BG108373A

BG108373A - Гликосилирани в сърцевина протеини, обвиващи вируса на хепатит с

Info

Publication number: BG108373A
Application number: BG108373A
Authority: BG
Inventors: Erik Delpa; Alfons Bosman; Geert Deschamps; Erwin Sablon; Manfred Suckow; Isabelle Samson; Gert Verheyden
Original assignee: Innogenetics N.V.
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2003-11-21
Publication date: 2004-12-30
Also published as: IL158422A0; CO5650176A2; HRP20030946A2; AP2003002886A0

Abstract

Изобретението се отнася до протеини, обвиващи вируса на хепатит С, или техни части, продуцирани в еукариотни клетки. Средно до 80% от местата за N-гликозилиране на протеините са гликозилирани в сърцевина. От местата за N-гликозилиране повече от 70% са гликозилирани с олигоманоза, съдържаща от 8 до 10 манози. Съотношението на олигоманозите със структура Man(7)-GlcNAc(2) към олигоманозата със структура Man(8)-GlcNAc(2) е по-малко от или равно на 0.45. По-малко от 10% от олигоманозите завършват с алфа-1,3-свързана маноза. Протеините, обвиващи вируса на хепатит С, са подходящи за диагностични, профилактични и терапевтични цели. Подходяща еукариотна клетка за продуциране на протеини е клетка на Hansenula. а

Description

Настоящото изобретение се отнася до отделяне на рекомбинантен протеин, до диагностициране на заразяване с вируса на хепатит С, до лечение или превенция на зараза от вируса на хепатит С или до прогнозиране/ наблюдение на клиничната ефективност на лечението на индивид с хроничен хепатит, или прогнозиране/наблюдение на естествено заболяване.

По-специално, настоящото изобретение се отнася до отделяне на протеини, обвиващи вируса на хепатит С, в квасни гъбички, щамове на квасни гъбички за отделяне на гликосилирани в сърцевина протеини, обвиващи вируса и до приложение на протеините, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, при диагностициране, профилактика или лечение.

Предшестващо състояние на техниката

Заразяването с вируса на хепатит С (HCV) е голям здравословен проблем, както в развитите, така и в развиващите се страни. Изчислено е, че около 1 до 5% от населението на света е засегнато от вируса. Заразяването с вируса на хепатит С (HCV) изглежда е най-вече се причинява от свързан с трансфузия хепатит и често прогресира до хронично разрушаване на черния дроб. Още повече, съществуват доказателства, въвличащи вируса на хепатит С при индуциране на хепатоцелуларен карцином. Следователно, търсенето на благонадеждни методи за диагностика и ефективни терапевтични агенти е голямо. Необходими са също и чувствителни и специфични скринингови методи за откриване на заразени с вируса на хепатит С кръвни продукти, както и подобрени методи за култивиране на вируса на хепатит С.

Вирусът на хепатит С е вирус на положително насочена рибонуклеинова киселина от приблизително 9,600 бази, които кодират единичен полипротеинов прекурсор от около 3000 аминокиселини. Показано е, че протеолитното разцепване на прекурсора, куплиран към съ- и пост-транслационни модификати, води до получаване на поне три структурни и шест неструктурни протеина. На база на хомологията на последователностите, структурните протеини функционално са означени като единичен сърцевинен протеин и два обвиващи гликопротеини Е1 и Е2. Е1 обвиващият гликопротеин се състои от 192 аминокиселини и съдържа 4 до 5 места за N-гликосилиране, в зависимост от генотипа на вируса на хепатит С. Е2 обвиващият гликопротеин се състои от 363 до 370 аминокиселини и съдържа 9 до 11 места за N-гликосилиране, в зависимост от генотипа на вируса на хепатит С (виж, обзорите на Major, Feinstone, 1997; Maertens, Stuyver, 1997). Е1 обвиващият гликопротеин съдържа различни променливи домени (Maertens, Stuyver, 1997). Е2 обвиващият гликопротеин съдържа три хиперпроменливи домени, от които основният домен е локализиран в N-края на протеина (Maertens, Stuyver, 1997). Гликопротеините на вируса на хепатит С са локализирани предимно в ендоплазмения ретикулум (ER), където те се модифицират и свързват в олигомерни комплекси.

В евкариотните клетки, захарните остатъци обикновено са свързани с четири различни аминокиселинни остатъка. Тези аминокиселинни остатъци се класифицират като О-свързани (серин, треонин и хидроксилизин) и Nсвързани (аспарагин). О-свързаните захарни остатъци се синтезират в Golgi или в грубия ендоплазмен ретикулум от нуклеотидни захари. N-свързаните захарни остатъци се синтезират от обичаен прекурсор и след това се третират. Счита се, че протеините, обвиващи вируса на хепатит С са N-гликосилирани. На специалистите е известно, че добавянето на N-свързани въглехидратни вериги е важно за стабилизиране на нагънатите междинни съединения и оттук, за ефикасно нагъване, превенция на неправилното нагъване и деградация на ендоплазмения ретикулум, олигомеризация, биологична активност и транспорт на гликопротеини (виж, обзорите на Rose et al., 1988; Doms et al., 1993; Helenius, 1994). Трипептидните последователности Asn-X-Ser и Asn-X-Thr (в които X може да бъде коя да е аминокиселина) в полипептидите са консенсусни места за свързване на на N-свързаните олигозахариди. След добавянето на Nсвързания олигозахарид към полипептида, олигозахаридът се превръща в комплекс (съдържащ N-ацетилглюкозамин, маноза, фукоза, галактоза и сиалова киселина) или във висша маноза (съдържаща N-ацетилглюкозамин и маноза). Счита се, че протеините, обвиващи вируса на хепатит С са от типа висша маноза. N-свързаният олигозахарид, действащ в квасните гъбички, е много различен от действието в Golgi на бозайници. В квасните гъбички, веригите на олигозахаридите се удължават в Golgi посредством степенно прибавяне на маноза, което води до получаване на висши манозни структури, отнасящи се като хипергликосилиране. Обратно на това, протеините, които се отделят в прокариотните клетки, никога не са гликосилирани.

За различни евкариотни клетки са определени картините на гликосилиране от висш манозен тип на протеини или пептиди. В клетките на бозайници, средно 5 до 9 манозни звена се свързват към две Nацетилглюкозаминни части в олигозахарид, гликосилиран в сърцевина (структурата е представена накратко като Man(5-9)GlcNAc(2)). Гликосилирането в сърцевина се отнася до структура, подобна на затворената структура на Фигура 3 на Herscovics и Orleans (1993).

Публикувано е, че метилотрофните квасни гъбички Pich/a pastoiis свързват приблизително 8 до 14 манозни звена, т.е. Man(8-14)GlcNAc(2) на място за гликосилиране (Tschopp, ЕР 0256421) и приблизително 85% от Nсвързаните олигозахариди са в границите на размера на Man(8-14)GlcNAc(2) (Grinna, Tschopp, 1989). Други изследователи са публикували различни олигозахаридни структури, свързани с хетерологични протеини, отделяни в Pichia pastoiis·. Man(8-9)GlcNAc(2) (Montesino et al. 1998), Man(9-14)GlcNAc(2) или Man(9-15)GlcNAc(2) (Kalidas et al. 2000) и Man(8-18)GlcNAc(2) c превъзходство на Man(9-12)GlcNAc(2) и c главния цялостен олигозахарид Man(10)GlcNAc(2) (Miele et al., 1998; Trimble et al., 1991), съставен от равно разпределение на Man(8)GlcNAc(2) и Man(9)GlcNAc(2) в около 75% N-свързани олигозахариди с допълнително 17% места за N-гликосилиране, окупирани от Man(10)GlcNAc(2) и останалите 8% от местата за N-гликосилиране, окупирани от Man(11)GlcNAc(2). Понякога се съобщава и за хипергликосилирането на протеина, отделен в Pichia pastoiis (Scorer et al., 1993).

Aspergillus niger е прибавяне на Man(5-10)GlcNAc(2) към места за Nгликосилиране (Panchai, Wodzinski, 1998).

Мутант mnn9 с дефицитно гликосилиране на Saccharomyces cerevisiae се различава от необлагородения вид Saccharomyces cerevisiae в това, че тпп9 клетките продуцират гликосилирани протеини с модифициран олигозахарид, състоящ се от Man(9-13)GlcNAc(2) вместо хипергликосилирани протеини (Mackay et al., US 5,135,854; Kniskern et al., Wo94/01132). Съобщава се за друг мутант на Saccharomyces cerevisiae, ochlmnn9, при който Man(8)GlcNAc(2) се добавя към места за N-гликосилиране в протеини (Yoshifumi et al., JP 06277086).

Характеристика на сърцевинните олигозахариди на Saccharomyces cerevisiae (необлагороден вид и тпп9 мутант) е наличието на крайни ос-1,3свързани манозни остатъци (Montesino et al. 1998). Олигозахаридите, свързани с местата за N-гликосилиране на протеини, отделяни от Pichia pastoiis или Saccharomyces cerevisiae ochlmnn9, се разделят на такива крайни ос-1,3свързани манози (Gellissen et al., 2000). Счита се, че крайните а-1,3-свързани манози са алергенни (Jenkins et al. 1996). Следователно, протеините, носещи върху техните олигозахариди, крайни а-1,3-свързани манозни остатъци, не са подходящи за диагностични или терапевтични цели.

Картината на гликосилирането на протеините, отделени в метилотрофичните квасни гъбички Hansenuta potymorpha притежава, въпреки използването на тези квасни гъбички за продуциране на значителен брой хетерологични протеини (виж Таблица 3 в Gellissen et al., 2000) не е изучена в големи подробности. От експериментите на Janowicz et al., 1991 и Diminsky et al., 1997, изглежда, че Hansenuta potymorpha не е или е слабо гликосилираща големия или малкия повърхностен антиген на вируса на хепатит В (HbsAg). Най-вероятно това се дължи на факта, че антигенът на вируса на хепатит В се отделя без сигнален пептид, и така предпазва получения антиген на вируса на хепатит В да въведе лумен на ендоплазмения ретикулум и от гликосилиране. Съобщава се за ограничено добавяне на моно- или дихексози към фактора, стимулиращ гранулоцитна колония, продуциран от Hansenuta potymorpha, (Fisher et al., WO00/40727). От друга страна, наблюдава се хипергликосилиране на хетерологична α-галакгозидаза, отделяна в клетки на Hansenuta potymorpha (Fellinger etal., 1991).

Досега е доказано, че ваксинация против болест е най-ефективният и ефикасен метод за контролиране на болести. Въпреки обещаващите резултати, опити за разработване на ефикасна ваксина против вируса на хепатит С, обаче, се провеждат с трудности. A conditio sine qua non за ваксини е индуцирането на имунна реакция у пациентите. Следователно, трябва да се идентифицират антигенни детерминанти на вируса на хепатит С и да се администрират върху пациентите по подходящ начин. Антигенните детерминанти могат да бъдат разделени на поне две форми, т.е. линейни и конформационни епитопи. Конформационни епитопи се получават в резултат на нагъването на молекула в тридименсионалното пространство, включително съ- и пост-транслационни модификации, като гликосилиране. Най-общо, счита се, че конформационните епитопи ще реализират най-ефикасните ваксини, тъй като те представляват епитопи, които наподобяват епитопи на природен вирус • на хепатит С и, които могат по-добре да бъдат съхранявани от действителна j линейна аминокиселинна последователност. Следователно, евентуалната

I степен на гликосилиране на протеините, обвиващи вируса на хепатит С, е от най-голяма важност за създаване на антигенни детерминанти на природния | вирус на хепатит С. Обаче, съществуват привидно непреодолими проблеми с j култивирането на вируса на хепатит С. Още повече, съществуват големи j

проблеми с отделянето и пречистването на рекомбинантните протеини, които се изразяват в това, че водят до получаване на или малки количества протеини, хипергликосилирани протеини, или протеини, които не са ф гликосилирани.

Протеините, обвиващи вируса на хепатит С, се получават по рекомбинантен механизъм в Escherichia сой, клетки на насекоми, клетки на квасни гъбички и клетки на бозайник. Обаче, отделянето в по-висши евкариотни клетки се характеризира с трудно получаване на големи количества антигени за евентуално получаване на ваксина. Отделянето в прокариотни клетки, като Escherichia сой, води до получаване на протеини, j обвиващи вируса на хепатит С, които не са гликосилирани. Отделянето на

I i протеини, обвиващи вируса на хепатит С, в квасни гъбички вди до получаване } на хипергликосилиране. Както вече е показано от Maertens et al., WO 96/04385, отделянето на протеин Е2, обвиващ вируса на хепатит С, в Saccharomyces cerevisiae води до получаване на протеини, които са силно гликосилирани. Това хипергликосилиране води до защитаване на протеиновите епитопи. Въпреки че Mustilli et al. (1999) претендират, че отделянето на протеин Е2, обвиващ вируса на хепатит С, в Saccharomyces cerevisiae води до гликосилиране в сърцевина, резултатите за интрацелуларно отделения

ί /I ί

материал показват, че поне част от него е хипергликосилирана, докато при правилното третиране на остатъка от този материал това не се показва. Още повече, хипергликосилирането, наблюдавано от Mustilli et al. (1999), може единствено да бъде предотвратено в присъствие на туникамицин, инхибитор на гликосилирането, като това не отразява гликосилиране, протичащо при нормални, природни условия за растеж. Приета е необходимостта от протеини, обвиващи вируса на хепатит С, получени от интрацелуларен източник (Maertens et al., WO 96/04385; Heile et al., 2000). Тази необходимост е обоснована от слабата реакгивоспособност на отделения от квасни гъбички Е2 протеин със серум на шимпанзе, имунизирано с Е2 протеини, получени от култура на клетки от бозайник, както се вижда от Фигура 5 на Mustilli et al. (1999). Това е документирано от Rosa et al. (1996), който показва, че имунизирането с протеини, обвиващи вируса на хепатит С, получени от квасни гъбички, не защитава при предизвикателство.

Следователно, съществува необходимост от ефикасни системи за отделяне, изразяващи се в големи и ефективни като цена количества протеини, които в същото време притежават подобна на природната гликосилирана картина, лишена от крайни «1,3-свързани манози. В частност, такива системи са необходими за получаване на протеини, обвиващи вируса на хепатит С.

Техническа същност на изобретението

Първият аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, включващ поне едно място за N-гликосилиране, като споменатият протеин или негов фрагмент се характеризира с това, че е продукт на отделяне в евкариотна клетка и с това, че средно до 80% от местата за N-гликосилиране, са гликосилирани в сърцевина. В частност, повече от 70% от споменатите места за гликосилиране в сърцевина са гликосилирани с олигоманоза със структура Мап(8-10)GlcNAc(2). Още повече, съотношението на олигоманозата със структура Man(7)-GlcNAc(2) към олигоманозата със структура Man(8)-GlcNAc(2) е помалко от или равно на 0.45. По-специално, споменатите олигоманози съдържат по-малко от 10% крайна а-1,3-маноза. Евкариотната клетка, отделяща споменатия изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, може да бъде клетка на квасна гъбичка, като клетка на Hansenula.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, който може да бъде получен от протеин, включващ авиан лизозим водещ пептид или негова функционална разновидност, свързана със споменатия протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент. Поспециално, изолираният протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, се получава от протеин, характеризиращ се със структурата:

0ί-[(Α1)₃-(Ρ81)^(Α2)_ε]-Η0νΕΝν-[(Α3)_ά-(Ρ52)_θ-(Α4)₁] където:

CL е авиан лизозим водещ пептид или негов функционален еквивалент,

А1, А2, АЗ и А4 са адапторни пептиди, които могат да бъдат различни или еднакви,

PS1 и PS2 са работещи места, които могат да бъдат различни или еднакви,

HCVENV е протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част.

a, b, с, d, е и f са 0 или 1, и където, А1 и/или А2 могат да бъдат част на PS1 и/или, където АЗ и/или А4 могат да бъдат част на PS2.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че е включен в структура, избрана от групата, включваща мономери, хомодимери, хетеродимери, хомоолигомери и хетероолигомери. Или пък, споменатият протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, е включен във вирусоподобна частица. Още по-специално, всеки изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, може да включва цистеини, от които цистеин-тиоловите групи са химично модифицирани.

Специфични аспекти на настоящото изобретение се отнасят до изолирани протеини, обхващащи вируса на хепатит С, или техни фрагменти, съгласно настоящото изобретение, характеризиращи се с това, че са антигенни или имуногенни и/или съдържат Т-клетки, стимулиращи епитопа.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до състав, включващ изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение. Споменатият състав може да включва също и фармацевтично приемлив носител и може да бъде медикамент или ваксина.

Настоящото изобретение се отнася и до метод за откриване на присъствието на антитела спрямо вируса на хепатит С в проба, която се очаква, че включва антитела спрямо вируса на хепатит С, като споменатият метод включва:

(i) контакт на протеин или негова част, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно претенции от 1 до 15 на настоящото изобретение, със споменатата проба при условия, позволяващи комплексообразуване на протеин или негова част, обвиващ вируса на хепатит С, със споменатите антитела на вируса на хепатит С, (ii) откриване на формирания, съгласно (i) комплекс, и (iii) вадене на заключение от (ii) за присъствие на споменатите антитела на вируса на хепатит С в споменатата проба.

По-специално, споменатият метод може да включва етап (i), при който споменатият контакт протича при конкурентни условия. В частност, при споменатите методи може да бъде използван твърд супорт, към който се свързва споменатият протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част.

Настоящото изобретение се отнася и до диагностичен набор за откриване присъствието на антитела на вируса на хепатит С в проба, която се очаква, че включва антитела спрямо вируса на хепатит С, като споменатият набор съдържа протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение. По-специално, споменатият набор може да съдържа споменатия протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, свързан към твърд супорт.

Настоящото изобретение се отнася и до медикамент или ваксина, съдържащи протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение.

Настоящото изобретение се отнася също и до фармацевтичен състав за предизвикване на специфична имунна реакция спрямо вируса на хепатит С в бозайник, като споменатият състав включва ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, и по възможност, фармацевтично приемлива добавка. Споменатият фармацевтичен състав може да бъде способен да индуцира специфични антитела спрямо вируса на хепатит С в бозайник или да предизвика действие на Т-клетки в бозайник. Още повече, споменатият фармацевтичен състав може да представлява профилактичен състав или терапевтичен състав. В частност, споменатият бозайник е човек.

Описание на приложените фигури

Фигура 1. Схематична карта на бацилоносителя pGEMT-EsH6RB, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:6.

Фигура 2. Схематична карта на бацилоносителя pCHH-Hir, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:9.

Фигура 3. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT121, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:12.

Фигура 4. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT-CHH-E1-H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:13.

Фигура 5. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT-Mfa-EI-Нб, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:16.

Фигура 6. Схематична карта на бацилоносителя pUC18-MFa-E1-H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:17.

Фигура 7. Схематична карта на бацилоносителя pUC18-FMD-CL-E1-H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:20.

Фигура 8. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT-CL-E1-H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:21.

Фигура 9. Схематична карта на бацилоносителя pSP72E2H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:22.

фигура 10. Схематична карта на бацилоносителя рМРТ121, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:23.

Фигура 11. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT-MFa-E2-H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:24.

Фигура 12. Схематична карта на бацилоносителя pMPT-MFa-E2-H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:25.

Фигура 13. Схематична карта на бацилоносителя pMF30, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:28.

Фигура 14. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT-CL-E2-H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:32.

Фигура 15. Схематична карта на бацилоносителя pUC18-FMD-CL-E1, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:35.

Фигура 16. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT-CL-EI, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:36.

Фигура 17. Схематична карта на бацилоносителя pUC18-FMD-CL-H6-E1-KН6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:39.

Фигура 18. Схематична карта на бацилоносителя pFPMT-CL-H6-K-E1, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:40.

Фигура 19. Схематична карта на бацилоносителя pYIG5, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:41.

Фигура 20. Схематична карта на бацилоносителя pYIG5E1H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:42.

Фигура 21. Схематична карта на бацилоносителя pSY1, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:43.

Фигура 22. Схематична карта на бацилоносителя pSY1aMFE1sH6a, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:44.

Фигура 23. Схематична карта на бацилоносителя pBSK-E2sH6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:45.

Фигура 24. Схематична карта на бацилоносителя pYIG5HCCL-22aH6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:46.

Фигура 25. Схематична карта на бацилоносителя pYYIGSE2H6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:47.

фигура 26. Схематична карта на бацилоносителя pYIG7, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:48.

фигура 27. Схематична карта на бацилоносителя pYIG7E1, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:49.

Фигура 28. Схематична карта на бацилоносителя pSY1YIG7E1s, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:50.

Фигура 29. Схематична карта на бацилоносителя pPICZalphaA, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:51.

Фигура 30. Схематична карта на бацилоносителя pPICZalphaD’, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:52.

Фигура 31. Схематична карта на бацилоносителя pPICZalphaE’, който

притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:53.

фигура 32. Схематична карта на бацилоносителя pPICZalphaD’E1sH6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:58.

Фигура 33. Схематична карта на бацилоносителя pPICZalphaE’E1sH6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:59.

фигура 34. Схематична карта на бацилоносителя pPICZalphaD’E2sH6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:60.

Фигура 35. Схематична карта на бацилоносителя pPICZalphaE’E2sH6, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:61.

Фигура 36. Схематична карта на бацилоносителя pUC18MFa, който притежава последователността, дефинирана в SEQ ID N0:62.

Фигура 37. Профил на елуиране от хроматография, която не отчита размера, на пречистен посредством IMAC Е2-Н6 протеин, отделен от MFa-E2Нб-отделящ Hansenula polymorpha (виж Пример 15). На оста X е нанесен елуиращият обем (в mL). Вертикалните линии през профила на елуиране показват отделените фракции. “РГ = локва на фракции от 4 до 9, “Р2” = локва на фракции от 30 до 35, “РЗ” = локва на фракции от 37 до 44. На оста Y е нанесено поглъщането, дадено в mAU (милиединици на поглъщане). На оста X е нанесен елуиращият обем в mL.

Фигура 38. Различните локви и отделените фракции при хроматография, която не отчита размера, (виж фигура 37) са анализирани посредством нередуциращ SDS-PAGE, последван от маркиране със сребро на полиакриламиден гел. Анализираните локви (“РГ, “Р2” и “РЗ”) и фракции (от 16 до 26) са показани отгоре на хроматограмата на маркирания със сребро гел. От ляво (линия “М”) са показани размерите на молекулните маси на маркерите.

Фигура 39. Фракции от 17 до 23 от хроматографията, която не отчита размера, показани на фигура 37, се събират и алкилират. След това, протеиновият материал се подлага на Endo Н третиране за дегликосилиране. Нетретиранияг материал и Endo Н третираният материал се разделят върху SDS-PAGE гел и се нанасят върху PVDF мембрана. Петната се оцветяват с амидо-черно.

Линия 1: Алкилиран Е2-Н6 преди Endo Н третиране

Линия 2: Алкилиран Е2-Н6 след Endo Н третиране фигура 40. Western blot анализ на клетъчни лизати на Е1, отделен от Saccharomyces cerevisiae. Western blot анализът се провежда при използване на специфично спрямо Е1 моноклонално антитяло IGH 201.

Линии 1-4: Продукт, отделен, съответно, след 2-ия, 3-ия, 5-ия или 7-ия ден на отделяне в Saccharomyces клон, преобразуван с pSY1YIG7E1s (SEQ ID N0:50, фигура 28), включващ нуклеотидната последователност, кодираща пилешкия лизозим водещ пептид, свързан с Е1-Н6.

Линии 5-7: Продукт, отделен, съответно, след 2-ия, 3-ия или 5-ия ден на отделяне в Saccharomyces клон, преобразуван с pSY1aMFE1sH6aYIG1 (SEQ ID N0:44, Фигура 22), включващ нуклеотидната последователност, кодираща асвързващия фактор на водещ пептид, свързан с Е1-Н6.

Линия 8: Молекулно тегло на маркерите, както е показано.

Линия 9: Пречистени E1s, получени от клетки на бозайник, заразени с вирус на HCV-рекомбинантна ваксина.

Фигура 41. Анализ на пречистен, посредством афинитетна хроматография с имобилизиран метален йон (IMAC), Е2-Н6 протеин, отделен от и обработен до CL-E2-H6 от Hansenula polymorpha (виж Пример 17). Протеините с различни фактори на измиване (линии от 2 до 4) и фракциите от елуирането (линии от 5 до 7) са анализирани посредством редуциращ SDS-PAGE, последван от маркиране със сребро на тела (А, отгоре на фигурата) или посредством Western blot при използване на специфично моноклонално антитяло, насочено към Е2 (В, отдолу на фигурата). Размерът на молекулната маса на маркерите е показан отляво.

Фигура 42. Профил на елуиране от първия етап на IMAC-хроматография, върху Ni-IDA колона (Chelating Sepharose FF, натоварена с Ni²⁺, Pharmacia) за пречистване на сулфониран Н6-К-Е1 протеин, отделен от Hansenuia polymorpha (виж Пример 18). Колоната е калибрирана с буфер А (50 тМ фосфат, 6 М гуанидинхлорид, 1% Empigen ВВ (об./об.), pH 7.2), обогатен с 20 тМ имидазол. След взимане на пробата, колоната последователно се промива с буфер А, съдържащ, съответно, 20 тМ и 50 тМ имидазол (както е показано на хроматограмата). Следващото промиване и етапът на елуиране на His-tag продуктите се провеждат при последователно прилагане на буфер В (PBS, % Empigen ВВ, pH 7.2), обогатен, съответно, с 50 тМ имидазол и 200 тМ имидазол (както е показано на хроматограмата). Следните фракции се събират: промита локва 1 (фракции 8-11, промити с 50 тМ имидазол). Елуираният материал се събира като отделни фракции от 63 до 72 или като фракции от елуирането (фракции 63-69). На оста Y е нанесено поглъщането, дадено в mAU (милиединици на поглъщане). На оста X е нанесен елуиращият обем в mL.

Фигура 43. Анализ на пречистен, посредством IMAC Н6-К-Е1 протеин (виж фигура 42), отделен от и обработен от CL-H6-K-E1 до Н6-К-Е1 от Hansenuia polymorpha. Протеините в промитата локва 1 (линия 12) и фракциите от елуирането 63-72 (линии от 2 до 11) са анализирани посредством редуциращ SDS-PAGE, последван от маркиране със сребро на гела (А, отгоре на фигурата). Протеините, присъстващи в пробата преди IMAC (линия 2), в потока през локвата (линия 4) и в промитата локва 1 (линия 5) и в елуираната локва (линия 6) са анализирани посредством Western blot при използване на специфично моноклонално антитяло, насочено към Е1 (В, отдолу на фигурата; в линия 3 не е въведена проба). Размерът на молекулната маса на маркерите (линия М) е показан отляво.

Фигура 44. Профил на елуиране от втория етап на IMAC-хроматография, върху Ni-IDA колона (Chelating Sepharose FF, натоварена с Ni²⁺, Pharmacia) за пречистване на Е1, получен от in vitro обработен Н6-К-Е1 (пречистване: виж Фигура 42) с Endo Lys-C. Преминаващият поток се събира като различни фракции (1-40), които се анализират за присъствие на Е1 продукти. Фракциите (от 7 до 28), съдържащи цял Е1, получен от Н6-К-Е1, се събират. На оста Y е нанесено поглъщането, дадено в mAU (милиединици на поглъщане). На оста X е нанесен елуиращият обем в mL.

Фигура 45. Western blot анализ, показващ специфични ивици на E1s протеини, взаимодействащи с биотинилиран хепарин (виж също Пример 19). Анализирани са Е 1s продуктите, пречистени от клетъчна култура от бозайник, заразени с вирус на HCV-рекомбинантна ваксина, или отделени от Hansenula poiymorpha. Областта в дясно от вертикалната линия показва Western blot анализ, проведен с биотинилиран Е1 специфичен моноклонален IGH 200. Областта в ляво от вертикалната линия показва Western blot анализ, проведен с биотинилиран хепарин. От тези резултати може да се направи изводът, че главно слабо гликосилпраният E1s има силен афинитет към хепарина.

Линии М: Молекулно тегло на маркерите (молекулните тегла са показани отляво).

Линии 1: E1s от клетки на бозайник, алкилирани през време на изолирането.

Линии 2: E1s-H6, отделен от Hansenula polymoipha, сулфониран през време на изолирането.

Линии 3: E1s-H6, отделен от Hansenula polymoipha, алкилиран през време на изолирането.

Линии 4: Същият материал, както в линии 2, но третиран с дитиотреитол до превръщане на сулфонираните Cys-тиолови групи в Cys-тиол.

Фигура 46. Профил на елуиране от хроматография, която не отчита размера (SEC), на пречистен Е2-Н6 протеин, отделен от Hansenula polymorpha в сулфонирана форма, подложен на преминаване в PBS, 3% бетаин за индуциране на формиране на вирусоподобни частици посредством замяна на бетаина с Empigen ВВ. Обединените фракции, съдържащи вирусоподобни частици, използвани при следващи изследвания, са означени с На оста

У е нанесено поглъщането, дадено в mAU (милиединици на поглъщане). На оста X е нанесен елуиращият обем в mL. Виж, също, Пример 20.

Фигура 47. Профил на елуиране от хроматография, която не отчита размера (SEC), на пречистен Е2-Н6 протеин, отделен от Hansenula polymorpha в алкилирана форма, подложен на преминаване в PBS, 3% бетаин за индуциране на формиране на вирусоподобни частици посредством замяна на бетаина с Empigen ВВ. Обединените фракции, съдържащи вирусоподобни частици, използвани при следващи изследвания, са означени с “<—На оста У е нанесено поглъщането, дадено в mAU (милиединици на поглъщане). На оста X е нанесен елуиращият обем в mL. Виж, също, Пример 20.

Фигура 48. Профил на елуиране от хроматография, която не отчита размера (SEC), на пречистен Е1 протеин, отделен от Hansenula polymorpha в сулфонирана форма, подложен на преминаване в PBS, 3% бетаин за индуциране на формиране на вирусоподобни частици посредством замяна на бетаина с Empigen ВВ. Обединените фракции, съдържащи вирусоподобни частици, използвани при следващи изследвания, са означени с На оста

Фигура 49. Профил на елуиране от хроматография, която не отчита размера (SEC), на пречистен Е1 протеин, отделен от Hansenula polymorpha в алкилирана форма, подложен на преминаване в PBS, 3% бетаин за индуциране на формиране на вирусоподобни частици посредством замяна на бетаина с Empigen ВВ. Обединените фракции, съдържащи вирусоподобни частици, използвани при следващи изследвания, са означени с “<—На оста Y е нанесено поглъщането, дадено в mAU (милиединици на поглъщане). На оста X е нанесен елуиращият обем в mL. Виж, също, Пример 20.

Фигура 50. SDS-PAGE (при редукционни условия) и Western blot анализ на вирусоподобни частици, изолирани след хроматография, която не отчита размера (SEC), както е описано за фигури 48 и 49. Лява област: маркиран със сребро SDS-PAGE гел. Дясна област: Western blot при използване на специфично монокпонално антитяло спрямо Е1 (IGH201).

Линии 1: Молекулно тегло на маркерите (молекулните тегла са показани отляво).

Линии 2: Локва от вирусоподобни частици, съдържаща сулфониран Е1 (виж фигура 48).

Линии 3: Локва от вирусоподобни частици, съдържаща алкилиран Е1 (виж Фигура 49). Виж, също, Пример 20.

Фигура 51. Е1, продуциран от клетки на бозайник (“М”) или Е1, продуциран от Hansenula polymorpha (“Н”) са нанесени върху ELISA твърд супорт за определяне на крайния пункт при титруването на антителата, присъстващи в серума след ваксиниране на мишки с Е1, продуциран от клетки на бозайник (горната област) или след ваксиниране на мишки с Е1, продуциран от Hansenula polymorpha (долната област). Хоризонталните линии показват средния титьр на антитялото. Крайният пункт при титруването (пъти разреждане) е показан на оста Y. Виж, също, Пример 22.

Фигура 52. Е1, продуциран от Hansenula polymorpha, е алкилиран (“А”) или сулфониран (“S”) и е нанесен върху ELISA твърд супорт за определяне на крайния пункт при титруването на антителата, присъстващи в серума след ваксиниране на мишки с Е1, продуциран от Hansenula polymorpha, който е алкилиран (горната област) или след ваксиниране на мишки с Е1, продуциран от Hansenula polymorpha, който е сулфониран (долната област). Хоризонталните линии показват средния титър на антитялото. Крайният пункт при титруването (пъти разреждане) е показан на оста Y. Виж, също, Пример 23.

Фигура 53. Е1 на вируса на хепатит С, продуциран от клетки на бозайник, заразени с вирус на рекомбинантна ваксина спрямо вируса на хепатит С, Е1 на вируса на хепатит С, продуциран от Hansenula polymorpha, директно се нанасят върху ELISA плочки. Крайният пункт при титруването на антителата се определя в серум на шимпанзета, ваксинирани с Е1, продуциран от клетки на бозайник (горната област), и на миши моноклонални антитела, повишени спрямо Е1, продуциран от клетки на бозайник (долната област). Шимпанзетата Yoran и Marti са ваксинирани профилактично. Шимпанзетата Ton, Phil, Marcel, Peggy и Femma са ваксинирани с лечебна цел.

Черни правоъгълници на хистограмата: ELISA плочки, покрити с Е1, продуциран от клетки на бозайник.

Бели правоъгълници на хистограмата: ELISA плочки, покрити с Е1, продуциран от Hansenula polymorpha.

Крайният пункт при титруването (пъти разреждане) е показан на оста Y. Виж, също, Пример 24.

Фигура 54. Въглехидратна гелелектрофореза с помощта на флуорофор на олигозахариди, получени от Е1, продуциран от клетки на бозайник, заразени с вирус на рекомбинантна ваксина, и от Е1-Н6 протеин, продуциран от Hansenula polymorpha.

Линия 1: Стълба на глюкозен стандарт като отляво е даден броят на монозахаридите (от 3 до 10, обозначени с от G3 до G10).

Линия 2: 25 цд N-свързани олигозахариди, получени от (алкилиран) Е1, продуциран от клетки на бозайник.

Линия 3: 25 цд N-свързани олигозахариди, получени от (алкилиран) Е1Н6, продуциран от Hansenula polymorpha.

Линия 4:100 пикомола малтотетраоза.

Виж, също, Пример 25.

фигура 55. Тази фигура показва опростени структури на сравнителните олигоманози Мап-9 (Фигура 55.А), Мап-8 (Фигура 55.В), Мап-7 (фигура 55.С), Мап-6 (Фигура 55.D) и Мап-5 (Фигура 55.Е). “Man” = маноза; “GIcNAc” = Nацетилглюкозамин; “а” = ос-връзка между две манози; “β” = β-връзка между две манози; “(1-3)”, “(1-4)” и “(1-6)” = съответно, (1-3), (1-4) и (1-6) връзка между две манози. Скобите на Фигура 55.В и 55.С показват, съответно, че два и един манозни остатъка отляво на скобите, са куплирани, съответно, с а (1-2) връзка, съответно, към два и един, на три манозни остатъка вдясно от скобата. Виж, също, Пример 26.

фигура 56. Тази фигура показва по-висша олигоманоза, съставена от 10 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. Всеки краен манозен остатък е свързан посредством а 1-3 връзка към не-краен манозен остатък. Тънката стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а 1-2 манозидаза (не за тази олигоманоза), дебелите стрелки, сочещи нагоре и наляво, показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а 1-2 манозидаза след отделяне на а 1-2-свързаните манози (неприложимо за тази олигоманоза), а белите стрелки, сочещи надолу показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством β манозидаза след отделяне на а 1-2свързаните манози. Виж, също, Пример 26.

фигура 57. Тази фигура показва по-висша олигоманоза, съставена от 9 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В тази олигоманоза, един краен манозен остатък е свързан посредством а 1-2 връзка с некраен манозен остатък. Тънката стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а 1-2 манозидаза, дебелите стрелки, сочещи нагоре и наляво, показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а манозидаза след отделяне на а 1-2свързаните манози, а белите стрелки, сочещи надолу показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством β манозидаза след отделяне на α-свързаните манози. Виж, също, Пример 26.

