KR20030094359A - 코어 글리코실화된 ｈｃｖ 엔빌로프 단백질 - Google Patents

코어 글리코실화된 ｈｃｖ 엔빌로프 단백질 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진핵생물 세포에서의 발현산물인 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 상기 HCV 엔빌로프 단백질은 N-글리코실화 부위의 평균 80% 까지가 코어-글리코실화되는 것을 특징으로 한다. 이들 N-글리코실화된 부위중 70% 이상은 8 내지 10개 만노오스를 함유하는 올리고만노오스에 의해 글리코실화된다. 또한, Man(8)GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 대한 Man(7)GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스의 비율이 0.45 이하이다. 10% 미만의 올리고만노오스는 α1,3 결합된 만노오스에 의해 종료된다. 본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질은 진단, 예방 및 치료 목적에 특히 적합하다. 본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질을 생산하기 위해 적합한 진핵생물 세포는 한세눌라(Hansenula) 세포이다.

Description

코어 글리코실화된 ＨＣＶ 엔빌로프 단백질{Core-glycosylated HCV envelope proteins}
C형 간염 바이러스(HCV) 감염은 개발국과 개도국 모두에서 주요 건강 문제이다. 세계 인구의 약 1 내지 5%가 이 바이러스에 감염된 것으로 추산된다. HCV 감염은 수혈과 관련된 간염의 가장 중요한 원인으로 보이며 흔히 만성적인 간 손상으로까지 진행한다. 또한, HCV가 간세포암의 유도에 관여함을 보여주는 증거가 존재한다. 따라서, 안정적인 진단법과 효과적인 치료제에 대한 요구가 높다. HCV-오염된 혈액 산물을 예민하고 특이하게 스크리닝하는 방법과 HCV를 배양하는 향상된 방법도 또한 요구된다.
HCV는 약 3000개 아미노산의 단일 폴리단백질을 암호화하는 약 9,600개 염기의 양성 표준 RNA 바이러스이다. 번역과 동시에 생기는 수식 및 번역후 수식에 결부된 전구체의 단백질 분해는 적어도 3개의 구조 단백질 및 6개의 비-구조적 단백질을 생성하는 것으로 나타나있다. 서열 상동성을 기초로 하여, 구조적 단백질은 1개의 단일 코어 단백질 및 2개의 엔빌로프 당단백질 E1 및 E2로 기능적으로 특정된다. 상기 E1 단백질은 192개의 아미노산으로 구성되며 또 HCV 유전형에 따라서 4 내지 5개의 N-글리코실화 부위를 함유한다. E2 단백질은 363 내지 370개 아미노산으로 구성되고 또 HCV 유전형에 따라서 9 내지 11개의 N-글리코실화 부위를 함유한다 (Major and Feinstone, 1997; Maertens and Stuyver, 1997 참조). E1 단백질은 다양한 가변 도메인을 함유한다(Maertens and Stuyver, 1997 참조). E2 단백질은 3개의 초가변적인 도메인을 함유하며, 이들의 주요 도메인은 단백질의 N-말단에 위치한다(Maertens and Stuyver, 1997 참조). HCV 당단백질은 ER에 주로 존재하며, 그곳에서 HCV 당단백질은 수식되어 올리고머성 복합체로 조립된다.
진핵생물에서, 당 잔기는 일반적으로 4개의 상이한 아미노산 잔기에 결합된다. 이들 아미노산 잔기는 O-결합된 잔기(세린, 트레오닌 및 히드록시리신) 및 N-결합된 잔기(아스파라긴)로 분류된다. O-결합된 당은 뉴클레오티드 당으로부터 골지체 또는 조면 소포체(ER)에서 합성된다. N-결합된 당은 통상의 전구체로부터 합성된 다음 가공된다. HCV 엔빌로프 단백질은 N-글리코실화되는 것으로 믿어진다. N-결합된 탄수화물 사슬의 부가는 접힘현상(folding) 중간체의 안정화 및 효과적인 접힘현상, 잘못된 접힘현상의 예방 및 소포체에서 분해, 올리고머화, 생물학적 활성 및 당단백질의 수송에 중요한 역할을 하는 것으로 당분야에 공지되어 있다 (Rose 등, 1988; Doms 등, 1993; Helenius, 1994 에 의한 문헌 참조). 폴리펩티드상에서 세 개펩티드 서열 Asn-X-Ser 및 Asn-X-Thr (식중, X는 임의의 아미노산임)은 N-결합된 올리고당이 결합하기 위한 콘센서스(consensus) 부위이다. N-결합된 올리고당을 폴리펩티드에 부가한 후, 올리고당을 복합체 유형(N-아세틸글루코사민, 만노오스, 푸코오스, 갈락토오스 및 시알산을 함유) 또는 고-만노오스 유형(N-아세틸글루코사민 및 만노오스 함유)으로 더욱 가공한다. HCV 엔빌로프 단백질은 고-만노오스 유형일 것으로 보인다. N-결합된 올리고당의 효모에서의 가공은 포유동물 골지체 가공과는 아주 상이하다. 효모에서는, 올리고당 사슬은 만노오스의 점진적인 부가를 통하여 골지체에서 연장되어 "초글리코실화"로 불리는 정교한 고 만노오스 구조를 형성한다. 이와 대조적으로, 원핵생물에서 발현된 단백질은 글리코실화되지 않는다.
단백질 또는 펩티드의 고-만노오스 글리코실화의 패턴은 다양한 진핵생물 세포에 따라 결정된다. 포유동물 세포에서는, 평균 5 내지 9개의 만노오스 단위체가 코어-글리코실화 유형 올리고당중의 2개의 N-아세틸글루코사민 잔기에 결합된다(이 구조를 간단히 Man(5-9)GlcNAc(2)라 칭함). 코어 글리코실화는 Herscovics 및 Orleans(1993)의 도 3에서 박스(boxed) 구조와 유사한 구조를 지칭한다.
메틸로트로픽(methylotrophic) 효모 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)는 글리코실화 부위당 평균 8 내지 14개 만노오스 단위, 즉 Man(8-14)GlcNAc(2)를 부착하고 있고(EP0256421호에서 Tschopp에 의해) 또 약 85%의 N-결합된 올리고당이Man(8-14)GlcNAc(2) (Grinna 및 Tschopp 1989) 크기 범위에 있다고 보고되어 있다. 다른 연구자들은 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 발현된 이종 단백질에 부착된 약간 상이한 올리고당 구조를 공개하였다: Man(8-9)GlcNAc(2) (Montesino 등, 1998), Man(9-14)GlcNAc(2) 또는 Man(9-15)GlcNAc(2) (Kalidas 등 2001), 및 Man(8-18)GlcNAc(2), 이때 Man(9-12)GlcNAc(2)가 우세하고 대부분의 올리고당은 Man(10)GlcNAc(2) (Miele 등, 1998)이다. Trimble 등(1991)은 약 75%의 N-결합된 올리고당에서 Man(8)GlcNAc(2) 및 Man(9)GlcNAc(2)의 분포가 동일하며 부가적으로 17%의 N-글리코실화 부위는 Man(10)GlcNAc(2)에 의해 점유되고 나머지 8%의 부위는 Man(11)GlcNAc(2)에 의해 점유된다고 보고하였다. 피. 파스토리스(P. pastoris)-발현된 단백질의 초글리코실화는 경우에 따라 보고되었다(Scorer 등 1993).
아스페르길루스 니거(Aspergillus niger)는 Man(5-10)GlcNAc(2)를 N-글리코실화 부위에 부가한다 (Panchal 및 Wodzinski 1998).
사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 글리코실화 결핍 돌연변이체mnn9는,mnn9세포가 초글리코실화된 단백질 대신, Man(9-13)GlcNAc(2)으로 구성된 수식된 올리고당을 갖는 글리코실화 단백질을 생산하는 점에서 야생형 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae)와 상이하다 (US 5,135,854호에서 Mackay 등 및 WO 94/01132호에서 Knisken 등 참조). 다른 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 돌연변이체,ochlmnn9는 단백질중의 N-글리코실화 부위에 Man(8)GlcNAc(2)를 부가하는 것으로 보고되었다 (JP06277086호에서 Yoshifumi 등 참조).
에스. 세레비시아애(S. cerevisiae)(야생형 및mnn9돌연변이체) 코어 올리고당의 특징은 말단 α1,3-결합된 만노오스 잔기가 존재하는 점이다(Montesino 등 1998). 피. 파스토리스(P. pastoris) 또는 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae)och1mnn1에서 발현된 단백질의 N-글리코실화 부위에 부착된 올리고당은 이러한 말단 α1,3-결합된 만노오스를 갖고 있지 않다(Gellissen 등 2000). 말단 α1,3-결합된 만노오스는 알레르기 유발물질로 간주된다(Jenkins 등 1996). 따라서, 자신에 당에 말단 α1,3-결합된 만노오스 잔기를 갖는 단백질은 진단 또는 치료 목적용으로는 적합하지 않다.
메틸로트로픽 효모 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 발현된 단백질에서 글리코실화 패턴은 다수의 이종 단백질의 생산을 위해 상기 효모에서 사용됨에도 불구하고 (Gellissen 등, 2000에서 표 3 참조), 그다지 자세하게 연구되지 않았다. Janowicz 등 (1991) 및 Diminsky 등(1997)의 실험으로부터, 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)는 대형 또는 소형의 B형 간염 바이러스성 표면 항원(HBsAg)을 글리코실화시키지 않거나 극히 적게 글리코실화시키는 것으로 보인다. 이것은 HBsAg가 시그널 펩티드없이 발현됨으로 인하여, 생산된 HBsAg가 소포체의 세포간극으로 들어가지 못하게 하여 글리코실화를 방해하기 때문으로 보여진다. 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에서 생산된 G-CSF (과립구 군체 자극인자)에 대한 모노- 또는 디헥소오스의 제한된 부가는 보고되어 있다 (Fischer 등 WO 00/40727호에 보고). 한편, 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha) 세포에서 발현된 이종 α-갈락토시다제의 초글리코실화가 보고되어 있다(Fellinger 등 1991).
지금까지, 질병에 대한 백신처리는 질병을 제어하는 가장 비용 효과적이고 효율적인 방법으로 알려져 왔다. 그러나, 유망한 결과에도 불구하고 효과적인 HCV 백신을 개발하려는 노력은 여러 문제에 직면하였다. 백신에 대한 필수조건은 환자에서 면역반응을 유발하는 것이다. 따라서, HCV 항원결정부위를 확인해야하고, 적합한 조건에서 환자에게 투여되어야한다. 항원결정부위는 적어도 2개 형태, 즉 선형 및 입체적 항원결정부위로 분류될 수 있다. 입체적 항원결정부위는 글리코실화와 같은 번역과 동시에 생기는 수식 및 번역후 수식을 비롯한 3차원 공간에서 분자의 접힘현상에 기인한다. 일반적으로, 입체적 항원결정부위는 대부분의 효과적인 백신을 실현할 수 있을 것으로 보는데, 그 이유는 입체적 항원결정부위는 천연과 유사한 HCV 항원결정부위와 유사하고 또 실제의 선형 아미노산 서열보다 더 잘 보존될 수 있는 항원결정부위를 나타내기 때문이다. 따라서, HCV 엔빌로프 단백질의 글리코실화의 실제 정도는 천연 HCV 항원 결정기를 생성하는데 가장 중요하다. 그러나, HCV를 배양하는 것은 무수한 문제를 갖고 있어, 극히 소량의 비리온을 초래할 뿐이다. 또한, 재조합 단백질의 발현과 정제에도 다수의 문제가 존재하므로, 소량의 단백질, 초글리코실화된 단백질 또는 글리코실화되지 않은 단백질을 초래하게된다.
HCV 엔빌로프 단백질은 대장균(Escherichia coli), 곤충 세포, 효모 세포 및 포유동물 세포에서 재조합 수법에 의해 생산되었다. 그러나, 더 고등한 진핵생물에서의 발현은 실제의 백신 제조를 위한 다량의 항원을 얻는데 어려움이 존재한다. 대장균(E.coli)과 같은 원핵생물에서 발현은 글리코실화되지 않은 HCV 엔빌로프 단백질을 초래한다. 효모에서의 HCV 엔빌로프 단백질의 발현은 초글리코실화를 초래한다. WO 96/04385에서 Maertens 등에 의해 이미 나타낸 바와 같이, 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae)에서 HCV 엔빌로프 단백질 E2의 발현은 상당히 글리코실화된 단백질을 초래한다. 이러한 초글리코실화는 단백질 항원결정부위를 숨기게된다. Mustilli 등(1999)는 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae)에서 HCV E2의 발현이 코어-글리코실화를 초래하지만, 세포내적으로 발현된 물질의 결과는 그 일부가 초글리코실화되는 반면에 나머지 물질의 정확한 가공이 나타나지 않는다고 주장하였다. 더구나, Mustilli 등 (1999)에 의해 관찰된 초글리코실화는 튜니카마이신(글리코실화 억제제의 일종)의 존재하에서만 방지될 수 있고, 또 이것은 정상적인 천연 생장 조건하에서 생기는 글리코실화를 나타내지 않는다. 세포내 공급원으로부터 유도된 HCV 엔빌로프 단백질에 대한 필요는 잘 받아들여지고 있다 (WO 96/04385에서 Maertens 등, Heile 등, 2000). 이러한 필요성은 Mustilli 등(1999)의 도 5에서 분명한 바와 같이 포유동물 세포 배양액 유래 E2 단백질에 의해 면역화된 침팬지의 혈청과 분비된 효모 유래 E2의 불량한 반응성으로 부터도 더욱 예시된다. 이러한 것은 효모 유래 HCV 엔빌로프 단백질을 사용한 면역화가 그러한 도전으로 보호하는데 실패하였음을 보여주는 로사 등(1996)에 의한 문헌에 수록되어 있다.
따라서, 말단 α1,3-결합된 만노오스를 갖지 않는 천연과 유사한 글리코실화 패턴을 동시에 갖는 단백질을 다량으로 또 비용 효과적으로 얻을 수 있는 효과적인 발현계가 요망되고 있다. 특히, 이러한 계는 HCV 엔빌로프 단백질의 제조에 필요하다.
본 발명은 일반적 재조합 단백질 발현, HCV 감염의 진단, HCV 감염의 치료 또는 예방, 및 만성간염에 걸린 개인을 치료할 때 임상적 효과를 진단/조절하는 것과 천연 질병의 진단/조절에도 관한 것이다.
보다 자세하게는, 본 발명은 코어-글리코실화된 바이러스성 엔빌로프 (envelope) 단백질의 발현에 적합한 효모, 효모 균주에서 C형 간염 바이러스 엔빌로프 단백질의 발현, 및 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질의 진단, 예방 또는 치료에서의 용도에도 관한 것이다.
도 1은 서열번호 6에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pGEMT-E1sH6RB의 개략도이다.
도 2는 서열번호 9에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pCHH-Hir의 개략도이다.
도 3은 서열번호 12에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT121의 개략도이다.
도 4는 서열번호 13에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT-CHH-E1-H6 의 개략도이다.
도 5는 서열번호 16에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT-MFa-E1-H6의 개략도이다.
도 6은 서열번호 17에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pUC18-FMD-MFa-E1-H6 의 개략도이다.
도 7은 서열번호 20에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pUC18-FMD-CL-E1-H6 의 개략도이다.
도 8은 서열번호 21에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT-CL-E1-H6 의 개략도이다.
도 9는 서열번호 22에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pSP72E2H6 의 개략도이다.
도 10은 서열번호 23에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pMPT121 의 개략도이다.
도 11은 서열번호 24에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT-MFa-E2-H6 의 개략도이다.
도 12는 서열번호 25에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pMPT-MFa-E2-H6 의 개략도이다.
도 13은 서열번호 28에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pMF30의 개략도이다.
도 14는 서열번호 32에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT-CL-E2-H6 의 개략도이다.
도 15는 서열번호 35에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pUC18-FMD-CL-E1 의 개략도이다.
도 16은 서열번호 36에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT-CL-E1의 개략도이다.
도 17은 서열번호 39에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pUC18-FMD-CL-H6-E1-K-H6 의 개략도이다.
도 18은 서열번호 40에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pFPMT-CL-H6-K-E1 의 개략도이다.
도 19는 서열번호 41에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pYIG5 의 개략도이다.
도 20은 서열번호 42에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pYIG5E1H6 의 개략도이다.
도 21은 서열번호 43에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pSY1의 개략도이다.
도 22는 서열번호 44에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pSY1aMFE1sH6a 의 개략도이다.
도 23은 서열번호 45에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pBSK-E2sH6의 개략도이다.
도 24는 서열번호 46에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pYIG5HCCL-22aH6 의 개략도이다.
도 25는 서열번호 47에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pYYIGSE2H6 의 개략도이다.
도 26은 서열번호 48에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pYIG7 의 개략도이다.
도 27은 서열번호 49에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pYIG7E1 의 개략도이다.
도 28은 서열번호 50에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pSY1YIG7E1s 의 개략도이다.
도 29는 서열번호 51에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pPICZalphaA 의 개략도이다.
도 30은 서열번호 52에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pPICZalphaD' 의 개략도이다.
도 31은 서열번호 53에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pPICZalphaE' 의 개략도이다.
도 32는 서열번호 58에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pPICZalphaD'E1sH6 의 개략도이다.
도 33은 서열번호 59에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pPICZalphaE'E1sH6 의 개략도이다.
도 34는 서열번호 60에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pPICZalphaD'E2sH6의 개략도이다.
도 35는 서열번호 61에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pPICZalphaE'E2sH6 의 개략도이다.
도 36은 서열번호 62에 정의된 바와 같은 서열을 갖는 벡터 pUC18MFa 의 개략도이다.
도 37. MFα-E2-H6-발현 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로부터발현된 IMAC-정제된 E2-H6 단백질의 크기 배제 크로마토그래피의 용출 프로필 (실시예 15 참조). X축은 용출 부피(mL)를 나타낸다. 용출 프로필을 통과하는 수직선은 수집된 분획을 나타낸다. "P1"는 모아진 분획 4-9, "P2"는 모아진 분획 30-35, 그리고 "P3"는 모아진 분획 37-44를 나타낸다. Y축은 mAU(milli absorbance units)로 나타낸 흡수도를 나타낸다. X축은 용출부피(mL)를 나타낸다.
도 38. 크기 배제 크로마토그래피(도 37 참조) 이후 수집된 상이한 푸울(pool) 및 분획을 비환원성 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음 폴리아크릴아미드 겔을 은 염색하였다. 분석된 푸울("P1", "P2", 및 "P3") 및 분획(16-26)은 은-염색된 겔의 사진의 상부에서 나타난다. 좌측(레인"M")에서는 분자 질량 마커의 크기를 나타낸다.
도 39. 도 37에 도시한 바와 같은 크기 배제 크로마토그래피의 분획 17-23을 모아서 알킬화시켰다. 그후, 단백질물질을 엔도 H 처리하여 탈글리코실화시켰다. 미처리 물질 및 엔도 H-처리된 물질을 SDS-PAGE 겔상에서 분리하여 PVDF 막에 블로팅시켰다. 이 블럿을 아미도 블랙으로 염색시켰다.
레인 1: 엔도 H-처리전 알킬화된 E2-H6
레인 2: 엔도 H-처리후 알킬화된 E2-H6
도 40은 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현된 E1의 세포 용균물의 웨스턴-블럿 분석이다. 웨스턴-블럿은 E1-특이적 모노클로날 항체 IGH201을 사용하여 개발되었다.
레인 1-4: E1-H6에 결합된 닭의 리소짐 리더 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pSY1YIG7E1s (서열번호: 50, 도 28)에 의해 형질전환된 사카로마이세스(Saccharomyces) 클론에서 각기 발현된 지 2, 3, 5 또는 7일 후의 발현산물.
