú ďalšie glykosylačné miesto v oblasti V5 (na Asn299). Izolát S83, ktorý prislúcha ku genotypu 2c, je dokonca bez prvého uhľovodanového motívu v oblasti VI (na Asn), zatiaľ čo tento motív je prítomný vo všetkých ďalších izolátoch (Stuyver et al., 1994). Ale aj u kompletne konzervovaných adičných cukrových motívoch nemusí byť prítomnosť uhľovodanov na skladanie požadovaná, ale môže hrať úlohu v úniku pred imunitným dozorom. Z tohto dôvodu môže byť identifikácia úlohy glykosylácie ďalej testovaná mutagenéziou motívov glykosylácie. Mutagenézia motívu glykosylácie (NXS alebo NXT sekvenciou) môže byť dosiahnutá buď mutáciou v kodónoch pre N, S, alebo T takým spôsobom, že tieto kodóny kódujú aminokyseliny odlišné od N v prípade N, a/alebo aminokyseliny odlišné od S alebo T, v prípade S a v prípade T. Alebo môže byť pozícia X mutovaná na P, lebo je známe, že NPS alebo NPT nie sú často modifikované s uhlovodanmi. Po stanovení toho, ktoré uhľovodanové adičné motívy sú potrebné na skladanie a/alebo reaktivitu proteínu, a ktoré nie, môžu byť uskutočnené kombinácie takých mutácií. Takéto pokusy boli opísané v Maertens et al. v príklade 8 vo WO96/04385, ktorý je tu zahrnutý formou konkrétneho odkazu.
Výraz glykosylácia, použitý v predkladanom vynáleze, sa týka N-glykosylácie, pokiaľ nie je špecifikované inak.
Konkrétne sa predkladaný vynález týka obalových proteínov HCV, alebo ich častí, ktoré sú glykosylované s jadrom glykosylácie („core-glycosylated). V tomto zmysle výraz „glykosylovaný s jadrom glykosylácie sa týka štruktúry „podobnej štruktúre, ktorá je zobrazená na obrázku 3 s vyznačenými rámčekmi v práci Herscovics and Orlean (1993). Uvádzaná štruktúra cukru obsahuje 10 až 11 monosacharidov. Najmä je dôležité poznamenať, že uvedená práca je tu zahrnutá formou odkazu. Výraz „podobný znamená, že nie viac ako 4 ďalšie monosacharidy môžu byť pridané k štruktúre, alebo, že nie viac ako približne 3 monosacharidy boli zo štruktúry odstránené. Preto uhlovodanová štruktúra glykosylačného jadra podľa vynálezu obsahuje minimálne 7 a maximálne 15 monosacharidov a môže obsahovať 8, 9, 10, 11, 12, 13 alebo 14 monosacharidov. Ako monosacharidy sú myslené najmä glukóza, manóza alebo N-acetylglukozamín.
Podľa ďalšieho aspektu sa predkladaný vynález týka izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje aspoň jedno N-glykosylačné miesto, pričom uvedený proteín alebo fragment je charakterizovaný tým, že je produktom expresie v eukaryontnej bunke a ďalej je charakterizovaný tým, že viac ako 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64
O, o z 65 g. o z 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 o, ° z 73 %, 74 %,
75 o. ! 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85
0, ° z 86 O ° z 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 O, *0 , 94 % alebo
95 g, 0 glykosylačných miest je glykosylovaných s oligomanózou
definovanou ako Man(8 až 10)-GlcNAc(2). Konkrétnejšie, k vyššie uvedeným glykosylačným charakteristikám je ďalšou charakteristikou pomer medzi počtom miest glykosylovaných s jadrom glykosylácie s oligomanózou so štruktúrou Man(7)GlcNAc(2) a počtom miest glykosylovaných s jadrom glykosylácie s oligomanózou so štruktúrou Man(8)-GlcNAc(2) , ktorý je menší ako alebo sa rovná 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, alebo 0,50. Ďalšou špecifickejšou charakteristikou k vyššie uvedeným N-glykosylačným charakteristikám je, že uvedené oligomanózy obsahujú menej ako 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, alebo 5 % terminálnej a 1,3 manózy.
Ďalší alternatívny aspekt vynálezu sa týka izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje aspoň jedno N-glykosylačné miesto, pričom uvedený proteín alebo fragment je produktom expresie v eukaryontnej bunke a je ďalej charakterizovaný tým, že N-glykosylačné miesta sú obsadené oligomanózami, kde pomer oligomanóz so štruktúrou Man(7)-GlcNAc(2) k oligomanózam so štruktúrou Man(8)-GlcNAc(2) je menší ako alebo sa rovná 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, alebo 0,50. Ďalšou konkrétnejšou charakteristikou k vyššie uvedeným charakteristikám je, že uvedené oligomanózy obsahujú menej ako 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %,9 %, 8 %, 7 %, 6 %, alebo 5 % terminálnej a 1,3 manózy.
Podlá ďalšieho alternatívneho aspektu sa predkladaný vynález týka izolovaného obalového proteinu HCV alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje aspoň jedno N-glykosylačné miesto, pričom uvedený proteín alebo fragment je charakterizovaný tým, že je produktom expresie v eukaryontnej bunke a nie cicavčej bunke, a ďalej charakterizovaný tým, že počet N-glykosylačných miest je aspoň o 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, alebo 15 % menší, ako je počet N-glykosylačných miest v zhodnom proteíne alebo jeho fragmente, ktorý bol exprimovaný v eukaryontnej bunke vystavenej infekcii vírusu vaccinia. Konkrétnejšie, vedľa vyššie uvedených N-glykosylačných
charakteristík je až 50 %, 51 %, 52 %, 53 Q, Z 54 %, 55 %, 56 %,
57 0, 0 z 58 %, 59 O, o z 60 %, 61 %, 62 %, 63 Q š Z 64 O z 65 %, 66 %, 67
o, o Z 68 %, 69 %, 70 o, Z 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %,
78 0 *0 f 79 %, alebo 80 % uvedených N- glykosylačných miest
glykosylovaných s jadrom glykosylácie. Konkrétnejšie, viac ako
60 %,61 %, 62 %, 63 O, Ό z 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70
0 *o / 71 %, 72 %, 73 % , 74 O ° z 75 %, 76 0, t-t O, *S , II *5 , 78 %, 79 %, 80 %,
81 %, 82 %, 83 %, 84 0. t 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91
%, 92 %, 93 %, 94 o, 'o alebo 95 % N-glykosylačných miest je
glykosylovaných s oligomanózou so štruktúrou definovanou ako Man(8 až 10)GlcNAc(2). Ešte viacej konkrétne, k akejkoľvek z vyššie uvedených N-glykosylačných charakteristík pristupuje ďalšia, to je že pomer počtu miest glykosylovaných s jadrom glykosylácie s oligomanózou so štruktúrou Man(7)-GlcNAc(2) k počtu miest glykosylovaných s jadrom glykosylácie s oligomanózou so štruktúrou Man(8)-GlcNAc(2) je menší ako alebo sa rovná 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, alebo 0,50. Ďalšou, konkrétnejšou charakteristikou k akejkoľvek z vyššie uvedených N-glykosylačných charakteristík je, že uvedené oligomanózy obsahujú menej ako 20 %, 19 %,18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, alebo 5 % terminálnej a 1,3 manózy.
Podľa ďalšieho aspektu vynálezu je izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu produktom expresie v bunke kvasnice. Konkrétnejšie, izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu je produktom expresie v bunke kmeňov Saccharomyces, ako je Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveri, alebo Saccharomyces uvarum, Schizosaccharomyces, ako je Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, ako je Kluyveromyces lactis, Yarrowia, ako je Yarrowia lipolytica, Hansenula, ako je Hansenula polymorpha, Pichia, ako je Pichia pastoris, Aspergillus species, Neurospora, ako je Neurospora crassa, alebo Schwanniomyces, ako je Schwanniomyces occidentalis, alebo mutantná bunka odvodená z ktoréhokoľvek z vyššie uvedených kmeňov. Konkrétnejšie, izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu je produktom expresie v bunke Hansenula. Ešte viacej špecificky, izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu je produktom expresie v bunke kvasnice, napríklad rodu Hansenula, v neprítomnosti glykosylačných inhibítorov, ako je tunicamycín.
Podľa ďalšieho aspektu vynálezu je izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu získaný z proteínu, ktorý obsahuje vedúci peptid opičieho lysozýmu alebo jeho funkčný variant, pripojený k zmienenému obalovému proteínu HCV alebo jeho fragmentu. Konkrétnejšie, izolovaný obalový proteín alebo jeho časť podľa vynálezu je získaný z proteínu, ktorý je charakterizovaný štruktúrou vzorca
CL-HCVENV- [ (A3)d- (PS2)e- (A4)f] , kde:
CL vedúci peptid opičieho lysozýmu alebo jeho funkčný ekvivalent,
Al, A2, A3 a A4 sú adaptorové peptidy, ktoré môžu byť odlišné alebo zhodné,
PSI a PS2 sú miesta úpravy, ktoré môžu byť odlišné alebo zhodné,
HCVENV je obalový proteín HCV alebo jeho časť, a, b, c, d, eafjeO alebo 1, a kde sú prípadne Al a/alebo A2 časťou PSI, a/alebo kde A3 a/alebo A4 sú časťou PS2.
„Opičím vedúcim peptidom alebo jeho časťou, pripojenou k obalovému proteínu HCV alebo jeho časti je myslené, že Ckoncová aminokyselina uvedeného vedúceho peptidu je kovalentné pripojená prostredníctvom peptidovej väzby k N-koncovej aminokyseline uvedeného obalového proteínu HCV alebo k jeho časti. V alternatívnom uskutočnení je C-koncová aminokyselina uvedeného vedúceho peptidu oddelená od N-koncovej aminokyseliny obalového proteínu HCV alebo jeho časti peptidom alebo proteínom. Uvedený peptid alebo proteín môže mať štruktúru CL-HCVENV-[(A3) d (PS2) e- (A4)f] tak, ako je definovaná vyš šie.
Odvodenie obalového proteínu HCV, ktorý je predmetom záujmu, z proteínu obsahujúceho vedúci peptid opičieho lysozýmu alebo jeho funkčný ekvivalent pripojený k obalovému proteínu HCV alebo k jeho časti, alebo z proteínu charakterizovanom štruktúrou CL-HCVENV- [ (A3)j-(PS2)e- (A4) f] môže byť uskutočnené in vivo proteolytickým štiepením v bunkách , v ktorých je tento pre-proteín exprimovaný. Konkrétnejšie, stupeň odstránenia opičieho vedúceho peptidu je výhodne uskutočňovaný in vivo proteolytickým aparátom buniek, v ktorých je pre-proteín exprimovaný. Ale odvodenie môže byť tiež uskutočnené len in vitro po a/alebo počas izolácie a/alebo purifikácie pre-proteínu, a/alebo proteínu z buniek exprimujúcich pre-proteín, a/alebo z kultivačnej kvapaliny, v ktorej boli pestované bunky exprimujúce pre-proteín. Alternatívne je uvedené odvodenie in vivo uskutočňované kombináciou s uvedeným získaním in vitro. Odvodenie proteínu HCV, ktorý je predmetom záujmu, z rekombinantné exprimovaného pre-proteínu môže ďalej zahŕňať použitie proteolytického enzýmu (proteolytických enzýmov) v čistiacom stupni, kde všetky alebo väčšina kontaminujúcich proteínov, ktoré sú spoločne prítomné s proteínom, ktorý je predmetom záujmu, je degradovaná, a kde proteín záujmu je rezistentný na čistenie s proteolytickým enzýmom (proteolytickými enzýmami). Odvodenie a čistenie nie sú vzájomne sa vylučujúce procesy a môžu byť dosiahnuté s použitím jediného proteolytického enzýmu. Ako príklad sa tu uvádza proteín HCV Els genotypu HCV lb (SEQ ID NO: 2), ktorý je bez zvyškov Lys. Pri štiepení proteínového extraktu, ktorý obsahuje uvedené EI proteiny HCV, s endoproteázou Lys-C (endo-Lys), nie sú proteiny EI degradované, zatial čo kontaminujúce proteiny obsahujúce jeden alebo viacej zvyškov Lys sú degradované. Taký proces môže významne zjednodušiť izoláciu alebo zvýšiť účinnosť purifikácie proteínov HCV El. Okrem toho je možné dosiahnuť ďalšie výhodné možnosti správneho in vitro oddelenia vedúceho peptidu z HCV El pre-proteínu tým, že je zavedený ďalší zvyšok lysinu, napríklad medzi vedúci peptid a proteín HCV El. Iné proteiny HCV El môžu obsahovať zvyšok Lys v jednej, alebo vo viacerých z pozíciách 4, 40, 42, 44, 61, 65 alebo 179 (kde pozíciou 1 je prvá N-koncová prirodzená aminokyselina proteinu El, to je pozícia 192 v polyproteíne HCV). Aby bolo umožnené použitie endo-lys C tak, ako je opísané vyššie, môžu byť uvedené zvyšky Lys mutované na iné aminokyselinové zvyšky, výhodne na zvyšok Arg.
„Správne odstráneným vedúcim peptidom sa myslí, že uvedený vedúci peptid je z proteinu, obsahujúceho signálnu sekvenciu pripojenú na proteín záujmu, odstránený s vysokou účinnosťou, t.j. veľké množstvo pre-(pro-)proteínov je premenené na (pro-)proteiny, a s vysokou fidelitou, to je že len pre-aminokyselinová sekvencia je odstránená a nie je odstránená žiadna z aminokyselín proteinu, ktorý je predmetom záujmu a je pripojený k uvedenej pre-aminokyselinovej sekvencii. „Odstránením vedúceho peptidu s vysokou účinnosťou sa myslí, že aspoň približne 40 %, výhodnejšie približne 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % alebo dokonca 99 % pre-proteínov je premenené na proteín, z ktorého je pre-sekvencia odstraňovaná. Alternatívne, keď časť exprimovaných pre-proteínov nie je premenená na proteín, z ktorého je pre-sekvencia odstraňovaná, tieto pre-proteíny môžu aj tak byť purifikované alebo môžu byť odstránené počas purifikácie.
Výrazom „funkčný ekvivalent vedúceho peptidu opičieho lysozýmu (CL) sa má na mysli vedúci peptid CL, v ktorom jedna alebo viacej aminokyselín bola substituovaná za inú aminokyselinu, pričom uvedená substitúcia je konzervatívnou aminokyselinovou substitúciou. Výrazom „konzervatívna aminokyselinová substitúcia sa má na mysli substitúcia aminokyselín patriacich k skupine konzervovaných aminokyselín za inú aminokyselinu, ktorá patrí do rovnakej skupiny konzerovovaných aminokyselín. Skupinami konzervovaných aminokyselín sa majú na mysli: skupina pozostávajúca z Met, íle, Leu a Val; skupina pozostávajúca z Arg, Lys a His; skupina pozostávajúca z Phe, Trp a Tyr,· skupina pozostávajúca z Asp a Glu; skupina pozostávajúca z Asn a Gin; skupina pozostávajúca z Cys, Ser a Thr,· a skupina pozostávajúca z Ala a Gly. Príkladnou konzervatívnou aminokyselinovou substitúciou vo vedúcom peptide CL je prirodzená variácia v pozícii 6, kde aminokyselinou v tejto pozícii je buď Val alebo íle; ďalšia variácia sa objavuje v pozícii 17, kde aminokyselinou v tejto pozícii, okrem iného, je Leu alebo Pro (pozri SEQ ID NO:1). Rezultujúce vedúce peptidy CL sú tak považované za funkčné ekvivalenty. Iné funkčné ekvivalenty vedúcich peptidov CL zahŕňajú tie vedúce peptidy, ktoré vykazujú zhodné technické vlastnosti, ako majú vedúce peptidy CL, tak, ako sa opisujú v predkladanom vynáleze, vrátane delečných a inzerčných variant.
Označením „A alebo „adaptorový peptid sa má na mysli peptid (napríklad s 1 až 30 aminokyselinami), alebo proteín, ktorý môže slúžiť ako linker (spojovník) medzi napríklad vedúcim peptidom a miestom úpravy (processing site, PS), vedúcim peptidom a proteínom, ktorý je predmetom záujmu, a PS a proteínom, ktorý je predmetom záujmu, a/alebo proteínom, ktorý je predmetom záujmu, a PS; a/alebo môže slúžiť ako linker na N- alebo C-konci, napríklad vedúceho peptidu, PS alebo proteínu záujmu. Adaptorový peptid „A môže mať určitú trojrozmernú štruktúru, napríklad α-skrutkovnicovú alebo βlistovú štruktúru, alebo ich kombináciu. Alternatívne nie je trojrozmerná štruktúra celkom definovaná, napríklad sa jedná o štruktúru zvinutej slučky „coiled-coil. Adaptor A môže byť súčasťou napríklad pre-sekvencie, pro-sekvencie, proteínu, ktorý je predmetom záujmu, alebo miesta úpravy. Adaptor môže slúžiť ako identifikátorová značka (tag), ktorá zvyšuje alebo umožňuje detekciu a/alebo purifikáciu a/alebo úpravu proteínu, ktorého je A súčasťou. Jedným z príkladov peptidu A je peptid „his-tag (HHHHHH; SEQ ID NO: 63) Hn, kde n sa obvykle rovná 6, ale môže tiež byť 7, 8, 9, 10, 11, alebo 12. Iné z príkladov peptidov A zahŕňajú peptidy EEGEPK (Kjeldsen et al. vo WO98/28429; SEQ ID NO: 64) alebo EEAEPK (Kjeldsen et al. vo WO97/22706; SEQ ID NO: 65), o ktorých je známe, že keď sú prítomné na N-konci proteínu záujmu, zvyšujú fermentačný výťažok, ale tiež chránia N-koniec proteínu záujmu proti úpravám s dipeptidyl aminopeptidázou, a tak vzniká homogénny N-koniec poiypeptidu. Súčasne môže byť zrenie proteínu záujmu in vitro, napríklad odstránenie uvedených peptidov EEGEPK (SEQ ID NO: 64) a EEAEPK (SEQ ID NO: 65) z proteínu záujmu, dosiahnuté s použitím napríklad endo-lys C, ktorá štiepi Ckoniec zvyšku Lys v uvedených peptidoch. Uvedené peptidy tak môžu slúžiť ako adaptorový peptid (A) , rovnako ako miesto úpravy (PS) (pozri nižšie). Adaptorové peptidy sú opísané v sekvenciách SEQ ID NO: 63 až 65, 70 až 72 a 74 až 82. Iným príkladom adaptorového peptidu je imunologický tichý (immunosilent) linker G4S. Iné príklady adaptorových peptidov alebo adaptorových proteinov sú uvedené v tabuľke 2 práce Stevensa (Stevens et al. 2000).
Označením „PS alebo „miesto úpravy (processing site) sa má na mysli miesto špecifickej úpravy proteínu alebo upravitelné miesto. Taká úprava môže nastať enzymaticky alebo chemicky. Príklady miest úpravy náchylných k špecifickej enzymatickej úprave zahŕňajú IEGR^X (SEQ ID NO: 66), IDGRÍX (SEQ ID NO: 67), AEGRÍX (SEQ ID NO: 68), pričom vo všetkých je proteázou hovädzieho faktora Xa rozpoznávané a štiepené miesto medzi zvyškom Arg a Xaa (akákoľvek aminokyselina) označená vyššie ako „Φ (Nagai, K. and Thogersen, H. C. 1984). Iným príkladom miesta PS je dibázické miesto, napríklad Arg-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys alebo Lys-Arg, ktoré je štiepiteľné s kvasnicovou Kex2 proteázou (Julius, D. et al. 1984). Miestom PS môže tiež byť monobázické miesto Lys. Uvedené monobázické miesto Lys (Lys-PS-site) môže byť tiež obsiahnuté na C-konci peptidu A. Príklady adaptorových peptidov A, ktoré obsahujú na C-konci monobázické Lys-PS-miesto, sú uvedené v sekvenciách SEQ ID NO: 64 až 65 a 74 až 76. Exoproteolytické odstránenie His-tag (HHHHHH; SEQ ID NO: 63) je možné s použitím dipeptidyl aminopeptidázy I (DAPase) samotnej, alebo v kombinácii s glutamin cyklotransferázou (glutamine cyclotransferase,
Qcyclase) a pyroglutámovou aminopeptidázou (pyroglutamic aminopeptidase, pGAPase) (Pedersen,J. et al. 1999). Uvedené exopeptidázy obsahujúce rekombinantnú značku His-tag (ktorá umožňuje odstránenie peptidázy z reakčnej zmesi pomocou afinitnej chromatografie na imobilizovaných iónoch kovov (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC) sú komerčne dostupné, napríklad ako TAGZyme System, Unizyme Laboratories (Horsholm, DK). „Úpravou sa tak všeobecne myslí metóda alebo spôsob, pri ktorom je proteín špecificky štiepený, alebo je proteín štiepiteľný v aspoň jednom mieste úpravy, pričom uvedené miesto úpravy je prítomné v zmienenom proteíne. PS môže byť náchylné k endoproteolytickému štiepeniu alebo môže byť náchylné k exoproteolytickému štiepeniu, v každom prípade je štiepenie špecifické, napríklad nezasahuje miesta, ktoré sú odlišné od miest rozpoznávaných proteolytickými enzýmami zúčastnenými v úprave proteínu (processing proteolytic enzýme). Rad miest PS je uvedený v sekvenciách SEQ ID NO: 66 až 68 a 83 až 84.
Všestrannosť štruktúry [(Al/3)a/d - (PSl/2)bye - (A2/4)c/f] tak, ako bola opísaná vyššie, bola preukázaná pomocou niektorých príkladov. V prvom príklade je uvedená štruktúra prítomná na C-terminálnom konci proteínu záujmu, ktorý je obsiahnutý v pre-proteíne, a kde A3 je peptid „VIEGR (SEQ ID NO : 69), ktorý sa vzájomne presahuje s PS miestom faktora Xa „IEGRX (SEQ ID NO: 66) , a kde X=A4 je značka histidin-tag (SEQ ID NO: 63) (d, e a f sú tak v danom prípade všetky 1) . Proteín HCV, ktorý je predmetom záujmu, môže byť (prípadne) purifikovaný s IMAC. Po úprave s faktorom Xa, nesie proteín záujmu HCV (prípadne purifikovaný) na svojom C-konci miesto úpravy PS, ktorým je „IEGR (SEQ ID NO: 70) . Iným variantom miesta úpravy upravovaného faktorom Xa môže byť IDGR (SEQ ID NO: 71) alebo AEGR (SEQ ID NO: 72) . V ďalšom príklade je štruktúra [(Al/3)a/d ' (PSl/2)b/e - (A2/4)c/f] prítomná na Nkonci proteínu záujmu HCV. Ďalej, Al je histidin-tag (SEQ ID NO: 63), PS je rozpoznávacie miesto faktora Xa (akákoľvek zo sekvencii SEQ ID NO: 66 až 68), pričom X je proteín záujmu, a a=b=l a c=0. Po správnom odstránení vedúceho peptidu, napríklad hostiteľskou bunkou, môže byť rezultujúci proteín záujmu HCV purifikovaný s IMAC (prípadne). Po úprave s faktorom Xa, proteín záujmu je bez štruktúry [ (Al)a-(PSI)b(A2)c] .
Ďalej je zrejmé, že ktorýkoľvek z Al, A2, A3, A4, PSI a PS2, keď sú prítomné, potom môžu byť prítomné v opakovanej štruktúre. Keď sú prítomné takéto opakujúce sa štruktúry, sú v tomto kontexte stále počítané ako 1, napríklad a, b, c, d, e, alebo f sa rovnajú 1, aj keď napríklad Al sa vyskytuje napríklad ako 2 opakovanie (Al-Al).
Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka akéhokoľvek izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu podľa vynálezu, v ktorom tiólové skupiny cysteínu sú chemicky modifikované.
Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka akéhokoľvek izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu podlá vynálezu, ktorý je antigynný.
Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka akéhokoľvek izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu podľa vynálezu, ktorý je imunogenný.
Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka akéhokoľvek izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu podlá vynálezu, ktorý zahŕňa epitop stimulujúci T-bunky.
Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka akéhokoľvek izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu podľa vynálezu, ktorý je obsiahnutý v štruktúre vybranej zo skupiny pozostávajúcej z monomérov, homodimérov, heterodimérov, homooligomérov a hetero-oligomérov.
Ďalší aspekt tohto vynálezu sa týka akéhokoľvek izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu podlá vynálezu, ktorý je obsiahnutý v častici podobnej vírusu.
V obalových proteínoch HCV alebo v ich častiach, tak ako sú tu opísané, ktoré obsahujú aspoň jeden zvyšok cysteínu, výhodne ale 2 a viacej zvyškov cysteínu, môžu byť tiólové skupiny cysteínu ireverzibilné chránené s chemickými alebo enzymatickými prostriedkami. Konkrétne, „ireverzibilná ochrana alebo „ireverzibilné blokovanie s chemickými prostriedkami sa týkajú alkylácie, výhodne alkylácie obalových proteínov HCV s použitím alkylačných činidiel, ako sú napríklad aktívne halogény, etylénimín alebo N(jódetyl)trifluór-acetamid. Z tohto hladiska je treba alkyláciu tiólových skupín cysteínu chápať ako zámenu vodíka v tiólovej skupine skupinou (CH2)nR, v ktorej n je 0, 1, 2, 3 alebo 4 a R = H, COOH, NH2, CONH2, fenyl, alebo ktorýkoľvek ich derivát. Alkylácia môže byť uskutočňovaná akoukolvek metódou známou v odbore, ako napríklad aktívnymi halogénmi X(CH2)nR, v ktorých X je halogén ako I, Br, Cl alebo F. Príklady aktívnych halogénov sú metyljodid, jódoctová kyselina, jódacetamid a 2-brómetylamín. Iné spôsoby alkylácie zahŕňajú použitie NEM (N-etylmaleimid) alebo Biotín-NEM, ich zmesi, alebo etylénimínu alebo N-(jódetyl)trifluóroacetamidu, ktoré obidva vedú k substitúcii -H za -CH2-CH2-NH2 (Hermanson, G. T. 1996) . Výraz „alkylačné činidlá tak, ako je tu použitý, sa týka zlúčenín, ktoré sú schopné uskutočňovať tu opísanú alkyláciu. Takéto alkylácie vedú k modifikovanému cysteínu, ktorý môže napodobňovať iné aminokyseliny. Alkylácia s etylénimínom vedie k štruktúre napodobňujúcej lysín takým spôsobom, že sú zavádzané nové štiepiace miesta pre trypsín (Hermanson, G. T. 1996). Podobne, použitie metyljodidu vedie k aminokyseline napodobňujúcej metionín, zatial čo použitie jódacetátu a jódacetamidu vedie k aminokyselinám napodobňujúcim kyselinu glutamovú a glutamín, v uvedenom poradí. Analogicky sú tieto aminokyseliny výhodne použité v priamej mutácii cysteínu. Z tohto dôvodu sa predkladaný vynález týka obalových proteínov HCV tak, ako sú tu opísané, v ktorých aspoň jeden zvyšok cysteínu v obalových proteínoch HCV tak, ako sú tu opísané, je mutovaný na prirodzenú aminokyselinu, výhodne na metionín, kyselinu glutamovú, glutamín alebo lysín. Termín „mutovaný sa týka miestneriadenej mutagenézie nukleových kyselín kódujúcich tieto aminokyseliny, to je veľmi dobre známych metód v odbore, ako miestne-riadená s použitím PCR sprostredkovanej oligonukleotidmi (oligonucleotide-mediated mutagenesis), ako sú opísané v (Sambrook,J. et al. 1989). Je treba uviesť, že v príkladové časti tohto vynálezu sa alkylácia týka použitia jódacetamidu ako alkylačného činidla, pokial nie je špecifikované inak.
je napríklad mutagenesis) mutagenézia (site-directed alebo via mutagenézie
Ďalej je treba uviesť, že v purifikačnom postupe môžu byť Ľiólové skupiny cysteínu, obsiahnutého v proteínoch HCV alebo ich častiach podľa predkladaného vynálezu, reverzibilne chránené. Účelom reverzibilnej ochrany je stabilizovať protein
HCV alebo jeho časť. Najmä po reverzibiInej protekcii je funkčná skupina obsahujúca síru (napríklad tióly a disulfidy) udržiavaná v nereaktívnych podmienkach. Funkčná skupina obsahujúca síru je tak neschopná reagovať s inými zlúčeninami, ktoré tak napríklad stratili svoju tendenciu na tvorbu alebo zámenu disulfidových väzieb, ako napríklad
Ri-SH + R2-SH ---X--- > Rx-S-S-Ra ;
Rx-S-S-Rs + R3-SH ---X--- > R1-S-S-R3 + R2-SH;
Rx-S-S-R2 + R3-S-S-R4 ---X---> Rx-S-S-R3 + R2-S-S-R4.
Opísané reakcie medzi tiólmi a/alebo disulfidovými zvyškami nie sú obmedzené na intermolekulárne procesy, ale môžu sa objavovať tiež intramolekulárne.
Termín „reverzibilná ochrana alebo „reverzibilné blokovanie tak, ako je tu použitý, predpokladá kovalentnú väzbu modifikujúcich činidiel na tiólové skupiny cysteínu, rovnako ako úpravu prostredia obklopujúceho proteín HCV tak, že redoxný stav tiólových skupín cysteínu zostáva počas nasledujúcich krokov purifikačného postupu nedotknutý (tienenie) . Reverzibilná ochrana tiólových skupín cysteínu môže byť uskutočnená chemicky alebo enzymaticky.
Výraz „reverzibilná ochrana s enzymatickými prostriedkami tak, ako je tu použitý sa týka reverzibilnej ochrany sprostredkovanej enzýmami, akými sú acyltransferázy, napríklad acyltransferázy, ktoré sú zúčastnené v katalýze tioesterifikácie, ako je palmitoyl acyltransferáza (pozri nižšie) .
Termín „reverzibilná ochrana s chemickými prostriedkami tak, ako je tu použitý sa týka reverzibilnej ochrany:
s modifikačnými činidlami, ktoré reverzibilné modifikujú cysteínyly, napríklad sulfonáciou a tioesterifikáciou;
Sulfonácia je reakcia, v ktorej tióly alebo cysteíny zúčastnené v disulfidových mostíkoch sú modifikované na S-sulfonát:RSH —> RS-SO3 (Darbre, A. 1986) alebo na RS-SR -> 2 RS-SO3‘ (sulfitolýza; (Kumar, N. et al. 1986)).
Reagenciami pre sulfonáciu sú napríklad Na2SO3, alebo tetrationát sodný. Druhé z činidiel pre sulfonáciu je používané v koncentrácii 10 až 200 mM, a výhodnejšie v koncentrácii 50 až 200 mM. Prípadne môže byť sulfonácia uskutočňovaná za prítomnosti katalyzátora, akým je napríklad Cu2+ (100 μΜ až 1 mM) alebo cysteín (1 až 10 mM) . Reakcia môže byť uskutočňovaná za podmienok, ktoré denaturujú proteín, rovnako ako za prirodzených podmienok (Kumar, N. et al. 1985, Kumar, N. et al. 1986) .
Tvorba tioesterových vazeb, alebo tioesterifikácia je charakterizovaná ako:
RSH + R'COX —» COR', kde v zlúčenine je X je výhodne halogén.
2. s modifikačnými činidlami, ktoré reverzibilne modifikujú cysteínyly podía predloženého vynálezu, akými sú napríklad ťažké kovy, konkrétne Zn2+, Cd2+, mono-, ditio- a disulfidové zlúčeniny (napríkladaryl- a alkylmetántiosulfonát, ditiopyridín, ditiomorfolín, dihydrolipoamid, Ellmann reagens, aldrotiol™ (Aldrich) (Rein, A. et al. 1996), ditiokarbamáty, alebo tiolačné činidlá (napríklad glutatión, N-acetyl cysteín, cysteínamín). Ditiokarbamát zahŕňa širokú triedu· molekúl, ktoré majú funkčnú skupinu RiR2NC (S) SR3, ktorá im poskytuje schopnosť reagovať so sulfhydrylovými skupinami. Zlúčeniny obsahujúce tiólovú skupinu sú s výhodou používané v koncentráciách 0,1 až 50 mM, výhodnejšie v koncentráciách 1 až 50 mM, a najvýhodnejšie v koncentráciách 10 až 50 mM;
3. s prítomnosťou modifikačných činidiel, ktoré zachovávajú stav tiólu (stabilizujú ho) , konkrétne antioxidačné látky, ako sú napríklad DTT, dihydroaskorbát, vitamíny a deriváty, manitol, aminokyseliny, peptidy a deriváty (napríklad histidín, ergotioneín, carnosín, metionín), galláty, hydroxyanizol, hydoxytoluén, hydrochinón, hydroxymetylfenol a ich deriváty v rozmedzí koncentrácií 10 μΜ až 10 mM; výhodnejšie v koncentrácii 1 M až 10 mM;
4. Za podmienok stabilizujúcich tiólové skupiny, ako sú napríklad (i) kofaktory, ako kovové ióny (Zn2+, Mg2+) , ATP, (ii) riadenie pH (napríklad pre proteíny vo väčšine prípadoch pH ~5 alebo je pH výhodne tiol pKa-2; napríklad pre peptidy purifikované chromatografiou na reverznej fáze pri pH 2).