Фигура 58. Тази фигура показва сравнителната по-висша олигоманоза Мап-9, съставена от 9 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В тази олигоманоза, всички крайни манозни остатъци са свързани посредством а 1-2 връзка с некраен манозен остатък. Тънката стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а 1-2 манозидаза, дебелите стрелки, сочещи нагоре, показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а манозидаза след отделяне на а 1-2-свързаните манози, а белите стрелки, сочещи надолу показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством β манозидаза след отделяне на α-свързаните манози. Виж, също, Пример 26.

фигура 59. Тази фигура показва по-висшата олигоманоза Мап-8, съставена от 8 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В тази олигоманоза, всички крайни манозни остатъци са свързани посредством а 1-3 или ос 1-6 връзка с некраен манозен остатък, който оставя тази структура напълно резистентна към разцепване посредством а 1-2 манозидаза. Тънката стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а манозидаза, а белите стрелки, сочещи надолу показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством β манозидаза след отделяне на α-свързаните манози. Виж, също, Пример 26.

Фигура 60. Тази фигура показва по-висшата олигоманоза Мап-7, съставена от 7 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В тази олигоманоза, всички крайни манозни остатъци са свързани посредством а 13 връзка с некраен манозен остатък, който оставя тази структура напълно резистентна към разцепване посредством а 1-2 манозидаза. Тънката стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се

разцепват посредством а манозидаза, а белите стрелки, сочещи надолу показват олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством β манозидаза след отделяне на α-свързаните манози. Виж, също, Пример 26.

Фигура 61. Тази фигура показва по-висша олигоманоза, съставена от 9 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В тази олигоманоза, един краен манозен остатък е свързани посредством ос 1-2 връзка с некраен манозен остатък. Тънката стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а 1-2 манозидаза, дебелата стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а манозидаза след отделяне на а 1-2-свързаните манози, а бялата стрелка, сочеща надолу показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством β манозидаза след отделяне на oc-свързаните манози. Виж, също, Пример 26.

Фигура 62. Тази фигура показва предполагаем олигозахарид, съдържащ глюкоза, състоящ се от 1 или 2 глюкозни остатъка и 8 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В този олигозахарид, един от крайните а 1-2-свързани манозни остатъци на А- или В-клона (“Аи “В >” във фигурата) носи 1 или 2 глюкозни остатъка, показани като (Glc)Glc отляво на скобата. Тънката стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством ос 1-2 манозидаза, така че никаква глюкоза не се закача към крайния манозен остатък. Дебелата стрелка, сочеща нагоре, показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством а манозидаза след отделяне на а 1-2-свързаните манози, а бялата стрелка, сочеща надолу показва олигозахаридните връзки, които са склонни да се разцепват посредством β манозидаза след отделяне на асвързаните манози. Преглед на възможните реакционни продукти е направен в Таблица 10 на Пример 26.

Фигура 63. Реакционните продукти на Мап-9 след инкубиране в продължение на една нощ със или без екзагликозидази са разделени върху TSK гел-амид-80 (0.46 х 25 cm, Tosoh Biosep) колона, куплирана към Waters Alliance станция на високоефективна течна хроматография. Разделянето на олигозахаридите се провежда при стайна температура при 1.0 mL/min. Разтворител А се състои от 0.1% оцетна киселина в ацетонитрил и Разтворител В се състои от 0.2% оцетна киселина-0.2% триетиламин във вода. Разделянето на 2-АВ маркираните олигозахариди се провежда при използване на 28% В изократен на 5 колонни обема, последван от линейно повишаване до 45% В над 15 колонни обема. Съставът на разтворителя за елуиране е показан на дясната ос Y като % разтворител В в разтворител А (об./об.). Времето за елуиране е показано в минути на оста X. Лявата ос Y показва флуоресценцията на елуираните олигозахариди, маркирани с 2-аминобензамид (2-АВ). Дължината на вълната на възбуждане на 2-АВ е 330 nm, дължината на вълната на излъчване е 420 nm.

Крива 1 (“1”) на хроматограмата показва елуирането на Мап-9, инкубиран в продължение на една нощ без екзогликозидази. Крива 2 ('2) на хроматограмата показва елуирането на смес на Мап-5 и Мап-6 след инкубиране в продължение на една нощ на Man-9 с а 1-2 манозидаза. Криви 3 и 4 (“3” и “4”) на хроматограмата показват елуирането на 4’-βманозилхитобиоза след инкубиране в продължение, съответно, на един час и една нощ, на Man-9 с а 1-2 манозидаза. Крива 5 (“5”) на хроматограмата показва елуирането на хитобиоза след инкубиране в продължение на една нощ на Мап-9 с а- и β-манозидаза. Криви 1-5 са представени една над друга, като не всички от техните съответни базови линии лежат на нулево ниво. Крива 6 (6”) на хроматограмата показва използвания градиент на разтворителя.

Пиковете, когато присъстват, означени със символите от А до К в горната част на фигурата представляват: А - хитобиоза, В - 4’-β24 манозилхитобиоза, С - Man-2, D - Man-3, Е - Man-4, F - Man-5, G - Man-6, H - Man-

7,1 - Man-7, J - Man-8, K - Man-10. Виж, също и Пример 26.

фигура 64. Реакционните продукти на олигозахаридите, получени от E1s. продуциран от Saccharomyces, след инкубиране в продължение на една нощ със или без екзагликозидази, са разделени върху TSK гел-амид-80 (0.46 х 25 cm, Tosoh Biosep) колона, куплирана към Waters Alliance станция на високоефективна течна хроматография. Разделянето на олигозахаридите се провежда при стайна температура при 1.0 mL/min. Разтворител А се състои от 0.1% оцетна киселина в ацетонитрил и Разтворител В се състои от 0.2% оцетна киселина-0.2% триетиламин във вода. Разделянето на 2-АВ маркираните олигозахариди се провежда при използване на 28% В изократен на 5 колонни обема, последван от линейно повишаване до 45% В над 15 колонни обема. Съставът на разтворителя за елуиране е показан на дясната ос Y като % разтворител В в разтворител А (об./об.). Времето за елуиране е показано в минути на оста X. Лявата ос Y показва флуоресценцията на елуираните олигозахариди, маркирани с 2-аминобензамид (2-АВ). Дължината на вълната на възбуждане на 2-АВ е 330 nm, дължината на вълната на излъчване е 420 nm.

Крива 1 (“1”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, получен от Saccharomyces, инкубирани в продължение на една нощ без екзогликозидази. Крива 2 (“2”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, получен от Saccharomyces, след инкубиране в продължение на една нощ на Man-9 с а 1-2 манозидаза. Криви 3 и 4 (“3” и “4”) на хроматограмата показват елуирането на олигозахариди, получени от Е 1s, получен от Saccharomyces, след инкубиране в продължение, съответно, на един час и една нощ, с а 1-2 манозидаза. Крива 5 (“5”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, получен от Saccharomyces, след инкубиране в продължение на една нощ с а- и β-манозидаза. Криви 1-5 са представени една над друга, като не всички от техните съответни базови линии лежат на нулево ниво. Крива 6 (“6”) на хроматограмата показва използвания градиент на разтворителя.

Пиковете, когато присъстват, означени със символите от А до К в горната част на фигурата представляват: А - хитобиоза, В - 4’-βманозилхитобиоза, С - Man-2, D - Мап-3, Е - Man-4, F - Man-5, G - Мап-6, Н - Мап-

7,1 - Man-7, J - Man-8, К - Мап-10. Виж, също и Пример 26.

Фигура 65. Реакционните продукти на олигозахариди, получени от E1s, продуциран във ваксинирани клетки на бозайник, след инкубиране в продължение на една нощ със или без екзагликозидази са разделени върху TSK гел-амид-80 (0.46 х 25 cm, Tosoh Biosep) колона, куплирана към Waters Alliance станция на високоефективна течна хроматография. Разделянето на олигозахаридите се провежда при стайна температура при 1.0 mL/min. Разтворител А се състои от 0.1% оцетна киселина в ацетонитрил и Разтворител В се състои от 0.2% оцетна киселина-0.2% триетиламин във вода. Разделянето на 2-АВ маркираните олигозахариди се провежда при използване на 28% В изократен на 5 колонни обема, последван от линейно повишаване до 45% В над 15 колонни обема. Съставът на разтворителя за елуиране е показан на дясната ос Y като % разтворител В в разтворител А (об./об.). Времето за елуиране е показано в минути на оста X. Лявата ос Y показва флуоресценцията на елуираните олигозахариди, маркирани с 2-аминобензамид (2-АВ). Дължината на вълната на възбуждане на 2-АВ е 330 nm, дължината на вълната на излъчване е 420 nm.

Крива 1 (“1”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, продуциран във ваксинирани клетки на бозайник, инкубиран в продължение на една нощ без екзогликозидази. Крива 2 (“2) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, продуциран във ваксинирани клетки на бозайник, след инкубиране в продължение на една нощ на Man-9 с а 1-2 манозидаза. Криви 3 и 4 (“3” и “4”) на хроматограмата показват елуирането на олигозахариди, получени от E1s, продуциран във ваксинирани клетки на бозайник, след инкубиране в продължение, съответно, на един час и една нощ, са 1-2 манозидаза. Крива 5 (“5”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, продуциран във ваксинирани клетки на бозайник, след инкубиране в продължение на една нощ с а- и β-манозидаза. Криви 1 -5 са представени една над друга, като не всички от техните съответни базови линии лежат на нулево ниво. Крива 6 (“6”) на хроматограмата показва използвания градиент на разтворителя.

Пиковете, когато присъстват, означени със символите от А до К в горната част на фигурата представляват: А - хитобиоза, В - 4’-рманозилхитобиоза, С - Man-2, D - Man-З, Е - Man-4, F - Man-5, G - Man-6, Н - Мап-

7.1 - Man-7, J - Man-8, К - Man-10. Виж, също и Пример 26.

Фигура 66. Реакционните продукти на олигозахаридите, получени otEIs, продуциран от Hansenuia, след инкубиране в продължение на една нощ със или без екзагликозидази, са разделени върху TSK гел-амид-80 (0.46 х 25 cm, Tosoh Biosep) колона, куплирана към Waters Alliance станция на високоефективна течна хроматография. Разделянето на олигозахаридите се провежда при стайна температура при 1.0 mL/min. Разтворител А се състои от 0.1% оцетна киселина в ацетонитрил и Разтворител В се състои от 0.2% оцетна киселина0.2% триетиламин във вода. Разделянето на 2-АВ маркираните олигозахариди се провежда при използване на 28% В изократен на 5 колонни обема, последван от линейно повишаване до 45% В над 15 колонни обема. Съставът на разтворителя за елуиране е показан на дясната ос Y като % разтворител В в разтворител А (об./об.). Времето за елуиране е показано в минути на оста X. Лявата ос Y показва флуоресценцията на елуираните олигозахариди, маркирани с 2-аминобензамид (2-АВ). Дължината на вълната на възбуждане на 2-АВ е 330 nm, дължината на вълната на излъчване е 420 nm.

Крива 1 (“1”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от Е 1s, получен от Hansenuia, инкубирани в продължение на една нощ

без екзогликозидази. Крива 2 (“2”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, получен от Hansenula, след инкубиране в продължение на една нощ на Мап-9 с α 1-2 манозидаза. Криви 3 и 4 (“3” и “4”) на хроматограмата показват елуирането на олигозахариди, получени от E1s, получен от Hansenula, след инкубиране в продължение, съответно, на един час и една нощ, с ос 1-2 манозидаза. Крива 5 (“5”) на хроматограмата показва елуирането на олигозахариди, получени от E1s, получен от Hansenula, след инкубиране в продължение на една нощ с ос- и β-манозидаза. Криви 1-5 са представени една над друга, като не всички от техните съответни базови линии лежат на нулево ниво. Крива 6 (“6”) на хроматограмата показва използвания градиент на разтворителя.

7,1 - Man-7, J - Man-8, К - Мап-10. Виж, също и Пример 26.

фигура 67. SDS-PAGE анализ и оцветяване с Coomassie Brilliant Blue на Е1 протеини, продуцирани от Hansenula, или от клетки на бозайник, заразени с вирус на рекомбинантна ваксина спрямо вируса на хепатит С.

Линия 1: маркери с молекулно тегло, означени отляво; Линия2:

алкилирани E1s, продуцирани от Hansenula polymorpha, (10 pg); Линия3:

алкилирани E1s, продуцирани от Hansenula polymorpha, (5 pg) Линия4:

алкилирани E1s, продуцирани от Hansenula polymorpha, (2.5 pg); Линия5:

алкилирани Е 1s, продуцирани от веро клетки, заразени с вирус на рекомбинантна ваксина спрямо вируса на хепатит С (10 pg); Линия 6: алкилирани Е 1s, продуцирани от веро клетки, заразени с вирус на рекомбинантна ваксина спрямо вируса на хепатит С (5 pg); Линия 7: алкилирани E1s, продуцирани от веро клетки, заразени с вирус на рекомбинантна ваксина спрямо вируса на хепатит С (2.5 pg). Виж, също и

Пример 27.

Фигура 68. Последователност на Е2-Н6 протеин на вируса на хепатит С (SEQ ID N0:5) с индикация за триптинови фрагменти (оградени последователности) на гликосилирания протеин. Гликосилираните Asn остатъци се превръщат в Asp остатъци посредством PNGase F ензим и са означени със звездичка (“*”) под последователността. Asn остатъците са склонни към протеолитично разцепване посредством Asp-N ендопротеиназа. Възможните места за N-гликосилиране в Е2-Н6 (SEQ ID N0:5) са N417, N423, N430, N443, N478, N532, N540, N553, N₅76, N₆23 и N645, съгласно номерирането в полипротеина на вируса на хепатит С; тези места са номерирани като N34, N40, N47, Nes, N95, N₁₄₉, N157, N173, N₁₃₃, N240 и N262, в тази Фигура. Виж, също и Пример

Подробно описание на изобретението

В работа, водеща до настоящото изобретение, е наблюдавано, че отделяне на гликосилирани протеини, обвиващи вирура на хепатит С, в Saccharomyces cerevisiae, Pchia pastoris и Hansenula polymoipha е възможно при отделяне на споменатите протеини, обвиващи вирура на хепатит С, като протеини, включващи сигнална пептидна последователност, свързана към споменатите протеини, обвиващи вирура на хепатит С. Гликосилираните протеини, обвиващи вирура на хепатит С, отделени в тези три вида квасни гъбички, обаче, са много различни (виж, Примери 6, 10, 13 и 25). По-специално, протеините, обвиващи вирура на хепатит С, отделени в Saccharomyces cerevisiae (мутант с дефицитно гликосилиране) и Hansenula polymoipha се гликосилират по начин, наподобяващ гликосилиране в сърцевина. Протеините, обвиващи вирура на хепатит С, отделени от Pchia pastoris са хипергликосилирани, въпреки по-ранни съобщения, че протеините, отделени в тези квасни гъбички, нормално не са хипергликосилирани (Gellissen, et al., 2000, Surgue et al., 1997).

При по-нататъшен анализ на гликосилираните протеини, обвиващи вирура на хепатит С, продуцирани в Saccharomyces cerevisiae (мутант с дефицитно гликосилиране), и Hansenula polymorpha в заразени клетки на бозайници с рекомбинантен вирус на ваксина спрямо вирура на хепатит С, изненадващо е установено, че протеините, обвиващи вирура на хепатит С, продуцирани в Hansenula показват гликосилиран продукт, който е много перспективен за диагностициране, профилактика и лечебно приложение на тези протеини, обвиващи вирура на хепатит С (виж, Примери 21-24 и 26-29). Това неочаквано откритие е отразено в различни аспекти и детайли на настоящото изобретение, описани по-долу.

® Първият аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обвиващ вирура на хепатит С, или негов фрагмент, характеризиращ се с това, че включва поне едно място за N-гликосилиране, като споменатият протеин или негов фрагмент се характеризира с това, че е продукт на отделяне в евкариотна клетка и с това, че средно до 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95% от местата за N-гликосилиране са гликосилирани в сърцевина. По-специално, повече от 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, • 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%,

88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95% от местата за N-гликосилиране са гликосилирани с олигоманоза със структура Man(8-10)-GlcNAc(2). В допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, съотношението на местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Мап(7) GlcNAc(2) към местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Man(8)-GlcNAc(2) е по-малко от или равно на 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 или 0.50. В още едно допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, споменатите олигоманози съдържат по30 малко от 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% крайна а-1,3-маноза.

Терминът “места за N-гликосилиране, гликосилирани с олигоманоза със структура, дефинирана като Man(8-10)-GlcNAc(2)” означава, че споменатите места за N-гликосилиране са гликосилирани с един от Man(8)-GlcNAc(2), Man(9)-GlcNAc(2) или Man(10)-GlcNAc(2).

Ще стане ясно, че едно и също място за N-гликосилиране в два протеина може да бъде заето с различна олигоманоза.

Терминът “протеин” се отнася до полимер на аминокиселини, като не се отчита специфичната дължина на продукта; следователно, в дефиницията за протеин се включват пептиди, олигопептиди и полипептиди. Терминът не се отнася и не изключва, също така, модификации на протеина, протекли след отделянето, например, гликосилиране, ацетилиране, фосфорилиране и други. В дефиницията се включват, например, полипептиди, съдържащи един или повече аналози на аминокиселини (включващи, например, неприродни аминокиселини, пептиднуклеинови киселини и т.н.), полипептиди със заместени връзки, както и други модификации, известни на специалистите, както тези, протичащи в природата, така и тези, които не протичат в природата.

Използваният в настоящото изобретение термин “пре-про-протеин” или “пре-протеин” означава, съответно, протеин, състоящ се от препро последователност, свързана с въпросния протеин, или протеин, включващ про-последователност, свързана с въпросния протеин. Като алтернатива на термина “пре-последователност” се използват термините “сигнална последователност, “сигнален пептид”, водещ пептид” или “водеща последователност”; като всички те се отнасят до аминокиселинна последователност, насочваща пре-протеин към грубия ендоплазмен ретикулум (ER), което е предварително необходимо условие за N-гликосилиране. “Сигналната последователност, “сигналният пептид”, водещият пептид” или ‘водещата последователност’ се отцепват, т.е. се отделят от протеина, включващ сигналната последователност, свързана към въпросния протеин, на луминалната страна на този ендоплазмен ретикулум посредством приемащи специфични протеази, отнасящи се като сигнални пептидази. Иначе, пре-пропротеинът се превръща в про-протеин при транслокация на лумена на ендоплазмения ретикулум. В зависимост от природата на “про” аминокиселинната последователност, може или не може да бъде отделена от приемащата клетка, отделяща пре-про-протеина. Известна пре-проаминокиселинна последователност е α-свързващ фактор на пре-пропоследователност на α-свързващ фактор на S. cerevisidae.

Терминът “протеин, обвиващ вируса на хепатит С (HCV)” означава протеин или негова част, обвиващ вируса на хепатит С Е1 или вируса на хепатит С Е2, при което споменатите протеини могат да бъдат получени от род вирус на хепатит С от всеки генотип. По-специално, протеинът, обвиващ вируса на хепатит С (HCVENV) се подбира от групата аминокиселинни последователности, включващи SEQ ID NO: от 85 до 98, аминокиселинни последователности, които са поне 90% идентични с SEQ ID N0: от 85 до 98, и техни фрагменти. “Идентични” аминокиселини се считат описаните по-горе групи от запазени аминокиселини, т.е. групата, съдържаща Met, lie, Leu и Val; групата, съдържаща Arg, Lys и His; групата, съдържаща Phe, Trp и Tyr; групата, съдържаща Asp и Glu; групата, съдържаща Asn и Gin; групата, съдържаща Cys, Ser и Thr; и групата, съдържаща Ala и Gly.

По-специално, терминът “протеин, обвиващ вируса на хепатит С (HCV)” се отнася до полипептид или негов аналог (например, мимотопи), включващ аминокиселинна последователност (и/или аминокиселинни аналози), дефинираща поне един епитоп на вируса на хипатит С на Е1 или на Е2 областта, в допълнение към мястото за гликосилиране. Тези обвиващи протеини могат да бъдат мономерни, хетероолигомерни или хомоолигомерни форми на рекомбинантно отделени обвиващи протеини. Обикновено, последователностите, дефиниращи епитопа, съответстват на аминокиселинните последователности на Е1 или на Е2 областта на вируса на хепатит С (или са идентични, или преминават през заместване на аналози на природен аминокиселинен остатък, които не разрушават епитопа).

Трябва да се разбере, че епитопът на вируса на хепатит С може да е локализиран съвместно с мястото за гликосилиране.

Най-общо, последователността, дефинираща епитопа, се състои от 3 или 4 аминокиселини по дължина, по-често от 5, 6 или 7 аминокиселини по дължина, още по-често от 8 или 9 аминокиселини по дължина, и най-вече, от 10 или повече аминокиселини по дължина. По отношение на конформационните епитопи, дължината на последователността, дефинираща епитопа, може да бъде подложена на разширяване, понеже се счита, че тези епитопи се формират с тридименсионална форма на антигена (например, нагъване). Следователно, аминокиселините, дефиниращи епитопа, могат да бъдат относително малко на брой, но широко диспергирани по дължината на молекулата, формираща правилната конформация на епитопа чрез нагъване. Частите на антигена между остатъците, дефиниращи епитопа, могат да не бъдат критични спрямо конформационната структура на епитопа. Например, заличаването или заместването на тези участващи последователности не влияе на конформационния епитоп, при условие, че се поддържат последователности, критични спрямо конформацията на епитопа (например, цистеини, включени в дисулфидно свързване, места за гликосилиране и т.н.). Конформационен епитоп може, също така, да бъде формиран от 2 или повече основни региона на подзвена на хомоолигомер или хетероолигомер.

Както се използва в настоящото изобретение, епитоп на определен полипептид означава епитопи със същата аминокиселинна последователност както епитопа в определения полипептид и техни имунологични еквиваленти. Тези еквиваленти включват също род, подтип (=генотип) или специфични разновидности на вид(група), например, известни последователности или видове, принадлежащи към генотип 1а, 1Ь, 1 с. 1 d, 1 е, 11, 2а, 2Ь. 2с. 2d, 2е, 21, 2д. 2h, 2i, За, ЗЬ, Зс, 3d, Зе, 31, Зд, 4а, 4b, 4с, 4d, 4е, 41, 4д, 4h, 4i, 4j, 4k, 41, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 11 (и техни подтипове), 12 (и техни подтипове) или 13 (и техни подтипове), или някой друг новодефиниран (под)тип на вируса на хепатит С. Трябва да се разбере, че аминокиселините, съставящи епитопа, не е необходимо да бъдат част от линейна последователност, но могат да бъдат разпръснати от редица аминокиселини, формиращи конформационен епитоп.

Антигените на вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, включват конформационни епитопи от Е1 и/или Е2 (обвиващи) домени на вируса на хепатит С. Е1 доменът, който се счита, че съответства на протеин, обвиващ вируса, обхваща аминокиселини 192-383 на полипротеина на вируса на хепатит С (Hijikata et al., 1991). При отделяне в системата за кърмене (гликосилиране), протеинът има средно молекулно тегло 35 kDa, определено посредством SDS-PAGE. Е2 протеинът, преди наричан NS1, се счита, че обхваща аминокиселини 384-809 или 384-746 (Grakoui et al., 1993) на полипротеина на вируса на хепатит С, също и, че е обвиващ протеин. При отделяне в системата за ваксинирано (гликосилиране), се счита, че той има привидно гелово молекулно тегло около 72 kDa. Ясно е, че тези протеинови крайни случаи са приблизителни (например, завършващият с карбоксилна група край на Е2 може да бъде някъде в областта на аминокиселини 730 820, например, да завършва при аминокиселина 730, 735, 740, 742, 744, 745, за предпочитане, 746. 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820). Е2 протеинът може да бъде отделен заедно с Е1 и/или с вътрешност (аа 1-191), и/или с Р7 (аа 747-809), и/или с NS2 (аа 810-1026), и/или с NS3 (аа 1027-1657), и/или с NS4A (аа 1658-1711), и/или с NS4B (аа 1712-1972), и/или с NS5A (аа 19732420), и/или с NS5B (аа 2421-3011), и/или с някоя част на някой протеин на вируса на хепатит С, различен от Е2. Иначе, Е1 протеинът може да бъде отделен заедно с Е2 и/или с вътрешност (аа 1-191), и/или с Р7 (аа 747-809),

J.

и/или c NS2 (aa 810-1026), и/или c NS3 (aa 1027-1657), и/или c NS4A (aa 16581711), и/или c NS4B (aa 1712-1972), и/или c NS5A (aa 1973-2420), и/или c NS5B (aa 2421-3011), и/или c някоя част на някой протеин на вируса на хепатит С, различен от Е1. Отделянето заедно с тези други протеини на вируса на хепатит С може да бъде съществено за постигане на правилно нагъване на протеина.

Използваният в настоящото изобретение термин Έ1” включва също аналози и скъсени форми, които имунологично кръстосано реагират с природен Е1, и включват Е1 протеини от генотипове 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, или от друг новоидентифициран тип или подтип на вируса на хепатит С. Използваният в настоящото изобретение термин Έ2” включва също аналози и скъсени форми, които имунологично кръстосано реагират с природен Е2, и включват Е2 протеини от генотипове 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, или от друг новоидентифициран тип или подтип на вируса на хепатит С. Например, въвеждане на многостранни кодони между кодони 383 и 384, както и заличаването на аминокиселини 384-387, са описани от Kato et al. (1992). Следователно, също така става ясно, че изолатите, използвани в раздела на примерите, съгласно настоящото изобретение, не ограничават обхвата на настоящото изобретение и, че всеки изолат на вируса на хепатит С от тип 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13, или друг нов генотип на вируса на хепатит С, е подходящ източник на Е1 и/или Е2 последователност, съгласно настоящото изобретение. Подобно, както е описано по-горе, протеините на вируса на хепатит С, които едновременно се отделят с протеините, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат получени от всеки тип вирус на хепатит С, следователно, и от същия тип, както протеините, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение.

Използваното в настоящото изобретение “Е1/Е2” се отнася до олигомерна форма на обвиващи протеини, съдържащи поне един Е1 компонент и поне един Е2 компонент.

Терминът “специфичен олигомерен” Е1 и/или Е2 и/или Е1/Е2 обвиващи протеини се отнася до всички възможни олигомерни форми на рекомбинантно отделени Е1 и/или Е2 обвиващи протеини, които не са агрегати. Е1 и/или Е2 специфичните олигомерни обвиващи протеини се отнасят също и до хомоолигомерни Е1 и/или Е2 обвиващи протеини (виж по-долу). Терминът “единичен или специфичен олигомерен” Е1 и/или Е2 и/или Е1/Е2 обвиващи протеини се отнася до единични мономерни Е1 или Е2 протеини (единични в точния смисъл на думата), както и до специфични олигомерни Е1 и/или Е2 и/или Е1/Е2 рекомбинантно отделени протеини. Тези единични или специфични олигомерни обвиващи протеини, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат дефинирани със следната формула (Е1)_Х(Е2)_У, където х може да бъде число от 0 до 100, а у може да бъде число от 0 до 100, при условие, че х и у не са едновременно 0. При х=1 и у=0, споменатите протеини включват мономерен Е1.

Използваният в настоящото изобретение термин “хомоолигомер” се отнася до комплекс на Е1 или Е2, съдържащи повече от един Е1 или Е2 мономер, например, Е1/Е1 димери, Е1/Е1/Е1 тримери или Е1/Е1/Е1/Е1 тетрамери, и Е2/Е2 димери, Е2/Е2/Е2 тримери или Е2/Е2/Е2/Е2 тетрамери, Е1 пентамери и хексамери, Е2 пентамери и хексамери или по-висши хомоолигомери на Е1 или Е2, всичките от тях “хомоолигомери”, съгласно настоящото изобретение. Олигомерите могат да включват един, два или няколко различни мономери на Е1 или Е2, получени от различни типове или подтипове вирус на хепатит С, включващи, например, тези, описани от Maertens et al. в WO94/25601 и WO96/13590, и двата от настоящите заявители. Такива смесени олигомери още са хомоолигомери, съгласно настоящото изобретение, и могат да осигурят по-универсална диагноза, профилактика или лечение на вируса на хепатит С.

Е1 и Е2 антигените, използвани в настоящото изобретение, могат да представляват вирусни протеини с пълна дължина, техни разновидности с почти пълна дължина или техни функционални фрагменти (например, фрагменти, съдържащи поне един епитоп и/или място за гликосилиране). Още повече, антигените на вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, могат да включват също и други последователности, които не блокират или не предотвратяват образуването на въпросния конформационен епитоп. Присъствието или отсъствието на конформационен епитоп може лесно да се определи при сканиране на антигена с антитяло (поликлонален серум или моноклонален спрямо конформационния епитоп) и сравняване на неговата реактивоспособност с тази на променената разновидност на антигена, която оставя само линейни епитопи (ако има). При такова сканиране, използвайки поликлонални антитела, може да е предимство адсорбирано на поликлоналния серум най-напред с променен антиген и наблюдаване дали оставя антитела спрямо въпросния антиген.

Протеините на вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат гликосилирани. Гликосилираните протеини представляват протеини, които съдържат една или повече въглехидратни групи, по-специално, захарни групи. Най-общо, всички евкариотни клетки са способни да гликосилират протеини. След подреждане на различните последователности на протеина, обвиващ генотиповете на вируса на хепатит С, може да се заключи, че не всичките шест места за гликосилиране върху Е1 протеина на вируса на хепатит С са способни на правилно нагъване и реактивоспособност. Известно е още, че мястото за гликосилиране на позиция 325 не се модифицира посредством N-гликосилиране (Fournillier-Jacob et al., 1996, Meunier et al., 1999). Още повече, подтипът на вируса на хепатит С 1b Е1 протеин съдържа шест места за гликосилиране, но някои от тези шест места за гликосилиране отсъстват в някои други (под)типове. Четвъртият въглехидратен мотив (върху Asn250), присъстващ в типове 1Ь, 6а, 7, 8 и 9, отсъства във всички други, известни днес, типове. Този мотив с добавена захар може да мутира до получаване на тип 1b Е1 протеин с подобрена реактивоспособност. Също така, последователностите на тип 2Ь показват допълнително място за гликосилиране във V5 региона (върху Asn299). В изолата S83, принадлежащ към генотип 2с, даже липсва първият въглехидратен мотив във V1 региона (върху Asn), докато присъства във всички други изолати (Stuyver et al., 1994). Обаче, даже сред напълно запазените мотииви с добавена захар, не се изисква присъствие на въглехидрат за нагъване, но той играе роля при избягване на имунното наблюдение. Следователно, идентификацията на ролята на гликосилирането може да се изпитва посредством мутагенеза на гликосилираните мотиви. Мутагенеза на гликосилиран мотив (NXS или NXT последователности) може да се осъществи или при мутирано на кодоните за N, S или Т, по такъв начин, че тези кодони да кодират аминокиселини, различни от N в случая на N, и/или аминокиселини, различни от S или Т в случай на S и в случай на Т. Или пък, X позицията може да бъде мутирана в Р, тъй като е известно, че NPS или NPT не се модифицират често с въглехидрати. След като се установи, кои мотиви с добавен въглехидрат са необходими за нагъване и/или реактивоспособност, и кои не са, могат да се правят комбинации от такива мутации. Такива експерименти са описани от Maertens et al., в Пример 8 на WO96/04385, даден в настоящото изобретение за сравнение.

® Използваният в настоящото изобретение термин “гликосилиране” се отнася до N-гликосилиране, ако не е споменато друго.

В частност, настоящото изобретение се отнася до протеини, обвиващи вируса на хепатит С или техни части, които са гликосилирани в сърцевината. В това отношение, терминът “гликосилирани в сърцевината” се отнася до структура, “подобна” на структурата, представена на Фигура 3 на Herscovics и Orlean (1993). Следователно, показаната въглехидратна структура съдържа от 10 до 11 монозахарида. Видимо, тя е дадена в настоящото изобретение за сравнение. Терминът “подобна” означава, че не повече от 4 допълнителни монозахарида се добавят към структурата или, че не повече от около 3 монозахарида се отделят от структурата. Следователно, гликосилираната в сърцевината въглехидратна структура, съгласно настоящото изобретение, включва минимално 7 и максимално 15 монозахарида и може да съдържа 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 монозахарида. Означените монозахариди са, за предпочитане, глюкоза, маноза или N-ацетилглюкозамид.

Алтернативен аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, включващ поне едно място за N-гликосилиране, характеризиращ се с това, че споменатият протеин или негов фрагмент е продукт на отделяне в евкариотна клетка и с това, че повече от 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, © 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%,

86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95% от местата за Nгликосилиране са гликосилирани с олигоманоза със структура Мап(8-10)GlcNAc(2). В допълнение към посочената по-горе характеристика на Nгликосилирането, съотношението на местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Man(7)-GlcNAc(2) към местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Man(8)-GlcNAc(2) е по-малко от или равно на 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 или 0.50. В още едно допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, © споменатите олигоманози съдържат по-малко от 20%, 19%, 18%, 17%, 16%,

15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% крайна а-1,3-маноза.

Друг алтернативен аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, включващ поне едно място за N-гликосилиране, характеризиращ се с това, че споменатият протеин или негов фрагмент е продукт на отделяне в евкариотна клетка и с това, че местата за N-гликосилиране са окупирани от олигоманози, като съотношението на олигоманозите със структура Man(7)-GlcNAc(2) към олигоманозите със структура Man(8)-GlcNAc(2) е по-малко от или равно на 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 или 0.50. В допълнение към посочената по39 горе характеристика на N-гликосилирането, споменатите олигоманози съдържат по-малко от 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% крайна а-1,3-маноза.

Друг алтернативен аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, включващ поне едно място за N-гликосилиране, характеризиращ се с това, че споменатият протеин или негов фрагмент е продукт на отделяне в евкариотна клетка не от бозайник и с това, че броят на местата за N-гликосилиране е поне 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% или 15%, по-малък от броя на местата за N-гликосилиране в същия протеин или негов фрагмент, отделен от вирус на ваксина в евкариотна клетка, подразположена или заразена със споменатия вирус на ваксина. В допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, до 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,

72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% или 80% от споменатите места за Nгликосилиране са гликосилирани в сърцевина. По-специално, повече от 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%,

76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,

91%, 92%, 93%, 94% или 95% от местата за N-гликосилиране са гликосилирани с олигоманоза със структура Man(8-10)-GlcNAc(2). В допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, съотношението на местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Мап(7)GlcNAc(2) към местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Man(8)-GlcNAc(2) е по-малко от или равно на 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 или 0.50. В още едно допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, споменатите олигоманози съдържат помалко от 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% крайна а-1,3-маноза.

В друг аспект на настоящото изобретение, изолираният протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, е продукт на отделяне в клетка на квасни гъбички. По-специално, изолираният протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, е продукт на отделяне в клетка на щамове на Saccharomyces, като Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces kluyveii или Saccharomyces uvarum, Sclizosaccharomyces като Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, като Kluyveromyces lactis. Yarrowia, като Yarrowia ipolytica, Hansenula, като Hansenula polymorpha, Pichia, като Pichia pastoris, Aspergillus species, Neurospora като Neurospora crassa, или Schwanniomyces, като Schwanniomyces ocddentaHs или мутантни клетки, получени от тях. Поспециално, изолираният протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, е продукт на отделяне в Hansenula клетка. Още по-специално, изолираният протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, е продукт на отделяне в квасни гъбички, например, Hansenula клетка, в отсъствие на инхибитори на гликосилирането, като туникамицин.

В друг аспект на настоящото изобретение, изолираният протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, се получава от протеин, включващ авиан лизозим водещ пептид или негова функционална разновидност, свързана със споменатия протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент. По-специално, изолираният протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно настоящото изобретение, се получава от протеин, характеризиращ се със структурата:

CL-[(A1)_a-(PS1)b-(A2)_c]-HCVENV-[(A3)_{l-(RS2)_e-(A4)₁] където:

PS1 и PS2 са работещи места, които могат да бъдат различни или еднакви, HCVENV е протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, a, b, с, d, е и t са 0 или 1, и където, А1 и/или А2 могат да бъдат част на PS1 и/или, където АЗ и/или А4 могат да бъдат част на PS2.