레인 5-7: E1-H6에 결합된 α-메이팅 인자 리더 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 pSY1aMFE1sH6aYIG1 (서열번호: 44, 도 22)에 의해 형질전환된 사카로마이세스(Saccharomyces) 클론에서 각기 발현된 지 2, 3 또는 5일 후의 발현산물.
레인 8: 나타낸 크기를 갖는 분자량 마커.
레인 9: HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 정제된 E1s.
도 41. 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 CL-E2-H6에서 부터 E2-H6 까지 발현되고 가공된 고정화된 이온 친화성 크로마토그래피(IMAC)-정제된 E2-H6 단백질의 분석(실시예 17 참조). 상이한 세척 분획(레인 2 내지 4) 및 용출 분획(레인 5 내지 7)에 있는 단백질은 환원성 SDS-PAGE 실시한 다음 겔을 은 염색(A, 도면 상부)하거나 또는 E2에 관한 특정 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블럿(B, 도면 하단)에 의해 분석하였다. 분자량 마커의 크기는 좌측에 나타낸다.
도 42. 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 생산된 술폰화된 H6-K-E1 단백질을 정제하기 위한 Ni-IDA 칼럼(Ni2+가 로딩된 Chelating Sepharose FF, 파마시아 제조)상에서 제1 IMAC 크로마토그래피 단계의 용출 프로파일(실시예 18 참조). 상기 칼럼은 20 mM 이미다졸이 보충된 완충액 A(50 mM 포스페이트, 6m GuHCl, 1% Empigen BB (v/v), pH 7.2)로 균형을 이루었다. 샘플을 적용한 후, 칼럼을 20 mM 및 50 mM 이미다졸을 각각 함유하는 완충액 A를 사용하여 순차적으로 세척하였다 (크로마토그램상에 나타낸 바와 같음). 각기 50 mM 이미다졸 및 200 mM 이미다졸이 보충된 완충액 B(PBS, 1% empigen BB, pH 7.2)를 순차적으로 적용하여 His-태깅된 생성물의 추가의 세척 및 용출단계를 실시하였다 (크로마토그램상에 나타낸 바와 같음). 분획을 모았다: 세척 푸울 1(분획 8 내지 11, 50 mM 이미다졸에 의해 세척됨). 용출된 물질을 별도의 분획 63 내지 72로 수집하거나 용출 푸울(분획 63 내지 69)로서 수집하였다. Y-축은 흡수도(mAU)(milli absorbance units)를 나타낸다. X축은 용출 부피(mL)를 나타낸다.
도 43. 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 발현되고 가공된 IMAC-정제된 H6-K-E1 단백질(도 42 참조)의 분석. 세척 푸울 1(레인 12) 및 용출 분획 63-72(레인 2 내지 11)중의 단백질은 환원성 SDS-PAGE를 실시한 다음 겔을 은 염색(A, 상부 도면)하여 분석하였다. IMAC 전의 샘플(레인 2), 유동 푸울(레인 4), 세척 푸울 1(레인 5) 및 용출 푸울(레인 6)에 존재하는 단백질은 E1에 대한 특이적인 모노클로날 항체를 사용한 웨스턴 블럿(B, 하부 도면; 레인 3에서는 어떤 샘플도 로딩되지 않았음)에 의해 분석하였다. 분자량 마커(레인 M)의 크기는 좌측에 나타낸다.
도 44. Endo Lys-C를 갖는 H6-K-E1 (정제: 도 42 참조)의 시험관내 가공으로 기인한 E1의 정제에 대한 Ni-IDA 칼럼(Ni2+가 로딩된 Chelating Sepharose FF) 상에서 제2 IMAC 크로마토그래피 단계의 용출 프로필. 유량은 E1s-생성물의 존재에 대해 스크리닝된 상이한 분획(1 내지 40)으로 수집되었다. H6-K-E1으로부터 가공된 완전 E1를 함유하는 분획(7 내지 28)을 모았다. Y축은 mAU로 나타낸 흡수도이다. X축은 용출부피(mL)이다.
도 45. 비오티닐화된 헤파린과 반응하는 특정 E1s 단백질 밴드를 나타내는 웨스턴 블럿 분석(실시예 19 참조). HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포 배양액으로부터 정제되거나 또는 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 발현된 E1s 제제를 분석하였다. 수직선으로부터 우측에 있는 패널은 비오티닐화된 E1 특정 모노클로날 IGH200에 의해 생긴 웨스턴-블럿을 도시한다. 수직선으로부터 좌측에 있는 패널은 비오티닐화된 헤파린을 사용하여 생긴 웨스턴-블럿을 도시한다. 이들 결과로부터, 글리코실화가 덜된 E1s는 헤파린에 대하여 높은 친화성을 갖는다고 결론지을 수 있다.
레인 M: 분자량 마커 (좌측에 나타낸 분자량)
레인 1: 포유동물 세포로부터 얻으며, 분리하는 동안 알킬화된 E1s.
레인 2: 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 발현되며 분리하는 동안 술폰화된 E1s-H6.
레인 3: 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 발현되며 분리하는 동안 알킬화된 E1s-H6.
레인 4: 레인 2에 로딩된 것과 동일 재료이지만 디티오트레이톨에 의해 처리되어 술폰화된 Cys-티올기를 Cys-티올로 전환시킴.
도 46. 베타인 대신 Empigen BB를 사용하는 것에 의해 바이러스-유사 입자 형성을 실시하기 위하여 PBS, 3% 베타인으로 실시된 술폰화된 형태로 정제된에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)-발현된 E2-H6의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필. 더 연구하기 위해 사용된 VLP를 함유하는 모아진 분획은 "↔"로 나타낸다. Y축은 mAU(milli absorbance units)로 나타낸 흡수도를 나타낸다. X축은 용출 부피(mL)이다. 실시예 20 참고.
도 47. 베타인 대신 Empigen BB를 사용하는 것에 의해 바이러스-유사 입자 형성을 실시하기 위하여 PBS, 3% 베타인으로 실시된 알킬화된 형태로 정제된에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)-발현된 E2-H6의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필. VLP를 함유하는 모아진 분획은 "↔"로 나타낸다. Y축은 mAU(milli absorbance units)로 나타낸 흡수도를 나타낸다. X축은 용출 부피(mL)이다. 실시예 20 참고.
도 48. 베타인 대신 Empigen BB를 사용하는 것에 의해 바이러스-유사 입자 형성을 실시하기 위하여 PBS, 3% 베타인으로 실시된 술폰화된 형태로 정제된에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)-발현된 E1의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필. VLP를 함유하는 모아진 분획은 "↔"로 나타낸다. Y축은 mAU(milli absorbance units)로 나타낸 흡수도를 나타낸다. X축은 용출 부피(mL)이다. 실시예 20 참고.
도 49. 베타인 대신 Empigen BB를 사용하는 것에 의해 바이러스-유사 입자 형성을 실시하기 위하여 PBS, 3% 베타인으로 실시된 알킬화된 형태의 정제된 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)-발현된 E1의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로필. VLP를 함유하는 모아진 분획은 "↔"로 나타낸다. Y축은 mAU(milli absorbance units)로 나타낸 흡수도를 나타낸다. X축은 용출 부피(mL)이다. 실시예 20 참고.
도 50. 도 48 및 49에 기재한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 실시한 후 분리된 VLP를 SDS-PAGE(환원성 조건하) 및 웨스턴 블럿 분석. 좌측 패널: 은-염색된 SDS-PAGE 겔. 우측 패널: E1에 대한 특정 모노클로날 항체(IGH201)를 사용한 웨스턴 블럿. 레인 1: 분자량 마커 (좌측에 나타낸 분자량); 레인 2: 술폰화된 E1을 함유하는 VPS의 푸울 (도 48 참조); 레인 3: 알킬화된 E1을 함유하는 VLP의 푸울 (도 49 참조). 실시예 20 또한 참조.
도 51. 포유동물 세포에서 생산된 E1 ("M") 또는 한세눌라(Hansenula)-생산된 E1 ("H")를 ELISA 고형 지지체상에 피복함으로써, 포유동물 세포에서 생산된 E1을 사용하여 마우스를 백신처리한 후(패널 상부) 또는 한세눌라(Hansenula)-생산된 E1을 사용하여 마우스를 백신처리한 후(패널 하부) 혈청에 존재하는 항체의 종점 역가를 결정한다. 종점 역가(배가-희석)는 Y축상에 나타낸다. 실시예 22 참조.
도 52. 한세눌라(Hansenula)-생산된 E1을 알킬화("A") 또는 술폰화("S") 시킨 다음 ELISA 고형 지지체상에 피복함으로써, 알킬화된 한세눌라(Hansenula)-생산된 E1을 사용하여 마우스를 백신처리한 후(패널 상부), 또는 술폰화된 한세눌라(Hansenula)-생산된 E1을 사용하여 마우스를 백신처리한 후(패널 하부) 혈청에 존재하는 항체의 종점 역가를 결정한다. 수평 선은 평균 항체 역가를 나타낸다. 종점 역가(배가-희석)는 Y축상에 나타낸다. 실시예 23 참조.
도 53. HCV-재조합 백시니아 바이러스 감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E1 및 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 생산된 HCV E1을 직접적으로 ELISA 플레이트에 피복하였다. 항체의 종점 역가는 포유동물 세포에 의해 생산된 E1으로 백신처리된 침팬지의 혈청 (상부 패널) 및 포유동물 세포에 의해 생산된 E1에 대한 쥐의 모노클로날 항체의 혈청(하부 패널)에서 결정하였다. 침팬지 요란(Yoran)과 마티(Marti)를 예방적으로 백신처리하였다. 흑색 막대: 포유동물 세포에 의해 생산된 E1에 의해 피복된 ELISA 플레이트. 빈 막대: 한세눌라(Hansenula)에 의해 생산된 E1으로 피복된 ELISA 플레이트. 종점 역가(배가-희석)는 Y축에 나타낸다. 실시예 24 또한 참조.
도 54. 재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포로부터 방출된 올리고당 및 한세눌라(Hansenula)에 의해 생산된 E1-H6 단백질로부터 방출된 올리고당의 형광-보조된 탄수화물 겔 전기영동.
레인 1: 좌측에 단당류의 개수를 나타낸 글루코오스 사다리 표준 (3 내지 10, G3 내지 G10으로 표시).
레인 2: 포유동물 세포에 의해 생산된 (알킬화된) E1으로부터 방출된 25 ㎍ N-결합된 올리고당.
레인 3: 한세눌라(Hansenula)에 의해 생산된 (알킬화된) E1-H6으로부터 방출된 25 ㎍ N-결합된 올리고당.
레인 4: 100 피코몰의 말토테트라오스.
실시예 25 또한 참조.
도 55. 이 도면은 표준 올리고만노오스, Man-9 (도 55. A), Man-8 (도 55. B), Man-7 (도 55. C), Man-6 (도 55.D) 및 Man-5 (도 55.E)의 단순화된 구조를 도시한다. "Man" = 만노오스; "GlcNAc" = N-아세틸글루코사민; "α" = 2개 만노오스 사이의 α-결합; "β" = 2개 만노오스 사이의 β-결합; "(1-3)" , "(1-4)" 및 "(1-6)" = 2개 만노오스 사이의 (1-3), (1-4) 및 (1-6) 결합을 각각 나타낸다. 도 55.B 및 도 55.C에서 괄호는 괄호로부터 좌측에 있는 각각 2 및 1개의 만노오스 잔기가 괄호로부터 우측에 있는 3개 만노오스 잔기의 2 및 1에 대하여 α(1-2) 결합으로 결합됨을 나타낸다. 실시예 26 또한 참조.
도 56. 치토바이오스에 결합된 10개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스를 도시한다. 각 말단 만노오스 잔기는 비-말단 만노오스 잔기에 대하여 α1-3 결합에 의해 연결된다. 얇은 상방향 화살표는 α1-2 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합(이 올리고만노오스에는 적용되지 않음)을 나타내고, 두꺼운 상방향 또는 좌측을 가르키는 화살표는 α1-2 결합 만노오스의 제거후 α-만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합(상기 올리고만노오스에는 적용되지 않음)을 나타내고 또 비어있는 하방을 가르키는 화살표는 α-결합된 만노오스의 제거후 β 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타낸다. 실시예 26 또한 참조.
도 57. 치토바이오스에 결합된 9개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스를 도시한다. 상기 올리고만노오스에서, 1개 말단 만노오스 잔기는 α1-2 결합에 의해 비-말단 만노오스 잔기에 결합된다. 얇은 상방향 화살표는 α1-2 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내고, 두꺼운 상방향 또는 좌측을 가르키는 화살표는 α1-2 결합 만노오스의 제거후 α-만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내며 또 비어있는 하방을 가르키는 화살표는 α-결합된 만노오스의 제거후 β 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타낸다. 실시예 26 또한 참조.
도 58. 치토바이오스에 결합된 9개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스 Man-9를 도시한다. 상기 올리고만노오스에서, 모든 말단 만노오스 잔기는 α1-2 결합에 의해 비-말단성 만노오스 잔기에 결합된다. 얇은 상방을 가르키는 화살표는 α1-2 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내고, 두꺼운 상방향 화살표는 α 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내며 또 비어있는 하방을 가르키는 화살표는 α-결합된 만노오스의 제거후 β 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타낸다. 실시예 26 또한 참조.
도 59. 치토바이오스에 결합된 8개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스 Man-8를 도시한다. 상기 올리고만노오스에서, 모든 말단 만노오스 잔기는 α1-3 또는 α1-6 결합에 의해 비-말단성 만노오스 잔기에 결합되므로 이 구조는 α1-2 만노시다제에 의한 분해에 충분히 견딜 수 있게 된다. 두꺼운 상방향 화살표는 α 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내고 또 비어있는 하방을 가르키는 화살표는 α-결합된 만노오스의 제거후 β 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타낸다. 실시예 26 또한 참조.
도 60. 치토바이오스에 결합된 7개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스 Man-7을 도시한다. 상기 올리고만노오스에서, 모든 말단 만노오스 잔기는 α1-3 결합에 의해 비-말단성 만노오스 잔기에 결합되므로 이 구조는 α1-2 만노시다제에 의한 분해에 충분히 견딜 수 있게 된다. 두꺼운 상방향 화살표는 α 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내고 또 비어있는 하방을 가르키는 화살표는 α-결합된 만노오스의 제거후 β 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타낸다. 실시예 26 또한 참조.
도 61. 치토바이오스에 결합된 9개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스를 도시한다. 상기 올리고만노오스에서, 모든 말단 만노오스 잔기는 α1-2 결합에 의해 비-말단성 만노오스 잔기에 결합된다. 얇은 상방향을 가르키는 화살표는 α1-2 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내고, 두꺼운 상방향 또는 좌측을 나타내는 화살표는 α 1-2 결합된 만노오스의 제거후 α 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내며 또 비어있는 하방을 가르키는 화살표는 α-결합된 만노오스의 제거후 β 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타낸다. 실시예 26 또한 참조.
도 62. 치토바이오스에 결합된 1 또는 2개의 글루코오스 잔기 및 8개의 만노오스 잔기로 구성된 임의의 글루코오스-함유 올리고당을 도시한다. 상기 올리고당에서, A- 또는 B-브랜치 (도면에서 "A →" 및 "B→")의 말단 α1-2 결합된 만노오스 잔기의 하나는 (Glc)Glc로 표시한 바와 같이 괄호의 좌측에 1 또는 2개의 글루코오스 잔기를 갖고 있다. 얇은 상방을 가르키는 화살표는 α1-2 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합은 말단 만노오스 잔기에 대하여 글루코오스를 부착하고 있지 않음을 나타낸다. 두꺼운 상방향 또는 좌측을 가르키는 화살표는 α 1-2 결합된 만노오스의 제거후 α만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타내고 또 비어있는 하방을 가르키는 화살표는 α-결합된 만노오스의 제거후 β 만노시다제에 의해 분해되기 쉬운 올리고당 결합을 나타낸다. 가능한 반응 산물의 개요는 실시예 26의 표 10에 나타낸다.
도 63. 엑소글리코시다제를 사용하거나 또는 사용하지 않고 철야 배양한 후 Man-9의 반응산물을 Waters Alliance HPLC 스테이션에 결합된 TSK gel-Amide-80 (0.46 x 25 cm, 토소 바이오셉 제조)상에서 분리하였다. 올리고당의 분리는 주위 온도, 1.0 mL/분으로 실시하였다. 용매 A는 아세토니트릴중 0.1% 아세트산으로 구성되고 용매 B는 물중의 0.2% 아세트산-0.2% 트리에틸아민으로 구성된다. 2-AB 라벨링된 올리고당의 분리는 5개 칼럼 부피에 대하여 28% B 이소크래틱을 사용하여 실시한 다음 15개 칼럼 부피에 대하여 45% B 까지 일직선으로 증가시켰다. 용출 용매의 조성은 용매 A중의 % 용매 B (v/v)로서 Y축 우측에 나타낸다. 용출시간은 X축 상에 분으로 나타낸다. Y축 좌측은 용출하는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)-라벨링된 올리고당의 형광을 나타낸다. 2-AB의 여기 파장은 330 nm이고, 방출 파장은 420 nm이다.
크로마토그램의 트레이스 1("1")은 엑소글리코시다제를 사용하지 않고 철야 배양된 Man-9의 용출을 나타낸다. 트레이스 2("2")는 α1-2 만노시다제와 함께Man-9를 철야 배양한 후 Man-5 및 Man-6의 혼합물의 용출을 도시한다. 트레이스 3 및 4 ("3" 및 "4")는 α-만노시다제와 함께 Man-9를 1시간 및 철야 배양한 후 4'-β-만노실 치토바이오스의 용출을 도시한다. 트레이스 5 ("5")는 α- 및 β-만노시다제와 함께 Man-9를 철야 배양한 후 치토바이오스의 용출을 도시한다. 트레이스 1-5는 겹쳐서 표시되는데, 이것은 이들의 각각의 기준선이 0 수준이 아니기 때문이다. 트레이스 6 ("6")은 적용된 용매 구배를 도시한다.
도의 상단에 글자 A 내지 K로 표시한 피이크는 다음을 의미한다: A, 치토바이오스; B, 4'-β-만노실-치토바이오스; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7; J, Man-8; 및 K, Man-10. 실시예 26 또한 참조.
도 64. 엑소글리코시다제를 사용하거나 또는 사용하지 않고 철야 배양한 후 사카로마이세스(Saccharomyces) 생산된 E1으로부터 유도된 올리고당의 반응 산물을 Waters Alliance HPLC 스테이션에 결합된 TSK gel-Amide-80 (0.46 x 25 cm, 토소 바이오셉 제조)상에서 분리하였다. 올리고당의 분리는 주위 온도에서, 1.0 mL/분으로 실시하였다. 용매 A는 아세토니트릴중 0.1% 아세트산으로 구성되고 용매 B는 물중의 0.2% 아세트산-0.2% 트리에틸아민으로 구성된다. 2-AB 라벨링된 올리고당의 분리는 5개 칼럼 부피에 대하여 28% B 이소크래틱을 사용하여 실시한 다음 15개 칼럼 부피에 대하여 45% B 까지 일직선으로 증가시켰다. 용출 용매의 조성은 용매 A중의 % 용매 B (v/v)로서 Y축 우측에 나타낸다. 용출시간은 X축 상에 분으로 나타낸다. Y축 좌측은 용출하는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)-라벨링된 올리고당의 형광을 나타낸다. 2-AB의 여기 파장은 330 nm이고, 방출 파장은 420 nm이다.