Kombinácia reverzibilnej ochrany tak, ako je opísaná v bodoch (1), (2), (3) a (4) môže viesť k podobne čistým a znovu poskladaným (refolded) proteínom HCV. V podstate môžu byť použité kombinované zlúčeniny, ako napríklad Z103 (Zn carnosín), výhodne v koncentrácii 1 až 10 mM. Je treba uviesť, že reverzibilná ochrana sa mimo modifikácie skupín a tienení, opísaných vyššie, tiež týka akejkoľvek metódy ochrany cysteínylu, ktorá môže byť vrátená späť enzymaticky alebo chemicky bez narušenia chrbtice peptidu. V tomto zmysle sa predkladaný vynález špecificky týka peptidov, pripravených klasickou chemickou syntézou (pozri vyššie), v ktorej napríklad tioesterové väzby sú štiepené tioesterázou, za bázických pufrovacích podmienok Beekman, N. J. et al. 1997), alebo pôsobením hydroxylamínu (Vingerhoeds, M. H. et al. 1996) .
Proteíny HCV obsahujúce tiólové skupiny môžu byť purifikované napríklad na živiciach afinitnej chromatografie, ktoré ako imobilizovaný ligand obsahujú (1) štiepitelný spájací vešiačik obsahujúci disulfidovú väzbu (napríklad imobilizovaný 5,5'ditiobis(2-nitrobenzoová kyselina) (Jayabaskaran, C. et al. 1987) a kovalentná chromatografia na aktivovanej tiol-Sepharóze 4B (Pharmacia)), alebo (2) amínohexanoyl-4-amínofenylarsín. Druhá z afinitných matrix bola použitá na purifikáciu proteínov, ktoré sú predmetom redoxnej regulácie a ditiólových proteínov, ktoré sú cielmi pre oxidačný stres (Kalef ,E. et al. 1993).
Na zvýšenie rozpustnosti a extrakcie peptidov môže tiež byť použitá reverzibilná ochrana (Pomroy, N. C. and Deber, C. M. 1998).
Zlúčeniny na reverzibilnú ochranu a stabilizáciu tiólových skupín môžu byť v monomérnej, polymérnej forme, alebo vo forme lipozómov.
Odstránenie stavu reverzibilnej ochrany cysteínových zvyškov môže byť dosiahnuté chemicky alebo enzymaticky s pomocou reduktans, konkrétne s DTT, DTE, 2-merkaptoetanolom, ditionitom, SnCl2, bórohydridom sodným, hydroxylamínom, TCEP, a to konkrétne v koncentrácii 1 - 200 mM, výhodnejšie v koncentrácii 50 - 200 mM;
- odstránenie podmienok stabilizujúcich tiólové skupiny alebo reagens stabilizujúcich tiólové skupiny, ako je napríklad zvýšenie pH;
- enzýmov, konkrétne tioesteráz, glutaredoxínu, tioredoxínu, konkrétne v koncentrácii 0,01 - 5 μΜ, ešte konkrétnejšie v rozmedzí koncentrácií 0,1-5 μΜ;
- kombinácie vyššie opísaných chemických a/alebo enzymatických podmienok.
Odstránenie stavu reverzibilnej ochrany cysteínových zvyškov môže byť uskutočňované in vitro alebo in vivo, napríklad v bunke alebo v živom jedincovi.
Je treba zdôrazniť, že v postupe purifikácie môžu alebo nemusia byť cysteínové zvyšky ireverzibilné blokované, alebo nahradené akýmkolvek reverzibilne modifikačným agens tak, ako je opísané vyššie.
Reduktans podlá predkladaného vynálezu je akékoľvek činidlo, ktoré umožní redukciu síry v zvyškoch cysteínu, napríklad „S-S disulfidových mostíkov, desulfonáciu cysteínových zvyškov (RS-S03' -> RSH) . Antioxidantom je akékoľvek činidlo, ktoré chráni tiólový stav, alebo minimalizuje tvorbu „S-S a/alebo ich zmien. Redukcia „S-S disulfidových mostkov je chemickou reakciou, pri ktorej sú disulfidy redukované na tiólové skupiny (-SH). Činidlá, ktoré štiepia disulfidové mostíky a spôsoby tohto štiepenia sú opísané v Maertens et al. vo WO 96/04385, a sú v predkladanom opise zahrnuté formou odkazu. Redukcia „S-S môže byť dosiahnutá s (1) enzymatickou kaskádovou dráhou, alebo s (2) redukčnými zlúčeninami. Je známe, že enzýmy, ako sú tioredoxín a glutaredoxín, sú zúčastnené v redukci disulfidov in vivo, a tiež bolo preukázané, že sú účinné v redukci mostíkov „S-S in vitro. Disulfidové mostíky sú rýchle štiepené s redukovaným tioredoxínom pri pH 7,0, s rýchlosťou druhého radu, ktorá je približne 104krát vyššia, ako je zodpovedajúca rýchlostná konštanta s DTT. Kinetika redukcie môže byť dramaticky zvýšená preinkubáciou proteínového roztoku s 1 mM DTT alebo dihydrolipoamidu (Holmgren, A. 1979). Tiólovými zlúčeninami, ktoré sú schopné redukovať disulfidové mostíky, sú napríklad ditiotreitol (DTT), ditioerytritol (DTE), β-merkaptoetanol, tiokarbamáty, bis(2-merkaptoetyl)sulfón a N,N'bis(merkaptoacetyl)-hydrazín, a ditionit sodný. Tiež môžu byť na redukciu proteínov HCV použité redukčné činidlá bez tiólových skupín, ako je askorbát alebo chlorid ciničitý (SnCl2) , o ktorých bolo preukázané, že sú velmi vhodné na redukciu disulfidových mostíkov v monoklonálnych protilátkach (Thakur, M. L. et al. 1991). Okrem toho môžu zmeny v hodnotách pH ovplyvňovať redoxný stav proteínov HCV. Bolo preukázané, že pôsobenie bórohydridu sodného je účinné na redukciu disulfidových mostíkov v peptidoch (Gailit, J. 1993) . Tris (2karboxyetyl) fosfin (TCEP) je schopný redukovať disulfidy pri nízkom pH (Burns, J. et al. 1991). Selenol katalyzuje redukciu disulfidu na tióly, keď je DTT alebo bórohydrid sodný použitý ako reduktans. Selenocysteamín, komerčne dostupný diselenid, bol použitý ako prekurzor katalyzátora (Singh, R. and Kats, L. 1995).
Výraz „imunogenný sa týka schopnosti proteínu alebo látky vyvolať imunitnú odpoveď. Imunitnou odpoveďou je celková odpoveď tela na zavedenie antigénu, ktorá zahŕňa tvorbu protilátok, bunkovú imunitu, precitlivelosť (hypersensitivitu), alebo imunologickú toleranciu. Bunková imunita sa týka odpovede T-pomocných buniek a/alebo CTLodpovede.
Výraz „antigenný sa týka schopnosti proteínu alebo látky spôsobiť tvorbu protilátky alebo vyvolať bunkovú odpoveď.
Výraz epitop stimulujúci T-bunky podía predkladaného vynálezu sa týka epitopu schopného stimulovať T-bunky alebo CTL-bunky, v uvedenom poradí. Epitop stimulujúci T-pomocné bunky môže byť vybraný na základe monitorovania lymfoproliferatívnej odpovede k polypeptidom obsahujúcim vo svojej aminokyselinovej sekvencii (zdanlivý) epitop stimulujúci T-bunky. Uvedená lýmfoproliferatívna odpoveď môže byť meraná skúškou „T-helper assay, ktorá zahŕňa stimuláciu in vitro mononukleárnych buniek periférnej krvi (peripheral blood mononuclear cells, PMBCs) zo sér pacientov s rôznymi koncentráciami peptidov, ktoré sú testované na aktivitu stimulácie T-buniek, a stanovením množstva príjmu rádioaktívne označeného tymidínu. CTL-stimulujúci epitop môže byť vybraný pomocou skúšky CTL (cytotoxic T-cell assay), v ktorej sa meria lytická aktivita cytotoxických buniek s použitím uvolňovania 51Cr. Prolyferácia je hodnotená ako pozitívna, keď index stimulácie (priemer cpm kultúr stimulovaných antigénom/priemer cpm kontrolných kultúr) (cpm - impuls per minuté) je väčší ako 1, výhodne vyšší ako 2, najvýhodnejšie potom väčší ako 3.
Ďalší aspekt vynálezu sa potom týka kompozície obsahujúcej izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho fragment podľa vynálezu. Uvedená kompozícia môže ďalej obsahovať farmaceutický prijateľný nosič a môže byť liečivom alebo vakcínou.
Ďalší aspekt vynálezu zahŕňa liečivo alebo vakcínu obsahujúcu obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu.
Ešte ďalší aspekt vynálezu zahŕňa farmaceutickú kompozíciu na indukciu imunitnej odpovede špecifickej k HCV u cicavca, ktorá obsahuje účinné množstvo obalového proteínu HCV alebo jeho časti podlá vynálezu a prípadne farmaceutický prijateľné adjuvans. Farmaceutická kompozícia zahŕňajúca účinné množstvo obalového proteínu HCV alebo jeho časti podlá vynálezu môže byť tiež schopná indukovať HCV-špecifické protilátky u cicavca, alebo je schopná indukovať fukncíu Tbuniek u cicavca. Farmaceutická kompozícia zahŕňajúca účinné množstvo obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu môže byť profylaktickou kompozíciou alebo terapeutickou kompozíciou. V konkrétnom uskutočnení je uvedeným cicavcom človek.
Výraz „cicavec je treba chápať ako príslušníka triedy vyšší stavovci. Cicavci vrátane človeka sú charakterizovaní rodením živých mláďat, srsťou tela, mliečnymi žľazami samíc, ktoré sekretujú mlieko na výživu mláďat. Cicavci taktiež zahŕňajú primáty iné, ako je človek, a myši (Zauberman et al. 1999).
„Vakcínou alebo „liečivom je kompozícia schopná vyvolať ochranu proti ochorení, či už čiastočnú alebo úplnú, ako aj proti akútnemu alebo chronickému ochoreniu; v tomto prípade je vakcína alebo liečivo profylaktickou vakcínou alebo profylaktickým liečivom. Vakcína alebo liečivo môžu byť tiež vhodné na liečbu už chorých jedincov, v tomto prípade sú nazývané liečebnou vakcínou alebo liečivom. Podobne môže byť farmaceutická kompozícia použitá buď na profylaktické a/alebo terapeutické účely, v tomto prípade sa jedná o profylaktickú a/alebo terapeutickú kompozíciu, v uvedenom poradí.
Obalové proteiny HCV podľa predkladaného vynálezu môžu byť použité ako také, v biotinylovanej forme (ako je vysvetlené vo WO 93/18054) a/alebo komplexované s Neutralite Avidin (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA), avidínom alebo streptavidínom. Tiež je treba uviesť, že „vakcína alebo „liečivo môžu okrem účinnej látky obsahovať „farmaceutický prijateľný nosič alebo „farmaceutický prijateľné adjuvans, ktorým môže byť vhodný excipient, riedidlo, nosič a/alebo adjuvans, ktoré samé o sebe neindukujú tvorbu protilátok škodlivých pre jedinca, ktorému bola kompozícia podávaná, ani nevyvolávajú ochranu. Typickými vhodnými nosičmi sú typicky obrovské pomaly metabolizované makromolekuly, ako napríklad proteiny, polysacharidy, polymliečne kyseliny, polyglykólové kyseliny, poiyaminokyseliny, aminokyselinové kopolyméry a inaktívne vírusové častice. Odborníkom v odbore sú takéto nosiče veľmi dobre známe. Výhodné adjuvans na zvýšenie účinnosti kompozície zahŕňajú, bez obmedzenia: hydoxid hlinitý, alumínium v kombinácii s 3-O-deacylovaným monofosforyl lipidom A tak, ako sa opisuje vo WO 93/19780, alumínium fosfát tak, ako bol opísaný vo WO 93/24148, N65 acetyl-muramyl-L-treonyl-D-izoglutamín tak, ako bol opísaný v U.S. patente č. 4 606 918, N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-Dizoglutamín, N-acetylmuramyl-L-alanyl-izoglutamyl-L-alanín-2(ľ 2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)etylamin,
RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA), ktorý obsahuje monofosforyl lipid A, detoxifikovaný endotoxín, trehalóza-6,6-dimykolát, a skelet bunkových stien (MPL + TDM + CWS) v emulzii 2% skvalen/Tween 80. Akákoľvek z troch zložiek MPL, TDM alebo CWS môže tiež byť použitá samostatne alebo v kombinácii s druhou zložkou. MPL môže tiež byť zamenená svojim syntetickým analógom, ktorý je označovaný ako RC-529. Okrem toho môžu byť použité adjuvans, ako napríklad Stimulon (Cambridge Bíoscience, Worcester, MA, USA), SAF-1 (Syntex) alebo adjuvans na báze bakteriálnej DNA, ako je ISS (Dynavax) alebo CpG (Coley Pharmaceuticals), rovnako ako adjuvans, ktorými sú napríklad kombinácie medzi QS21 a 3-0deacetylovaným monofosforyl lipidom A (W094/00153), alebo MF59 (Chiron) , adjuvans na báze poly[di(karboxylátfenoxy)fosfazénu] (Virus Research
Inštitúte), alebo adjuvans na báze blokových polymérov, ako je Optivax (VaxcEl, Cythx), alebo adjuvans na báze inulínu, ako je Algammulín a Gammalnulín (Anutech), neúplné Freundovo adjuvans (Incomplete Freunďs Adjuvant, IFA) alebo prípravky Gerbu (Gerbu Biotechnik). Je treba uviesť, že neúplné Freundovo adjuvans (CFA) môže rovnako dobre byť použité pre aplikácie mimo človeka a na výskumné účely. „Kompozícia vakcíny môže ďalej obsahovať excipienty a riedidlá, ktoré sú vo svojej podstate netoxické a neterapeutické, akými sú napríklad voda, fyziologický roztok, glycerol, etanol, zvlhčujúce emulzifikačné látky, látky pufrujúce pH, konzervačné látky, a podobne. Typicky sú vakcíny pripravované v injektovatelnej forme buď ako kvapalné roztoky, alebo ako suspenzie. Injekcie môžu byť subkutánne, intramuskulárne, intravenózne, intraperitoneálne, intratekálne, intradermálne. Iné spôsoby podania zahŕňajú implantáciu, čapíky, orálne prehltnutie, enterickú aplikáciu, inhaláciu, aerosóly alebo nosný sprej, alebo kvapky. Tiež môžu byť pripravené pevné formy vhodné na prípravu roztokov alebo suspenzií v kvapalných nosičoch pred vlastnou injekčnou aplikáciou. Prípravok môže byť tiež emulzifikovaný alebo uzavretý do lipozómov na zvýšenie adjuvantného účinku. Polypeptidy môžu tiež byť včlenené do „Immune Stimulating Complexes spoločne so saponínmi, napríklad s Quil A (ISCOMS). Kompozície vakcín obsahujú účinné množstvo aktívnej látky, rovnako ako akúkolvek z vyššie uvedených zložiek. „Účinné množstvo aktívnej látky znamená, že podanie tohto množstva jedincovi buď v jednotlivej dávke, alebo ako súčasti radov podaní, je účinné na zabránenie alebo liečbu ochorení, alebo na vyvolanie požadovaného účinku. Toto množstvo je premenlivé v závislosti na zdraví a fyzickej kondícii jedinca, ktorý má byť ošetrený, v závislosti na taxonomickej skupine jedincov, ktorí majú byť ošetrení (napríklad človek, primáti mimo človeka, primáti atď.), v závislosti na kapacite imunitného systému jedinca na dosiahnutie imunitnej odpovede, na stupni požadovanej ochrany, na zložení vakcíny, posúdení ošetrujúceho lekára, kmeni infekčného patogénu a iných relevantných faktoroch. Predpokladá sa, že toto účinné množstvo bude spadať do relatívne širokého rozmedzia, ktoré môže byť stanovené na základe rutinných pokusov. Spravidla sa účinné množstvo mení od 0,01 do 1000 gg/dávka, konkrétnejšie od 0,1 do 100 gg/dávka. Dávkovací režim môže byť režimom jednotlivých dávok, alebo režimom opakovaných dávok. Vakcína môže byť podávaná v spojení s ďalšími imunoregulačnými agens.
Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu prípravy izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu.
Spôsob prípravy izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu zahŕňa napríklad transformáciu hostiteľskej bunky s rekombinantnou nukleovou kyselinou alebo s vektorom, ktorý obsahuje otvorený čítací rámec kódujúci uvedený obalový proteín HCV alebo jeho časť, pričom hostiteľská bunka je schopná exprimovať uvedený obalový proteín HCV alebo jeho časť. Spôsob ďalej zahŕňa kultiváciu hostitelských buniek vo vhodnom médií tak, aby bola dosiahnutá expresia uvedeného proteínu, izoláciu exprimovaného proteínu z kultúry hostitelských buniek, alebo izoláciu z vlastných hostitelských buniek. Postup izolácie môže zahŕňať jeden alebo viacej z krokov (i) lýzie hostitelských buniek za prítomnosti chaotropného agens, (ii) chemické modifikácie tiólových skupín cysteínu v izolovaných proteínoch, pričom uvedené chemické modifikácie môžu byť reverzibilné alebo ireverzibilné a (iii) heparínové afinitné chromatografie.
Príkladnými „chaotropnými činidlami sú guanídinium chlorid a močovina. Všeobecne je chaotropným agens chemická látka, ktorá môže rušiť štruktúru väzieb vodíka vo vode. V koncentrovaných roztokoch môžu tieto činidlá denaturovať proteíny, lebo znižujú hydrofobný účinok.
Výrazom „rekombinantné nukleová kyselina sa myslí nukleová kyselina prirodzeného alebo syntetického pôvodu, ktorá bola podrobená aspoň jednej úprave technikou rekombinácie DNA, ako je štiepenie reštrikčným enzýmom, PCR, ligácie, defosforylácie, fosforylácie, mutagenézie, úpravy kodónov na expresiu v heterológnej bunke atď. Všeobecne je rekombinantnou nukleovou kyselinou prirodzene sa vyskytujúci fragment nukleovej kyseliny, alebo rekombinantné nukleová kyselina obsahuje aspoň dva fragmenty nukleovej kyseliny vzájomne prepojenej, alebo sa jedná o úplne syntetickú nukleovú kyselinu.
Keď sú použité výrazy „polynukleotid, „polynukleová kyselina „sekvencia nukleovej kyseliny, „nukleotidová sekvencia, „molekula nukleovej kyseliny, „oligonukleotid, „sonda alebo „primer, týkajú sa nukleotidov, buď ribonukleotidov, deoxyribonukleotidov, alebo peptidových nukleotidov alebo zamknutých (locked) nukleotidov, alebo ich kombinácií, v polymérnej forme s akoukoľvek dĺžkou alebo tvarom (napríklad rozvetvená DNA). Uvedené termíny ďalej zahŕňajú dvojreťazcové (double-stranded, ds) a jednoreťazcové (single stranded, ss) polynukleotidy, rovnako ako trojreťazcové polynukleotidy. Tiež zahŕňajú známe modifikácie nukleotidov, ako je metylácie, cyklizácie, a vytváranie čiapok („caps) a substitúcie jedného alebo viacej prirodzene sa vyskytujúceho nukleotidu za analóg, akým je napríklad inosín, alebo modifikácie s neamplifikovatelnými monomérmi, ako je napríklad HEG (hexaetylén glykol). Ribonukleotidy sú označované ako NTPs, deoxyribonukleotídy ako dNTPs a dideoxyribonukleotidy ako ddNTPs.
Nukleotidy môžu byť všeobecne označené rádioaktívne, chemiluminiscenčne, fluorescenčné, fosforescenčne alebo s infračervenými farbivami, alebo s povrchom-zosilnenou Ramanovou značkou alebo plazmonovou rezonančnou časticou (plasmon resonant particle, PRP).
Uvedené termíny „polynukleotid, „polynukleová kyselina „sekvencia nukleovej kyseliny, nukleotidová sekvencia, „molekula nukleovej kyseliny, „oligonukleotid, „sonda alebo „primér tiež zahŕňajú peptidové nukleové kyseliny (peptide nucleic acids, PNAs), DNA analógy, v ktorých je chrbticou pseudopeptid, pozostávajúci skôr z N-(2-amínoetyl)-glycínových jednotiek ako z cukru. PNAs napodobňujú chovanie DNA a viažu komplementárne reťazce nukleových kyselín. Neutrálna chrbtica PNA vedie k silnejšej väzbe a k väčšej špecifičnosti, ako aká je bežne dosahovaná. Okrem toho boli jedinečné chemické, fyzikálne a biologické vlastnosti PNA využité na prípravu silných biomolekulárnych prostriedkov, antisenzie a antigenných agens, molekulárnych sónd a biosensorov. PNA sondy môžu všeobecne byť kratšie ako sondy DNA a všeobecne majú dĺžku od 6 do 20 báz, výhodnejšie potom od 12 do 18 báz (Nielsen, P. E. 2001). Uvedené termíny ďalej zahŕňajú zamknuté nukleové kyseliny (locked nucleic acids ,LNAs), ktorými sú deriváty RNA, v ktorých je ribózový kruh fixovaný metylénovou väzbou medzi 2'-kyslíkom a 4'-uhlíkom. LNAs vykazujú mimoriadnu väzbovú afinitu k cielovým sekvenciám DNA alebo RNA. Nukleotidy LNA môžu byť oligomerizované a môžu byť včlenené do chimérických alebo zmiešane-chimerických molekúl LNA/DNA alebo LNA/RNA. Javí sa, že LNAs nie sú toxické pre kultivované bunky (Orum, H. and Wengel, J. 2001, Wahlestedt, C. et al. 2000). Všeobecne sú myslené chiméry alebo zmiešané70 chiméry ktorýchkoľvek DNA, RNA, PNA a LNA, rovnako ako akékoľvek z nich, v ktorých je tymín zamenený uracilom.
Z vyššie uvedeného je zrejmé, že predkladaný vynález sa tiež týka použitia obalových proteínov HCV glykosylovaných s jadrom glykosylácie, alebo kompozícií podľa vynálezu na prípravu kompozície vakcíny proti HCV. Konkrétne sa predkladaný vynález týka použitia obalového proteínu HCV glykosylovaného s jadrom glykosylácie podľa vynálezu na indukciu imunity proti HCV u chronických prenášačov HCV. Konkrétnejšie sa predkladaný vynález týka použitia obalových proteínov HCV glykosylovaných s jadrom glykosylácie tak, ako tu boli definované, na indukciu imunity proti HCV u chronických prenášačov HCV, a to pred, simultánne alebo po akejkoľvek inej terapii, akou je napríklad velmi dobre známa liečba s interferónom v kombinácii alebo bez kombinácie s podávaním malých zlúčenín na liečbu HCV, akou je napríklad ribavirín. Takéto kompozície môžu byť použité pred a alebo po transplantácii pečene, alebo po predpokladanej infekcii, ako je napríklad infekcia ihlou injekčnej striekačky.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka spôsobu detekcie prítomnosti anti-HCV protilátok vo vzorke, o ktorej sa predpokladá, že tieto anti-HCV protilátky obsahuje, pričom uvedený spôsob zahŕňa:
(i) kontaktovanie obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu s uvedenou vzorkou za podmienok, ktoré umožňujú komplexáciu obalového proteínu HVC alebo jeho časti s anti-HCV protilátkami, (ii) detekciu komplexu vytvoreného v bode (i), a (iii) dedukciu na základe výsledku podlá (ii) prítomnosti uvedených anti-HCV protilátok vo vzorke.
V konkrétnom uskutočnení sa kontaktovanie v kroku (i) uvedeného postupu uskutočňuje za kompetitívnych podmienok. V inom špecifickom uskutočnení uvedeného spôsobu je obalový proteín HCV alebo jeho časť pripojená na pevný nosič. V ďalšom uskutočnení je uvedenou vzorkou, o ktorej sa predpokladá, že obsahuje anti-HCV protilátky, biologickú vzorku.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka diagnostickej súpravy (kitu) na detekciu prítomnosti anti-HCV protilátok vo vzorke, o ktorej sa predpokladá, že obsahuje anti-HCV protilátky, pričom uvedený kit obsahuje obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa vynálezu. V konkrétnom uskutočnení je obalový proteín HCV alebo jeho časť pripojený na pevný nosič. V inom uskutočnení je vzorka, o ktorej sa predpokladá, že obsahuje anti-HCV protilátky, biologickou vzorkou.
Výraz „biologická vzorka, tak ako je tu používaný, sa týka vzorky tkaniva alebo tekutiny izolovanej z jedinca, ktorý je vybraný, bez obmedzenia, napríklad zo séra, plazmy, lymfatickej tekutiny, externých častí kože, respiračných, črevných alebo genitálne-urinálnych traktov, oocytov, sĺz, slín, mlieka, krvných buniek, nádorov, orgánov, sekrétov žalúdka, slizu, miechového moku, externých výlučkov, akými sú napríklad exkrementy, moč, spermie, a podobne.
Obalové proteíny HCV podlá predkladaného vynálezu, alebo ich časti, sú obzvlášť vhodné na použitie v metodách, ktorými sú imunoskúšky na detekciu HCV, a/alebo genotypizácie HCV na prognózu/monitorovanie ochorení spôsobených HCV, alebo ako terapeutické látky.
V postupoch, akými sú imunoskúšky podlá predkladaného vynálezu, sú používané obalové proteíny HCV podlá vynálezu, ktoré majú lineárne (v prípade peptidov) a konformačné epitopy, ktoré sú rozpoznávané protilátkami v séroch jedincov, infikovaných s HCV. Antigény HCV El a E2 podľa prekladaného vynálezu môžu byť fakticky použité v akejkoľvek skúške, ktorá používa známy antigén na detekciu protilátok. Samozrejme, forma, v ktorom je HCV konformačný epitop denaturovaný, nie je použiteľná, alebo je treba ju prispôsobiť. Všeobecným znakom všetkých týchto skúšok je, že antigén je kontaktovaný so zložkou tela, o ktorej sa predpokladá, že obsahuje HCV protilátky, za podmienok, ktoré umožňujú väzbu antigénu na akúkoľvek takúto protilátku, prítomnú v zložke. Takými podmienkami sú typicky fyziologická teplota, pH a iónová sila s použitím nadbytku antigénu. Inkubácia antigénu so vzorkou je nasledovaná detekciou imunitných komplexov, ktoré obsahujú antigén.
Spôsob uskutočnenia imunoskúšok je predmetom mnohých spôsobov obmien, a rad uskutočnení je v odbore známy. Postupy môžu napríklad používať pevné nosiče, alebo imunoprecipitáciu. Väčšina postupov používa označené protilátky alebo označený poplypeptid; ako značky môžu byť napríklad použié enzymatické, fluorescenčné, chemiluminiscenčné a rádioaktívne molekuly, alebo molekuly farbív. Tiež sú známe skúšky, v ktorých je zosilňovaný signál imunitného komplexu; príklady takých skúšok sú testy, v ktorých je použitý avidín alebo streptavidín, a imunoskúšky s enzymatickým označením a sprostredkovaním, akými sú skúšky ELISA a RIA.
Imunoskúška môže byť, bez obmedzenia, uskutočňovaná v heterogénnom alebo homogénnom a v štandardnom alebo kompetitívnom usporiadaní. V heterogénnom uskutočnení je polypeptid bežne naviazaný na pevnú matrix alebo nosič tak, aby po inkubácii bola zjednodušená separácia vzorky od polypeptidu. Príklady pevných nosičov, ktoré môžu byť použité, sú nitrocelulóza (napríklad nanesená na membránu alebo na jamky mikrotitračných doštičiek), polyvinylchlorid (napríklad v podobe fólií alebo na jamkách mikrotitračných doštičiek), polystyrénový latex (napríklad v perličkách alebo na mikrotitračných doštičkách), polyvinylidinfluorid (známy ako Immunolon™) , diazotizovaný papier, nylonové membrány, aktivované guličky a guličky s naviazaným Proteínom A. Tak napríklad, v heterogénnom uskutočnení môžu byť použité mikrotitračné doštičky Dynatech Immunolon™ 1 alebo Immunlon™ 2. Pevný nosič, obsahujúci antigenne polypeptidy, je bežne po oddelení od testovanej vzorky premytý pred detekciou naviazaných protilátok. Ako štandardné, tak kompetitívne uskutočnenie skúšky je v odbore dobre známe.
V homogénnom uskutočnení je testovaná vzorka inkubované s kombináciou antigénov v roztoku. Tak napríklad, je možné uskutočnenie za podmienok, pri ktorých dochádza na precipitáciu ktorýchkoľvek vytváraných komplexov antigénprotilátka. Ako štandardné, tak kompetitívne uskutočnenia týchto skúšok sú v odbore známe.
V štandardnom uskutočnení je v komplexoch protilátkaantigén priamo monitorované množstvo protilátok, ktorými sú napríklad anti-HCV protilátky. Toto môže byť uskutočnené stanovením, či sa označené anti-xenogenne (napríklad protiludské) protilátky, ktoré rozpoznávajú epitop k uvedeným protilátkam, to je predmetnej anti-HCV protilátky, budú viazať vďaka tvorbe komplexu. V kompetitívnom uskutočnení je vo vzorke množstvo protilátok, akými sú anti-HCV protilátky, stanovené monitorovaním kompetičného účinku na väzbu známeho množstva (označenej) protilátky (alebo iného súťažiaceho ligandu), alebo antigénu v komplexu.
Komplexy antigen-protilátka môžu byť detegované akýmkoľvek z radu metód známych v odbore, v závislosti na spôsobe uskutočnenia. Tak napríklad, neoznačené protilátky, ako sú napríklad anti-HCV protilátky v komplexe, môžu byť detegované s použitím konjugátu anti-xenogennej lg komplexovanom sa značkou (napríklad enzymatickou značkou).
j
V uskutočnení skúšky ako imunoprecipitačnej alebo aglutinačnej vytvára reakcia medzi antigénom a protilátkou proteínový zhluk (cluster), ktorý precipituje v roztoku alebo v suspenzii a tvorí viditelnú vrstvu alebo film precipitátu. Keď v testovanej vzorke žiadna protilátka nie je prítomná, žiadny taký precipitát sa nevytvára.
Obalové proteíny HCV alebo ich špecifické časti podlá vynálezu obsahujúce konformačné epitopy sú bežne balené do súpravy na použitie v týchto imunoskúškach. Súprava normálne obsahuje v oddelených nádobkách prirodzený antigén HCV, preparáty kontrolných protilátok (pozitívnych a/alebo negatívnych), označenú protilátku, keď uskutočnenie skúšky vyžaduje zhodné a signál vytvárajúce reagencie (napríklad enzýmový substrát), pokial značka negeneruje signál priamo. Prirodzený antigén HCV môže už byť naviazaný na pevný nosič, alebo je od látok vytvárajúcich väzbu k nosiču oddelený. Spravidla sú inštrukcie na uskutočnenie skúšky (napríklad v písomnej forme, alebo ako záznam na páske, CD-ROMu atď.) v súprave priložené.
Vybraná pevná fáza môže zahŕňať polymérne alebo sklenené guličky, nitrocelulózu, mikročastice, mikrojamky reakčné doštičky, testovacie skúmavky a magnetické guličky. Zlúčenina vytvárajúca signál môže byť vybraná zo skupiny zahŕňajúcej enzým, luminiscenčnú zlúčeninu, chromogén, rádioaktívny prvok a chemiluminiscenčnú zlúčeninu. Príklady enzýmov zahŕňajú alkalickú fosfatázu, chreňovú peroxidázu, a beta galaktosidázu. Príklady zosilňujúcich zlúčenín zahŕňajú biotín, anti-biotin a avidín. Príklady látok viažúcich zosilňujúce zlúčeniny zahŕňajú biotín, anti-biotín a avidín. Na blokovanie účinkov látok podobných reumatoidnému faktoru, je testovaná vzorka podrobená podmienkam, ktoré sú dostatočné na blokovanie účinku látok podobných reumatoidnému faktoru. Tieto podmienky zahŕňajú kontaktovanie testovanej vzorky s množstvom anti-ľudského IgG za vytvárania zmesi, a inkubáciu zmesi počas a za podmienok, ktoré sú dostatočné na vytvorenie produktu reakčnej zmesi, ktorý je v podstate bez látok podobných reumatoidnému faktoru.
Konkrétne sa predkladaný vynález týka obalového proteínu HCV alebo jeho časti podía vynálezu na prípravu diagnostickej súpravy (kitu)·
Vzhľadom na to, že obalové proteíny HCV glykosylované s jadrom glykosylácie podľa predkladaného vynálezu sú vysoko imunogenne a stimulujú ako humorálnu, tak bunkovú odpoveď, týka sa predkladaný vynález tiež súpravy na detekciu Tbunkovej odpovede na HCV, pričom súprava obsahuje oligomerné častice alebo purifikovaný jednotlivý obalový proteín HCV podľa predmetného vynálezu. T-bunková odpoveď na HCV môže napríklad byť meraná tak, ako je opísané v Leroux-Roels et al. vo W095/12677.
Podľa ďalšieho aspektu sa vynález týka spôsobu indukcie HCV-špecifickej imunitnej odpovede u cicavca, kde uvedená metóda zahŕňa podanie účinného množstva obalového Proteínu HCV alebo jeho časti podlá vynálezu cicavcovi, prípadne s obsahom farmaceutický prijatelného adjuvans. Uvedená metóda zahŕňajúca podanie účinného množstva obalového Proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu cicavcovi môže byť tiež použitá na indukciu HCV-špecifických protilátok u cicavca, alebo na indukciu špecifických T-bunkových funkcií u cicavca. V uvedených spôsoboch môže byť podanie určené na profylaktické účely, napríklad ako profylaktické podanie, alebo na terapeutické účely, napríklad ako terapeutické podanie.