Терминът “авиан лизозим водещ пептид или негов функционален еквивалент, свързан с протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част” означава, че крайната аминокиселина на споменатия водещ пептид е ковалентно свързана през пептидна връзка с N-крайната аминокиселина на споменатия протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част. Или пък, крайната аминокиселина на споменатия водещ пептид е разделена от Nкрайната аминокиселина на споменатия протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, от пептид или протеин. Споменатите пептид или протеин могат да притежават споменатата по-горе структура -[(А1)_а-(Р81)ь (А2)_с].

Получаването на споменатия протеин, обхващащ вируса на хепатит С, от протеина, съдържащ авиан лизозим водещ пептид или негов функционален еквивалент, свързан с протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част или на протеина, характеризиращ се със структура CL-[(A1)_a-(PS1)_b-(A2)_c]HCVENV-[(A3)d-(PS2)_e-(A4)f], може да бъде проведено in vivo посредством протеолитично обработване на клетките, в които се отделя пре-про-протеин. По-специално, етапът, включващ отделяне на авиан водещ пептид, се провежда, за предпочитане, in vivo посредством протеолитично обработване на клетките, в които се отделя пре-протеин. Обаче, получаването може да бъде проведено също единствено in vitro след и/или през време на изолерането и/или пречистването на пре-протеина и/или протеина от клетките, отделящи пре-протеин, и/или от културната среда, в която нарастват клетките, отделящи пре-протеин. Или пък, споменатото in vivo получаване се провежда в комбинация със споменатото in vitro получаване. Получаването на споменатия протеин, обхващащ вируса на хепатит С, от рекомбинантно отделен препротеин може да включва използване на протеолитичен(ни) ензим(и) в етапа на изглаждането, където всички или повечето от заразяващите протеини, присъстващи заедно със споменатия протеин, се разлагат и, където споменатият протеин е резистентен към заразяващия(ите) протеолитичен(ни) ензим(и). Получаването и заразяването не са взаимно изключващи се процеса и могат да бъдат осъществени при използване на един и същи единичен протеолитичен ензим. Като пример в настоящото изобретение е даден протеин, обхващащ вируса на хепатит С, Е1 протеини на протеин, обхващащ вируса на хепатит С, от генотип 1b (SEQ ID N0:2), който е лишен от Lysостатьци. При асимилиране на екстракт на Е1 протеините на протеина, обхващащ вируса на хепатит С, с ендопротеиназа Lys-C (ендо-Lys-C), Е1 протеините няма да деградират, докато заразяващите протеини, съдържащи един или повече Lys-остатьци, деградират. Този процес може значително да опрости или да подобри изолирането и/или пречистването на Е1 протеините на протеина, обхващащ вируса на хепатит С. Още повече, при въвеждане на Lys-остатък в пре-протеина, например, между водещия пептид и Е1 протеина на протеина, обхващащ вируса на хепатит С, се предоставя допълнителна възможност за коректно in vitro разделяне на водещия пептид от Е1 препротеина на протеина, обхващащ вируса на хепатит С. Други Е1 протеини на протеина, обхващащ вируса на хепатит С, могат да включват Lys-остатьк в една или повече от позиции 4, 40, 42, 44, 61, 65 или 179 (където позиция 1 е първата, N-крайна природна аминокиселина на Е1 протеина, т.е. позиция 192 в полипротеина на протеина, обхващащ вируса на хепатит С. За да е възможно използването на ендо-Lys-C, описан по-горе, споменатите Lys-остатьци могат да мутират в друг аминокиселинен остатък, за предпочитане, в Агд-остатьк.

Терминът “коректно отделен” водещ пептид означава, че споменатият водещ пептид е отделен от протеина, включващ сигналната последователност, свързана към споменатия протеин с висока ефективност, т.е. голям брой препро-протеини се превръщат в про-протеини, и с висока прецизност, т.е. отделя се само пре-аминокиселинната последователност, а не друга аминокиселина от въпросния протеин, свързан със споменатата пре-аминокиселинна последователност. Терминът “отделяне на водещия пептид с висока ефективност” означава, че поне около 40%, за предпочитане, около 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или даже 99% от препротеините се превръщат в протеина, от който се отделя препоследователността. Или пък, ако значителна част от отделените пре-протеини не се превръщат в протеина, от който се отделя пре-последователността, тези пре-протеини вече могат да бъдат пречистени или отстранени през време на пречистването.

Терминът “функционален еквивалент на авиан лизозим (CL) водещ пептид” означава авиан лизозим (CL) водещи пептид, в който една или повече аминокиселини са заместени с друга аминокиселина, при което споменатото заместване е съхранено аминокиселинно заместване. Терминът “съхранено аминокиселинно заместване” означава заместване на аминокиселина, принадлежаща към групата на запазените аминокиселини с друга аминокиселина, принадлежаща към групата на запазените аминокиселини. Групи на запазените аминокиселини се счита, че са: групата, съдържаща Met, lie, Leu и Val; групата, съдържаща Arg, Lys и His; групата, съдържаща Phe, Trp и Tyr; групата, съдържаща Asp и Glu; групата, съдържаща Asn и Gin; групата, съдържаща Cys, Ser и Thr; и групата, съдържаща Ala и Gly. Примерно запазено аминокиселинно заместване в CL водещия пептид е природната промяна в позиция 6, като аминокиселината в тази позиция е или Val или Не; друга промяна протича в позиция 17, като аминокиселината в тази позиция е, сред воички останали, Leu или Pro (виж, SEQ ID N0:1). Следователно, получените CL водещи пептиди се считат за функционални еквиваленти. Други функционални еквиваленти на CL водещите пептиди включват онези водещи пептиди, репродуциращи същите технически аспекти, като CL водещите пептиди, описани в настоящото изобретение, включващи разновидности от заличаване и разновидности от вмъкване.

С “А” или “адапторен пептид” се означава пептид (например, с 1 до 30 аминокиселини) или протеин, които могат да служат като връзка между, например, водещ пептид и работещо място (PS), водещ пептид и въпросния протеин, работещо място и въпросния протеин и/или въпросния протеин и работещо място; и/или могат да служат като връзка в N- или С-края на, например, водещ пептид, работещо място или въпросния протеин. Адапторният пептид “А” може да притежава тридименсионална структура, напрмер, аспираловидна или β-равнинна структура или техни комбинации. Или пък, тридименсионалната структура на адапторния пептид не е дефинирана, например, кълбовидна структура. Адапторният пептид може да бъде част, например, от пре-последователност, про-последователност, последователност на въпросния протеин или действащо място. Адапторният пептид може да служи като tag, подобряващ или осигуряващ откриване и/или пречистване и/или действие на протеина, от който адапторният пептид е част. Пример за адапторен пептид е his-tag пептида (НННННН; SEQ ID N0:63) Нп, където η обикновено е 6, но може да бъде 7, 8, 9, 10, 11 или 12. Други примери за адапторни пептиди включват пептидите EEGEPK (Kjeldsen et al., WO98/28429; SEQ ID N0:64) или EEAEPK (Kjeldsen et al., WO97/22706; SEQ ID N0:65), които, когато присъстват в N-края на въпросния протеин, повишават ферментацията на квасните гъбички, но също и защитават N-края на въпросния протеин по отношение на действието на дипептидиламинопептидазата и, оттук, получаване на хомогенен N-края на полипептида. В същото време, in vitro узряването на въпросния протеин, т.е. отделянето на споменатите пептиди EEGEPK (SEQ ID N0:64) и EEAEPK (SEQ ID N0:65) от въпросния протеин може да бъде постигнато при използване, например, на ендо-lys С, който разцепва С-края на Lys-остатъка на споменатите пептиди. Следователно, споменатите пептиди служат като функция на адапторния пептид (А), както и на действащото място (PS) (виж по-горе). Адапторните пептиди са дадени в SEQ ID N0:63-65, 70-72 и 74-82. Друг пример за адапторен пептид е G4S имунобезшумния линкер. Други примери за адапторни пептиди или адапторни протеини са дадени в Таблица 2 от Stevens (Stevens et al., 2000).

C “PS” или “действащо място” се означава място за действие на специфичен протеин. Споменатото действие може да протича ензимно или химично. Примери за действащи места, разположени до специфични ензимни действащи места, включват IEGFUX (SEQ ID N0:66), IDGFUX (SEQ ID N0:67), AEGRiX (SEQ ID N0:68), всички разположени между Arg и Xaa остатъците (на коя да е аминокиселина), обозначено с Ч” от Ха протеазата на говеждия фактор (Nagai, К., Thogersen, Н.С., 1984). Друг пример за работещо място е дибазично място, например, Arg-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys или Lys-Arg, което се разцепва от Кех2 протеазата на квасни гъбички (Julius, D. et al., 1984). Действащото място може да бъде и монобазично Lys-място. Споменатото монобазично Lys-действащо място може да бъде включено и в С-края на адапторния пептид. Примери за адапторни пептиди, включващи С-крайно монобазично Lys-действащо място, са дадени в SEQ ID N0:64-65 и 74-76. Екзопротеолитично отстраняване на His-tag (НННННН; SEQ ID N0:63) е възможно при използване на дипептидиламинопептидаза I (DAPase) самостоятелно или в комбинация с глутаминциклотрансфераза (Qcyclase) и пироглутаминова аминопептидаза (pGAPase) (Pedersen, J. et al., 1999). Споменатите екзопептидази, включващи рекомбинантен His-tag (позволяващ отстраняване на пептидазата от реакционната смес посредством имобилизационна метал-афинитетна хроматография, IMAC), са търговски продукти, например, като TAGZyme System of Unizyme Laboratories (Hoersholm, DK). Най-общо, c “действащо” се означава всеки метод или процедура, с помощта на които протеинът се разцепва специфично или става възможно да бъде разцепен, на поне едно действащо място, когато споменатото действащо място присъства в споменатия протеин. Действащото място може да бъде разположено до ендопротеолитично разцепване или може да бъде разположено до екзопротеолитично разцепване, като във всеки случай разцепването е специфично, т.е. не се разпростира на други места, освен тези, разпознати от действащия протеолитичен ензим. Броят на действащите места е даден в SEQ ID N0:66-68 и 83-84.

Многостранността на подчертаната по-горе структура [(A1/3)a/d(PS1/2)b/_e-(A2/4)c/fJ е демонстрирана с няколко примера. В първия пример, споменатата структура присъства в С-края на въпросния протеин, включена в пре-протеин, където АЗ е “VIEGR” пептид (SEQ ID N0:69), който се припокрива с фактор Ха “IEGRX” действащо място (SEQ ID N0:66), и, където Х=А4 е хистидин-tag (SEQ ID N0:63) (в този случай, всички d.e и f са 1). Въпросния протеин на вируса на хепатит С може (по възможност) да бъде пречистен посредством имобилизационна метал-афинитетна хроматография (IMAC). След действието на фактор Ха, (по възможност пречистеният) въпросен протеин на вируса на хепатит С, носи на С-края си обработено действащо място, което е “IEGR” (SEQ ID N0.70). Измененото от фактор Ха действащо място може да бъде “IDGR” (SEQ ID N0:71) или “AEGR” (SEQ ID N0:72). В друг пример, структурата [(A1/3)_a/_d-(PS1/2)b/e-(A2/4)_c/f] присъства в N-края на въпросния протеин на вируса на хепатит С. Още повече, А1 е хистидин-tag (SEQ ID N0:63), действащото място е място за разпознаване от фактор Ха (всяка от SEQ ID N0:66-68), където X е въпросния протеин и а=Ь=1 и с=0. При коректно отделяне на водещи пептид, например, от приемаща клетка, полученият протеин на вируса на хепатит С може да бъде пречистен посредством имобилизационна метал-афинитетна хроматография (IMAC) (по възможност). След действието на фактор Ха, въпросният протеин ще бъде лишен от структурата [(A1)_a-(PS1)b-(A2)_cJ.

По-нататък ще стане ясно, че всеки от А1, А2, АЗ, А4, PS1 и PS2, когато присъстват, могат да присъстват в повтаряща се структура. Такава повтаряща се структура, когато присъства, в този смисъл се брои като 1, т.е. a, b, с, d, е или f са 1, даже ако, например, А1 се повтаря, например два пъти (А1-А1).

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че цистеин-тиоловите групи са химично модифицирани.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че е антигенен.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че е имуногенен.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че съдържа Т-клетки, стимулиращи епитопа.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че е включен в структура, избрана от групата, включваща мономери, хомодимери, хетеродимери, хомоолигомери и хетероолигомери.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, характеризиращ се с това, че е включен във вирусоподобна частица.

В протеините, обвиващи вируса на хепатит С, или в техни части, описани в настоящото изобретение, съдържащи поне един цистеинов остатък, за предпочитане, 2 или повече цистеинови остатъци, цистеин-тиоловите групи могат да бъдат необратимо защитени по химичен или ензимен начин. В частност, “необратима защита” или “необратимо блокиране” по химичен начин се отнася до алкилиране, за предпочитане, алкилиране на протеините, обвиващи вируса на хепатит С посредством алкилиращи агенти, като например, активни халогени, етиленимин или М-(йодетил)трифлуорацетамид. В този смисъл трябва да се разбира, че алкилирането на цистеин-тиоловите групи означава заместване на тиоловия водород с (CH₂)_nR, където η е 0, 1, 2, 3 или 4 и R е водород, карбоксилна група, аминогрупа, амидна група, фенил, или техни производни. Алкилирането може да бъде проведено по известен на специалистите метод, като например, активни халогени X(CH₂)_nR, в които X е халоген, като йод, бром, хлор или флуор. Примери за активни халогени са метилйодид, йодоцетна киселина, йодацетамид и 2-брометиламин. Други методи за алкилиране включват използването на NEM (N-етилмалеимид) или Biotin-NEM, техни смеси, или етиленимин или М-(йодетил)трифлуорацетамид, като и двата водят до заместване на водород с -CH₂-CH₂-NH₂ (Hermanson, G.T., 1996). Използваният в настоящото изобретение термин “алкилиращи агенти” се отнася до съединения, които са способни да осигурят алкилиране, както е описано в настоящото изобретение. Това алкилиране води до получаване на модифициран цистеин, който може да имитира други аминокиселини. Алкилирането с етиленимин води до структура, наподобяваща лизин, по такъв начин, че се въвеждат нови места за отцепване на трипсин (Hermanson, G.T., 1996). По същия начин, използването на метилйодид води до аминокиселина, наподобяваща метионин, докато при използване на йодацетат и йодацетамид се получават аминокиселини, наподобяващи, съответно, глугаминова киселина и глутамин. По аналогия, предпочита се, тези аминокиселини да се използват за директна мутация на цистеина. Следователно, настоящото изобретение се отнася до протеини, обвиващи вируса на хепатит С, характеризиращи се с това, че поне един цистеинов остатък от протеина, обвиващ вируса на хепатит С, мутира до природна аминокиселина, преференциално до метионин, глутаминова киселина, глутамин или лизин. Терминът “мутирал” се отнася до насочена към мястото мутагенеза на нуклеинови киселини, кодиращи тези аминокиселини, т.е. до известни на специалистите методи, като например, насочена към мястото мутагенеза посредством PCR или през управлявана от олигонуклеотид мутагенеза, както е описано в (Sambrook, J. et al., 1989). Трябва да бъде ясно, че в примерите, съгласно настоящото изобретение, алкилирането се отнася до използване на йодацетамид като алкилиращ агент, ако не е споменато друго.

Трябва да се разбере още, че при пречистването, цистеин-тиоловите групи на протеините на вируса на хепатит С или на техни части, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат обратимо защитени. Целта на обратимото защитаване е стабилизиране на протеина на вируса на хепатит С или на негова част. По-специално, след обратимото защитаване, сяросъдържащите функционални групи (например, тиоли и дисулфиди) остават в нереактивоспособно състояние. Следователно, сяросъдържащите функционални групи вече не са способни да взаимодействат с други съединения, например, изгубили са способността си за формиране или обменяне на дисулфидни връзки, като например

RrSH + R₂-SH	-X ->	R_rS-S-R₂;
R1-S-S-R2 + R3-SH	-Х->	R1-S-S-R3 + R₂-SH;
R1-S-S-R2 + R3-S-S-R4	-X ->	R1-S-S-R3 + R3-S-S-R4.
Описаните реакции	между тиоли	и/или дисулфидни остатъци не са

ограничени до междумолекулни процеси, но могат да протичат вътрешно молекулно.

Използваният в настоящото изобретение термин “обратимо защитаване” или “обратимо блокиране” обхваща ковалентно свързване на модифициращи агенти към цистеин-тиоловите групи, както и манипулиране със средата на протеина на вируса на хепатит С, така че редокси състоянието на цистеин-тиоловите групи остава незасегнато по време на следващите етапи на пречистване (защита). Обратимото защитаване на цистеин-тиоловите групи може да бъде проведено химично или ензимно.

Използваният в настоящото изобретение термин “обратимо защитаване по ензимен начин” обхваща обратимо защитаване, управлявано от ензими, като например, ацилтрансферази, например, ацилтрансферази, които могат да бъдат включени в каталитична тиоестерификация, като палмитоил ацилтрансфераза (виж по-долу).

Използваният в настоящото изобретение термин “обратимо защитаване по химичен начин” обхваща обратимо защитаване:

1. Посредством модифициращи агенти, които обратимо модифицират цистеинили, като например, посредством сулфониране и тиоестерификация;

Сулфонирането е реакция, при която тиол или цистеини, включени в дисулфидни мостове, се модифицират до S-сулфонат: RSH -> RS-SO₃ (Darbre. A, 1986) или RS-SR 2 RS-SO3· (сулфитолиза; (Kumar, N. et al., 1986)). Реагентите за сулфониране са, например, натриев сулфит или натриев тетратионат. Последните реагенти за сулфониране се използват в концентрация 10-200 mM, за предпочитане, в концентрация 50-200 mM. Възможно е, сулфонирането да бъде проведено в присъствие на катализатор, като Си²⁺ (100 μΜ-1 mM) или цистеин (1-10 mM).

Реакцията може да бъде проведена при денатуриране на протеина, както и в природни условия (Kumar, N. et al., 1985; Kumar, N. et al., 1986).

Формирането на тиоестерна връзка, или тиоестерификацията се характеризира с:

RSH + R’COX RS-COR’ където X е, за предпочитане, халогенид в съединението R’CO-X.

2. Посредством модифициращи агенти, които обратимо модифицират цистеинилите, съгласно настоящото изобретение, като например, посредством тежки метали, в частност Zn²⁺, Cd²⁺, моно-, дитио- и дисулфидни съединения (например, арил- и алкилметантиосулфонат, дитиопиридин, дитиоморфолин, дихидролипоамид, реагент на Ellmann, алдротиол™ (Aldrich) (rein, A. et al., 1996), дитиокарбамати) или тиолиращи агенти (например, глутатион, Nацетилцистеин, цистеинамин). Дитиокарбаматите включват широк клас молекули, притежаващи RiRsNCiSJSRa функционална група, която им придава способност да взаимодействат със сулфхидрилни групи. Предпочита се, тиолсъдържащите съединения да се използват в концентрация 0.1-50 mM, повече се предпочита, в концентрация 1-50 mM, а още повече се предпочита, в концентрация 10-50 mM;

3. В присъствие на модифициращи агенти, които запазват тиоловия статус (стабилизират), в частност, действат като антиоксиданти, като например, дитиотреитол, дихидроаскорбат, витамини и производни, манитол, аминокиселини, пептиди и производни (например, хистидин, ерготионеин, карнозин, метионин), галати, хидроксианизол, хидрокситолуен, хидрохинон, хидроксиметилфенол и техни производни в концентрационен интервал 10 μΜ10 mM, като повече се предпочита, в концентрация 1-10 mM;

4. В условия, които стабилизират тиола, като например, (i) кофактори като метални йони (Zn²⁺, Mg²⁺), ATP, (ii) pH контрол (например, за протеини в повечето случаи рН«5 или pH, за предпочитане, е тиол рК_а-2; например за пептиди, пречистени посредством обратима фазова хроматография при рН~2).

Комбинациите на обратима защита, описани в (1), (2), (3) и (4), водят до получаване на почти чисти и повторно нагънати протеини на вируса на хепатит С. В действителност, могат да се получат смесени съединения, като например, Z103 (цинков карнозин), за предпочитане, в концентрация 1-10 mM. Трябва да стане ясно, че обратимата защита се отнася също до, освен описаните по-горе модификация на групите или защитаване, метод за цистеинилова защита, която може да е ензимно или химично обратима, без разрушаване на пептидния скелет. В това отношение, настоящото изобретение специфично се отнася до пептиди, получени при класически химичен синтез (виж по-горе), при който, например, тиоестерните връзки се разцепват посредством тиоестераза, в базични буферни условия (Beekman, N.J. et al., 1997) или посредством третиране с хидроксиламин (Vingerhoeds, М.Н. et al., 1996).

Тиолсъдържащите протеини на вируса на хепатит С могат да бъдат пречистени, например, върху хроматографски смоли, които съдържат (1) конекторна ръка, съдържаща дисулфидна връзка, която може да се разцепи (например, имобилизирана 5,5’-дитиобис(2-нитробензоена киселина) (Jayabaskaran, С. et al., 1987) и посредством ковалентна хроматография върху активна тиол-Сефароза 4В (Pharmacia)), или (2) аминохексаноил-4аминофениларзин като имобилизиран лиганд. Втората афинитетна матрица се използва за пречистване на протеини, които са подложени на редукционно регулиране и дитиолови протеини, които са мишена за окислително напрежение (Kalef, Е. et al., 1993).

Обратимото защитаване може да се използва и за повишаване на разтворимостта и екстрахирането на пептидите (Роплгоу, N.C., Deber, С.М., 1998).

Обратимо защитените и тиол-стабилизиращите съединения могат да присъстват в мономерна, полимерна или липозомна форма.

Отстраняването на обратимото защитно състояние на цистеиновите остатъци може да бъде осъществено химично или ензимно посредством, например:

редуктант, по-специално, дитиотреитол, дитиоеритритол, 2меркаптоетанол, дитионит, калаен двухлорид, натриев борхидрид, хидроксиламин, ТСЕР, в частност, в концентрация 1-200 тМ, по-специално, в концентрация 50-200 тМ;

- премахване на тиол-стабилизиращите условия или агенти посредством, например, повишаване на pH;

- ензими, в частност, тиоестерази, глутардоксин, тиоредоксин, поспециално, в концентрация 0.01-5 μΜ, по-специално, в концентрация 0.1-5 μΜ;

- комбинации на гореописаните химични и/или ензимни условия.

Премахването на обратимото защитно състояние на цистеиновите остатъци може да бъде проведено in vitro или in vivo, например, в клетка или в индивид.

Трябва да се прецени, дали при пречистването цистеиновите остатъци могат или не могат да бъдат необратимо блокирани, или заменени с някакъв обратим модифициращ агент, както е посочено по-горе.

Редуктант, съгласно настоящото изобретение, е всеки реагент, който осигурява редукция на сярата в цистеиновите остатъци, например, “S-S” дисулфидни мостове, десулфониране на цистеиновия остатък (RS-SO₃ -> RSH). Антиоксидант е е всеки реагент, който запазва тиоловия статус или минимизира формирането и/или обмяната на “S-S”. Редукцията на “S-S” дисулфидните мостове е химична реакция, при която дисулфидите се редуцират до тиол (-SH). Реагентите и методите за разрушаване на дисулфидния мост, описани от Maertens et al., WO96/04385, са въведени съгласно настоящото описание. Редукцията на “S-S” може да се осъществи при (1) ензимна каскада или посредством (2) редуциращи съединения. Известно е, че ензими като тиоредоксин, глутаредоксин се въвеждат при in vivo редукцията на дисулфидите и е показано, че са ефективни при редуциране на “S-S” мостовете in vitro. Дисулфидните връзки лесно се разцепват посредством тиоредоксин при pH 7.0, със скорост от втори порядък, която е около 10⁴ пъти по-голяма от съответната скорост, която е постоянна за реакцията с дитиотреитол. Кинетиката на редукцията може драматично да бъде ускорена посредством предварително инкубиране на разтвор на протеин с 1 тМ дитиотреитол или дихидролипоамид (Holmgren, А, 1979). Тиолови съединения, способни да редуцират дисулфидните мостове на протеина, са, например, дитиотреитол (DTT), дитиоеритритол (DTE), β-меркаптоетанол, тиокарбамати, бис(2-меркаптоетил)сулфон и М,М’-бис(меркаптоацетил)хидразин и натриев дитионит. Редуциращи агенти без тиолови групи, като аскорбат или калаен двухлорид, които са много ефикасни при редукция на дисулфидни мостове в моноклонални антитела (Thakur, M.L. et al., 1991), могат да се използват и при редукцията на протеините на вируса на хепатит С. Още повече, промените в стойностите на pH могат да влияят върху редукционния статус на протеините на вируса на хепатит С. Показано е, че третирането с натриев борхидрид е ефективно при редукцията на дисулфидните мостове в пептидите (Gailit, J., 1993). Трис(2-карбоксиетил)фосфин (ТСЕР) е способен да редуцира дисулфиди при ниско pH (Burns, J. et al., 1991). Селенолът катализира редукцията на дисулфида до тиоли, когато като редуктанти се използват дитиотреитол или натриев борхидрид. Като прекурсор на катализатора се използва селеноцистеамин, диселенид - търговски продукт (Singh, R., Kats, L., 1995).

Терминът “имуногенен” се отнася до способността на протеин или субстанция да проявява имунна реакция. Имунната реакция представлява цялостен отговор на тялото при въвеждане на антиген, включително формиране на антитяло, клетъчен имунитет, свръхчувствителност или имунологична търпимост. Клетъчният имунитет се отнася до Т-помощно клетъчен и/или CTL-отговор.

Терминът “антигенен” се отнася до способността на протеин или субстанция да предизвиква образуване на антитяло или клетъчна реакция.

Отделянето на “епитоп, стимулиращ Т-клетка”, съгласно настоящото изобретение, се отнася до епитоп, способен да стимулира, съответно, Т-клетки или CTL-клетки. Епитоп, стимулиращ Т-помощна клетка, може да бъде подбран при наблюдение на лимфопролиферативната реакция, насочена към полипептиди, съдържащи в аминокиселинната си последователност (предполагаем) епитоп, стимулиращ Т-клетките. Споменатата лимфопролиферативна реакция може да бъде измерена посредством анализ на Т-хелпера, включващ in vitro стимулиране на периферни кръвни моноядрени клетки (РМВС) от серум на пациент с различни концентрации на пептиди, който се изследва за стимулираща активност на Т-клетките и преброяване на количеството повишен радиационно маркиран тимидин. Епитопът, стимулиращ CTL-клетките може да бъде подбран при цитотоксичен анализ на Т-клетки (CTL) при измерване на постепенно спадащата активност на цитотоксични клетки при използване на освобождаване на ⁵¹Сг. Пролиферацията се счита позитивна, когато индексът на стимулиране (среден срт на стимулирани с антиген култури/среден срт на контролни култури) е по-голям от 1, за предпочитане, по-голям от 2, а най-много се предпочита, по-голям от 3.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до състав, включващ изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение. Споменатият състав може да включва и фармацевтично приемлив носител и може да бъде медикамент или ваксина.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до медикамент или ваксина, съдържащи протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до фармацевтичен състав за предизвикване на специфична имунна реакция на протеина, обвиващ вируса на хепатит С, в бозайник, характеризиращ се с това, че споменатият състав включва ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, и по възможност, фармацевтично приемлива добавка. Споменатият фармацевтичен състав, съдържащ ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, може да бъде способен да индуцира специфични спрямо протеина, обвиващ вируса на хепатит С, антитела в бозайник, или да е способен да индуцира действие на Тклетките в бозайник. Споменатият фармацевтичен състав, съдържащ ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно настоящото изобретение, може да бъде профилактичен състав или терапевтичен състав. В един специфичен аспект, бозайникът е човек.

“Бозайник” е всеки член на класа висши гръбначни Mammalia, включително, човека; характеризиращ се с живо раждане, окосмяване на тялото и млечни жлези при женските бозайници, които секретират мляко за хранене на малките. Следователно, бозайници са и примати, които не са хора, и тримера мишки (Zauberman et al., 1999).

“Ваксина” или “медикамент” е състав, способен да предизвика протекция по отношение на болест, частична или пълна, спрямо остра или хронична болест; в този случай ваксината или медикаментът е профилактична ваксина или медикамент. Ваксината или медикаментът могат да бъдат ефикасни също и при лечение на вече болен индивид, като в този случай се нарича терапевтична ваксина или медикамент. Иначе, фармацевтичният състав може да бъде използван за профилактика и/или лечебни цели, като в тези случаи той е, съответно, профилактичен и/или терапевтичен състав.

Протеините, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, могат да се използват като такива в биотинилирана форма (обяснена в WO93/18054) или в комплекс с NeutraHte Avidin (Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA), авидин или стрептавидин. Трябва да бъде отбелязано още, че “ваксината” или “медикаментът” могат да включват, в допълнение към активната субстанция, “фармацевтично приемлив носител” или “фармацевтично приемлива добавка”, която може да бъде подходящ ексципиент, разредител, носител и/или добавка, която сама по себе си, не води до продуциране на антитела, вредни за индивида, приемащ състава, нито предизвиква защита. Подходящите носители обикновено са големи, бавно метаболизиращи макромолекули, като протеини, полизахариди, полимлечни киселини, полигликолови киселини, полимерни аминокиселини, съполимери на аминокиселини и неактивни вирусни частици. Тези носители са известни на специалистите в областта. Предпочитаните добавки, които повишават ефективността на състава, включват, но без да е ограничение, алуминиев хидроксид, алуминий в комбинация с 3-0деацилиран монофосфориллипид А, описан в WO93/19780, алуминиев фосфат, описан в WO93/24148, N-ацетилмурамил-Ь-треонил-О-изоглутамин, описан в U. S. Patent No. 4,606,918, Nацетил-нормурамил-1_-аланил-0-изоглутамин, ^ацетил-мурамил-1_-аланил-Оизоглугамил-1_-аланин-2-(Г,2’-дипалмитоил-8п-глицеро-3-хидроксифосфорилокси)етиламин, RIBI (ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT, USA), който съдържа монофосфориллипид А, детоксифициран ендотоксин, трехалоза-6,6димиколат и скелет на клетъчната стена (MPL + TDM + CWS) в 2% емулсия на скуален/Tween 80. Всеки от трите компонента MPL, TDM или CWS може да бъде използван самостоятелно или два по два. MPL може да бъде заменен с негов синтетичен аналог, означен като RC-529. Още повече, могат да бъдат използани добавки като Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA, USA), SAF-1 (Syntex) или бактериални добавки на базата на деоксирибонуклеинови киселини, като ISS (Dynavax) или CpG (Coiey Pharmaceuticals), както и добавки, като комбинации между GS21 и З^е-О-ацетилиран монофосфориллипид А (W094/00153), или MF-59 (Chiron), или добавки на базата на поли[ди(карбоксилатофенокси)фосфазен] (Virus Research Institute), или добавки на базата на блоксъполимер, като Optivax (Vaxcel, Cythx), или добавки на базата на инулин, като Aigammulin и Gammainulin (Anutech), Incomplete Freunds Adjuvant (IFA) или Gerbu preparations (Gerbu Biotechnik). Трябва да се разбере, че Ccomplete Freund’s Adjuvant (CFA) може да се използва за приложение не при човек, както и за научни цели. “Състав на ваксина” може да съдържа и ексципиенти и разредители, които са вътрушно нетоксични и нетерапевтични, като вода, салин, глицерол, етанол, омокрящи или емулгиращи агенти, pH буфериращи субстанции, консерванти и други. Обикновено съставът за ваксина се приготвя като инжектируем, или като течен разтвор или суспензия.

Инжектирането може да бъде подкожно, интрамускулно, интравенозно, интраперитонеално, интратекално или интрадермално. Други типове администриране включват имплантиране, супозитори, орално приемане, чревно приложение, инхалиране, аерозолни или за нос спрейове или капки. Могат да бъдат получени също и твърди форми, подходящи за разтваряне или суспендиране в течни среди преди инжектирането. Съставът също може да бъде емулгиран или капсулиран в липозоми за повишаване на ефекта на добавката. Полипептидите могат също да бъдат въведени в Immune Stimulating Complexes, заедно със сапонини, например, Quil A (ISCOMS). Съставите за ваксина включват ефективно количество активно вещество, както и някои други от гореизброените компоненти. “Ефективно количество” на активно вещество означава, че администрирането на такова количество върху индивид, или като единична доза или като част от серия, е ефективно за превенция или лечение на болест или за произвеждане на желан ефект. Това количество се променя в зависимост от здравното и физическо състояние на индивида, който се лекува, таксономичната група на индивида, който се лекува (например, човек, примат, различен от човека, примат и т.н.), капацитета на имунната система на индивида да прояви ефективна имунна реакция, степента на желаната защита, получаването на ваксината, лекарското предписание, вида на заразния патоген и други свързани фактори. Очаква се, че количеството ще намалява в относително широк интервал и може да бъде определяно въз основа на рутинен опит. Обикновено, количеството варира от 0.01 до 1000 цд/доза, за предпочитане, от 0.1 до 100 цд/доза. Дозичният режим на лечение може да се провежда като приемане на единична доза или многократни дози. Ваксината може да бъде администрирана заедно с други имунорегулаторни средства.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до метод за получаване на изолиран протеин или негов фрагмент, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение.

Споменатият метод за получаване на изолиран протеин или негов фрагмент, обвиващ вируса на хепатит С, например, включва трансформиране на приемаща клетка с рекомбинантна нуклеинова киселина или вектор, съдържащ отворена четяща рамка, кодираща споменатия протеин или негов фрагмент, обвиващ вируса на хепатит С, и се характеризира с това, че споменатата приемаща клетка е способна да отделя споменатия протеин или негов фрагмент, обвиващ вируса на хепатит С. Споменатият метод може да включва и култивиране на споменатите приемащи клетки в подходяща среда докато се осигури отделяне на споменатия протеин, изолиране на отделения протеин от културата на споменатите приемащи клетки, или от споменатите приемащи клетки. Споменатото изолиране може да включва един или повече (i) разтвори на споменатите приемащи клетки в присъствие на хаотропен агент, (Н) химична модификация на цистеин-тиоловите групи в изолираните протеини, в които споменатата химична модификация може да протича обратимо или необратимо и (iii) хепарин-афинитетна хроматография.

Примерни “хаотропни агенти” са гуанидинхлорид и карбамид. Най-общо, хаотропен агент е химично вещество, което може да разруши структурата на водородно свързване на водата. В концентрирани разтвори те могат да денатурират протеини поради това, че те понижават хидрофобния ефект.

‘Рекомбинантна нуклеинова киселина” означава нуклеинова киселина с природен или синтетичен произход, която е подложена на поне една рекомбинантна манипулация на деоксирибонуклеинова киселина, като ограничаване на ензимното усвояване, PCR, свързване с лигатура, дефосфорилиране, фосфорилиране, мутагенеза, адаптиране на кодоните за отделяне в хетерологична клетка и т.н. Най-общо, рекомбинантна нуклеинова киселина означава природно съществуваща нуклеинова киселина или включва поне два фрагмента на нуклеинова киселина неприродно свързани или е изцяло синтетична нуклеинова киселина.

Термините “полинуклеотид”, “поли нуклеинова киселина”, “последователност на нуклеинова киселина”, “нуклеотидна последователност”, молекула на нуклеинова киселина”, “олигонуклеотид”, “сонда” или “прекурсор”, използвани в настоящото изобретение, се отнасят до нуклеотиди, или рибонуклеотиди, деоксирибонуклеотиди, пептидни нуклеотиди или заключени нуклеотиди, или техни комбинации, в полимерна форма с всякаква дължина или всякаква форма (например, разклонена деоксирибонуклеинова киселина). Споменатите термини включват още двулентови (ds) и еднолентови (ss) полинуклеотиди, както и трилентови полинуклеотиди. Споменатите термини включват и известни нуклеотидни модификации, като метилиране, циклизиране и “покриване” и заместване на един или повече от природно съществуващите нуклеотиди с аналог, като инозин или със способни за се удължават мономери, като хексетиленгликол. Рибонуклеотидите са означени като NTP, деоксирибонуклеотидите са означени като dNTP и дидеоксирибонуклеотидите са означени като ddNTP.