크로마토그램의 트레이스 1("1")은 엑소글리코시다제를 사용하지 않고 철야 배양된 사카로마이세스(Saccharomyces) 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 나타낸다. 트레이스 2("2")는 α1-2 만노시다제와 함께 Man-9를 철야 배양한 후 사카로마이세스(Saccharomyces) 생산된 E1으로부터 유래한 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 3 및 4 ("3" 및 "4")는 α-만노시다제와 함께 1시간 및 철야 배양한 후 사카로마이세스(Saccharomyces) 생산된 E1으로부터 유래한 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 5 ("5")는 α- 및 β-만노시다제와 함께 철야 배양한 후 사카로마이세스(Saccharomyces) 생산된 E1으로부터 유래한 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 1-5는 겹쳐서 표시되는데, 이것은 이들의 각각의 기준선이 0 수준이 아니기 때문이다. 트레이스 6 ("6")은 적용된 용매 구배를 도시한다.
도의 상단에 글자 A 내지 K로 표시한 피이크는 다음을 의미한다: A, 치토바이오스; B, 4'-β-만노실-치토바이오스; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7; J, Man-8; 및 K, Man-10. 실시예 26 또한 참조.
도 65. 엑소글리코시다제를 사용하거나 또는 사용하지 않고 철야 배양한 후 백시니아 감염된 포유동물 세포에서 생산된 E1으로부터 유도된 올리고당의 반응산물을 Waters Alliance HPLC 스테이션에 결합된 TSK gel-Amide-80 (0.46 x 25 cm, 토소 바이오셉 제조)상에서 분리하였다. 올리고당의 분리는 주위 온도에서, 1.0 mL/분으로 실시하였다. 용매 A는 아세토니트릴중 0.1% 아세트산으로 구성되고 용매 B는 물중의 0.2% 아세트산-0.2% 트리에틸아민으로 구성된다. 2-AB 라벨링된 올리고당의 분리는 5개 칼럼 부피에 대하여 28% B 이소크래틱을 사용하여 실시한 다음 15개 칼럼 부피에 대하여 45% B 까지 일직선으로 증가시켰다. 용출 용매의 조성은 용매 A중의 % 용매 B (v/v)로서 Y축 우측에 나타낸다. 용출시간은 X축 상에 분으로 나타낸다. Y축 좌측은 용출하는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)-라벨링된 올리고당의 형광을 나타낸다. 2-AB의 여기 파장은 330 nm이고, 방출 파장은 420 nm이다.
크로마토그램의 트레이스 1("1")은 엑소글리코시다제를 사용하지 않고 철야 배양된 백시니아-감염된 포유동물 세포에서 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 나타낸다. 트레이스 2("2")는 α1-2 만노시다제와 함께 Man-9를 철야 배양한 후 백시니아-감염된 포유동물 세포에서 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출 을 도시한다. 트레이스 3 및 4 ("3" 및 "4")는 α-만노시다제와 함께 1시간 및 철야 배양한 후 백시니아-감염된 포유동물 세포에서 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 5 ("5")는 α- 및 β-만노시다제와 함께 철야 배양한 후 백시니아-감염된 포유동물 세포에서 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 1-5는 겹쳐서 표시되는데, 이것은 이들의 각각의 기준선이 0 수준이 아니기 때문이다. 트레이스 6 ("6")은 적용된 용매 구배를 도시한다.
도의 상단에 글자 A 내지 K로 표시한 피이크는 다음을 의미한다: A, 치토바이오스; B, 4'-β-만노실-치토바이오스; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7; J, Man-8; 및 K, Man-10. 실시예 26 또한 참조.
도 66. 엑소글리코시다제를 사용하거나 또는 사용하지 않고 철야 배양한 후한세눌라(Hansenula) 생산된 E1으로부터 유도된 올리고당의 반응산물을 Waters Alliance HPLC 스테이션에 결합된 TSK gel-Amide-80 (0.46 x 25 cm, 토소 바이오셉 제조)상에서 분리하였다. 올리고당의 분리는 주위 온도에서, 1.0 mL/분으로 실시하였다. 용매 A는 아세토니트릴중 0.1% 아세트산으로 구성되고 용매 B는 물중의 0.2% 아세트산-0.2% 트리에틸아민으로 구성된다. 2-AB 라벨링된 올리고당의 분리는 5개 칼럼 부피에 대하여 28% B 이소크래틱을 사용하여 실시한 다음 15개 칼럼 부피에 대하여 45% B 까지 일직선으로 증가시켰다. 용출 용매의 조성은 용매 A중의 % 용매 B (v/v)로서 Y축 우측에 나타낸다. 용출시간은 X축 상에 분으로 나타낸다. Y축 좌측은 용출하는 2-아미노벤즈아미드 (2-AB)-라벨링된 올리고당의 형광을 나타낸다. 2-AB의 여기 파장은 330 nm이고, 방출 파장은 420 nm이다.
크로마토그램의 트레이스 1("1")은 엑소글리코시다제를 사용하지 않고 철야 배양된 한세눌라(Hansenula) 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 나타낸다. 트레이스 2("2")는 α1-2 만노시다제와 함께 Man-9를 철야 배양한 후 한세눌라(Hansenula) 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 3 및 4 ("3" 및 "4")는 α-만노시다제와 함께 1시간 및 철야 배양한 후 한세눌라(Hansenula) 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 5 ("5")는 α- 및 β-만노시다제와 함께 철야 배양한 후 한세눌라(Hansenula) 생산된 E1으로부터 유래된 올리고당의 용출을 도시한다. 트레이스 1-5는 겹쳐서 표시되는데, 이것은 이들의 각각의 기준선이 0 수준이 아니기 때문이다. 트레이스 6 ("6")은 적용된 용매구배를 도시한다.
도의 상단에 글자 A 내지 K로 표시한 피이크는 다음을 의미한다: A, 치토바이오스; B, 4'-β-만노실-치토바이오스; C, Man-2; D, Man-3; E, Man-4; F, Man-5; G, Man-6; H, Man-7; I, Man-7; J, Man-8; 및 K, Man-10. 실시예 26 또한 참조.
도 67. 한세눌라(Hansenula)에 의해 및 HCV-재조합 백시니아 바이러스 감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 E1 단백질의 SDS-PAGE 분석 및 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색.
레인 1: 좌측에 나타낸 분자량을 갖는 분자량 마커; 레인 2: 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에 의해 생산된 알킬화 E1 (10 ㎍); 레인 3: 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에 의해 생산된 알킬화된 E1 (5 ㎍); 레인 4: 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에 의해 생산된 알킬화된 E1 (2.5 ㎍); 레인 5: HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 베로(vero) 세포에 의해 생산된 알킬화된 E1 (10 ㎍); 레인 6: HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 베로(vero) 세포에 의해 생산된 알킬화된 E1 (5 ㎍); 레인 7: HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 베로(vero) 세포에 의해 생산된 알킬화된 E1 (2.5 ㎍). 실시예 27 또한 참조.
도 68. 글리코실 제거된 단백질의 트립신 단편(박스로 표시한 서열)을 나타내는 HCV E2-H6 단백질의 서열(서열번호: 5). 글리코실화된 Asn-잔기는 PNGase F 효소에 의해 Asp-잔기로 전환되며 이는 서열하에서 "*"로 표시한다. Asn-잔기는 Asp-N 엔도프로테이나제(endoproteinase)에 의해 단백질 분해되기 쉽다. E2-H6에서 가능한 N-글리코실화 부위는 HCV 폴리단백질내 번호에 따른 N417, N423, N430, N448, N478, N532, N540, N556, N576, N623및 N645이다; 이들 부위는 도면에서 N34, N40, N47, N65, N95, N149, N157, N173, N193, N240및 N262번호로 되어 있다. 실시예 28 또한 참조.
발명의 요지
본 발명의 제1 요지는 진핵생물 세포에서의 발현산물이고 또 N-글리코실화 부위의 평균 80% 까지가 코어-글리코실화되어 있는 것을 특징으로 하는 한개 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다. 특히, 상기 코어-글리코실화 부위의 70% 이상이 글리코실화되고 올리고만노오스는 Man(8-10)-GlcNAc(2)에 의해 정의된 구조를 갖는다. 또한, Man(8)GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 대한 Man(7)GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스의 비율은 0.45 미만 또는 0.45 이다. 보다 자세하게는, 상기 올리고만노오스는 10% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유한다. 상기 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 발현하는 진핵생물 세포는 한세눌라(Hansenulla) 세포와 같은 효모 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 요지는 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 결합된 조류의 리소짐(lysozyme) 리더 펩티드 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 단백질로부터 유래한 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 상기 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 하기 구조식을 특징으로 하는 단백질로부터 유래된다:
CL-[(Al)a-(PS1)b-(A2)c]-HCVENV-[(A3)d-(PS2)e-(A4)f]
식중에서,
CL은 조류의 리소짐 리더 펩티드 또는 그의 기능적 등가물이고,
A1, A2, A3 및 A4는 상이하거나 동일할 수 있는 어댑터(adptor) 펩티드이며,
PS1 및 PS2는 상이하거나 동일할 수 있는 가공 부위이고,
HCVENV는 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부이며,
a, b, c, d, e 및 f는 0 또는 1이고, 또
경우에 따라, A1 및/또는 A2는 PS1의 일부이고 및/또는 A3 및/또는 A4는 PS2의 일부이다.
본 발명의 다른 요지는 단량체, 동종이합체, 이종이합체, 동종-올리고머 및 이종-올리고머로 구성되 군으로부터 선택된 구조에 포함되는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편을 포함한다. 다르게는, 본 발명에 따른 상기 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편은 바이러스-유사 입자를 포함한다. 보다 자세하게는, 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편은 시스테인 티올기가 화학적으로 수식된 시스테인을 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 요지는 항원성 또는 면역원성이고 및/또는 T-세포 자극 항원결정부위를 포함하는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 요지는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있으며 또 의약 또는 백신일 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편을 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 방법은,
(i) 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를, HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부와 항-HCV 항체의 복합체 형성을 허용하는 조건하에서 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플과 접촉시키는 단계,
(ii) (i)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계, 및
(iii) (ii)으로부터 상기 샘플에서 항-HCV 항체의 존재를 유추하는 단계를 포함하는, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플에서 항-HCV 항체의 존재를 검출하는 방법이다.
보다 자세하게는, 상기 방법은 상기 접촉이 경쟁 조건하에서 생기는 단계(i)를 포함할 수 있다. 특히 상기 방법은 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부가 부착되어 있는 고형 지지체를 이용할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플에서 항-HCV 항체의 존재를 검출하기 위한 진단 키트에도 관한 것이다. 보다 자세하게는, 상기 키트는 고형 지지체에 부착된 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 의약 또는 백신에도 관한 것이다.
본 발명에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부 및 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는 포유동물에서 HCV-특이적 면역반응을 유발하는 약제학적 조성물도 본 발명에 포함된다. 이러한 약제학적 조성물은 예방적 조성물 또는 치료적 조성물일 수 있다. 특히, 상기 포유동물은 인간이다.
발명의 상세한 설명
본 발명에 따른 실시에서, 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris) 및 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 글리코실화된 HCV 엔빌로프 단백질의 발현은 상기 HCV 엔빌로프 단백질을 상기 HCV 엔빌로프 단백질에 결합된 시그널 펩티드 서열을 포함하는 단백질로서 발현하는 것에 의해 가능함이 밝혀졌다. 그러나 이들 세 개 효모 종에서 발현된 HCV 엔빌로프 단백질의 글리코실화 패턴은 아주 상이하다 (실시예 6, 10, 13 및 25 참조). 보다 자세하게는, 에스.세레비시아애(S. cerevisiae) (글리코실화 결핍 돌연변이체)- 및 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)-발현된 HCV 엔빌로프 단백질은 코어-글리코실화 유사한 방식으로 글리코실화되었다. 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 발현된 HCV 엔빌로프 단백질은 상기 효모에서 발현된 단백질은 보통 초글리코실화되지 않는다(Gellissen 등 2000, Sugrue 등 1997)는 이전의 보고에도 불구하고 초글리코실화되었다.
에스.세레비시아애(S. cerevisiae) (글리코실화 결핍 균주), 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha) 및 HCV-재조합 백시니아 바이러스 감염된 포유동물 세포에서 생산된 HCV 단백질의 글리코실화 패턴을 더욱 분석하면, 놀랍게도 한세눌라(Hansenula) 생산된 HCV 엔빌로프 단백질은 HCV 엔빌로프 단백질의 진단,예방 및 치료용으로 아주 유리한 글리코실화 패턴을 나타낸다는 것이 밝혀졌다 (실시예 21-24 및 26-29 참조). 이러한 예상치 못한 발견은 이하에 기재한 본 발명의 상이한 요지 및 실시예에 반영되어 있다.
본 발명의 제1 요지는 진핵생물 세포에서의 발현산물이고 또 N-글리코실화 부위의 평균 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80% 까지가 코어-글리코실화되어 있는 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상의 N-글리코실화 부위는 Man(8-10)-GlcNAc(2)로 정의된 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 글리코실화된다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, Man(8)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위에 대한 Man(7)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위의 비율은 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 또는 0.50 이하이다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, 상기 올리고만노오스는 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유한다.
"Man(8-10)-GlcNAc(2)에 의해 정의된 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해글리코실화된 N-글리코실화 부위"는 상기 N-글리코실화 부위가 1개의 Man(8)-GlcNAc(2), Man(9)-GlcNAc(2) 또는 Man(10)-GlcNAc(2)에 의해 글리코실화됨을 의미한다.
2개의 단백질에서 동일한 N-글리코실화 부위는 상이한 올리고만노오스에 의해 점유될 수 있다는 것은 분명하다.
용어 "단백질"은 아미노산의 중합체를 지칭하며 특정 길이의 생성물을 의미하지 않는다; 따라서 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드는 단백질의 정의내에 포함된다. 이 용어는 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등과 같은 단백질의 발현후 수식을 지칭하거나 또는 배제하지 않는다. 예컨대 아미노산(예컨대 비천연 아미노산, PNA 등 포함)의 1개 이상의 유사체를 함유하는 폴리펩티드, 치환된 결합 뿐만 아니라 천연산출 또는 비-천연산출의 당업계에서 공지된 다른 수식을 갖는 폴리펩티드도 상기 정의에 포함된다.
본 명세서에서 "프리-프로-단백질" 또는 "프리-단백질"은 목적하는 단백질에 결합된 프리-프로-서열을 포함하는 단백질 또는 목적하는 단백질에 결합된 프로-서열을 포함하는 단백질을 의미한다. "프리-서열"에 대한 다른 예로서, 용어 "시그널 서열", "시그널 펩티드", "리더 펩티드" 또는 "리더 서열"이 사용된다; 이들은 모두 (N)-글리코실화에 대한 전제조건인 조면 소포체(ER)에 대한 프리-단백질을 목표로하는 아미노산 서열을 지칭한다. "시그널 서열", "시그널 펩티드", "리더 펩티드" 또는 "리더 서열"은 시그널 펩티다제로 불리는 숙주 특이적 프로테아제에 의해 상기 ER의 간극 측상에서 목적하는 단백질에 결합된 시그널 서열을 포함하는 단백질로부터 제거된다. 마찬가지로, 프리-프로-단백질은 ER의 루멘으로 전위시킬 때 프로-단백질로 전환된다. "프로"아미노산 서열의 성질에 따라서, 프리-프로-단백질을 발현하는 숙주 세포에 의해 제거될 수 있거나 제거될 수 없다. 공지된 프리-프로-아미노산 서열은 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) α 메이팅 인자의 α 메이팅 인자 프리-프로-서열이다.
"HCV 엔빌로프 단백질"은 HCV E1 및 HCV E2 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 의미하며, 상기 단백질은 임의의 유전형의 HCV 균주로부터 유도될 수 있다. 보다 자세하게는, HCVENV는 아미노산 서열이 90% 이상 서로 동일한 서열번호 85 내지 98 및 그의 단편으로 구성된 아미노산 서열군으로부터 선택된다. "동일한" 아미노산은 상술한 바와 같이 보존되는 아미노산 군, 즉 Met, Ile, Leu 및 Val로 구성된 군; Arg, Lys 및 His로 구성된 군; Phe, Trp 및 Tyr로 구성된 군; Asp 및 Glu로 구성된 군; Asn 및 Gln로 구성된 군; Cys, Ser 및 Thr로 구성된 군; 및 Ala 및 Gly로 구성된 군으로 간주된다.
보다 자세하게는, 용어 "HCV 엔빌로프 단백질"은 글리코실화 부위 이외에 E1 또는 E2 영역의 한 개 이상의 HCV 항원결정부위를 정의하는 아미노산 서열(및/또는 아미노산 유사체)를 포함하는 폴리펩티드 또는 그의 유사체(예컨대 미모토프)에 관한 것이다. 이들 엔빌로프 단백질은 재조합적으로 발현되는 엔빌로프 단백질의 단량체, 헤테로-올리고머 또는 동종-올리고머 형태일 수 있다. 전형적으로, 항원결정부위를 규정하는 서열은 HCV의 E1 또는 E2 영역의 아미노산 서열에 상응한다(동일하거나 또는 항원결정부위를 파괴하지 않는 천연 아미노산 잔기의 유사체의 치환을 통하여).
HCV 항원결정부위는 글리코실화 부위와 동일한 위치에 있을 수 있음이 알려져 있다.
일반적으로, 항원결정부위를 규정하는 서열은 3 또는 4개 아미노산 서열 길이, 보다 전형적으로 5, 6 또는 7개 아미노산 길이, 보다 전형적으로 8 또는 9개 아미노산 길이, 더욱 전형적으로 10개 이상의 아미노산 길이이다. 입체적 항원결정부위의 경우, 항원결정부위를 규정하는 서열의 길이는 다양할 수 있는데, 이는 이들 항원결정부위가 항원의 3차원 형상에 의해(예컨대 접힘현상) 형성되기 때문이라고 사료된다. 따라서, 항원결정부위를 규정하는 아미노산은 비교적 개수가 적을 수 있지만, 분자의 길이를 통하여 다양하게 분포되어 접힘현상을 통하여 정확한 항원결정부위 입체로 될 수 있다. 항원결정부위를 규정하는 잔기 사이의 항원 부분은 항원결정부위의 입체 구조에 중요하지 않을 수 있다. 예컨대, 이들 개제 서열의 결실 또는 항원결정부위 입체에 중요한 서열(예컨대 디술피드 결합, 글리코실화 부위에 관여되는 시스테인)이 유지되는 한 항원결정부위 입체에 영향을 주지 않을 수 있다. 입체적 항원결정부위는 동종-올리고머 또는 이종-올리고머의 서브유닛의 2개 이상의 필수 영역에 의해 형성될 수 있다.
본 명세서에서는, 지정된 폴리펩티드의 항원결정부위는 지정된 폴리펩티드에 있는 항원결정부위와 동일한 아미노산 서열을 갖는 항원결정부위 및 그의 면역학적 등가물을 의미한다. 이러한 등가물은 균주, 서브타입(=유전형), 또는 타입(그룹) 특이적 변이체를 포함하며, 예컨대 현재 공지된 서열 또는 균주는 유전형 1a, 1b,1c, 1d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4i, 4j, 4k, 4l, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a, 11 (및 그의 서브타입), 12 (및 그의 서브타입) 또는 13(및 그의 서브타입) 또는 다른 새롭게 정의된 HCV (서브)타입에 속한다. 항원결정부위를 구성하는 아미노산은 선형 서열의 일부가 아닐 수 있지만, 임의 개수의 아미노산에 의해 산재될 수 있으므로, 입체적 항원결정부위를 형성할 수 있음을 주목해야한다.