Ďalší aspekt vynálezu sa týka spôsobu imunizácie cicavca, ktorý zahŕňa podanie účinného množstva obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa vynálezu cicavcovi, prípadne s obsahom farmaceutický prijateľného adjuvans.
Predmetný vynález sa tiež týka spôsobu liečby cicavca infikovaného s HCV, kde uvedený spôsob zahŕňa podanie účinného množstva obalového proteínu HCV vynálezu cicavcovi, prípadne prijateľného adjuvans.
alebo jeho časti podľa s obsahom farmaceutický
Akýkoľvek z vyššie opísaných aspektov vynálezu, alebo z jeho uskutočnení špecifických pre uvedené aspekty, je tiež aplikovateľný všeobecne na predmetné proteíny, ktoré sú produktami expresie v eukaryontných bunkách, a ktoré sú ďalej charakterizované zhodnými glykosylačnými vlastnosťami, aké boli vyššie opísané pre dva odlišné obalové proteíny HCV.
Konkrétnejšie sa vynález tak týka izolovaného proteínu, ktorý je predmetom záujmu, alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje aspoň jedno N-glykosylačné miesto, pričom uvedený proteín alebo jeho fragment je charakterizovaný tým, že je produktom expresie v eukaryontnej bunke, a ďalej je charakterizovaný tým, že v priemere až 50 %, 51 %, 52 %, 53 %, 54 %, 55 %, 56 %, 57 %, 58 %, 59 %, 60 %, 61 %, 62 %, 63 %, 64 %, 65 %, 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %,74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, alebo 80 % N-glykosylovaných miest je glykosylovaných s glykosylačným jadrom. Ešte
konkrétnej šie, viac ako 60 o t 61 %, 62 O. 0 z 63 O z 64 %, 65 O 66
%, 67 %, 68 %, 69 g, *0 / 70 %, 71 %, 72 %, 73 O 'o , 74 %, 75 O, 0 z 76 o, !
77 %, 78 %, 79 O 0 z 80 o *0 t 81 82 %, 83 O. ° z 84 %, 85 %, 86 o, θ t 87
3- Q Q 2- Q Q 2- ΐ , OO *5 , O 'S , 90 a, o , 91 O, , 92 %, 93 O, O z 94 c, o alebo 95 o, *o N-
glykosylovaných miest je glykosylovaných s oligomanózou so štruktúrou definovanou ako Man(8 až 10)-GlcNAc(2). Konkrétnejšie, vedia akejkoľvek z vyššie uvedených Nglykosylačných charakteristík platí, že pomer počtu miest glykosylovaných s glykosylačným jadrom s oligomanózou so štruktúrou Man(7)-GlcNAc(2) k počtu miest glykosylovaných s jadrom glykosylácie s oligomanózou so štruktúrou Man(8)GlcNAc(2) je menší ako alebo sa rovná 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, alebo 0,50. Okrem toho ďalšou špecifickejšou charakteristikou, vedia akejkoľvek z vyššie uvedených charakteristík je, že uvedené oligomanózy obsahujú menej ako 20 %, 19 %, 18 %,17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, alebo 5 % terminálnej a 1,3 manózy.
Ďalší alternatívny aspekt vynálezu sa týka izolovaného proteínu záujmu alebo jeho fragmentu, ktorý obsahuje aspoň jedno N-glykosylačné miesto, pričom uvedený proteín alebo jeho fragment je charakterizovaný tým, že je produktom expresie v eukaryontnej bunke a ďalej tým, že N-glykosylačné miesta sú obsadené oligomanózami, pričom pomer oligomanóz so štruktúrou Man(7)-GlcNAc(2) k oligomanózám so štruktúrou Man(8)-GlcNAc(2) je menší alebo sa rovná 0,15, 0,2, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,44, 0,45, alebo 0,50. Ďalšou špecifickejšou charakteristikou vedia vyššie uvedených N-glykosylačných charakteristík je, že uvedené oligomanózy obsahujú menej ako 20 %, 19 %, 18 %,17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, alebo 5 % terminálnej a 1,3 manózy.
Konkrétne je uvedený izolovaný proteín záujmu alebo jeho fragment produktom expresie v bunke kvasnice, akou je napríklad bunka Hansenula. Takým izolovaným proteínom záujmu alebo jeho fragmentom môže byť napríklad vírusový obalový proteín alebo jeho fragment, akým je obalový proteín HCV alebo obalový proteín HBV (hepatitis B) , alebo jeho fragmenty. Ďalšie príkladné obalové proteíny vírusov zahŕňajú obalový proteín HIV (human immunodeficiency virus) gpl20 a vírusové obalové proteíny vírusov, ktoré patria k rodu Flavirideae.
Všeobecne, uvedeným izolovaným proteínom záujmu alebo jeho fragmentárni môže byť ktorýkoľvek proteín, ktorý má Nglykosylačné charakteristiky podľa predkladaného vynálezu.
Výrazom „HCV-rekombinantný vaccinia vírus sa má na mysli vírus vaccinia obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu proteín HCV alebo jeho časť.
Termíny „častica podobná vírusu HCV tvorená z obalového proteínu HCV a „oligomerné častice tvorené obalovými proteínmi HCV sú tu definované ako štruktúry so špecifickou podstatou a tvarom, obsahujúce niekoľko základných jednotiek obalových proteínov HCV El a/alebo E2, o ktorých sa predpokladá, že nezávisle pozostávajú z jedného alebo dvoch El a/alebo E2 monomérov, v uvedenom poradí. Je treba uviesť, že častice podľa predkladaného vynálezu sú definované tak, že neobsahujú infekčné HCV RNA genómy. Časticami podľa predkladaného vynálezu môžu byť častice vyššieho radu sférickej povahy, ktoré môžu byť prázdne, pozostávajúce z proteínov vonkajšieho obalu, v ktorom môžu byť uzavrené lipidy, detergenty, jadrový proteín HCV, alebo molekuly adjuvans. Tieto častice môžu byť opuzdrené s lipozómami alebo apolipoproteínmi, akými sú napríklad apolipoproteín B alebo lipoproteíny s nízkou hustotou, alebo s akýmikoľvek prostriedkami, ktoré zacielujú uvedené častice k špecifickému orgánu alebo tkanive. V tomto prípade sú takéto prázdne sférické častice často nazývané ako „častice podobné vírusu (virus-like particles, VLPs). V inom uskutočnení môžu časticami vyššieho radu mať pevnú sférickú štruktúru, v ktorých sa úplný obal skladá z oligomérov obalových proteínov HCV El alebo E2 oligomérov, do ktorých môžu byť dodatočne vnesené lipidy, detergenty, jadrový proteín HCV, alebo molekuly adjuvans, alebo ktoré naopak samé o sebe môžu byť zapuzdrené v lipozómoch alebo apolipoproteínoch, akými sú napríklad apolipoproteín B, lipoproteíny s nízkou hustotou, alebo v ktorýchkoľvek prostriedkoch, ktoré zacieľujú uvedené častice k špecifickému orgánu alebo tkanive, napríklad asialoglykoproteíny. Častice môžu tiež pozostávať z menších štruktúr (v porovnaní s prázdnými alebo pevnými sférickými štruktúrami opísanými vyššie), ktoré majú zaoblený tvar (pozri ďalej) a spravidla neobsahujú viac ako jednu vrstvu obalových proteinov HCV. Typickým príkladom menšej častice sú štruktúry podobné rozetám, ktoré sú tvorené menším počtom obalových proteinov HCV, obvykle medzi 4 a 16. Špecifický príklad takejto častice zahŕňa menšie častice získané z proteinov EI (Els) v 0,2% CHAPS tak, ako je tu doložené príkladom, ktoré zjavne obsahujú 8 až 10 monomérov Els. Takéto rozetám podobné štruktúry sú obvykle organizované v rovine a majú zaoblený tvar, napríklad vo forme kolesa. Opätovne môžu byť lipidy, detergenty, jadrový proteín HCV, alebo molekuly adjuvans dodatečne inkorporované do takýchto častíc, alebo môžu byť menšie častice opuzdrené v lipozómoch alebo s apolipoproteínmi, akými sú napríklad apolipoproteín B alebo lipoproteíny s nízkou hustotou, alebo v ktorýchkoľvek prostriedkoch, ktoré zacieľujú uvedené častice k špecifickému orgánu alebo tkanive. Menšie častice môžu tiež vytvárať malé sférické alebo globulárne štruktúry pozostávajúce z podobne menšieho počtu obalových proteinov HCV EI alebo E2, v ktorých môžu byť dodatočne uzavrené lipidy, detergenty, jadrový proteín HCV, alebo molekuly adjuvans, alebo ktoré naopak môžu byť opuzdrené v lipozómoch alebo s apolipoproteínmi, akými sú napríklad apolipoproteín B alebo lipoproteíny s nízkou hustotou, alebo v ktorýchkolvek prostriedkoch, ktoré zacielujú uvedené častice k špecifickému orgánu alebo tkanive. Velkosť (to je Priemer) vyššie definovaných častíc, meraná v odbore dobre známou technikou dynamického rozptylu svetla (dynamic light scattering), (pozri ďalej v časti Príklady uskutočnenia) je spravidla medzi 1 až 100 nm, výhodnejšie medzi 2 až 70 nm, najvýhodnejšie medzi 2 a 40 nm, medzi 3 až 20 nm, medzi 5 až 16 nm, medzi 7 až 14 nm alebo medzi 8 až 12 nm.
Predkladaný vynález sa konkrétne ďalej týka spôsobu purifikácie obalových proteínov vírusu hepatitídy C (HCV) glykosylovaných s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek ich časti, ktoré sú vhodné na použitie v imunoskúške alebo vo vakcíne, pričom tento spôsob zahŕňa:
(i) pestovanie glykosylačne negatívnych kmeňov Hansenula alebo Saccharomyces transformovaných s génom kódujúcim obalový proteín HCV El a/alebo HCV E2, alebo akúkoľvek jeho časť, vo vhodnom kultivačnom médii;
(ii) vyvolanie expresie uvedeného génu pre HCV El a/alebo HCV E2, alebo jeho časť; a (iii) purifikáciu uvedeného proteínu HCV El a/alebo HCV E2 glykosylovaného s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek jeho časti z uvedenej bunkovej kultúry.
Vynález sa ďalej týka spôsobu purifikácie obalových proteínov vírusu hepatitídy C (HCV) glykosylovaných s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek ich časti, ktoré sú vhodné na použitie v imunoskúške alebo vo vakcíne, pričom tento spôsob zahŕňa:
(i) pestovanie glykosylačne negatívnych kmeňov Hansenula alebo Saccharomyces transformovaných s génom kódujúcim obalový proteín HCV E1 a/alebo HCV E2, alebo akúkoľvek jeho časť, vo vhodnom kultivačnom médii;
(ii) vyvolanie expresie uvedeného génu pre HCV E1 a/alebo HCV E2, alebo ich časť; a (iii) purifikáciu uvedeného intracelulárne exprimovaného proteínu HCV E1 a/alebo HCV E2 glykosylovaného s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek jeho časti, po lýzii transformovanej hostiteľskej bunky.
Vynález sa ďalej týka spôsobu purifikácie obalových proteínov vírusu hepatitídy C (HCV) glykosylovaných s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek ich časti, ktoré sú vhodné na použitie v imunoskúške alebo vo vakcíne, pričom tento spôsob zahŕňa:
(i) pestovanie glykosylačne negatívnych kmeňov Hansenula alebo Saccharomyces transformovaných s génom kódujúcim obalový proteín HCV E1 a/alebo HCV E2, alebo akúkoľvek jeho časť, vo vhodnom kultivačnom médii, kde uvedený proteín HCV E1 a/alebo HCV E2, alebo akákolvek jeho časť, obsahuje aspoň dve aminokyseliny Cys;
(ii) vyvolanie expresie uvedeného génu pre HCV E1 a/alebo HCV E2, alebo ich časť; a (iii) purifikáciu uvedeného proteínu HCV E1 a/alebo
HCV E2 glykosylovaného s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek jeho časti, z kultúry, pričom uvedené aminokyseliny Cys sú reverzibilne chránené chemickými a/alebo enzymatickými prostriedkami.
Vynález sa ďalej týka spôsobu purifikácie obalových proteínov vírusu hepatitídy C (HCV) glykosylovaných s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek ich časti, ktoré sú vhodné na použitie v imunoskúške alebo vo vakcíne, pričom tento spôsob zahŕňa:
(i) pestovanie glykosylačne negatívnych kmeňov Hansenula alebo Saccharomyces transformovaných s génom kódujúcim obalový proteín HCV El a/alebo HCV E2, alebo akúkoľvek jeho časť, vo vhodnom kultivačnom médií, kde uvedený proteín HCV El a/alebo HCV E2, alebo akákoľvek jeho časť, obsahuje aspoň dve aminokyseliny Cys;
(ii) vyvolanie expresie uvedeného génu pre HCV El a/alebo HCV E2, alebo ich časť; a (iii) purifikácíu uvedeného intracelulárne exprimovaného proteinu HCV El a/alebo HCV E2 glykosylovaného s jadrom glykosylácie, alebo akejkoľvek jeho časti, po lýzii transformovanej hostiteľskej bunky, pričom uvedené aminokyseliny Cys sú reverzibilne chránené chemickými a/alebo enzymatickými prostriedkami.
Predkladaný vynález sa špecificky týka spôsobu purifikácie rekombinantných proteínov HCV z kvasníc, alebo ktorýchkoľvek ich častí, tak, ako sú tu opísané, v ktorom uvedená purifikácia zahŕňa použitie afinitnej chromatografii s heparínom.
Rovnako tak sa predkladaný vynález špecificky týka spôsobu purifikácie rekombinantných proteinov HCV z kvasníc, alebo ktorýchkoľvek ich častí, tak, ako sú tu opísané, v ktorom je chemickým prostriedkom sulfonácia.
Rovnako tak sa predkladaný vynález špecificky týka spôsobu purifikácie rekombinantných proteinov HCV z kvasníc, alebo ktorýchkolvek ich častí, tak, ako sú tu opísané, v ktorom reverzibilná ochrana aminokyselín Cys je zamenená za ireverzibilnú ochranu chemickými a/alebo enzymatickými prostriedkami.
Rovnako tak sa predkladaný vynález špecificky týka spôsobu purifikácie rekombinantných proteinov HCV z kvasníc, alebo ktorýchkoľvek ich častí, tak, ako sú tu opísané, v ktorom ireverzibilná ochrana chemickými prostriedkami je uskutočnená s jódacetamidom.
Rovnako tak sa predkladaný vynález špecificky týka spôsobu purifikácie rekombinantných proteinov HCV z kvasníc, alebo ktorýchkoľvek ich častí, tak, ako sú tu opísané, v ktorom ireverzibilná ochrana chemickými prostriedkami je uskutočnená s NEM alebo Biotín-NEM, alebo s ich zmesou.
Predkladaný vynález sa tiež týka kompozície tak, ako bola definovaná vyššie, ktorá tiež obsahuje jadrový proteín HCV, El, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/alebo NS5B proteín, alebo jeho časti. Proteíny El, E2, a/alebo E1/E2 glykosylované s jadrom glykosylácie podlá predkladaného vynálezu môžu byť napríklad kombinované s inými antigénmi HCV, akými sú napríklad jadrový proteín, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A a/alebo
NS5B proteín. Purifikácia týchto proteínov NS3 výhodne zahŕňa reverzibilné modifikácie zvyškov cysteínu, a ešte výhodnejšie sulfonáciu cysteínu. Spôsoby, ako dosiahnuť takýchto reverzibilných modifikácií, boli pre proteíny NS3 opísané v Maertens et al. (PCT/EP99/02547) . Je treba zdôrazniť, že celý obsah vrátane všetkých definícií, uvedených v tomto dokumente, je v predkladanej prihláške vynálezu zahrnutý formou odkazu.
Predkladaný vynález sa tiež týka použitia obalového proteínu glykosylovaného s jadrom glykosylácie tak, ako tu bol opísaný, na indukciu imunity proti HCV, ktorá sa vyznačuje tým, že obalový proteín glykosylovaný s jadrom glykosylácie je použitý ako súčasť podania zlúčenín v časovom slede. V tomto zmysle je treba výraz „podanie zlúčenín v časovom slede chápať ako podanie zlúčenín jedincovi v časových intervaloch, ktoré vyvoláva imunitná odpoveď. Tieto zlúčeniny môžu zahŕňať ktorýkoľvek z nasledujúcich komponentov: obalový proteín glykosylovaný s jadrom glykosylácie, kompozíciu vakcíny obsahujúcej DNA HCV, polypeptidy HCV. V tomto zmysle časový sled zhrňuje podanie buď:
(i) antigénu HCV, akým je napríklad obalový proteín glykosylovaný s jadrom glykosylácie v časových intervaloch, alebo (ii) antigénu HCV, akým je napríklad obalový proteín glykosylovaný s jadrom glykosylácie, v kombinácii s kompozíciou vakcíny obsahujúcou HCV DNA, kde oligomerné častice uvedeného proteínu glykosylovaného s jadrom glykosylácie a uvedená kompozícia vakcíny s DNA HCV môžu byť podávané simultánne, alebo v rôznych časových intervaloch, vrátane meniacich sa časových intervalov, alebo (iii) Podľa bodu (i) alebo (ii), prípadne v kombinácii s ďalšími peptidmi HCV v časových intervaloch.
V tomto zmysle je treba uviesť, že kompozícia vakcíny obsahujúcej DNA HCV obsahuje nukleové kyseliny kódujúce obalový peptid HCV, zahŕňajúci E1-, E2-, E1/E2-peptidy, NS3 peptid, iné peptidy HCV, alebo časti uvedených peptidov. Okrem toho je treba chápať, že uvedené peptidy HCV zahŕňajú obalové peptidy HCV, vrátane E1-, E2-, El/E2-peptidov, NS3 peptidu, iné peptidy HCV, alebo časti uvedených peptidov. Výraz „iné peptidy HCV sa týka akéhokoľvek peptidu HCV alebo jeho fragmentu. V bode (ii) vyššie uvedeného postupu obsahuje kompozícia vakcíny s DNA HCV výhodne nukleové kyseliny kódujúce obalové peptidy HCV. Podľa bodu (ii) vyššie uvedeného postupu pozostáva kompozícia vakcíny s DNA HCV ešte výhodnejšie z nukleových kyselín kódujúcich obalové peptidy HCV, prípadne v kombinácii s kompozíciou vakcíny obsahujúcou HCV-NS3 DNA. V tomto zmysle je treba uviesť, že kompozícia vakcíny s DNA HCV obsahuje plazmidový vektor zahŕňajúci polynukleotidovú sekvenciu kódujúcu peptid HCV tak, ako bol opísaný vyššie, operabilne spojenú s regulačnými prvkami transkripcie. Tu používaný výraz „plazmidový vektor sa týka molekuly nukleovej kyseliny schopnej prenášať inú nukleovú kyselinu, ku ktorej je táto pripojená. Výhodnými vektormi sú tie, ktoré sú schopné autonómnej replikácie a/alebo expresie nukleových kyselín, ku ktorým sú pripojené. Bez akéhokoľvek obmedzenia je možné všeobecne uviesť, že plazmidovými vektormi sú cirkulárne dvojreťazcové slučky DNA, ktoré vo forme vektora nie sú pripojené k chromozómu. Tak ako je tu použitý, znamená výraz „polynukleotidová sekvencia polynukleotidy, akými sú napríklad deoxyribonukleová kyselina (DNA), a tam, kde je to vhodné, tiež ribonukleovú kyselinu (RNA). Tento výraz by mal byť tiež chápaný tak, že zahŕňa analógy buď RNA, alebo DNA, ako ekvivalenty, ktoré boli pripravené z analógov nukleotidov, a jednoreťazcové (sense alebo antisense) a dvojreťazcové polynukleotidy. Tak, ako je tu výraz „regulačné prvky transkripcie použitý, týka sa nukleotidovej sekvencie, ktorá obsahuje základné regulačné prvky, a to také, ktoré po zavedení do živej bunky stavovcov sú schopné riadiť bunkový aparát na produkciu translačných produktov kódovaných polynukleotidom. Výraz „operabilne pripojený sa týka juxtapozície v ktorej sú zložky konfigurované tak, že umožňujú svoju bežnú funkciu. Preto sú regulačnými prvkami transkripcie operabilne pripojené nukleotidové sekvencie, schopné uskutočňovať expresiu uvedenej nukleotidovej sekvencie. Pre odborníka v odbore je na úspešné uskutočnenie celkom zrejmé použitie rôznych transkripčných promotorov, terminátorov, vektorov alebo špecifických génových sekvencií.
Alternatívne môže byť DNA vakcína podaná prostredníctvom živého vektora, akým je napríklad adenovírus, vírus kiahní kanárov (canary pox vírus), MVA, a podobne.
Predkladaný vynález je ilustrovaný Príkladmi uskutočnenia tak, ako sú uvedené nižšie. Príklady sú len ilustratívne a nie sú žiadnym spôsobom zamýšľané ako obmedzujúce pre rozsah vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
PRÍKLAD 1
KONŠTRUKCIA KYVADLOVÉHO VEKTORA pFPMT-MFOt-El-H6
Plazmidy na transformáciu Hansenula polymorpha boli skonštruované nasledujúcim spôsobom. Kyvadlový vektor pFPMTMFa-El-Ηβ bol skonštruovaný vo viacstupňovom postupe. Najprv bola sekvencia nukleovej kyseliny kódujúca proteín HCV Els (SEQ ID NO: 2) klonovaná za vedúcu sekvenciu CHH (CHH = Carcinus maenas hyperglykemický hormón), ktorá bola nasledovne zamenená za vedúcu sekvenciu MFa (MFa = Saccharomyces cerevisiae a-mating (párovací) faktor).
Najprv bol skonštruovaný derivát pUC18, nesúci jednotku CHH-E1-H6 ako EcoRl/BamHI fragment, s neprerušovanou metódou klonovania (Padgett, K. A. and Sorge, J. A. 1996). Navyše boli fragment DNA kódujúci Els-H6 a od pCHH-Hir odvodený akceptorový plazmid pripravené s PCR tak, ako je opísané nižšie.
Príprava fragmentu DNA kódujúceho Els-H6.
Fragment DNA E1-H6 (kódujúci proteín HCV typu lb Els pozostávajúci z aminokyselín Els 192 až 326, predĺžený o 6 zvyškov His; SEQ ID NO: 5) bol izolovaný s PCR z plazmidu pGEMTElsH6 (SEQ ID NO: 6; Obrázok 1). K tomu boli použité nasledujúce priméry :
- CHHE1-F:5'-agttactcttca.aggtatgaggtgcgcaacgtgtccg-3' (SEQ ID NO: 7) ;
Miesto Eamll04I štiepenia. Hrubo priméru CHH-línks vo vnútri oblasti
- CHHE1-R:
je podtrhnuté, bodka označuje miesto vytlačené bázy sú komplementárne k bázam Neoznačené bázy sa pripájajú v sense smere štart El (192-326); a ' -gttactcttca. cagggratcctccttaatggtgatggtggtggtgcc-3 ' (SEQ ID NO: 8) ;
Miesto EamllO4I je podtrhnuté, bodka označuje miesto štiepenia. Hrubo vytlačené bázy sú komplementárne k bázam priméru MF30-rechts. Bázy tvoriace miesto pre BamHI vhodné na ďalšie klonovacie postupy sú vytlačené kurzívou. Neoznačené bázy sa pripájajú v antisense smere vo vnútri konca jednotky E1-H6, ktorý obsahuje stop kodón a tri ďalšie bázy medzi stop kodónom a miestom BamHI.
Reakčná zmes sa skladala z nasledujúcich zložiek: celkový objem 50 μΐ obsahujúci 20 ng Eco311-linearizovaného pGEMTElsH6, po 0,2 μΜ každého z primérov CHHE1-F a CHHE1-R, dNTP's (každý v množstve 0,2 μΜ) , 1 x pufor 2 (Expand Long
Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázovej zmesi (polymerase mix, Expand Long Template PCR System; Boehringer ; Cat No 1681 834).
Bol použitý Program 1, ktorý sa skladal z nasledujúcich krokov:
1. denaturácia: 5 min 95°C ;
2. 10 cyklov denaturácie 30 s pri 95° C, 30 s nasadaním pri 65° C a 130 s predlžovaním pri 68° C;
3. terminácia pri 4° C.
Potom bolo do vzorky získanej podlá Programu 1 pridaných 5 μΐ 10 x pufru 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat
No 1681 834), 40 μΐ Η20 a 5 μΐ [dATP, dGTP a dTTP (každý 2mM),· 10 mM 5-metyl-dCTP] a bola uskutočňovaná ďalšia amplifikácia podľa Programu 2 pozostávajúceho z nasledujúcich stupňov:
1. denaturácia: 5 min pri 95° C;
2. 5 cyklov 45 s denaturácie pri 95° C, 30 s nasadaním pri 65° C a 130 s pri 68° C;
3. terminácia pri 4° C.
Príprava akceptorového plazmidu odvodeného od pCHH-Hir
Akceptorový fragment bol pripravený s PCR z plazmidu pCHH-Hir (SEQ ID NO: 9; Obrázok 2) a skladá sa z takmer úplného plazmidu pCHH-Hir, s tou výnimkou, že sekvencia kódujúca Hir nie je v produkte PCR prítomná. Pre túto PCR boli použité nasledujúce priméry:
1. CHH-links: 5-agttactcttca. cctcttttccaacgggtgtgtag-3' (SEQ ID NO: 10);
Místo Eamll04I je podtrhnuté, bodka označuje miesto štiepenia. Hrubo vytlačené bázy sú komplementárne k bázam primeru CHHE1F. Neoznačené bázy sa pripájajú v antisense smere vo vnútri konca sekvencie CHH; a
2. MF30-rechts: 5-agtcactcttca.ctgcaggcatgcaagcttggcg-3' (SEQ ID NO:11);
Místo EamllO4I je podtrhnuté, bodka označuje miesto štiepenia. Hrubo vytlačené bázy sú komplementárne k bázam primeru CHHE1R. Neoznačené bázy sa pripájajú vo vnútri sekvencií pUC18 za klonovaný CHH-Hirudin HL20 plazmidu pCHH-Hir, na vonkajšej strane od inzertu.
Reakčná zmes sa skladala z nasledujúcich zložiek: celkový objem 50 μΐ obsahujúci 20 ng Asp718I-linearizovaného pCHH-Hir, po 0,2 μΜ každého z primérov CHH-links a MF30-rechts, dNTP's (každý v množstve 0,2 μΜ) , 1 x pufor 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázovej zmesi (polymerase mix, Expand Long Template PCR System; Boehringer ; Cat No 1681 834) .
Bol použitý Program 1 tak, ako je opísaný vyššie.
Potom bolo do vzorky získanej podlá Programu 1 pridaných 5 μΐ 10 x pufru 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 40 μΐ H2O a 5 μΐ [dATP, dGTP a dTTP (každý 2mM) ; 10 mM 5-metyl-dCTP] a bola uskutočňovaná ďalšia amplifikácia podlá Programu 2 tak, ako je opísaný vyššie.
Príprava vektora pCHHEl
Fragment DNA kódujúci Els-H6 a akceptorový plazmid odvodený z pCHH-Hir, ktorý bol pripravený s PCR tak, ako je opísané vyššie, boli purifikované s použitím purifikačnej súpravy PCR (PCR product purification kit, Qiagen) podlá doporučenia výrobcu. Nasledovne boli purifikované fragmenty oddelene štiepené s EamllO4I. Potom bol fragment DNA Els-H6 ligovaný do akceptorového plazmidu odvodeného z pCHH-Hir s použitím T4 ligázy (Boehringer) podía inštrukcií výrobcu.
Bunky E. coli XL-Gold boli transformované s ligačnou zmesou a bola analyzovaná plazmidová DNA z niekolkých kolónií rezistentných na ampicilín štiepením s EcoRI a BamHI. Pozitívne klony boli vybrané a označené ako pCHHEl.
Príprava vektora pFPMT-CHH-ElH6
Fragment pCHHEl, získaný pôsobením EcoRl/BamHI bol ligovaný s vektorom pFPMT121, ktorý bol štiepený s EcoRI/BamHI (SEQ ID NO: 12; Obrázok 3) . Bola použitá T4 ligáza (Boehringer) podlá inštrukcií výrobcu. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu buniek E. coli DH5aF'.
V rade transformantov bola uskutočnená analýza reštrikčných vzoriek z plazmidovej DNA a pozitívny kloň bol odobraný a označený pFPMT-CHH-ElH6 (SEQ ID NO: 13; Obrázok 4).
Príprava pFPMT-MFa-El-H6
Nakoniec bol pripravený kyvadlový vektor pFPMT-MFa-El-H6 ligáciou troch fragmentov, kde uvedenými fragmentárni boli:
1. 6961kb z pFPMT121, štiepeného s EcoRI/BamHI (SEQ ID NO: 12; Obrázok 3),
2. 0,245 EcoRl/HindlII fragment z pUC18-MFct (SEQ ID NO: 62; Obrázok 3 6) , a
3. 0,442kb fragment z 0,454kb produktu PCR, odvodeného z pFPM CHH-E1H6 a štiepeného s HindlIl/BamHI.
Produkt PCR o 0,454 kb, ktorý poskytol fragment, bol získaný s PCR s použitím nasledujúcich primérov:
1. Primér MFa-El f-Hi:
5-aggggtaagcttggataaaaggtatgaggtgcgcaacgtgtccgggatgt-3' (SEQ ID NO: 14) ; a
2. Primér EI back-Bam:
5'-agttacggatccttaatggtgatggtggtggtgccagttcat-3' (SEQ ID NO: 15).
Reakčná zmes mala nasledujúce zloženie: Objem reakčnej zmesí 50 μΐ, pFPMT-CHH-El-H6 (EcoRI-linearizovaný; 15 ng/μΐ), 0,5 μΐ; primér MFa-El f-Hi (50 μΜ) , 0,25 μΐ; primér El backBam(50 μΜ) , 0,25 μΙ,-dNTP's (všetky 2mM) , 5μ1; DMSO, 5 μΐ; H2 O, 33,5 μΐ; Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheím; Cat No 1681 834) pufor 2 (10 x koncentrovaný), 5 μΐ; Expand
Long Template PCR System Polymerase mixture(l U/μΙ), 0,5 μΐ.
Bol použitý program PCR pozostávajúci z nasledujúcich stupňov:
1. denaturácia:5 min pri 95° C
2. 29 cyklov denaturácie 45 s pri 95° C, 45 s nasadanie pri 55° C, a 40 s elongácie pri 68° C
3. terminácia pri 4° C.
Na základe použitých primárov obsahoval výsledný 0,454kb produkt PCR kodóny z El (192-326), nasledovanými šiestimi histidínovými kodónmi a stop kodónom „taa, lemovanými proti smeru s 22 3'-terminálnymi pármi báz z MFa pre-pro sekvencie (obsahujúcej relevantné klonovacie miesto HíndlII plus šesť vyčnievajúcich párov báz) a po smere lemovanými s (na klonovanie relevantným) miestom BamHI a šestimi vyčnievajúcimi pármi báz.
Na ligačnú reakciu bola použitá T4 DNA ligáza (Boehringer Mannheím) podľa doporučenia výrobcu (objem vzorky 20 μΐ).
Bunky E. coli HB101 boli transformované s ligačnou zmesou a pozitívne klony boli odobrané po reštrikčnej analýze plazmidov, izolovaných z niekoľkých transformantov. Bol vyselektovaný pozitívny plazmid a označený ako pFPMT-MFa-El-H6 (SEQ ID NO: 16; Obrázok 5).
PRÍKLAD 2
KONŠTRUKCIA KYVADLOVÉHO VEKTORA pFPMT-CL-El~H6
Plazmidy na transformáciu Hansenula polymorpha boli skonštruované nasledovne. Kyvadlový vektor pFPMT-CL-El-H6 bol skonštruovaný počas troch krokov z východzieho pFPMT-MFa-El-H6 (SEQ ID NO: 16, Obrázok 5).
V prvom kroku bol čítací rámec MFa-El-H6 z pFPMT-MFcc-ElH6 subklonovaný do vektora pUC18. Preto bol l,798kb Sall/BamEI fragment z pFPMT-MFa-El-H6 (obsahujúci promotor FMD plus MFaE1-H6) ligovaný do vektorového Sall/BamHI fragmentu z pUC18 s ligázou T4 (Boehringer) podľa doporučenia výrobcu. Výsledkom bol plazmid, ktorý je zobrazený na Obrázku 6 (SEQ ID NO: 17), a ktorý je ďalej označovaný ako pMal2-l (pUC18-FMD-MFct-El-H6) . Na transformáciu buniek E. coli DH5aF' bola použitá ligačná zmes. Bolo odpichnutých niekolko kolónií rezistentných na ampicilín a plazmidová DNA z izolovaných klonov bola analyzovaná reštrikčným štiepením. Pozitívne klony boli ďalej analyzované stanovením sekvencie DNA pre kódujúcu sekvenciu MFa-El-H6. Správny kloň bol použitý na riadenú PCR mutagenéziu na zámenu pre-pro-sekvencie MFa za kodóny pre-sekvencie opičieho lysozýmu („CL; zodpovedajúci aminokyselinám 1 až 18 opičieho lysozýmu; SEQ ID NO: 1). Princíp aplikovanej PCRriadenej mutagenézie je založený na amplifikácii celého plazmidu s požadovanými zmenami umiestnenými na 5'-koncoch primérov. V krokoch po smere sú potom lineárne produkty PCR modifikované pred vlastnou ligáciou, čo vedie na požadovaný pozmenený plazmid.