Нуклеотидите могат да се маркират радиационно, хемилуминесцентно, флуоресцентно, фосфоресцентно или с инфрачервени багрила, или с повърхностен маркер на Raman или плазмон резонантна частица (PRP).

Споменатите термини “полинуклеотид”, “полинуклеинова киселина”, “после-дователност на нуклеинова киселина”, “нуклеотидна последователност”, молекула на нуклеинова киселина”, “олигонуклеотид”, “сонда” или “прекурсор” обхващат също пептидни нуклеинови киселини (PNA), аналог на деоксирибонуклеинова киселина, в който скелетът е псевдопептид, изграден от 1Ч-(2-аминоетил)глицинови звена, освен захар. Пептидните нуклеинови киселини имитират поведението на деоксирибонуклеиновата киселина и свързват допълнителни ивици нуклеинова киселина. Неутралният скелет на пептидните нуклеинови киселини води до по-силно свързване и поголяма специфичност, от нормално постигнатите. Още повече, уникалните химични, физични и биологични свойства на пептидните нуклеинови киселини се използват за получаване на мощни биомолекулни средства, антисензитивни и антигенни агенти, молекулни проби и биосензори. Сондите от пептидни нуклеинови киселини могат да бъдат по-къси от сондите на деоксирибонуклеиновата киселина и обикновено притежават от 6 до 20 бази по дължина, по-оптимално, от 12 до 18 бази по дължина (Nielsen, Р.Е., 2000). Споменатите термини включват също и заключени нуклеинови киселини (LNA), които са производни на рибонуклеинови киселини, в които рибознияг пръстен е ограничен в движението си от метиленова връзка между 2’-кислород и 4’съглерод. Заключените нуклеинови киселини показват безпрецедентна свързваща активност към последователностите на деоксирибонуклеиновата киселина или рибонуклеиновата киселина. Нуклеотидите на заключените нуклеинови киселини могат да бъдат олигомеризирани и могат да бъдат въведени в химерни или микс-мерни молекули на заключена нуклеинова киселина/деоксирибонуклеинова киселина или заключена нуклеинова кисел и на/рибонуклеи нова киселина. Заключените нуклеинови киселини са нетоксични за културните клетки (Orum, Н., Wengel, J., 2001, Wahlestedt, С. et al., 2000). Най-общо, отчитат се химерните или микс-мерните молекули на коя да е деоксирибонуклеинова киселина, рибонуклеинова киселина, пептидна нуклеинова киселина или заключена нуклеинова киселина, както и на тези, в които тиминът е заменен от урацил.

От гореописаното става ясно, че настоящото изобретение се отнася също и до използване на гликосилирани в сърцевината протеини, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или на състави, съгласно настоящото изобретение, за получаване на състави за ваксина спрямо вируса на хепатит С. По-специално, настоящото изобретение се отнася до използване на гликосилирани в сърцевината протеини, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, за индуциране на имунитет спрямо вируса на хепатит С в носители на хроничен вирус на хепатит С. Още по-специално, настоящото изобретение се отнася до използване на гликосилирани в сърцевината протеини, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, за индуциране на имунитет спрямо вируса на хепатит С в носители на хроничен вирус на хепатит С преди, по време на и след друго лечение, като например, известна терапия с интерферон или в комбинация, или не, с администриране на малки количества лекарства, лекуващи вируса на хепатит С, като например, рибавирин. Този състав може да бъде използван също преди или след трансплантация на черен дроб, или след предполагаема инфекция, като например, нараняване вследствие убождане с игла.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до метод за откриване на присъствието на антитела спрямо вируса на хепатит С в проба, която се очаква, че включва антитела спрямо вируса на хепатит С, като споменатият метод включва:

(i) контакт на протеин или негова част, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, със споменатата проба при условия, позволяващи комплексообразуване на протеин или негова част, обвиващ вируса на хепатит С, със споменатите антитела на вируса на хепатит С, (ii) откриване на формирания, съгласно (i) комплекс, и (iii) вадене на заключение от (ii) за присъствие на споменатите антитела на вируса на хепатит С в споменатата проба.

В един специфичен аспект на настоящото изобретение, контактът от етап (i) на споменатия метод протича при конкурентни условия. В друг специфичен аспект на настоящото изобретение, споменатият протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или част от него, се свързва към твърд супорт. В друг специфичен аспект на настоящото изобретение, споменатата проба, която съдържа антитела на вируса на хепатит С, представлява биологична проба.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до диагностичен набор за откриване на присъствие на антитела на вируса на хепатит С в проба, която се очаква, че съдържа антитела на вируса на хепатит С, като споменатият набор включва протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или част от него, съгласно настоящото изобретение. В специфичен аспект, споменатият протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или част от него, се свързва с твърд супорт. В друг аспект, споменатата проба, която се очаква, че съдържа антитела на вируса на хепатит С, представлява биологична проба.

Използваният в настоящото изобретение термин “биологична проба” се отнася до проба от тъкан или флуид, изолирана от индивид, включително, но без да е ограничение, от серум, плазма, лимфа, външни секрети на кожата, от респираторния, стомашно-чревния или генитало-отделителния тракт, ооцити, сълзи, слюнка, мляко, кръвни клетки, тумори, органи, стомашни сокове, лигавица, течност от гръбначния стълб, външни секрети, като например, екскременти, урина, сперма и други.

Протеините, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или части от него, са особено подходящи за приложение при различни методи, като имуноаналитични методи, за откриване на вируса на хепатит С, и/или за установяване на генотипа на вируса на хепатит С, за прогнозиране/наблюдение на болестта, причинена от вируса на хепатит С, или като терапевтично средство.

При методите, като имуноаналитичните методи, съгласно настоящото изобретение, се използват протеините, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, които поддържат линейни (в случай на пептиди) и конформационни епитопи, разпознавани от антитела в серум на индивид, заразен с вируса на хепатит С. Е1 и Е2 антигените на вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат прилагани виртуално или в анализ, при който използва известен антиген за откриване на антителата. Разбира се, форматът, който денатурира конформационния епитоп на вируса на хепатит С, трябва да се избягва или да се приспособява. Обичаен елемент на всички тези анализи е това, че антигенът контактува с компонент на тялото, заподозрян, че съдържа антитела на вируса на хепатит С, при условия, които позволяват свързване на антигена към всяко такова антитяло, присъстващо в компонента. Такива условия са, обикновено, физиологична температура, pH и йонна сила, при използване на излишък от антиген. Инкубирането на антигена със спесимен се следва от откриване на имунни комплекси, включени в антигена.

Имуноанализите са обект на много разновидности и много техни формати са известни на специалистите в областта. Протоколите могат, например, да използват твърди носители или имуноутаяване. Повечето анализи включват употребата на маркирано антитяло или полипептид; като маркерите могат да бъдат, например, ензимни, флуоресцентни, хемилуминесцентни, радиоактивни или оцветяващи молекули. Известни са, също така анализи, които усилват сигналите от имунния комплекс; примери за такива анализи са тези, при които се използва биотин и авидин или стрептавидин, и маркирани или управлявани от ензим имуноанализи като ELISA и RIA анализите.

Имуноанализът може, но без да е ограничение, в хетерогенен или в хомогенен формат или от стандартен или конкурентен тип. В хетерогенен формат, полипептидът обикновено е свързан към твърда матрица или супорт за да се улесни разделянето на пробата от полипептида след инкубиране. Примерите за твърди супорти, които могат да бъдат използвани, включват нитроцелулоза (например, като мембрана или под формата на микротитьрно гнездо), поливинилхлорид (например, като листове или под формата на микротитърни гнезда), полистиренов латекс (например, като зърна или микротитьрни плочки), поливинилидинфлуорид (известен като ImmunoIon™), диазотирана хартия, найлонови мембрани, активирани зърна и зърна от Протеин А. Например, Dynatech ImmunoIon™ 1 или ImmunoIon™ 2 микротитьрните плочки могат да се използват в хетерогенен формат. Твърдият супорт, съдържащ антигенните полипептиди, обикновено се промива след отделянето от него на тестваната проба и преди откриването на свързани антитела.И двата формата - стандартен и конкурентен, са известни на специалистите.

В хомогенен формат, тестовата проба се инкубира с комбинация от антигени в разтвор. Например, при условие, че всеки комплекс на антиген и антитяло, който се образува, се утаява. И стандартният, и конкурентният формати на тези анализи са известни на специалистите.

В стандартен формат, количеството антитела, като антитела на вируса на хепатит С в комплексите на антиген и антитяло, се наблюдават директно. Това може да бъде постигнато при определяне дали маркираните антиксеногенни (например, античовешки) антитела, които разпознават епитоп върху споменатите антитела, като споменатите антитела на вируса на хепатит С, ще се свържат в зависимост от комплексообразуването. В конкурентен формат, количеството на споменатите антитела, като антитела на вируса на хепатит С в проба се определя при наблюдаване на конкурентния ефект върху свързването на известно количество (маркирано) антитяло (или друг конкурентен лиганд) или антиген в комплекса.

Комплексите на антиген-антитяло могат да се откриват по редица известни методи, в зависимост от формата. Например, немаркирани антител, като антитела на вируса на хепатит С в комплекса, могат да бъдат открити при използване на съединение на антиксеногенен Ig в комплекс с маркер (например, ензимен маркер).

При имуноутаителен или слепващ анализ, при реакцията между антиген и антитяло се формират протеинов клъстер, който се утаява от разтвора или суспензията и образува видим слой или филм от утайка. Ако в тестовия спесимен или проба не присъства антитяло, не се образува утайка.

Протеините, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или части от него, съставени от конформационни епитопи, обикновено се пакетират под формата на набор за приложение в споменатите анализи. Наборът обикновено съдържа, в отделни опаковки, природен антиген на вируса на хепатит С, контролни състави на антитялото (позитивни и/или негативни), маркирано антитяло, когато анализът изисква същото, и реагенти, генериращи сигнал (например, ензимен субстрат), ако маркерът не генерира директно сигнал. Природният антиген на вируса на хепатит С може вече да е свързан с твърда матрица или отделен с реагенти за свързването му към матрицата. В набора обикновено се прилагат инструкции (например, ръкопис, дискета, CD-ROM, и т.н.) за провеждане на анализа.

Подбраната твърда фаза може да включва полимерни или стъклени зърна, нитроцелулоза, микрочастици, микрогнезда на реакционна плочка, тестови епруветки и магнитни зърна. Съединението, генериращо сигнал, може да включва ензим, луминесцентно съединение, хромоген, радиоактивен елемент и хемилуминесцентно съединение. Примерите за ензими включват алкална фосфатаза, хорсредиш пероксидаза и бета-галакгозидаза. Примерите за усилващи съединения, свързващи отделни членове, включват биотин, антибиотин и авидин. За блокиране на ефекта на субстанциите, наподобяващи ревматоидния фактор, тестовата проба се подлага на условия, достатъчни за блокиране на ефекта на субстанциите, наподобяващи ревматоидния фактор. Тези условия включват контакт на тестовата проба с количество античовешки IgG до получаване на смес, и инкубиране на сместа в продължение на толкова време и при такива условия, достатъчни за получаване на реакционна смес, значително освободен от субстанцията, наподобяваща ревматоидния фактор.

В частност, настоящото изобретение се отнася до използване на протеин, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или части от него, за получаване на диагностичен набор.

Тъй като гликосилираните в сърцевина протеини, обвиващи вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, са силно имуногенни и стимулират както хуморалната, така и клетъчната имунна реакция, настоящото изобретение се отнася също и до набор за откриване на вируса на хепатит С, свързан с реакцията на Т-клетки, включващ олигомерна частица или пречистен единичен протеин, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение. Реакцията на Т-клетките на вируса на хепатит С може, например, да бъде измерена, както е описано от Leroux-Roels et al., WO95/12677.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до метод за предизвикване на специфична имунна реакция спрямо вируса на хепатит С в бозайник, като споменатият метод включва администриране върху споменатия бозайник на ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или част от него, по възможност включващ и фармацевтично приемлива добавка. Споменатият метод, включващ администриране върху споменатия бозайник на ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или части от него, може да се прилага също и за индуциране на специфични антитела на вируса на хепатит С в бозайник или за индуциране на специфично действие на Т-клетките в бозайник. При споменатите методи, администрирането може да се извършва с профилактична цел, т.е. профилактично администриране, или с терапевтична цел, т.е. терапевтично администриране.

Друг аспект на настоящото изобретение се отнася до метод за имунизиране на бозайник, като споменатият метод включва администриране върху споменатия бозайник на ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или част от него, по възможност включващ и фармацевтично приемлива добавка.

Настоящото изобретение се отнася до метод за мечение на бозайник, заразен с вируса на хепатит С, като споменатият метод включва администриране върху споменатия бозайник на ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно настоящото изобретение, или част от него, по възможност включващ и фармацевтично приемлива добавка.

Всеки от гореспоменатите аспекти на настоящото изобретение или детайлите, специфични за споменатите аспекти, са приложими също и за протеини, които са продукт на отделяне в евкариотни клетки и, които се характеризират със същите гликосилиращи свойства, описани по-горе за двата различни протеина, обвиващи вируса на хепатит С.

По-специално, настоящото изобретение се отнася до изолиран протеин или негов фрагмент, включващ поне едно място за N-гликосилиране, характеризиращ се с това, че споменатият протеин или негов фрагмент е продукт на отделяне в евкариотна клетка, като средно до 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% или 80% от местата за N-гликосилиране са гликосилирани в сърцевина. По-специално, повече от 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% или 95% от местата за N-гликосилиране са гликосилирани с олигоманоза със структура Man(8-10)-GlcNAc(2). В допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, съотношението на местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Мап(7)GlcNAc(2) към местата, гликосилирани в сърцевина, с олигоманоза със структура Man(8)-GlcNAc(2) е по-малко от или равно на 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 или 0.50. В още едно допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, споменатите олигоманози съдържат помалко от 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% крайна а-1,3-маноза.

Друг алтернативен аспект на настоящото изобретение се се отнася до изолиран протеин или негов фрагмент, включващ поне едно място за Nгликосилиране, характеризиращ се с това, че споменатият протеин или негов фрагмент е продукт на отделяне в евкариотна клетка, и с това, че местата за Nгликосилиране са окупирани от олигоманози, при което съотношението на олигоманозите със структура Man(7)-GlcNAc(2) към олигоманозите със структура Man(8)-GlcNAc(2) е по-малко от или равно на 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 или 0.50. В още едно допълнение към посочената по-горе характеристика на N-гликосилирането, споменатите олигоманози съдържат помалко ОТ 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% или 5% крайна а-1,3-маноза.

По-специално, споменатият изолиран протеин или негов фрагмент е продукт на отделяне в квасни гъбички, например, Hansenula клетка. Споменатият изолиран протеин или негов фрагмент, като протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или протеин, обвиващ вируса на хепатит В (HBV), или техни фрагменти. Други примерни протеини, обвиващи вирус, включват протеин, обвиващ вируса на имунната недостатъчност при човека (HIV) др 120 и протеини, обвиващи вирус, принадлежащ към Flavirideae. Най-общо, споменатият изолиран протеин или негов фрагмент може да бъде всеки протеин, удовлетворяващ характеристиките за N-гликосилиране, съгласно настоящото изобретение.

“Рекомбинантен вирус на ваксина спряво вируса на хепатит С” означава вирус на ваксина, включващ последователност на нуклеинова киселина, кодираща протеина на вируса на хепатит С или негова част.

Термините “вирусоподобна частица на вируса на хепатит С, получена от протеин, обвиващ вируса на хепатит С” и “олигомерни частици, получени от протеини, обвиващи вируса на хепатит С” са дефинирани в настоящото изобретение като структури със специфична природа и форма, съдържащи няколко базични звена на Е1 и/или Е2 протеини, обвиващи вируса на хепатит С, които са съставени, съответно, от един или два Е1 и/или Е2 мономера. Трябва да стане ясно, че частиците, съгласно настоящото изобретение, са разделени на инфекциозни геноми на рибонуклеиновите киселини на вируса на хепатит С. Частиците, съгласно настоящото изобретение, могат да бъдат високо подредени частици със сферична форма, които могат да бъдат празни, състоящи се от обвивка от обвиващи протеини, в която могат да се въведат липиди, детергенти, сърцевинен протеин на вируса на хепатит С или молекули на добавки. Последните частици могат също да бъдат капсулирани с липозоми или аполипопротеини, като например, аполипопротеин В или липопротеини с ниска плътност, или по други начини за насочване на споменатите частици към специфичен орган или тъкан. В този случай, тези празни сферични частици често се отнасят като “вирусоподобни частици” или VLP. Или пък, високо подредените частици могат да представляват твърди сферични структури, където завършената сфера се състои от Е1 или Е2 олигомери на обвиващ вируса на хепатит С протеин, в които допълнително могат да бъдат въведени липиди, детергенти, сърцевинен протеин на вируса на хепатит С или молекули на добавки, или които могат също да бъдат капсулирани с липозоми или аполипопротеини, като например, аполипопротеин В или липопротеини с ниска плътност, или по други начини за насочване на споменатите частици към специфичен орган или тъкан, например, азиалогликопротеини. Частиците могат да бъдат съставени и от по-малки структури (в сравнение с празните или твърдите сферични структури, описани по-горе), които обикновено имат кръгла форма, и които обикновено не съдържат повече от един слой протеини, обвиващи вируса на хепатит С. Типичен пример за такива по-малки частици са структури, подобни на розетка, които се състоят от по-малък брой протеини, обвиващи вируса на хепатит С, обикновено между 4 и 16. Специфичен пример включва по-малки частици, получени с Е1 в 0.2% CHAPS, който съдържа 8-10 мономера Е1. Такива подобни на розетка структури обикновено са равнинно организирани и са кръгли по форма, например, под формата на колело. Отново, в тях могат да бъдат допълнително въведени липиди, детергенти, сърцевинен протеин на вируса на хепатит С или молекули на добавки, или помалките частици могат да бъдат капсулирани с липозоми или аполипопротеини, като например, аполипопротеин В или липопротеини с ниска плътност, или по други начини за насочване на споменатите частици към специфичен орган или тъкан. По-малките частици могат да формират също и сферични или глобуларни структури, състоящи се от също по-малък брой Е1 или Е2 протеини, обвиващи вируса на хепатит С, в които могат да бъдат допълнително въведени липиди, детергенти, сърцевинен протеин на вируса на хепатит С или молекули на добавки, или по-малките частици могат да бъдат капсулирани с липозоми или аполипопротеини, като например, аполипопротеин В или липопротеини с ниска плътност, или по други начини за насочване на споменатите частици към специфичен орган или тъкан. Размерът (т.е. диаметърът) на дефинираните по-горе частици, измерени по известни на специалистите методи на динамично разсейване на светлината (виж в раздела на примерите по-долу), обикновено е между 1 и 100 nm, за предпочитане, между 2 и 70 nm, повече се предпочита, между 2 и 40 nm, между 3 и 20 nm, между 5 и 16 nm, между 7 и 14 nm или между 8 и 12 nm.

В частност, настоящото изобретение се отнася до метод за пречистване на протеини, обвиващи вируса на хепатит С, гликосилиран в сърцевина, или техни части, подходящи за използване в имуноанализ или ваксина, характеризиращ се с това, че включва:

(i) нарастване на гликосилирани щамове от Hansenula или Saccharomyces, трансформирани с обвиващ ген, кодиращ Е1 протеина на вируса на хепатит С и/или Е2 протеина на вируса на хепатит С, или техни части, в подходяща културна среда;

(ίΐ) предизвикване на отделяне на споменатия ген на Е1 протеина на вируса на хепатит С и/или Е2 протеина на вируса на хепатит С, или техни части; и (iii) пречистване на споменатия гликосилиран в сърцевина Е1 протеин на вируса на хепатит С и/или Е2 протеин на вируса на хепатит С, или техни части, от споменатата клетъчна култура.

Настоящото изобретение се отнася още и до метод за пречистване на гликосилирани в сърцевина протеини, обвиващи вируса на хепатит С, или техни части, подходящи за използване в имуноанализ или ваксина, характеризиращ се с това, че включва:

(ii) предизвикване на отделяне на споменатия ген на Е1 протеина на вируса на хепатит С и/или Е2 протеина на вируса на хепатит С, или техни части; и (iii) пречистване на споменатия интрацелуларно отделен гликосилиран в сърцевина Е1 протеин на вируса на хепатит С и/или Е2 протеин на вируса на хепатит С, или техни части, при разтваряне на трансформираната приемаща клетка.

(i) нарастване на гликосилирани щамове от Hansenula или Saccharomyces, трансформирани с обвиващ ген, кодиращ Е1 протеина на вируса на хепатит С и/или Е2 протеина на вируса на хепатит С, или техни части, в подходяща културна среда, като споменатият Е1 протеин на вируса на хепатит С и/или Е2 протеин на вируса на хепатит С, или техни части, съдържат поне две Cys-аминокиселини;

(ii) предизвикване на отделяне на споменатия ген на Е1 протеина на вируса на хепатит С и/или Е2 протеина на вируса на хепатит С, или техни части; и (iii) пречистване на споменатия гликосилиран в сърцевина Е1 протеин на вируса на хепатит С и/или Е2 протеин на вируса на хепатит С, или техни части, в които споменатите Cys-аминокиселини са обратимо защитени по химичен и/или ензимен начин, от споменатата култура.

(ii) предизвикване на отделяне на споменатия ген на Е1 протеина на вируса на хепатит С и/или Е2 протеина на вируса на хепатит С, или техни части; и (iii) пречистване на споменатия интрацелуларно отделен гликосилиран в сърцевина Е1 протеин на вируса на хепатит С и/или Е2 протеин на вируса на хепатит С, или техни части, при разтваряне на трансформираната приемаща клетка, в която споменатите Cys-аминокиселини са обратимо защитени по химичен и/или ензимен начин.

Настоящото изобретение се отнася още и до метод за пречистване на рекомбинантни, гликосилирани в сърцевина протеини от квасни гъбички на вируса на хепатит С, или тяхна част, като споменатото пречистване включва хепарин-афинитетна хроматография.

Следователно, настоящото изобретение се отнася и до метод за пречистване на рекомбинантни, гликосилирани в сърцевина протеини от квасни гъбички на вируса на хепатит С, или тяхна част, при който споменатият химичен начин е сулфониране.

Следователно, настоящото изобретение се отнася и до метод за пречистване на рекомбинантни, гликосилирани в сърцевина протеини от квасни гъбички на вируса на хепатит С, или тяхна част, при който споменатата обратима защита на Cys-аминокиселините се заменя с необратима защита по химични и/или ензимни начини.

Следователно, настоящото изобретение се отнася и до метод за пречистване на рекомбинантни, гликосилирани в сърцевина протеини от квасни гъбички на вируса на хепатит С, или тяхна част, при който споменатата необратима защита на Cys-аминокиселините по химичен начин е йодацетамид.

Следователно, настоящото изобретение се отнася и до метод за пречистване на рекомбинантни, гликосилирани в сърцевина протеини от квасни гъбички на вируса на хепатит С, или тяхна част, при който споменатата необратима защита на Cys-аминокиселините по химичен начин е NEM или Biotin-NEM или тяхна смес.

Настоящото изобретение се отнася също и до споменатия по-горе състав, който включва сърцевина на вируса на хепатит С, Е1, Е2, Р7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и/или NS5B протеини или техни части. Гликосилираните в сърцевина протеини Е1, Е2 и/или Е1/Е2, съгласно настоящото изобретение, могат, например, да се комбинират с други антигени на вируса на хепатит С, например, сърцевина, Р7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и/или NS5B. Пречистването на тези NS3 протеини, за предпочитане, включва обратимо модифициране на цистеиновите остатъци, а повече се предпочита, сулфониране на цистеините. Методи за получаване, като обратимо модифициране, включващо сулфониране, е описано за NS3 протеини от Maertens et al. (РСТ/ЕР99/02547). Трябва да се подчертае, че цялото съдържание, включително всички дефиниции, на цитирания документ, са дадени за сравнение в настоящата заявка.

Също така, настоящото изобретение се отнася и до приложение на гликосилиран в сърцевина обвиващ протеин за индуциране на имунитет спрямо вируса на хепатит С, характеризиращо се с това, че споменатият гликосилиран в сърцевина обвиващ протеин се използва като част от серия на интервали от време и съединения. В това отношение, трябва да се разбере, че терминът “серия на интервали от време и съединения” се отнася до администриране върху индивид през интервали от време на съединенията, използвани за предизвикване на имунна реакция. Последните съединения могат да включват кой да е от следните компоненти: гликосилиран в сърцевина обвиващ протеин, DNA състав за ваксина спрямо вируса на хепатит С, полипептиди на вируса на хепатит С.

В това отношение, сериите включват администриране на:

(i) антиген на вируса на хепатит С, като например, гликосилиран в сърцевина обвиващ протеин, през интервали от време, или (ii) антиген на вируса на хепатит С, като например, гликосилиран в сърцевина обвиващ протеин в комбинация с DNA състав за ваксина спрямо вируса на хепатит С, като споменатите олигомерни частици на гликосилирания в сърцевина обвиващ протеин и споменатият състав за ваксина спрямо вируса на хепатит С могат да бъдат администрирани едновременно или през различни интервали от време, включително през редуващи се интервали от време, или (iii) или (i), или (ii), по възможност в комбинация с други пептиди, през интервали от време.

В това отношение, трябва да бъде ясно, че DNA съставът за ваксина спрямо вируса на хепатит С включва нуклеинови киселини, кодиращи пептида, обвиващ вируса на хепатит С, включително Е1-, Е2-, Е1/Е2 пептиди, NS3 пептид, други пептиди на вируса на хепатит С, или части от тези пептиди. Още повече, трябва да се разбере, че споменатите пептиди на вируса на хепатит С включват пептиди, обвиващи вируса на хепатит С, включително Е1-, Е2-, Е1/Е2 пептиди, други пептиди на вируса на хепатит С, или части от тези пептиди.

Терминът “други пептиди на вируса на хепатит С” се отнася до кой да е пептид на вируса на хепатит С или негов фрагмент. В точка (И) на горната схема, DNA съставът за ваксина спрямо вируса на хепатит С включва, за предпочитане, нуклеинови киселини, кодиращи пептида, обвиващ вируса на хепатит С. В точка (ii) на горната схема, DNA съставът за ваксина спрямо вируса на хепатит С включва даже по-преференциално, нуклеинови киселини, кодиращи пептиди, обвиващ вируса на хепатит С, по възможност, в комбинация на вирус на хепатит C-NS3 и DNA състав за ваксина спрямо вируса на хепатит С. В това отношение, трябва да бъде ясно, че DNA съставът за ваксина спрямо вируса на хепатит С включва плазмиден вектор, съдържащ полинуклеотидна последователност, кодираща описания по-горе пептид на вируса на хепатит С, свързан към регулаторни елементи. Използваният в настоящото изобретение термин “плазмиден вектор” се отнася до молекула нуклеинова киселина, способна да транспортира друга нуклеинова киселина, към която е свързана. Предпочитани вектори са тези, способни на автономна репликация и/или отделяне на нуклеинови киселини, към които са свързани. Най-общо, но без да е ограничение, празмидните вектори представляват кръгообразни бримки от двойно ивична деоксирибонуклеинова киселина, които, в тяхната векторна форма не са свързани с хромозома. Използваният в настоящото изобретение термин “полинуклеотидна последователност” се отнася до полинуклеотиди, като деоксирибонуклеинова киселина и, когато е подходящо, рибонуклеинова киселина. Трябва да се разбере, че този термин включва като еквиваленти, аналози на рибонуклеиновата киселина или на деоксирибонуклеиновата киселина, изградени от нуклеотидни аналози и единични (сензитивни или антисензитивни) и двойно-ивични полинуклеотиди. Използваният в настоящото изобретение термин “регулаторни елементи” се отнася до нуклеотидна последователност, която съдържа значителни регулаторни елементи, като при въвеждане в жива гръбначна клетка, е способна да предизвика клетката да продуцира транслационни продукти, кодирани от полинуклеотида.

Използваният в настоящото изобретение термин “оперативно свързан” се отнася до съпоставяне, при което компонентите са така конфигурирани, че да представят тяхното обичайно действие. Следователно, регулаторните елементи, оперативно свързани с нуклеотидна последователност, са способни да въздействат върху проявлението на споменатата нуклеотидна последователност. Специалистът в областта може да прецени, че успешно могат да бъдат използвани различни транскрибиращи промотори, терминатори, вектори на носителя или последователности на специфичен ген.

Или пък, DNA ваксината може да бъде доставяна през жив вектор, като аденовирус, canary pox вирус, MVA и други.

Примери за изпълнение на изобретението

Настоящото изобретение е илюстрирано от показаните по-долу примери. Тези примери са само илюстративни и не ограничават настоящото изобретение по никакъв начин.

ПРИМЕР 1

Изграждане на pFPMT-MFa-E1-H6 сновящ бацилоносител

Плазмиди за трансформиране на Hanselula polymorpha се конструират по следния начин. pFPMT-MFa-E1-H6 сновящ бацилоносител се изгражда при многоетапен метод. Първоначално последователността на нуклеиновите киселини, кодиращи Е1 протеина на вируса на хепатит С (SEQ ID N0:2) се клонира след СНН водеща последователност (CHH = Cardnus maenas хипергликемичен хормон), която след това се променя в MFa водеща последователност (MFa — Saccharomyces cerevisiae a-свързващ фактор).

Най-напред се изгражда pUC18 производно, прилепвайки СНН-Е1-Н6 звено като EcoRI/BamHI фрагмент посредством безшевен клониращ метод (Padgett, KA, Sorge, J.A, 1996). Освен това, посредством PCR, както е описано по-долу, се генерират Е1-Н6-кодиращ фрагмент на деоксирибонуклеиновата киселина и pCHH-Hir производно на акцепторен плазмид.

Генериране на Е1-Н6-кодиращ фрагмент на деоксирибонуклеиновата киселина

Е1-Н6 фрагментът на деоксирибонуклеиновата киселина (кодиращ тип 1Ь Е1 протеин на вируса на хепатит С, състоящ се от аминокиселини от 192 до 326 на Е1, удължен с шест His остатъка, SEQ ID N0:5) се изолира посредством PCR от плазмид pGEMTE1H6 (SEQ ID N0:6; фигура 1). Освен това, се използват следните прекурсори:

- CHHE1-F: 5-aqttactcttca.aqqtatqaqqtqcqcaacqtqtccq-3’ (SEQ ID N0:7);

Eam1104l мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Почернените бази са допълнителни към тези на СНН-отляво на прекурсора. Немаркираните бази са присъщи на стартовата област на Е1 (192326) във възходяща посока; и

- CHHE1-R: 5’-agttactcttca.cagggatcctccttaatggtgatggtggtggtgcc-3’ (SEQ ID N0:8);

Eam1104l мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Почернените бази са допълнителни към тези на МЕЗО-отдясно на прекурсора. Базите, формиращи BamHI мястото, полезно при следващо клониране. са изписани наклонено. Немаркираните бази са подредени в обратна посока от края на Е1-Е6 звеното, включвайки стопиращия кодон и три допълнителни бази между стопиращия кодон и BamHI мястото.

Реакционната смес се получава по следния начин: общ обем от 50 μ!_, съдържащ 20 ng Есо311-линеаризиран pGEMTE1H6, по 0.2 μΜ от прекурсорите CHHE1-F и CHHE1-R, деоксирибонуклеотиди (всеки по 0.2 μΜ), 1 х буфер 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834), 2.5 U полимеразна смес (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834).

Използва се програма 1, като споменатата програма включва следните етапи:

1. денатуриране: 5 минути при 95°С;

2. 10 цикъла по 30 секунди денатуриране при 95°С и 130 секунди удължаване при 68°С;

3. завършване при 4°С.

Към пробата, получена съгласно програма 1, след това се прибавят 5 μΐ.

х буфер 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834), 40 gL вода и 5 ul [dATP, dGTP и dTTP (2 mM всеки); 10 mM 5-метил-0СТР] и се провежда последващо удължаване, като се използва програма 2, състояща се от следните етапи:

1. денатуриране: 5 минути при 95°С;

2. 5 цикъла по 45 секунди денатуриране при 95°С, 30 секунди отгряване при 65°С и 130 секунди при 68°С;

3. завършване при 4°С.

Генериране на акцепторен плазмид. получен от pCHH-Hir

Акцепторният фрагмент се изгражда посредством PCR от pCHH-Hir плазмид (SEQ ID N0:9; Фигура 2) и се състои от почти пълния pCHH-Hir плазмид, с тази разлика, че Hir-кодиращата последователност не присъства в продукта на PCR. За тази PCR се използват следните прекурсори:

1. СНН-отляво: 5 -aattactcttca.cctcttttccaacaaatatgtaa-3^: (SEQ ID N0:10);

Еа/п11041 мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Почернените бази са допълнителни към тези на прекурсора CHHE1-F. Немаркираните бази са присъщи за края на СНН последователността в обратна посока; и

2. МРЗО-отдясно: 5’-agtcactcttea.ctgcaggcatgcaagcttggcg-3’ (SEQ ID N0:11);

Ea/n1104l мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Почернените бази са допълнителни към тези на прекурсора CHHE1-R. Немаркираните бази се намират в pUC18 последователностите зад клонирания CHH-Hiru(tin HL20 на pCHH-Hir.

Реакционната смес се получава по следния начин: общ обем от 50 μΙ_, съдържащ 20 ng Авр7181-линеаризиран pCHH-Hir, по 0.2 μΜ от прекурсорите СНН-отляво и MFSO-отдясно, деоксирибонуклеотиди (всеки по 0.2 μΜ), 1 х буфер 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834), 2.5 U полимеразна смес (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834).

Използва се програма 1, както е описана по-горе.

Към пробата, получена съгласно програма 1, след това се прибавят 5 pL 10 х буфер 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834), 40 uL вода и 5 pL [dATP, dGTP и dTTP (2 mM всеки); 10 mM 5-MeTnn-dCTP] и се провежда последващо удължаване, като се използва програма 2, както е описана по-горе.

Генериране на бацилоносител РСННЕ1

Е1-Н6-кодиращият фрагмент на деоксирибонуклеиновата киселина и акцепторният плазмид, получен от pCHH-Hir, генерирани при PCR, както е описано по-горе, че пречистват при използване на набор за пречистване на продукти на PCR (Qiagen), съгласно инструкциите на производителя. След това пречистените фрагменти се асимилират поотделно с Еат11041. След това, Е1Н6 фрагментът на деоксирибонуклеиновата киселина се свързва с акцепторния плазмид, получен от pCHH-Hir, при използване на Т4 лигаза (Boehringer), следвайки инструкциите на производителя.

Е сой XL-Gold клетки се пренасят в сместа и плазмидът DNA на различни устойчиви на ампицилин колонии се анализира посредством асимилиране с EcoRI и BamHI. Избира се позитивен клон и се означава като рСННЕ1.

Генериране на бацилоносител PFPMT-CHH-E1-H6

EcoRI/BamHI фрагментът на рСННЕ1 се свързва с EcoRI/BamHI усвоения бацилоносител pFPMT121 (SEQ ID N0:12; фигура 3). Използва се Т4 лигаза (Boehringer), следвайки инструкциите на производителя. Получената смес се използва за трансформиране на Е сой DH5aF’ клетки. Няколко получени W продукта се анализират при ограничение за плазмид DNA и се спира позитивен клон, който е означен с pFPMT-CHH-E1H6 (SEQ ID N0:13; Фигура 4).