본 발명의 HCV 항원은 HCV의 E1 및/또는 E2 (엔빌로프) 도메인으로부터의 입체적 항원결정부위를 포함한다. 바이러스성 엔빌로프 단백질에 상응하는 E1 도메인은 현재 HCV 폴리단백질의 아미노산 192-382에 걸쳐 존재하는 것으로 추정된다 (Hijikata 등, 1991). 포유동물 계에서 발현되면(글리코실화되면), SDS-PAGE에 의해 결정된 바와 같이 약 35 kDa의 분자량을 가질 것이다. 전에는 NS1로 불린 E2 단백질은 HCV 폴리단백질의 아미노산 384-809 및 384-746에 걸쳐 존재(Grakoui 등, 1993)하고 엔빌로프 단백질인 것으로 예상된다. 백시니아 계에서 발현되면(글리코실화되면), 약 72 kDa의 겔 분자량을 가질 것으로 생각된다. 이들 단백질 종점은 근사치임을 이해해야한다(예컨대 아미노산 730, 735, 740, 742, 744, 745, 바람직하게는 746, 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820에서 끝남). E2 단백질은 E1, 및/또는 코어(aa 1-191), 및/또는 P7 (aa 747-809), 및/또는 NS2 (aa 810-1026), 및/또는 NS3 (aa 1027-1657), 및/또는 NS4A (aa 1658-1711) 및/또는 NS4B (aa 1712-1972) 및/또는 NS5A (aa 1973-2420), 및/또는 NS5B (aa 2421-3011), 및/또는 E2와는 상이한 HCV 단백질의 임의 부분과 함께 발현될 수 있다. 마찬가지로, E1 단백질은 또한 E2, 및/또는 코어(aa 1-191), 및/또는 P7 (aa 747-809), 및/또는 NS2 (aa 810-1026), 및/또는 NS3 (aa 1027-1657), 및/또는 NS4A (aa 1658-1711) 및/또는 NS4B (aa 1712-1972), 및/또는 NS5A (aa 1973-2420), 및/또는 NS5B (aa 2421-3011), 및/또는 E1과는 상이한 HCV 단백질의 일부와 함께 발현될 수 있다. 이들 HCV 단백질과의 발현은 정확한 단백질 접힘현상을 얻는데 중요할 수 있다.
본 명세서에 사용한 용어 "E1"는 천연 E1과 면역학적으로 교차반응하는 유사체 및 절단된 형태를 포함하며 또 유전형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13의 E1 단백질 또는 다른 새롭게 동정된 HCV 유형 또는 서브유형을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "E2"는 천연 E2와 면역학적으로 교차반응하는 유사체 및 절단된 형태를 포함하며 또 유전형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13의 E2 단백질 또는 다른 새롭게 동정된 HCV 유형 또는 서브유형을 포함한다. 예컨대 코돈 383과 384 사이에 복수의 코돈을 삽입하는 것 뿐만 아니라 아미노산 384-387의 결실이 카토 등(1992)에 의해 보고되어 있다. 따라서, 본 발명의 실시예 부분에서 사용된 분리물은 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니며 또 유형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13으로부터의 HCV 분리물 또는 새로운 유전형의 HCV는 본 발명을 실시하기 위한 E1 및/또는 E2 서열의 적합한 공급원이라는 것을 알 수 있다. 유사하게, 상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질과 함께 발현되는 HCV 단백질은 임의의 HCV 유형으로부터 유도될수 있고, 또한 본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질과 동일한 유형으로부터 유도될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "E1/E2"는 하나 이상의 E1 성분 및 하나 이상의 E2 성분을 함유하는 엔빌로프 단백질의 올리고머 형태를 지칭한다.
용어 "특정 올리고머" E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 엔빌로프 단백질은 응집되지 않는 재조합적으로 발현된 E1 및/또는 E2 엔빌로프 단백질의 모든 가능한 올리고머 형태를 지칭한다. E1 및/또는 E2 특정 올리고머 엔빌로프 단백질은 또한 동종-올리고머 E1 또는 E2 엔빌로프 단백질(이하 참조)로도 불린다. 용어 "단일 또는 특정 올리고머성" E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 엔빌로프 단백질은 단일 단량체성 E1 또는 E2 단백질(엄밀한 단어 의미대로의 단일함) 뿐만 아니라 특정 올리고머성 E1 및/또는 E2 및/또는 E1/E2 재조합적으로 발현된 단백질을 지칭한다. 본 발명에 따른 이들 단일 또는 특정 올리고머성 엔빌로프 단백질은 화학식 (E1)x(E2)y에 의해 더욱 정의될 수 있으며, 이때 x는 0 내지 100의 수일 수 있고, 또 y는 0 내지 100의 수일 수 있으며, 단 x 및 y는 동시에 0이 아니다. x =1 및 y = 0일 때 상기 엔빌로프 단백질은 단량체성 E1을 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "동종-올리고머"는 1개 이상의 E1 또는 E2 단량체를 함유하는 E1 또는 E2의 복합체를 지칭하며, 예컨대 E1/E1 이합체, E1/E1/E1 삼합체 또는 E1/E1/E1/E1 사합체 및 E2/E2 이합체, E2/E2/E2 삼합체 또는 E2/E2/E2/E2 사합체, E1 펜타머 및 헥사머, E2 펜타머 및 헥사머 또는 더 높은 E1또는 E2의 동종-올리고머가 본 발명의 범위내의 "동종-올리고머"이다. 이들 올리고머는 본 출원인에 의해 출원된 WO 94/25601호 및 WO96/13590호에서 Maertens 등에 의해 기재된 바와 같은 것을 비롯한 C형 간염 바이러스의 상이한 유형 또는 서브타입으로부터 얻은 1개, 2개 또는 몇 개의 상이한 E1 또는 E2 단량체를 함유할 수 있다. 이러한 혼합된 올리고머는 본 발명의 범위내에 속하는 동종-올리고머이며 또 HCV의 보다 일반적인 진단, 예방 또는 치료를 허용한다.
본 발명에서 사용된 E1 및 E2 항원은 전체 길이의 바이러스성 단백질, 그의 실질적으로 전체 길이 버전 또는 그의 기능적 단편(예컨대 하나 이상의 항원결정부위 및/또는 글리코실화 부위를 포함하는 단편)일 수 있다. 또한, 본 발명의 HCV 항원은 목적하는 입체적 항원결정부위의 형성을 차단하거나 방해하지 않는 다른 서열을 포함할 수 있다. 입체적 항원결정부위의 존재 또는 부재는 목적하는 항원을 항체(입체적 항원결정부위에 대한 폴리클로날 혈청 또는 모노클로날)를 사용하여 스크리닝하고 그의 반응성을, 선형 항원결정부위만을 함유하는 변성버전 항원의 반응성과 비교하는 것에 의해 용이하게 결정할 수 있다. 폴리클로날 항체를 사용한 이러한 스크리닝에서는, 변성된 항원을 사용하여 폴리클로날 혈청을 먼저 흡착한 다음 항체가 목적하는 항원을 함유하고 있는지를 조사하는 것이 바람직하다.
본 발명의 HCV 단백질은 글리코실화될 수 있다. 글리코실화된 단백질은 한 개 이상의 탄수화물 기, 특히 당기를 함유하는 단백질을 의미한다. 일반적으로, 모든 진핵생물 세포는 단백질을 글리코실화할 수 있다. HCV 유전형의 상이한 엔빌로프 단백질 서열을 정렬한 후, 적합한 접힘현상과 반응성을 위해 HCV E1 단백질상의 6개 글리코실화 부위 모두가 필요한 것은 아니다라는 것을 유추할 수 있다. 또한 위치 325에 있는 글리코실화 부위는 N-글리코실화에 의해 변형되지 않는다는 것도 알려져 있다(Fournillier-Jacob 등, 1996, Meunier 등 1999). 또한 HCV 서브타입 1b E1 단백질은 6개의 글리코실화 부위를 함유하지만, 이들 글리코실화 부위의 일부는 특정 다른 (서브)타입에는 존재하지 않는다. 4번째 탄화수소 모티프(Asn250)는 타입 1b, 6a, 7, 8 및 9에 존재하지만, 지금까지 공지된 다른 모든 타입에는 존재하지 않는다. 이러한 당-부가 모티프는 돌연변이되어 향상된 반응성을 갖는 타입 1b E1 단백질을 생성할 수 있다. 또한 타입 2b 서열은 V5 영역(Asn299상)에서 여분의 글리코실화 부위를 나타낸다. 유전형 2c에 속하는 분리물 S83은 V1 영역(Asn 상)에서 제1 탄수화물 모티프가 결여되어 있는 반면에, 모든 다른 분미물에는 존재한다(Stuyver 등 1994). 그러나, 완전히 보존된 당-부가 모티프중에서도, 탄수화물의 존재는 접힘현상에 반드시 필요한 것은 아니지만, 면역 감독의 기피에는 어떤 역할을 가질 수 있다. 따라서, 글리코실화의 역할의 확인은 글리코실화 모티프의 돌연변이에 의해 더욱 시험될 수 있다. 글리코실화 모티프(NXS 또는 NXT 서열)의 돌연변이는 N, S 또는 T에 대한 코돈을 돌연변이 유발시켜 N의 경우 그 코돈이 N과는 상이한 아미노산을 암호화하게하고, 및/또는 S인 경우 및 T인 경우 S 또는 T와 다른 아미노산을 암호화하게 한다. 다르게는, NPS 또는 NPT는 탄수화물에 의해 흔히 변형되지 않기 때문에 X 위치는 P로 돌연변이될 수 있다. 접힘현상 및/또는 반응성에 어떤 탄수화물 부가 모티프가 필요하고 필요하지 않은지를 확립한 후, 이러한 돌연변이의 조합을 실시할 수 있다. 이러한 실험은 Maertens 등에 의해 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 WO96/04385호의 실시예 8에 자세하게 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 글리코실화는 특별히 언급하지 않는 한 N-글리코실화를 의미한다.
특히, 본 발명은 코어-글리코실화되는 HCV 엔빌로프 단백질, 또는 그의 일부에 관한 것이다. 이와 관련하여, 용어 "코어-글리코실화"는 Herscovics 및 Orlean (1993)의 도 3에서 박스 구조로 나타낸 구조와 "유사한" 구조를 의미한다. 따라서, 탄수화물 구조는 10 내지 11개 단당류를 함유하는 것을 의미한다. 상기 기재내용은 참고문헌으로 본 명세서에 포함되어 있다. 용어 "유사한"은 4개 이하의 단당류가 구조에 부가되거나 또는 약 3개 이하의 단당류가 구조로부터 제거됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 말하는 코어-글리코실화 탄화수소 구조는 최소한 7개 단당류 및 최대한 15개 단당류로 구성되며 또 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개 단당류로 구성될 수 있다. 단당류는 바람직하게는 글루코오스, 만노오스 또는 N-아세틸 글루코사민을 의미할 수 있다.
본 발명의 다른 요지는 진핵생물 세포에서의 발현산물이며 N-글리코실화 부위의 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상이 Man(8-10)-GlcNAc(2)로 정의된 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 글리코실화되는 것을 특징으로 하는, 한 개 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에관한 것이다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, Man(8)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위에 대한 Man(7)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위의 비율은 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 또는 0.50 이하이다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, 상기 올리고만노오스는 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유한다.
본 발명의 또 다른 요지는 진핵생물 세포에서의 발현산물이며 N-글리코실화 부위가 올리고만노오스에 의해 점유되며, Man(8)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 대한 Man(7)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스의 비율이 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 또는 0.50 이하인 것을 특징으로 하는, 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다. 또한 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, 상기 올리고만노오스는 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유한다.
본 발명의 다른 요지는 비-포유동물 진핵생물 세포에서의 발현산물이며 N-글리코실화 부위의 개수가, 백시니아 바이러스로 감염되기 쉬운 진핵생물에서 백시니아 바이러스로부터 발현된 단백질 또는 그의 단편에 있는 N-글리코실화 부위의 개수보다 적어도 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% 또는 15% 미만인 것을 특징으로 하는 하나 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, 상기 N-글리코실화 부위의 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80%까지는 코어-글리코실화되어 있다. 보다 자세하게는, N-글리코실화 부위의 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상이 Man(8-10)-GlcNAc(2)로 정의된 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 글리코실화된다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, Man(8)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위에 대한 Man(7)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위의 비율은 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 또는 0.50 이하이다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, 상기 올리고만노오스는 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유한다.
본 발명의 다른 요지로서, 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 효모 세포에서 발현산물이다. 보다 자세하게는, 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 사카로마이세스 세레비시아애 (Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri) 또는 사카로마이세스 우바룸 (Saccharomyces uvarum)와 같은 사카로아이세스(Saccharomyces) 균주; 시조사카로마이세스 폼베 (Saccharomyces pombe)와 같은 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) 균주; 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)와 같은 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 균주; 야로비아 리폴리티카 (Yarowia lipolytica)와 같은 야로비아(Yarowia) 균주; 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)와 같은 한세눌라(Hansenula) 균주; 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 피치아(Pichia) 균주, 아스페르길루스(Aspergillus) 종; 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 뉴로스포라(Neurospora) 균주; 또는 슈바니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)와 같은 슈바니오마이세스(Schwanniomyces) 균주의 세포; 또는 이들로부터 유래한 돌연변이 세포에서의 발현산물이다. 보다 자세하게는, 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 한세눌라(Hansenula) 세포에서의 발현산물이다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 효모, 예컨대 투니카마이신과 같은 글리코실화 억제제가 존재하지 않는 한세눌라(Hansenula) 세포에서의 발현산물이다.
본 발명의 다른 요지로서, 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 결합된 조류의 리소짐 리더 펩티드 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 단백질로부터 유도된다. 보다 자세하게는, 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 하기 구조식으로 특징지워지는 단백질로부터 유도된다:
식중에서,
CL은 조류의 리소짐 리더 펩티드 또는 그의 기능적 등가물이고,
A1, A2, A3 및 A4는 상이하거나 동일할 수 있는 어댑터(adptor) 펩티드이며,
PS1 및 PS2는 상이하거나 동일할 수 있는 가공 부위이고,
HCVENV는 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부이며,
a, b, c, d, e 및 f는 0 또는 1이고, 또
경우에 따라, A1 및/또는 A2는 PS1의 일부이고 및/또는 A3 및/또는 A4는 PS2의 일부이다.
"HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부에 결합된 조류의 리소짐 리더 펩티드 또는 그의 기능적 등가물"은 상기 리더 펩티드의 C-말단 아미노산이 펩티드 결합을 통하여 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부의 N-말단 아미노산에 공유결합되는 것을 의미한다. 다르게는, 상기 리더 펩티드의 C-말단 아미노산은 펩티드 또는 단백질에 의해 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부의 N-말단 아미노산으로부터 분리된다. 상기 펩티드 또는 단백질은 상기 정의한 바와 같은구조를 가질 수 있다.
HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부에 결합된 조류의 리소짐 리더 펩티드 또는 그의 기능적 등가물을 포함하는 단백질로부터 목적하는 HCV 엔빌로프 단백질의 유도 또는구조를 특징으로 하는 단백질의 유도는 프리-단백질 단백질이 발현되어 있는 세포의 단백질 분해기전에 의해 생체내에서 실시될 수 있다. 보다 자세하게는, 조류의 리더 펩티드를 제거하는 것으로 구성된 단계는 바람직하게는 프리-단백질이 발현되어 있는 세포의 단백질 분해 기전에 의해 생체내에서 실시된다. 그러나, 상기와 같은 유도는 프리-단백질을 발현하는 세포로부터 및/또는 프리-단백질을 발현하는 세포가 생장하는 배양액으로부터 프리-단백질 및/또는 단백질을 분리 및/또는 정제한 후 및/또는 동안 시험관내에서 모두 실시될 수 있다. 다르게는, 상기 생체내 유도는 시험관내 유도와 조합되어 실시될 수 있다. 재조합적으로 발현된 프리-단백질로부터 목적하는 HCV 단백질을 유도하는 것은 가공 단계에서 단백질분해 효소를 사용하는 것을 더 포함할 수 있으며, 목적하는 단백질과 함께 존재하는 모든 또는 대부분의 오염 단백질은 분해되고 목적하는 단백질은 상기 가공성 단백질분해 효소에 견딘다. 유도와 가공과정은 서로 배타적인 과정이 아니며 동일한 단일의 단백질분해 효소를 사용하여 실시될 수 있다. 예로서 Lys-잔기가 부족한 HCV 유전형 1b(서열번호: 2)의 HCV E1 단백질을 들 수 있다. 상기 HCV E1 단백질을 함유하는 단백질 추출물을 엔도프로테이나제 Lys-C (endo-lys C)를 사용하여 분해시키는 것에 의해, E1 단백질은 분해되지 않는 반면에 1개 이상의 Lys-잔기를 함유하는 오염 단백질은 분해된다. 이러한 과정은 HCV E1 단백질의 분리 및/또는 정제를 현저히 단순화하거나 향상시킬 수 있다. 또한, 프리-단백질에 부가적인 Lys-잔기, 예컨대 리더 펩티드 및 HCV E1 단백질을 포함하는 것에 의해, HCV E1 프리-단백질로부터 리더 펩티드의 정확한 시험관내 분리를 할 수 있는 부가적 이점을 가질 수 있다. 다른 HCV E1 단백질은 위치 4, 40, 42, 44, 61, 65 또는 179 (위치 1은 E1 단백질의제1 N-말단 천연아미노산이고, 즉 HCV 폴리단백질중의 위치 192)의 1개 이상에서 Lys-잔기를 포함할 수 있다. 상술한 바와 같은 endo-lys C를 사용할 수 있기 위해서는, 상기 Lys-잔기는 다른 아미노산 잔기, 바람직하게는 Arg-잔기로 돌연변이될 수 있다.
"정확하게 제거된" 리더 펩티드는 고효율(즉 다수의 프리-(프로-)단백질이 (프로-)단백질로 전환됨) 및 고 적합도(즉, 프리-아미노산 서열이 제거될 뿐만 아니라 상기 프리-아미노산 서열에 결합된 목적하는 단백질의 아미노산도 제거됨)로 목적하는 단백질에 결합된 시그널 서열을 포함하는 단백질로부터 상기 리더 펩티드가 제거됨을 의미한다. "고 효율로 리더 펩티드를 제거"하는 것은 프리-단백질의 약 40% 이상, 더욱 바람직하게는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가, 프리-서열이 제거된 단백질로 전환됨을 의미한다. 다르게는, 발현된 프리-단백질의 일부가 프리-서열이 제거된 단백질로 전환되지 않으면, 이들 프리-단백질은 더욱 정제되거나 또는 정제하는 동안 제거될 수 있다.
"조류의 리소짐(CL) 리더 펩티드의 기능적 등가물"은 CL 리더 펩티드를 의미하며, 1개 이상의 아미노산은 다른 아미노산으로 치환되며 또 상기 치환은 보존적 아미노산 치환임을 의미한다. "보존적 아미노산 치환"은 보존되는 아미노산 군에 속하는 아미노산을, 보존되는 아미노산의 동일 군에 속하는 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 보존되는 아미노산 군으로서는 다음을 고려할 수 있다: Met, Ile, Leu 및 Val로 구성된 군; Arg, Lys 및 His로 구성된 군; Phe, Trp 및 Tyr로 구성된 군; Asp 및 Glu로 구성된 군; Asn 및 Gln로 구성된 군; Cys, Ser 및 Thr로 구성된 군; 및 Ala 및 Gly로 구성된 군. CL 리더 펩티드에서 보존적 아미노산 치환의 예는 위치 6에서의 자연적 변이이며, 상기 위치에서의 아미노산은 Val 또는 Ile이며; 다른 변이는 위치 17에서 생기며, 이 위치에서의 아미노산은 그 중에서 Leu 또는 Pro (서열번호: 1 참조) 이다. 생성한 CL 리더 펩티드는 기능적 등가물로 볼 수 있다. CL 리더 펩티드의 다른 기능적 등가물은, 결실 변이체 및 삽입 변이체를 비롯하여, 본 발명을 통하여 기재된 바와 같이 CL 리더 펩티드와 동일한 기술적 특징을 재현하는 리더 펩티드를 포함한다.