Pre reakciu PCR boli použité nasledujúce priméry:
1. primér CL hin :
5'-tgcttcctaccactagcagcactaggatatgaggtgcgcaacgtgtccggg-3' (SEQ ID NO: 18);
2. Primér CL her neu:
5'-tagtactagtattagtaggcttcgcatgaattcccgatgaaggcagagagcg-3' (SEQ ID NO: 19).
Podtrhnuté 5' oblasti primárov obsahujú kodóny, ktoré pochádzajú približne z jednej polovici z pre-sekvencie opičieho lysozýmu. Primér CL her neu obsahuje reštrikčné miesto Spel (kurzíva). Nepodtrhnuté oblasti primárov sa pripájajú ku kodónom pre aminokyselinové zvyšky 192 až 199 z El (CL hin), alebo ku štart kodónu „atg promotora FMD za miesto EcoRI až k pozícii -19 (počítané od miesta EcoRI). Zámena kodónov pre-pro-sekvencie MFa za kodóny pre-sekvencie opičieho lysozýmu bola uskutočnená preto, že priméry sú určené na amplifikáciu úplného pMal2-l.
Reakčná zmes mala nasledujúce zloženie: pUC18-FMD-Mfa-ElH6 (pMal2-l; 1,3 ng/μΐ), 1 μΐ; primér CL hin(100 μΜ) , 2 μΐ;
primér CL her neu (100 μΜ) , 2 μΐ; dNTP's (každý 2,5mM), 8 μΐ ; H2O, 76 μΐ; Expand Long Template PCR System (Boehringer; Cat No 1681 834) Pufor 2 (10 x koncentrovaný), 10 μΐ; Expand Long
Template PCR System Polymerase mixture (polymerázová zmes, 1 U/μΙ), 0,75μ1.
Bol použitý program PCR pozostávajúci z nasledujúcich stupňov:
1. denaturácia: 15 min pri 95° C
2. 35 cyklov denaturácie 30 s pri 95° C, 1 min nasadaní pri 60° C, a 1 min elongácie pri 72° C
3. terminácia pri 4° C.
Správná veľkosť výsledného produktu PCR bola kontrolovaná elektroforézou v agarózovom géli (3,5 kb) . Potom boli vyčnievajúce konce 3'-A odstránené z produktu PCR reakciou s T4 polymerázou tak, aby mali zarovnané konce 3'- a 5'-OH skupiny. Preto bolo na produkt PCR pôsobené s T4 polymerázou (Boehringer; 1 U/μΙ): k zostávajúcim 95 μΐ reakčnej zmesi PCR boli pridané 1 μΐ T4 polymerázy a 4 μΐ dNTP's (každý 2,5 mM). Vzorka bola inkubovaná počas 20 minút pri 37° C. Nasledovne bola DNA precipitovaná s etanolom a prevedená do 16 μΐ H20.
Nasledovne boli pridané 5-'fosfáty k produktu PCR na zarovnanie koncov kinázovou reakciou. Preto bol k 16 μΐ produktu PCR so zarovnanými koncami pridaný 1 μΐ T4 polynukleotid kinázy (Boehringer; lU/μΙ), 2 μΐ lOkrát koncentrovaného reakčného pufru pre T4 polynukleotid kinázu (T4 polynucleotide kinase reaction buffer, Boehringer), a 1 μΐ ATP (lOmM) . Vzorka bola inkubovaná počas 30 minút pri 37° C. Potom bola DNA nanesená na 1% agarózový gél, pás so zodpovedajúcim produktom bol izolovaný pomocou gélovej extrakčnej súpravy (gel extraction kit, Qiagen) podľa doporučenia výrobcu. Päťdesiat (50) ng purifikovaného produktu bolo samoligovaných s použitím T4 ligázy (Boehringer) za podmienok podľa doporučenia výrobcu. Po inkubácii 72 hodín pri °C bola DNA v ligačnej zmesi precipitovaná s etanolom a rozpustená v 20 μΐ vody.
Nasledovne boli bunky E. coli DH5a-F' transformované s 10 μΐ ligačnej vzorky. Plazmidová DNA z niekoľkých klonov rezistentných na ampicilín bola kontrolovaná s použitím štiepenia s reštrikčnými enzýmami. Pozitívny kloň bol izolovaný a označený ako p27d-3 (pUCl8-FMD-CL-El-H6, SEQ ID NO: 20, Obrázok 7) . Potom bol overený čítací rámec pre CL-E1H6 sekvenovaním DNA.
V poslednom kroku bol skonštruovaný kyvadlový vektor pFPMT-CL-El-H6 tak, ako je opísané nižšie. Fragment EcoRl/BamHI o 0,486 kb z p27d-3 (obsahujúci CL-E1 (192-326)H6) bol ligovaný s pFPMT121 (SEQ ID NO: 12, Obrázok 3) , štiepeným s EcoRl/BamHI. Na reakciu bola použitá T4 ligáza (Boehringer) podľa doporučenia výrobcu. DNA v ligačnej vzorke bola precipitovaná s etanolom a rozpustená v 10 μΐ H2O. Bunky E. coli DH5a'-F'byly transformované s 10 μΐ ligačnej vzorky a plazmidová DNA z niekoľkých kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná štiepením s EcoRI a BamHI. Plazmidový kloň p37-5 (pFPMT-CL-E1-H6; SEQ ID NO: 21, Obrázok 8) vykazoval požadované veľkosti fregmentov o 0,486 kb a 9,961 kb. Správnosť sekvencie CL-E1-H6 v p37-5 bola overená sekvenovaním.
PRÍKLAD 3
KONŠTRUKCIA KYVADLOVÝCH VEKTOROV pFPMT-MFa-E2-H6 a pMPT-MFaE2-H6
Plazmidy na transformáciu Hansenula polymorpha boli skonštruované nasledujúcim spôsobom. Sekvencia DNA kódujúca MFa-E2s((aminokyseliny 384-673 z HCV E2)-VIEGR-His6 (SEQ ID NO: 5) bola izolovaná ako l,331kb EcoRl/BglII-fragment z plazmidu PSP72E2H6 (SEQ ID NO: 22, Obrázok 9). Tento fragment bol ligovaný buď s HcoRl/BglII-štiepeným vektorom pFPMT121 (SEQ ID NO: 12, Obrázok C+2), alebo s EcoRl/BglIIštiepeným vektorom pMPT121 (SEQ ID NO: 23, Obrázok 10) s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer Mannheim) podía doporučenia výrobcu. Po transformácii E.coli a kontrole plazmidovej DNA izolovanej z rôznych transformantov pomocou štiepenia s reštrikčnými enzýmami, boli pozitívne klony odobrané a výsledné kyvadlové vektory boli označené a ako pFPMT-MFa-E2-H6 (SEQ ID NO: 22, Obrázok 11) a pMPT-MFct-E2-E6 (SEQ ID NO: 23, Obrázok 12) v uvedenom poradí.
PRÍKLAD 4
KONŠTRUKCIA KYVADLOVÉHO VEKTORA pFPMT-CL-E2-H6
Kyvadlový vektor pFPMT-CL-E2-H6 bol zostavený v trojstupňovom postupe. Bol pripravený medziproduktový konštrukt, v ktorom bola sekvencia kódujúca E2 klonovaná za signálnu sekvenciu α-amylázy z Schwanniomyces occidentalis. Toto bolo uskutočnené neprerušovanou metódou klonovania (Padgett, K. A. and Sorge, J. A. 1996).
Príprava DNA fragmentu kódujúceho E2s-H6
Najprv bola sekvencia DNA kódujúca E2-H6 (aminokyseliny 384 až 673 z E2 HCV s predĺžením o linkerový peptid „VIEGR a 6 zvyškov His, SEQ ID NO: 5) amplifikovaná z plazmidu pSP72E2H6 (SEQ ID NO: 24, Obrázok 11) metódou PCR. Použité príméry boli označené MF30E2/F a MF30E2/R a mali nasledujúce sekvencie:
- primér MF30E2/F:
5'-agtcactcttca.aggcatacccgcgtgtcaggaggg-3' (SEQ ID NO. 26; miesto EamllO4I je podtrhnuté, bodka označuje miesto enzymatického štiepenia; posledný kodón signálnej sekvencie zo S. occidentalis je vytlačený hrubo; nepodtrhnuté bázy sa pripájajú ku kodónom z E2 (aminokyseliny 384-390 z E2 HCV);
- primér MF30E2/R:
5'-agtcactcttca.cagggatccttagtgatggtggtgatg-3 ' (SEQ ID NO: 27; miesto £amllO4I je podtrhnuté, bodka označuje miesto enzymatického štiepenia; hrubo vytlačené bázy sú komplementárne k hrubo vytlačeným bázam primeru MF30-Rechts (pozri nižšie); miesto SairiHI, ktoré má byť zavedené do konštruktu, je vytlačené kurzívou; neoznačené sekvencie sa pripájajú ku stop kodónu a ko kodónom pre šesť terminálnych His z E2 (384-673)-VIEGR-H6 (SEQ ID NO: 5).
Reakčná zmes mala nasledujúce zloženie: v celkovom objeme 50 μΐ bolo obsiahnutých 20 ng l,33kb BcoRI/BglII fragmentu z pSPO72E2H6, 0,2 μΜ každého z primérov MF30E2/F a MF30E2/R, dNTP's (všetky 0,2 μΜ) , lx Puf or 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázovej zmesi (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834).
100
Bol použitý program PCR 3 pozostávajúci z nasledujúcich stupňov:
1. denaturácia: 5 min pri 95° C
2. 10 cyklov denaturácie 30 s pri 95° C, 30 s nasadanie pri 65° C, a 1 min elongácia pri 68° C
3. terminácia pri 4° C.
Potom bolo do vzorky získanej pódia Programu 3 pridaných 10 μΐ 10 x pufru 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 40 μΐ H20 a 5 μΐ [dATP, dGTP a dTTP (každý 2mM); 10 mM 5-metyl-dCTP] a pokračovalo sa s programom PCR 4, pozostávajúcim z nasledujúcich stupňov:
1. denaturácia: 5 min pri 95° C,2. 5 cyklov 45 s denaturácie pri 95° C, 30 s nasadanie pri 65° C a 1 min elongácia pri 68° C;
3. terminácia pri 4° C.
Príprava akceptorového plazmidu odvodeného z pMF30
Druhý fragment pochádza z plazmidu pMF30 (SEQ ID NO: 28, Obrázok 13) , amplikónom bol takmer kompletný plazmid pMF3 0 s výnimkou kodónov pre zrelú a-amylázu zo S. occidentalis, modifikácie, významné pre klonovanie, boli zavedené pomocou úpravy prímérov. Bola použitá nasledujúca sada primérov:
- primér MF30-Links:
' -agtcactcttca. cctcttgtcaaaaataatcggttgag-3 ' (SEQ ID NO: 29,- ;
miesto Eamll04I je podtrhnuté, bodka označuje miesto enzymatického štiepenia; hrubo vytlačené „cct je komplementárne k hrubo vytlačenému „aag v priméri MF30E2/F
101 (pozri vyššie) ,· neoznačené bázy sa pripájajú k 26 koncovým bazam z kodónov cc-amylázy zo S. occidentalis v pMF30;
-primér MF30-Rechts:
5'-agtcactcttca.ctgcaggcatgcaagcttggcg-3'(SEQ ID NO: 11; miesto £<aznllO4I je podtrhnuté, bodka označuje miesto enzymatického štiepenia; hrubo vytlačené „ctg je komplementárne k hrubo vytlačenému „cag v priméri MF30E2/R (pozri vyššie); neoznačené bázy sa pripájajú k sekvenciám pUC18 po smere od stôp kodónu cc-amylázy zo S. occidentalis v pMF30).
Reakčná zmes mala nasledujúce zloženie: v celkovom objeme 50 μΐ bolo obsiahnutých 20 ng SgrlII-linearizovaného pMF30, 0,2 μΜ každého z primérov MF30-Links a MF30-Rechts, dNTP's (všetky 0,2 μΜ) , lx Pufor 1 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834), 2,5 U polymerázovej zmesi (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834). Boli použité zhodné programy (Program 3 a 4) tak, ako sú opísané vyššie, s výnimkou doby elongácie, ktorá bola v obidvoch programoch predĺžená z 1 minúty na 4 minúty.
Príprava vektora pAMY-E2
Fragment DNA kódujúci E2s-H6 a z PCR získaný akceptorový plazmid odvodený z pMF30 boli z hladiska ich veľkostí skontrolované pomocou gélovej elektroforézy na 1% agarózovom géli. Produkty PCR boli purifikované s purifikačnou súpravou pre produkty PCR (Qiagen) podľa doporučenia výrobcu. Potom boli purifikované fragmenty oddelene štiepené s Eam 11041. Ligácia fragmentu E2s-H6 s akceptorovým plazmidom odvodeným z pMF30 bola uskutočňovaná s použitím T4 ligázy (Boehringer)
102 podľa doporučenia výrobcu. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu buniek É. coli DH5ctF' a plazmidová DNA z niekoľkých klonov bola analyzovaná EcoRl/BamHI štiepením. Bol vybraný pozitívny kloň, jeho plazmid bol ďalej označený ako pAMY-E2, a bol použitý na ďalšie modifikácie tak, ako je opísané nižšie.
Príprava vektora pUC18-CL-E2-H6
Plazmid pAMY-E2 bol podrobený PCR-riadenej mutagenézii tak, aby boli kodóny pre signálnu sekvenciu α-amylázy zamenené s kodónmi pre pre-sekvenciu opičieho lysozýmu. Táto je ďalej označovaná ako „CL, a zodpovedá prvým 15 aminokyselinám opičieho lysozýmového ORF (SEQ ID NO: 1). Na mutagenéziu boli použité nasledujúce priméry:
- primér CL2 hin:
5'-tgcttcctaccactagcagcactaggacatacccgcgtgtcaggaggggcag-3' (SEQ ID NO: 30); a
- primér CL2 her:
5' -tagtactagtattagtaggcttcgcatgg'aafcfccactggccgtcgtttta-caacgtc3' (SEQ ID NO: 31).
Podtrhnuté 5'-oblasti primérov obsahujú sekvencie DNA približne z jednej polovici pre-sekvencie opičieho lysozýmu. Primér CL2 her obsahuje reštrikčné miesta Spel (kurzíva) a EcoRI (hrubo vytlačené kurzíva). Nepodtrhnuté oblasti primérov sa pripájajú ku kodónom aminokyselinových zvyškov 384 až 392 z E2 (CL2 hin) alebo k „atg štart kodónu za miesto EcoRI až do pozície -19 (počítané od miesta EcoRI) promotora FMD. Priméry boli navrhnuté tak, aby bol amplifikovaný celý vektor
103 pAMY-E2, a preto boli zamenené kodóny signálnej sekvencie aamylázy za kodóny pre-sekvencie opičieho lysozýmu.
Reakcia PCR bola uskutočňovaná podľa nasledujúceho programu:
1. denaturácia: 15 min pri 95° C;
2. 35 cyklov 35 s denaturácie pri 95° C, 1 min nasadanie pri 60° C a 1 min elongácia pri 72° C;
3. terminácia pri 4° C.
Bola použitá nasledujúca reakční zmes: pAMY-E2 (1 ng/μΐ) , μ1; primér CL2 hin (100 μΜ), 2 μΐ; primér CL2 her (100 μΜ) 2 μΐ; dNTP's (všetky 0,2 μΜ), 8 μΐ; H20 , 76 μΐ; Pufor 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681 834) (10 x koncentrovaný), 10 μΐ; polymerázová zmes Expand Long Template PCR System (1 U/μΙ), 0,75 μΐ.
Výsledný produkt PCR bol kontrolovaný gélovou elektroforézou na 1% agarózovom géli. Pred ligáciou bol PCR fragment modifikovaný nasledovne. Vyčnievajúce konce 3'-A boli odstránené s T4 polymerázou, čo viedlo na zarovnanie koncov so 3'- a 5'-OH skupinami. Preto bol 1 μΐ polymerázy T4 (Boehringer, 1 U/μΙ) pridaný k zostávajúcim 95 μΐ PCR reakčnej zmesi spoločne so 4 μΐ dNTP's (každý 2,5 mM) . Vzorka bola inkubovaná počas 2 0 minút pri 3 7 °C. Nasledovne bola DNA precipitovaná s etanolom a rozpustená v 16 μΐ deionizovanej vody. Potom nasledovalo pôsobenie kinázy tak, aby boli pripojené 5'-fosfáty k produktu PCR so zarovnanými koncami.
K 16 μΐ rozpusteného produktu PCR so zarovnanými koncami bol pridaný 1 μΐ T4 polynukleotid kinázy (Boehringer, 1 U/μΙ), μΐ lOkrát koncentrovaného reakčného pufru pre polynukleotid
104 kinázu (Boehringer) a 1 μΐ ATP (10 mM). Vzorka bola inkubovaná počas 30 minút pri 37° C.
Vzorka podrobená pôsobeniu kinázy bola nasledovne oddelená na 1% agarózovom géli. Pás produktu bol izolovaný. DNA bola extrahovaná z agarózových rezov pomocou gélovej extrakčnej súpravy (Gel Extraction kit Qiagen) podlá doporučenia výrobcu. Päťdesiat (50) ng purifikovaného produktu bolo samoligovaných s použitím T4 ligázy (Boehringer) podľa doporučenia výrobcu. Po inkubácii 16 hodín pri 16° C bola DNA v ligačnej zmesi precipitovaná s etanolom a rozpustená v 20 μΐ H20 (ligačná vzorka).
Bunky E. coli DH5ccF' boli transformované s 10 μΐ ligačnej vzorky. Niekoľko klonov rezistentných na ampicilín bolo ďalej charakterizovaných s reštrikčnou analýzou izolovanej plazmidovej DNA. Pozitívny kloň bol označený ako pUC18-CL-E2H6 a bol použitý na ďalšie modifikácie tak, ako je opísané nižšie.
Príprava kyvadlového vektora pFPMT-CL-E2-H6
Fragment BcoRl/BamHI o 0,966 kb bol izolovaný z pUC18-CLE2-H6 (nesúci CL-E2(384-673)-VIEGR-H6) a bol ligovaný do plazmidu pFPMT121 (SEQ ID NO: 12, Obrázok 3) štiepeného s BcoRI/BamHI. Na reakciu bola použitá ligáza T4 (Boehringer) podľa doporučenia výrobcu. Ligačná vzorka bola precipitovaná s etanolom a rozpustený v 10 μΐ vody. Takto pripravená vzorka bola použitá na transformáciu buniek E. coli DH5aF', pozitívne klony boli odobrané po reštrikčnej analýze a príslušný plazmid bol označený ako pFPMT-CL-E2-H6 (SEQ ID NO: 32, Obrázok 14).
105
PRÍKLAD 5
KONŠTRUKCIA KYVADLOVÉHO VEKTORA pFPMT-CL-K-H6-El
Konštrukcia tohto kyvadlového vektora pozostávala z dvoch stupňov.
V prvom stupni bol konštrukt pUC18-FMD-CL-H6-K-El-H6 zostavený miestne riadenou mutagenéziou. Plazmid pUC18-FMD-CLE1-H6 bol použitý ako templát (SEQ ID NO: 20, Obrázok 7). Boli použité nasledujúce priméry:
-Primér H6KRK hin neu:
5'-catcacaaatatgaggtgcgcaacgtgtccgggatgtac-3'(SEQ ID NO: 37). -Primér H6KRK her neu:
5'-gtgatggtggtgtcctagtgctgctagtqgtaqqaaqcataq-3' (SEQ ID NO: 38) .
(Bázy poskytujúce prídavné kodóny sú podtrhnuté).
Reakčná zmes mala nasledujúce zloženie: pUC18-FMD-CL-ElH6 (2 ng/μΐ), 1 μΐ; primér HCK hin neu (100 μΜ), 2 μΐ; primér
H6KRK her neu (100 μΜ), 2 μΐ; dNTP's (každý 2,5mM), 8 μΐ; H2O, 76 μΐ; Expand Long Template PCR System (Boehringer; Cat No 1681 834) Pufor 2 (10 x koncentrovaný), 10 μΐ; Expand Long
Template PCR System Polymerase mixture (polymerázová zmes, 1 U/μΙ), 0,75μ1.
Byl použitý program PCR pozostávajúci z nasledujúcich stupňov:
1. denaturácia: 15 min pri 95° C
2. 35 cyklov denaturácie 30 s pri 95° C, 1 min nasadanie pri 60 °C, a 1 min elongácia pri 72° C
106
3. terminácia pri 4° C.
Alikvóty vzorky z PCR boli analyzované na 1% agarózovom géli ku kontrole velkosti, ktorá bola správna (~ 4,2 kb) .
Potom boli z produktu PCR odštiepené prečnívajúce konce 3'-A reakciou s T4 polymerázou, čo viedlo na zarovnanie koncov so skupinami 3'- a 5'- OH. Preto bol 1 μΐ polymerázy T4 (Boehringer, 1 U/μΙ) pridaný k zostávajúcim 95 μΐ PCR reakčnej zmesi spoločne so 4 μΐ dNTP's (každý 2,5 mM) . Vzorka bola inkubovaná počas 2 0 minút pri 3 7° C. Nasledovne bola DNA precipitovaná s etanolom a rozpustená v 16 μΐ H2O. Potom nasledovalo pôsobenie kinázy tak, aby boli pripojené 5'fosfáty k produktu PCR so zarovnanými koncami. K 16 μΐ rozpusteného produktu PCR so zarovnanými koncami boli pridané 1 μΐ T4 polynukleotid kinázy (Boehringer, 1 U/μΙ), 2 μΐ lOkrát koncentrovaného reakčného pufru pre polynukleotid kinázu (Boehringer) a 1 μΐ ATP (10 mM) . Vzorka bola inkubovaný počas 30 minút pri 37° C.
Vzorka bola nasledovne nanesená na 1% agarózový gél a správny pás produktu bol izolovaný pomocou gélovej extrakčnej súpravy (Qiagen) podlá doporučnia výrobcu. Päťdesiat (50) ng purifikovaného produktu bolo samoligovaných s použitím T4 ligázy (Boehringer) podľa doporučenia výrobcu. Po inkubácii 72 hodín pri 16° C bola DNA v ligačnej zmesi precipitovaná s etanolom a rozpustená v 10 μΐ vody.
Bunky E. col i DH5aF'byly transformované s 5 μΐ ligačnej vzorky. Plazmidcvá DNA z niekolkých kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná štiepením s reštrikčnými enzýmami a
107 pozitívny kloň bol odobraný a zodpovedajúci plazmid bol označený ako pUC18.FMD.CL-H6-El-K-H6 (SEQ ID NO: 39, Obrázok 17) .
V druhom kroku bol skonštruovaný prenosový vektor pomocou dvoufragmentovej ligácie. V nasledujúcom spôsobe konštrukcie boli použité fragmenty s Bell kohezívnymi koncami. Vzhladom na to, že Bell môže štiepiť svoje miesto len na nemetylované DNA, bol kmeň E. coli dam~ transformovaný s plazmidmi pUC18FMD-CL-H6-K-E1-H6 (SEQ ID NO: 39, Obrázok 17) a pFPMT-CL-El (SEQ ID NO: 36, Obrázok 16). Z každej transformácie boli odpichnuté kolónie rezistentné na ampicilín, pestované v tekutej kultúre a nemetylované plazmidové DNAs boli pripravené na ďalšie použitie. Boli pripravené fragmenty Bcll/Hindlll o 1,273 kb z nemetylovaného plazmidu pUC18-FMDCL-H6-K-E1-H6 (nesúce promotor FMD, kodóny z jednotky CL-H6-K a štart z El) a fragment Bcll/Hindlll s 6,057 kb z plazmidu pFPMT-CL-El (nesúci chýbajúcu časť čítacieho rámca El začínajúcu od miesta Bell, bez C-koncovej identifikátorovej značky (tag) His, rovnako tak, ako prvky umiestnené v pFPMT121 s výnimkou promotora FMD) , ktoré boli spoločne ligované počas 72 hodín pri 16° C s použitím ligázy T4 (Boehringer) v celkovom objeme 20 μΐ podlá doporučenia výrobcu. Nasledovne bola ligační zmes nanesená na kúsok nitrocelulózovej membrány plávajúcej na sterilnej deionizovane j vode tak, aby došlo na odsolenie ligačnej zmesi (inkubácia počas 30 minút pri teplote miestnosti). Bunky E.coli TOP10 boli transformované elektroporáciou 5 μΐ odsolenej vzorky. Plazmidová DNA z niekoľkých výsledných kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná štiepením s reštrikčnými enzýmami. Pozitívny
108 kloň bol odobraný a označený ako pFPMT-CL-H6-K-El (SEQ ID NO: 40, Obrázok 18).
PRÍKLAD 6
TRANSFORMÁCIA HANSENULA POLYMORPHA A SELEKCIA TRANSFORMANTOV
Kmeň H. polymorpha RB11 bol transformovaný (postupom „PEG-Mediated DNA uptake protocol v podstate tak, ako je opísaný v Klebe, R J. et al. 1983, s modifikáciou podľa
Roggenkamp, R. et al. 1986) s odlišnými základnými vektormi, ktoré sú opísané v príkladoch 1 až 5. Pre každú transformáciu bolo vybraných 72 uracil-prototrofných kolónií a použitých na prípravu kmeňa nasledujúcim postupom. Každá kolónia bola inokulovaná do 2 ml tekutej kultúry a pestovaná v testovacích skúmavkách počas 48 hodín (37° C; 160 otáčok za minútu, uhol 45°) v selekčnom médií (YNB/glukóza, Difco). Tento stupeň je označený ako prvý stupeň pasážovania. Alikvóty kultúr s 150 μΐ z prvého stupňa pasážovania boli použité na inokuláciu 2 ml čerstvého YNB/glukózového média. Opätovne boli kultúry inkubované tak, ako je opísané vyššie (druhý stupeň pasážovania). Celkom bolo uskutočnených osem takých stupňov pasážovania. Alikvóty kultúr po treťom a ôsmom stupni pasážovania boli použité na inokuláciu 2 ml neselektívneho média YPD (Difco) . Po inkubácii 48 hodín pri 37° C (160 otáčok za minútu; uhol 45°; takzvaný prvý stabilizačný krok) boli 150μ1 alikvóty týchto YPD kultúr použité na inokuláciu čerstvých 2ml YPD kultúr, ktoré boli inkubované tak, ako je opísané vyššie (druhý stabilizačný krok). Alikvóty kultúr z druhého stabilizačného kroku boli potom rozotreté na platne obsahujúce selekčný YNB/agar. Platne boli inkubované počas štyroch dní, dokial neboli pozorovateľné makroskopické
109 kolónie. Jednotlivé kolónie z každej separácie, prenesené do jamiek kultivačných doštičiek, boli označené ako kmeň a použité na ďalšiu analýzu expresie.
Analýza expresie bola uskutočnená v kultúrach pestovaných v trepaných, maloobjemových nádobách. Bola odpichnutá kolónia z vyššie uvedených YNB/agarových platní a inokulovaná do 2 ml YPD a inkubovaná počas 48 hodín tak, ako je opísané vyššie. Tento 2ml alikvót bol použitý ako inokulačná kultúra do 20ml trepanej fľašovej kultúry. YPGlycerol (1%) bol použitý ako médium a trepané fľaše boli inkubované na rotačnej trepačke (200 otáčok za minútu, 3 7° C) . Po 48hodinovom rastu bolo do kultúry pridané 1 % MeOH na indukciu expresnej kazety. V rôznych časových intervaloch boli odoberané bunkové pelety z lml alikvótov a tieto sa potom uchovávali pri -20° C do ďalšej analýzy. Špecifická expresia proteínov bola analyzovaná s SDS-PAGE/Western blottingom. Na to boli bunkové pelety rozpustené vo vzorkovom pufri (TrisHCl-SDS) a inkubované počas > 15 minút pri 95° C. Proteiny boli separované na 15% polyakrylamidovom géli a prenesené (blotované) (wet-blot,· bikarbonátový pufor) na nitrocelulózové membrány. Bloty boli vyhodnotené s použitím špecifických myšacích anti-El (IGH 201) alebo myšacích anti-E2 (IGH 216, opísaných v Maertens et al. vo WO96/04385) protilátok, ako prvou protilátkou, a králičia anti-myšacia AP bola použitá ako druhá protilátka. Farbenie bolo uskutočnené s NBT-BCIP. Pozitívne kmene boli odobrané na ďalší pokusy.
Päť z týchto pozitívnych klonov bolo použitých v pokuse vyhodnocujúcom expresiu v trepaných fľašových kultúrach. Kolónia príslušného kmeňa bola odpichnutá z platni YNB a bola
110 použitá na inokuláciu 2 ml YPD. Takéto kultúry boli inkubované tak, ako je opísané vyššie. Bunkové suspenzie boli použité na inokuláciu druhej zdrojovej kultúry, ktorá bola v 500 ml trepaných fliaš s obsahom 100 ml média YPD. Trepané fľaše boli inkubované na rotačnej trepačke počas 48 hodín pri 37° C a 200 otáčkach za minútu. Alikvóty s objemom 25 ml z tejto druhej zdrojovej kultúry boli použité na inokuláciu 250 ml YPGlycerolového (1%) média a boli inkubované v dvojlitrových trepaných fľašiach za vyššie opísaných podmienok. 48 hodín po inokulácii sa pridalo 1 % MeOH (na indukciu promotora) a trepané fľaše boli ďalej inkubované za vyššie opísaných podmienok. 24 h po indukcii bol pokus zastavený a bunkové pelety boli zhromaždené centrifugáciou. Hladina expresie v piatich odlišných klonoch bola analyzovaná s SDS-PAGE/Western blottingom (za vyššie uvedených podmienok). Titračné rady z každého klonu boli nanesené na gél a najproduktívnejší kloň bol vybraný na ďalšie fermentačné a purifikačné skúšky.
Bolo s prekvapením zistené, že H. polymorpha, kvasnicový kmeň velmi blízko príbuzný s Pichia pastoris (Gellissen, G. 2000), je schopný exprimovaf proteíny HCV v podstate bez hyperglykosylácie, teda so zlúčeninami cukrov s porovnateľným rozsahu, aký majú obalové proteíny HCV, exprimované cicavčími bunkami infikovanými s HCV rekombinantným vírusom vaccinia.
Kmeň Hansenula polymorpha RB 11 bol uložený 19. apríla 2002 za podmienok Budapešťskej zmluvy v Mycothéque de l'UCL (MUCL), Université Catholique de Louvain, Laboratoíre de mycologie, Plače Croix du Sud 3 bte 6, B-1348 Louvain-laNeuve, Belgium, a má MUCL prírastkové číslo MUCL43805.
111
PRÍKLAD 7
KONŠTRUKCIA VEKTORA pSYlaMFElsH6a
Plazmid na expresiu v S. cerevisiae bol skonštruovaný nasledovne. Sekvencia kódujúca E1 bola izolovaná ako NsTl/Eco52I fragment z plazmidu pGEMT-ElsH6 (SEQ ID NO: 6, Obrázok 1), u ktorého bolo uskutočnené zarovnanie koncov (s použitím T4 DNA polymerázy) a bol klonovaný do vektora pYIG5 (SEQ ID NO: 41, Obrázok 19) s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer) podlá doporučenia výrobcu. Klonovanie bolo uskutočnené tak, že fragment kódujúci Els-H6 bol pripojený priamo a v čítacom rámci sekvencie kódujúcej aMF. Ligačnou zmesou boli transformované bunky E. coli DH5aF'. Nasledovne bola plazmidová DNA z niekolkých klonov rezistentných na ampicilín analyzovaná s reštrikčným štiepením a pozitívne klony boli odobrané a označené ako pYIG5ElH6 (ICCG3470; SEQ ID NO: 42, Obrázok 20).
Expresná kazeta (obsahujúca aMF-sekvenciu a oblasť kódujúcu Els s His-identifikátorovou značkou) bola prenesená ako BamHI fragment (2790 bp) z pYIG5ElH6 do kyvadlového vektora psYl pre E. coli/S. cerevisiae štiepeného s BamHI (SEQ ID NO: 21, Obrázok 43) . Ligácia bola uskutočňovaná s T4 DNA ligázou (Boehringer) podlá doporučenia výrobcu. Bunky E. coli DH5ccF' boli transformované s ligačnou zmesou a plazmidová DNA z niekolkých kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná štiepením s reštrikčnými enzýmami. Pozitívny kloň bol odobraný a označený ako pSYlaMFElsHSa (ICCG3479; SEQ ID NO: 44, Obrázok 22).