Генериране на pFPMT-MFa,-E1-H6

Накрая, посредством свързване на три фрагмента, се получава сновящият бацилоносител pFPMT-MFa-E1-H6, като споменатите фрагменти са:

1. 6.961 kb pFPMT121, асимилиран от EcoRI/BamHI (SEQ ID N0:12; Фигура 3),

2. 0.245 EcoPA/Hind\\\ фрагмент на pUC18-MFa (SEQ ID N0:62; фигура 36), r

3. 0.442 kb Hincflll/BamHI фрагмент на 0.454 kb продукт на PCR, получен от • pFPMT-CHH-E1H6.

0.454 kb продуктът на PCR, даващ повишение на фрагмент №3, се получава при PCR при използване на следните прекурсори:

1. прекурсор MFa-E1 f-Hi: 5’-aggggtaagcttggataaaaggtatgaggtgcgcaacgtgtccgggatgt-3’ (SEQ ID N0:14); и

2. прекурсор Е1 обратен-Вапл: 5’-agttacggatccttaatggtgatggtggtggtgccagttcat-3’ (SEQ ID N0:15).

Реакционната смес се получава по следния начин: общ обем на реакционната смес от 50 μ!_ pFPMT-CHH-E1-H6 (EcoRI-линеаризиран; 15 ng/j-iL), 0.5 μ!_; прекурсор MFa-E1 1-Hi (50 μΜ), 0.25 μΙ_; прекурсор Е1 обратен82

Bam (50 μΜ), 0.25 μΙ_; деоксирибонуклеотиди (всеки по 0.2 mM), 5 μ4_; диметилсулфоксид, 5 pL; вода, 33.5 μί; Expand Long Template PCR System (Boehringer Mannheim; Cat No 1681834), Буфер 2 (10 x концентриран), 5 uL; Expand Long Template PCR System полимеразна смес (1 U/_;oL), 0.5 μι.

Използвана e PCR програма, състояща се от следните етапи:

1. денатуриране: 5 минути при 95°С;

2. 29 цикъла по 45 секунди денатуриране при 95°С, 45 секунди отгряване при 55°С и 40 секунди удължаване при 68°С;

3. завършване при 4°С.

На базата на използваните прекурсори, полученият 0.454kb продукт на реакцията PCR, съдържа кодони на Е1 (192-326), следвани от шест хистидинови кодона и “taa” стопиращ кодон, нагоре ограничен от двадесет и две 3’-крайни базови двойки на MFa препто последователността (включително съответното клонирано Hindu място плюс шест базични двойки отгоре) и надолу ограничен от (съответно клонирано) BamHI място и шест базични двойки отгоре.

За реакцията на свързване се използва Т4 DNA лигаза (Boehringer Mannheim), съгласно условията на производителя (обем на пробата 20 μι).

Е. сой НВ101 клетки се пренасят в сместа и се спират позитивни клони, избрани след ограничителен анализ на плазмидите, изолирани от няколко продукта на трансформация. Избира се позитивен плазмид и се означава като pFPMT-MFa-E1H6 (SEQ ID N0:16; фигура 5).

ПРИМЕР 2

Изграждане на pFPMT-CL-E1-H6 сновящ бацилоносител

Плазмиди за трансформиране на Hanselula polymoipha се конструират по следния начин. pFPMT-CL-E1-H6 сновящ бацилоносител се изгражда в три етапа, като се излиза от pFPMT-MFa-E1-H6 (SEQ ID N0:16; Фигура 5).

В първия етап, MFa-E1-H6 рамката на pFPMT-MFoc-E1-H6 се субклонира в бацилоносител pUC18. Следователно, 1.798 kb Safl/SamHI фрагмент на pFPMTMFa-E1-H6 (съдържащ FMD промотор плюс MFa-E1-H6) се свързва с Safl/BamHI фрагмент на бацилоносител pUC18 с Т4 лигаза (Boehringer), съгласно условията на производителя. Това води до получаване на плазмид, показан на Фигура 6 (SEQ ID N0:17), означен по-нататък като рМа12-1 (pUC18FMD-MFa-E1-H6). Получената смес се използва за трансформиране на Е соН DH5aF’ клетки. Отделят се няколко устойчиви на ампицилин колонии и се анализират при ограничително ензимно асимилиране на плазмид DNA, изолиран от отделените клони. След това се анализира позитивен клон посредством определяне на DNA последователността на MFa-E1-H6 кодиращата последователност. Директен клон се използва за мутагенеза, направлявана от PCR, за заменяне на MFa пре-про-последователността с кодони на авиан лизозим пре-последователността (“CL”; съответстваща на аминокиселини от 1 до 18 на авиан лизозима; SEQ ID N0:1). Принципът на прилагания метод на направлявана от PCR мутагенеза, се базира на свързване на цял плазмид с желани изменения, локализирани в 5 -краищата на прекурсорите. При низходящ ред на етапите, краищата на линейния продукт на реакцията PCR се модифицират преди собственото свързване, като се получава желаният променен плазмид.

За провеждане на PCR са използвани следните прекурсори:

1. прекурсор CL hin: 5’-tgcttoctaccactagcagcactaggatatgaggtgcgcaacgtgtccggg-3’ (SEQ ID N0:18);

2. прекурсор CL her neu: 54aqtactaqtattaqtaqqcttcqcatqaattcccqat gaaggcagagagcg-3’ (SEQ ID N0:19).

Подчертаните 5’ области на прекурсорите съдържат кодони на почти половината от авиан лизозим пред-последователността. Прекурсорът CL her neu включва Spe\ ограничително място (наклонено). Неподчертаните области на прекурсорите са свързани с кодоните за аминокиселинните остатъци от 192 до 199 на Е1 (CL hin) или с “atg” стартовия кодон на EcoRI мястото до позиция 19 (броено от EcoRI мястото) на FMD промотора. Означените прекурсори свързват целия рМа12-1, при което кодоните на MFa пре-пропоследователността се заменят с кодони на авиан лизозим препоследователността.

Реакционната смес се получава по следния начин: pUC18- FMD-MFoc-E1Н6 (рМа12-1; 1.3 ng/μΙ.), 1 μι; прекурсор CL hin (100 μΜ), 2 μΙ_; прекурсор CL her neu (100 μΜ), 2 μΙ; деоксирибонуклеотиди (всеки по 2.5 тМ), 8 μ!_; вода, 76 liL; Expand Long Template PCR System (Boehringer; Cat No 1681834), Буфер 2 (10 x концентриран), 10 μΐ; Expand Long Template PCR System полимеразна смес (1 LI/pL), 0.75 μί.

1. денатуриране: 15 минути при 95°С;

2. 35 цикъла по 30 секунди денатуриране при 95°С, 1 минута отгряване при 60°С и 1 минута удължаване при 72°С;

3. завършване при 4°С.

Полученият продукт на PCR се проверява посредством електрофореза с агарозен гел за коректен размер (3.5 kb). След това, горните 3’-А формирали продукта на PCR, се отделят при реакция с Т4 полимераза, при което се получават нечулствителни краища с 3’- и 5’-хидроксилни групи. Следователно, продуктът на PCR се третира с Т4 полимераза (Boehringer; 1 U/uL), като към останалите 95 μ!_ от PCR реакционната смес се прибавят 1 μ£ Т4 полимераза и 4 μ!_ деоксирибонуклеотиди (всеки по 2.5 тМ). Пробата се инкубира в продължение на 20 минути при 37°С. След това деоксирибонуклеиновата киселина се утаява с етанол и се поставя в 16 μ£ вода.

След това, при реакция с киназа, към PCR продукта с нечувствителни краища се прибавят 5’-фосфати. Следователно, към 16 μι PCR продукт с нечувствителни краища се прибавя 1 μΙ. Т4 полинуклеотид киназа (Boehringer; 1 υ/μί), 2 μί 10-кратно концентриран реакционен буфер на Т4 полинуклеотид киназа (Boehringer) и 1 μ!_ ATP (10 mM). Пробата се инкубира в продължение на 30 минути при 37°С. След това деоксирибонуклеиновата киселина се поставя върху 1% агарозен гел и се изолира коректен продукт посредством набор за голова екстракция (Giagen), съгласно условията на производителя. След това 50 ng от пречистения продукт се самосвързват при използване на Т4 лигаза (Boehringer), съгласно условията на производителя. След инкубиране в продължение на 72 часа при 16°С деоксирибонуклеиновата киселина в сместа се утаява с етанол и се разтваря в 20 μι. вода.

Е coli DH5a-F’ клетки след това се трансформират с 10 μί от пробата. DNA плазмид от няколко устойчиви на ампицилин клона се проверяват при ограничително ензимно асимилирано, на плазмид DNA, изолиран от отделените клони. След това се анализира позитивен клон и се означава като p27d-3 (pUC18-FMD-CL-E1-H6, SEQ ID N0:20, Фигура 7). След това рамката CLЕ1-Н6 се проверява за DNA последователност.

В последния етап, pFPMT-CL-E1-H6 сновящият бацилоносител се изгражда, както е описано по-долу. 0.486 kb EcoRI/BamHI фрагмент на p27d-3 (присъединил С1_-Е1(192-326)-Н6) се свързва с pFPMT121, асимилиран от EcoRI/BamHI (SEQ ID N0:12, фигура 3). За тази реакция се използва Т4 лигаза (Boehringer), съгласно изискванията на производителя. Деоксирибонуклеиновата киселина в пробата се утаява с етанол и се разтваря в 10 μΙвода. Е сой DH5a-F клетки след това се преобразуват с 10 μΙ_ от пробата и DNA плазмид от няколко устойчиви на ампицилин колонии се анализират при асимилирано с EcoRI и BamHI. Плазмиден клон р37-5 (pFPMT-CL-E1-H6; SEQ ID N0:21, Фигура 8) показва желан размер на фрагмента от 0.486 kb и 6.961 kb. Коректната последователност CL-E1-H6 на р37-5 се проверява за последователност.

ПРИМЕР 3

Изграждане на pFPMT-MFa-E2-H6 и pMPT-MFa-E2-H6 сновящи бацилоносители

Плазмиди за преобразуване на Hanselula polymoipha се конструират по следния начин. DNA последователността, кодираща MFa-E2 (аминокиселини 384-673 на Е2 на вируса на хепатит C)-VIEGR-His6 (SEQ ID N0:5) се изолира като 1.33 kb EcoRI/Sg/ll фрагмент от плазмид pSP72E2H6 (SEQ ID N0:22, фигура 9). Този фрагмент е свързан или с усвоени от EcoRI/BgMl бацилоносители pFPMT121 (SEQ ID N0:12, фигура С+2) или рМРТ121 (SEQ ID N0:23, Фигура 10) при използване на Т4 DNA лигаза (Boehringer Mannheim), съгласно условията на производителя. След трансформиране на Е. сой и проверяване на плазмид DNA, изолиран от различни продукти на трансформация, посредством ограничително ензимно усвояване, се отделят позитивни клони и получените сновящи бацилоносители се означават, съответно, като pFPMT-MFa-E2-H6 (SEQ ID N0:22, Фигура 11) и pMPT-MFoc-E2-H6 (SEQ ID N0:23, Фигура 12).

ПРИМЕР 4

Изграждане на pFPMT-CL-E2-H6 сновящ бацилоносител

Сновящият бацилоносител pFPMT-CL-E2-H6 се получава по триетапен метод. Получава се междинна конструкция, в която Е2 кодиращата последователност се клонира зад сигналната последователност на аамилазата на Schwanniomyces асскЗегйайв. Това се прави по безшевен клониращ метод (Padgett, К.А, Sorge, JA, 1996).

Генериране на Е2-Н6-кодиращ фрагмент на деоксирибонуклеиновата киселина

Най-напред, DNA последователността, кодираща Е2-Н6 (аминокиселини от 384 до 673 на Е2 на вируса на хепатит С, удължен със свързващ пептид “VIEGR” и шест His остатъка, SEQ ID N0:5) се изолира посредством PCR от плазмид pSP72E2H6 (SEQ ID N0:24, фигура 11). Използваните прекурсори са означени като MF30E2/F и MF30E2/R и притежават следните последователности:

- прекурсор MF30E2/F: 5’-agtcactottca.aggcatacccgcgtgtcaggaggg-3’ (SEQ ID N0:26);

Eam1104l мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Последният кодон на сигналната последователност на Schwanmomyces ocddentaHs е отпечатан с черно. Немаркираните бази са присъщи на Е2 (аминокиселини 384-390 на Е2 на вируса на хепатит С);

- прекурсор MF30E2/R: 5’-aatcactcttca.caaQQatccttaataatqqtqqtaata-3’ (SEQ ID N0:27);

Еат11041 мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Почернените бази са допълнителни към тези на МРЗО-отдясно (виж по-долу) на прекурсора. Базите, формиращи BamHI мястото, полезно при следващо клониране, са изписани наклонено. Немаркираните последователности са свързани със стопиращия кодон и с шестте крайни His кодони на Е2 (384-673)-VIEGR-H6 (SEQ ID N0:5).

Реакционната смес се получава по следния начин: общ обем от 50 μ1_, съдържащ 20 ng 1.33 kb EcoRI/Bg/ll фрагмент на pSP72E2H6, по 0.2 μΜ от прекурсорите MF30E2/F и MF30E2/R, деоксирибонуклеотиди (всеки по 0.2 μΜ), 1 х буфер 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834), 2.5 U полимеразна смес (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834).

Използва се PCR програма 3, като споменатата програма включва следните етапи:

1. денатуриране: 5 минути при 95°С;

2. 10 цикъла по 30 секунди денатуриране при 95°С, 30 секунди отгряване при 65°С и 1 минута удължаване при 68°С;

3. завършване при 4°С.

Към пробата, получена съгласно PCR програма 3, след това се прибавят 10 μί 10 х буфер 2 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834), 40 μ1_ вода и 5 μί. [dATP, dGTP и dTTP (2 mM всеки); 10 mM 5-метилdCTP] и се провежда последващо удължаване, като се използва PCR програма 4, състояща се от следните етапи:

1. денатуриране: 5 минути при 95°С;

2. 5 цикъла по 45 секунди денатуриране при 95°С, 30 секунди отгряване при 65°С и 1 минута удължаване при 68°С;

3. завършване при 4°С.

Генериране на акцепторен плазмид, получен от pMF30

Вторият фрагмент, получен от плазмид pMF30 (SEQ ID N0:28, Фигура 13) и се състои от почти пълния pMF30 плазмид, с изключение на кодоните на свързаната α-амилаза на Schwanniomyces ocddentaiis, модификации, отнасящи се до клониране, което е въведено в конструкцията на прекурсора. Използвани са следните п ре курсори:

- прекурсор МРЗО-отляво: 5’-agtcactcttca.cctcttgtcaaaaataatcggttgag-3’ (SEQ ID N0:29);

Eam1104l мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Почернените бази “cct” са допълнителни към тези, отпечатани с черно “agg” на прекурсора MF30E2/F (виж по-горе). Немаркираните и почернените бази са свързани с 26 крайни бази на кодоните на а-амилазата на Schwanniomyces occtdentaiis в MF30;

- прекурсор MF30-oTflBCHo: 5’-agtcactettca.ctgcaggcatgcaagcttggcg-3’ (SEQ ID N0:11);

Eam1104l мястото е подчертано, точката означава мястото на разцепване. Почернените бази “ctg” са допълнителни към тези, отпечатани с черно “cag” на прекурсора MF30E2/R (виж по-горе). Немаркираните бази са свързани с pUC18 последователности надолу от стопиращия кодон на аамилазата на Schwanruomyces ocodentabs в MF30.

Реакционната смес се получава по следния начин: общ обем от 50 μΙ_, съдържащ 20 ng ВдЛ1-линеаризиран pMF30, по 0.2 цМ от прекурсорите MF30отляво и MFSO-отдясно, деоксирибонуклеотиди (всеки по 0.2 μΜ), 1 х буфер 1 (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834), 2.5 U полимеразна смес (Expand Long Template PCR System; Boehringer; Cat No 1681834). Използват се описаните по-горе PCR програми (програми 3 и 4), с тази разлика, че времената за удължаване са продължени от 1 минута до 4 минути в двете програми.

Генериране на бацилоносител рАМ YE2

Е2-Н6-кодиращият фрагмент на деоксирибонуклеиновата киселина и акцепторният плазмид, получен от pMF30, получени при PCR, се контролират за относителен размер посредством гелова електрофореза върху 1% агарозен гел. PCR продуктите се пречистват при използване на набор за пречистване на продукти на PCR (Qiagen), съгласно инструкциите на производителя. След това пречистените фрагменти се асимилират поотделно с Еат11041. След това, Е2-Н6 фрагментът се свързва с акцепторния плазмид, получен от pMF30, при използване на Т4 лигаза (Boehringer), следвайки инструкциите на производителя. Сместа се използва за преобразуване на Е. cob DH5aF’ клетки и плазмидът DNA на различни клони се анализира посредством асимилирано с EcdR\/BarrM\. Избира се позитивен клон и се означава като pAMY-E2, който се използва за по-нататъшни модификации, както е описано по-долу.

Генериране на бацилоносител PUC18-CL-E2-H6 ρΑΜΥ-Ε2 се подлага на мутагенеза, направлявана от PCR, за заменяне на кодоните на a-амилазната сигнална последователност с кодоните на авиан лизозим пре-последователност. По-нататък тя се означава като “CL”, като съответства на първите 18 аминокиселини на авиан лизозим ORF (SEQ ID N0:1). За тази мутагенеза се използват следните прекурсори:

- прекурсор CL2 hin: 5^;-tqcttcctaccactaqcaqcactaqaacatacccacatgtcaaaaaaaacaa-3' (SEQ ID N0:30);

прекурсор CL her: 5^,-taqtacta.qtattaqtaqqcttcqcatqqaattcactqqccqtcqttttacaacqtc-3’ (SEQ ID N0:31).

Подчертаните 5’ области на прекурсорите съдържат DNA последователността на около половината от авиан лизозим препоследователността. Прекурсорът CL2 her включва Spel (наклонено) и EcoRI (наклонено, двойно подчертано) ограничителни места. Неподчертаните области на прекурсорите са свързани с кодоните за аминокиселинните остатъци от 384 до 392 на Е2 (CL2 hin) или с “atg” стартовия кодон на EcoRI мястото до позиция -19 (броено от EcoRI мястото) на FMD промотора. Означените прекурсори свързват пълния pAMY-E2 бацилоносител, при което кодоните на α-амилазната сигнална последователност се заменят с кодони на авиан лизозим пре-последователността.

PCR рекцията се провежда съгласно следната програма:

1. денатуриране: 15 минути при 95°С;

3. завършване при 4°С.

Реакционната смес се получава по следния начин: pAMY-E2 (1 пд/цЦ, 1 μ!_; прекурсор CL2 hin (100 μΜ), 2 μί; прекурсор CL2 her (100 μΜ), 2 μ!_; деоксирибонуклеотиди (всеки по 2.5 mM), 8 μ!_; вода, 76 μί; Expand Long Template PCR System (Boehringer; Cat No 1881834) Буфер 2 (10 x концентриран), 10 μί; Expand Long Template PCR System полимеразна смес (1 U/μί), 0.75 μί.

Полученият продукт на PCR се проверява посредством електрофореза с 1% агарозен гел. Преди свързване, PCR фрагментът се модифицира, както следва. Горните 3’-А формирали продукта на PCR, се отделят при реакция с Т4 полимераза, при което се получават нечувствителни краища с 3’- и 5’хидроксилни групи. Следователно, продуктът на PCR се третира с 1 μΙ_ Т4 полимераза (Boehringer; 1 υ/μ1_), като към останалите 95 μί. от PCR реакционната смес се прибавят 4 llL деоксирибонуклеотиди (всеки по 2.5 тМ). Пробата се инкубира в продължение на 20 минути при 37°С. След това деоксирибонуклеиновата киселина се утаява с етанол и се поставя в 16 μΙ_ дейонизирана вода. След това, при реакция с киназа, към PCR продукта с нечувствителни краища се прибавят 5’-фосфати. Следователно, към 16 μί. PCR продукт с нечувствителни краища се прибавя 1 μΙ_ Т4 полинуклеотид киназа (Boehringer; 1 υ/μΙ_), 2 μί. 10-кратно концентриран реакционен буфер на Т4 полинуклеотид киназа (Boehringer) и 1 μί. ATP (10 mM). Пробата се инкубира в продължение на 30 минути при 37°С.

След това деоксирибонуклеиновата киселина се поставя върху 1% агарозен гел. Продуктът се изолира. Деоксирибонуклеиновата киселина се изолира от агароззата посредством набор за голова екстракция (Giagen), съгласно условията на производителя. След това 50 ng от пречистения продукт се самосвързват при използване на Т4 лигаза (Boehringer), съгласно условията на производителя. След инкубиране в продължение на 16 часа при 16°С деоксирибонуклеиновата киселина в сместа се утаява с етанол и се разтваря в 20 μί. вода (свързана проба).

Е соН DH5a-F’ клетки след това се преобразуват с 10 μί. от пробата. Няколко, устойчиви на ампицилин, клона се охарактеризират посредством ограничителен анализ на изолирания плазмид DNA. След това се анализира позитивен клон и се означава като pUC18-CL-E2-H6, който се използва за понататъшни модификации, описани по-долу.

Генериране на сновящ бацилоносител PFPMT-CL-E2-H6

0.966 kb EcoRI/BamHI фрагмент на pUC18-CL-E2-H6 (присъединил CLE2(384-673)-VIEGR-H6) се свързва с pFPMT121, асимилиран от EcoRI/SamHI (SEQ ID N0:12, фигура 3). За тази реакция се използва Т4 лигаза (Boehringer), съгласно изискванията на производителя. Свързаната проба се утаява с етанол и се разтваря в 10 μ1_ вода. £ coli DH5a-F’ клетки след това се преобразуват с пробата и позитивен клон се отделя след ограничителен анализ, като съответният плазмид е означен като pFPMT-CL-E2-H6 (SEQ ID N0:32, фигура 14).

ПРИМЕР 5

Изграждане на pFPMT-CL-K- Н6-Е1 сновящ бацилоносител

Изграждането на сновящия бацилоносител протича в два етапа.

В първия етап, pUC18-FMD-CL-H6-K-E1-H6 конструкцията се изгражда посредством насочена към мястото мутагенеза. pUC18-FMD-CL-E1-H6 се използва като модел (SEQ ID N0:20, Фигура 7).

Използвани са следните прекурсори:

- Прекурсор Н6К hin neu: 5’-catcacaaatatgaggtgcgcaacgtgtccgggatgtac-3’ • (SEQ ID N0:37).

- Прекурсор H6KRK her neu: 5’-gtgattjgtggtgtcctagtgctgctagtggtaggaagcatag-3’ (SEQ ID N0:38).

(Базите на допълнителните кодони са подчертани.)

PCR рекционната смес се получава по следния начин: pUC18-FMD-CLЕ1-Н6 (2 ng/pL), 1 μΙ_; прекурсор Н6К hin neu (100 μΜ), 2 μ!_; прекурсор H6KRK her neu (100 μΜ), 2 pL; деоксирибонуклеотиди (всеки по 2.5 mM), 8 pL; вода, 76 μΙ_; Expand Long Template PCR System (Boehringer; Cat No 1681834) Буфер 2 (10 x концентриран), 10 pL; Expand Long Template PCR System полимеразна смес (1 U/pL), 0.75 pL.

Използваната програма за PCR рекцията се състои от следните етапи:

1. денатуриране: 15 минути при 95°С;

3. завършване при 4°С.

Аликвотна част от PCR пробата се анализира върху 1% агарозен гел за проверка на нейния размер за коректност (около 4.2 kb).

След това, горните 3’-А от продукта на PCR се отделят при реакция с Т4 полимераза, при което се получават нечувствителни краища с 3’- и 5’хидроксилни групи. Следователно, продуктът на PCR се третира с 1 gL Т4 полимераза (Boehringer; 1 U/gL), като към останалите 95 gL от PCR реакционната смес се прибавят 4 gL деоксирибонуклеотиди (всеки по 2.5 mM). Пробата се инкубира в продължение на 20 минути при 37°С. След това деоксирибонуклеиновата киселина се утаява с етанол и се разтваря в 16 gL вода.

След това, при реакция с киназа, към PCR продукта с нечувствителни краища се прибавят 5’-фосфати. Следователно, към 16 gL разтворен PCR продукт с нечувствителни краища се прибавя 1 gL Т4 полинуклеотид киназа (Boehringer; 1 U/gL), 2 gL 10-кратно концентриран реакционен буфер на Т4 полинуклеотид киназа (Boehringer) и 1 gL ATP (10 mM). Пробата се инкубира в продължение на 30 минути при 37°С.

След това деоксирибонуклеиновата киселина се поставя върху 1% агарозен гел. Продуктът се изолира. Деоксирибонуклеиновата киселина се изолира от агароззата посредством набор за гелова екстракция (Giagen), съгласно условията на производителя. След това 50 ng от пречистения продукт се самосвързват при използване на Т4 лигаза (Boehringer), съгласно условията на производителя. След инкубиране в продължение на 72 часа при 16°С деоксирибонуклеиновата киселина в сместа се утаява с етанол и се разтваря в 20 gL вода.

E coli DH5a-F’ клетки се преобразуват с 10 μί от пробата. Плазмид DNA на няколко, устойчиви на ампицилин, колонии се анализират посредством ограничително ензимно асимилиране. След това се анализира позитивен клон и съответният плазмид се означава като pUC18-FMD-CL-H6-E1-K-H6 (SEQ ID N0:39, Фигура 17).

При втория етап, пренесеният бацилоносител се изгражда при свързване на два фрагмента. В следващата конструкция са въведени фрагменти с ВсЛ кохезивни краища. Тъй като ВсЛ може да отцепи място само от неметилирана деоксирибонуклеинова киселина, Е. соН dam щамът може да взаимодейства с въведените плазмиди pUC18-FMD-CL-H6-E1-K-H6 (SEQ ID N0:39, Фигура 17) и pFPMT-CL-E1 (SEQ ID N0:36, фигура 16). За всяко преобразуване се взима устойчива на ампицилин колония, растяща в течна културна среда като се получават неметилираните DNA плазмиди за следваща употреба.

ВсЛ/Е5йх1111 фрагментът с 1.273 kb на неметилирания плазмид pUC18-FMDCL-H6-K-E1-H6 (приютяващ промотора FMD, кодоните на CL-H6-K звеното и стартовия на Е1) и ВсА/Hindis фрагментът с 6.057 kb на плазмид pFPMT-CL-E1 (приютяващ липсващата част на Е1 рамката, стартирайки от ВсЛ мястото, без С-краен His tag, както и pFPMTI 21-локализираните елементи, с изключение за промотора FMD) се получават и се свързват един с друг в продължение на 72 часа при 16°С при използване на Т4 лигаза (Boehringer) в общ обем от 20 μΙ_, съгласно условията на производителя. След това свързаната смес с© поставя върху парче от нитроцелулозна мембрана, плуващо върху стерилна дейонизирана вода за обезсоляване на сместа (инкубиране в продължение на 30 минути при стайна температура). Е. coti ТОР 10 клетки се преобразуват посредством електропорация с 5 μΙ_ от обезсолената проба. Плазмид DNA на няколко, устойчиви на ампицилин, колонии се анализират посредством ограничително ензимно асимилиране. След това се анализира позитивен клон и съответният плазмид се означава като pFPMT-CL-H6-K-El (SEQ ID N0:40, Фигура 18).

ПРИМЕР 6

Преобразуване на Hansenuia polymorpha и подбиране на преобразувателите

Щамът на Hansenuia polymorpha RB11 се преобразува (протокол на отделяне на деоксирибонуклеинова киселина с участие на полиетиленгликол, описан от Klebe, R.J. et al., 1983) при модификация на Roggenkamp, R. et al., 1986) с различни парентерални сновящи бацилоносители, както е описано в Примери от 1 до 5. За всяко преобразуване се подбират 72 урацилпрототропни колонии и се използват за създаване на щам по следния начин. За всяка колония, 2 mL течна култура се инокулира и нараства в тестови епруветки в продължение на 48 часа (37°С; 160 оборота за минута; ъгъл 45°) в селективна среда (YNB/глюкоза, Difco). Този етап се дефинира като първи преходен етап. 150 μ!_ аликвотна част от културата, съгласно първия преходен етап, се използва за инокулиране на 2 mL пресна среда YNB/глюкоза. Културите отново се инкубират, както е описано по-горе (втори преходен етап). Провеждат се общо осем такива преходни етапа. Аликвотни части от културите след третия и след осмия преходни етапа, се използват за инокулиране на 2 mL неселекгивна YPD среда (Difco). След инкубиране в продължение на 48 часа при 37°С (160 оборота за минута; ъгъл 45°; т.н. етап на стабилизиране), 150 pL. аликвотни части от тези YPD култури се използват за инокулиране на пресни 2 mL YPD култури, които се инкубират, както е описано по-горе (втори етап на стабилизиране). Аликвотни части от културите на втория етап на стабилизиране, след това се посипват върху плочки, съдържащи селективен YNB/arap. Тези плочки се инкубират в продължение на четири дни, докато макроскопските колонии станат видими. Добре дефинирана единична колония от всяко отделяне се дефинира като щам и се използва за следващи анализи за отделяне.

Анализът за отделяне се провежда култури в малки по размер колби. О гореспоменатата YNB/arap плочка се взима колония и се инокулира в 2 mL YPD и се инкубира в продължение на 48 часа, както е споменато по-горе. Тази аликвотна част от 2 mL се използва като посадъчна култура за 20 посявка в колбата. Като среда се използва УРглицерол (1%) и колбата се поставя на ротационна клатачна машина (200 оборота в минута, 37°С). След растеж в продължение на 48 часа, към културата се прибавя 1% метанол, за индуциране на отделянето. През различни интервали от време се взимат 1 m аликвотни части от клетъчни пелети и се съхраняват при -20°С до следващ анализ. Отделянето на специфичен протеин се анализира посредством SDSPAGE/Western blotting. Следователно, клетъчните пелети се солюбилизират в проба-буфер (TrisHCl-SDS) и се инкубират в продължение на повече от 15 минути при 95°С. Протеините се отделят върху 15% полиакриламиден гел и се нанасят като петно (омокрящо петно; бикарбонатен буфер) върху нитроцелулозни мембрани. Петната се откримат при използване на специфичен миши анти-Е1 (IGH 201) или миши анти-Е2 (IGH 216, описан от Maertens et al., WO96/04385) като първо антитяло, Rabbit-Anti-Mouse-AP се използва като второ антитяло. Оцветяването се осъществява с NBT-BCIP.

Отделят се позитивни щамове за по-нататъшно изследване.

Пет от тези позитивни клона се използват в експеримент за отделяне в колба. Колония от съответния щам се отделя от YNB плочка и се използва за инокулиране на 2 mL YPD. Тези култури се инкубират, както е описано по-горе. Тази клетъчна суспензия се използва за инокулиране на втора посадъчна култура от 100 mL YPD среда в колба от 500 mL. Тази колба се инкубира върху ротационна клатачна машина в продължение на 48 часа при 37°С и 200 оборота в минута. 25 mL аликвотна част от тази посадъчна култура се използва за инокулиране на 250 mL УРглицерол (1%) среда и се инкубира при разбъркване в 2-1 колба при гореописаните условия. Четиридесет и осем часа след инокулирането се прибавя 1% метанол (промотор на индуцирането) и колбите отново се инкубират при гореописаните условия. Двадесет и четири часа след индуцирането, експериментът се спира и клетъчните пелети се отделят при центрофугиране. Нивото на отделяне на пет различни клона се анализира посредством SDS-PAGE/Western blotting (условията са, както погоре). Серии за титруване на всеки клон се въвеждат върху гела и се подбира най-продуктивният щам за по-нататъшна ферментация и пречистване.

Изненадващо, Hansenula polymorpha, щам на квасни гъбички, близък до Ffchia pastoris (Gellissen, G., 2000), е способен да отделя протеини на вируса на хепатит С, значително без хипергликосилиране и оттук, със захарни остатъци, сравними по размер с протеините, обвиващи вируса на хепатит С, отделяни от инфектирани с рекомбинантен вирус на ваксина спрямо вируса на хепатит С клетки на бозайници.

Щамът на Hansenula polymorpha RB11 е депозиран на 19. април 2002 г., съгласно условията на Budapest Treaty at the Mycotheque de 1’UCL (MUCL), Universite Catholique de Louvian, Laboratoire de mycologie, Place Croix du Sud 3 bte 6, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium и има MUCL регистрационен номер MUCL43805.

ПРИМЕР 7

Изграждане на pSY1aMFE1sH6a бацилоносител

S. cerevisiae експресионният плазмид се изгражда по следния начин. Е1кодираща последователност се изолира като Nsh/Eco52\ фрагмент от pGEMTE1sH6 (SEQ ID N0:6, Фигура 1), който е с нечувствителни краища (при използване на Т4 DNA полимераза) и клониран в pYIG5 бацилоносител (SEQ ID N0:41, Фигура 19) при използване на Т4 DNA лигаза (Boehringer), съгласно описанието на производителя. Клонирането е такова, че Els-Нб кодиращият фрагмент е свързан директно в рамка към aMF-кодиращата последователност. Сместа се преобразува в Е сой DH5aF’ клетки. След това, DNA плазмидът на няколко устойчиви на ампицилин клона, се анализира посредством ограничено асимилирана и се отделя позитивен клон, означен като pYIG5E1H6 (ICCG3470; SEQ ID N0:42, фигура 20).

Експресионната касета (съдържаща aMF последователност и Elкодиращ регион с His-tag) се пренася като ВатН\ фрагмент (2790 Ьр) на pYIG5E1H6 в EamHI-асимилиран Е сой/S. cerevisiae pSY1 сновящ бацилоносител (SEQ ID N0:21, Фигура 43). Свързването се осъществява с Т4 DNA лигаза (Boehringer), съгласно описанието на производителя. Сместа се преобразува до E сой DHSaF’ клетки и DNA плазмидът на няколко устойчиви на ампицилин колонии, се анализира посредством ограничено асимилиране. Отделя се позитивен клон, означен като pSY1aMFE1sH6a (ICCG3479; SEQ ID N0:44, Фигура 22).

ПРИМЕР 8

Изграждане на pSYYIGSE2H6 бацилоносител

S. cerevisiae експресионният плазмид се изгражда по следния начин. Е2кодираща последователност се изолира като Sall/KprA фрагмент от pBSKE2sH6 (SEQ ID N0:45, Фигура 23), който е с нечувствителни краища (при използване на Т4 DNA полимераза) и в последствие клониран в pYIG5 бацилоносител (SEQ ID N0:41, Фигура 19) при използване на Т4 DNA лигаза (Boehringer), съгласно описанието на производителя. Клонирането е такова, че Е2-Н6 кодиращият фрагмент е свързан директно в рамка към aMF-кодиращата последователност. Сместа се преобразува в Е сой DHSaF’ клетки. След това, DNA плазмидът на няколко устойчиви на ампицилин клона, се анализира посредством ограничено асимилиране и се отделя позитивен клон, означен като pYIG5HCCL-22aH6 (ICCG2424; SEQ ID N0:46, Фигура 24).

Експресионната касета (съдържаща aMF последователност и Е2 (384673) кодиращ регион с His-tag) се пренася като BamHl фрагмент (3281 Ьр) на pYIG5HCCL-22aH6 в ВатН\ отворен Е colt/S. cerevisiae pSY1 сновящ бацилоносител (SEQ ID N0:43, Фигура 21). Свързването се осъществява с Т4 DNA лигаза (Boehringer), съгласно описанието на производителя. Сместа се преобразува до Е сой DH5aF’ клетки и DNA плазмидът на няколко устойчиви на ампицилин колонии, се анализира посредством ограничено асимилирано. Отделя се позитивен клон, означен като pSYYIGSE2H6 (ICCG2466; SEQ ID N0:47, фигура 25).

О ПРИМЕР 9

Изграждане на pSY1YIG7E1s бацилоносител

S. cerevisiae експресионният плазмид pSY1YIG7E1s се изгражда по следния начин. Е1-кодираща последователност се изолира като A/s/1/Eco52l фрагмент от pGEMT-E1s (SEQ ID N0:6, Фигура 1), който е с нечувствителни краища и в последствие е клониран в pYIG5 бацилоносител (SEQ ID N0:48, Фигура 26) при използване на Т4 DNA лигаза (Boehringer), съгласно описанието на производителя. Клонирането е такова, че Е1-кодиращият фрагмент е • свързан директно в рамка към aMF-кодиращата последователност. Сместа се преобразува в Е сой DH5aF’ клетки. След това, DNA плазмидът на няколко устойчиви на ампицилин клона, се анализира посредством ограничено асимилирано и се отделя позитивен клон, означен като pYIG7E1 (SEQ ID N0:49, Фигура 27).