"A" 또는 "어댑터 펩티드"는 예컨대 리더 펩티드와 가공 부위(PS) 사이, 리더 펩티드와 목적하는 단백질 사이, PS와 목적하는 단백질 사이, 및/또는 목적하는 단백질과 PS 사이에서 링커로서 작용할 수 있거나; 및/또는 예컨대 리더 펩티드, PS 또는 목적하는 단백질의 링커 N- 또는 C-말단으로 작용할 수 있는 펩티드(예컨대 1 내지 30개 아미노산) 또는 단백질을 의미한다. 어댑터 펩티드 "A"는 특정 3차원 구조, 예컨대 α-나선형 또는 β-쉬트 구조 또는 이들을 조합한 구조일 수 있다. 다르게는, A의 3차원 구조는 잘 규정되지 않으며, 예컨대 코일드-코일 구조일 수 있다. 어댑터 A는 예컨대 프리-서열, 프로-서열, 목적하는 서열의 단백질 또는 가공 부위의 일부일 수 있다. 어댑터 A는 A가 일부인 단백질의 결실 및/또는 정제 및/또는 가공을 향상시키거나 가능하게 하는 태그(tag)로서 작용할 수 있다. A 펩티드의 일례는 his-tag 펩티드 (HHHHHH; 서열번호: 63) Hn이며, n은 6이지만, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12일 수 있다. A-펩티드의 다른 예는 펩티드 EEGEPK (WO 98/28429호에서 Kjeldsen 등; 서열번호: 64) 또는 EEAEPK (WO 98/28429호에서 Kjeldsen 등; 서열번호: 65)를 포함하며, 목적하는 단백질의 N-말단에 존재할 때는발효수율을 증가시키는 것으로 보고되어 있지만, 디펩티딜 아미노펩티다제에 의한 가공으로부터 목적하는 단백질의 N-말단을 보호하므로, 폴리펩티드의 균질한 N-말단을 초래할 수 있다. 동시에, 목적하는 단백질의 시험관내 성숙, 즉 상기 펩티드 EEGEPK (서열번호: 64) 및 EEAEPK (서열번호: 65)를 목적하는 단백질로부터 제거하는 것은 상기 펩티드내의 Lys-잔기의 C-말단을 분해하는 엔도-lys C를 사용함으로써 달성할 수 있다. 따라서 상기 펩티드는 어댑터 펩티드(A) 뿐만 아니라 가공 부위(PS)의 작용도 한다 (이하 참조). 어댑터 펩티드는 서열번호: 63-65, 70-72 및 74-82에 기재되어 있다. 어댑터 펩티드의 다른 예는 G4S 면역침묵(immunosilent) 링커이다. 어댑터 펩티드 또는 어댑터 단백질의 다른 예는 Stevens (Stevens 등 2000)의 표 2에 수록되어 있다.
"PS" 또는 "가공부위"는 특정 단백질 가공 또는 가공가능한 부위를 의미한다. 상기 가공은 효소적으로 또는 화학적으로 생길 수 있다. 특정 효소적 가공되기 쉬운 가공부위의 예는 IEGR↓X (서열번호: 66), IDGR↓X (서열번호: 67), AEGR↓X (서열번호: 68)을 포함하며, 이들은 모두 Arg 및 Xaa (임의 아미노산) 잔기 사이에 "↓"로 표시한 바와 같이 소의 인자 Xa 프로테아제(나가이, 케이 및 토게르센, 에이치.씨. 1984)에 의해 인식되어 분해된다. PS 부위의 다른 예는 이염기성 부위, 예컨대 Arg-Arg, Lys-Lys, Arg-Lys 또는 Lys-Arg이며, 효모 Kex2 프로테아제에 의해 분해될 수 있다(Julius, D 등 1984). PS 부위는 단염기성 Lys-부위일 수 있다. 상기 단염기성 Lys-PS-부위는 A 펩티드의 C-말단에 포함될 수 있다. C 말단의 일염기성 Lys-PS-부위를 포함하는 A 어댑터 펩티드의 예는 서열번호: 64-65 및74-76에 기재되어 있다. His-tag (HHHHHH; 서열번호: 63)의 엑소단백질분해 제거는 디펩티딜 아미노펩티다제 I(DAPase)를 단독 사용하거나 또는 글루타민 시클로트랜스퍼라제(Qcyclase 제조) 및 피로글루타민 아미노펩티다제 (pGAPase) (Pedersen, J 등 1999)와 조합하여 실시한다. 재조합 His-태그를 포함하는 상기 엑소펩티다제(고정 금속-치환성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 반응 혼합물로부터 펩티다제를 제거할 수 있음)는 유니자임 라보라토리스 (Hφrsholm, DK)에 의해 TAGZyme System으로서 시판되고 있다. "가공"은 일반적으로 가공 부위가 단백질에 존재할 때, 단백질을 하나 이상의 가공 부위에서 특이적으로 분해 또는 절단되는 방법 또는 과정을 의미한다. PS는 엔도프로테오리틱 분해되기 쉽거나 또는 상기 분해가 특이적일 때, 즉 단백질분해 효소를 가공하는 것에 의해 인식된 부위 이외의 부위로 확대되지 않는 엑소프로테오리틱 분해될 수 있다. 다수의 PS 부위가 서열번호: 66-68 및 83-84에 기재되어 있다.
상기 기재한 바와 같은구조의 다양성은 일부 실시예에 의해 예시할 수 있다. 일례로서, 상기 구조는 프리-단백질에 포함되어 있는 목적하는 단백질의 C-말단에 존재할 수 있고 또 A3은 인자 Xa "IEGRX" PS 부위(서열번호: 66)와 중복되는 "VIEGR" 펩티드 (서열번호: 69)이고 또 X = A4는 히스티딘-태그 (서열번호: 63)(이때, d, e 및 f는 상기 경우 모두 1임)이다. 목적하는 HCV 단백질은 경우에 따라 IMAC에 의해 정제될 수 있다. 인자 Xa로 가공한 후, (경우에 따라 정제된) 목적하는 HCV 단백질은, 그의 C-말단에, 가공된 PS 부위, "IEGR"(서열번호: 70)을 가질 것이다. 변이체 가공된 인자 Xa 가공부위는 IDGR(서열번호: 71) 또는 AEGR (서열번호: 72)일 수 있다. 다른 예로서,구조는 목적하는 HCV 단백질의 N-말단에 존재한다. 또한 A1은 히스티딘-태그(서열번호: 63)이고, PS는 인자 Xa 인식 부위 (임의의 서열번호: 66-68)이며, X는 목적하는 단백질이고, a=b=1 및 c = 0 이다. 숙주세포에 의해 리더 펩티드를 정확히 제거할 때, 생긴 목적하는 HCV 단백질은 IMAC(임의적)에 의해 정제될 수 있다. 인자 Xa를 사용하여 가공한 후, 목적하는 단백질은구조를 갖지 않을 것이다.
A1, A2, A3, A4, PS1 및 PS2는 존재하는 경우, 반복 구조로 존재함이 분명하다. 이러한 반복 구조는, 존재할 경우, 1로 카운트하며, 즉 A1이 2 반복체(A1-A1)로 생기더라도 a, b, c, d, e 또는 f는 1이다.
본 발명의 다른 요지는 시스테인 티올 기가 화학적으로 수식(修飾)된 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 다른 요지는 항원성인 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 더 다른 요지는 면역원성인 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 더 다른 요지는 T-세포 자극 항원결정부위를 포함하는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 더 다른 요지는 단량체, 동종이합체, 이종이합체, 동종올리고머및 이종올리고머로 구성된 군으로부터 선택되는 구조에 포함되는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 요지는 바이러스-유사 입자에 포함되는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다.
1개 이상의 시스테인 잔기를 포함하지만 바람직하게는 2개 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 상기 기재한 바와 같은 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부에서, 시스테인 티올 기는 화학적 또는 효소적 수단에 의해 비가역적으로 보호될 수 있다. 특히, 화학적 수단에 의한 "비가역적 보호" 또는 "비가역적 차단"은 알킬화, 바람직하게는 활성 할로겐, 에틸렌이민 또는 N-(요오도에틸)트리플루오로-아세트아미드와 같은 알킬화제를 사용하여 HCV 엔빌로프 단백질을 알킬화하는 것을 의미한다. 이와 관련하여, 시스테인 티올 기의 알킬화는 티올-수소를 (CH2)nR (n은 0, 1, 2, 3 또는 4이고 또 R = H, COOH, NH2, CONH2, 페닐 또는 그의 유도체임)에 의해 치환되는 것을 의미한다. 알킬화는 예컨대 활성 할로겐 X(CH2)nR (식중, X는 I, Br, Cl 또는 F와 같은 할로겐임)과 같이 당업자에게 공지된 방법에 의해 실시된다. 활성 할로겐의 예는 메틸요오다이드, 요오도아세트산, 요오도아세트아미드 및 2-브로모에틸아민이다. 알킬화의 다른 방법은 NEM (N-에틸말레이미드) 또는 비오틴-NEM, 그의 혼합물 또는 에틸렌이민 또는 N-(요오도에틸)트리플루오로아세트아미드의 사용을 포함하며, 그에 의해 -H가 -CH2-CH2-NH2(Hermanson, G. T. 1996)에 의해 치환된다. 본 명세서에 사용된 용어 "알킬화제"는 본 명세서에 기재한 바와 같이 알킬화를 실시할 수 있는 화합물을 지칭한다. 이러한 알킬화는 결국 수식된 시스테인을 초래할 것이고, 이것은 다른 아미노산을 모방할 수 있다. 에틸렌이민에 의한 알킬화는 구조적으로 유사한 리신을 초래하며, 그에 의해 트립신에 대한 새로운 분해 부위가 도입된다 (Hermanson, G.T. 1996). 유사하게, 메틸요오다이드의 사용은 메티오닌과 유사한 아미노산을 초래하는 반면, 요오도아세테이트 및 요오도아세트아미드를 사용하면 글루탐산 및 글루타민과 유사한 아미노산을 초래한다. 이와 비슷하게, 상기 아미노산은 바람직하게는 시스테인을 직접적으로 돌연변이시키는데도 사용된다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 HCV 엔빌로프 단백질의 하나 이상의 시스테인 잔기가 돌연변이되어 천연의 아미노산으로, 바람직하게는 메티오닌, 글루타민산, 글루타민 또는 리신으로 된 HCV 엔빌로프 단백질에도 관한 것이다. 용어 "돌연변이된"은 상기 아미노산을 암호화하는 핵산의 부위-특이적 돌연변이, 즉 예컨대 PCR에 의한 부위-특이적 돌연변이 또는 (Sambrook, J. 등 1989)에 기재된 바와 같은 올리고뉴클레오티드-매개 돌연변이를 통하는 것과 같은 당업자에게 공지된 방법을 지칭한다. 본 발명의 실시예 부분의 경우 알킬화는 특별히 언급하지 않는 한 알킬화제인 요오도-아세트아미드를 사용하는 것을 의미함을 이해해야한다.
또한 정제과정에서, 본 발명의 HCV 단백질 또는 그의 일부의 시스테인 티올-기는 가역적으로 보호될 수 있음을 이해해야한다. 가역적 보호의 목적은 HCV 단백질 또는 그의 일부를 안정화시키기 위한 것이다. 특히, 가역적 보호 후 황-함유 기능적 기(예컨대 티올 및 디술피드)는 비-반응성 조건으로 유지된다. 황-함유 기능적 기는 다른 화합물과 반응할 수 없는데, 예컨대 다음과 같은 디술피드 결합을 형성하거나 변경하는 경향을 손실하였다:
티올 및/또는 디술피드 잔기 사이의 상기 반응은 분자상호간 과정에 한정되지 않지만, 분자내에서도 생길 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "가역적 보호" 또는 "가역적 차단"은 수식제를 시스테인 티올 기에 공유결합시키는 것 뿐만 아니라 HCV 단백질 자체의 환경을 조작하여 시스테인 티올-기의 산화환원 상태가 후속 정제단계를 통하여 영향을 받지 않고 유지되게하는(보호하는) 것을 의미한다. 시스테인 티올 기의 가역적 보호는 화학적으로 또는 효소적으로 실시할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "효소적 수단에 의한 가역적 보호"는 예컨대 아실 트랜스퍼라제와 같은 효소에 의해 매개되는 가역적 보호를 의미할 수 있으며, 상기 아실 트랜스퍼라제는 팔미토일 아실트랜스퍼라제와 같은 티오-에스테르화를 촉진하는데 관여한다(하기 내용 참조).
본 명세서에서 사용된 용어 "화학적 수단에 의한 가역적 보호"는 다음과 같은 가역적 보호를 고려할 수 있다:
1. 예컨대 술폰화 반응 및 티오-에스테르화 반응과 같은 시스테이닐을 가역적으로 수식시키는 수식제(modification agent)에 의함;
술폰화는 디술피드 브릿지에 관여하는 티올 또는 시스테인이 수식되어 S-술포네이트를 형성하는 반응이다: RSH → RS-SO3 -(Darbre, A. 1986) 또는 RS-SR → 2 RS-SO3 -(술피톨리시스; (Kumar, N. 등 1986)). 술폰화 시약은 예컨대 Na2SO3또는 나트륨 테트라티오네이트이다. 술폰화를 위한 후자 시약은 10-200 mM 농도, 보다 바람직하게는 50-200 mM의 농도로 사용된다. 경우에 따라 술폰화반응은 예컨대 Cu2+(100 μM-1mM) 또는 시스테인 (1-10 mM)과 같은 촉매 존재하에서 실시될 수 있다.
상기 반응은 단백질 변성조건 뿐만 아니라 천연 조건하에서 실시될 수 있다 (Kumar, N 등 1985, Kumar, N 등 1986). 티오에스테르 결합 형성 또는 티오-에스테르화 반응은 다음과 같이 특징지워질 수 있다:
RSH + R'COX → RS-COR'
(식중, X는 바람직하게는 화합물 R'CO-X에 있는 할로게나이드이다).
2. 예컨대 중금속, 특히 Zn2+, Cd2+, 모노-, 디티오- 및 디술피드 화합물 (예컨대 아릴- 및 알킬메탄티오술포네이트, 디티오피리딘, 디티오모르폴린, 디히드로리포아미드, 엘만 시약, 알드로티올TM(알드리히 제조) (Rein, A 등 1996), 디티오카르바메이트) 또는 티올화제 (예컨대 글루타티온, N-아세틸 시스테인, 시스테인아민)와 같은 본 발명의 시스테인을 가역적으로 수식시키는 수식제에 의함. 디티오카르바메이트는 술피드릴 기와의 반응성을 부여하는 R1R2NC(S)SR3작용기를 갖는 광범위한 범위의 분자를 포함한다. 티올 함유 화합물은 바람직하게는 0.1-50 mM 농도, 보다 바람직하게는 1-50 mM 농도, 더욱 바람직하게는 10-50 mM 농도로 사용된다.
3. 티올 상태를 보존하는(안정화시키는) 수식제, 특히 DTT, 디히드로아스코르베이트, 비타민 및 유도체, 만니톨, 아미노산, 펩티드 및 유도체(예컨대 히스티딘, 에르고티오네인, 카르노신, 메티오닌), 갈레이트, 히드록시아니솔, 히드록시톨루엔, 히드로퀴논, 히드록시메틸페놀 및 이들의 유도체와 같은 산화방지제가 10μM-10 mM 농도, 보다 바람직하게는 1-10 mM 농도로 존재하는 것에 의함.
4. 티올 안정화 조건에 의해, 예컨대 (i) 금속 이온(Zn2+, Mg2+), ATP와 같은 보조인자, (ii) pH 제어 (예컨대 대부분의 단백질의 경우 pH ~5 이거나 또는 pH는 바람직하게는 티올 pKa -2임; 예컨대 역상 크로마토그래피에 의해 정제된 펩티드의 경우는 pH ~2).
상기 (1), (2), (3) 및 (4)에 기재된 바와 같은 가역 보호를 조합하면 유사하게 순수하고 재구성된 HCV 단백질을 얻을 수 있다. 실제로, 예컨대 Z103 (Zn 카르노신)과 같은 조합 화합물은 바람직하게는 1-10 mM 농도로 사용될 수 있다. 가역보호는 또한 상기 기재한 바와 같은 수식기 또는 보호 이외에, 펩티드 주쇄를 파괴하지 않고 효소적으로 또는 화학적으로 가역적인 시스테이닐 보호방법을 의미함을 이해해야한다. 이와 관련하여, 본 발명은 특히 티오에스테르 결합이 티오에스테르분해효소 (티오에스테라제), 염기성 완충액 조건(Beekman, N, J. 1997)에 의해 또는 히드록실아민 처리(Vingerhoeds, M. H. 등 1996)에 의해 분해되는 전통적인 화학적 합성법(상기 기재)에 의해 제조된 펩티드를 주목하고 있다.
티올 함유 HCV 단백질은 예컨대 (1) 디술피드 결합을 함유하는 분해가능한 커넥터 아암(connector arm) [예컨대, 고정화된 5,5' 디티오비스(2-니트로벤조산) (Jayabaskaran, C. 등 1987) 및 활성화된 티올-세파로오스 4B (파마시아 제조)상에서의 공유결합 크로마토그래피] 또는 (2) 고정화된 리간드인 아미노헥사노일-4-아미노페닐아르신을 함유하는 친화성 크로마토그래피 수지상에서 정제될 수 있다. 후자 친화성 매트릭스는 단백질의 정제를 위해 사용되었고, 산화환원 조절 및 산화적 스트레스의 표적인 티올 단백질 처리된다 (Kalef, E. 등 1993).
가역적 보호는 펩티드의 용해화 및 추출을 증가시키기 위해 사용될 수 있다 (Pomroy, N.C. 및 Deber, C. M. 1998).
가역적 보호 및 티올 안정화 화합물은 단량체성, 중합체성 또는 리포좀 형태로 존재할 수 있다.
시스테인 잔기의 가역적 보호상태의 제거는 예컨대 다음과 같이 화학적으로 또는 효소적으로 실시될 수 있다:
- 1-200 mM의 농도, 보다 바람직하게는 50-200 mM 농도의 환원제, 특히 DTT, DTE, 2-머캅토에탄올, 디티오나이트, SnCl2, 붕소수소화나트륨, 히드록실아민, TCEP.
- 예컨대 pH증가에 의한 티올 안정화 조건 또는 티올안정화제의 제거.
- 0.01-5 μM의 농도, 더욱 특히 0.1-5 μM 농도 범위의 효소, 특히 티오에스테르 분해효소, 글루타르레독신, 티오레독신.
- 상기 기재한 화학적 및/또는 효소적 조건의 조합.
시스테인 잔기의 가역적 보호상태의 제거는 시험관내 또는 생체내에서, 예컨대 세포내 또는 개체내에서 실시될 수 있다.
정제 과정에서, 시스테인 잔기는 경우에 따라 비가역적으로 차단되거나 또는 상기 수록한 가역적 수식제에 의해 치환될 수 있다.