112
PRÍKLAD 8
KONŠTRUKCIA VEKTORA pSYYIGSE2H6
Plazmid na expresiu v S. cerevisiae pSYYIGSE2H6 bol skonštruovaný nasledovne. Sekvencia kódujúca E2 bola izolovaná ako Sall/Κρηΐ fragment z pBSK-E2sH6 (SEQ ID NO: 45, Obrázok 23), ktorý bol pripravený ako fragment so zarovnanými koncami (s použitím T4 DNA polymerázy) a nasledovne bol klonovaný do vektora pYIG5 (SEQ ID NO: 41, Obrázok 19) s použitím T4 DNA ligázy (Boehringer) podlá doporučenia výrobcu. Vlastné klonovanie bolo uskutočnené tak, že fragment kódujúci E2-H6 bol pripojený priamo a do čítacieho rámca aMF-kódujúcej sekvencie. Bunky E. coli DH5aF' boli potom transformované s ligačnou zmesou, plazmidová DNA z niekoľkých kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná s reštrikčným štiepením a pozitívny kloň bol odobraný a označený ako pYIG5HCCL-22aH6 (ICCG2424; SEQ ID NO: 46, Obrázok 24).
Kazeta na expresiu (obsahujúca aMF-sekvenciu a oblasť kódujúcu E2 (384-673) s identifikátorovou značkou His) bola prenesená ako BamHI fragment (3281 bp) z pYIG5HCCL-22aH6 do kyvadlového vektora pSYl pre E. coli/S. cerevisiae, otvoreného s BamHI (SEQ ID NO: 43, Obrázok 21). Ligácia bola uskutočnená s T4 DNA ligázou (Boehringer) podía doporučenia výrobcu. Bunky E. coli DH5aF' boli potom transformované s ligačnou zmesou, plazmidová DNA z niekoľkých kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná s reštrikčným štiepením a pozitívny kloň bol odobraný a označený ako pSYYIGSE2H6 (ICCG2466; SEQ ID NO: 47, Obrázok 25).
113
PRÍKLAD 9
KONŠTRUKCIA VEKTORA pSYlYIG7Els
Plazmid pSYlYIG7Els na expresiu v S. cerevisiae bol skonštruovaný nasledujúcim spôsobom. Sekvencia kódujúca El bola izolovaná ako NsIl/Eco52I fragment z pGEMT-Els (SEQ ID NO: 6, Obrázok 1) , ktorý bol pripravený ako fragment so zarovnanými koncami, a bol klonovaný do vektora pYIG7 (SEQ ID NO: 48, Obrázok 26) s použitím T4 .DNA ligázy (Boehringer) podľa doporučenia výrobcu. Vlastné klonovanie bolo uskutočnené tak, že fragment kódujúci El bol pripojený priamo a do čítacieho rámca aMF-kódujúcej sekvencie. Bunky E. coli DH5aF' boli potom transformované s ligačnou zmesou, plazmidová DNA z niekoľkých kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná s reštrikčným štiepením a pozitívny kloň bol odobraný a označený ako pYIG7El (SEQ ID NO: 49, Obrázok 27).
Kazeta na expresiu (obsahujúca vedúcu sekvenciu CL a oblasť kódujúcu El (192-326) bola prenesená ako BamHI fragment (2790 bp) z pYIG7El do kyvadlového vektora pSYl pre E. coli/S. cerevisiae, štiepeného s BamHI (SEQ ID NO: 43, Obrázok 21). Ligácia bola uskutočnená s T4 DNA ligázou (Boehringer) podľa doporučenia výrobcu. Bunky E. coli DH5aF' boli potom transformované s ligačnou zmesou, plazmidová DNA z niekoľkých kolónií rezistentných na ampicilín bola analyzovaná s reštrikčným štiepením. Pozitívny kloň bol odobraný a označený ako pSY!YIG7Els (SEQ ID NO: 50, Obrázok 28).
114
PRÍKLAD 10
TRANSFORMÁCIA SACCHAROMYCES CEREVISIAE A SELEKCIA TRANSFORMANTOV
Preto, aby boli prekonané problémy hyperglykosylácie, ktoré sú často opisované pre proteíny zvýšene exprimované v Saccharomyces cerevisiae, bol použitý screening mutantov. Tento screening vychádzal z metódy opísanej Ballom (Ballou, L. et al. 1991), v ktorej sú selektované spontánne recesívne mutanty rezistentné na ortovanadičnan. Počiatočná selekcia kmeňov bola uskutočnená na základe glykosylačného vzoru po pôsobení invertázy tak, ako bol pozorovaný po základnej gélovej elektroforéze. Na ďalšie pokusy na expresiu rekombinantných proteínov bol odobraný kmeň, ktorý mal zníženú schopnosť glykosylácie a ktorý bol označený ako IYCC155. Podstata mutácie nebola ďalej skúmaná.
Uvedený glykosylačne-deficientný kmeň IYCC155 bol transformovaný s plazmidmi, tak ako je opísané v príkladoch 7 až 9, konkrétne metódou s lítium acetátom opísanou Elble (Elble, R. 1992) . Niekolko Ura-komplementovaných kmeňov bolo odpichnutých zo selektívnej platni obsahujúcej YNB + 2% agar (Difco) a použitých na inokuláciu 2 ml YNB + 2 % glukózy. Kultúry boli inkubované počas 72 hodín pri 37° C, 200 otáčkach za minútu na kruhovej trepačke, a supernatanty z kultúry a vnútrobunkové frakcie boli analyzované z hladiska expresie El Western blottingom, uskutočňovaným so špecifickou myšacou anti-El monoklonálnou protilátkou (IGH 201). Na ďalšie pokusy bol odobraný kloň s najvyššou produkciou.
115
Expresiu proteinov v tu použitom glykosylačne deficientnom mutante S cerevisiae obmedzujú suboptimálne rastové charakteristiky takýchto kmeňov, čo vedie na nižší výťažok biomasy a tým na nižší výťažok požadovaných proteinov v porovnaní s divokými typmi kmeňov S. cerevisiae. Nepriek tomu výťažok požadovaných proteinov bol podstatne vyšší ako v cicavčích bunkách.
PRÍKLAD 11
KONŠTRUKCIA VEKTORA pPICZalphaD'ElsH6 A pPICZalphaE'ElsH6
Kyvadlový vektor pPICZalphaE'ElsH6 bol skonštruovaný z východzieho vektora pPICZalphaA (Invitrogen; SEQ ID NO: 51, Obrázok 29) . V prvom kroku bol uvedený vektor upravený tak, aby umožnil klonovanie sekvencie kódujúcej El priamo za štiepiace miesto KEX2 alebo STE13 proteáz (posttranslačné úpravové proteázy), v uvedenom poradí. Preto bol pPICZalphaA štiepený s Xhol a Nôti. Produkt štiepenia bol separovaný na 1% agarózovom géli a fragment s 3519 kb (väčšia časť vektora) bol izolovaný a purifikovaný s použitím súpravy na gélovú extrakciu (gel extraction kit, Qiagen) polymerázy to za prítomnosti špecifických oligonukleotidov poskytujúcich pPICZalphaD' (SEQ ID NO: 52, Obrázok 30) alebo pPICZalphaE' (SEQ ID NO: 53, Obrázok 31).
Potom bol fragment (Boehringer) podlá ligovaný s použitím T4 doporučenia výrobcu, a
Boli použité nasledujúce oligonukleotidy:
- na konštrukciu pPICZalphaD':
8822: 5'-TCGAGAAAAGGGGCCCGAATTCGCATGC-3 ' (SEQ ID NO: 54); a
8823: 5'-GGCCGCATGCGAATTCGGGCCCCTTTTC-3' (SEQ ID NO: 55), ktoré po pripojení poskytujú linkerový oligonukleotid:
116
TCGAGAAAAGGGGCCCGAATTCGCATGC (SEQ ID NO: 54)
CTTTTCCCCGGGCTTAAGCGTACGCCGG (SEQ ID NO: 55)
- na konštrukciu pPICZalphaE':
8649: 5'-TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCCTGCAGCATATGC-3' (SEQ ID NO:56) 8650: 5'-GGCCGCATATGCTGCAGGCTTCAGCCTCTCTTTTC-3' (SEQ ID NO:
57), ktoré po pripojení poskytujú linkerový oligonukleotid:
TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCCTGCAGCATATGC (SEQ ID NO:56)
CTTTTCTCTCCGACTTCGGACGTCGTATACGCCGG (SEQ ID NO: 57).
Uvedené kyvadlové vektory pPICZalphaD'a pPICZalphaE' majú novo zavedené klonovacie miesta za štiepiacim miestom príslušných úpravových proteáz KEX2 a STE13. Sekvencie kódujúce E1-H6 boli izolované ako NsIl/Eco52I fragment z plazmidu pGEMT-ElsH6 (SEQ ID NO: 6, Obrázok 1). Fragment bol purifikovaný s použitím súpravy na gélovú extrakciu (Qiagen) po separácii produktu štiepenia na 1% agarózovom géli. Výsledný fragment bol pripravený so zarovnanými koncami (použitím T4 DNA polymerázy) a bol ligovaný buď do pPICZalphaD'alebo do pPICZalphaE' priamo za príslušné miesto štiepenia úpravovej proteázy.
Bunky E. coli TOPIOF' boli transformované s ligačnými zmesmi a plazmidová DNA z niekolkých kolónií rezistentných na zeocín bola analyzovaná štiepením s reštrikčnými enzýmami. Pozitívne klony boli odobrané a označené ako pPICZalphaD'ElsH6 (ICCG3694; SEQ ID NO: 58, Obrázok 32) a pPICZalphaE'ElsH6 (ICCG3475; SEQ ID NO: 59, Obrázok 33), v uvedenom poradí.
117
PRÍKLAD 12
KONŠTRUKCIA VEKTORA pPICZalphaD'E2sH6 A pPICZalphaE Έ2εΗ6
Kyvadlové vektory pPICZalphaD' a pPICZalphaE' boli skonštruované spôsobom opísaným v príklade 11.
Sekvencia kódujúca E2-H6 bola izolovaná ako Sali/KpnI fragment z plazmidu pBSK-E2sH6 (SEQ ID NO: 45, Obrázok 23). Fragment bol purifikovaný s použitím súpravy na gélovú extrakciu (Qiagen) po separácii produktu štiepenia na 1% agarózovom géli. Výsledný fragment bol pripravený so zarovnanými koncami (použitím T4 DNA polymerázy) a ligovaný do buď pPICZalphaD' alebo do pPICZalphaE' priamo za príslušné štepiace miesto úpravovej proteázy.
Bunky E. coli TOPIOF' boli transformované s ligačnou zmesou a plazmidová DNA z niekolkých kolónií rezistentných na zeocín bola analyzovaná štiepením s reštrikčnými enzýmami. Pozitívne klony boli odobrané a označené ako pPICZalphaD'E2sH6 (ICCG3692; SEQ ID NO: 60, Obrázok 34) a pPICZalphaE'E2sH6 (ICGG3476; SEQ ID NO: 61, Obrázok 35), v uvedenom poradí.
PRÍKLAD 13
TRANSFORMÁCIA PICHIA PASTORIS A SELEKCIA TRANSFORMANTOV
Kyvadlové plazmidy pre P. pastoris, opísané v príkladoch 11 a 12, boli transformované do buniek P. pastoris podľa doporučenia výrobcu (Invitrogen). Kmene produkujúce El a E2 boli odobrané na ďalšiu charakterizáciu.
118
Obalové proteíny HCV boli exprimované v P. pastoris, čo je kvasnicový kmeň, o ktorom je dobre známe, že u neho je normálne hyperglykosylácia neprítomná (Gellissen, G. 2000) a už skôr bol použitý na expresiu proteínu E z vírusu tropickej horúčky v podobe fúzneho proteínu GST (Sugrue, R. J. et al. 1997). Obalové proteíny HCV, rezultujúce z expresie v P. pastoris, pozoruhodne vykazovali porovnateľnú glykosyláciu, aká je pozorovaná u divokých typov kmeňov Saccharomyces. Konkrétnejšie, obalové proteíny HCV, produkované v P. pastoris, sú hyperglykosylované (Podía molekulovej hmotnosti produktov expresie stanovenej vo Western-blottingu proteínov izolovaných z transformovaných buniek P. pastoris).
PRÍKLAD 14
PODMIENKY KULTIVÁCIE PRE SACCHAROMYCES CEREVISIAE, HANSENULA POLYMORPHA A PICHIA PASTORIS
Saccharomyces cerevisiae
Príprava bunkovej banky
Z vybraného rekombinantného klonu bola pripravená základná bunková banka a pracovná bunková banka. Zmrazené vzorky vo fiólách boli pripravené zo strednej exponenciálnej fázy rastu kultúry, pestovanej v trepaných flašiach (podmienky inkubácie boli zhodné ako u inokulačných kultúr, pozri nižšie). Ako kryoprotektívna látka bol pridaný glycerol (na konečnú 50% koncentráciu).
Fermentácia
Inokulačné kultúry boli získané z fľaštičiek so zmrazenými bunkami z pracovnej banky a boli pestované v 500 ml
119 média (YNB doplnené s 2 % sacharózy, Difco) vo 2litrových Erlenmeyerových trepaných bankách pri 37 °C, 200 otáčkach za minútu a počas 48 hodín.
Fermentácie boli bežne uskutočňované vo fermentoroch Biostat C s pracovným objemom 15 litrov (B. Braun Int., Melsungen, Germany). Fermentačné médium obsahovalo 1 % kvasnicového extraktu (Yeast Extract), 2 % Peptonu a 2 % sacharózy ako zdroja uhlíka. Ako protipeniace činidlo bol použitý polyetylénglykol.
Teplota, pH a rozpustený kyslík boli bežne počas fermentácie kontrolované a riadené, použiteľné parametre sú súhrnne uvedené v tabuľke 1. Rozpustený kyslík bol kaskádovito riadený pomocou miešania/prevzdušnenia. Hodnota pH bola riadená prídavkami NaOH (0,5M) alebo roztoku H3PO4 (8,5%).
Tabulka 1. Špecifické parametre pre fermentácie S. cerevisiae
Parameter Rozmedzie
teplota 33 - 37 °C
PH 4,2 - 5,0
DO (fáza rastu) 10 - 40 % nasýtenie vzduchom
DO (indukcia) 0 - 5 %
aerácia 0,5 - 1,8 wm*
miešanie 150 - 900 rpm
* výmena objemu za minútu rpm - otáčky za minútu
Fermentácia bola zahájená pridaním 10 % inokulačnej kultúry. Počas fázy rastu bola sledovaná koncentrácia
120 sacharózy analýzou HPLC off-line (Polysphere Column OAKC Merck).
Počas fázy rastu bol obsah rozpusteného kyslíka riadený kaskádovým riadením (miešanie/prevzdušnenie). Po úplnom zmetabolizovaní sacharózy bola produkcia heterologných proteínov riadená endogenne produkovaným etanolom doplneným s postupne pridávaným EtOH tak, aby bola koncentrácia udržiavaná približne na hodnote 0,5 % (HPLC analýza off-line, stĺpec „polyshper OAKC) Počas tejto indukčnej fázy bol rozpustený kyslík kontrolovaný a udržiavaný pod 5% nasýteným vzduchom, ručnou úpravou alebo úpravou rýchlosti prevzdušňovania a rýchlosti miešania.
Fermentačné produkty boli typicky zbierané 48 až 72 hodín po indukcii zakoncentrovaním s tangenciálnou prietokovou filtráciou, nasledovanou centrifugáciou zakoncentrovaných bunkových suspenzií tak, aby boli získané bunkové pelety. Pokial neboli bunkové pelety analyzované bezprostredne, boli uchovávané pri -70° C.
Hansenula polymorpha
Príprava bunkovej banky
Z vybraného rekombinantného klonu bola pripravená základná bunková banka a pracovná bunková banka.
Zmrazené vzorky vo fóliách boli pripravené zo strednej exponenciálnej fázy rastu kultúry, pestovanej v trepaných fľašiach (podmienky inkubácie boli zhodné ako u inokulačných
121 kultúr, pozri nižšie). Ako kryoprotektívna látka bol pridaný glycerol (na konečnú 50% koncentráciu).
Fermentácia
Inokulačné kultúry boli získané z flaštičiek so zmrazenými bunkami (-70° C) z pracovnej banky a boli pestované v 500 ml média (YNB, Difco) vo 21itrových Erlenmeyerových trepaných bankách pri 37 °C, 200 otáčkach za minútu a počas 48 hodín.
Fermentácie boli bežne uskutočňované vo fermentoroch Biostat C s pracovným objemom 15 litrov (B. Braun Int., Melsungen, Germany). Fermentačné médium obsahovalo 1 % kvasnicového extraktu (Yeast Extract), 2 % Peptónu a 1 % glycerolu ako zdroja uhlíka. Ako protipeniace činidlo bol použitý polyetylénglykol.
Teplota, pH, prívod vzduchu a rozpustený kyslík boli bežne počas fermentácie kontrolované a riadené, použitelné parametre sú súhrnne uvedené v tabuľke 2. Rozpustený kyslík bol riadený miešaním. Hodnota pH bola riadená prídavkami NaOH (0,5M) alebo roztoku H3PO4 (8,5%).
Tabuľka 2. Špecifické parametre pre fermentácie H. polymorpha
Parameter Rozmedzie
teplota 30 - 40° C
PH 4,2 - 5,0
DO (fáza rastu) 10 - 40 % nasýtenie vzduchom
aerácia 0,5 - 1,8 wm*
miešanie 150 - 900 rpm
122 * výmena objemu za minútu rpm - otáčky za minútu
Fermentácia bola zahájená pridaním 10 % inokulačnej kultúry. Počas fázy rastu bola sledovaná koncentrácia glycerolu off-line (Polysphere Column OAKC Merck) a 24 hodín po úplnom spotrebovaní glycerolu sa pridalo 1 % metanolu, aby bola indukovaná expresia heterológnych proteínov. Fermentačné produkty boli zbierané 24 hodín po indukcii zakoncentrovaním s tangenciálnou prietokovou filtráciou, nasledovanou centrifugáciou zákoneentrovaných bunkových suspenzií tak, aby boli získané bunkové pelety. Pokiaľ neboli bunkové pelety analyzované bezprostredne, boli uchovávané pri -70 °C.
Pichía pastori s
Pokusy s produkciou proteínov v rekombinantnej Pichla pastoris boli v malom meradle uskutočňované v kultúrach v trepaných fľašiach. Inokulačné kultúry boli pestované cez noc v médii YPD (Difco). Východzie pH média bolo upravené na 4,5. Trepané fľaše boli inkubované na rotačnej trepačke pri 200 250 otáčkach za minútu a 37° C.
Produkcia v malom meradle bola typicky uskutočňovaná v objeme 500 ml vo 21itrových bankách a bola zahájená s 10% inokuláciou do média na expresiu, obsahujúcim 1 % kvasnicového extraktu (Yeast extract), 2 % Peptónu (oba Difco) a 2 % glycerolu ako zdroja uhlíka. Podmienky na inkubáciu boli zhodné ako pre inokulačnú kultúru. Indukcia bola zahájená pridaním 1 % MeOH približne 72 hodín po inokulácii. Bunky sa zbierali 24 hodín po indukcii pomocou centrifugácie. Pokial
123 neboli bunkové pelety analyzované bezprostredne, boli uchovávané pri -70° C.
PRÍKLAD 15
ODSTRÁNENIE VEDÚCEHO PEPTIDU Z PROTEÍNU MF0C-E1-H6 A MF0C-E2-H6,
EXPRIMOVANÝCH VO VYBRANÝCH KMEŇOCH KVASNÍC
Ďalej boli analyzované produkty expresie proteínových konštruktov HCV El a E2 s vedúcou sekvenciou a-párovacieho faktora (a MF) zo S. cerevisiae v Hansenula polymorpha a v glykosylačne negatívnom kmeni Saccharomyces cerevisiae. Pretože ako genotyp lb HCV Els (aminokyseliny 192-326), tak HCV E2s (aminokyseliny 383-673, predĺžený so sekvenciou VIEGR (SEQ ID NO: 69) ) boli exprimované s „his identifikátorovou značkou na C-konci (H6, HHHHHH, SEQ ID NO: 63 - tieto proteíny sú ďalej v tomto Príklade označované ako ccMF-El-H6 a ctMF-E2H6), rýchla a účinná purifikácia produktov expresie po solubilizácii buniek kvasníc s guanidínium chloridom(GuHCl) bola uskutočňovaná na Ni-IDA (Ni-imínodioctová kyselina). Jednoducho povedané, bunkové pelety boli resuspendované v mM fosfátu, 6 M GuHCl, pH 7,4 (9 objemov/g buniek). Proteíny boli sulfónované cez noc pri teplote miestnosti (room temperature, RT) za prítomnosti 320 mM (4% hmotn./objem) siričitanu sodného a 65 mM (2% hmotn./objem) tetrationátu sodného. Lyzát bol po jednom cykle zmrazenie-rozpustenie vyčistený centrifugáciou (10 000 g, 30 min ,4 °C) a k supernatantu boli pridané Empigen (Albright & Wilson, UK) a imidazol na konečnú koncentráciu 1 % (hmotn./objem) a 20 mM, v uvedenom poradí. Vzorka bola filtrovaná (0,22 μΜ) a nanesená na stĺpec Ni-IDA Sepharose FF, ktorý bol ekvilibrovaný s 50 mM fosfátom, 6 M GuHCl, 1% Empigen (pufor A) doplneným s 20 mM
124 imidazolu. Stĺpec bol postupne premytý s pufrom A obsahujúcim 20 mM a 50 mM imidazolu, v uvedenom poradí, dokial absorbancia pri 280 nm nedosiahla základnú úroveň. Produkty s His-značkou boli eluované pôsobením pufru D, 50 mM fosfát, 6M GuHCl, 0,2 % (pre El) alebo 1 % (pro E2) Empigen, 200 mM imidazol. Eluované materiály boli analyzované s SDS-PAGE a Western-blottingom s použitím špecifických monoklonálnych protilátok namierených proti El (IGH201), alebo E2 (IGH212).
Produkty El boli bezprostredne analyzované Edmanovým odbúravaním.
Vzhľadom na to, že SDS-PAGE odhalila už velmi komplexný obraz proteínových pásov pre E2, bola uskutočňovaná ďalšia frakcionácia s gélovou chromatografiou (size exclusion chromatography). Eluát Ni-IDA bol skoncentrovaný ultrafiltráciou (MWCO 10 kDa, centriplus, Amicon, Millipore) a nanesený na Superdex G200 (10/30 alebo 16/60; Pharmacia) v PBS, 1% Empigen alebo PBS, 3 % Empigen. Elučné frakcie, obsahujúce produkty E2, s molekulovou hmotnosťou Mr medzi ~80 kDa a ~45 kDa, napríklad frakcie 17-23 z elučného profilu podľa Obrázku 37 vzniknuté migráciou na SDS-PAGE (Obrázok 38), boli spojené a alkylované (inkubáciou s 10 mM DTT, 3 hodiny pri teplote miestnosti, nasledovanou inkubáciou s 30 mM jódacetamidu počas 3 hodín pri teplote miestnosti). Vzorky na aminotermináľne sekvenovanie boli podrobené pôsobeniu Endo H (Roche Biochemicals), alebo sa nechali bez jej pôsobenia. Glykosylované a deglykosylované produkty E2 boli nanesené na PVDF-membrány na aminoterminálne sekvenovanie. Blot glykosylovaného a deglykosylovaného E2 zafarbený amidovou čerňou je znázornený na Obrázku 39.
125
Sekvenovanie obidvoch purifikovaných produktov El a E2 viedlo na prekvapujúce zistenie, že odstránenie signálnej sekvencie z obalových proteínov HCV sa objavuje len čiastočne (pozri Tabulka 3) . Okrem toho je väčšina vedľajších produktov (produkty degradácie a produkty doposiaľ obsahujúce vedúcu sekvenciu alebo jej časť) glykosylovaných. Táto glykosylácia je dokonca aj v časti na neodštiepenom fragmente signálnej sekvencie, ktorá též obsahuje N-glykosylačné miesto. Glykosylačné miesta môžu byť mutované tak, aby bolo dosiahnutých menej glykosylovaných vedľajších produktov. Oveľa viac závažným je ale zistenie, že niektoré alternatívne štiepené produkty majú odlišnosť len v 1 až 4 aminokyselinách v porovnaní s požadovaným intaktným obalovým proteínom. Z tohto dôvodu je purifikácia správne upravených produktov fakticky nemožná vzhľadom na to, že neexistujú dostatočné rozlišovacie biochemické charakteristiky medzi rôznymi produktami expresie. Niekolko z degradačných produktov môže byť výsledkom štiepenia podobného Kex-2 (napríklad štiepenie pozorované za aminokyselinou 196 v El, čo je štiepenie za arginínom), ktoré je tiež požadované na odštiepenie vedúceho peptidu α-párovacieho faktora a ktoré tak nemôže byť blokované, aby tak nebol narušený tento nepostrádateľný proces.
Bol porovnávaný kloň s vysokou produkciou El, získaný transformáciou S. cerevisiae IYCC155 s pSYlYIG7Els (SEQ ID NO: 50,- Obrázok 28) s klonom s vysokou produkciou, ktorý bol získaný transformáciou S cerevisiae IYCC155 s pSYlaMFElsH6aYIGlEls (SEQ ID NO: 44; Obrázok 22).
Vnútrobunková expresia proteínu El bola hodnotená 2 až 7 dní
126 po indukcii, to znamená, že bol použitý Western-blotting so špecifickou monoklonálnou protilátkou proti El (IGH 201) . Ako je možné usudzovať z Obrázku 40, maximálna expresia bola pozorovaná u obidvoch kmeňov po 2 dňoch, ale vzory expresie pre obidva kmene sú úplne odlišné. Expresia s vedúcim peptidom α-párovacieho faktora vedie k velmi komplexnému vzoru pásov, ktorý je dôsledkom skutočnosti, že úprava (odštiepenie) vedúceho proteinu nie je účinná. Táto skutočnosť vedie k niekoľkým produktom expresie s odlišnými aminokoncami, z ktorých niektoré sú modifikované s 1 až 5 N-glykosyláciami. Pre El, exprimovaný s vedúcim peptidom CL, je ale pozorovateľný obmedzený počet odlišných pásov, čo reflektuje vysokú úroveň správneho odstránenia vedúceho peptidu a skutočnosť, že len takto správne upravený materiál môže byť modifikovaný s N-glykosyláciou (1 až 5 reťazcov) tak, ako bolo pozorované u proteinu El, exprimovanom v Hansenula s rovnakým vedúcim peptidom CL (pozri Príklad 16).
Hybridomová bunková línia produkujúca monoklonálnu protilátku namierenú proti El (IGH201) bola uložená 12. marca 1998 podlá podmienok Budapeštianskej dohody v European Collection of Celí Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, UK, a má prírastkové číslo ECACC 98031216. Monoklonálna protilátka namierená proti E2 (IGH212) bola opísaná ako protilátka 12D11F2 v príklade 7.4 v Maertens et al. vo WO96/04385.
127
Tabuľka 3. Identifikácia N-koncov proteínov aMF-El-H6 a aMFE2-H6, exprimovaných v S. cerevisiae alebo H .polymorpha. Na základe N-terminálneho sekvenovania bolo možné odhadnúť množstvo N-koncov v zrelých proteínoch E1-H6 a Ξ2-Η6 („zrelosť indikuje správne odstránenie signálnej sekvencie α MF) . Celkové množstvo proteínových produktov bolo vypočítané ako pmol proteínu na základe intenzity píkov získaných Edmanovým odbúravaním. Nasledovne bolo pre každý špecifický protein (to je pre každý „detegovaný N-koniec) stanovené % mol versus celkové množstvo.
128
Kvasníca 0CMF-E1-H6 OMF-E2-VIEGR-H6
S. cerevisiae Pokus 1 : - 16% proteínov stále obsahujúcich sekvencie aMF -18 % proteínov štiepených medzi aa 195 a 196 proteínu E1 - 66 % proteínov so správne odstránenou sekvenciou α MF Pokus 2 / /
- 18 % proteínov stále obsahujúcich sekvencie aMF - 33 % proteínov štiepených medzi aa 195 a 196 proteínu E1 - 8 % iných proteínov iných produktov štiepenia E1 - 44 % proteínov so správne odstránenou sekvenciou α MF
H. polymorpha - 64 % proteínov stále obsahujúcich sekvencie aMF - 6 % proteínov štiepených medzi aa 192 a 193 proteínu E1 - 30 % proteínov so správne odstránenou sekvenciou α MF - 75 % proteínov stále obsahujúcich sekvencie α MF - 30 % proteínov so správne odstránenou sekvenciou α MF
PRÍKLAD 16
EXPRESIA KONŠTRUKTU E1 V KVASNICIACH, VHODNÝCH NA PRODUKCIU A PURIFIKÁCIU VO VEĽKOM MERADLE
Bolo použitých niekoľko ďalších vedúcich sekvencii na zámenu vedúceho peptidu a MF zo S. cerevisiae za sekvenciu vybranú zo skupiny zahŕňajúcej CHH (vedúca sekvencia
129 hyperglykemického hormónu z Carcinus maenas], Amyl (vedúca sekvencia amylázy zo S. Occidental i s}, Gam 1 (vedúca sekvencia glukoamylázy zo S. Occidental i s}, Phy5 (vedúca sekvencia hubovej fytázy), phol (vedúca sekvencia kyslej fosfatázy z Píchia pastoris) a CL (vedúca sekvencia opičieho lysozýmu C, 1,4-beta-N-acetylmuramidáza C), ktoré boli pripojené k E1-H6 (napríklad El s C-koncovým his-tag). Všetky konštrukty boli exprimované v Hansenula polymorpha a každý z výsledných bunkových lyzátov bol podrobený analýze Western blot. Na základe výsledkov bolo možné povedať, že rozsah odstránenia vedúcej alebo signálnej sekvencie alebo peptidu bol extrémne nízky s výnimkou konštruktu, v ktorom je použitý ako vedúci peptid CL. Toto zistenie bolo potvrdené pre konštrukt CHH-E1H6 Edmanovým odbúravaním materiálu purifikovaného na Ni-IDA: nebolo možné detegovať žiadny správne štiepený produkt, aj keď sa získalo niekolko odlišných sekvencií (pozri Tabulka 4).
Tabulka 4. Identifikácia N-koncov proteínov CHH-E1-H6, exprimovaných v H. polymorpha, na základe sekvenovania aminokyselín od N-konca u rôznych proteínových pásoch po separácii s SDS-PAGE a nanesení na PVFD membráne
Molekulová hmotnosť Identifikovaný N-koniec
4 5 kD začína u aminokyseliny 37 vedúceho peptidu CHH = len pre-sekvencia je odštiepená, pro- -sekvencia je stále pripojená
2 6 kD - čiastočne začína u aminokyseliny 1 vedúceho peptidu CHH = nebola odstránená pre-pro- -sekvencia
130
čiastočne začína u aminokyseliny 9 vedúceho peptidu CHH = produkt alternatívnej translácie začínajúci u druhého kodónu AUG
24 kD - čiastočne začína u aminokyseliny 1 vedúceho peptidu CHH = nebola odstránená pre-pro- -sekvencia - čiastočne začína u aminokyseliny 9 vedúceho peptidu CHH - produkt alternatívnej translácie začínajúci u druhého kodónu AUG
Ako už bolo vyššie uvedené, Western-bloty z bunkových lyzátov odhalili vzory El špecifických proteínových pásov, naznačujúce, že bol uskutočnený vysoký stupeň správneho odstránenia vedúceho peptidu CL. Toto je prekvapujúce, lebo vedúci peptid nie je aminokyselín Edmanovým odvodený z kvasníc. Sekvenovanie odbúravaním materiálu, ktorý bol solubilizovaný s GuHCl a purifikovaný na Ni-IDA, vskutku potvrdilo, že 84 % proteínov El je správne štiepených a materiál je v podstate bez degradačných produktov. Ešte 16 % neupraveného materiálu je prítomných, ale vzhladom na to, že tento materiál nie je glykosylovaný, môže byť jednoducho zo zmesi odstránený, čím je umožnené špecifické obohatenie správne štiepeného a glykosylovaného El. Metódou takého obohatenia môže byť afinitná chromatografia na lektíne, iné alternatívy sú tiež uvedené v príklade 19. V inom uskutočnení môže byť použitý materiál s vyššou hydrofobicitou na výber a optimalizáciu iných obohacovacích postupov. Správne odstránenie vedúceho peptidu CL z proteínu CL-E1-H6 bolo ďalej potvrdené hmotovou spektroskopiou, ktorá tiež potvrdila, že až
131 z 5 N-glykosylačných miest genotypu 1b Els môže byť obsadené, zatiaľ čo sekvencia NNSS (aminokyseliny 233 až 236 ; SEQ ID NO: 73) je považovaná za osamelé N-glykosylačné miesto.