Експресионната касета (съдържаща CL водеща последователност и Е1 (192-326) кодиращ регион) се пренася като ВатН! фрагмент (2790 Ьр) на pYIG7E1 в ВатН\ усвоен Е сой/S. cerevisiae pSY1 сновящ бацилоносител (SEQ ID N0:43, Фигура 21). Свързването се осъществява с Т4 DNA лигаза (Boehringer), съгласно описанието на производителя. Сместа се преобразува

100 до Е сой DH5aF’ клетки и DNA плазмидът на няколко устойчиви на ампицилин колонии, се анализира посредством ограничено асимилиране. Отделя се позитивен клон, означен като pSY1YIG7E1s (SEQ ID N0:50, Фигура 28).

ПРИМЕР 10

Преобразуване на Saccharomyces cerevisiae и подбиране на преобразувателите

За да се преодолеят проблемите, свързани с хипергликосилирането, често се съобщава за протеини, свръхизразяващи се в Saccharomyces cerevisiae, мутант, разкриващ какво става. Този метод се базира на метода на Ballou (Ballou, L. et al., 1991), при който се селектират спонтанни рецесивни, устойчиви на ортованадат мутанти. Първоначалната селекция на щам се осъществява на базата на модел на гликосилиране на инвертаза, както е наблюдавано след природна голова електрофореза. Щам с редуцирана способност за гликосилиране се отделя за следващи експериментиза рекомбинантно протеиново отделяне и се означава като щам IYCC155. Природата на мутацията още не е изследвана.

Споменатият, дефицитен на гликосилиране щам IYCC155, се преобразува с плазмидите, както е описано в Примери от 7 до 9, посредством литиево-ацетатен метод, както е описано от Elble (Elble, R., 1992). Няколко Ura допълнителни щамове се отделят от селективна YNB+2% arap (Difco) и се използват за инокулиране на 2 ml YNB+2% глюкоза. Тези култури се инкубират в продължение на 72 часа при 37°С и 200 оборота за минута на орбитална клатачна машина, и културният супернатант и интрацелуларните фракции се анализират за отделяне на Е1 посредством Western blot при откриване със специфично мишо моноклонално антитяло (IGH 210). Отделя се силно продуциран клон за по-нататъшни експерименти.

Отделянето на протеини от Saccharomyces cerevisiae мутант с дефицит на гликосилиране, използван в настоящото изобретение, се затруднява от по101 ниски от оптималните характеристики на такива щамове, които водят до понисък добив на биомаса и оттук, по-нисък добив на желани протеини, в сравнение с необлагородените щамове на Saccharomyces cerevisiae. Добивът на желаните протеини е значително по-висок в клетки на бозайник.

ПРИМЕР 11

Изграждане на pPICZalphaD’E1sH6 и pPICZalphaE’E1sH6 бацилоносители

Сновящият бацилоносител pPICZalphaE’E1sH6 се изгражда като се излиза от pPICZalphaA бацилоносител (Invitrogen; SEQ ID N0:51, фигура 29). В първия етап, споменатият бацилоносител се адаптира за да се осигури директно клониране на Е1 кодиращата последователност зад мястото за разцепване на КЕХ2 или STE13 действащите протеази. Следователно, pPICZalphaA се асимилира с ΧΛοΙ и ΝοΆ. Продуктът се разделя върху 1% агарозен гел и се изолира 3519 kb фрагментът (основната част на бацилоносителя), след което се пречиства посредством набор за гелова екстракция (Qiagen). След това този фрагмент се свързва с Т4 полимераза (Boehringer), съгласно описанието на производителя, в присъствие на специфични олигонуклеотиди, даващи pPICZalphaD’ (SEQ ID N0:52, Фигура 30) или pPICZalphaE’ (SEQ ID N0:53, Фигура 31).

Използват се следните олигонуклеотиди:

- за изграждане на pPICZalphaD’:

8822: 5’-TCGAGAAAAGGGGCCCGAATTCGCATGC-3’ (SEQ ID N0:54); и 8823: 5’-GGCCGCATGCGAATTCGGGCCCCTTTTC-3’ (SEQ ID N0:55), които дават, след отгряване, свързващия нуклеотид:

TCGAGAAAAGGGGCCCGAATTCGCATGC (SEQ ID N0:54)

CTTTTCCCCGGGCTTAAGCGTACGCCGG (SEQ ID N0:55)

- за изграждане на pPICZalphaE’:

8649: 5’-TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCCTGCAGCATATGC-3’ (SEQ ID N0:56); и

102

8650: 5-GGCCGCATATGCTGCAGGCTTCAGCCTCTCTTTTC-3' (SEQ ID N0:57), които дават, след отгряване, свързващия нуклеотид:

TCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCCTGCAGCATATGC (SEQ ID N0:56)

CTITTCTCTCCGACKCGGACGTCGTATACGCCGG (SEQ ID NO :57)

Тези сновящи бацилоносители pPICZalphaD’ и pPICZalphaE’ притежават нововъдени места за клониране, директно зад мястото за разцепване на съответните действащи протеази КЕХ2 и STE13.

Е1-Н6 кодиращата последователност се изолира като A/s/1/Eco52l фрагмент от pGEMT-E1sH6 (SEQ ID N0:6, фигура 1). Фрагментът се пречиства посредством набор за гелова екстракция (Qiagen) след разделяне на продукта върху 1% агарозен гел. Полученият фрагмент притежава нечувствителни краища (при използване на Т4 DNA полимераза) и се свързва с pPICZalphaD’ или pPICZalphaE’, директно зад мястото за разцепване на съответната действаща протеаза.

Получените смеси се преобразуват до Е. coli TOP10F’ клетки и плазмид DNA на няколко устойчиви на зеоцин колонии се анализира посредством ограничено ензимно асимилирано. Отделят се позитивни клони, които се означават, съответно, като pPICZalphaD’E1sH6 (ICCG3694; SEQ ID N0:58, Фигура 32) и pPICZalphaE’E1sH6 (ICCG3475; SEQ ID N0:59, Фигура 33).

ПРИМЕР 12

Изграждане на pPICZalphaD’E2sH6 и pPICZalphaE’E2sH6 бацилоносители

Сновящите бацилоносители pPICZalphaD’ и pPICZalphaE’ се изграждат, както е описано в Пример 11. Е2-Н6 кодиращата последователност се изолира като Saft/Kprd фрагмент от pBSK-E2sH6 (SEQ ID N0:45, фигура 23). Фрагментът се пречиства посредством набор за гелова екстракция (Qiagen) след разделяне на продукта върху 1% агарозен гел. Полученият фрагмент притежава нечувствителни краища (при използване на Т4 DNA полимераза) и

103 се свързва с pPICZalphaD’ или pPICZalphaE’, директно зад мястото за разцепване на съответната действаща протеаза.

Получените смеси се преобразуват до Е. coli TOP10F клетки и плазмид DNA на няколко устойчиви на зеоцин колонии се анализира посредством ограничено ензимно асимилиране. Отделят се позитивни клони, които се означават, съответно, като pPICZalphaD’E2sH6 (ICCG3692; SEQ ID N0:60, Фигура 34) и pPICZalphaE’E2sH6 (ICCG3476; SEQ ID N0:61, Фигура 35).

ПРИМЕР 13

Преобразуване на Rchia pastons и подбиране на преобразувателите

Ffchia pastons сновящите плазмиди, както е описано в Примери 11 и 12, се преобразуват до Pichia pastons клетки, съгласно условията на производителя (Invitrogen). Е1 и Е2 продуциращи щамове се отделят за понататъшно охарактеризиран©.

Протеините, обвиващи вируса на хепатит С, се отделят от Pichia pastons, щам от квасни гъбички, известни с това, че обикновено в тях отсъства хипергликосилиране (Gellissen, G., 2000) и досега са използвани за отделяне на протеин на вирус Е на тропическата треска денга като GST (Surgue, R.J. et al., 1997). Получените протеини, обвиващи вируса на хепатит С, отделени от Pichia pastons, показват сравнимо гликосилиране, както се наблюдава в необлагородени щамове на Saccharomyces. По-специално, протеините, обвиващи вируса на хепатит С, отделени от Pichia pastons, са хипергликосилирани (на база на молекулното тегло на отделените продукти, открити при маркиране на протеините, изолирани от преобразувани Pichia pastoris клетки).

104

ПРИМЕР 14

Условия за отглеждане на култури от Saccharomyces cerevisiae,

Hansenula polymoipha и Pichia pastoiis

Saccharomyces cerevisiae

Получаване на банки от клетки

Приготвят се основна клетъчна банка и работеща клетъчна банка на избрания рекомбинантен клон. От средно експоненциално нарастнала култура в колбата се приготвят криостъкленици (условията на инкубиране са като тези за ферментация на посадъчните култури, виж по-долу). Прибавя се глицерол (50% крайна концентрация) като криопротекгант.

Ферментация

Посадъчните култури се взимат от клетки на крио-съхранявана работеща клетъчна банка, които се оставят да растат в 500 ml среда (YNB обогатена с 2% сукроза, Difco) в ерленмайерови колби от 2 литра при 37°С, разклащани с 200 оборота в минута в продължение на 48 часа.

Ферментацията обикновено се провежда в Biostat С ферментатори с работещ обем 15 литра (В. Braun Int., Melsungen, Germany). Средата за ферментация съдържа 1% екстракт от квасни гъбички, 2% Peptone и 2% сукроза като източник на въглерод. Като антипенител се използва полиетиленгликол.

Температурата, pH и разтвореният кислород обикновено се контролират през време на ферментацията, като стойностите са обобщени в Таблица 1. Разтвореният кислород се контролира каскадно при разбъркване/аерация. pH се контролира чрез прибавяне на натриев хидроксид (0.5 М) или разтвор на фосфорна киселина (8.5%).

105

Таблица 1. Основни параметри на ферментацията на Saccharomyces cerevisiae

Параметър

Стойности

Температура pH

DO (фаза на растеж)

DO (индуциране)

Аерация

Разбъркване *промяна на обема за минута

- 37°С

4.2-5.0

- 40% насищане с въздух

0-5%

0.5- 1.8 wm*

150-900 rpm

Ферментацията се стартира при разбъркване на 10% посадъчна култура. През време на растежната фаза, посредством високоефективна течна хроматография (Polysphere Column ОАКС Merck), се следи за концентрацията на сукрозата.

През време на растежа, разтвореният кислород се контролира посредством каскаден контрол (разбъркване/аерация). След пълния метаболизъм на сукрозата, полученият хетерологичен протеин се отделя с ендогенно получен етанол, обогатен при постепенно прибавяне на етанол за поддържане на концентрацията приблизително 0.5% (високоефективна течна хроматография (Polysphere Column ОАКС)). През време на индуцирането, разтвореният кислород се контролира под 5% насищане с въздух, при ръчно настройване на скоростта на въздушния поток и скоростта на бъркалката.

Обикновено, ферментиралите култури се обират от 48 до 72 часа след индуциране чрез концентриране през тангенциално поточно филтруване, последвано от центрофугиране на концентрираната клетъчна суспензия до получаване на клетъчни пелети. Ако не се анализират веднага, клетъчните пелети се съхраняват при -70°С.

106

Hansenula Dolvmoroha

Получаване на банки от клетки

Приготвят се основна клетъчна банка и работеща клетъчна банка на избрания рекомбинантен клон. От средно експоненциално нарастнала култура в колбата се приготвят криостькленици (условията на инкубиране са като тези за ферментация на посадъчните култури, виж по-долу). Прибавя се глицерол (50% крайна концентрация) като криопротектант.

Ферментация

Посадъчните култури се взимат от клетки на крио-съхранявана (-70°С) работеща клетъчна банка, които се оставят да растат в 500 ml среда (YPD, Difco) в ерленмайерови колби от 2 литра при 37°С, разклащани с 200 оборота в минута в продължение на 48 часа.

Ферментацията обикновено се провежда в Biostat С ферментатори с работещ обем 15 литра (В. Braun Int., Melsungen, Germany). Средата за ферментация съдържа 1% екстракт от квасни гъбички, 2% Peptone и 2% глицерол като източник на въглерод. Като антипенител се използва полиетиленгликол.

Температурата, pH, входящият въздух и разтвореният кислород обикновено се контролират през време на ферментацията, като стойностите са обобщени в Таблица 2. Разтвореният кислород се контролира при разбъркване. pH се контролира чрез прибавяне на натриев хидроксид (0.5 М) или разтвор на фосфорна киселина (8.5%).

Таблица 2. Основни параметри на ферментацията на Hansenula polymotpha

Параметър

Температура pH

DO

Стойности

- 40°С

4.2 - 5.0

- 40% насищане с въздух

107

Аерация Разбъркване

0.5- 1.8 wm*

150 - 900 rpm *промяна на обема за минута ферментацията се стартира при разбъркване на 10% посадъчна култура. През време на растежната фаза, посредством високоефективна течна хроматография (Polysphere Column ОАКС Merck), се следи за концентрацията на глицерол и 24 часа след пълното изчерпване на глицерола се прибавя 1% метанол за индуциране на отделяне на хетерологичен протеин.

ферментиралите култури се обират 24 часа след индуциране чрез концентриране през тангенциално поточно филтруване, последвано от центрофугиране на концентрираната клетъчна суспензия до получаване на клетъчни пелети. Ако не се анализират веднага, клетъчните пелети се съхраняват при -70°С.

Pachta pastors

Експериментите с протеин с малка дължина с рекомбинантен щам Pichta pastoris се провеждат в колби с култури при разклащане. Посадъчните култури се оставят да нарастват в продължение на една нощ в YPD (Difco). pH на първоначалната среда се коригира до 4.5. Колбите се инкубират върху ротационна клатачна машина при 37°С, разклащани с 200-250 оборота в минута.

Полученият продукт с малка дължина се поставя в проба от 500 ml в колби от 2 литра и се започва с 10% инокулиране в средата за отделяне, съдържаща 1% екстракт от квасни гъбички, 2% Peptone (и двата от Difco) и 2% глицерол като източник на въглерод. Условията за инкубиране са като тези за посадъчната култура. Индуцирането започва, когато се прибави 1% метанол приблизително 72 часа след инокулирането. Клетките се отделят 24 часа след

108 индуциране посредством центрофугиране. Ако не се анализират веднага, клетъчните пелети се съхраняват при -70°С.

ПРИМЕР 15

Отделяне на водещ пептид от MFa-E1-H6 и MFoc-E2-H6 протеини, отделени в подбрани клетки на квасни гъбички

Анализирани са конструкции на продуктите на отделяне в Saccharomyces cerevisiae и Hansenula polymorpha гликосилиран отрицателен щам на Е1 и Е2 протеините на вируса на хепатит С, с водеща последователност с а-свързващ фактор на Saccharomyces cerevisiae. Тъй като и двата генотипа 1b E1s на вируса на хепатит С (аа 192-326), и E2s на вируса на хепатит С (аа 383-673, удължен с VIEGR (SEQ ID N0:69) последователност) се отделят като С-крайни с his-tag (Н6, НННННН, SEQ ID N0:63: като споменатите протеини на вируса на хепатит С са включени в този пример и са означени като aMF-E1-H6 и <xMF-E2-H6) протеини, върху Ni-IDA (Ni-иминодиоцетна киселина) се провежда бързо и ефективно пречистване на отделените продукти след солюбилизирането на клетките на квасните гъбички с гуанидинхлорид (GuHCI). Накратко, клетъчните пелети се ресуспендират в 50 тМ фосфат, 6М гуанидинхлорид, pH 7.4 (9 обема на 1 грам клетки). Протеините се сулфонират в продължение на една нощ при стайна температура в присъствие на 320 тМ (4% тегл./об.) натриев сулфит и 65 тМ (4% тегл./об.) натриев тетратионат. Лизатьт се избистря след цикъл на замразяване/размразяване посредством центрофугиране (10.000 д, 30 минути, 4°С) и Empigen (Albright & Wilson, UK) и към супернатанта се прибавя имидазол до крайна концентрация, съответно, 1% (тегл./об.) и 20 тМ. Пробата се филтрува (0.22 μΜ) и се въвежда в Ni-IDA Sepharose FF колона, уравновесена с 50 тМ фосфат, 6М гуанидинхлорид, 1% Empigen (буфер А), обогатен с 20 тМ имидазол. Колоната се промива последователно с буфер А, съдържащ, съответно, 20 тМ и 50 тМ имидазол докато се достигне ниво на базовата

109 линия на поглъщането 280 nm. Тези his-tag продукти се елуират посредством прилагане на буфер D, 50 тМ фосфат, 6М гуанидинхлорид, 0.2% (за Е1) или 1% (за Е2) Empigen, 200 mM имидазол. Елуираните продукти се анализират посредством SDS-PAGE и Western-blot при използване на специфични моноклонални антитела, насочени към Е1 (IGH201) или Е2 (IGH212).

Е1 продуктите се анализират веднага посредством разлагане на Edman.

Тъй като на този етап, SDS-PAGE вече разкрива много сложна картина от ивици на протеин за Е2 на вируса на хепатит С, се провежда следващо фракциониране посредством хроматография, изключваща размера. Ni-IDA се концентрира чрез ултрафилтрация (MWCO 10 kDa, centriplus, Amicon, Millipore) и се въвежда върху Superdex G200 (10/30 или 16/60; Pharmacia) в PBS, 1% Empigen или PBS, 3% Empigen. Фракциите от елуирането, съдържащи Е2 продукти, с Мг между приблизително 80 kDa и приблизително 45 kDa, т.е. фракции 17-23 на профила на елуиране от Фигура 37, на базата на мигриране върху SDS-PAGE (Фигура 38), се изливат и алкилират (инкубиране с 10 mM DTT в продължение на 3 часа при стайна температура, последвано от инкубиране с 30 тМ йодацетамид в продължение на 3 часа при стайна температура). Пробите от последователности с крайни аминогрупи се третират с Endo Н (Roche Biochemicals) или се оставят нетретирани. Гликосилираните и дегликосилираните Е2 продукти се напръскват върху PVDF мембрани за последователно навързване с крайни аминогрупи. Амидно, черно оцветено петно на гликосилиран и дегликосилиран Е2 е показано на Фигура 39.

Последователното навързване и на двата Е1 и Е2 пречистени продукта води до разочароващо наблюдение, че отделянето на сигналната последователност от протеините, обвиващи вируса на хепатит С, протича само частично (виж Таблица 3). Още повече, болшинството странични продукти (продукти на разлагане и продукти, вече съдържащи водещата последователност или нейна част) са гликосилирани. Това гликосилиране присъства даже в част на неразделения фрагмент на сигналната

110 последователност, която също включва място за N-гликосилиране. Тези места могат да бъдат мутирани за да се получат по-малко гликосилирани странични продукти. Обаче, даже по-проблемно е установяването, че някои алтернативно разцепени продукти се различават само с от 1 до 4 аминокиселини в сравнение с желания цял обвиващ протеин. Следователно, пречистването на коректно получения продукт е невъзможно, което се дължи на липса на достатъчно разграничими биохимични характеристики между различните продукти на отделянето. Някои от продуктите на разлагането могат да доведат до разцепване, подобно на Кех-2 (например, разцепването, наблюдавано след аа 196 на Е1, което е разцепване след аргинин), което също е необходимо за разцепването на α-свързващия фактор и, което не може да бъде блокирано без да се наруши основния процес.

Висш Е1 продуциращ клон, получен при преобразуване на Saccharomyces cerevisiae IYCC155 с pSY1YIG7R1s (SEQ ID N0:50, Фигура 28), се сравнява с висш продуциращ клон, получен при преобразуване на Saccharomyces cerevisiae IYCC155 с pSY1aMFE1sH6aYIG1E1s (SEQ ID N0:44, Фигура 22). Междуклетъчното отделяне на Е1 протеин се оценява от 2 до 7 дни след индуцирането, посредством Western-blot при използване на Е1 специфично моноклонално антитело (IGH201). Както може да се съди от Фигура 40, максимално отделяне се наблюдава след 2 дни и за двата щама, но самото отделяне за двата щама е напълно различно. Отделянето с водещ асвързващ фактор води до много сложна картина от ивици, която е следствие на факта, че действието на водача не е ефективно. Това води до различни продукти на отделянето с различни крайни аминогрупи като някои са модифицирани с от 1 до 5 вериги за N-гликосилиране. Обаче, за Е1, отделен с CL водач се набрюдават ограничен брой разграничими ивици, което отразява високото ниво на отделяне на коректен CL водач и факта, че само този коретктно получен продукт може да бъде модифициран посредством NIll гликосилиране (от 1 до 5 вериги), както е наблюдавано за Е1, отделен в Hanselula polymorpha със същия CL водач (виж, Пример 16).

Хибридомната клетъчна линия, продуцираща моноклоналното антитяло, насочено към Е1 (IGH201) е депозирана на 12. март 1998 г., съгласно условията на Budapest Treaty at the European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbiology & Research, Salisbuty, Wiltshire SP4 OJG, UK, и има регистрационен номер ECACC 98031216. Моноклоналното антитяло, насочено към Е2 (IGH212) е описано като антитяло 12D11F2 в Пример 7.4 от Maertens et al., WO96/04385.

Таблица 3: Идентификация на N-края на a-MF-E1-H6 и a-MF-E2-H6 протеини, отделени в Saccharomyces cerevisiae или Hanselula polymorpha. На базата на Nкрайно подреждане на последователностите, количеството N-краища на свързаните Е1-Н6 и Е2-Н6 протеини може да бъде оценено (“свързване” означава коректно отделяне на aMF сигналната последователност). Общото количество протеинови продукти се изчислява в pmol протеин на база на интензивността на пиковете, покрити от разлагане на Edman. Следователно, за всеки специфичен протеин (т.е. за всеки ‘открит N-край”) се изчислява молният процент по отношение на общия.

Квасни гъбички aMF-E1-H6________________________aMF-E2-VIEGR-H6

S. cerevisiae Експеримент 1:

-16% от протеините съдържат aMF последователности

-18% от протеините се разцепват между аа 195 и 196 на Е1

-66% от протеините са с коректно отделена aMF

112

Експеримент 2:

-18% от протеините съдържат aMF последователности

-33% от протеините се разцепват между аа 195 и 196 на Е1

-8% други протеини, различни от Е1, са продукти на разцепване

-44% от протеините са с коректно отделена aMF

Н. polymorpha -64% от протеините съдържат

-75% от протеините aMF последователности съдържат aMF

-6% от протеините се разцепват последователности между аа 192 и 193 на Е1

-25% от протеините

-30% от протеините са с коректно са с коректно отделена aMF отделена aMF

ПРИМЕР 16

Отделяне на Е1 конструкция в квасни гъбички, подходящи за получаване в големи размери и пречистване

За заменяне на aMF водещ пептид в Saccharomyces cerevisiae, включващ СНН (водеща последователност от Cardnus maenas хипергликемичен хормон), Amyl (водеща последователност на амилаза от Saccharomyces Occidentahs), Gam1 (водеща последователност на гликоамилаза от Saccharomyces ocddentats), Phy5 (водеща последователност на фунгална фитаза), pho1 (водеща последователност на киселинна фосфатаза от Pichia pastoris) и CL (лидер на авиан лизозим С, 1,4-бета-1\1-ацетилмурамидаза С), свързани към Е1113

Н6 (т.е. с С-краен his-tag), се използват няколко други водещи последователности. Всички конструкции се отделят в Hanselula polymorpha и всеки от получените клетъчни лизати се подлага на Western blot анализ Това позволява вече да се направи изводът, че степента на отделяне на водач или сигнална последователност или пептид е екстремно ниска, в изключение на конструкцията, където CL се използва като водещ пептид. Това е потвърдено за СНН-Е1-Н6 конструкцията посредством Edman-разлагане на Ni-IDA

пречистен

материал: въпреки че се отделят няколко различни

последователности, не може да се открие некоректно разцепен продукт (виж Таблица 4).

Таблица 4: Идентификация на N-края на СНН-Е1-Н6 протеини, отделени в Hanselula polymorpha на базата на N-крайно подреждане на последователности на различни ивици протеин след разделяне посредством SDS-PAGE и нанасяне на PVDF мембрана.

Молекулен

Идентифициран N-край

размер

45 kD	започва при аминокиселина 27 на водача СНН=само пре-
26 kD	последователността е разцепена, про-последователността е все още свързана -частично започва при аминокиселина 1 на водача СНН=няма
24 kD	отделяне на пре-про-последователност -частично започва при аминокиселина 9 на водача СНН=продукт на алтернативно транслиране, започвайки при втория AUG кодон -частично започва при аминокиселина 1 на водача СНН=няма отделяне на пре-про-последователност -частично започва при аминокиселина 9 на водача СНН=продукт на алтернативно транслиране, започвайки при втория AUG кодон

114

Както беше отбелязано по-горе, Western blot на клетъчните лизати разкримат картина на ивици на Е1 специфичен протеин, показателна за повисока степен на коректно отделяне на CL водещия пептид. Това е изненадващо, тъй като този водач не се получава от квасни гъбички. Подреждането на аминокиселините според Edman-разлагане на GuHCI солюбилизиран и Ni-IDA пречистен материал наистина потвърждава, че 84% от Е1 протеините се разцепват коректно и материалът в голяма степен е освободен от продукти на разлагането. Само 16% от материала не са реагирали, на докато този материал не е гликосилиран, той може лесно да бъде отделен от сместа, позволявайки специфично обогатяване с коректно разцепен и гликосилиран Е1 Такъв метод за обогатяване може да бъде афинитетна хроматография върху лектини, като други алтернативи са дадени в Пример 19. Или пък, може да бъде използвана по-високата хидрофобност на негликосилирания материал за подбиране и оптимизиране на други обогатяващи процедури. Коректното отделяне на CL водещия пептид от CL-E1Н6 протеина е потвърдено също и от мас-спектрометрия, с помощта на която се потвърждава също и, че могат да бъдат окупирани до четири от петте места за N-гликосилиране на генотипа 1Ь Е 1s, при което се счита, че последователността NNSS (аминокиселини от 233 до 236; SEQ ID N0:73) е единично място за N-гликосилиране.

ПРИМЕР 17

Пречистване и биохимично охарактеризиране на Е2 протеин на вируса на хепатит С, отделен в Hanselula polymorpha от CL-E2-H6 кодираща конструкция

Анализирана е ефективността на отделяне на CL водещ пептид от CL-E2VIEGR-H6 (по-нататък в примера, означен като “CL-E2-H6”) протеин, отделен в Hanselula polymorpha. Тъй като Е2 на вируса на хепатит С (аа 383-673) се отделя като his-tag протеин, бързо и ефективно пречистване на отделения протеин,

115 след солюбилизация с гуанидинхлорид (GuHCI) на отделените клетки, се провежда върху Ni-IDA Накратко, клетъчните пелети се ресуспендират в 30 тМ фосфат, 6 М гуанидинхлорид, pH 7.2 (9 ml буфер/g клетки). Протеинът се сулфонира в продължение на една нощ при стайна температура в присъствие на 320 тМ (4% тегл./об.) натриев сулфит и 65 тМ (2% тегл./об.) натриев тетратионат. Лизатът се избистря след цикъл на замразяване/рамразяване посредством центрофугиране (10.000 д, 30 минути, 4°С). Прибавят се Empigen ВВ (Albright & Wilson) и имидазол до крайна концентрация, съответно, 1% (тегл./об.) и 20 тМ. Всички следващи хроматографски етапи се провеждат върху Akta FPLC (Pharmacia). Пробата се филтрува през мембрана с размер на • порите 0.22 цт (целулозен ацетат) и се нанася върху Ni-IDA колона (хелатираща сефароза FF, въведена с Ni²⁺, Pharmacia), уравновесена с 50 тМ фосфат, 6 М гуанидинхлорид, 1% Empigen ВВ, pH 7.2 (буфер А), обогатен с 20 тМ имидазол. Колоната се промива последователно с буфер А съдържащ, съответно, 20 тМ и 50 тМ имидазол докато поглъщане от 280 nm достигне базовата линия. Тези his tag продукти се елуират при използване на буфер D, 50 тМ фосфат, 6 М гуанидинхлорид, 0.2% Empigen ВВ, pH 7.2, 200 тМ имидазол. Пречистените продукти се анализират посредством SDS-PAGE и Western blot при използване на специфично моноклонално антитяло, насочено ® към Е2 (IGH212) (фигура 41). IMAC пречистеният Е2-Н6 протеин се подлага също и на N-крайно подреждане на последователностите посредством разлагане на Edman. За тази цел протеините се третират с N-гликозидаза F (Roche) (0.2 U/pg Е2, 1 час инкубиране при 37°С в PBS/3% Empigen ВВ) или не се третират. Гликосилираните и негликосилираните Е2-Н6 протеини се подлагат на SDS-PAGE и Western blot върху върху PVDF мембрани за последователно навързване с крайни аминогрупи (анализът се провежда върху PROCISE™ 492 протеин, Applied Biosystems). Тъй като на този етап SDSPAGE разкрива някои продукти на разлагане, се провежда следващо фракциониране посредством хроматография, изключваща размера. Ni-IDA

116 елуатът се концентрира чрез ултрафилтрация (MWCO 10 kDa, centriplus, Amicon, Millipore) и се въвежда върху Superdex G200 (Pharmacia) в PBS, 1% Empigen ВВ. Фракциите от елуирането, съдържащи главно цели Е2 продукти, с Мг между приблизително 30 kDa и приблизително 70 kDa, на базата на мигриране върху SDS-PAGE, се изливат и евентуално се алкилират (инкубиране с 5 mM DTT в продължение на 30 минути при 37°С, последвано от инкубиране с 20 тМ йодацетамид в продължение на 30 минути при 37°С). Възможното присъствие на продукти на разлагането след IMAC пречистването може да бъде преодоляно посредством следващо фракциониране на целия продукт посредством хроматография, изключваща размера. Получени са неочаквано добри резултати. На база на N-крайното подреждане на последователностите, може да се изчисли количеството Е2 продукт, от който е отделен CL водещият пептид. Общото количество протеинови продукти се изчисляват като pmol протеин на база на интензитета на пиковете, възстановени при разлагането на Edman. Следователно, за всеки специфичен протеин (т.е. за всеки “открит N-край”) се изчислява молният процент в зависимост от общия. В настоящия експеримент се открива само коректният N-край на Е2-Н6, а други разновидности на Е2-Н6 с липсващи аминокиселини на Е2 протеин или съдържащи N-крайни аминокиселини, които не са включени в Е2 протеина, липсват. В заключение, Е2-Н6 протеинът, отделен в Hanselula potymorpha като CL-E2-H6 протеин, се изолира без in vitro обработка като >95% коректно разцепен протеин. Това е в остър контраст с точността на отделянето на водещ пептид от Hanselula potymorpha на O.MF-E2-H6 протеин спрямо Е2-Н6 протеин, който се изчислява на 25% от изолираните протеини (виж Таблица 3).

117

ПРИМЕР 18

Пречистване и биохимично охарактеризиране на Е1 протеин на вируса на хепатит С, отделен в Hanselula polymorpha от CL-H6-K-E1 кодираща конструкция и in vitro обработка на Нб-съдържащи протеини

Анализирана е ефективността на отделяне на CL водещ пептид от CL-H6К-Е1 протеин, отделен в Hanselula polymorpha, както и ефективността на следваща in vitro обработка за отделяне на Н6 (his-tag)-aflanTopeH пептид и Endo Lys-C място за обработка. Тъй като Е1 на вируса на хепатит С (аа 192-326) се отделя като N-краен his-K-tag протеин CL-H6-K-E1, се провежда бързо и ефективно пречистване на отделения протеин, както е описано в Пример 17. Профилът на елуиране при IMAC хроматографското пречистване на Н6-К-Е1 (и възможно остатъчен CL-H6-K-E1) протеините е показано на Фигура 42. След SDS-PAGE и сребърно оцветяване на гела и Western blot анализ при използване на специфично моноклонално антитяло, насочено към Е1 (IGH201) (фигура 43), като фракциите от елуирането (63-69), съдържащи рекомбинантни Е1 продукти се изливат (“IMAC изливане”) и се подлагат на третиране в продължение на една нощ с ендопротеиназа Lys-C (Roche) (съотношение ензим/субстрат 1/50 (тегл./тегл ), 37°С) за отделяне на Н6-К кондензираната опашка. Отделянето на нетретирания кондензиран продукт се провежда посредством негативна IMAC хроматографски етап върху Ni-IDA колона, при която третираните с Endo-Lys-C протеини се отделят във фракция от потока. Пробата от усвоен от ендопротеиназа Lys-C протеин се поставя в Ni-IDA колона след 10-кратно разреждане с 10 mM NaH₂PO₄.3H₂O, 1% (об./об.) Empigen В, pH 7.2 (буфер В), последвано от промиване с буфер В, докато поглъщане от 280 nm достигне базовата линия. Потокът, от който се отделят различни фракции (1-40) се анализира за присъствие на E1s продукти (Фигура 44). Фракциите (7-28), съдържащи цял Е1, от който се отделя N-краен Н6-К (и възможно остатъчен CL-H6-K) (с Мг между приблизително 15 kDa и

118 приблизително 30 kDa, на базата на мигриране върху SDS-PAGE, последвано от сребърно оцветяване или Western blot анализ при използване на специфично моноклонално антитяло, насочено към Е1 (IGH201)), се изливат и евентуално се алкилират (инкубиране с 5 mM DTT в продължение на 30 минути при 37°С, последвано от инкубиране с 20 mM йодацетамид в продължение на 30 минути при 37°С).

Полученият продукт се подлага на N-крайно подреждане на последователностите (разлагане на Edman). За тази цел протеините се третират с N-гликозидаза F (Roche) (0.2 U/gg Е1, 1 час инкубиране при 37°С в PBS/3% Empigen ВВ) или не се третират. Гликосилираните и негликосилираните Е1 протеини след това се подлагат на SDS-PAGE и Western blot върху върху PVDF мембрани за следващ анализ посредством разлагане на Edman (анализът се провежда върху PROCISE™ 492 протеин, Applied Biosystems). На базата на N-крайното подреждане на последователностите, може да се изчисли количеството на коректно обработения Е1 продукт (обработката включва коректно разцепване на Н6-К последователността). Общото количество протеинови продукти се изчисляват като pmol протеин на база на интензитета на пиковете, възстановени при разлагането на Edman. Следователно, за всеки специфичен протеин (т.е. за всеки “открит N-край”) се изчислява молният процент в зависимост от общия. В настоящия експеримент се открива само коректният N-край на Е1, а не N-краяг на други разновидности на Н6-К-Е1. На базата на това се изчислява съотношението на in vitro обработения протен посредством Endo-Lys-C на Н6-К-Е1 Е1 (и възможно остатъчен CL-H6-K-E1) протеин към Е1 протеин за да съвпада с точността повече от 95%.

119

ПРИМЕР 19

Специфично отделяне на слабо гликосилирани форми на Е1 на вируса на хепатит С посредством хепарин

За да се намерят етапи за специфично пречистване на протеини, обвиващи вируса на хепатит С, от квасни гъбички, се изследват клетки, свързани с хепарин. Известно е, че хепаринът се свързва с някои вируси и, следователно, се предполага и свързването му към протеин, обвиващ вируса на хепатит С (Garson, J.A. et al., 1999). За анализирането на това потенциално свързване, хепаринът се биотинилира и се анализира взаимодействието с Е1 на вируса на хепатит С в микротитърни плочки, покрити или със сулфониран Е1 на вируса на хепатит С от Hanselula polymorpha, или алкилиран Е1 на вируса на хепатит С от култура на клетки на бозайник, заразени с бацилоносител, отделен от ваксина. Изненадващо, силно свързване може да се наблюдава само със сулфониран Е1 на вируса на хепатит С от Hanselula polymorpha, докато свързване с Е1 на вируса на хепатит С от култура на клетки на бозайник напълно липсва. Посредством Western blot може да се покаже, че това свързване е специфично за ивиците на смес на Е1 протеини на вируса на хепатит С с по-ниско молекулно тегло (Фигура 45), специфично за слабогликосилпраната смес от Е1 протеини на вируса на хепатит С. Фигура 45 разкрива също, че сулфонирането не е съществено за свързването с хепарин, тъй като при премахване на това сулфониране, все още се наблюдава свързване за Е1 протеини на вируса на хепатит С с по-ниско молекулно тегло (крива 4). Или пък, алкилирането понижава значително това свързване, обаче, това може да бъде причинено от специфичен алкилиращ агент (йодацетамид), използван в настоящия пример. Това установяване демонстрира и промишленото приложение на CL-HCV-обвиващи експресионни касети за квасни кьбички, тъй като съставите на Е1 на вируса на хепатит С специфично могат да бъдат обогатени по отношение на съставите на Е1 протеини на вируса

120 на хепатит С с по-висока степен на гликосилиране (т.е. повече заети места за гликосилиране).