본 발명에 따른 환원제는 시스테인 잔기, 예컨대 "S-S" 디술피드 브릿지에 있는 황을 환원시키거나, 시스테인 잔기의 탈술폰화 (RS-SO3 -→ RSH)할 수 있는 물질이다. 산화방지제는 티올상태를 보존하거나 또는 "S-S"형성 및/또는 변경을 최소화시키는 물질이다. "S-S" 디술피드 브릿지의 환원은 화학적 반응이며, 그에 의해 디술피드는 티올 (-SH)로 환원된다. WO 96/04385호에서 Maertens 등에 의해 기재된 디술피드 브릿지를 파괴하는 물질 및 방법은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다. "S-S" 환원은 (1) 효소적 캐스케이드 경로에 의해 또는 (2) 화합물을 환원시키는 것에 의해 달성할 수 있다. 티오레독신, 글루타르레독신과 같은 효소는 디술피드의 생체내 환원에 관여하는 것으로 알려져 있으며 또한 시험관내에서 "S-S"브릿지를 환원시키는데 효과적으로 알려져 있다. 디술피드 결합은 pH 7.0에서, 환원된 티오레독신에 의해 신속하게 분해되며, DTT와의 반응에 대해 상응하는 속도상수보다 104배 더 큰 2차 속도로 분해된다. 환원 키네틱은 단백질 용액을 1 mM DTT 또는 디히드로리포아미드와 예비배양하는 것에 의해 현저하게 증가될 수 있다 (Holmgren, A. 1979). 단백질 디술피드 브릿지를 환원시킬 수 있는 티올 화합물은 예컨대 디티오트레이톨(DTT), 디티오에리트리톨 (DTE), β-머캅토에탄올, 티오카르바메이트, 비스(2-머캅토에틸)술폰 및 N,N'-비스(머캅토아세틸)히드라진 및 나트륨-디티오나이트이다. 모노클로날 항체에서 디술피드 브릿지의 환원에 아주 유용한 (Thakur, M. L. 등 1991) 것으로 알려져 있는 아스코르베이트 또는 염화주석(SnCl2)과 같은 티올기를 갖지 않는 환원제는 HCV 단백질의 환원에도 사용될 수 있다. 또한, pH값에서의 변화는 HCV 단백질의 산화환원 상태에 영향을 줄 수 있다. 붕소수소화나트륨 처리는 펩티드중의 디술피드 브릿지의 환원에 효과적인 것으로 드러났다 (Gailit, J. 1993). 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP)은 낮은 pH에서 디술피드를 환원시킬 수 있다 (Burns, J. 등 1991). 셀레놀은, DTT 또는 붕소수소화 나트륨이 환원제로 사용될 때, 디술피드가 티올로 환원되는 것을 촉진한다. 상업적으로 시판되는 디셀레나이드인 셀레노시스테아민은 촉매의 전구체로서 사용되었다 (Singh, R. 및 Kats, L. 1995).
용어 "면역원성"은 단백질 또는 물질이 면역반응을 유발할 수 있는 능력을 지칭한다. 면역반응은 항원의 도입에 대한 몸의 전체적 반응으로서, 항체 형성, 세포성 면역, 과민반응 또는 면역학적 내성을 포함한다. 세포성 면역은 T-헬퍼 세포 반응 및/또는 CTL-반응이라 칭한다.
용어 "항원성"은 단백질 또는 물질이 항체형성을 유발하거나 세포성 반응을 유도하는 능력을 지칭한다.
본 발명에 따른 표현 "T-세포 자극 항원결정부위"는 T-세포 또는 CTL-세포를 각각 자극할 수 있는 항원결정부위를 지칭한다. T-헬퍼 세포 자극 항원결정부위는 자신의 아미노산 서열에 (임의의) T-세포 자극 항원결정부위를 함유하는 폴리펩티드에 대한 림프증식성 반응을 모니터링하는 것에 의해 선택될 수 있다. 상기 림프증식성 반응은 환자혈청으로부터 얻은 말초혈액 단핵성 세포(PMBC)를 시험관내에서 T-세포 자극 활성에 대해 시험할 다양한 농도의 펩티드를 사용하여 자극시킨 다음 방사성표지된 티미딘 흡수량을 계산하는 것을 포함하는 T-헬퍼 에세이법에 의해 측정할 수 있다. CTL-자극 항원결정부위는51Cr 방출을 이용한 세포독성 세포의 용균(lytic) 활성을 측정하는 세포독성 T-세포 (CTL) 에세이법을 이용하여 선택할 수 있다. 자극지수(항원-자극된 배양액의 평균 cpm/대조용 배양액의 평균 cpm)가 1 이상, 바람직하게는 2 이상, 가장 바람직하게는 3 이상일 때 증식은 양성으로 간주된다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있고 또 의약 또는 백신일 수 있다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 의약 또는 백신을 포함한다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부 및 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 포유동물에서 HCV 특이적 면역반응을 유발하기 위한 약제학적 조성물을 포함한다. 본 발명에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 포유동물에서 HCV 특이적 항체를 유발할 수 있거나, 포유동물에서 T-세포 작용을 유발할 수 있다. 본 발명에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 상기 약제학적 조성물은 예방적 조성물 또는 치료적 조성물일 수 있다. 특정 구체예로서, 상기 포유동물은 사람이다.
"포유동물"은 사람을 비롯한 포유강(Mammalia)의 고등 척추동물로 이해되며, 출생, 체모 및 암컷에 유선세포를 갖고 있어서 어린애들을 먹이기 위한 젖을 분비하는 것을 특징으로 한다. 포유동물은 비인간 영장류 및 트리메라 마우스(Zauberman 등 1999)도 포함한다.
"백신" 또는 "의약"은 일부 또는 전면적이든 질병이든, 급성 또는 만성 질병이든 질병으로부터 보호할 수 있는 조성물이다; 백신 또는 의약은 예방적 백신 또는 의약일 수 있다. 백신 또는 의약은 이미 병에 걸린 개체의 치료에 유용하며, 이 경우 치료적 백신 또는 의약이라 불린다. 마찬가지로, 약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 조성물인 경우 예방적 및/또는 치료적 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질은 비오티닐화된 형태(WO 93/18054호에 설명됨)로 사용될 수 있거나 및/또는 뉴트랄라이트 아비딘(Neutralite Avidin) (미국오리건 유진에 소재하는 Molecular Probes Inc. 제조), 아비딘 또는 스트랩트아비딘에 착화될 수 있다. "백신" 또는 "의약"은 활성 물질 이외에, 그 자체로는 조성물을 받아들이는 개체에 유해한 항체 생산을 유발하지 않고 보호를 유발하지도 않는 적합한 부형제, 희석제, 담체 및/또는 보조제일 수 있는 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 보조제"를 포함할 수 있다. 적합한 담체는 전형적으로 단백질, 다당류, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 전형적으로 크고 느리게 대사되는 거대분자이다. 이러한 담체는 당업자에게 공지되어 있다. 조성물의 효과를 향상시키기 위한 바람직한 보조제는 다음을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다: 수산화알루미늄, WO 93/19780호에 기재된 바와 같은 3-O-데아실화된 모노포스포릴 지질 A와 조합된 알루미늄, WO 93/24148호에 기재된 인산알루미늄, 미국특허 4,606,918호에 기재된 N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민, N-아세틸-노르무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민, N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타밀-L-알라민 2-(1'2'디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)에틸아민, 모노포스포릴 지질 A를 함유하는 RIBI (ImmunoChem Research Inc. 제조, 미국 미네소타 해밀톤 소재), 해독된 엔도톡신, 트레할로오스-6,6-디미콜레이트 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 유제중의 세포벽 구조(MPL + TDM + CWS). 세 개 성분 MPL, TDM 또는 CWS의 어떤 것도 단독으로 또는 2개씩 조합될 수 있다. MPL은 RC-529로 불리는 그의 합성 유사체로 교체될 수 있다. 부가적으로, Stimulon (캠브릿지 바이오사이언스 제조, 미국 미네소타 와세스터 소재), SAF-1 (Syntex 제조) 또는 ISS (Dynavax 제조) 또는 CpG (Coley Pharmaceuticals 제조)와 같은 세균성 DNA-기제 보조제와 같은 보조제는 QS21 및 3-de-O-아세틸화 모노포스포릴 지질 A (WO 94/00153)의 조합물, 또는 MF-59 (Chiron 제조), 또는 폴리[디(카르복시라토페녹시)포스파젠] 기제 보조제 (Virus Research Institute 제조), 또는 Optivax (Vaxcel, Cythx 제조)와 같은 블록공중합체 기제 보조제 또는 Algammulin 및 GammaInulin (Anutech 제조)과 같은 이눌린-기제 보조제, 불완전 프로인드 보조제 (IFA) 또는 Gerbu 제제 (Gerbu Biotechnik 제조)와 같은 보조제도 사용될 수 있다. 완전 프로인드 보조제(CFA)는 비-인간 용도 및 연구 목적에 사용될 수 있다. "백신 조성물"은 또한 고유하게 비독성이고 비치료성인 부형제 및 희석제, 예컨대 물, 염수, 글리세롤, 에탄올, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질, 보존제 등을 더 함유할 수 있다. 전형적으로, 백신 조성물은 주사가능하게, 예컨대 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 주사는 피하주사, 근육내 주사, 정맥주사, 복강내주사, 지주막하 주사, 피내주사일 수 있다. 다른 형태의 투여는 이식, 좌약, 경구 섭취, 장내 적용, 흡입, 에어로졸화 또는 경비 분무 또는 점적투여를 포함한다. 주사하기 전, 액체 전색제상에서 용액 또는 액제 전색제중에서 현탁액으로 되기 적합한 고상 형태도 제조될 수 있다. 이러한 제제는 보조제 효과를 향상시키기 위하여 리포좀에 유화되거나 유제화될 수 있다. 폴리펩티드는 사포닌과 함께 면역자극 복합체(Immune Stimulating Complex), 예컨대 Quil A(ISCOMS)에 혼입될 수 있다. 백신 조성물은 유효량의 활성물질 뿐만 아니라 상술한 성분 이외의 것도 포함한다. 활성성분의 "유효량"은 단일 투여 또는 일련의 투여의 일부로서 그 양을 개체에게 투여하면 질병의 예방 또는 치료에 효과적이거나 또는 소망하는 효과를 유발하는데 효과적이라는 것을 의미한다. 이 양은 처리될 개체의 건강 및 신체적 조건, 처리될 개체의 분류학적 그룹 (예컨대 인간, 비인간 영장류, 영장류 등), 효과적인 면역반응에 도달하는 개별 면역 계의 능력, 소망하는 보호정도, 백신의 제형, 치료 의사의 평가, 감염 병원체의 균주 및 다른 관련 인자에 따라서 달라질 수 있다. 상기 양은 일반적인 실험을 통하여 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위내에 포함될 수 있다. 통상, 상기 양은 0.01 내지 1000 ㎍/투여, 보다 자세하게는 0.1 내지 100 ㎍/투여로 다양할 수 있다. 투여 처리는 단일 투여 스케쥴 또는 다중 투여 스케쥴일 수 있다. 백신은 다른 면역조절제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편을 제조하는 방법에도 관한 것이다.
HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 제조하는 방법은 예컨대 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 재조합 핵산 또는 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함하며, 상기 숙주 세포는 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 발현할 수 있다. 상기 방법은 또한 상기 숙주 세포를 적합한 배지에서 배양하여 상기 단백질의 발현을 얻고, 발현된 단백질을 상기 숙주 세포의 배양액으로부터 또는 상기 숙주 세포로부터 분리하는 것을 더 포함한다. 상기 분리는 (i) 카오트로픽제(chaotropic agent) 존재하에서 상기 숙주 세포를 용균시키거나, (ii) 분리된 단백질중에 있는 시스테인 티올 기를 가역적 또는 비가역적일 수 있게 화학적으로 수식시키거나 및 (iii) 헤파린친화성 크로마토그래피 처리하는 등 1개 이상을 포함할 수 있다.
"카오트로픽제"의 예는 염화 구아니디늄 또는 요소이다. 일반적으로, 카오트로픽제는 물의 수소결합 구조를 파괴할 수 있는 화학물질이다. 농축 용액에서, 이들은 소수성 효과를 감소시키기 때문에 단백질을 변성시킬 수 있다.
"재조합 핵산"은 재조합 효소 분해, PCR, 결찰, 탈인산반응, 인산화반응, 돌연변이, 이종 세포에서 발현을 위한 코돈의 개질과 같은 재조합 DNA 수법 조작의 하나 이상에 처리된 천연 또는 합성 기원의 핵산을 의미한다. 일반적으로, 재조합 핵산은 천연산출 핵산의 단편이거나 또는 천연적으로 관련이 없는 2개 이상의 핵산 단편을 포함하거나 또는 완전한 합성 핵산이다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드", "폴리핵산", "핵산서열", "뉴클레오티드 서열", "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드", "프로브" 또는 "프라이머"는 임의 길이 또는 형상의 중합체 형태 (예컨대 측쇄 DNA)의 뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 펩티드 뉴클레오티드 또는 로크(locked)된 뉴클레오티드, 또는 이들의 조합물을 지칭한다. 상기 용어는 또한 이중 가닥(ds) 및 단일가닥(ss) 폴리뉴클레오티드 뿐만 아니라 삼중가닥 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 용어는 메틸화, 고리화 및 "캡스"와 같은 공지 뉴클레오티드 수식 및 1개 이상의 천연산출 뉴클레오티드를 이노신과 같은 유사체 또는 HEG (헥에틸렌 글리콜)과 같은 비-증식성 단량체로의 치환을 포함한다. 리보뉴클레오티드는 NTP로 표시하고, 데옥시리보뉴클레오티드는 dNTP로 표시하며 또 디데옥시리보뉴클레오티드는 ddNTP로 표시한다.
뉴클레오티드는 일반적으로 방사선, 화학적발광, 형광적으로, 인광적으로 또는 적외선 염료에 의해 또는 표면향상된 라만 표지 또는 플라스몬 공명 입자(PRP)에 의해 표지될 수 있다.
상기 용어 "폴리뉴클레오티드", "폴리핵산", "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열", "핵산 분자", "올리고뉴클레오티드", "프로브" 또는 "프라이머"는 또한 펩티드 핵산(PNA), 주쇄가 당이 아니라 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위체로 구성된 슈도펩티드인 DNA 유사체를 포함한다. PNA는 DNA의 특징과 유사하고 상보적 핵산 가닥과 결합된다. PNA의 중성 주쇄는 보통 얻어지는 것 보다 더 강한 결합과 더 큰 특이성을 초래한다. 또한, PNA의 독특한 화학적, 물리적 및 생물학적 특성은 강력한 바이오분자 도구, 안티센스 및 항원제, 분자 프로브 및 바이오센서를 생성하기 위해 이용될 수 있다. PNA 프로브는 DNA 프로브보다 더 짧을 수 있고 또 일반적으로 6 내지 20개 염기 길이이며, 가장 최적인 길이는 12 내지 18개 염기 길이이다(Nielsen, P. E. 2001). 상기 용어는 또한 리보오스 고리가 2'-산소와 4'-탄소 사이의 메틸렌 결합에 의해 속박되는 RNA 유도체인 로크된 핵산(LNA)를 더 포함한다. LNA는 DNA 또는 RNA 표적 서열에 대하여 예상치 못한 결합 친화력을 나타낸다. LNA 뉴클레오티드는 올리고머화될 수 있고 또 키메라 또는 혼합-mer성 LNA/DNA 또는 LNA/RNA 분자에 혼입될 수 있다. LNA는 배양액에 대하여 비독성으로 보인다(Orum, H. 및 Wngel, J. 2001, Wahlestedt, C. 등 2000). 일반적으로, DNA, RNA, PNA 및 LNA의 키메라 또는 혼합-mer는 티민이 우라실로 치환된 임의의 어느 하나로 간주될 수 있다.
상기 내용으로부터, 본 발명은 본 발명에 따른 코어-글리코실화된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 본 발명에 따른 조성물의 HCV 백신 조성물 제조를 위한 용도에 관한 것임이 분명하다. 특히, 본 발명은 만성 HCV 보균자에서 HCV에 대한 면역성을 유발하기 위한 본 발명에 따른 코어-글리코실화된 HCV 엔빌로프 단백질의 용도에도 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 소량의 HCV 치료 약물 투여와 조합하거나 또는 조합하지 않고도, 공지된 인터페론 요법과 같은 다른 요법을 실시하기 전, 실시함과 동시에 또는 실시한 후, 만성 HCV 보균자에서 HCV에 대한 면역성을 유발하기 위한 상기 정의한 바와 같은 코어-글리코실화된 HCV 엔빌로프 단백질의 용도에 관한 것이다. 이러한 조성물은 간 이식전 또는 이식후 또는 예컨대 주사바늘 손상과 같은 예상할 수 있는 감염 후 이용될 수 있다.
본 발명의 다른 요지는,
(i) HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부가 항-HCV 항체와 복합체를 형성하게하는 조건하에서, 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 항-HCV 항체를 갖는 것으로 추정되는 샘플과 접촉시키는 단계,
(ii) (i)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계, 및
(iii) (ii)로부터 상기 샘플에 항-HCV 항체가 존재하는지를 유추하는 단계를 포함하는, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플중에서 항-HCV 항체의 존재를 검출하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시예로서, 상기 방법의 단계(i)에서의 접촉은 경쟁적 조건하에서 실시된다. 상기 방법에 대한 다른 특정 실시예로서, 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는그의 일부는 고형 지지체에 부착된다. 다른 실시예로서, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플은 생물학적 샘플이다.
본 발명의 다른 요지는 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플에서 항-HCV 항체의 존재를 검출하기 위한 진단 키트에 관한 것이다. 특정 실시예로서, 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 고형 지지체에 부착된다. 다른 실시예로서, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플은 생물학적 샘플이다.
본 명세서에 사용된 용어 "생물학적 샘플"은 개체로부터 분리된 조직 또는 체액 샘플이며, 예컨대 혈청, 플라즈마, 림프액, 피부의 외부 분비물, 호흡관, 내장 또는 생식기-비뇨기, 난모세포, 눈물, 타액, 우유, 혈액세포, 종양, 기관, 위장 분비, 점액, 척수액, 대변, 소변, 정자 등과 같이 외부로 분비되는 물질을 들 수 있고, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 HCV의 검출 및/또는 HCV의 유전자형 확정, HCV 질병의 진단/모니터링을 위한 면역에세이법과 같은 방법에 혼입되기에 적합하거나 또는 치료제로서 적합하다.
본 발명에 따른 면역에세이법과 같은 방법은 HCV에 의해 감염된 개체로부터 혈청에 있는 항체에 의해 확인되는 선형(펩티드인 경우) 및 입체적 항원결정부위를 유지하는 본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질을 이용한다. 본 발명의 HCV E1 및 E2 항원은 항체를 검출하기 위한 공지된 항원을 이용하는 임의의 에세이 포맷으로 이용될 수 있다. 물론, HCV 입체적 항원결정부위를 변성시키는 포맷은 피해야하거나또는 변경되어야한다. 이들 에세이법의 공통되는 특징은 항원이 성분중에 존재하는 항체와 결합하게하는 조건하에서 HCV 항체를 함유할 것으로 추정되는 체내 성분을 항원과 접촉시키는 것이다. 항원과 시편을 배양한 다음 항원으로 구성된 면역 복합체의 검출을 실시한다.
면역에세이법의 디자인은 다양하게 변화될 수 있으며, 많은 포맷이 당분야에 공지되어 있다. 실험방법은 예컨대 고형 지지체 또는 면역침전을 이용할 수 있다. 대부분의 에세이법은 라벨링된 항체 또는 폴리펩티드의 사용을 포함하며; 상기 라벨은 예컨대 효소적, 형광적, 화학발광적, 방사활성적 또는 염료 분자일 수 있다. 면역 복합체로부터의 신호를 증폭시키는 에세이법은 또한 공지되어 있다; 그 예는 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙트아비딘을 이용하는 에세이법, 및 ELISA 및 RIA 에세이법과 같은 효소-라벨링된 및 매개된 면역에세이법이다.
면역에세이법은 비제한적으로 이종 또는 동종 포맷일 수 있고 또 표준형 또는 경쟁형일 수 있다. 이종 포맷의 경우, 폴리펩티드는 전형적으로 고형 매트릭스 또는 지지체에 결합되어 배양후 폴리펩티드로부터 샘플의 분리를 촉진시킨다. 사용될 수 있는 고형 지지체의 예는 니트로셀룰로오스 (예컨대 막 또는 마이크로티터 웰 형태), 염화폴리비닐 (예컨대, 쉬트 또는 마이크로티터 웰), 폴리스티렌 라텍스 (예컨대, 비이드 또는 마이크로티터 플레이트), 폴리비닐리덴 플루오라이드 (ImmunolonTM으로 공지), 디아조화 종이, 나일론 막, 활성화된 비이드, 및 단백질A 비이드이다. 예컨대, Dynatech ImmunolonTM1 또는 ImmunolonTM2 마이크로티터 플레이트는 이종 포맷으로 사용될 수 있다. 항원 폴리펩티드를 함유하는 고형 지지체는 전형적으로 시험 샘플로부터 분리한 후 및 결합항체를 검출하기 전에 세척된다. 표준 및 경쟁 표맷은 당업계에 공지되어 있다.