PRÍKLAD 17
PURIFIKÁCIA A BIOCHEMICKÁ CHARAKTERIZÁCIA PROTEÍNU HCV E2, EXPRIMOVANOM V HANSENULA POLYMORPHA Z KONŠTRUKTU KÓDUJÚCOM CLE2-H6
Bola analyzovaná účinnosť odstránenia vedúceho peptidu CL z proteínu CL-E2-VIEGR-H6 (ďalej v tomto príklade označovaný ako „CL-E2-H6), exprimovaného v Hansenula polymorpha. Vzhľadom na to, že HCV E2s (aminokyseliny 383-673) bol exprimovaný ako his-označený (his-tagged) proteín, bola uskutočňovaná rýchla a účinná purifikácia exprimovaného proteínu na Ni-IDA po GuHCl solubilizácii zobraných buniek. Stručne povedané, bunkové pelety boli resuspendované v 30 mM fosfátu, 6 M GuHCl, pH 7,2 (9 ml pufru/g buniek). Proteín bol sulfónovaný cez noc pri teplote miestnosti za prítomnosti 320 mM (4 % hmotn./objem) siričitanu sodného a 65 mM (2 % hmotn./objem) tetrationátu sodného. Lyzát bol po jednom cykle zmrazenie-rozpustenie vyčistený centrifugáciou (10 000 g, 30 minút, 4 °C) . Boli pridané Empigen BB (Albright & Wilson) a imidazol na konečnú koncentráciu 1 % (hmotn./objem) a 20 mM, v uvedenom poradí. Všetky dalšie chromatografické kroky boli uskutočňované na zariadení Aktá FPLC workstation (Pharmacia). Vzorka bola filtrovaná cez membránu s veľkosťou pórov 0,22 μπι (celulózo acetát) a nanesený na stĺpec Ni-IDA (chelatačná Sepharosa FF nasýtená s Ni2'1', Pharmacia) , ktorý bol ekvilibrovaný s 50 mM fosfátu, 6 M GuHCl, 1 % Empigen BB, pH 7,2 (pufor A) s doplnkom 20 mM imidazolu. Stĺpec bol postupne
132 premytý s pufrom A obsahujúcim 20 mM a 50 mM imidazolu, v uvedenom poradí, dokiaľ nedosiahla absorbancia pri 280 nm základnú úroveň. His-označené produkty boli eluované aplikáciou pufru D, 50 mM fosfát, 6 M GuHCl, 0,2 % Empigen BB (pH 7,2), 200 mM imidazolu. Purifikované materiály boli analyzované s SDS-PAGE a Western blottingom s použitím špecifickej monoklonálnej protilátky namierenej proti E2(IGH212) (Obrázok 41). Proteín E2-H6 purifikovaný cez IMAC bol tiež podrobený N-terminálnemu sekvenovaniu Edmanovým odbúravaním. Preto bolo na proteíny pôsobené N-glykosidázou F (Roche) (0,2 U/^g E2, 1 hodina inkubácie pri 37° C v PBS/3 %
Empigen BB) , alebo boli ponechané bez akéhokoľvek pôsobenia. Glykosylované a deglykosylované proteíny E2-H6 boli podrobené SDS-PAGE a nanesené (blotované) na membránu PVDF na stanovenie sekvencie aminokyselín (analýza bola uskutočňovaná na proteínovom sekvenátori PROCISE™ 492, Applied Biosystems). Vzhladom na to, že v tomto stupni boli metódou SDS-PAGE zistené nejaké produkty degradácie, bola uskutočňovaná ďalšia fakcionácia pomocou gélovej chromatografie. K tomu bol Ni-IDA eluát koncentrovaný ultrafíltráciou (MWCO 10 kDa, centriplus, Amicon, Millipore) a nanesený na Superdex G200 (Pharmacia) v PBS, 1 % Empigen BB. Elučné frakcie, obsahujúce najmä intaktné produkty príbuzné s E2s so zjavnou molekulovou hmotnosťou Mr medzi ~30 kD a ~70 kDa, stanovenou migráciou na SDS-PAGE, boli spojené a prípadne alkylované (inkubáciou s 5 mM DTT počas 30 minút pri 37° C, nasledovanou inkubáciou s 20 mM jódacetamidu počas 30 minút pri 37° C) . Možná prítomnosť degradačných produktov po purifikácii IMAC môže tak byť prekonaná ďalšou frakcionáciou intaktného produktu s použitím gélovej chromatografie. Bol dosiahnutý neočakávane dobrý výsledok. S využitím N-terminálneho sekvenovania je možné
133 stanoviť množstvo produktu E2, z ktorého bol odstránený vedúci peptid CL. Celkové množstvo proteínových produktov je počítané v pmol proteíne podľa intenzity pikov získaných v Edmanovom odbúravaní. Nasledovne je pre každý špecifický proteín (napríklad pre každý „detegovaný N-koniec) stanovené % mol versus celkové množstvo. V tomto pokuse bol detegovaný len správny N-koniec proteinu E2-H6 a iné varianty E2-H6 postrádajúce aminokyseliny z proteinu E2, alebo obsahujúce Nterminálny aminokyseliny, ktoré nie sú súčasťou proteinu E2, neboli prítomné. Je možné povedať, že proteín E2-H6, exprimovaný v H. polymorpha ako proteín CL-E2-H6, bol izolovaný bez akejkoľvek ďalšej úpravy in vitro ako z > 95 % správne štiepený proteín. Toto zistenie je v príkrom protiklade s presnosťou odstránenia vedúceho peptidu s H. polymorpha pri úprave proteinu a MF-E2-H6 na proteín E2-H6, u ktorej bolo stanovené, že sa vyskytuje u 25 % izolovaných proteínov (pozri Tabulka 3).
PRÍKLAD 18
PURIFIKÁCIA A BIOCHEMICKÁ CHARAKTERIZÁCIA PROTEINU HCV El, EXPRIMOVANOM V HANSENULA POLYMORPHA Z KONŠTRUKTU KÓDUJÚCOM CLH6-K-E1 A IN VITRO ÚPRAVA PROTEÍNOV OBSAHUJÚCICH H6
Bola analyzovaná účinnosť odstránenia vedúceho peptidu CL z proteinu CL-H6-K-E1, exprimovaného v Hansenula polymorpha, rovnako ako účinnosť následnej úpravy in vitro tak, aby bol odstránený H6 (his-tag)-adaptorový peptid a miesto úpravy Endo Lys-C. Vzhľadom na to, že HCV Els (aminokyseliny 192-326) bol exprimovaný ako proteín označený s his-K značkou na N-konci (his-K-tagged), to je CL-H6-K-E1, mohla byť uskutočnená rýchla a účinná purifikácia tak, ako je opísané v príklade 17. Elučný
134 profil z IMAC-chromatografickej purifikácie proteínov H6-K-E1 (a prípadných reziduálnych CL-H6-K-E1 proteínov) je znázornený na Obrázku 42. Po SDS-PAGE a farbenie gélu striebrom a analýze Western-blotting, používajúcej monoklonálnu protilátku namierenú proti El (IGH201) (Obrázok 43), boli elučné frakcie (63-69) obsahujúce rekombinantné produkty Els, spojené („IMAC pool) a podrobené cez noc pôsobeniu endoproteinázy Lys-C (Roche) (pomer enzým/substrát 1/50 (hmotn./hmotn.), 37 °C) ) tak, aby bolo odstránené fúzované predĺženie H6-K. Odstránenie neupravených fúznych produktov bolo uskutočnené krokom negatívnej IMAC chromatografie na stĺpci Ni-IDA, v ktorej sú proteíny upravené s endo-Lys-C zbierané do pretekajúcej frakcie. Na to bola vzorka proteínu štiepená s endoproteinázou Lys-C nanesená na stĺpec Ni-IDA po lOnásobnom riedení s 10 mM NaH2P04 · 3H2O, 1 % (objem/objem) , Empigen B, pH 7,2 (pufor B), s následným premývaním s pufrom B, dokial absorbancia pri 280 nm nedosiahla základnú úroveň. Pretekajúci prúd bol odoberaný do rôznych frakcií (1-40) , ktoré boli screenované na prítomnosť produktov Els (Obrázok 44). Frakcie (7-28), obsahujúce intaktný El, z ktorého bolo N-koncové predĺženie H6-K (a eventuálne reziduálne CL-H6-K) odstránené (so zrejmou molekulovou hmotnosťou Mr medzi ~ 15 kDa a ~ 30 kDa, stanovenou SDS-PAGE po farbení striebrom alebo analýzou Western blotting s použitím špecifickej monoklonálnej protilátky namierenej proti El (IGH201)) , boli spojené a prípadne alkylované (inkubáciou s 5 mM DTT počas 30 minút pri 3 7 °C, s následnou inkubáciou s 20 mM jódacetamidu počas 3 0 minút pri 37 °C).
Tento materiál bol podrobený N-terminálnemu sekvenovaniu (Edmanovo odbúravanie) . Preto bolo na proteínové vzorky
135 pôsobené N-glykosidázou F (Roche) (0,2 U/pg El, 1 hodina inkubácie pri 37° C v PBS/3 % Empigen BB) , alebo boli ponechané bez akéhokoľvek pôsobenia. Glykosylované a deglykosylované proteíny El bolí oddelené s SDS-PAGE a nanesené (blotované) na membránu PVDF na ďalšiu analýzu Edmanovým odbúravaním (analýza bola uskutočňovaná na proteínovom sekvenátori PROCISE™ 492, Applied Biosystems). Na základe N-terminálneho sekvenovania mohlo byť stanovené množstvo správne upraveného produktu El (úprava zahŕňa správne odštiepenie sekvencie H6-K). Celkové množstvo proteínových produktov je vypočítané v pmol proteíne podľa intenzity píkov získaných v Edmanovom odbúravaní. Nasledovne je pre každý špecifický proteín (napríklad pre každý „detegovaný N-koniec) stanovené % mol versus celkové množstvo. V tomto pokuse bol detegovaný len správny N-koniec proteínu El a nie N-konce iných variantov H6-K-E1. Potom bolo stanovené, že úprava proteínu H6-K-E1 (prípadne reziduálneho CL-H6-K-E1) in vitro s Endo-Lys-C na proteín El sa vyskytuje s presnosťou väčšou ako 95 %.
PRÍKLAD 19
ŠPECIFICKÉ ODSTRÁNENIE FORIEM HCV El S „LOW-GLYKOSYLÁCIOU POMOCOU HEPARÍNU
Na nájdenie špecifických purifikačných krokov pre obalové proteíny HCV z buniek kvasníc bola stanovená ich väzba s heparínom. Je známe, že heparín sa viaže s radom vírusov, a preto už bolo doporučené stanovenie väzby obalu HCV (Garson, J. A. et al. 1999). Aby mohla byť analyzovaná táto potenciálna väzba, bol heparín biotinylovaný a bola analyzovaná interakcia s HCV El na mikrotitračných doštičkách potiahnutých s buď
136 sulfónovaným HCV El z H.polymorpha, alkylovaným HCV El z H. polymorpha (obidva produkované tak, ako je opísané v príklade 16) , alebo s alkylovaným HCV El z kultúry cicavčích buniek, transfekovaných s vektorom na expresiu vo víruse vaccinia. Prekvapivo silná väzba mohla byť pozorovaná len so sulfónovaným HCV El z H.polymorpha, zatiaľ čo väzba s HCV El z kultúry cicavčích buniek bola celkom neprítomná. S použitím metódy Western-blotting bolo možné preukázať, že táto väzba bola špecifická pre pásy s nižšou molekulovou hmotnosťou v proteínovej zmesi HCV El (Obrázok 45), čo korešponduje s nízko glykosylovanou podstatou HCV Els. Obrázok 45 tiež ukazuje, že sulfonácia nie je nutná pre väzbu s heparínom, lebo po odstránení tejto sulfonácie je stále pozorovaná väzba u El s nízkou molekulovou hmotnosťou (línia 4). Inak povedané, alkylácia podstatne redukuje túto väzbu, ale toto môže byť spôsobené špecifickým alkylačným činidlom (jódacetamidom), použitým v danom príklade. Tento nález ďalej demonštroval priemyselnú využiteľnosť obalových expresívnych kaziet na kvasnice CL-HCV, lebo je možné špecificky obohatiť preparáty HCV El v zmysle získania preparátov s proteínmi HCV El s vyšším stupňom glykosylácie (napríklad tým, že je obsadené viacej glykosylačných miest) .
PRÍKLAD 20
TVORBA A ANALÝZA ČASTÍC PODOBNÝCH VÍRUSU (VIRUS-LIKE PARTICLES, VLPs)
Premena obalových proteinov HCV El a E2, exprimovaných v H. polymorpha (Príklady 16 až 18) na VLPs bola uskutočňovaná v podstate tak, ako opisujú Depla et al. vo WO99/67285 a
137
Bosman et al. vo W001/30815. Stručne povedané, po kultivácii transformovaných buniek H.polymorpha, počas ktorej sú exprimované obalové proteiny HCV, boli bunky zbierané, lýzované v GuHCl a sulfónované tak, ako je opísané v príklade 17. Proteiny označené His-tag boli nasledovne purifikované s IMAC a koncentrované s ultrafiltráciou tak, ako je opísané v príklade 17.
Tvorba VLP z obalových proteínov HCV so sultónovanými Cys—tiólovými skupinami
Koncentrované obalové proteiny HCV sulfónované počas izolačného postupu neboli podrobené redukcii a boli nanesené na stĺpec gélovej chromatografie (Superdex G200, Pharmacia) ekvilibrovaný s PBS, 1 % (objem/objem) Empigen. Eluované frakcie boli analyzované s SDS-PAGE a Western blottingom. Frakcie s relatívnou molekulovou hmotnosťou Mr ~ 29-15 kD (stanovenou na základe migrácie v SDS-PAGE) boli spojené, zakoncentrované a nanesené na Superdex G200, ekvilibrované s PBS, 3 % (hmotn./objem) betaín, na posilnenie tvorby častíc podobných vírusu (vírus like particle, VLP) . Frakcie boli spojené, zakoncentrované a odsolené do PBS, 0,5% (hmotn./objem) betaín.
Tvorba VLP z obalových proteínov HCV s ireverzibilno modifikovanými Cys—tiólovými skupinami
Koncentrované obalové proteiny HCV sulfónované počas izolačného postupu boli podrobené redukčnému pôsobeniu (inkubácia za prítomnosti 5 mM DTT v PBS) na premenu sulfónovaných Cys-tiólových skupín na voľné Cys-tiólové
138 skupiny. Ireverzibilná modifikácia Cys-tiólových skupín bola uskutočnená (i) inkubáciou pod dobu 30 minút za prítomnosti 20 mM jódacetamidu, alebo (ii) inkubáciou počas 30 minút za prítomnosti 5 mM N-etylmaleimidu (NEM) a 15 mM biotín-Netylmaleimidu. Nasledovne boli proteíny nanesené na stĺpec gélovej chromatografie (Superdex G200, Pharmacia) ekvilibrovaný s PBS, 1 % (objem/objem) Empigen v prípade blokovania s jódacetamidom, alebo s PBS, 0,2 % CHAPS v prípade blokovania s NEM a biotín-NEM. Eluované frakcie boli analyzované s SDS-PAGE a Western blottingom. Frakcie s relatívnou molekulovou hmotnosťou Mr ~ 29 - -15 kD (stanovenou na základe migráce v SDS-PAGE) boli spojené, zakoncentrované a na posilnenie tvorby častíc podobných vírusu boli nanesené na stĺpec Superdex G200 ekvilibrovaný s PBS, 3% (hmotn./objem) betaín. Frakcie boli spojené, zakoncentrované a odsolené do PBS, 0,5% (hmotn./objem) betaín v prípade blokovania s j ódacetamidom, alebo s PBS, 0,05 % CHAPS v prípade blokovania s NEM a biotín-NEM.
Tvorba VLP z obalových proteínov modifikovanými Cys—tiólovými skupinami
HCV s reverzibilno
Koncentrované obalové proteíny HCV sulfonované počas izolačného postupu boli (inkubácia za prítomnosti podrobené redukčnému pôsobeniu mM DTT v PBS) na premenu sulfónovaných Cys-tiólových skupín na volné Cys-tiólové skupiny. Reverzibilná modifikácia Cys-tiólových skupín bola uskutočnená inkubáciou počas 30 minút za prítomnosti ditiodipyridínu (DTDP), ditiokarbamátu (DTC) alebo cysteínu. Nasledovne boli proteíny nenesené na stĺpec gélovej chromatografie (Superdex G200, Pharmacia) ekvilibrovaný s PBS,
139 % (objem/objem) Empigen. Eluované frakcie boli analyzované s SDS-PAGE a Western blottingom. Frakcie s relatívnou molekulovou hmotnosťou ~29 - -15 kD (stanovenou na základe migrácie v SDS-PAGE) boli spojené, zakoncentrované a nenesené na Superdex G200, ekvilibrovaný s PBS, 3 % (hmotn./objem) betaín, na posilnenie tvorby častíc podobných vírusu (VLP). Frakcie boli spojené, zakoncentrované a odsolené do PBS, 0,5% (hmotn./objem) betaín.
Elučné profily z gélovej chromatografie v PBS, 3 % (hmotn./objem) betaín pre VLPs získané z E2-H6, exprimovaného v H. polymorpha sú uvedené na Obrázku 46 (sulfónovaný proteín) a Obrázku 47 (z proteín alkylovaného s jódacetamidom).
Elučné profily z gélovej chromatografie v PBS, 3 % (hmotn./objem) betaín pre VLPs získané z El, exprimovaného v H. polymorpha, sú uvedené na Obrázku 48 (sulfónovaný proteín) a Obrázku 49 (z proteínu alkylovaného s jódacetamidom). Výsledné VLPs boli analyzované s SDS-PAGE a Western blottingom tak, ako uvádza Obrázok 50.
Analýza veľkosti VLPs, vytvorených z obalových proteín HCV exprimovaných v H. polymorpha
Velkosť častice VLP bola stanovená metódou Dynamic Light Scattering. V týchto pokusoch s použitím rozptylu svetla, bol použitý analyzátor velkosti častíc (Partícle-size analyzer, ModEl Zetasizer 1000 HS, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcester UK) , ktorý bol riadený softwarom pre fotónovú korelačnú spektroskopiu (photon correlation spectroscopy, PCS). Fotónová korelačná spektroskopie alebo dynamický rozptyl
140 svetla (dynamic light scattering, DLS) je optická metóda, ktorá meria Brownov pohyb a uvádza ho do vzťahu k velkosti častíc. Svetlo kontinuálneho, viditeľného laserového lúča smeruje cez súbor makromolekúl alebo častíc v suspenzii, ktoré sa pohybujú Brownovým pohybom. Niektorý z laserových svetelných lúčov je časticami rozptýlený a tento rozptýlený svetelný lúč je meraný s fotonásobičom. Fluktuácie v intenzite rozptýleného svetla sú premieňané na elektrické impulzy, ktoré sú vkladané do korelátora. Korelátor generuje autokorelačnú funkciu, ktorá sa prenáša na počítač, v ktorom je uskutočňovaná príslušná analýza dát. Použitý laser bol 10 mW monochromatický koherentný He-Ne laser s fixovanou vlnovou dĺžkou 633 nm. Pre každú vzorku bolo uskutočnených tri až šesť následných meraní.
Výsledky týchto pokusov sú zahrnuté v tabulke 5.
Tabuľka 5. Výsledky analýzy dynamického svetelného rozptylu uvedených kompozícií VLP, ktoré boli pripravené z obalových Proteínov HCV exprimovaných v H. polymorpha. Veľkosť častíc VLP je uvedená ako stredná hodnota priemeru častíc.
Modifikácia Cys-tiólových skupín E1-H6 E2-VIEGR-H6 El
sulfonácia 25 - 45 nm 20 nm 20 - 26 nm
alkylácia (j ódacetamidom) 23 - 56 nm 20 - 56 nm 21 - 25 nm
Zistenie, že sulfónovaný HCV El, odvodený z H. polymorpha, ešte vytvára častice s veľkosťou v zhodnom rozmedzí veľkostí, ako alkylovaný HCV El z Hansenula, je prekvapujúca. Takýto účinok nebol očakávaný, lebo bohatá sieť
141 navýšení negatívnych nábojov (až 8 Cys-tiólových skupín môže byť modifikovaných v HCV El) , ako dôsledok sulfonácie, môže indukovať iónové odpudzovanie medzi podjednotkami. Iné činidlá reverzibilné modifikujúce cysteín, ktoré boli testované, tiež umožnili tvorbu častíc z HCV El pripraveného týmto spôsobom, ale preukázalo sa, že sú tieto častice menej stabilné ako častice zo sulfónovaného materiálu, ktorý vzniká z agregáce na základe disulfidových mostíkov v HCV El. Na použitie týchto iných reverzibilných blokátorov je potrebná ďalšia optimalizácia podmienok.
PRÍKLAD 21
ANTIGENNE EKVIVALENCIE HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO V HANSENULA, A HCV El, PRODUKOVANÉHO V CICAVČÍCH BUNKÁCH INFIKOVANÝCH VÍRUSOM VACCINIA
Reaktivita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, so sérom chronických prenášačov HCV bola porovnaná s reaktivitou HCV El, produkovaného cicavčími bunkami infikovanými s HCVrekombinantným vírusom vaccinia tak, ako bolo opísané v Depla et al. vo WO99/67285. Obidva testované preparáty HCV-E1 pozostávali z VLPs, v ktorých boli proteiny HCV El alkylované s NEM a biotín-NEM. Reaktivita obidvoch preparátov VLP s HCV El so sérom od chronických prenášačov HCV bola stanovovaná metódou ELISA. Výsledky sú súhrnne uvedené v tabuľke 6. Ako je možné odvodiť z Tabuľky 6, neboli zaznamenané žiadne rozdiely v reaktivite medzi HCV El, exprimovaným v cicavčích bunkách infikovaných HCV-rekombinantným vírusom vaccinia, a HCV El, exprimovaným v H. polymorpha.
142
Tabulka 6. Antigenita El, produkovaného v cicavčej bunkovej kultúre, alebo produkovaného v H. polymorpha, bola hodnotená na panele sér z ľudských chronických prenášačov HCV. Na tento účel bol biotinylovaný El naviazaný na doštičky ELISA potiahnuté streptavidínom. Potom boli pridané ľudské séra v zriedení 1/20 a boli detegované imunoglobulíny zo sér pomocou králičej špecifickej sekundárnej ľudskému IgG-Fc označenej peroxidázou.
Výsledky sú vyjadrené ako hodnoty OD. Priemerné hodnoty sú priemery hodnôt OD zo všetkých testovaných vzoriek sér.
naviazané k El s protilátky proti
Sérum Hansenula Cicavčí Sérum Hansenula Cicavčí
17766 1,218 1,159 55337 1,591 1,416
17767 1,513 1,363 55348 1,392 1,261
17777 0,806 0,626 55340 1,202 0,959
17784 1,592 1,527 55342 1,599 1,477
1778S 1,508 1,439 55345 1,266 1,428
17794 1,724 1,597 55349 1,329 1,137
17798 1,132 0,989 55350 1,486 1,422
17801 1,636 1,504 55352 0,722 1,329
17805 1,053 0,944 55353 1,065 1,157
17810 1,134 0,999 55354 1,118 1,092
17819 1,404 1,24 55355 0,754 0,677
17820 1,308 1,4 55362 1,43 1,349
17826 1,163 1,009 55365 1,612 1,608
17827 1,668 1,652 55368 0,972 0,959
17849 1,595 1,317 55369 1,506 1,377
55333 1,217 1,168 W
143
PRÍKLAD 22
IMUNOGENNE EKVIVALENCIE HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO V HANSENULA, A HCV El, PRODUKOVANÉHO V CICAVČÍCH BUNKÁCH INFIKOVANÝCH VÍRUSOM VACCINIA
Imunogenita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, bola porovnaná s imunogenitou HCV El, produkovaného v cicavčích bunkách infikovaných HCV-rekombinantným vírusom vaccinia tak, ako opísali Depla et al. vo WO99/67285. Obidva testované preparáty HCV-E1 pozostávali z VLPs, pričom proteíny HCV El boli alkylované s jódacetamidom. Obidva preparáty VLP boli upravené s kamencom a injikované myšiam Balb/c (3 intramuskulárne/subkutánne injekcie s trojtýždňovým intervalom medzi každou z injekcií a každá z injekcií obsahovala 5 pg El v 125 μΐ obsahujúcich 0,13% Alhydrogel, Superfos, Denmark). Krv bola myšiam odobraná (vykrvácaním) 10 dní po tretej imunizácii.
Výsledky týchto pokusov sú znázornené na Obrázku 51. V hornej časti Obrázku 51 boli stanovované protilátky vzniknuté po imunizácii s VLPs z El, produkovaného v cicavčích bunkách. Titre protilátok boli stanovované metódou ELISA (pozri Príklad 21), pričom ako El, produkovaný v cicavčích bunkách („M”), tak El, produkovaný v Hansenula („H), boli priamo nanesené na pevný nosič ELISA a doštičky ELISA boli blokované s kaseínom. V dolnej časti Obrázku 51 boli stanovované protilátky vzniknuté po imunizácii s VLPs z El, produkovaného v Hansenula. Titre protilátok boli stanovované metódou ELISA (pozri Príklad 21) , pričom ako El, produkovaný v cicavčích bunkách („M) , tak El, produkovaný v Hansenula („H) , boli
144 priamo nanesené na pevný nosič ELISA a doštičky ELISA boli blokované s kaseínom.
Titre protilátok boli stanovované ako konečné titre (end point titers). Konečný titer je určený ako riedenie séra vedúce k OD (stanovenej s ELISA) rovnajúcej sa dvojnásobku priemernej hodnoty pozadia v danej skúške.
Obrázok 51 uvádza, že neboli pozorované žiadne signifikantné rozdiely medzi imunogennými vlastnosťami obidvoch kompozícií obsahujúcich El a to, že stanovené titre protilátok sú nezávislé na antigéne, použitom v ELISA skúške na uskutočnenie titrácie ku konečným titrom.
HCV El získaný z kvasníc indukoval po vakcinácii obrannú odpoveď podobnú obrannej reakcii, ktorá bola dosiahnutá po vakcinácii s alkylovaným HCV El, získaným z cicavčej bunkovej kultúry. Posledne menovaná odpoveď bola schopná zabrániť chronickému vývoju HCV po akútnej infekcii.
PRÍKLAD 23
ANTIGENNÝ A IMUNOGENNÝ PROFIL HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO V HANSENULA, KTORÝ JE SULFÓNOVANÝ
Reaktivita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, so sérom od chronických prenášačov HCV bola porovnávaná s reaktivitou HCV El, produkovaného v cicavčích bunkách infikovaných s HCVrekombinantným vírusom vaccinia tak, ako opísali Depla et al. vo WO99/67285. Obidva testované preparáty HCV-E1 pozostávali z VLPs, pričom proteiny HCV-E1, produkované v Hansenula, boli sulfónované a proteiny HCV El, produkované v cicavčích
145 bunkách, boli alkylované. Výsledky sú uvedené v tabulke 7. Aj keď celková (priemerná) reaktivita bola identická, u jednotlivých sér boli zistené určité významné rozdiely. Toto vedie k záveru, že sulfónovaný materiál poskytuje aspoň niektoré zo svojich epitopov spôsobom odlišným od alkylovaného HCV El.
Imunogenita HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula., ktorý bol sulfónovaný, bola porovnávaná s imunogenitou HCV E1-H6, produkovaného v Hansenula, ktorý bol alkylovaný. Obidva testované preparáty HCV-E1 obsahovali VLPs. Obidva preparáty VLP boli upravené s kamencom a injikované myšiam Balb/c (3 intramuskulárne/subkutánne injekcie s trojtýždňovým intervalom medzi každou z injekcií a každá z injekcií obsahovala 5 μg El v 125 μΐ obsahujúcich 0,13% Alhydrogel, Superfos, Denmark). Krv bola myšiam odobraná (vykrvácaním) 10 dní po tretej imunizácii.
Titre protilátok boli stanovované podobne, ako je opísané v príklade 22. Imunizácia so sulfónovaným materiálom viedla prekvapivo k vyšším titrom protilátok, bez ohľadu na antigén, ktorý bol použitý v skúške ELISA na určenie týchto titrov (Obrázok 51; horný panel: titrácia protilátok vyvolaných proti alkylovanému El ; dolný panel: titrácia protilátok vyvolaných proti sulfónovanému El; „A: alkylovaný El nanesený na doštičku ELISA; „S: sulfónovaný El nanesený na doštičku ELISA). V tomto pokuse sú ale jednotlivé titre odlišné v závislosti na použitom antigéne, čo potvrdzuje zistenie uvedené pre séra od pacientov s HCV. Preto HCV El, v ktorom sú tiólové skupiny cysteínu modifikované reverzibilným spôsobom, môžu byť viacej imuno^enne, a tak majú vyššiu účinnosť ako
146 vakcína chrániaca proti HCV (chronickej infekcii). Okrem toho sa s menšou pravdepodobnosťou objavuje indukcia odpovede k neo-epitopom, vyvolaná ireverzibilným blokovaním.
Tabuľka 7. Antigenita alkylovaného El (produkovaného v cicavčej bunkovej kultúre) alebo sulfónovaného E1-H6 (produkovaného v H. polymorpha) bola určená na panele sér od ľudských chronických prenášačov HCV („séra pacientov) a na paneli kontrolných sér („krvné donórové séra). Na tento účel bol El naviazaný na doštičky ELISA a potom boli doštičky ďalej saturované s kaseínom. Boli pridané ľudské séra v riedení 1/20 a naviazané imunoglobuliny boli detegované so sekundárnou králičou protilátkou proti ludskému IgG-Fc, označenou s peroxidázou. Výsledky sú vyjadrené ako hodnoty OD. Priemerné hodnoty sú priemery hodnôt OD zo všetkých testovaných vzoriek sér.
séra pacientov krvné donórové séra
Číslo séra Hansenula cicavčí Číslo séra Hansenula Cicavčí
17766 0,646 0,333 F500 0,055 0,054
17777 0,46 0,447 F504 0,05 0,05
17785 0,74 0,417 F508 0,05 0,054
17794 1,446 1,487 F510 0,05 0,058
17801 0,71 0,902 F511 0,05 0,051
17819 0,312 0,539 F512 0,051 0,057
17827 1,596 1,576 F513 0,051 0,052
17849 0,586 0,964 F527 0,057 0,054
55333 0,69 0,534 1SSS8 £,~:p.s2. Óý.'ď54
55338 0,461 0,233
55340 0,106 0,084
147
55345 1,474 1,258
55352 1,008 0,68
55355 0,453 0,444
55362 0,362 0,717
55369 0,24 0,452
JO W55 b'tíáSíd *t-awíl_
PRÍKLAD 24
IDENTICKÁ ANTIGENNÁ REAKTIVITA HCV E1-H6, PRODUKOVANÉHO V HANSENULA, A HCV El, PRODUKOVANÉHO V CICAVČÍCH BUNKÁCH INFIKOVANÝCH VÍRUSOM VACCINIA, SO SÉRAMI OD VAKCINOVANÝCH ŠIMPANZOV
Bola porovnávaná reaktivita El, produkovaného cicavčími bunkami infikovanými HCV-rekombinantným vírusom vaccinia, a E1-H6, produkovaného v Hansenula, (obidvaa alkylované) so sérom z vakcinovaných šimpanzov a s monoklonáInými protilátkami. Preto boli uvedené proteíny El nanesené priamo na doštičky ELISA a nasledovala saturácia doštičiek s kaseínom. Konečné titre protilátok viažúcich sa s proteínmi El naviazanými na doštičky ELISA boli stanovené pre sérum šimpanzov a pre špecifické myšacie monoklonálne protilátky, pričom všetky boli získané imunizáciou s El, produkovaným v cicavčích bunkách. Stanovenie konečných titrov bolo uskutočnené tak, ako je opísané v príklade 22. Použitými myšacími monoklonáInými látkami boli IGH201 (pozri Príklad 15), IGH198 (IGH198 = 23C12 v Maertens et al. vo WO96/04385), IGH203 (IGH203 = 15G6 v Maertens et al. vo WO96/04385) a IGH202 (IGH202 = 3F3 v Maertens et al. vo W099/50301).
148
Ako je možné odvodiť z Obrázku 53, reaktivity 7 odlišných šimpanzích sér sú identické, keď sú testované s proteínom El, produkovaným ako v Hansenula, tak v cicavčích bunkách. Reaktivity monoklonálnych protilátok proti HCV El sú tiež takmer zhodné. Dva zo šimpanzov (Yoran a Marti) boli zahrnutí v profylaktickej vakcinačnej štúdii a boli schopní vylúčiť akútnu infekciu po imunizácii, zatiaľ čo kontrolné zviera infekciu nevylúčilo. Päť ďalších šimpanzov (Ton, Phil, Marcel, Peggy, Femma) bolo zahrnutých do terapeutickej vakcinačnej štúdie a po imunizáciách s HCV El vykázalo zníženie poškodenia pečene, merané s ALT v sére a/alebo indexom histologickej aktivity pečeňovej biopsie.
Výsledky získané v tomto pokuse sú zreteľne odlišné od výsledkov Mustilliho a spolupracovníkov (Mustilli, A. C. et al. 1999), ktorí exprimovali proteín HCV E2 ako v Saccharomyces cerevisiae, tak v Kluyveromyces lactis. Purifikovaný E2, produkovaný v kvasinci, bol ale odlišný od HCV E2, produkovaného v cicavčích (CHO) bunkách v tom, že u neho bola pozorovaná nižšia reaktivita so sérom šimpanzov imunizovaných s HCV E2, produkovaným cicavčími bunkami, zatiaľ čo reaktivita s monoklonáInými protilátkami bola vyššia u HCV E2 produkovaného kvasnicami.