ПРИМЕР 20

Формиране и анализ на вирусоподобни частици (VLP)

Превръщането на Е1 е Е2 протеините, обвиващи вируса на хепатит С, отделяни в Hanselula polymorpha, (Примери от 16 до 18) във вирусоподобни частици, се провежда главно, както е описано от Depia et al. в WO99/67285 и от Bosman et al. в W001/30815. Накратко, след култивирането на преобразуваните Hanselula polymorpha клетки, през време на което се отделят протеините, обвиващи вируса на хепатит С, клетките се обират, разтварят се в гуанидинхлорид и се сулфонират, както е описано в Пример 17. His-tag протеините след това се пречистват посредством IMAC и се концентрират при ултрацентрофугиране, както е описано в Пример 17.

формиране на вирусоподобни частици (VLP) на протеините, обвиващи вируса на хепатит С, със сулфонирани Cvs-тиолови групи

Концентрираните протеини, обвиващи вируса на хепатит С, сулфонирани през време на етапа на изолиране не се подлагат на редуциращо третиране и се въвеждат, независимо от размера, в хроматографска колона (Superdex G200, Pharmacia), уравновесена с PBS, 1% (об./об.) Empigen. Елуираните фракции се анализират посредством SDS-PAGE и Western blot, фракциите с относително Мг от приблизително 29 до приблизително 15 kD (на базата на SDS-PAGE миграция) се изливат, концентрират се и се въвеждат върху Superdex G200, уравновесена с PBS, 3% (тегл./об.) бетаин, за да се инициира формирането на вирусоподобни частици (VLP). Фракциите се изливат, концентрират се и се обезсолват в PBS, 0.5% (тегл./об.) бетаин.

121

Формиране на вирусоподобни частици (VLP) на протеините, обвиващи вируса на хепатит С, с необратимо модифицирани сулфонирани Cys-тиолови групи

Концентрираните протеини, обвиващи вируса на хепатит С, сулфонирани през време на етапа на изолиране се подлагат на редуциращо третиране (инкубиране в присъствие на 5 mM DTT в PBS) до превръщане на сулфонираните Cys-тиолови групи в свободни Cys-тиолови групи. Необратимата Cys-тиолова модификация се провежда посредством (а) инкубиране в продължение на 30 минути в присъствие на 20 mM йодацетамид, или посредством (б) инкубиране в продължение на 30 минути в присъствие на 5 mM N-етиленмалеимид (NEM) и 15 mM биотин-М-етиленмалеимид. Протеините след това се въвеждат в хроматографска колона, която не отчита размера, (Superdex G200, Pharmacia), уравновесена с PBS, 1% (об./об.) Empigen в случай на блокиране с йодацетамид, или с PBS, 0.2% CHAPS в случай на блокиране с N-етиленмалеимид и биотин^-етиленмалеимид. Елуираните фракции се анализират посредством SDS-PAGE и Western blot. Фракциите с относително Мг от приблизително 29 до приблизително 15 kD (на базата на SDS-PAGE миграция) се изливат, концентрират се и, за да се инициира формирането на вирусоподобни частици, се въвеждат върху Superdex G200, уравновесена с PBS, 3% (тегл./об.) бетаин. фракциите се изливат, концентрират се и се обезсолват в PBS, 0.5% (тегл./об.) бетаин в случай на блокиране с йодацетамид,, или в PBS, 0.05% CHAPS в случай на блокиране с Nетиленмалеимид и биотин^-етиленмалеимид.

формиране на вирусоподобни частици (VLP) на протеините, обвиващи вируса на хепатит С, с обратимо модифицирани сулфонирани Cys-тиолови групи

Концентрираните протеини, обвиващи вируса на хепатит С, сулфонирани през време на етапа на изолиране се подлагат на редуциращо третиране (инкубиране в присъствие на 5 mM DTT в PBS) до превръщане на сулфонираните Cys-тиолови групи в свободни Cys-тиолови групи. Обратимата

122

Cys-тиолова модификация се провежда посредством инкубиране в продължение на 30 минути в присъствие на дитиодипиридин (DTDP), дитиокарбамат (DTC) или цистеин. Протеините след това се въвеждат в хроматографска колона, която не отчита размера, (Superdex G200, Pharmacia), уравновесена с PBS, 1% (об./об.) Empigen. Елуираните фракции се анализират посредством SDS-PAGE и Western blot. Фракциите с относително Мг от приблизително 29 до приблизително 15 kD (на базата на SDS-PAGE миграция) се изливат, концентрират се и се въвеждат върху Superdex G200, уравновесена с PBS, 3% (тегл./об.) бетаин, за да се инициира формирането на вирусоподобни частици. Фракциите се изливат, концентрират се и се обезсолват в PBS, 0.5% (тегл./об.) бетаин.

Профилите на елуиране от хроматографския анализ, който не отчита размера, в PBS, 3% (тегл./об.) бетаин, за получаване на вирусоподобни частици на отделен от Hanselula polymorpha Е2-Н6, са показани на Фигура 46 (сулфонирани) и фигура 47 (алкилирани с йодацетамид).

Профилите на елуиране от хроматографския анализ, който не отчита размера, в PBS, 3% (тегл./об.) бетаин, за получаване на вирусоподобни частици на отделен от Hanselula polymorpha Е1, са показани на Фигура 48 (сулфонирани) и фигура 49 (алкилирани с йодацетамид). Получените вирусоподобни частици са анализирани посредством SDS-PAGE и Western blot, както е показано на Фигура 50.

Анализ на размера на висусоподобните частици. Формирани от протеини, обвиващи фируса на хепатит С, отделени от Hanselula polymorpha

Размерът на вирусоподобните частици е определен посредством динамично разсейване на светлината. За експериментите на разсейване на светлината, се използва анализатор на размера на частиците (Model Zetasizer

1000 HS, Malvern Instruments Ltd., Malvern, Worcester UK), който се контролира посредством софтуер на фотонна корелационна спектроскопия (PCS).

123

Фотонната корелационна спектроскопия или динамичното разсейване на светлината (DLS) е оптимален метод, при който се измерва брауновото движение и се отнася към размера на частиците. Светлина от непрекъснат видим лазерен лъч се насочва през ансамбъл от макромолекули или частици в суспензия, движещи се с брауново движение. Част от лазерната светлина се разсейва и тази разсеяна светлина се измерва посредством фотомултиплейер. Флуктуациите в интензивността на разсеяната светлина се превръщат в електрически импулси, които захранват корелатор. Така се създава автокорелационна функция, която отива в компютър, където се получават данните от анализа. Използваният лазер е 10 mW монохромен кохерентен хелий-неонов лазер с фиксирана дължина на вълната от 633 nm. За всяка проба се извършват от три до шест последователни измервания.

Резултатите от тези експерименти са дадени в Таблица 5.

Таблица 5. Резултати от динамично разссейване на светлината на показаните състави на вирусоподобни частици от протеини, обвиващи вируса на хепатит С, отделени от Hanselula polymorpha. Размерът на вирусоподобните частици е даден като среден диаметър на частиците.

Цис-тиол ова модификация Е1-Н6____________E2-VIEGR-H6______Е1.

Сулфониране 25-45 nm 20 nm 20-26nm

Алкилиране 23-56 nm 20-56 nm 21-25nm (йодацетамид)

Наблюдението, че сулфонираният Е1 на вируса на хепатит С, отделени от Hanselula polymorpha, формира частици с размер в същия интервал, както алкилирания Е1 на вируса на хепатит С, отделени от Hanselula polymorpha, е изненадващо. Такъв ефект не е очакван, тъй като силното (до 8 Cys-тиолови групи могат да бъдат модифицирани върху Е1 на вируса на хепатит С)

124 повишаване на мрежата от отрицателни товари като следствие от сулфонирането трябва да индуцира йонно отблъскване между подзвената. Другите тествани обратими цистеинови модифициращи агенти също позволяват формиране на частици, като Е1 на вируса на хепатит С, продуциран по същия начин, е доказано, че е по-нестабилен от сулфонирания материал, което води до агрегиране на дисулфидна база на Е1 на вируса на хепатит С. За да се използват тези други обратими блокери, се изисква понататъшно оптимизиране на условията.

ПРИМЕР 21

Антигенна еквивалентност на продуциран от Hansenuia Е1-Н6 на вируса на хепатит С и продуциран от заразени с ваксина клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С

Реактивоспособността на продуциран от Hansenuia Е1-Н6 на вируса на хепатит С със серум на хронични носители на вируса на хепатит С се сравнява с реактивоспособността на продуциран от заразени с вирус на рекомбинантна ваксина клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С, както е описано от Depla et al., WO 99/67285. И двата изследвани състава на Е1 на вируса на хепатит С се състоят от вирусоподобни частици, в които Е1 протеините на вируса на хепатит С са алкилирани с N-етиленмалеимид и биотин-Nетиленмалеимид. Реактивоспособността и на двата състава от вирусоподобни частици на Е1 на вируса на хепатит 0 със серум на хронични носители на вируса на хепатит С се определя посредством ELISA. Резултатите са сумирани в Таблица 6. Както може да се види от Таблица 6, не се забелязва никаква разлика в реактивоспособността между Е1 на вируса на хепатит С, продуциран от заразени с вирус на рекомбинантна ваксина клетки на бозайник, и продуциран от Hansenuia polymorpha Е1-Н6 на вируса на хепатит С.

125

Таблица 6. Антигенността на Е1, продуциран в клетъчна култура от бозайник, или продуциран от Hansenula potymorpha , се оценява върху панел от серум на човешки хронични носители на вируса на хепатит С. За тази цел, биотинилиран Е1 се свързва към покрити със стрептавидин ELISA плочки. След това се прибавя човешки серум при разреждане 1/20 и свързаните имуноглобупини от серума, свързан с Е1, се откриват със заешки-античовешки IgG-Fc специфично вторично антитяло, маркирано с пероксидаза. Резултатите са представени като OD-стойности. Средните стойности представляват средни на OD-стойностите на всички тествани серумни проби.

Серум_____Hansenula Бозайник Серум_____Hansenula Бозайник

17766	1.218	1.159	55337	1.591	1.416
17767	1.513	1.363	55348	1.392	1.261
17777	0.806	0.626	55340	1.202	0.959
17784	1.592	1.527	55342	1.599	1.477
17785	1.508	1.439	55345	1.266	1.428
17794	1.724	1.597	55349	1.329	1.137
17798	1.132	0.989	55350	1.486	1.422
17801	1.636	1.504	55352	0.722	1.329
17805	1.053	0.944	55353	1.065	1.157
17810	1.134	0.999	55354	1.118	1.092
17819	1.404	1.240	55355	0.754	0.677
17820	1.308	1.400	55362	1.430	1.349
17826	1.163	1.009	55365	1.612	1.608
17827	1.668	1.652	55368	0.972	0.959
17849	1.595	1.317	55369	1.506	1.377
55333	1.217	1.168	Средно	1.313	1.245

126

ПРИМЕР 22

Имуногенна еквивалентност на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С и продуциран от заразени с ваксина клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С

Имуногенността на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С се сравнява с имуногенността на продуциран от заразени с вирус на рекомбинантна ваксина клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С, както е описано от Depla et al., WO 99/67285. И двата изследвани състава на Е1 на вируса на хепатит С се състоят от вирусоподобни частици, в които Е1 протеините на вируса на хепатит С са алкилирани с йодацетамид. И двата състава от вирусоподобни частици се получават с alum и се инжектират върху Balb/c мишки (три интрамускулни/подкожни инжекции през интервал от три седмици между всяка и всяка, състояща се от 5 цд Е1 в 125 μΙ, съдържащи 0.13% Alhydrogel, Superfos, Denmark). Мишките умират от кръвоизлив десет дни след третата инжекция.

Резултатите от този експеримент са показани на фигура 51. За горната част на Фигура 51, се определят повишените антитела след имунизацията с вирусоподобни частици на Е1, продуциран от клетки на бозайник. Титрите на антителата се определят посредством ELISA (виж Пример 21), където или Е1, продуциран в клетки на бозайник (“М”), или Е1, продуциран от Hansenula (“Н”) директно се нанасят върху ELISA твърд супорт, след което ELISA плочките се блокират с казеин. За долната част на Фигура 51, се определят повишените антитела след имунизацията с вирусоподобни частици на Е1, продуциран от Hansenula. Титрите на антителата се определят посредством ELISA (виж Пример 21), кьдето или Е1, продуциран в клетки на бозайник (“М”), или Е1, продуциран от Hansenula (“Н”) директно се нанасят върху ELISA твърд супорт, след което ELISA плочките се блокират с казеин.

127

Определените титри на антителата са крайните точки на титрите. Крайната точка на титъра се определя като разреждане на серума, при което се получава OD (определен посредством ELISA) равно на два пъти средното за анализа.

Фигура 51 показва, че не се наблюдават значителни разлики между имуногенните свойства и на двата състава на Е1 и, че определените титри на антитела5та не зависят от използвания антиген в ELISA за осъществяване на титруването.

Полученият от квасни гъбички Е1 на вируса на хепатит С индуцира защитна реакция при ваксиниране, подобна на защитната реакция, получена при ваксиниране с алкилиран Е1 на вируса на хепатит С, получен от клетъчна култура от бозайник. Последната реакция е способна да предотврати хроничното развитие на вируса на хепатит С след остра инфекция.

ПРИМЕР 23

Антигенен и имуногенен профил на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С, който е сулфониран

Реактивоспособността на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С със серум на хронични носители на вируса на хепатит С се сравнява с реактивоспособността на продуциран от заразени с вирус на рекомбинантна ваксина клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С, както е описано от Depla et al., WO 99/67285. И двата изследвани състава на Е1 на вируса на хепатит С се състоят от вирусоподобни частици, в които продуцираните от Hansenula Е1 протеини на вируса на хепатит С са сулфонирани, а продуциранияг от клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С е алкилиран. Резултатите са представени в Таблица 7. Въпреки че общата (средна) реактивоспособност е идентична, за отделните серуми се забелязват някои основни разлики. Това означава, че сулфонираният материал присъства в

128 поне някои от неговите епитопи по начин, различен от алкилирания Е1 на вируса на хепатит С.

Имуногенността на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С, който е сулфониран, се сравнява с имуногенността на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С, който е алкилиран. И двата изследвани състава на Е1 на вируса на хепатит С се състоят от вирусоподобни частици. И двата състава от вирусоподобни частици се получават с alum и се инжектират върху Balb/c мишки (три интрамускулни/подкожни инжекции през интервал от три седмици между всяка и всяка, състояща се от 5 pg Е1 в 125 μΙ, съдържащи 0.13% Alhydrogel, Superfos, Denmark). Мишките умират от кръвоизлив десет дни след третата инжекция.

Титрите на антителата се определят по начина, описан в Пример 22. Изненадващо, имунизирането със сулфониран материал води до по-високи титри на антителата, независимо от използвания в ELISA антиген за оценка на тези титри (Фигура 51; горна част: титруване на повишени антитела спрямо алкилиран Е1; долна част: титруване на повишени антитела спрямо сулфониран Е1; “А”: алкилиран Е1, нанесен върху ELISA плочка; “S”: сулфониран Е1, нанесен върху ELISA плочка). При този експеримент, обаче, индивидуалните титри са различни, в зависимост от използвания за анализа антиген, което потвърждава наблюдението, забелязано със серум от пациенти с вируса на хепатит С. Следователно, Е1 на вируса на хепатит С, където цистеин-тиоловите групи са модифицирани по обратим начин, може да бъде по-имуногенен и, следователно, да притежава по-голяма сила като ваксина, защитаваща от вируса на хепатит С (хронична инфекция). В допълнение на гореказаното, предизвикване на реакция към нео-епитопи, индуцирана при необратимо блокиране, е по-малко вероятно да се случи.

129

Таблица 7. Антигенноспа на алкилиран Е1 (продуциран в клетъчна култура от бозайник) или на сулфониран Е1-Н6 (продуциран от Hansenula polymorpha) се оценява върху панел от серум на човешки хронични носители на вируса на хепатит С (“серум от пациент”) и панел от контролен серум (“серум от кръвен донор”). За тази цел, Е1 се свързва към ELISA плочки, след което плочките се насищат с казеин. След това се прибавя човешки серум при разреждане 1/20 и свързаните имуноглобулини се откриват със заешки-анти-човешки IgG-Fc специфично вторично антитяло, маркирано с пероксидаза. Резултатите са представени като OD-стойности. Средните стойности представляват средни на OD-стойностите на всички тествани серумни проби.

CeovM от пациент	Cbdvm от кръвен донос
Сер. №	Hansenula	Бозайник	Сер.№	Hansenula	Бозайник
17766	0.646	0.333	F500	0.055	0.054
17777	0.460	0.447	F504	0.05	0.05
17785	0.740	0.417	F508	0.05	0.054
17794	1.446	1.487	F510	0.05	0.058
17801	0.710	0.902	F511	0.05	0.051
17819	0.312	0.539	F512	0.051	0.057
17827	1.596	1.576	F513	0.051	0.052
17849	0.586	0.964	F527	0.057	0.054
55333	0.690	0.534	Средно	0.052	0.054
55338	0.461	0.233
55340	0.106	0.084
55345	1.474	1.258
55355	0.453	0.444
55362	0.362	0.717
55369	0.240	0.452
Средно	0.706	0.691

130

ПРИМЕР 94

Идентична антигенна реактивоспособност на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С и продуциран от заразени с ваксина клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С към серум от ваксинирани шимпанзета

Реактивоспособностга на продуциран от Hansenula Е1-Н6 на вируса на хепатит С към серум на хронични носители на вируса на хепатит С се сравнява с реактивоспособностга на продуциран от заразени с вирус на рекомбинантна ваксина клетки на бозайник Е1 на вируса на хепатит С (и двата алкилирани) към серум от ваксинирани шимпанзета и с моноклонални антитела. При това, © споменатите Е1 протеини директно са нанесени върху ELISA плочки, последвано от насищане на плочките с казеин. Крайните точки на титруване на антителата, свързани с Е1 протеините, нанесени върху ELISA плочките, се определят за серум на шимпанзе и за специфични миши моноклонални антитела, всички, получени от животни, имунизирани с Е1, продуциран от клетки на бозайник. Определянето на крайния титьр се извършва, както е описано в Пример 22. Използваните миши моноклонални антитела са IGH201 (виж Пример 15), IGH198 (IGH198 = 23С12 в Maertens et al., WO96/04385), IGH203 (IGH203 = 15G6 в Maertens et al., WO96/04385) и IGH202 (IGH202 = 3F3 в © Maertens et al., W099/50301).

Както може да се види от фигура 53, реактивността на седем различни шимпанзета е една и съща, когато са тествани с Е1 протеин, продуциран и от Hansenula, и от клетки на бозайник. Реактивоспособностите на моноклоналните антитела спрямо Е1 на вируса на хепатите С също са почти равни. Две от шимпанзетата (Yoran и Marti) са въведени в изследване с профилактична ваксина и са способни да изчистят остра инфекция, докато контролно животно не може да изчисти остра инфекция. Петте други шимпанзета (Ton, Phil, Marcel, Peggy, Femma) са въведени в изследване с терапевтична ваксина и показват понижение в разрушаването на черния дроб,

131 както е измерено посредством ALT в серум и/или индекс на хистологична активност при биопсия на черния дроб, при имунизиране с Е1 на вируса на хепатит С.

Резултатите, получени при този експеримент, ясно се различават от тези, получени от Mustilli и сътрудници (Mustilli, AC. et al., 1999), които които отделят Е2 протеин на вируса на хепатит С както от Saccharomyces cerevisiae, така и от Kluyveromyces lactis. Пречистеният Е2, продуциран от квасните гъбички, обаче, се различава от Е2 протеина на вируса на хепатит С, продуциран от клетки на бозайници (СНО), по това, че се наблюзава по-ниска реактивоспособност към серум от шимпанзета, имунизирани с Е2 на вируса на хепатит С, продуциран от клетки на бозайници, докато реактивоспособността към моноклонални антитела е по-висока за Е2 на вируса на хепатит С, продуциран от квасните гъбички.

ПРИМЕР 25

Гликопрофилиране на Е1 на вируса на хепатит С посредством въглехидратна електрофореза с помощта на флуорофор (FACE)

Профилите на гликосилиране са сравнени за продуциран от Hansenula Е1 на вируса на хепатит С и за Е1 на вируса на хепатит С, продуциран от клетки на бозайник, заразени с вируса на хепатит С на рекомбинантна ваксина, както е описано от Depla at al., WO 99/67285 Това се извършва посредством въглехидратна електрофореза с помощта на флуорофор (FACE). При това, от Е1 протеините, продуцирани от клетки на бозайник или Hansenula, се отделят олигозахариди посредством пептид^-гликозидаза (PNGase F), които се маркират с ANTS (Е1 протеините са алкилирани с йодацетамид преди усвояването с пептид-Нчликозидаза (PNGase F)). Маркираните с ANTS олигозахариди се разделят посредством PAGE върху 21% полиакриламиден гел в електрическо поле от 15 mA при 4°С в продължение на 2-3 часа. От

132

Фигура 54 се вижда, че олигозахаридите върху Е1, продуциран от клетки на бозайник,и Е1-Н6, продуциран от Hansenula, мигрират като олигомалтоза със степен на полимеризация между 7 и 11 монозахарида. Това показва, че експресионната система на Hansenula изненадващо води до получаване на Е1 протеин, който не е хипергликосилиран, и, който притежава захарни вериги с дължина, равна на дължината на захарните вериги, прибавени към Е1 протеините, продуцирани от клетки на бозайник.

ПРИМЕР 26

Получаване на последователност от N-свързани олигозахариди, получени от Е1 протеини, продуцирани от Saccharomyces и Hansenula, и от Е1 протеини, продуцирани отклетки на бозайник, заразени с вируса хепатит С от рекомбинантна ваксина

Е1 протеини (225 цд), пречистен от култури на Saccharomyces или Hansenula (виж Примери 15-16) или от култура на RK13 клетки, заразени с вируса хепатит С от рекомбинантна ваксина (виж Maertens et al., WO96/04385) и, присъстващи в PBS, 0.5% бетаин, се разреждат с дегликосилиращ инкубационен буфер (50 mM Na2HPO4, 0.75% Nonidet Р-40) до крайна концентрация от 140 ug/mL. pH на разтвора се установява pH 5.5 с концентрирана фосфорна киселина. Към този разтвор се прибавят 2 U PNGase F (пептид-М⁴-(ацетил-ЬеГа-глюкозаминил)-аспарагин амидаза ма Flavobacterium meningosepticum; EC 5.5.1.52; производство на Roche) и пробата се инкубира в продължение на една нощ при 37°С. След инкубирането в продължение на една нощ, pH на разтвора се установява pH 5.5 с концентрирана фосфорна киселина. Протеините и олигозахаридите се утаяват последователно посредством прибавяне на 4 обема ацетон (при ~20°С) и смесите се инкубират при -20°С в продължение на 15 минути. Пробите се центрофугират при 4°С с 13000 оборота в минута в продължение на 5 минути. Ацетоновият супернатант

133 се изхвърля и пелетата се инкубира при -20°С в продължение на 1 час след прибавяне на 150 μ!_ леденостуден 60% метанол. Метаноловият супернатант, съдържащ отделените олигозахариди се събира и се суши посредством ротационно изпарение (SpeedVac).

Сухите Е1 гликани, както и сравнителните олигозахариди (всички доставени от Glyko, Bicester, UK; виж фигура 55) Man-9 (11 монозахаридни звена), Мап-8 (10 монозахаридни звена), Мап-7 (9 монозахаридни звена), Мап6 (8 монозахаридни звена) и Мап-5 (7 монозахаридни звена), се разтварят в 5 μ!_ 2-аминобензамид (2-АВ) маркиращ реактив (+0.35 Μ 2-АВ + +1 М NaCNBH₃в 30% оцетна киселина/70% диметилсулфоксид) до получаване на крайна концентрация на гликан между 5 и 100 цМ. След това разтворът на гликан се инкубира в продължение на 2 часа при 65°С. След 30 минути пробата се хомогенизираа чрез завихряне. След взаимодействието, излишъкът от 2-АВ се отделя по следния начин. Пробата се разрежда с 16 μΙ_ пречистена вода (MilliQ) и се поставя в колона върху Sephadex G-10 (диаметър 1 cm, височина 1.2 cm, Amersham Biosciences; свързана с VacElut система, Varian) след изсушаване на колоната.

Маркираните олигозахариди се елуират чрез прибавяне на 2 х 100 μί пречистена вода (MilliQ) в колоната. Елуатите на сравнителните въглехидрати (Мап-9, Мап-8, Мап-7 и Мап-6) се сушат и съхраняват при -70°С до провеждането на високоефективна течна хроматография. Елуатите на Е1 пробите, както и Мап-9 сравнителният гликан, се разпределят върху 4 номерирани епруветки за PCR и се сушат. Провеждат се реакциите, посочени в Таблица 8, като всички реакции се оставят да протичат една нощ при 37°С, с изключение на реакцията в епруветка 3, която завършва за един час. Крайната концентрация на използваните екзогликозидазни ензими (всички доставени от Glyko, Bicester, UK) е: за а 1-2 манозидаза (Aspergillus saitoi): 2 mU/mL; за αманозидаза (Jack Bean): 50 U/mL; β-манозидаза (Helix pomatia): 4 U/mL.

134

Таблица 8. Преглед на реакционните смеси за получаване на последователности на олигозахаридите

	Епр.1	Епр.2	Епр.З	Епр.4	Епр.5
E1s (pmol)	400	400	400	400	400
а-1-2-манозидаза (gL)	-	4	-	-	-
α-манозидаза (gL)	-	-	5	5	5
β-манозидаза (gL)	-	-	-	-	4
инкубационен буфер 4х	5	5	5	5	5
MilliQ вода (gL)	15	11	10	10	6

Фигура 56 показва по-висша олигоманоза, състояща се от 10 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. Всеки краен манозен остатък е свързан посредством а 1-3 връзка към не-краен манозен остатък. Олигоманозата от Фигура 56 е напълно резистентна към разцепване посредством екзогликозидаза а 1-2 манозидаза. Дълготрайното инкубиране (една нощ) на олигоманозата от Фигура 56 с екзогликозидаза α-манозидаза води до разцепване на всички α,-връзки (ос 1-2, ос 1-3, ос 1-6), но не на β-връзките. Следователно, полученият олигозахарид ще бъде 4’-р-манозилхитобиоза. Тази 4’-р-манозилхитобиоза може да бъде превърната в маноза и хитобиоза при въздействие с екзогликозидаза β-манозидаза. Съгласно спесификацията на доставчика (Glyko), а манозидазата превръща напълно сравнителния олигозахарид Мап-6 (виж Фигура 55.D) в 4Чз-манозилхитобиоза и следващото му превръщане в маноза и хитобиоза посредством β-манозидаза, също се счита за пълно.

Фигура 57 показва по-висша олигоманоза, състояща се от 9 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В тази олигоманоза, един краен манозен остатък е свързан посредством а 1-2 връзка към не-краен манозен остатък. При въздействие с екзогликозидаза ос 1-2 манозидаза, споменатата ех 1-2135 свързана маноза ще се отдели. При следващо действие на α-манозидаза и βманозидаза, ще се получат реакционните продукти, описани за олигоманозата от Фигура 56. Съгласно спесификацията на доставчика (Glyko), α-1-2 манозидазата е способна да превръща сравнителните олигозахариди Мап-9 и Мап-6 в Мап-5 (виж Фигура 55) с ефективност от >90%.

Фигура 58 показва сравнителната по-висша олигоманоза Мап-9, състояща се от 9 манозни остатъка, куплирани до хитобиоза. В тази олигоманоза, всички крайни манозни остатъци са свързани посредством α 1-2 връзка към не-краен манозен остатък. При въздействие с екзогликозидаза α 12 манозидаза, Мап-9 ще се превърне в Мап-5, съгласно спесификацията на доставчика с ефективност от >90% При следващо усвояване с ос-манозидаза, Мап-5 ще се превърне в 4’-р-манозилхитобиоза.

Съдържанието на различните реакционни епруветки, показани в Таблица 8, се изсушава в центрофужен вакуумен изпарител или в лиофилизатор и се съхранява при -70°С до провеждането на високоефективна течна хроматография. Преди навлизане в колоната, всяка проба (Е 1s и сравнителна) се разтваря в 25 μΐ вода и се зарежда върху TSK gel-amide-80 (0.46 х 25 cm, Tosoh Biosep) колона, куплирана към Waters Alliance HPLC station.

Разделянето на олигозахаридите се провежда при стайна температура при 1.0 mL/min. Разтворител А се състои от 0.1% оцетна киселина в ацетонитрил, а разтворител В се състои от 0.2% оцетна киселина/0.2% триетиламин във вода. Разделянето на 2-АВ маркираните олигозахариди се провежда при използване на 28% В изократен на 5 колонни обема, последвано от линейно повишаване до 45% В над 15 колонни обема.

Сравнителният олигозахарид Мап-6 се елуира за 53+1 минути, Мап-7 се елуира за 59±1 минути, Мап-8 се елуира за 67+2 минути и Мап-9 се елуира за 70±1 минути, 4’-р-манозилхитобиозата се елуира за 10+1 минути, а хитобиозата се елуира за 6+1 минути (не е показано). Това е показано за реакционните продукти на Мап-9 след инкубиране в продължение на една нощ

136 без екзогликозидази (крива 1 на хроматограмата от Фигура 63; само Мап-9), след инкубиране в продължение на една нощ с а 1-2 манозидаза (крива 2 на хроматограмата от Фигура 63; смес на Мап-5 и Мап-6), след инкубиране в продължение на, съответно, 1 час или една нощ с α-манозидаза (съответно, криви 3 и 4 на хроматограмата от Фигура 63; само 4’-р-манозилхитобиоза) и след инкубиране в продължение на една нощ с а- и β-манозидаза. Крива 6 на хроматограмата от Фигура 63 показва градиента на използвания разтворител.

Продуктите на реакцията на олигозахаридите на E1s, продуцирани от Saccharomyces (получени след PNGaseF третиране) без екзогликозидази, са главно четири въглехидрата, елуирани при 59+1 минути (15%), при 67±1 минути (45%), при 70+1 минути (25%), при 75+1 минути (15%). Общото съдържание на Man(8)-GlcNAc(2) и Man(9)-GlcNAc(2) в Е 1s, продуцирани от Saccharomyces е около 65%. В реакцията с а 1-2 манозидаза, изчезват само въглехидратите с време на задържане 70±1 минути. Интензитетът на въглехидрата с време на задържане 75+.1 минути остава същия, а интензитетът на въглехидрата с време на задържане 67±1 минути се повишава. Това означава, че не всички крайни манозни звена притежават ос(1-2) конфигурация. След инкубиране в продължение на една нощ с α-манозидаза, всички въглехидратни вериги се скъсяват до 4’-р-манозилхитобиозния остатък. Това означава, че въглехидратът е висша маноза и всички манозни остатъци, с изключение на един, имат а конфигурация. Редуцирането на този 4’-р-манозилхитобиозен остатък до хитобиоза е очевидно след инкубиране в продължение на една нощ с βманозидаза. Получените хроматограми са показани на Фигура 64, като са регистрирани при същите условия, както тези на хроматограмите от фигура 63. Резултатите са сумирани в Таблица 9.

Същите експерименти са повторени с Е1 протеини, продуцирани от заразени с ваксина клетки и изненадващо се наблюдава напълно различна картина. При реакцията без ензими, съществува сложна смес на въглехидрати (виж, фигура 65 и Таблица 9). Общото количество MOHO3axapnfl(8)-GlcNAc(2) и

137

MOHO3axapwfl(9)-GlcNAc(2) е 37%. След взаимодействие с ос 1-2 манозидаза, въглехидратите с времена на задържане 70±1 и 59+1 минути изчезват. След инкубиране в продължение на една нощ с α-манозидаза, остава значително количество монозахарид(6)-С1сМАс(2) в допълнение на 4’-рманозилхитобиозния продукт. Това е индикация, че един от олигозахаридните клони е резистентен към деградацията на oc-манозидазата. Това може да се обясни с наличието на 1- или 2-глюкозни остатъци, свързани с Мапа(1-2)-краен клон на N-свързания олигозахарид. На Фигура 62 е показана възможна структура на такъв глюкоза-съдържащ олигозахарид. Възможните реакционни продукти на олигозахаридите, съдържащи глюкоза, са дадени в Таблица 10. Тъй като не остава олигозахарид, еквивалентен на Мап-7 (т.е. олигозахарид, съставен от 9 монозахарида) след реакцията с а 1-2 манозидаза, тези глюкозни остатъци най-вероятно се свързват към В-клона на олигозахаридната структура, показана на Фигура 62. Това, обаче, може да не изключва възможността, и двата А- и В-клона на олигозахарида от Фигура 62, да са частично завършени с глюкоза.

Редуцирането на 4’-р-манозилхитобиозния остатък до хитобиоза е очевидно след инкубиране в продължение на една нощ с β-манозидаза. Получените хроматограми са показани на фигура 65, като са регистрирани при същите условия, както тези на хроматограмите от Фигури 63-64.

Получените резултати са сумирани в Таблица 9.

Същите експерименти са повторени с Е1 протеини, продуцирани от Hansenula и изненадващо се наблюдава напълно различна картина. При реакцията без ензими, съществуват основно два въглехидрата с времена на задържане 67+2 и 70+1 минути, съответстващи, респективно, на Мап-8 и Мап9. Общото количество монозахарид(8)-С1сМАс(2) и MOHO3axapHfl(9)-GlcNAc(2) в Е1 протеините, продуцирани от Hansenula, е около 90%. След взаимодействие с а 1-2 манозидаза, въглехидратите са редуцирани главно до Мап-5 с време на задържане 45+1 минути и Мап-6 с време на задържане 53+1 минути. След

138 инкубиране в продължение на една нощ с α-манозидаза, всички въглехидратни вериги са редуцирани до 4’-р-манозилхитобиозен остатък. Това означава, че въглехидратът е висша маноза и всички манозни остатъци, освен един, притежават α-конфигурация. Редуцирането на 4’-р-манозилхитобиозния остатък до хитобиоза е очевидно след инкубиране в продължение на една нощ с β-манозидаза. Получените хроматограми са показани на Фигура 66, като са регистрирани при същите условия, както тези на хроматограмите от Фигури 6365.

Таблица 9. Олигоманози, получени при усвояване на олигоманози, добити от Е1 протеини, продуцирани от Saccharomyces (“Sc”) и Hansenula (“Нр”), както и от Е1 протеини, продуцирани от заразени с рекомбинантна ваксина на вируса на хепатит С клетки на бозайник (“Vac”). Показани са различни олигоманози с техните хроматографски времена на задържане (“Rt”, в минути) и процентът на дадена олигоманоза, по отношение на общото съдържание на олигоманози (горните редове), както и най-вероятната структура за всяка наблюдавана олигоманоза, показана на Фигури 55-62. Олигоманозите с крайни а 1-3 манози, са отбелязани с Олигоманозите с крайни глюкози, са отбелязани с всяко сравнение, отбелязано с “от 62*”, означава, че структурата може да бъде получена от структурата, показана на фигура 62. “1” е реакция без екзогликозидази, “2” е реакция с а 1-2 манозидаза. Олигоманозата с време на задържане 45+1 минути е, по общо мнение, олигоманоза, състояща се от 5 манозни остатъка, свързани в хитобиоза. Олигоманозата с време на задържане 75+1 минути е, по общо мнение, олигоманоза, състояща се от 10 манозни остатъка, свързани в хитобиоза.