동종 포맷의 경우, 시험 샘플은 용액에서 항원 조합과 배양된다. 예컨대, 형성된 항원-항체 복합체를 석출하는 조건하에서 실시된다. 이들 에세이에 대한 표준 및 경쟁적 포맷은 당업계에 공지되어 있다.
표준 포맷의 경우, 항체-항원 복합체에서 항-HCV 항원과 같은 항체의 양은 직접적으로 조절된다. 이것은 상기 항-HCV 항체와 같은 항체상의 항원결정부위를 인식하는 라벨링된 항-이종발생성(xenogeneic) (항-인간) 항체가 복합체 형성으로 인하여 결합되는지 여부를 결정하는 것에 의해 달성된다. 경쟁적 포맷의 경우, 샘플에서 상기 항-HCV 항체와 같은 항체의 양은 공지 양의 복합체중의 (라벨링된) 항체 (또는 기타 경쟁적 리간드) 또는 항원의 결합에 대한 경쟁적 효과를 조절하는 것에 의해 감소된다.
항원-항체 복합체는 포맷에 따라 다수의 공지 수법에 의해 검출될 수 있다. 예컨대, 복합체중의 항-HCV 항체와 같은 라벨링되지 않은 항체는 라벨(예컨대 효소 라벨)과 복합체를 이룬 항-이종발생성 Ig 콘쥬게이트를 사용하여 검출될 수 있다.
면역석출법 또는 응집 에세이 포맷에서, 항원과 항체 사이의 반응은 용액 또는 현탁액으로부터 석출되는 단백질 덩어리를 형성하며 석출물의 가시층 또는 필름을 형성한다. 항체가 시편 또는 샘플에 존재하지 않으면, 이러한 석출물은 형성되지 않는다.
입체적 항원결정부위로 구성된 본 발명의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 특정 부위는 상기 면역에세이법에 사용하기 위한 키트 형태로 팩케이지된다. 상기 키트는 별도의 용기에 천연 HCV항원, 대조 항체 제제(양성 및/또는 음성), 에세이 포맷이 동일한 신호 생성 시약(예컨대 효소 기질)을 필요로 할 때 라벨이 신호를 직접적으로 발생하지 않으면, 라벨링된 항체를 함유한다. 천연 HCV 항원은 고형 매트릭스에 이미 결합되어 있거나 매트릭스에 결합되기 위한 시약과 별도로 존재한다. 상기 에세이법을 실시하기 위한 지시사항(문헌, 테이프, CD-롬 등)은 키트에 포함되어 있다.
선택된 고상은 중합성 또는 유리 비이드, 니트로셀룰로오스, 마이크로입자, 반응 트레이의 마이크로웰, 시험 관 및 자기 비이드를 포함할 수 있다. 신호 발생 화합물은 효소, 발광 화합물, 발색물질, 방사성 요소 및 화학발광성 화합물을 포함할 수 있다. 효소의 예는 알칼리성 포스파타제, 꽃양배추 퍼옥시다제 및 베타-갈락토시다제를 포함한다. 인헨서 화합물의 예는 비오틴, 항-비오틴 및 아비딘을 포함한다. 인헨서 화합물 결합 막의 예는 비오틴, 항-비오틴 및 아비딘을 포함한다. 관절염 인자 유사 물질의 효과를 차단하기 위하여, 시험 샘플을 관절염 인자 유사 물질의 효과를 차단하기에 충분한 조건에 처리시킨다. 이들 조건은 시험 샘플을 다량의 항-인간 IgG와 접촉시켜 혼합물을 형성시킨 다음, 관절염 인자 유사 물질을 실질적으로 갖지 않는 반응 혼합물 생성물을 형성하기에 충분한 시간 및 조건하에서 상기 혼합물을 배양하는 것을 포함한다.
특히, 본 발명은 진단 키트를 제조하기 위한 본 발명에 따른 HCV 엔비로프 단백질 또는 그의 일부의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 코어-글리코실화된 HCV 엔빌로프 단백질은 면역원성이 높고 또 체액성 및 세포성 면역반응을 자극하기 때문에, 본 발명은 본 발명의 올리고머성 입자 또는 정제된 단일 HCV 엔빌로프 단백질을 포함하는 HCV 관련 T 세포 반응을 검출하기 위한 키트에 관한 것이다. HCV T 세포 반응은 WO 95/12677호에서 Leroux-Roels 등에 의해 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.
본 발명의 다른 요지는 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는 유효량의 본 발명에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 HCV 특이적 면역반응을 유발하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 상기 방법은 포유동물에서 HCV 특이적 항체를 유발하기 위해 또는 포유동물에서 특정 T-세포 작용을 유발하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 상기 투여는 예방적 목적, 즉 예방적 투여 또는 치료적 목적, 즉 치료적 투여일 수 있다.
본 발명의 다른 요지는 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 본 발명에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는 포유동물을 면역화시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 본 발명에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포유동물에 투여하는 것을 포함하는, HCV에 감염된 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.
상기 기재한 본 발명의 요지 또는 상기 요지에 특이적인 실시예는 진핵생물에서의 발현산물이고 2개의 상이한 HCV 엔빌로프 단백질에 대하여 상기 기재한 동일한 글리코실화 특성에 의해 특징지워지는 목적하는 단백질에도 적용된다.
보다 자세하게는, 본 발명은 진핵생물 세포에서의 발현산물이고 또 N-글리코실화 부위의 평균 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 또는 80% 까지가 코어-글리코실화되어 있는 것을 특징으로 하는, 한개 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다. 보다 자세하게는, N-글리코실화 부위의 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 이상은 N-글리코실화 부위가 Man(8-10)-GlcNAc(2)로 정의된 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 글리코실화된다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, Man(8)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위에 대한 Man(7)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위의 비율은 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 또는 0.50 이하이다. 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, 상기 올리고만노오스는 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%,6% 또는 5% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유한다.
본 발명의 다른 요지는 진핵생물 세포에서의 발현산물이며 N-글리코실화 부위가 올리고만노오스에 의해 점유되며, Man(8)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 대한 Man(7)-GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스의 비율이 0.15, 0.2, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.44, 0.45 또는 0.50 이하인 것을 특징으로 하는, 한개 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 관한 것이다. 또한 상기 N-글리코실화 특징에 대하여 더욱 자세하게는, 상기 올리고만노오스는 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6% 또는 5% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유한다.
특히, 상기 목적하는 분리된 단백질 또는 그의 단편은 한세눌라(Hansenula) 세포와 같은 효모 세포에서의 발현산물이다. 상기 목적하는 분리된 단백질 또는 그의 단편은 바이러스성 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편, 예컨대 HCV 엔빌로프 단백질 또는 HBV(B형 간염) 엔빌로프 단백질, 그의 단편이다. 다른 바이러스성 엔빌로프 단백질의 예는 HIV (인간 면역결핍 바이러스) 엔빌로프 단백질 gp120 및 플라비리데아애(Flavirideae)에 속하는 바이러스의 바이러스성 엔빌로프 단백질을 포함한다. 일반적으로, 상기 목적하는 분리된 단백질 또는 그의 단편은 본 발명의 N-글리코실화 특징을 필요로하는 단백질일 수 있다.
"HCV-재조합 백시니아 바이러스"는 HCV 단백질 또는 그의 일부를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 백시니아 바이러스를 의미한다.
본 명세서에 기재된 "HCV 엔빌로프 단백질로 형성된 HCV 바이러스-유사 입자", "HCV 엔빌로프 단백질로 형성된 올리고머 입자"는 스스로가 1 또는 2개의 E1 및/또는 E2 단량체로 구성되는 HCV E1 및/또는 E2 엔빌로프 단백질의 몇 개의 기본 단위를 함유하는 특정 성질 및 형상의 구조로 정의된다. 본 발명의 입자는 감염성 HCV RNA 게놈을 갖고 있지 않는 것으로 정의됨이 분명하다. 본 발명의 입자는 비어져 있을 수 있고 지질, 세제, HCV 코어 단백질 또는 보조제 분자가 혼입될 수 있는 엔빌로프 단백질의 쉘로 구성되는 구형입자의 고급 입자일 수 있다. 후자 입자는 아포리포단백질 B 또는 저밀도 리포단백질과 같은 리포좀 또는 아포리포단백질에 의해, 또는 특정 기관 또는 조직에 대해 입자를 표적화시키는 기타 수단에 의해 캡슐화될 수 있다. 상기 경우, 빈 구형 입자는 흔히 "바이러스-유사 입자" 또는 VLP라 칭한다. 다르게는, 고급 입자는 고상의 구형입자일 수 있으며, 완전한 구형은 HCV E1 또는 E2 엔빌로프 단백질 올리고머로 구성되며, 이때 지질, 세제, HCV 코어 단백질 또는 보조제 분자는 더욱 혼입될 수 있거나, 또는 다르게 리포좀 또는 아포리포단백질에 의해, 예컨대 아포리포단백질 B, 저밀도 리포단백질에 의해 또는 상기 입자를 특정 기관 또는 조직에 대하여 표적화하기 위한 다른 수단에 의해 캡슐화될 수 있다. 입자는 흔히 원형(하기 참조)이고 또 HCV 엔빌로프 단백질의 단일층 1개 이상을 함유하지 않는 소형 구조(상기 기재한 비워있거나 고형의 구형 구조)로 구성된다. 이러한 소형 입자의 전형적인 예는 적은 수의 HCV 엔빌로프 단백질, 흔히 4 내지 16개로 구성되는 장미모양 구조이다. 후자의 특정 예는 E1의 8 내지 10개 단량체를 함유하는 것으로 예시된 바와 같이 0.2% CHAPS중에서 E1으로 수득한 소형 입자를 포함한다. 이러한 장미모양 구조는 평면형으로 구성되며 원형,예컨대 바퀴 형태이다. 지질, 세제, HCV 코어 단백질 또는 보조제 분자는 부가적으로 혼입될 수 있거나, 또는 작은 입자가 리포좀 또는 아포리포단백질, 예컨대 아포리포단백질 B 또는 저밀도 리포단백질에 의해, 또는 상기 입자를 특정 기관 또는 조직에 대하여 표적화시키는 다른 수단에 의해 캡슐화될 수 있다. 더 작은 입자는유사한 적은 개수의 HCV E1 또는 E2 엔빌로프 단백질로 구성된 작은 구형 또는 글로불라 구조를 형성할 수 있고, 지질, 세제, HCV 코어 단백질, 또는 보조제 분자는 부가적으로 혼입되거나, 또는 리포좀 또는 아포리포단백질, 예컨대 아포리포단백질 B 또는 저밀도 리포단백질에 의해, 또는 상기 입자를 특정 기관 또는 조직에 대하여 표적화시키는 다른 수단에 의해 캡슐화될 수 있다. 상기 정의된 입자의 크기(즉, 입경)은 당업자에게 공지된 동적 광산란 수법(실시예 부분 참조)에 의해 측정된 바와 같이 보통 1 내지 100 nm, 보다 바람직하게는 2 내지 70 nm, 더욱 바람직하게는 2 내지 40 nm, 3 내지 20 nm, 5 내지 16 nm, 7 내지 14 nm 또는 8 내지 12 nm 이다.
특히, 본 발명은,
(i) HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 암호화하는 엔빌로프 유전자에 의해 형질전환된 한세눌라 (Hansenula) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 글리코실화 마이너스 균주를 적합한 배지에서 생장시키는 단계;
(ii) 상기 HCV E1 및/또는 HCV E2 유전자 또는 그의 일부를 발현시키는 단계; 및
(iii) 상기 코어-글리코실화된 HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 상기 세포 배양액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 면역에세이 또는 백신에서 사용하기 적합한 코어 글리코실화된 C형간염 바이러스 (HCV) 엔빌로프 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한,
(i) HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 암호화하는 엔빌로프 유전자에 의해 형질전환된 한세눌라 (Hansenula) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 글리코실화 마이너스 균주를 적합한 배지에서 생장시키는 단계;
(ii) 상기 HCV E1 및/또는 HCV E2 유전자 또는 그의 일부를 발현시키는 단계; 및
(iii) 형질전환된 숙주 세포를 용균시켜 상기 세포내 발현된 코어-글리코실화된 HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 정제하는 단계를 포함하는, 면역에세이 또는 백신에서 사용하기 적합한 코어 글리코실화된 C형간염 바이러스(HCV) 엔빌로프 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은,
(i) 2개 이상의 Cys-아미노산을 포함하는 HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 암호화하는 엔빌로프 유전자에 의해 형질전환된 한세눌라 (Hansenula) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 글리코실화 마이너스 균주를 적합한 배지에서 생장시키는 단계;
(ii) 상기 HCV E1 및/또는 HCV E2 유전자 또는 그의 일부를 발현시키는 단계; 및
(iii) 상기 Cys-아미노산이 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 가역적으로 보호되는 상기 코어-글리코실화된 HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 상기 배양액으로부터 정제하는 단계를 포함하는, 면역에세이 또는 백신에서 사용하기 적합한 코어-글리코실화된 C형간염 바이러스(HCV) 엔빌로프 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은,
(i) 2개 이상의 Cys-아미노산을 포함하는 HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 암호화하는 엔빌로프 유전자에 의해 형질전환된 한세눌라 (Hansenula) 또는 사카로마이세스 (Saccharomyces) 글리코실화 마이너스 균주를 적합한 배지에서 생장시키는 단계;
(ii) 상기 HCV E1 및/또는 HCV E2 유전자 또는 그의 일부를 발현시키는 단계; 및
(iii) 형질전환된 숙주 세포를 용균처리하여 상기 Cys-아미노산이 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 가역적으로 보호되는 상기 세포내 발현된 코어-글리코실화된 HCV E1 및/또는 HCV E2 단백질 또는 그의 일부를 정제하는 단계를 포함하는, 면역에세이 또는 백신에서 사용하기 적합한 코어-글리코실화된 C형 간염 바이러스(HCV) 엔빌로프 단백질을 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히 헤파린 친화성 크로마토그래피를 포함하는 재조합 코어-글리코실화된 HCV 효모 단백질 또는 그의 일부를 정제하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 화학적 수단이 술폰화인 것을 특징으로 하는 상기 기재한재조합 코어-글리코실화된 HCV 효모 단백질 또는 그의 일부를 정제하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 Cys-아미노산의 가역적 보호는 화학적 및/또는 효소적 수단에 의해 비가역적 보호로 변경되는 것을 특징으로 하는, 재조합 코어-글리코실화된 HCV 효모 단백질 또는 그의 일부를 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 화학적 수단에 의한 비가역적 보호가 요오도-아세트아미드인 것을 특징으로 하는, 재조합 코어-글리코실화된 HCV 효모 단백질 또는 그의 일부를 정제하는 방법에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 화학적 수단에 의한 비가역적 보호가 NEM 또는 비오틴-NEM 또는 그의 혼합물인 재조합 코어-글리코실화된 HCV 효모 단백질 또는 그의 단편을 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 HCV 코어, E1, E2, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및/또는 NS5B 단백질 또는 그의 일부를 또한 포함하는 상기 정의한 바와 같은 조성물에도 관한 것이다. 본 발명에 따른 코어-글리코실화된 단백질 E1, E2 및/또는 E1/E2는 예컨대 코어, P7, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및/또는 NS5B와 같은 기타 HCV 항원과 조합될 수 있다. 이들 NS3 단백질의 정제는 바람직하게는 시스테인 잔기의 가역적 수식을 포함하고, 또 더욱 바람직하게는 시스테인의 술폰화를 포함한다. 이러한 가역적 수식을 얻기 위한 술폰화를 비롯한 방법은 Maertens 등(PCT/EP99/02547호)에 의해 NS3 단백질에 대해 개시되었다. 후술한 문서의 모든 정의를 비롯한 전체 내용은 본 발명에 참고문헌으로 포함되어 있음을 유념해야한다.
또한 본 발명은 코어-글리코실화된 엔빌로프 단백질을 일련의 시간 및 화합물의 일부로서 사용하는 것을 특징으로 하는 HCV에 대한 면역을 유발하기 위한 본 명세서에 기재된 바와 같은 코어-글리코실화된 엔빌로프 단백질의 용도에도 관한 것이다. 이와 관련하여, 용어 "일련의 시간 및 화합물"은 면역반응을 유발하기 위해 사용된 화합물을 개체에 시간 간격을 두고 투여하는 것을 의미한다. 후자 화합물은 하기 성분을 더 포함할 수 있다: 코어-글리코실화된 엔빌로프 단백질, HCV DNA 백신 조성물, HCV 폴리펩티드. 이 점에서, 시리즈는 다음을 투여하는 것을 포함한다:
(i) 코어-글리코실화된 엔빌로프 단백질과 같은 HCV 항원을 시간 간격을 두고 투여; 또는
(ii) 코어-글리코실화된 엔빌로프 단백질 올리고머 입자 및 HCV DNA 백신 조성물을 포함하는 HCV DNA 백신 조성물과 조합된 코어-글리코실화된 엔빌로프 단백질과 같은 HCV 항원을 동시에 투여하거나, 또는 교대 시간 간격을 비롯한 상이한 시간 간격으로 투여하거나, 또는
(iii) 시간 간격을 두고 다른 HCV 펩티드와 함께 (i) 또는 (ii)를 조합하여 실시.
이렇게하여, HCV DNA 백신 조성물은 E1-, E2-, E1/E2-펩티드, NS3 펩티드, 기타 HCV 펩티드를 비롯한 HCV 엔빌로프 펩티드, 또는 상기 펩티드의 일부를 암호화하는 핵산을 포함하는 것이 분명하다. 또한, 상기 HCV 펩티드는 E1-, E2-, E1/E2-펩티드, NS3 펩티드, 기타 HCV 펩티드를 비롯한 HCV 엔빌로프 펩티드 또는그의 일부를 포함한다. 용어 "기타 HCV 펩티드"는 HCV 펩티드 또는 그의 단편을 의미한다. 상기 계획 (ii)에서, HCV DNA 백신 조성물은 HCV 엔빌로프 펩티드를 암호화하는 핵산을 우선적으로 포함한다. 상기 계획의 (ii)에서, HCV DNA 백신 조성물은 바람직하게는 HCV-NS3 DNA 백신 조성물과 조합되어 HCV 엔빌로프 펩티드를 암호화하는 핵산으로 더욱 바람직하게 구성된다. 이렇게 하여, HCV DNA 백신 조성물은 전사 조절 요소에 기능적으로 결합된, 상기와 같은 HCV 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 명세서에서는, "플라스미드 벡터"는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 바람직한 벡터는 결합된 핵산을 자동 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터이다. 일반적으로, 여기에 한정되는 것은 아니라, 플라스미드 벡터는 환형 이중가닥 DNA 루프이고, 이 벡터 형태에서는 염색체에 결합되지 않는다. 본 명세서에서 이용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드 서열"은 데옥시리보핵산(DNA)와 같은 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 필요한 경우, 리보핵산(RNA)을 의미한다. 상기 용어는 등가물로서, 뉴클레오티드 유사체 및 단일(센스 또는 안티센스) 및 이중가닥 폴리뉴클레오티드로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체를 포함하는 것으로 이해되어야한다. 본 명세서에서는, 용어 "전사 조절 요소"는 살아있는 척추세포에 도입되면 세포성 기전에 작용하여 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 번역산물을 생성하게 하는 필수 조절서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 용어 "기능적으로 결합된"은 성분이 통상의 작용을 실시하도록 구성된 배치를 지칭한다. 따라서, 뉴클레오티드 서열에 기능적으로 결합된 전사조절서열은 상기 뉴클레오티드 서열의 발현에 영향을 줄 수 있다.