PRÍKLAD 25
STANOVENIE GLYKOSYLAČNÉHO PROFILU HCV El ELEKTROFORÉZOU S FLUORESCENČNÝM OZNAČENÍM CUKRU (FLUÓROPHORE-ASSISTED CARBOHYDRATE ELECTROPHORESIS, FACE)
Boli porovnávané glykosylačné profily pre HCV El, produkovaný v Hansenula, a pre HCV El, produkovaný cicavčími
149 bunkami infikovanými HCV-rekombinantným vírusom vaccinia. tak, ako bolo opísané v Depla et al. vo WO99/67285. Porovnanie bolo uskutočnené metódou elektroforézou s fluorescenčným označením cukrov (fluórophore-assisted carbohydrate electrophoresis,
FACE). Za týmto účelom boli oligosacharidy uvolnené z Els, produkovaných v cicavčích bunkách alebo v Hansenula, s peptidN-glykosidázou (PNGázou)(peptide-N-glycosidase, PNGase F) a označené s ANTS (proteíny El boli pred štiepením s PNGázou alkylované s jódacetamidom). Oligosacharidy označené s ANTS boli separované metódou PAGE na 21% polyakrylamidovom géli pri prúde 15 mA, 4 °C počas 2-3 hodín. Z Obrázku 54 bolo odvodené, že oligosacharidy na El, produkovanom cicavčími bunkami, a oligosacharidy na E1-H6, produkovanom v Hansenula, migrujú podobne ako oligomaltóza so stupňom polymerizácie medzi 7 a 11 monosacharidmi. Toto potvrdzuje, že Hansenula expresívny systém prekvapivo vedie k proteínu El, ktorý nie je hyperglykosylovaný a ktorý má reťazce cukrov s dĺžkou podobnou reťazcom cukrov, ktoré sú pripojené k proteínom El, produkovaným v cicavčích bunkách.
PRÍKLAD 26
STANOVENIE SEKVENCIE N-VIAZANÉHO OLIGOSACHARIDU, KTORÝ BOL ZÍSKANÝ Z Els, PRODUKOVANÝCH V SACCHAROMYCES A V HANSENULA, A Z Els, PRODUKOVANÝCH CICAVČÍMI BUNKAMI INFIKOVANÝMI S HCVREKOMBINANTNÝM VÍRUSOM VACCINIA
Proteíny Els (225 pg) , purifikovaná z kultúry Saccharomyces alebo Hansenula (pozri Príklady 15-16), alebo z kultúry buniek RK13 infikovaných s HCV-rekombinantným vírusom vaccinia (pozri Maertens et al. vo WO96/04385) a prítomné v PBS, 0,5% betainu boli zriedené s inkubačným pufrom
150 na deglykosyláciu (50 mM Na2HPO4, 0,75 % Nonidet P-40) na konečnú koncentráciu 140 pg/ml. Hodnota pH roztoku bola upravená na pH 5,5 s koncentrovanou H3PO4. K uvedenému roztoku boli pridané 2 U PNGázy F(Peptid-N4-(acetyl-beta-glukózaminyl)-asparagin amidáza z Flavobacterium meningosepticum; EC 3.5.1.52; získaná od Roche) a vzorka bola cez noc inkubovaná pri 37° C. Po inkubácii cez noc bolo pH roztoku upravené na pH 5,5 s koncentrovanou H3PO4. Proteíny a oligosacharidy boli nasledovne precipitované pridaním 4 objemov acetónu (pri -2 0° C) a zmesi boli inkubované pri -20 °C počas 15 minút. Vzorky boli centrífugované pri 4° C, 13000 otáčkach za minútu, počas 5 minút. Acetónový supernatant bol odstránený a peleta bola po pridaní 150 μΐ ladovo chladného 60% metanolu inkubovaná pri -20 °C počas 1 hodiny. Metanolový supernatant obsahujúci uvoľnené oligosacharidy bol odobraný a vysušený na rotačnej odparke (SpeedVac).
Vysušené glykány z El, rovnako ako referenčné oligosacharidy (všetky od Glyko, Bicester, UK; pozri Obrázok 55) Man-9 (11 monosacharidových jednotiek), Man-8 (10 monosacharidových jednotiek), Man-7 (9 monosacharidových jednotiek), Man-6 (8 monosacharidových jednotiek) a Man-5 (7 monosacharidových jednotiek) boli rozpustené v 5 μΐ
2-aminobenzamidu (2-AB), ako značiacemu reagens (± 0,35 M 2-AB ± 1 M NaCNBH3 v 30 % HOAc/70 % DMSO) tak, že boli získané konečné koncentrácie glykánov medzi 5 a 100 μΜ. Roztok glykánov bol potom inkubovaný počas 2 hodín pri 65° C. Po 3 0 minútach bol vzorka premiešaná miešadlom Vortex. Po naviazaní bol prebytok 2-AB odstránený nasledovne. Vzorka bola zriedená so 16 μΐ purif ikovanej vody (MilliQ) a nanesená na stĺpec Sephadex G-10 (s priemerom 1 cm, výške l,2cm, Amersham
151
Biosciences; prepojená so systémom VacElut systém, Varian), ktorý bol vysušený.
Značené oligosacharidy boli eluované nanesením 2 x 100 μΐ purifikovanej vody (MilliQ) na stĺpec. Eluáty referenčných cukrov (Man-9, Man-8, Man-7 a Man-6) boli vysušené a do analýzy HPLC uchovávané pri -70 °C. Eluáty zo vzoriek Els, rovnako ako referenčný glykán Man-9, bolí rozdelené do 4 očíslovaných skúmaviek PCR a vysušené. Uskutočnili sa reakcie tak, ako sú opísané v tabuľke 4, pričom všetky reakcie prebiehali cez noc pri 37 °C s výnimkou reakcie v skúmavke 3, ktorá bola skončená po 1 hodine. Použité koncentrácie exoglykosidázových enzýmov (všetky boli získané od Glyko, Bicester, UK) boli nasledujúce: a 1-2 manozidáza (Aspergillus saitoi) : 2 mU/ml; α-manozidáza (Jack Bean) : 50 U/ml; a βmanozidáza (Helix pornatia): 4 U/ml.
Tabuľka 8. Prehľad reakčných zmesí na stanovenie sekvencie oligosacharidov.
Skúmavka 1 Skúmavka 2 Skúmavka 3 Skúmavka 4 Skúmavka 5
Els (pmol) 400 400 400 400 400
cti-2 mano- zidáza (μΐ) - 4 - - -
α-mano-zidáza (μΐ) - - 5 5 5
β-mano-zidáza (μΐ) - - - - 4
inkubačný pufor 4x (μΐ) 5 5 5 5 5
MilliQ H20 (μΐ) 15 11 10 10 6
152
Obrázok 56 uvádza vyššiu oligomanózu pozostávajúcu z 10 molekúl manózy pripojených k chitobióze. Každý terminálny zvyšok manózy je prepojený väzbou a 1-3 na neterminálny zvyšok manózy. Oligomanóza z Obrázku 56 je celkom rezistentná na štiepenie s exoglykosidázou a 1-2 manozidázou. Dlhodobá inkubácia (cez noc) oligomanózy podía Obrázku 56 s exoglykosidázou α-manozidázou vedie na štiepenie všetkých α-väzieb (a 1-2, a 1-3, ce 1-6), nie ale β-väzieb. Výsledným oligosacharidom je tak 4'~P-manosyl chitobióza. Táto molekula 4'-P-manosyl chitobiózy môže byť premenená na manózu a chitobiózu pôsobením exoglykosidázy β-manozidázy. Podľa špecifikácie dodávateľa (Glyko) α-manozidáza celkom premieňa referenčný oligosacharid Man-6 (pozri Obrázok 55. D) na 4'-βmanosyl chitobiózu, ktorej ďalšia konverzie na manózu a chitobiózu s β-manozidázou bola tiež opísaná ako kompletná.
Obrázok 57 uvádza vyššiu oligomanózu pozostávajúcu z 9 molekúl manózy pripojených k chitobióze. V tejto oligomanóze je jeden terminálny zvyšok manózy prepojený a 1-2 väzbou s neterminálnym zvyškom manózy. Po pôsobení exoglykosidázy a 1-2 manozidázy je uvedená 1-2-viazaná manóza odstránená. Po následnom pôsobení a manozidázy a β manozidázy je získaný reakčný produkt opísaný pre oligomanózu z Obrázku 56. Podľa špecifikáce dodávateľa (Glyko) je a 1-2 manozidáza schopná premeniť referenčné oligosacharidy Man-9 a Man-6 na Man-5 (pozri Obrázok 55) s účinnosťou > 90 %.
Obrázok 58 uvádza referenčnú vyššiu oligomanózu Man-9 pozostávajúcu z 9 molekúl manózy pripojených k chitobióze. V tejto oligomanóze sú všetky terminálne manózové zvyšky
153 pripojené väzbou a 1-2 na neterminálny zvyšok manózy. Po pôsobení exoglykosidázy a 1-2 manozidázy je tak Man-9 premenený na Man-5, a to podľa špecifikácie výrobcu z > 90 %. Následné štiepenie .s α-manozidázou konvertuje Man-5 na 4'-βmannosyl chitobiózu.
Obsahy odlišných reakčných skúmaviek, ako sú uvedené v tabuľke 8, boli vysušené v odstredivej vákuovej odparke alebo v lyofilizačnom zariadení a uchovávané pri -70 °C do analýzy HPLC. Pred nanesením na stĺpec bola každá vzorka (Els a referenčná vzorka) rozpustená v 25 μΐ vody a nanesená na stĺpec TSK gel-Amide-80 (0,46 x 25 cm, Tosoh Biosep) prepojený so zariadením Waters Alliance HPLC station.
Separácia oligosacharidov bola uskutočňovaná pri teplote prostredia pri prietoku 1,0 ml/min. Rozpúšťadlo A pozostávalo z 0,1 % kyseliny octovej v acetonitrile a rozpúšťadlo B pozostávalo z 0,2 % kyseliny octovej-trietylamínovej vo vode. Separácia oligosacharidov označených s 2-AB bola uskutočňovaná s použitím izokratickej elúcie 28 % B na 5 objemov stĺpca s nasledujúcim lineárnym zvýšením na 45 % B počas pätnástich objemov stĺpca.
Referenčný oligosacharid Man-6 je eluovaný v 53 + 1 min, Man-7 je eluovaný v 59 ± 1 min, Man-8 v 67 ± 2 min a Man-9 v 70 ± i min; 4'-β-mannosyl chitobióza sa eluuje v 10 ± 1 min a chitobióza v 6 +1 min (neznázornené). Výsledky sú ilustrované pre reakčné produkty z Man-9 po inkubácii cez noc bez exoglykosidáz (stopa 1 na chromatograme uvedenom na Obrázku 63; len Man-9), po inkubácii cez noc s a 1-2 manozidázou (stopa 2 na chromatograme uvedenom na Obrázku 63 ;
154 zmes Man-5 a Man-6) po 1 hodinovej inkubácii, alebo po inkubácii cez noc s a manozidázou (stopy 3 a 4, v uvedenom poradí, znázornené na chromatograme uvedenom na Obrázku 63; len 4'-β- mannosyl chitobióza), a po inkubácii cez noc s a- a β-manozidázou (stopa 5 chromatogramu na Obrázku 63; len chitobióza). Stopa 6 chromatogramu uvedenom na Obrázku 63 zobrazuje gradient použitého rozpúšťadla.
Oligosacharidovými produktami z reakcie Els, produkovaných v Saccharomyces, (získané po pôsobení PNGázy F) bez pôsobenia exoglykosidáz boli prevažne štyri cukry, prítomné v eluáte z 59 ± 1 min (15%), 67 ± 1 min (45%), 70 ± 1 min (25%) a 75 ± 1 min (15%). Celkový obsah Man (8) GlcNAc (2) a Man(9)GlcNAc(2) v Els, produkovaných v Saccharomyces, bol ~ 65 %. V reakcii s a 1-2 manozidázou zmizli len karbohydráty s retenčným časom 70 ± 1 min. Intenzita cukru s retenčným časom 7 5 ± 1 min zostávala rovnaká a intenzita cukru s retenčným časom 67 ± 1 min bola zvýšená. To znamená, že nie všetky terminálne manózové jednotky majú konfiguráciu a(l-2). Po inkubácii cez noc s a manozidázou boli všetky reťazce cukrov redukované na zlúčeninu 4'-β-mannosyl chitobiózy. To znamená, že cukrom je vyššia manóza a všetky zvyšky manózy, s výnimkou jediného, majú konfiguráciu a. Redukcia tejto 4'-βmannosyl chitobiózovej zlúčeniny na chitobiózu bola zrejmá po inkubácii cez noc s β manozidázou. Výsledné chromatogramy, znázornené na Obrázku 64, boli získané za zhodných podmienok, aké boli opísané pre chromatogramy z Obrázku 63. Výsledky súhrnne uvádza Tabulka 9.
Zhodné pokusy boli opakované s Els, produkovanými v bunkách infikovaných vírusom vaccinia, a prekvapivo ukázali
155 celkom odlišný výsledok. V reakcii bez enzýmov bola prítomná komplexná zmes cukrov (pozri Obrázok 65 a Tabuľka 9) . Celkový obsah monosacharidu (8)-GlcNAc(2) a monosacharidu (9)-GlcNAc(2) bol 37 %. Po reakcii s a 1-2 manozidázou zmizli cukry s retenčnými časmi 70 ± 1 a 59 ± 1 min. Po inkubácii cez noc s a manozidázou pretrvávalo významné množstvo monosacharidu(6)-GlcNAc(2) vedia 4'P-mannosyl chitobiózového produktu. Toto je dôkazom preto, že jedna z oligosacharidových vetví je na degradáciu s a manozidázou rezistentná. Je možné to vysvetliť prítomnosťou 1 alebo 2 zvyškov glukózy pripojených k Mana (1-2)-ukončenej vetve N-viazaného oligosacharidu. Zdanlivá štruktúra takýchto oligosacharidov obsahujúcich glukózu je uvedená na Obrázku 62. Možné produkty reakcie z oligosacharidov obsahujúcich glukózu sú uvedené v tabulke 10. Vzhladom na to, že žiadny oligosacharid ekvivalentný k Man-7 (napríklad oligosacharid pozostávajúci z 9 monosacharidov) nepretrváva po reakcii s a 1-2 manozidázou, sú tieto glukózové zvyšky s najväčšou pravdepodobnosťou pripojené k B-vetve oligosacharidovéj štruktúry uvedenej na Obrázku 62. Nie je ale možné vylúčiť, že ako A-, tak B-vetva oligosacharidu na Obrázku 62 nie sú čiastočne ukončené glukózou.
Redukcia 4'-β-mannosyl chitobiózovej zlúčeniny na chitobiózu bola zrejmá po inkubácii cez noc s β manozidázou. Výsledné chromatogramy, znázornené na Obrázku 65, boli získané za zhodných podmienok, aké boli opísané pre chromatogramy z Obrázku 63. Výsledky súhrnne uvádza Tabuľka 9.
Zhodné pokusy sa uskutočnili s Els, produkovanými v Hansenula, a prekvapivo bolo zistené, že bol získaný celkom
156 odlišný výsledok. V reakcii bez enzýmov boli prevažne prítomné dva cukry s retenčnými časmi 67 + 2 min a 70 ± 1 min, ktoré zodpovedajú Man-8 a Man-9, v uvedenom poradí. Celkový obsah Man(8)-GlcNAc (2) a Man(9)-GlcNAc(2) v Els, produkovaných v Hansenula, bol ~ 90 %. Po reakcii s a 1-2 manozidázou boli cukry redukované prevažne na Man-5 s retenčným časom 45 ± 1 min a na Man-6 s retenčným časom 53 ± 1 min. Po inkubácii cez noc s a manozidázou boli všetky reťazce cukrov redukované na zlúčeninu 4'-β-mannosyl chitobiózy. To znamená, že cukrom je vyššia manóza a všetky zvyšky manózy, s výnimkou jediného, majú konfiguráciu a. Redukcia tejto 4'-β-mannosyl chitobiózovej zlúčeniny na chitobiózu bola zrejmá po inkubácii cez noc s β manozidázou. Výsledné chromatogramy, znázornené na Obrázku 66, boli získané za zhodných podmienok, aké boli opísané pre chromatogramy z Obrázkov 63-65. Výsledky súhrnne uvádza Tabulka 9.
Tabulka 9. Oligomanózy vznikajúce zo štiepenia oligomanóz získaných z Els, produkovaných v Saccharomyces („Sc) a Hansenula („Hp), rovnako ako z Els, produkovaných cicavčími bunkami infikovanými HCV-rekombinantným vírusom vaccinia („Vac). Sú uvedené odlišné oligomanózy s ich chromatografickými retenčnými percento danej oligomanózy oligomanóz (horné riadky), časmi („Rt, v minútach) a vzhladom k celkovému obsahu ako aj najpravdepodobnejšia štruktúra pre každú zistenú oligomanózu, uvedená odkazom na niektorý z Obrázkov 55-62. Oligomanózy s terminálnymi a 1-3 manéžami sú označené symbolom „°. Oligomanózy s terminálnymi glukózami sú označené symbolom u niektorých odkazov poznámka „od 62* znamená, že táto štruktúra môže byť odvodená zo štruktúry uvedenej na Obrázku 62. Číslo „1 znamená reakciu
157 bez exoglykosidáz, číslo „2 znamená reakciu s a 1-2 manozidázou. Predpokladá sa, že oligomanóza s retenčným časom 45 + 1 min je oligomanózou, ktorá obsahuje 5 zvyškov manózy pripojených k chitobióze. Predpokladá sa, že oligomanóza s retenčným časom 75 ± 1 min je oligomanózou, ktorá obsahuje 10 zvyškov manózy pripojených k chitobióze.
(Man- 5 Rt: 5±1 Man-6 Rt: 53+1 Man-7 Rt: 5±1 Man- 8 Rt: 67±1 Man-9 Rt: 70±l (Man-10) Rt: 75±1
Sc 1 / 1 % 14 % 42 % 23 % 18 %
štruk- 55.D 55.C 59° 57° 56°
túra 61°
Sc 2 17 % / 8 % 50 % 6 % 16 %
štruk- 55 .E 60° 59° 57° 56°
túra 61°
Vac 1 3 % 32 % 20 23 % 14 % 5 %
štruk- 55 .E od 62* 55 .C od 62* od 62* od 62*
túra & Tabulka & Tabuľka & Tabuľka & Tabuľka
10 10 10 10
Vac 1 74 % 2 % / 20 % 4 % /
štruk- 55. E od 62* od 62* od 62* od 62*
túra & Tabuľka & Tabuľka & Tabuľka & Tabulka
10 10 10 10
Hp 1 / 2 % 7 % 54 % 36 % /
štruk- 55 .D 55.C 55 .B 58
túra
Hp 2 80 % 20 % / / / /
štruk- 55.E 55.D
túra
158
Tabulka 10. Produkty z N-viazaných oligosacharidov obsahujúcich glukózu po reakcii s a 1-2 manozidázou, alebo s c. 1-2 manozidázou a a manozidázou.
Man- ekvivalent Produkt a 1-2 manozidázy (1) Produkt a manozidázy (po (D )
Vetva A + 2 Glc Man-10 Man-8 Man- 6
Vetva A + 1 Glc Man-9 Man-7 Man - 6
Vetva A + žiadny Glc Man - 8 Man-5 4'-β-manosyl chitobióza
Vetva B + 2 Glc Man-10 Man-9 Man - 6
Vetva B + 1 Glc Man-9 Man-8 Man-6
Vetva B + žiadny Glc Man-8 Man-5 4'-β-manosyl chitobióza
PRÍKLAD 27
OBSADENOSŤ N-GLYKOSYLAČNÝCH MIEST V REKOMBINANTNOM HCV El
V závislosti na množstve obsadených N-glykosylačných miest vykazujú Els odlišné migračné chovanie v analýze SDSPAGE. Na základe tejto vlastnosti je možné stanoviť priemerné množstvo obsadených N-glykosylačných miest v produkte El. Za týmto účelom boli vzorky purifikovaného produktu El podrobené SDS-PAGE a farbeniu s modravou Coomassie Brilliant Blue (Obrázok 67) , a ďalej boli analyzované s použitím softwaru
159
ImageMaster 1D Prime Software packet (Pharmacia). Stručne povedané, gél bol skenovaný a pre každý proteínový pás bolo stanovené % výskytu (jeho intenzita v porovnaní s celkovou intenzitou odlišných pásov, zatiaľ čo súčet všetkých pásov je 100 %) (Tabuľka 11) . Je treba uviesť, že každý špecifický proteínový pás predstavuje molekuly Els s rovnakým počtom obsadených N-glykosylačných miest.
Získané výsledky potvrdzujú, že hlavný podiel (> 90 %) produktu El, produkovaného v Hansenula, má 1 alebo viacej Nglykosylačných miest menej obsadených, ako Els, získaný z vaccinia expresívneho systému (aký opísal Maertens et al. vo WO96/04385). Za predpokladu, že v produkte El z vaccinia sú všetky N-glykosylačné miesta obsadené (pričom v El je sekvencia „NNSS (SEQ ID NO: 73) v pozícii 233-236 považovaná za jedno glykosylačné miesto), je možné takmer s istotou usudzovať, že priemerný počet obsadených N-glykosylačných miest v proteíne El, exprimovanom v Hansenula, nepresahuje 80 % všetkých dostupných N-glykosylačných miest.
Tabuľka 11. Stanovenie priemerného počtu obsadených Nglykosylačných miest v proteínoch El, získaných z Hansenula polymorpha a vaccinia/vero expresívnych systémov, s SDS-PAGE a analýzou intenzity farbenia s modravou Coomassie Brilliant Blue. Proteínové pásy sú označené molekulovou hmotnosťou. Pozri Obrázok 67.
160
Alkylované Els % výskytu (relatívna intenzita)
Hansenula polymorpha Pokus 1 Pokus 2
MW 29 9 8
MW 25 25 27
MW 21 38 42
MW 18 27 22
MW 14-15 nes tanovované ne s t anovované
Vaccinia/Vero
MW 29 100 100
PRÍKLAD 28
OBSADENOSŤ N-GLYKOSYLAČNÝH MIEST V REKOMBINANTNOM HCV E2
Dvesto (200) μ9 proteínu E2-H6, produkovaného v Hansenula, bolo deglykosylovaných s PNGázou F.
Deglykosylované proteíny E2-H6 boli nanesené na mini-gél (10 μg/dráha) . Proteínové pásy boli štiepené s trypsínom a endo Asp-N. Hmotnosť výsledných proteínov bola stanovená metódou Maldi-MS (dried droplet and thin layer metód).
Táto metóda môže byť použitá na stanovenie stupňa Nglykosylácie: počas deglykosylácie s enzýmom PNGázou F je úplný reťazec cukrov odštiepený a súčasne je asparagín (N) hydrolyzovaný na kyselinu asparagovú (D) . Hmotnostný rozdiel medzi týmito dvoma aminokyselinami je 1 Da, ktorý môže byť stanovený hmotnostnou spektrofotometriou. Okrem toho hydrolýza N na D vytvára nové štiepiace miesto pre enzým Asp-N.
Možnými miestami glykosylácie v E2 sú N4i7y N423 , N430 , N44a, N478 , N532 í N540í N556, NS7s, Ns23 a N54S (pozri Obrázok 68) . Analýza
161
Maldi-MS preukázala, že v každom z týchto glykosylačných miest nebola N-glykosylácia úplná, pretože po deglykosylácii s PNGázou F sa našli peptidy buď s N alebo D glykosylačným miestom (s hmotnostným rozdielom 1 Da). Pomer počtu zvyškov D a počtu zvyškov N uvádza priemerné obsadenie jedného Nglykosylačného miesta reťazcom cukrov vo všetkých proteínoch E2, exprimovaných v Hansenula, a prítomných v analyzovanej vzorke. Uvedené výsledky sú sumarizované v Tabuľkách 12 až 14.
Z výsledkov bolo vypočítané, že v priemere každé glykosylačné miesto bolo glykosylované približne z 54 %.
Tabulka 12. Percento glykosylácie stanovené v peptide štiepenom trypsínom a obsahujúcim jedno N-glykosylačné miesto.
N-glykosylačné miesto Glykosylované Neglykosylované
N430 60 % 40 %
N448 50 % 50 %
N556 80 % 20 %
N576 90 % 10 %
N623 20 % 80 %
N645 10 % 90 %
162
Tabuľka 13. Percento glykosylácie stanovené v peptide štiepenom trypsínom a obsahujúcim dve N-glykosylačné miesta.
N-glykosy- lačné miesto Obidve miesta glykosylované 1 z 2 miest glykosylované Žiadne miesto glykosylované Vypočítané pre jednotlivé N
N417 a N42 3 70 % 25 % 5 % 85 %
N532 A n54 0 0 % 80 % 20 % 40 %
Tabuľka 14.Percento glykosylácie stanovené pre N478 v produkte štiepenia s Asp-N.
N-glykosylačné miesto Glykosylované Neglykosylované
N478 35 % 65 %
PRÍKLAD 29
REAKTIVITA DARCOVSKÝCH KRVNÝCH SÉR S HCV El, PRODUKOVANÝCH V SACCHAROMYCES ALEBO V HANSENULA
Els-H6, produkované v Saccharomyces (exprimovaných s a-MF vedúcou sekvenciou) a Els-H6, produkovaných v Hansenula (exprimovaných s vedúcou sekvenciou CL) boli obidva purifikované tak, ako bolo opísané v príkladoch 15 a 16, a na záver boli podrobené alkylácii a tvorbe VLP, tak ako bolo opísané v príklade 20. Obidva proteíny boli priamo adsorbované na mikrotitračné doštičky v množstve 0,5 gg/ml (1 hodina, 37 °C) , a po blokovaní doštičky (PBS-0,1 % kaseín, 1 hodinu, 37 °C) boli séra testované na HCV a séra z negatívnych darcovských krvi inkubované v zriedení 1/20 (PBS-0,5 % kaseín,
163 % (hmotn./objem) sacharóza, 0,2% (objem/objem) Triton X705, 1 hodinu, 37 °C). Nakoniec bolo detegované naviazanie s použitím sekundárneho králičieho antiséra so špecifickými protilátkami proti ľudskému IgG-Fc, spojeným s peroxidázou (Dáko, Denmark) v zriedení 1/50 000 (PBS-0,1 % kaseín, 1 hodina, pri teplote miestnosti), a nasledovalo farbenie. Medzi všetkými stupňami boli doštičky 3krát premyté s PBS-0,05% (hmotn./objem) Tweenem-20. Na porovnanie boli tiež rovnakým spôsobom analyzované séra s Els, získané z cicavčích buniek, ktoré boli pripravené a purifikované tak, ako opísal Depla et al. vo WO99/67285.
Medzné hodnoty pre túto skúšku ELISA boli stanovené ako dvojnásobok priemeru pozadia (napríklad reaktivita všetkých sér v zhodnom uskutočnení, ale so streptavidínom naviazaným na jamky).
Z Tabuľky 15 je možné usudzovať, že mnohé zo sér (75 %) vykazujú reaktivitu nad medznú hodnotou voči El, produkovaným v Saccharomyces, zatial čo len niekolko sér (6 %) vykazuje nejakú reaktivitu nad medznú hodnotu voči El, produkovaným v Hansenula. Uvedený rozdiel v reaktivite je pričítaný prítomnosti terminálnych a 1-3 manóz spojených s a 1-2 manózatni na El, produkovanom v Saccharomyces, ako bolo zaznamenané v príklade 26. Young et al. (1998) už skôr naznačili, že tento typ manóz je tiež zodpovedný za reaktivitu ludských sér s manánom, získaným zo Saccharomyces. Aby bolo ďalej potvrdené, že reaktivita El, získaného zo Saccharomyces, môže byť pripočítaná tomuto typu manózy, bola opakovaná skúška ELISA na El, produkovanom v Saccharomyces, so zriedením darcovských krvných sér preinkubovaných (1 hodinu pri 37 °C)
164 s 1 alebo 5 mg/ml manánu (Sigma), ktorý bol pridaný do riediaceho pufru. Ako je možné usúdiť z Tabuľky 16, preinkubácia s manánom redukovala aktivitu tohto El s darcovskými krvnými sérami, a to spôsobom závislým na koncentrácii k hodnotám pozadia ku všetkým séram (s výnimkou jediného (F556) analyzovaného séra). Priemerná hodnota je znížená z 0,24 bez kompetície s manánom na 0,06 pri použití 5 mg manánu/ml).
Tabuľka 15. Reaktivita El, produkovaného v Hansenula, Saccharomyces a v cicavčích bunkách. Reaktivity nad medznú hodnotu sú uvedené vo zvýraznených poliach.
číslo séra Hanse- nula El Saccharomyces El Cicavčí El Slepá vzorka
F552 gg§ !!S3f 0,056 0,05
F553 0,062 ϋ 0,056 0,052
F555 0,06 0,079 0,054 0,051
F556 0,073 ϋ 0,054 0,051
F557 0,059 0,053 0,05
F558 0,066 fffl 0,06 0,058
F559 0,084 |§|g 0,056 0,053
F560 0,062 IO 0,052 0,052
F562 0,056 §il§ 0,053 0,053
F563 0,064 0,059 0,056
F570 0,056 Ifgg 0,054 0,055
F571 0,06 0,054 0,055
F572 0,061 0,055 0,056
F575 0,079 0,104 0,062 0,056
F576 0,061 |gg 0,058 0,057
F577 0,063 síl 0,055 0,058
165
F578 0,089 0,057 0,061
F581 0,064 0,098 0,061 0,057
F594 0,055 Ž'W 0,056 0,057
F595 0,059 0^9' 0,057 0,058
F598 0,076 * áv'-ι*f* 'f-.“ ť'« &/3Ϊ1 '> l J»·* * 0,056 0,059
F450 gggj 0,078 0,099 0,059
F453 0,059 0,057 0,06
F456 0,058 lUf 0,056 0,06
F458 0,055 0,088 0,054 0,054
F459 0,054 0,069 0,056 0,054
F463 0,055 0,083 0,054 0,056
F466 0,086 0,071 0,094
F467 0,066 0,055 0,055
F469 0,059 0,074 0,057 0,057
F470 0,074 0,056 0,056
F473 0,094 ®p8ÍJ7 0,054 0,057
F479 0,06 0,075 0,06 0,051
F480 0,053 c^cfe 0,056 0,053
F481 0,059 w; £^3-25 0,071 0,052
F488 0,063 í^A'·-·.-.- 0^^6.7 0,059 0,053
priemer 0,072 0,242 0,058 eílB o
# sér nad 2/36 27/36
medznou
hodnotou
% sér 6 75
nad medznou
hodnotou
166
Tabuika 16. Reaktivita El, produkovaného v bunkách Saccharomyces, tak ako v tabulke 15, ale za prítomnosti 5 mg manánu/ml. Reaktivity nad medznú hodnotu sú uvedené vo zvýraznených poliach.
Číslo séra Koncentrácia manánu
0 mg/ml 1 mg/ml 5 mg/ml
F552 0,207 0,128 0,103
F553 0,487 0,098 0,050
F555 0,066 0,044 0,041
F556 0,769 0,540 0,372
F557 0,158 0,094 0,088
F558 0,250 0,076 0,046
F559 0,300 0,077 0,066
F560 0,356 0,088 0,044
F562 0,122 0,106 0,089
F563 0,164 0,091 0,04F9
F570 0,110 0,043 0,040
F571 0,212 0,057 0,042
F572 0,464 0,087 0,043
F575 0,095 0,081 0,062
F576 0,138 0,042 0,043
F577 0,216 0,042 0,041
F578 0,125 0,100 0,093
F581 0,083 0,064 0,042
F594 0,102 0,044 0,041
F595 0,520 0,088 0,044
F598 0,340 0,054 0,042
F450 0,053 0,060 0,053
F453 0,116 0,049 0,044
F456 0,112 0,050 0,043
167
F458 0 , 086 0,051 0,042
F4 5 9 0, 054 0,044 0,042
F463 0,078 0,043 0,041
F466 0,172 0,111 0,085
F467 0,420 0,117 0,049
F469 0, 053 0,043 0,041
F470 0,220 0,070 0,061
F473 0,924 0,183 0,063
F479 0,059 0,049 0,043
F480 0,281 0,155 0,054
F481 0,355 0,042 0,046
F488 0,474 0,090 0,046
priemer 0,243 0,089 0,062
ZOZNAM ODKAZOV
Agaphonov, M. O., Beburov, M, Y., Ter Avanesyan, M. D., and Smirnov, V. N. (1995) A disruption-replacement approach for the targeted integration of foreign genes in Hansenula polymorpha. Yeast 11: 1241-1247.
Agaphonov, M. 0., Trushkina, P. M., Sohn, J.H., Choi, E. S., Rhee, S. K., and Ter Avanesyan, M. D. (1999) Vectors for rapid selection of integrants with différent plazmid copy numbers in the yeast Hansenula polymorpha DL1. Yeast 15: 541-551.
Alber, T. and Kawasaki, G. (1982) Nucleotide sequence of the triose phosphate izomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol Appl. Genet 1: 419-434.
168
Ammerer, G.(1983) Expression of genes in yeast using the ADCI promoter. Metods Enzymol. 101: 192-201.
Ballou, L. , Hitzeman, R. A., Lewis, M. S., and Ballou, C. E.
(1991) Vanadate-resistant yeast mutants are defective in protein glycosylation. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A 88: 32093212 .
Beekman, N. J., Schaaper, W. M., Tesser, G. I., Dalsgaard, K., Kamstrup, S., Langeveld, J. P., Boshuizen, R. S., and Meloen, R. H. (1997) Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a tioester bond inereases immunogenicity. J. Pept. Res. 50: 357-364.
Burns, J., Butler, J., and Whitesides, G. (1991) Selective reduction of disulfides by Tris (2carboxyetyl) phosphine. J. Org. Chem. 56: 2648-2650.
Cox, H., Mead, D., Sudbery, P., Eland, R. M., Mannazzu,I., and Evans, L. (2000) Constitutive expression of recombinant proteins in the metylotrophic yeast Hansenula polymorpha using the PMA1 promoter. Yeast 16: 1191-1203.
Cregg, J. M. (1999) Expression in the metylotrophic yeast Pichia pastoris. In Gene expression systems: using náture for the art of expression, J. M. Fernandez and J. P. Hoeffler, eds (San Diego: Academic Press), pp. 157-191.