139

	Man-5	Man-6	Мап-7	Мап-8	Мап-9	Мап-10
	Rt:45+1	Rt:53+1	Rt:59+1	Rt:67+1	Rt:70+1	Rt:75+1
Sc1	/	1%	14%	42%	23%	18%
		55.D	55.С	59°	57°	56°
					61°
Sc2	17%	/	8%	50%	6%	16%
	55.E		60°	59°	57°	56°
					61°
Vac1	3%	32%	20%	23%	14%	5%
	55. Е	от 62*	55.С	от 62*	62*	62*
		АТабл.Ю		&Табл.1О	&Табл.1О	&Табл.1О
Vac2	74%	2%	/	20%	4%	/
	55. Е	от 62*		от 62*	62*	62*
		&Табл.1О		&Табл.Ю	&Табл.10	&Табл.10
Нр1	/	2%	7%	54%	36%	/
		55.D	55.С	55. В	58
Hp2	80%	20%	/	/	/	/
	55.Е	55. D

Таблица 10. Продукти на N-свързаните олигозахариди, съдържащи глюкоза, след взаимодействие с α 1-2 манозидаза или α 1-2 манозидаза и ссманозидаза

	Мап-еквивалент	продукт (1) на а 1-2 манозидаза	продукт (след (1)) на а-манозидаза
Клон А+2 Glc	Мап-10	Мап-8	Мап-6
Клон А+1 Glc	Мап-9	Мап-7	Мап-6
Клон А без Glc	Мап-8	Мап-5	4’-р-манозилхитобиоза
Клон В+2 Glc	Мап-10	Мап-9	Мап-6
Клон В+1 Glc	Мап-9	Мап-8	Мап-6
Клон В без Glc	Мап-8	Мап-5	4’-₽-манозилхитобиоза

140

ПРИМЕР 27

Заемане на местата за N-гликосилиране в рекомбинантен Е1 на вируса на хепатит С

В зависимост от количеството заети места за N-гликосилиране, Е1 показва различно миграционно поведение при SDS-PAGE анализ. На базата на това свойство, може да се определи средното количество заети места за Nгликосилиране в Е1 продукта. При това, проби от пречистен Е1 продукт се подлагат на SDS-PAGE анализ и Coomassie Brilliant Blue оцветяване (фигура 67), последвани от анализиране посредством ImageMaster 1D Prime Software пакет (Pharmacia). Накратко, гелът се сканира и процентът на присъствие (неговата интензивност по отношение на общата интензивност на различните ивици, при което общият процент за всички ивици е 100%) се изчислява за всяка специфична ивица протеин (Таблица 11). Трябва да се отбележи, че всяка специфична протеинова ивица отговаря на молекули от Е1 протеини с еднакъв брой заети места за N-гликосилиране.

Получените резултати показват, че основната част (>90%) от Е1 продуктите, продуцирани от Hansenula, имат едно или повече места за Nгликосилиране, по-малко заети, отколкото Е1 продуктите, получени от ваксина (както е описано от Maertens et al., WO96/04385). Предполагайки, че в Е1 продуктите, получени от ваксина, всички места за N-гликосилиране са заети (в които последователността “NNSS” (SEQ ID N0:73) в позиция 233-236 на Е1, се счита за едно място за гликосилиране), спокойно може да се направи изводът, че средният брой заети места за N-гликосилиране в Е1 протеина, продуциран от Hansenula, не надвишава 80% от всички налични места за N-гликосилиране.

141

Таблица 11. Определяне на средния брой места за N-гликосилиране в Е1 протеини, продуцирани от Hansonula polymorpha, ваксина/vero експресионни системи, посредством SDS-PAGE анализ и Coomassie Brilliant Blue оцветяване. Протеиновите ивици са показани като техни молекулни тегла. Виж Фигура 67.

Алкилирани Е1 протеини Hansenula polymorpha	% на появяване (относителна интензивност)
Експеримент 1	Експеримент 2
MW 29	9	8
MW 25	25	27
MW 21	38	42
MW 18	27	22
MW 14-15	не е определен	не е определен
Ваксина/vero
MW 29	100	100

ПРИМЕР 28

Заемане на местата за N-гликосилиране в рекомбинантен Е2 на вируса на хепатит С

Двеста микрограма (200 дд) Е2-Н6 протеин, продуциран от Hansenula, се дегликосилират с PNGaseF. Дегликосилираните Е2-Н6 се зареждат върху минигел (10 дд/линия). Протеиновите ивици се проявяват с трипсин и ендо Asp-N. Масите на получените пептиди се определят посредством Maldi-MS (метод, включващ сухи капки и тънък слой).

Методът може да се използва за определяне на степента на Nгликосилиране: през време на дегликосилирането с ензима PNGaseF, сложната захарна верига се разцепва и, в същото време, аспарагинът (N) се хидролизира до аспартинова киселина (D). Разликата в масите на тези две

142 аминокиселини е 1 Da, която може да се определи посредством масспектрометрия. Още повече, хидролизата на N до D създава нови места за разцепване за Asp-N ензима.

Възможни места за гликосилиране в Е2 са N417- N423, N430. N443, N473, N532, N540, N556, N576, Νβ23 и Νθ45 (виж Фигура 68). Maldi-MS анализът показва за всяко от тези места за гликосилиране, че N-гликосилирането се е пълно, тъй като след дехидролизиране с PNGaseF, са установени пептиди, или с N или с D на мястото на гликосилирането (разликата в масите е 1 Da). Съотношението на броя D-остатъци към броя N-остатьци, дава индикация за средната заетост (всички Е2 протеини са продуцирани от Hansenula и присъстват в анализираната проба) на единично място за N-гликосилиране посредством захарна верига. Тези резултати са представени в Таблици от 12 до 14.

От тези резултати е изчислено, че средно всяко място за гликосилиране е гликосилирано приблизително 54%.

Таблица 12. Процентно гликосилиране, определено от триптични пептиди, съдържащи едно място за N-гликосилиране.

Място за N-гликосилиране	Гликосилирани	Не-гликосилирани
N430	60%	40%
N448	50%	50%
N556	80%	20%
N576	90%	10%
N623	20%	80%
N645	10%	90%

143

Таблица 13. Процентно гликосилиране, определено от триптични пептиди, съдържащи две места за N-гликосилиране.

Места за	И двете ме-	1 от двете ме-	Не са глико-	Изчислено за
N-глико-	ста са гли-	ста са глико-	силирани	отделно N

силиране косилирани силирани

N417 и N423	70%	25%	5%	85%
N532 И N540	0%	80%	20%	40%

Таблица 14. Процентно гликосилиране, определено за N478 в Asp-N.

Място за N-гликосилиране Гликосилирани Не-гликосилирани

N478 35% 65%

ПРИМЕР 29

Реактивност на серум от кръвен донор с Е1 на вируса на хепатит С, продуциран от Saccharomyces и Hansenula

Е1-Н6, продуциран от Saccharomyces (отделен с α-MF водещ пептид) и Е1-Н6, продуциран от Hansenula (отделен с CL водещ пептид) се пречистват, както е описано в Примери 15 и 16 и, накрая, се подлагат на алкилиране и формиране на вирусоподобни частици, както е описано в Пример 20. И двата протеина са директно адсорбирани върху микротитьрна плочка при 0.5 ag/mL (1 час, 37°С) и след блокиране на серума в плочката (PBS-0.1% казеин, 1 час, 37°С) от изследвания вирус на хепатит С и отрицателните кръвни донори се инкубират при разреждане 1/20 (PBS-0.5% казеин, 10% (тегл./об.) сукроза, 0.2% (об./об.) Triton Х-705,1 час, 37°С). Свързването се открива при използване на вторичен заешки анти-човешки lgG-F_c специфичен антисерум, куплиран към

144 пероксидаза (Dako, Denmark) при разреждане 1/50000 (PBS-0.1% казеин, 1 час, стайна температура), последвано от оцветяване. Между всички етапи плочките се промиват три пъти с PBS-0.05% (тегл./об.) Tween-20. За сравнение, серумът също се анализира по същия начин върху Е1 протеини, продуцирани от клетки на бозайник, продуцирани и пречистени, както е описано от Depla et al., WO99/67285.

За прекъсване на ELISA анализа се взима 2 пъти средния фон (т.е. реактивността на целия серум в идентичен етап, но със стрептавидин, адсорбиран в гнездата).

От Таблица 15 може да се види, че голямо количество (75%) серум показва реактивност над тази за Е1, продуциран от Saccharomyces, докато малко количество (6%) серум показва реактивност над тази за Е1, продуциран от Hansenula. Тази разлика в реактивностите се дължи на наличието на крайни ос 1-3 манози, свързани към ос 1-2 манози, върху Е1, продуциран от Saccharomyces, както е показано в Пример 26. Young и сътрудници (1998) вече са показали, че този тип манози са също отговорни за реактивността на човешки серум с mannan, получен от Saccharomyces. За да се потвърди, че реактивността на Е1, продуциран от Saccharomyces, може да се дължи на този тип манозни остатъци, ELISA анализът на Е1, продуциран от Saccharomyces, се повтаря при разреждане на серум от кръвен донор, предварително инкубиран (1 час, 37°С) с 1 или 5 mg/mL mannan (Sigma), прибавени към разреждащия буфер. Както може да се види от Таблица 16, предварителното инкубиране с mannan, понижава реактивността на този Е1 със серум от кръвен донор по начин, зависещ от концентрацията, до базови нива за целия анализиран серум, без F556 (средното OD се понижава от 0.24, без конкуренция с mannan до 0.06, при използване на 5 mg mannan/mL).

145

Таблица 15. Реактивност на Е1, продуциран от Hansenula, Saccharomyces и клетки на бозайник. Реактивностите над стойността на прекъсване, са подчертани.

Серум Ns	Hansenula Е1	Saccharomyces Е1	Клетки на бозайник Е1	Празна проба
F552	0.18	0.224	0.056	0.05
F553	0.062	0.449	0.056	0.052
F555	0.06	0.079	0.054	0.051
F556	0.073	0.679	0.054	0.051
F557	0.059	0.173	0.053	0.05
F558	0.066	0.232	0.06	0.058
F559	0.084	0.309	0.056	0.053
F560	0.062	0.338	0.052	0.052
F562	0.056	0.128	0.053	0.053
F563	0.064	0.181	0.059	0.056
F570	0.056	0.135	0.054	0.055
F571	0.06	0.209	0.054	0.055
F572	0.061	0.427	0.055	0.056
F575	0.079	0.104	0.062	0.056
F576	0.061	0.144	0.058	0.057
F577	0.063	0.224	0.055	0.058
F578	0.089	0.131	0.057	0.061
F581	0.064	0.098	0.061	0.057
F594	0.055	0.116	0.056	0.057
F595	0.059	0.539	0.057	0.058
F598	0.076	0.311	0.056	0.059
F450	0.205	0.078	0.099	0.059
F453	0.059	0.128	0.057	0.06

146

F456	0.058	0.121	0.056	0.06
F458	0.055	0.088	0.054	0.054
F459	0.054	0.069	0.056	0.054
F463	0.055	0.083	0.054	0.056
F466	0.086	0.208	0.071	0.094
F467	0.066	0.344	0.055	0.055
F469	0.059	0.074	0.057	0.057
F470	0.074	0.222	0.056	0.056
F473	0.094	0.807	0.054	0.057
F479	0.06	0.075	0.06	0.051
F480	0.053	0.305	0.056	0.053
F481	0.059	0.395	0.071	0.052
F488	0.063	0.467	0.059	0.053
Средно	0.072	0.242	0.058	Прекъсване 0.113
# серум над ст.на прекьсв.	2/36	27/36	0/36
% серум над ст.на прекьсв.	6	75

Таблица 16. Реактивност на Е1, продуциран от Saccharomyces клетки, както в

Таблица 15, но в присъствие на 5 mg mannan/mL. Реакгивностите над стойността на прекъсване, са подчертани.

Серум Ns		Концентрация на mannan
	0 mg/mL	1 mg/mL	5 mg/mL
F552	0.207	0.128	0.103
F553	0.487	0.098	0.050

. ......A............_: . — _:.........——

147

F555	0.066	0.044	0.041
F556	0.769	0.540	0.372
F557	0.158	0.094	0.088
F558	0.250	0.076	0.046
F559	0.300	0.077	0.066
F560	0.356	0.088	0.044
F562	0.122	0.106	0.089
F563	0.164	0.091	0.049
F570	0.110	0.043	0.040
F571	0.212	0.057	0.042
F572	0.464	0.087	0.043
F575	0.095	0.081	0.062
F576	0.138	0.042	0.043
F577	0.216	0.042	0.041
F578	0.125	0.100	0.093
F581	0.083	0.064	0.042
F594	0.102	0.044	0.041
F595	0.520	0.088	0.044
F598	0.340	0.054	0.042
F450	0.053	0.060	0.053
F453	0.116	0.049	0.044
F456	0.112	0.050	0.043
F458	0.086	0.051	0.042
F459	0.054	0.044	0.042
F463	0.078	0.043	0.041
F466	0.172	0.111	0.085
F467	0.420	0.117	0.049
F469	0.053	0.043	0.041

148

F470	0.220	0.070	0.061
F473	0.924	0.183	0.063
F479	0.059	0.049	0.043
F480	0.281	0.155	0.054
F481	0.355	0.042	0.046
F488	0.474	0.090	0.046
Средно	0.243	0.089	0.062

Литература

Agaphonov, М.0., Beburov, Μ.Υ., Ter Avanesyan, M.D. and Smirnov, V.N. (1995) A disruption-replacement approach tor the targeted integrated of foreign genes in Hansenuia polymorpha. Yeast 11: 1241-1247.

Agaphonov, M.O., Trushkina, P.M., Sohn, J.H., Choi, E.S., Rhee, S.K. and Ter Avanesyan, M.D. (1999) Vector for rapid selection of integrants with different plasmid copy numbers in the yeast Hansenuia polymorpha DL1. Yeast 15: 541-551.

Alber, T. and Kawasaki, G. (1982) Nucleotid sequence of the triose phosphate isomerase gene of Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Appt Genet. 1: • 419-434.

Ammerer, G. (1983) Expression of genes in yeast using the ADCI promoter. Methods Enzymol. 101: 192-201.

Ballou, L„ Hitzeman, R.A., Lewis, M.S. and Ballou, C.E. (1991) Vanadateresistant yeast mutants are defective in protein glycosylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3209-3212.

Beekman, N.J., Schaaper, W.M., Tesser, G.I., Dalsgaard, K., Kamstrup, S., Langeveld, J.P., Boshuizen, R.S. and Meloen, R.H. (1997) Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity. J. Pept. Res. 50: 357-364.

149

Burns, J., Butler, J. and Whitesides, G. (1991) Selective reduction of disulfides by Tris(2-carboxyethyl)posphine, J. Org. Chem. 56: 2648-2650.

Cox, H., Mead, D., Sudbery, P., Eland, R.M., Mannazzu, I. And Evans, L. (2000) Constitutive expression of recombinant proteins in the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha using the PMA1 promoter. Yeast 16:1191-1203.

Cregg, J.M. (1999) Expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. In Gene expression systems: using nature for the art of expression, J.M. Fernandez and J.P. Hoeffler, eds (San Diego: Academic Press), pp. 157-191.

Diarbre, A. (1986) Practical protein chemistry: a handbook. Whiley & Sons Ltd.

Diminsky, D., Schirmbeck, R., Reimann, J. and Barenholz, Y. (1997) Comparison between hepatitis B surface antigen (HbsAg) particles derived from mammalian cells (CHO) and yeast cells (Hansenula polymorpha): composition, stricture and immunogenicity. Vaccine 15: 637-647.

Doms, R.W., Lamb, R.A., Rose, J.K. and Helenius, A. (1993) Folding and assembly of viral membrane proteins. Virology 193: 545-562.

Elble, R. (1992) A simple and efficient procedure for transformation of yeasts. Biotechniques 13: 18-20.

Fellinger, A.J., Verbakel, J.M., Veale, R.A., Sudbery, P.E., Bom, I.J., Overbeeke, N. and Verrips, C.T. (1991) Expression of alpha-galactosidase from Cyamopsis tetragonoloba (guar) by Hansenula polymorpha. Yeast 7: 463-473.

Fournillier, J.A., Cahour, A., Escriou, N., Girad, M. and Wychowski, C. (1996) Processing of the E1 glycoprotein of hepatitis C virus expressed in mammalian cells. J. Gen. Virol. 77 (Pt 5): 1055 1064.

Gailit, J. (1993) Restoring free sulfhydryl groups in synthetic peptides. Anal. Biochem. 214: 334-335.

Garson, J.A., Lubach, D., Passas, J., Whitby, K. and Grant, P.R. (1999) Suramin blocks hepatitis C binding to human hepatoma cells in vitro. J. Med. Virol. 57: 238-242.

150

Gatzke, R., Weydemann, U„ Janowicz, Z.A. and Hollenberg, C.P. (1995) Stable multicopy integration of vector sequences in Hansenula polymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43: 844-849.

Gellissen, G. (2000) Heterologous protein production in methylotrophic yeasts. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54: 741-750.

Grakoui, A, Wychowski, C., Lin, C., Feinstone, S.M. and Rice, C.M. (1993) Expression and identification of hepatitis C virus polyprotein cleavage products. J. Virol. 67: 1385-1395.

Grinna, L.S. and Tschopp, J.F. (1989) Size distribution and general structural features of N-linked oligosaccharides from the methylotrophic yeast, Pichia pastoris. Yeast 5: 107-115.

Heile, J.M., Fong, Y.L, Rosa, D., Berger, K., Saletti, G., Campagnoli, S., Bensi, G., Capo, S., Coates, S., Crawford, K., Dong, C., Wininger, M., Baker, G., Cousens, L, Chien, D., Ng, P., Archangel, P., Grandi, G., Houghton, M. and Abrignani, S. (2000) Evaluation of kepatitis C virus glycoprotein E2 for vaccine design: an endoplasmic reticulum-retained recombinant protein is superior to secreted recombinant protein and DNA-based vaccine candidates. J. Virol. 74: 68856892.

Helenius, A (1994) How N-linked oligosaccharides affect glycoprotein folding in the endoplasmic reticulum. Mol. Biol. Cell 5; 253-265.

Hermanson, G.T. (1996) Bioconjugate techniques. San Diego: Academic Press.

Hercovics, A and Orlean, P. (1993) Glycoprotein biosynthesis in yeast. FASEB J. 7: 540-550.

Hijikata, M., Kato, N„ Ootsuyama, Y., Nakagawa, M. and Shimotohno, K. (1991) Gene mapping of the putative structural region of the hepatitis C virus genome by in vitro processing analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5547-5551.

Hitzeman, R.A., Clarke, L. and Carbon, J. (1980) Isolation and characterization of the yeast 3-phosphoglycerokinase gene (PGK) by an immunological screening technique. J. Biol. Chem. 255:12073-12080.

151

Hollenberg, C.P. and Gellissen, G (1997) Production of recombinant proteins by methylotrophic yeasts. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 554-560.

Holmgren, A (1979) Thioredoxin catalyzes the reduction of insulin disulfides by dithiothreitol and dihydrolipoamide. J. Biol. Chem. 254: 9627-9632.

Janowicz, Z.A, Melber, K, Merckelbach, A, Jacobs, E., Harford, N., Comberbach, M. and Hollenberg, C.P. (1991) Simultaneous expression of the S and L surface antigens of hepatitis B, and formation of mixed particles in the methylotrophic yeast, Hansenula polymorpha. Yeast 7: 431-443.

Jayabaskaran, C., Davison, P.F. and Paulus, H. (1987) Facile preparation and some applications of an affinity matrix with a cleavable connector arm containing a disulfide bond. Prep. Biovhem. 17: 121-141.

Jenkins, N., Parekh, R.B. and James, D.C. (1996) Getting the glycosylation right: implications for the biotechnology industry. Nat. Biotechnol. 14: 975-981.

Julius, D., Brake, A, Blair, L., Kunisawa, R. and Thorner, J. (1984) Isolation of the putative structural gene for the lysine-arginine-cleaving endopeptidase required for processing of yeast prepro-alpha-factor. Cell 37: 1075-1089.

Kalsf, E., Walfish, P.G. and Gitler, C. (1993) Arsenical-based affinity chromatography of vicinal dithiol-containing proteins: purification of L1210 leukemia cytoplasmic proteins and the recombinant rat c-erb A beta 1 T3 receptor. Anal. Biochem. 212: 325-334.

Kalidas, C., Joshi, L. and Batt, C. (2001) Characterization of glycosylated variants of beta-lactoglobulin expressed in Pichia pastoris. Protein Eng. 14: 201 207.

Kato, N.. Ootsuyama, Y„ Tanaka, T., Nakagawa, M., Nakazawa, T., Muraiso, K., Ohkoshi, S., Hijikata, M. and Shimotohno, K. (1992) Marked sequence diversity in the putative envelope proteins of the hepatitis C viruses. Virus Res. 22: 107-123.

Kawasaki, G and Fraenkel, D.G. (1982) Cloning of yeast glycolysis genes by complementation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 108:1107-1122.

152

Klebe, R.J., Harriss, J.V., Sharp, Z.D. and Douglas, M.G. (1983) A general method for polyethylene-glycol-induced genetic transformation of bacteria and yeast. Gene 25: 333-341.

Kumar, N., Kella, D. and Kinsella, J.E. (1985) A method for the controlled cleavage of disulfide bonds in proteins in the absence of denaturants. J. Biochem. Biophys. Methods 11: 251-263.

Kumar, N., Kella, D. and Kinsella, J.E. (1986) Anomalous effects of denaturants on sulfitolysis of protein disulfide bonds. Int. J. Peptide Prot. Res. 28: 586-592.

Maertens, G. and Stuyver, L. (1997) Genotypes and genetic variation of hepatitis C virus. In The molecular medicine of viral hepatitis, T.J. Harrison and A.J. Zuckerman, eds John Wiley & Sons, pp. 183-233.

Major, M.E. and Feinstone, S.M. (1997) The molecular virology of hepatitis C. Hepatology 25: 1527-1538.

Miele, R.G., Nilsen, S.L., Brito, T., Bretthauer, R.K. and Castellino, F.J. (1997) Glycosylation properties of the Pichia pastoris-expressed recombinant kringle 2 domain of tissue-type plasminogen activator. Biotechnol. Appl. Biochem. 25 (Pt 2): 151-157.

Meunier. J.C., Fournillier, A, Choukhi, A, Cahour, A., Cocquerel, L., Dubuisson, J. and Wychowski, C. (1999) Analysis of the glycosylation sites of hepatitis C virus (HCV) glycoprotein E1 and the influence of E1 glycans on the formation of the HCV glycoprotein complex. J. Gen Virol. 80 (Pt 4): 887-896.

Montesino, R., Garcia, R., Quintero, O. and Cremata, JA (1998) Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 14:197-207.

Mustilli, AC., Izzo, E., Houghton, M. and Galeotti, C.L. (1999) Comparison of secretion of a hepatitis C virus glycoprotein in Saccharomyces cerevisiae and Kluyveromyces lactis. Res. Microbiol. 150: 179-187.

153

Nagai, K. and Thogersen, H.C. (1984) Generation of beta-globin by sequencespecific proteolysis of a hybrid produced in Escherichia coli. Nature 309: 810-812.

Nielsen, P.E. (2001) Targeting double stranded DNA with peptide nucleic acid (PNA). Curr. Med. Chem. 8: 545-550.

Okabayashi, K., Nakagawa, Y., Hayasuke, N., Ohi, H., Miura, M., Ishida, Y., Shimizu, M., Murakami, K., Hirabayashi, K., Minamino, H. (1991) Secretory expression of the human serum albumin gene in the yeast, Saccharomyces cerevisiae. J. Biochem. (Tokyo) 110: 103-110.

Orum, H. and Wengel, J. (2001) Locked nucleic acids: a promising molecular family for gene-function analysis and antisense drug development. Curr. Opin. Mol.

• Ther. 3: 239-243.

Padgett, K.A and Sorge, J.A (1996) Creating seamless junctions independent of restriction sites in PCR cloning. Gene 168: 31-35.

Panchai, T. and Wodzinski, R.J. (1998) Comparison of giycosyiation patterns of phytase from Aspergillus niger (A ficuum) NRRL 3135 and recombinant phytase. Prep. Biochem. Biotechnol. 28: 201-217.

Pedersen J., Lauritzen, C., Madsen, M.T. and Weis, D.S. (1999) Removal of Nterminal polyhistidine tags from recombinant proteins using engineered aminopeptidases. Protein Expr. Purif. 15: 389-400.

• Pomroy, N.C. and Deber, C.M. (1998) Solubilization of hydrophobic peptides by reversible cysteine PEGylation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 245: 618-621.

Raymond, C.K. (1999) Recombinant protein expression in Pichia methanolica.

In Gene expression systems: using nature for the art of expression, J.M. Fernandez and J.P. Hoeffler, eds (San Diego: Academic Press), pp. 193-209.

Rein, A, Ott, D.E., Mirro, J., Arthur, L.O., Rice, W. and Henderson, LE. (1996) Inactivation of murine leukemia virus by compounds that react with the zinc finger in the viral nucleocapsid protein. J. Virol. 70: 4966-4972.

154

Roggenkamp. R., Hansen, H., Eckart, M., Janowicz, Z. and Hollenberg, C.P. (1986) Transformation of the methylotrphic yeast Hansenula polymorpha by autonomous replication and integration vectors. Mol. Gen. Genet. 202: 302-308.

Rosa, D., Campagnoli, S., Moretto, C., Guenzi, E., Cousens, L, Chin, M., Dong, C., Weiner, A.J., Lau, J.Y., Choo, G.L., Chien, D., Pileri, P„ Houghton, M. and Abrignani, S. (1996) A quantitative test to estimate neutralizing antibodies to the hepatitis C virus: cytofluorimetric assessment of envelope glycoprotein 2 binding to target cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 1759-1763.

Rose, J.K. and Dorns, R.W. (1988) Regulation of protein export from the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Cell. Biol. 4: 257-288.

Russell, D.W., Smith, M., Williamson, V.M. and Young, E.T. (1983) Nucleotide sequence of the yeast alcohol dehydrogenase II gene. J. Biol. Chem. 258: 2674-2682.

Russell, P.R. (1983) Evolutionary divergence of the mRNA transcription initiation mechanism in yeast. Nature 301: 167-169.

Russell, P.R. (1985) Transcription of the triose-phosphate-isomerase gene of Schizosaccharomyces pombe initiates from a start point different from that in S Saccharomyces cerevisiae. Gene 40:125 130.

Russell, P.R. and Hall, B.D. (1983) The primary structure of the alcohol dehydrogenase gene from the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. J. Biol. Chem. 258: 143-149.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Scorer, C.A., Clare, J.J., McCombie, W.R., Romanos, M.A and Sreekrishna, K. (1994) Rapid selection using G418 of high copy number transformations of Pichia pastorisfor high-level foreign gene expression. Biotechnology (N.Y.) 12:181-184.

Singh, R. and Kats, L. (1995) Catalysis of reduction of disulfide by selenol. Anal. Biochem. 232: 86-91.

155

Sohn, J.H., Choi, E.S., Kang, H.A., Rhee, J.S. and Rhee, S.K. (1999) A family of telomere-associated autonomously replicating sequences and their functions in targeted recombination in Hansenula polymorpha DL-1. J. Bacteriol. 181:1005-1013.

Stuyver, L., van Arnhem, W., Wyseur, A, Hernandez, F„ Delaporte, E. and Maertens, G. (1994) Classification of hepatitis C viruses based on phylogenetic analysis of the envelope 1 and nonstructurai 5B regions and identification of five additional subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10134-10138.

Surgue, R.J., Cui. T„ Xu, Q., Fu, J. and Chan, Y.C. (1997) The production of recombinant dengue virus E protein using Escherichia coli and Pichia pastoris. J. Virol. Methods 69:159-169.

Trimble, R.B., Atkinson, P.H., Tschopp, J.F., Townsend, R.R. and Maley, F. (1991) Structure of oligosaccharides on Saccharomyces SUC2 invertase secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris. J. Biol. Chem. 266: 22807-22817.

Vingerhoeds, M.H., Haisma, H.J., Belliot, S.O., Smit, R.H., Crommelin, D.J. and Storm, G. (1996) Immunoliposomes as enzyme-carriers (immunoenzymosomes) for antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT): optimization of prodrug activating capacity. Pharm. Res. 13: 604-610.

Wahlestedt, C., Salmi, P., Good, L., Kela, J., Johnsson, T., Hokfelt, T., Broberger, C„ Porreca, F., Lai, J., Ren, K., Ossipov, M., Koshkin, A., Jakobsen, N , Skouv, J., Oerum, H., Jakobsen, M.H. and Wengel, J. (2000) Potent and nontoxic antisense oligonucleotides containing locked nucleic acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5633-5638.

Weydemann, U., Keup, P., Piontek, M., Strasser, AW., Schweden, J., Gellissen, G. and Janowicz, Z.A. (1995) High-level secretion of hirudin by Hansenula polymorpha - authentic processing of three different preprohirudins. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 377-385.

Young, M„ Davies, M.J., Bailey, D., Gradwell, M.J., Smestad-Paulsen, B., Wold, J.K., Barnes, R.M.R. and Hounsell, E. (1998) Characterization of

156 oligosaccharides from an antigenic mannan of Saccharomyces cerevisiae. Glycoconjugate Journal 15: 815-822.

Zauberman, A.. Nussbaum, 0., Ilan, E., Eren, R., Ben-Moshe, 0., Arazi, Y., Berre, S., Lubin, I., Shouval, D., Galun, E„ Reisner, Y. and Dagan, S. (1999) The trimera mouse system: a mouse model for hepatitis C infection and evaluation of therapeutic agents. 6*^h International Symposium on hepatitis C and related viruses. Bethesda 6-9 June, 1999.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, характеризиращ се с това, че включва поне едно място за N-гликосилиране, като споменатият протеин, или негов фрагмент, се характеризира с това, че е продукт на отделяне в евкариотна клетка и с това, че средно до 80% от местата за N-гликосилиране, са гликосилирани в сърцевина.
2. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че повече от 70% от споменатите места за гликосилиране в сърцевина са гликосилирани с олигоманоза, съдържаща от 8 до 10 манози.
3. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции 1 или 2, характеризиращ се с това, че съотношението на местата, гликосилирани в сърцевина с олигоманоза със структура Man(7)-GlcNAc(2) към местата, гликосилирани в сърцевина с олигоманозата със структура Man(8)-GlcNAc(2), е по-малко от или равно на 0.45.
4. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 3, характеризиращ се с това, че споменатите олигоманози съдържат по-малко от 10% крайна ос-1,3-маноза.
5. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 4, характеризиращ се с това, че продуктът се отделя в клетка на квасни гъбички.
6. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че споменатата клетка на квасна гъбичка е клетка на Hansenula.
7. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 6, характеризиращ се с това, че се получава от протеин, съдържащ авиан лизозим водещ пептид или негова

158 функционална разновидност, свързани със споменатия протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент.
8. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че се получава от протеин, дефиниран със следната структура:

CL-[(A1 )_a-(PS1 )b-(A2)_c]-HCVENV-[(A3)d-(PS2)_e-(A4)i] където:

CL е авиан лизозим водещ пептид или негов функционален еквивалент,

А1, А2, АЗ и А4 са адапторни пептиди, които могат да бъдат различни или еднакви,

PS1 и PS2 са работещи места, които могат да бъдат различни или еднакви, HCVENV е протеин, обхващащ вируса на хепатит С, или негова част, a, b, с, d, е и f са 0 или 1, и където, А1 и/или А2 могат да бъдат част на PS1 и/или, където АЗ и/или А4 могат да бъдат част на PS2.
9. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че авиан лизозим водещият пептид CL притежава аминокиселинна последователност, дефинирана посредством SEQ ID N0:1.
10. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че А притежава аминокиселинна последователност, подбрана между SEQ ID N0:63-65, 70-72 и 74-82, и с това, че PS притежава аминокиселинна последователност, подбрана между SEQ ID N0:66-68 и 83-84, или с това, че PS представлява дибазично място, като Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg или Arg-Lys или монобазично място, като Lys, и с това, че протеинът, обвиващ вируса на хепатит С, (HCVENV) е подбран между SEQ ID N0:85-98 или нейни фрагменти.

159
11. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 10, характеризиращ се с това, че е включен в структура, подбрана от групата, състояща се от мономери, хомодимери, хетеродимери, хомоолигомери и хетероолигомери.
12. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 10, характеризиращ се с това, че е включен във вирусоподобна частица.
13. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 12, характеризиращ се с това, че цистеин-тиоловите групи в него са химично модифицирани.
14. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 13, характеризиращ се с това, че е антигенен.
15. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 13, характеризиращ се с това, че е имуногенен.
16. Изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 13, характеризиращ се с това, че включва Т-клетъчен епитоп.
17. Състав, характеризиращ се с това, че включва изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 16.
18. Състав, съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че включва и фармацевтично приемлив носител и с това, че е медикамент.
19. Състав, съгласно претенция 17, характеризиращ се с това, че включва и фармацевтично приемлив носител и с това, че е ваксина.
20. Метод за получаване на изолиран протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негов фрагмент, съгласно всяка от претенции от 1 до 16.

160
21. Метод за откриване на присъствието на антитела на вируса на хепатит С в проба, която се очаква, че съдържа антитела на вируса на хепатит С, характеризиращ се с това, че споменатият метод включва:

(i) контакт на протеин или негова част, обвиващ вируса на хепатит С, съгласно претенции от 1 до 16, със споменатата проба при условия, позволяващи комплексообразуване на протеин или негова част, обвиващ вируса на хепатит С, със споменатите антитела на вируса на хепатит С, (ii) откриване на формирания, съгласно (i) комплекс, и (iii) вадене на заключение от (ii) за присъствие на споменатите антитела на вируса на хепатит С в споменатата проба.
22. Метод, съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че споменатият контакт съгласно етап (i) протича при конкурентни условия.
23. Метод, съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че споменатият протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, се свързват с твърд супорт.
24. Диагностичен набор за откриване на присъствието на антитела на вируса на хепатит С в проба, която се очаква, че съдържа антитела на вируса на хепатит С, характеризиращ се с това, че споменатият набор включва протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно всяка от претенции от 1 до 16.
25. Диагностичен набор, съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че споменатият протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, се свързват с твърд супорт.
26. Медикамент, характеризиращ се с това, че включва протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно всяка от претенции от 1 до 16.
27. Ваксина, характеризираща се с това, че включва протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно всяка от претенции от 1 до 16.

161
28. Фармацевтичен състав за предизвикване на специфична имунна реакция спрямо вируса на хепатит С в бозайник, характеризиращ се с това, че споменатият състав включва ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно всяка от претенции от 1 до 16, и, по възможност, фармацевтично приемлива добавка.
29. Фармацевтичен състав за индуциране на специфични антитела на вируса на хепатит С в бозайник, характеризиращ се с това, че споменатият състав включва ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С. или негова част, съгласно всяка от претенции от 1 до 16, и, по възможност, фармацевтично приемлива добавка.
30. Фармацевтичен състав за предизвикване на Т-клетьчно действие в бозайник, характеризиращ се с това, че споменатият състав включва ефективно количество протеин, обвиващ вируса на хепатит С, или негова част, съгласно всяка от претенции от 1 до 16, и, по възможност, фармацевтично приемлива добавка.
31. Фармацевтичен състав, съгласно всяка от претенции от 28 до 30. характеризиращ се с това, че представлява профилактичен състав.
32 Фармацевтичен състав, съгласно всяка от претенции от 28 до 30, характеризиращ се с това, че представлява терапевтичен състав.
33. Фармацевтичен състав, съгласно всяка от претенции от 28 до 32. характеризиращ се с това, че споменатият бозайник е човек.

V7Q