Darbre, A. (1986) Practical protein chemistry: a handbook. Whiley & Sons Ltd.
169
Diminsky, D., Schirmbeck, R., Reimann, J., and Barenholz, Y.
(1997) Comparison between hepatitis B surface antigén (HBsAg) particles derived trom mammalian cells (CHO) and yeast cells (Hansenula polymorpha): composition, structure and immunogenicity. Vaccine 15: 637647.
Doms, R. W., Lamb, R. A., Rose, J. K., and Helenius, A. (1993) Folding and assembly of viral membráne proteins. Virology 193: 545-562 .
Elble, R. (1992) A simple and efficient procedúre for transformation of yeasts. Biotechniques 13: 18-20.
Fellinger, A. J., Verbakel, J. M., Veale, R. A., Sudbery, P. E., Bom, I. J., Overbeeke, N., and Verrips, C. T. (1991) Expression of the alpha-galactosidase from Cyamopsis tetragonoloba (guar) by Hansenula polymorpha. Yeast 7: 463473 .
Fournier, J. A., Cahour, A., Escriou, N., Girad, M., and Wychowski, C. (1996) Processing of the El glycoprotein of hepatitis C vírus expressed in mammalian cells. J. Gen Virol. 77 (Pt 5) : 1055-1064 .
Gailit, J. (1993) Restoring free sulfhydryl groups in synthetic peptides. Anál. Biochem. 214: 334-335.
Garson, J. A., Ľubách, D., Passas, J., Whitby,K., and Grant,
P. R. (1999) Suramin blocks hepatitis C binding to human hepatóma cells in vitro. J. Med. Virol. 57: 238-242.
170
Gatzke, R., Weydemann, U., Janowicz, Z. A., and Hollenberg, C.
P. (1995) Stable multicopy integration of vector sequences in Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:844-849.
GELlissen, G. (2000) Heterologous proteín production in metylotrophic yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741750 .
Grakoui, A., Wychowski, C., Lin, C., Feinstone, S. M., and Rice, C. M. (1993) Expression and Identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J. Virol. 67: 13851395.
Grinna, L. S. and Tschopp, J. F. (1989) Size distribution and generál structural features of N-linked oligosaccharides from the metylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast 5: 107-115.
Heile, J. M., Fong, Y. L., Rosa, D., Berger,K., Saletti, G., Campagnoli, S.,Bensi, G., Capo, S., Coates, S., Crawford, K., Dong, C., Wininger, M., Baker, G., Cousens, L., Chien, D.,Ng, P., Archangel, P., Grandi, G.,Houghton, M., and Abrignani, S.
(2000) Evaluation of hepatitis C virus glycoprotein E2 for vaccine design: an endoplasmic reticulum-retained recombinant proteín is superior to secreted recombinant proteín and DNAbased vaccine candidates. J. Virol. 74: 6885-6892.
Helenius, A. (1994) How N-linked oligosaccharides affect glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Biol. Celí 5: 253-265.
171
Hermanson, G. T. (1996) Bioconjugate techniques. San Diego: Academic Press.
Herscovics, A. and Orlean, P. (1993) Glycoprotein biosynthesis in yeast. FASEB J. 7: 540-550.
Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M., and Shimotohno, K. (1991) Gene mapping of the putative structural región of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 88: 5547-5551.
Hitzexnan, R. A., Čiarke, L., and Carbon, J. (1980) Isolation and characterization of the yeast 3-phosphoglycerokinase gene(PGK) by an immunological screening technigue. J. Biol. Chem. 255: 12073-12080.
Hollenberg, C. P. and GELlissen, G. (1997) Production of recombinant proteins by metylotrophic yeasts. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 554-560.
Holmgren, A. (1979) Tioredoxin catalyzes the reduction of inzulín disulfideš by ditiotreitol and dihydrolipoamide. J.
Biol. Chem. 254: 9627-9632.
Janowicz, Z . A., Melber, K., Merckelbach, A., Jacobs, E. ,
Harford, N. , Comberbach, M., and Hollenberg, C.P. (1991)
Simultaneous expression of the S and L surface antigens of
hepatitis B, and formation of mixed particles in the metylotrophic yeast, Hansenula polymorpha. Yeast 7: 431-443.
172
Jayabaskaran, C., Davison, P. F., and Paulus, H. (1987) Facile preparation and some applications of an affinity matrix with a cleavable connector arm containing a disulfide bond. Prep. Biochem. 17: 121-141.
Jenkins, N., Parekh, R. B., and James, D. C. (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat. Biotechnol. 14:975-981.
Julius, D., Brake, A., Blair, L·., Kunisawa, R., and Thorner,
J. (1984) Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine-cleaving endopeptidase required for processing of yeast prepro-alpha-factor. Celí 37: 1075-1089.
Kalef, E., Walfish, P. G., and Gitler, C. (1993) Arsenicalbased affinity chromatography of vicinal dítiol-containing proteins: purification of L1210 leukémia cytoplasmic proteins and the recombinant rat c-erb A beta 1 T3 receptor. Anál. Biochem. 212: 325-334.
Kalidas, C., Joshi, L., and Batt, C. (2001) Characterization of glycosylated variants of betalactoglobulin expressed in Pichia pastoris. Proteín Eng 14: 201-207.
Kato, N. ,0otsuyama, Y., Tanaka, T., Nakagawa, M., Nakazawa, T., Muraiso, K., Ohkoshi, S., Hijikata, M., and Shimotohno, K.
(1992) Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of hepatitis C viruses. Virus Res. 22: 107-123.
173
Kawasaki, G. and Fraenkel, D. G. (1982) Cloning of yeast glycolysis genes by complementation. Biochem. Biophys. Res. Comraun. 108: 1107-1122.
Klebe, R. J., Harriss, J .V., Sharp, Z. D., and Douglas, M. G.
(1983) A generál metód for polyetylene-glycol-induced genetic transformation of bacteria and yeast. Gene 25: 333-341.
Kumar, N., Kella, D., and Kinsella, J. E. (1985) A metód for the controlled cleavage of disulfíde bonds in proteins in the absence of denaturants. J. Biochem. Biophys. Metods 11: 251263 .
Kumar, N., Kella, D., and Kinsella, J. E. (1986) Anomalous effects of denaturants on sulfitolysis of proteín disulfide bonds. Int. J. Peptide Prot. Res. 28: 586-592.
Maertens, G. and Stuyver, L. (1997) Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In The molecular medicíne of viral hepatitis, T. J. Harrison and A. J. Zuckerman, eds John Wiley & Sons), pp. 183-233.
Major, M. E. and Feinstone, S. M. (1997) The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 25: 1527-1538.
Miele, R. G., Nilsen, S. L., Brito, T., Bretthauer, R. K., and Castellino, F. J. (1997) Glycosylation properties of the Pichia pastoris-expressed recombinant kringle 2 domain of tissue-type plasminogen activator. Biotechnol. Appl. Biochem. 25 (Pt 2): 151-157.
174
Meunier, J. C., Fournillier, A., Choukhi, A., Cahour, A., Cocquerel, L., Dubuisson, J., and Wychowski, C. (1999) Analysis of the glycosylation sites of hepatitís C virus (HCV) glycoprotein El and the influence of El glycans on the formation of the HCV glycoprotein complex. J. Gen Virol. 80 (Pt 4): 887-896.
Montesino, R., Garcia, R., Quintero, O., and Cremata, J. A.
(1998) Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the metylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 14: 197-207.
Mustilli, A. C., Izzo, E., Houghton, M., and Galeotti, C. L.
(1999) Comparison of secretion of a hepatitís C virus glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae andKluyveromyces lactis. Res. Microbiol. 150: 179-187.
Nagai, K. and Thogersen, H. C. (1984) Generation of betaglobin by sequence-specific proteolysis of a hybrid protein produced in Escherichia coli. Náture 309: 810-812.
Nielsen, P. E. (2001) Targeting double stranded DNA with peptide nucleic acid (PNA). Curr. Med. Chem. 8: 545-550.
Okabayashi, K., Nakagawa, Y., Hayasuke, N., Ohi, H., Miura, M., Ishida, Y.,Shimizu, M., Murakami, K., Hirabayashi, K., Minamino, H., and (1991) Secretory expression of the human sérum albumín gene in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. J. Biochem. (Tokyo) 110: 103-110.
175
Orum, H. and Wengel, J. (2001) Locked nucleic acids.· a promising molecular family for gene-function analysis and antisense drug development. Curr. Opin. Mol. Ther. 3: 239-243.
Padgett, K. A. and Sorge, J. A. (1996) Creating seamless junctions independent of restriction sites in PCR cloning. Gene 168: 31-35.
Panchal, T. and Wodzinski, R. J. (1998) Comparison of glycosylation patterns of phytase from Aspergillus niger (A. ficuum) NRRL 313 5 and recombinant phytase. Prep. Biochem. Biotechnol. 28: 201-217.
Pedersen, J., Lauritzen, C., Madsen, M. T., and Weis, D, S.
(1999) Removal of N-terminal polyhistidine tags from recombinant proteins using engineered aminopeptidases. Protein Expr. Purif. 15: 389-400.
Pomroy, N. C. and Deber, C. M. (1998) Solúbilization of hydrophobic peptides by reversible cysteine PEGylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 618-621.
Raymond, C. K. (1999) Recombinant protein expression in Pichia metanolica. In Gene expression Systems: using náture for the art of expression, J. M. Fernandez and J. P.Hoeffler, eds (San Diego: Academic Press), pp. 193-209.
Rein, A., Ott, D. E., Mirro, J., Arthur, L. O., Rice, W., and Henderson, L. E. (1996) Inactivation of murine leukémia virus by compounds that react with the zinc finger in the viral nucleocapsid protein. J. Virol. 70: 4966-4972.
176
Roggenkamp, R., Hansen, H., Eckart, M., Janowícz, Z., and Hollenberg, C. P. (1986) Transformátion of the metylotrophic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors. Mol.Gen. Genet. 202: 302-308.
Rosa, D., Campagnoli, S., Moretto, C., Guenzi, E., Cousens, L., Chin, M., Dong, C., Weiner, A. J., Lau, J. Y., Choo, Q. L., Chien, D., Pileri, P., Houghton, M., and Abrignani, S.
(1996) A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 93: 1759-1763.
Rose, J. K and Doms, R. W. (1988) Regulation of proteín export from the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Celí. Biol. 4: 257288 .
Russell, D. W., Smith, M., Williamson, V. M., and Young, E. T.
(1983) Nucleotide sequence of the yeast alcohol dehydrogenase II gene. J. Biol. Chem. 258: 2674-2682.
Russell, P. R. (1983) Evolutionary divergence of the mRNA transcription initiation mechanism in yeast. Náture 301: 167169.
Russell, P. R. (1985) Transcription of the triose-phosphateizomérase gene of Schizosaccharomyces pombe initiates from a štart point different from that in Saccharomyces cerevisiae. Gene 40: 125-130.
177
Russell, P. R. and Halí, B. D. (1983) The primary structure of the alcohol dehydrogenase gene from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Biol. Chem. 258: 143-149.
Sambrook, J., Fritsch, E. F.,
Molecular Cloning: A Lahoratory Laboratory Press.
and Maniatis, T. Manual. Cold Spring (1989)
Harbor
Scorer, C. A., Čiare, J. J., McCombie, W. R., Romans, M. A., and Sreekrishna, K. (1994) Rapid selection using G418 of high copy number transformants of Pichia pastoris for high level foreign gene expression. Biotechnology (N. Y.) 12: 181-184.
Singh, R. and Kats, L. (1995) Catalysis of reduction of disulfíde by selenol. Anál. Biochem. 232: 86-91.
Sohn, J.H., Choi, E. S., Kang, H. A., Rhee, J. S., and Rhee,
S. K. (1999) A family of telomere-associated autonomously replicating sequences and their functions in targeted recombination in Hansenula polymorpha DL-1. J. Bacteriol. 181: 1005-1013.
Stuyver, L., van Arnhem, W., Wyseur, A., Hernandez, F., Delaporte, E., and Maertens, G. (1994) Classification of hepatitis C viruses based on phylogenetic analysis of the envelope 1 and nonstructural 5B regions and identification of five additional subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91: 10134-10138.
Sugrue, R. J., Cui, T., Xu, Q., Fu, J., and Chán, Y. C. (1997) The production of recombinant dengue virus E protein using
178
Escherichia coli and Pichia pastoris. J. Virol. Metods 69:
159-169.
Thakur, M. L., DeFulvio, J., Richard, M. D., and Park, C.H.
(1991) Technetium-99m labeled monoclonal antibodies: evaluation of reducing agents. Int. J. Rad. Appl. Instrum.B 18: 227-233.
Trimble, R. B., Atkinson, P.H., Tschopp, J.F., Townsend, R. R., and Maley, F. (1991) Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the metylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Biol. Chem. 266: 22807-22817.
Vingerhoeds, M.H., Haisma, H. J., Belliot, S. 0., Smit, R. H.,
CrommElin, D. J., and Storm, G.
enzýme-carri ers(immuno-enzymosomes) enzýme prodrug therapy (ADEPT) :
(1996) Immunoliposomes as for antibody-directed optimization of prodrug activating capacity.Pharm. Res. 13: 604-610.
Wahlestedt, C., Salmi, P., Good, L., Kela, J., Johnsson, T., Hokfelt, T. ,Broberger, C., Porreca,F., Lai, J., Ren, K., Ossipov, M., Koshkin, A., Jakobsen, N.,Skouv, J., Oerum, H., Jacobsen, M. H., and Wengel, J. (2000) Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 97: 5633-5638.
Weydemann, U., Keup, P.,Piónek, M., Strasser, A. W. , Schweden, J., GELlissen, G., and Janowicz, Z. A. (1995) High-level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha-authentic Processing of three different preprohirudins. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 377-385.
179
Young, M., Davies, M. J., Bailey,
Gradwell, M. J.,
K., Barnes, R. M. R., Hounsell, of oligosaccharides from an Glycoconjugate
Smestad-Paulsen, B., Wold, J.
E. (1998) Characterization antigenic mannan of Saccharomyces cerevisiae Journal 15: 815-822.
Zauberman, A., Nussbaum, O., Ilan, E., Eren, R., Ben-Moshe, O., Arazi, Y., Berre, S., Lubín, I., Shouval, D., Galun, E., Reisner, Y., and Dagan, S. (1999) The trimera mouse systém: a mouse model f or hepatitis C infection and evaluation of therapeutic agents. 6th International Symposium on hepatitis C and related viruses. Bethesda 6-9 June, 1999.

Claims (32)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho fragment zahŕňajúci aspoň jedno N-glykosylačné miesto, pričom uvedený proteín alebo jeho fragment je produktom expresie v eukaryontnej bunke, vyznačujúci sa tým, že v priemere až 80 % jeho N-glykosylačných miest je glykosylovaných s jadrom glykosylácie.
  2. 2. Izolovaný obalový proteín HCV alebo podľa nároku 1, v ktorom je viac ako glykosylovaných s jadrom glykosylácie s obsahujúci 8 až 10 manóz.
    jeho fragment
    70 % miest oligomanózou
  3. 3. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho fragment podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 alebo 2, v ktorom pomer miest glykosylovaných s jadrom glykosylácie obsahujúcim oligomanózu so štruktúrou definované ako Man(7)-GlcNAc(2) počtu miest glykosylovaných s jadrom glykosylácie obsahujúcim oligomanózu so štruktúrou definované ako Man(8)-GlcNAc(2) je menší alebo sa rovná 0,45.
  4. 4. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho fragment podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, v ktorom uvedené oligomanózy obsahujú menej ako 10 % terminálnej a 1,3 manózy.
  5. 5. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, ktorý je produktom expresie v bunke kvasnice.
    181
  6. 6. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa nároku 5, kde uvedenou bunkou kvasnice je bunka Hansenula.
    Ί. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 6, ktorý bol získaný z proteínu obsahujúceho vedúci peptid opičieho lysozýmu alebo jeho funkčnú variantu, ktoré sú pripojené k obalovému proteínu HCV alebo jeho fragmentu.
  7. 8. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa nároku 7, ktorý bol získaný z proteínu charakterizovaného vzorcom
    CL-[(Al)a- (PSI) b (A2) c ] -HCVENV-[ (A3) d - (PS2)e- (A4)f], kde:
    CL je vedúci peptid opičieho lysozýmu alebo jeho funkčný ekvivalent,
    Al, A2, A3 a A4 sú adaptorové peptidy, ktoré môžu byť odlišné alebo rovnaké,
    PSI a PS2 sú miesta úprav, ktoré môžu byť odlišné alebo rovnaké,
    HCVENV je obalový proteín HCV alebo jeho časť, a, b, c, d, e , f sú 0 alebo 1, a kde prípadne sú Al a/alebo A2 častí PSI, a/alebo kde A3 a/alebo A4 sú časťou PS2.
  8. 9. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa nároku 8, kde uvedený vedúci peptid opičieho lysozýmu CL má aminokyselinovú sekvenciu definovanú v SEQ ID NO: 1.
    182
  9. 10. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť poclla nároku 8, v ktorom A má aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo sekvencii SEQ ID NO: 63 - 65, 70 - 72 a 74 - 82, PS má aminokyselinovú sekvenciu vybranú zo sekvencii SEQ ID NO: 66 68 a 83 - 84, alebo j e PS dibázickým miestom, akým je Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg a Arg-Lys, alebo monobázickým miestom, akým je Lys, a v ktorom je HCVENV vybraný zo sekvencii SEQ ID NO: 85 - 98 a jeho fragmentov.
  10. 11. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, ktorý je obsiahnutý v štruktúre vybranej zo skupiny pozostávajúcej z monomérov, homodimérov, oligomérov.
    heterodimérov, homo-oligomérov hetero
  11. 12. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 10, ktorý je obsiahnutý v častici podobnej vírusu.
  12. 13. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 12, v ktorom sú tiólové skupiny cysteínu chemicky modifikované.
  13. 14. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 13, ktorý je antigenný.
  14. 15. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 13, ktorý je imunogenný.
    183
  15. 16. Izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podlá ktoréhokolvek z nárokov 1 až 13, ktorý obsahuje epitop pre Tbunky.
  16. 17. Kompozícia, vyznačujúca sa tým, že obsahuje izolovaný obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 16.
  17. 18. Kompozícia podlá nároku 17, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje farmaceutický prijateľný nosič, a ktorá je liečivom.
  18. 19. Kompozícia podľa nároku 17, vyznačujúca sa tým, že ďalej obsahuje farmaceutický prijateľný nosič, a ktorá je vakcínou.
  19. 20. Spôsob prípravy izolovaného obalového proteínu HCV alebo jeho fragmentu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16.
  20. 21. Spôsob detekcie prítomnosti protilátok proti HCV vo vzorke, o ktorom sa predpokladá, že obsahuje protilátky antiHCV, vyznačujúci sa tým, že pozostáva z:
    (i) kontaktovania obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 16 so vzorkou za podmienok dovoľujúcich komplexáciu obalového proteínu HCV alebo jeho časti s uvedenými anti-HCV protilátkami (ii) detekciu komplexu vytvoreného v (i) , a (iii) vyvodenie záveru z (ii) o prítomnosti anti-HCV protilátok v uvedenej vzorke.
    184
  21. 22. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedený stupeň kontaktovania (i) prebieha za kompetitívnych podmienok.
  22. 23. Spôsob podľa nároku 21, vyznačujúci sa tým, že uvedený obalový proteín HCV alebo jeho časť sú naviazané na pevný nosič.
  23. 24. Diagnostická súprava na detekciu prítomnosti protilátok anti-HCV vo vzorke, o ktorej sa predpokladá, že obsahuje protilátky anti-HCV, vyznačujúca sa tým, že obsahuje obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 16.
  24. 25. Diagnostická súprava podľa nároku, vyznačujúca sa tým, že obalový proteín HCV alebo jeho časť sú naviazané na pevný nosič.
  25. 26. Liečivo, vyznačujúce sa tým, že obsahuje obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokolvek z nárokov 1 až 16.
  26. 27. Vakcína, vyznačujúca sa tým, že obsahuje obalový proteín HCV alebo jeho časť podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 .
  27. 28. Farmaceutická kompozícia na indukciu HCV-špecifickej imunitnej odpovede u cicavca, vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné množstvo obalového proteínu HCV alebo jeho časti podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 a prípadne farmaceutický prijateľné adjuvans.
    185
  28. 29. Farmaceutická kompozícia na vyvolanie HCV-špecifických protilátok u cicavca, vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné množstvo obalového proteínu HCV alebo jeho časti podlá ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 a prípadne farmaceutický prij atelné adj uvans.
  29. 30. Farmaceutická kompozícia na indukciu funkcie T-buniek u cicavca, vyznačujúca sa tým, že obsahuje účinné množstvo obalového proteínu HCV alebo jeho časti podía ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 16 a prípadne farmaceutický prijatelné adjuvans.
  30. 31. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 28 až 30, ktorá je profylaktickou kompozíciou.
  31. 32. Farmaceutická kompozícia podľa ktoréhokoľvek z nárokov 28 až 30, ktorá je terapeutickou kompozíciou.
  32. 33. Farmaceutická kompozícia podía ktoréhokoľvek z nárokov 28 až 32, kde uvedeným cicavcom je človek.
SK1314-2003A 2001-04-24 2002-04-24 Core-glycosylated HCV envelope proteins SK13142003A3 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01870088 2001-04-24
US30560401P 2001-07-17 2001-07-17
PCT/BE2002/000064 WO2002086101A2 (en) 2001-04-24 2002-04-24 Core-glycosylated hcv envelope proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK13142003A3 true SK13142003A3 (en) 2004-11-03

Family

ID=34072546

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1314-2003A SK13142003A3 (en) 2001-04-24 2002-04-24 Core-glycosylated HCV envelope proteins

Country Status (20)

Country Link
US (3) US7314925B2 (sk)
EP (3) EP1381671A2 (sk)
JP (2) JP4261195B2 (sk)
KR (1) KR100950104B1 (sk)
CN (1) CN1636050A (sk)
AR (3) AR035869A1 (sk)
AU (3) AU2002308449B2 (sk)
BR (2) BR0209033A (sk)
CA (3) CA2443781A1 (sk)
CZ (1) CZ20032853A3 (sk)
HU (1) HUP0303924A2 (sk)
MX (2) MXPA03009626A (sk)
NZ (2) NZ529019A (sk)
OA (1) OA13092A (sk)
PL (1) PL366621A1 (sk)
RU (1) RU2274643C2 (sk)
SK (1) SK13142003A3 (sk)
WO (3) WO2002085932A2 (sk)
YU (1) YU84103A (sk)
ZA (3) ZA200308272B (sk)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040185061A1 (en) * 1994-07-29 2004-09-23 Innogenetics N.V. Redox reversible HCV proteins with native-like conformation
HUP0303924A2 (hu) * 2001-04-24 2004-03-01 Innogenetics N.V. Core-glikozilált HCV-burokproteinek
DE10143490C2 (de) * 2001-09-05 2003-12-11 Gsf Forschungszentrum Umwelt Rekombinantes MVA mit der Fähigkeit zur Expression von HCV Struktur-Antigenen
CA2504711A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Innogenetics N.V. Hcv vaccine compositions comprising e1 and ns3 peptides
US7439042B2 (en) * 2002-12-16 2008-10-21 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
JP4371739B2 (ja) * 2003-09-02 2009-11-25 株式会社東芝 シリアルａｔａインタフェースを持つ電子機器及びシリアルａｔａバスのパワーセーブ方法
EP1602664A1 (en) * 2004-03-08 2005-12-07 Innogenetics N.V. HCV E1 comprising specific disulfide bridges
EP1574517A1 (en) * 2004-03-09 2005-09-14 Innogenetics N.V. HCV E1 comprising specific disulfide bridges
JP4885476B2 (ja) * 2004-05-21 2012-02-29 株式会社日本触媒 タンパク質及び／又はペプチドの細胞内導入方法
AU2005295317B2 (en) * 2004-10-18 2011-10-13 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
AU2011254055B2 (en) * 2004-10-18 2012-12-20 Globeimmune, Inc. Yeast-based therapeutic for chronic hepatitis C infection
US20060234360A1 (en) * 2005-04-13 2006-10-19 Paola Branduardi Ascorbic acid production from D-glucose in yeast
US9216212B2 (en) 2005-08-05 2015-12-22 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
US7951384B2 (en) * 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
PE20070796A1 (es) * 2005-10-24 2007-08-15 Wyeth Corp Metodo de produccion proteica utilizando compuestos anti-senescencia
EP2027271A4 (en) * 2006-05-19 2010-06-09 Glycofi Inc RECOMBINANT VECTORS
AU2015234338C1 (en) * 2006-07-28 2017-07-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Improved vaccines and methods for using the same
AU2007288129B2 (en) * 2006-08-25 2013-03-07 The Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Limited Recombinant HCV E2 glycoprotein
WO2010033841A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Globeimmune, Inc. Immunotherapy for chronic hepatitis c virus infection
WO2010039224A2 (en) * 2008-09-30 2010-04-08 University Of Massachusetts Medical School Respiratory syncytial virus (rsv) sequences for protein expression and vaccines
US20100104555A1 (en) * 2008-10-24 2010-04-29 The Scripps Research Institute HCV neutralizing epitopes
DE102009044224A1 (de) * 2009-10-09 2011-04-28 PomBio Tech GmbH Starterzentrum der Universität des Saarlandes Campus Geb. A1-1 Methode zur Produktion von HCV Virus-ähnlichen Partikeln
MX345854B (es) 2010-12-22 2017-02-17 Bayer Ip Gmbh Respuesta inmune potenciada en la especie bovina.
US20140155469A1 (en) 2011-04-19 2014-06-05 The Research Foundation Of State University Of New York Adeno-associated-virus rep sequences, vectors and viruses
EP2707382B1 (en) 2011-05-09 2019-07-17 Ablynx NV Method for the production of immunoglobulin single variable domains
JP6772065B2 (ja) 2014-02-28 2020-10-21 バイエル・アニマル・ヘルス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｍｂｈ 免疫賦活プラスミド
CA3005304C (en) 2015-11-13 2024-02-20 Tarlan MAMMEDOV Production of in vivo n-deglycosylated recombinant proteins by co-expression with endo h
ES2740449T3 (es) * 2015-12-22 2020-02-05 Bisy E U Célula de levadura
WO2018055535A2 (en) 2016-09-21 2018-03-29 The Governors Of The University Of Alberta Hepatitis c virus immunogenic compositions and methods of use thereof

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4395395A (en) * 1979-05-21 1983-07-26 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Detection of non-A, non-B hepatitis associated antigen
EP0288198A3 (en) * 1987-04-20 1989-03-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of peptide
US5135854A (en) 1987-10-29 1992-08-04 Zymogenetics, Inc. Methods of regulating protein glycosylation
US5350671A (en) * 1987-11-18 1994-09-27 Chiron Corporation HCV immunoassays employing C domain antigens
US5698390A (en) * 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US5683864A (en) * 1987-11-18 1997-11-04 Chiron Corporation Combinations of hepatitis C virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
JP2791418B2 (ja) * 1987-12-02 1998-08-27 株式会社ミドリ十字 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
NO177065C (no) * 1988-09-26 1995-07-12 Labofina Sa Framgangsmåte for framstilling av enzymatisk aktivt humant lysozym
US5747239A (en) * 1990-02-16 1998-05-05 United Biomedical, Inc. Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to HCV, diagnosis of HCV infection and preventions thereof as vaccines
US6312889B1 (en) * 1990-04-04 2001-11-06 Chiron Corporation Combinations of hepatitis c virus (HCV) antigens for use in immunoassays for anti-HCV antibodies
WO1992001800A1 (en) * 1990-07-20 1992-02-06 Chiron Corporation Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
CA2047792C (en) 1990-07-26 2002-07-02 Chang Y. Wang Synthetic peptides specific for the detection of antibodies to hcv, diagnosis of hcv infection and prevention thereof as vaccines
RO117329B1 (ro) 1991-06-24 2002-01-30 Chiron Corp Emeryville Polipeptide care contin o secventa a virusului hepatitei c
WO1994001132A1 (en) 1992-07-07 1994-01-20 Merck & Co., Inc. VACCINE COMPRISING MIXED preS1+preS2+S AND CORE PARTICLE
ATE290592T1 (de) 1993-11-04 2005-03-15 Innogenetics Nv Von menschlichen t-zellen immunodominante epitopen des virus der c-hepatitis
EP1211315A1 (en) * 1994-07-29 2002-06-05 Innogenetics N.V. Recombinant vectors for producing HCV envelope proteins
ZA9610456B (en) * 1995-12-20 1997-06-20 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
US5935824A (en) * 1996-01-31 1999-08-10 Technologene, Inc. Protein expression system
ES2258797T3 (es) * 1996-12-20 2006-09-01 Novo Nordisk A/S Proteinas con extension n-terminal expresadas en la levadura.
WO1999024466A2 (en) 1997-11-06 1999-05-20 Innogenetics N.V. Multi-mer peptides derived from hepatitis c virus envelope proteins for diagnostic use and vaccination purposes
JP2003525570A (ja) * 1998-01-23 2003-09-02 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵母において所望のポリペプチドを産生する方法
CN1305589A (zh) 1998-04-17 2001-07-25 基因创新有限公司 采用还原剂的改进型免疫诊断分析
JP2002518037A (ja) 1998-06-24 2002-06-25 イノジェネティックス・ナムローゼ・フェンノートシャップ Ｈｃｖエンベロープ蛋白の粒子：ワクチン接種への使用
CN1384839A (zh) * 1999-10-27 2002-12-11 基因创新有限公司 具有天然样构象的氧化还原可逆hcv蛋白
HUP0302416A2 (hu) 2001-01-11 2003-10-28 Innogenetics N.V. Tisztított hepatitis-C vírusmembrán-proteinek diagnosztikai és terápiás célú alkalmazása
HUP0303924A2 (hu) * 2001-04-24 2004-03-01 Innogenetics N.V. Core-glikozilált HCV-burokproteinek
BR0215081A (pt) 2001-12-18 2004-10-19 Innogenetics Nv Proteìnas purificadas do envoltório do vìrus de hepatite c para uso diagnóstico e terapêutico
CA2504711A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Innogenetics N.V. Hcv vaccine compositions comprising e1 and ns3 peptides

Also Published As

Publication number Publication date
WO2002086100A2 (en) 2002-10-31
MXPA03009632A (es) 2004-06-30
US7238356B2 (en) 2007-07-03
AU2002308449B2 (en) 2008-05-29
JP4261195B2 (ja) 2009-04-30
ZA200308272B (en) 2005-01-24
CZ20032853A3 (cs) 2004-08-18
US20030108561A1 (en) 2003-06-12
RU2003130955A (ru) 2005-04-20
WO2002085932A3 (en) 2003-03-13
OA13092A (en) 2006-11-10
US7048930B2 (en) 2006-05-23
AU2002257392B2 (en) 2007-05-10
CN1636050A (zh) 2005-07-06
KR20030094359A (ko) 2003-12-11
YU84103A (sh) 2006-05-25
BR0209033A (pt) 2005-01-11
WO2002086101A2 (en) 2002-10-31
AR035869A1 (es) 2004-07-21
AR035868A1 (es) 2004-07-21
PL366621A1 (en) 2005-02-07
HUP0303924A2 (hu) 2004-03-01
MXPA03009626A (es) 2004-06-30
JP4173741B2 (ja) 2008-10-29
NZ529019A (en) 2004-05-28
US20030152940A1 (en) 2003-08-14
US20030211597A1 (en) 2003-11-13
EP1381671A2 (en) 2004-01-21
AR035867A1 (es) 2004-07-21
AU2002252856A1 (en) 2002-11-05
EP1414942A2 (en) 2004-05-06
WO2002085932A2 (en) 2002-10-31
NZ529324A (en) 2005-08-26
BR0209034A (pt) 2005-02-01
US7314925B2 (en) 2008-01-01
CA2443740A1 (en) 2002-10-31
EP1417298A2 (en) 2004-05-12
ZA200308277B (en) 2004-07-08
JP2004536052A (ja) 2004-12-02
KR100950104B1 (ko) 2010-03-30
ZA200308274B (en) 2005-01-24
RU2274643C2 (ru) 2006-04-20
CA2444006A1 (en) 2002-10-31
JP2004532029A (ja) 2004-10-21
CA2443781A1 (en) 2002-10-31
WO2002086100A3 (en) 2004-02-19
WO2002086101A3 (en) 2004-02-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7238356B2 (en) Core-glycosylated HCV envelope proteins
AU2002257392A1 (en) Core-glycosylated hcv envelope proteins
KR100559096B1 (ko) Ｈｃｖ 피막 단백질 입자 및 그의 백신접종용 용도
AU2002308449A1 (en) Constructs and methods for expression of recombinant HCV envelope proteins
JP2001511459A (ja) フラビウイルス感染に対抗する組換え二量体エンベロープワクチン
US20080124763A1 (en) Constructs and methods for expression of recombinant proteins in methylotrophic yeast cells
BG108373A (bg) Гликосилирани в сърцевина протеини, обвиващи вируса на хепатит с
JP2004536582A (ja) 組換え型ｈｃｖエンベロープタンパク質の発現のための構築物及び方法
JP2007289204A (ja) 組換え型ｈｃｖエンベロープタンパク質の発現のための構築物及び方法
SABLON et al. Patent 2443740 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
FB9A Suspension of patent application procedure