당업자는 상이한 전사 프로모터, 터미네이터, 캐리어 벡터 또는 특정 유전자 서열이 성공적으로 사용될 수 있음을 숙지하고 있을 것이다. 다르게는, DNA 백신은 아데노바이러스, 카나리아 수두 바이러스, MVA 등과 같은 생존 벡터를 통하여 전달될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 더욱 자세하게 설명한다. 이들 실시예는 예시하기 위한 것으로 어떠한 의미로든 제한을 의미하지 않는다.
실시예 1
pFPMT-MFα-E1-H6 셔틀 벡터의 작성
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 형질전환용 플라스미드는 다음과 같이 작성하였다. pFPMT-MFα-E1-H6 셔틀벡터는 다단계 과정으로 작성하였다. 먼저 HCV E1 단백질을 암호화하는 핵산서열(서열번호: 2)을 CHH 리더 서열 (CHH = 카르시누스 마애나스(Carcinus maenas) 고혈당증 호르몬) 뒤에 클로닝한 다음 MFα리더 서열 (MFα = 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) α-메이팅 인자)에 대해 변경시켰다.
먼저, 이음매없는(seamless) 클로닝 방법(Padgett, K. A. 및 Sorge, J. A. 1996)에 의해EcoRI/BamHI 단편으로서 CHH-E1-H6 단위를 포함하는 pUC18 유도체를 작성하였다. 여기에, 이하에 기재한 바와 같이 PCR에 의해 E1s-H6-암호화 DNA 단편 및 pCHH-Hir-유도된 어셉터 플라스미드를 생성하였다.
E1s-H6-암호화 DNA 단편의 생성
E1-H6-암호화 DNA 단편 (6 His-잔기에 의해 연장된 E1의 아미노산 192 내지 326으로 구성된 HCV형 1b E1 단백질을 코딩; 서열번호: 5)은 플라스미드pGEMTE1sH6 (서열번호: 6; 도 1)로부터 PCR에 의해 분리하였다. 하기 프라이머를 사용하였다:
Eam1104I 부위는 밑줄쳐져 있고, 점은 절단부위를 나타낸다. 진하게 인쇄된(볼드체) 염기는 프라이머 CHH-링크의 염기와 상보적이다. 마킹되지 않은 염기는 센스 방향으로 E1(192-326)의 개시 영역내에서 결합된다; 및
Eam1104I 부위는 밑줄 표시하고, 점은 절단부위를 나타낸다. 진하게 인쇄된(볼드체) 염기는 프라이머 MF30-rechts 와 상보적이다. 나중의 클로닝 과정에 유용한BamHI 부위를 형성하는 염기는 이탤릭체로 인쇄되어 있다. 마킹되지 않은 염기는 종지코돈 및 종지코돈과 BamHI 부위 사이에 3개의 부가적 염기를 포함하는 E1-H6 단위의 마지막내에서 안티센스 방향으로 결합된다.
상기 반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다: 20 ng의Eco311-선형화된 pGEMTE1sH6, 각각 0.2μM의 프라이머 CHHE1-F 및 CHHE1-R, dNTP (각각 0.2 μM), 1 x 완충액 2 (Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834), 2.5U 중합효소 혼합물(Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834)을 함유하는 전체 부피 50 μL.
프로그램 1을 이용하며, 이 프로그램은 다음 단계로 구성된다:
1. 변성: 95℃에서 5분;
2. 95℃에서 30초간 변성하고, 65℃에서 30초간 결합한 다음 68℃에서 130초간 연장시키는 주기 10회;
3. 4℃에서 종료.
이어, 5 μL 10 x 완충액 2 (Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834), 40 μL의 H2O 및 5 μL의 [dATP, dGTP, 및 dTTP (2mM 각각); 10 mM 5-메틸-dCTP]를 상기 프로그램 1로부터 얻은 샘플에 부가하고, 다음 단계로 구성된 프로그램 2에 의해 추가의 증폭을 실시하였다:
1. 변성: 95℃에서 5분;
2. 95℃에서 45초간 변성, 65℃에서 30초간 결합, 및 68℃에서 130초간 연장하는 주기 5회;
3. 4℃에서 종료.
pCHH-Hir-유도된 어셉터 플라스미드의 생성
어셉터 단편은 pCHH-Hir 플라스미드 (서열번호: 9; 도 2)로부터 PCR에 의해 제조하였으며 Hir-코딩 서열이 PCR 산물에 존재하지 않는 이외에는 완전한 pCHH-Hir 플라스미드로 구성된다. 하기 프라이머가 PCR에 사용되었다:
Eam1104I 부위는 밑줄쳐져 있고, 점은 절단부위를 나타낸다. 진하게 인쇄된(볼드체) 염기는 프라이머 CHHE1-F의 염기와 상보적이다. 마킹되지 않은 염기는 CHH 서열의 마지막내에서 안티센스 방향으로 결합된다; 및
Eam1104I 부위는 밑줄쳐져 있고, 점은 절단부위를 나타낸다. 진하게 인쇄된(볼드체) 염기는 프라이머 CHHE1-R의 염기와 상보적이다. 마킹되지 않은 염기는 클론된 pCHH-Hir의CHH-Hirudin HL 20뒤의 pUC18 서열내에서 결합되어, 삽입물로부터 떨어져있다.
상기 반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다: 20 ng의Asp718I-선형화된 pCHH-Hir, 각각 0.2μM의 프라이머 CHH-링크 및 MF30-rechts, dNTP (각각 0.2 μM), 1 x 완충액 2 (Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834), 2.5U 중합효소 혼합물(Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834)을 함유하는 전체 부피 50 μL.
상기 기재한 바와 같은 프로그램 1을 이용하였다.
이어, 5 μL 10 x 완충액 2 (Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834), 40 μL의 H2O, 및 5 μL의 [dATP, dGTP, 및 dTTP (2mM 각각); 10 mM 5-메틸-dCTP]를 상기 프로그램 1로부터 얻은 샘플에 부가하고, 상기 기재한 바와 같은 프로그램 2에 의해 추가의 증폭을 실시하였다.
벡터 pCHHE1의 생성
상기 기재한 바와 같이 PCR에 의해 생성된 E1s-H6-암호화 DNA 단편 및 pCHH-Hir-유래 어셉터 플라스미드는 공급자의 명세에 따라 PCR 산물정제키트(Quagen 제조)를 이용하여 정제하였다. 이어 정제된 단편을Eam1104I에 의해 개별적으로 분해시켰다. 이어, E1s-H6 DNA 단편을, 공급자의 명세를 따라 T4 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 pCHH-Hir-유래 어셉터 플라스미드에 결찰시켰다.
대장균 XL-골드 세포를 결찰 혼합물을 사용하여 형질전환시키고 몇 개의 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA는EcoRI 및BamHI를 사용한 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 선택하고 pCHHE1으로 명명하였다.
벡터 pFPMT-CHH-E1H6의 생성
pCHHE1의EcoRI/BamHI 단편을EcoRI/BamHI 분해된 벡터 pFPMT121 (서열번호: 12; 도 3)에 결찰시켰다. 공급자의 지시에 따라서 T4 리가제(뵈링거 제조)를 사용하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시켰다. 몇 개의 형질전환체를 플라스미드 DNA의 제한패턴에 대해 분석하고 양성 클론을 pFPMT-CHH-E1H6 (서열번호: 13; 도 4)으로 명명하였다.
pFPMT-MFα-E1-H6의 생성
마지막으로, 하기에 기재한 세 개 단편을 결찰시키는 것에 의해 셔틀벡터 pFPMT-MFα-E1-H6을 생성하였다:
1. 6.961 kb의EcoRI/BamHI 분해된 pFPMT121 (서열번호: 12; 도 3),
2. pUC18-MFα(서열번호: 62; 도 36)의 0.245 kbEcoRI/HindIII 단편, 및
3. pFPMT-CHH-E1H6으로부터 유래한 0.454 kb PCR 산물의 0.442 kbHindIII/BamHI 단편.
단편 번호 3을 생성한 0.454 kb PCR 산물은 다음과 같은 프라이머를 사용한PCR에 의해 얻었다:
상기 반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다: 반응 혼합물 부피 50 μL, pFPMT-CHH-E1-H6 (Eco311-선형화됨; 15 ng/μL), 0.5 μL; 프라이머 MFa-Eq f-Hi (50 μM), 0.25 μL; 프라이머 E1 back-Bam (50 μM), 0.25μL; dNTP (모두 0.2 μM), 5 μL; DMSO, 5 μL; H2O, 33.5 μL; Expand Long Template PCR System (뵈링거 만하임 제조; Cat No. 1681 834) 완충액 2 (10 x 농축), 5 μL; Expand Long Template PCR System 중합효소 혼합물 (1U/μL), 0.75 μL.
하기 단계로 구성된 PCR 프로그램을 이용하였다:
1. 변성: 95℃에서 5분;
2. 95℃에서 45초간 변성하고, 55℃에서 45초간 결합한 다음 68℃에서 40초간 연장시키는 주기 29회;
3. 4℃에서 종료.
사용된 프라이머를 기준으로 하여, 생성한 0.454 kb의 PCR 산물은 E1(192-326) 코돈에 이어, 6개의 히스티딘 코돈 및 "taa" 종지코돈, MFα 프리프로 서열 (클로닝 관련HindIII 부위와 6개의 염기쌍 오버헹을 포함)과 접하는 상류 및 (클로닝 관련) BamHI 부위 및 6개의 염기쌍 오버헹과 접하는 하류를 함유하였다.
결찰 반응의 경우, 제조자의 조건 (샘플 부피 20 μL)에 따라 T4 DNA 리가제(뵈링거 만하임 제조)를 사용하였다.
대장균 HB101 세포를 결찰 혼합물로 형질전환시켰고 또 몇 개의 형질전환체로부터 분리된 플라스미드의 제한분석후 양성 클론을 보류시켰다. 양성 플라스미드를 선택하고 pFPMT-MFα-E1-H6 (서열번호: 16; 도 5)로 명명하였다.
실시예 2
pFPMT-CL-E1-H6 셔틀 벡터의 작성
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 형질전환용 플라스미드는 다음과 같이 작성하였다. pFPMT-CL-E1-H6 셔틀 벡터는 pFPMT-MFα-E1-H6 (서열번호: 16, 도 5)로부터 출발하여 3단계로 작성하였다.
첫 단계로서, pFPMT-MFα-E1-H6의 MFα-E1-H6 리딩 프레임을 pUC18 벡터에 서브클로닝하였다. 따라서, pFPMT-MFα-E1-H6 (FMD 프로모터 및 MFα-E1-H6 함유)의 1.798 kbSalI/BamHI 단편을 제조자의 조건에 따라 T4 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 pUC18의SalI/BamHI 벡터 단편에 결찰시켰다. 그 결과 도 6에 도시한 플라스미드(서열번호: 17)를 생성하며, 이것을 pMa12-1 (pUC18-FMD-MFα-E1-H6)으로 명명하였다. 이 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시켰다. 몇 개의 암피실린 내성 콜로니를 선택하고 선택된 클론으로부터 분리한 플라스미드 DNA를 제한효소 분해시켜 분석하였다. MFα-E1-H6 코딩 서열의 DNA 서열을 결정하는 것에 의해 양성 클론을 더 분석하였다. 정확한 클론을 PCR 특이적 돌연변이에사용하여 MFα프리-프로-서열을 조류의 리소짐 프리-서열의 코돈("CL"; 조류 리소짐의 아미노산 1 내지 18에 상응; 서열번호: 1)으로 치환하였다. 적용된 PCR 특이적 돌연변이의 원리는 프라이머의 5'-말단에 위치한 소망하는 변형을 갖는 전체 플라스미드의 증폭에 기초로 한다. 하류 단계에서, 선형 PCR 산물의 말단은 자가-결찰 되기 전에 변형되어 소망하는 변형된 플라스미드를 생성한다.
하기 프라이머가 상기 PCR 반응에 사용되었다:
프라이머의 밑줄친 5' 영역은 조류의 리소짐 프리-서열의 약 1/2의 코돈을 함유한다. 프라이머 CL her neu는SpeI 제한 부위(이탤릭체)를 포함한다. 프라이머의 밑줄치지 않은 영역은 E1의 아미노산 잔기 192-199에 대한 코돈 또는FMD프로모터의 위치 -19 (EcoRI 부위로부터 계산)까지의EcoRI 부위에 대한 "atg" 개시코돈과 함께 결합된다. 프라이머는 완전한 pMa12-1를 증폭하도록 고안되어, MFα 프리-프로-서열의 코돈을 조류의 리소짐 프리 서열의 코돈으로 치환시킨다.
반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다: pUC18-FMD-Mfα-E1-H6 (pMa12-1; 1.3 ng/μL), 1μL; 프라이머 CL hin (100 μM), 2μL; 프라이머 CL her neu (100 μM), 2μL; dNTP (모두 2.5 mM), 8μL; H2O, 76 μL; Expand Long Template PCR System (뵈링거 제조; Cat No. 1681 834) 완충액 2 (10 x 농축), 10 μL; Expand Long Template PCR System 중합효소 혼합물 (1 U/μL), 0.75 μL.
하기 단계로 구성된 PCR 프로그램을 적용하였다:
1. 변성: 95℃에서 15분;
2. 95℃에서 30초간 변성하고, 60℃에서 1분간 결합한 다음 72℃에서 1분간 연장시키는 주기 35회;
3. 4℃에서 종료.
생성한 PCR 산물은 아가로오스 겔 전기영동법에 의해 정확한 크기(3.5 kb)를 확인하였다. 상기 PCR 산물로부터 3'-A 오버헹을 T4 중합효소 반응에 의해 제거하여 3'- 및 5'-OH 기를 갖는 무딘 말단을 생성하였다. 따라서, 상기 PCR 산물을 T4 중합효소(뵈링거 제조; 1U/μL)로 처리시키고; 잔류하는 95 μL의 PCR 반응 혼합물에 1μL의 T4 중합효소 및 4 μL dNTP (모두 2.5 mM)를 부가하였다. 이 샘플을 37℃에서 20분간 배양하였다. 이어, 에탄올을 사용하여 DNA를 석출시키고 16 μL H2O에 용해시켰다.
이어, 키나제 반응에 의하여 상기 무딘 말단 PCR 산물에 5'-포스페이트를 부가하였다. 16 μL의 무딘 말단 PCR 산물에 1 μL T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뵈링거 제조; 1U/μL), 2 μL 10배 농축된 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충액 (뵈링거 제조), 및 1 μL ATP (10 mM)를 부가하였다. 이 샘플을 37℃에서 30분간 배양하였다. 이어, DNA를 1% 아가로오스 겔에 가하고 정확한 생성물 밴드는 제조자의 조건에 따라 겔 추출 키트(Qiagen 제조)에 의하여 분리하였다. 정제된 생성물의 50 ng을 제조자의 조건에 따라 T4 리가제 (뵈링거)를 사용하여 자가 결찰시켰다. 16℃에서 72시간 동안 배양한 후, 결찰 혼합물중의 DNA를 에탄올에 의해 석출시키고 20 μL 물에 용해시켰다.
대장균 DH5α-F 세포는 10 μL의 결찰 샘플을 사용하여 형질전환시켰다. 몇 개의 암피실린 내성 클론의 플라스미드 DNA는 제한효소 분해에 의해 확인하였다. 양성 클론을 유지시키고 p27d-3 (pUC18-FMD-CL-E1-H6, 서열번호: 20, 도 7)로 명명하였다. 이어 CL-E1-H6 리딩 프레임은 DNA 서열결정법에 의해 확인하였다.
마지막 단계로, pFPMT-CL-E1-H6 셔틀 벡터는 다음과 같이 작성하였다. p27d-3 (CL-E1 (192-3260)-H6 포함)의 0.486 kbEcoRI/BamHI 단편을EcoRI/BamHI-분해된 pFPMT121 (서열번호: 12, 도 3)에 결찰시켰다. 이 반응의 경우, 제조자의 추천에 따라 T4 리가제(뵈링거 제조)를 사용하였다. 결찰 샘플중의 DNA를 에탄올을 사용하여 석출시키고 10 μL의 H2O에 용해시켰다. 대장균 DH5αF' 세포를 10 μL의 결찰 샘플을 사용하여 형질전환시키고 몇 개의 암피실린-내성 콜로니의 플라스미드 DNA를EcoRI 및BamHI을 사용하여 분해시킴으로써 분석하였다. 플라스미드 클론 p37-5 (pFPMT-CL-E1-H6; 서열번호: 21, 도 8)는 0.486 kb 및 6.96 kb의 소망하는 단편 크기를 나타내었다. p37-5의 CL-E1-H6의 정확한 서열은 서열결정법에 의해 확인하였다.
실시예 3
pFPMT-MFα-E2-H6 및 pMPT-MFα-E2-H6 셔틀 벡터의 작성
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 형질전환용 플라스미드는 다음과 같이 작성하였다. MFα-E2s (HCV E2의 아미노산 384-673)-VIEGR-His6 (서열번호: 5)를 암호화하는 DNA 서열은 플라스미드 pSP72E2H6 (서열번호: 22, 도 9)로부터 1.331kbEcoRI/BglII 단편으로서 분리하였다. 이 단편을 제조자의 추천에 따라서 T4 DNA 리가제 (뵈링거 만하임 제조)를 사용하여EcoRI/BglII-분해된 벡터 pFPMT121 (서열번호: 12, 도 C+2) 또는 pMPT121 (서열번호: 23, 도 10)에 결찰시켰다. 대장균을 형질전환시키고 상이한 형질전환체로부터 분리된 플라스미드 DNA를 제한효소 분해에 의해 확인한 후, 양성 클론을 유지시키고 생성한 셔틀 벡터를 각각 pFPMT-MFα-E2-H6 (서열번호: 22, 도 11) 및 pMPT-MFα-E2-H6 (서열번호: 23, 도 12)로 명명하였다.
실시예 4
pFPMT-CL-E2-H6 셔틀 벡터의 작성
셔틀 벡터 pFPMT-CL-E2-H6는 3단계 과정으로 조립하였다. E2 코딩 서열이 슈바니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis)의 α-아밀라제의 시그널 서열 뒤에 클로닝된 중간체 작성물을 제조하였다. 이것은 이음매없는 클로닝방법(Padgett, K. A. 및 Sorge, J. A. 1996)에 의해 실시되었다.
E2-H6 암호화 DNA 단편의 생성
먼저, E2-H6를 암호화하는 DNA 서열(링커 펩티드 "VIEGR" 및 6개의 His 잔기를 갖도록 연장된 HCV E2의 아미노산 384 내지 673, 서열번호: 5)은 PCR에 의해pSP72E2H6 플라스미드 (서열번호: 24, 도 11)로부터 증폭하였다. 사용된 프라이머를 MF30E2/F 및 MF30E2/R로 표시하며 다음과 같은 서열을 갖는다:
Eam1104I 부위는 밑줄로 표시하였고, 점은 효소의 절단부위를 나타내며; 에스. 옥시덴탈리스((S. occidentalis) 시그널 신호의 마지막 코돈은 볼드체로 인쇄하며; 또 마킹되지 않은 염기는 E2의 코돈(HCV E2의 아미노산 384-390)과 결합시킨다;
Eam1104I 부위는 밑줄로 표시하였고, 점은 효소의 절단부위를 나타내며; 볼드체로 인쇄된 염기는 프라이머 MF30-Rechts (이하 참조)의 볼드체 인쇄된 염기와 상보적이며; 상기 작성물에 도입될BamHI 부위는 이탤릭체로 인쇄되며; 마킹되지 않은 서열은 종지코돈 및 E2 (384-673)-VIEGR-H6 (서열번호: 5)의 6개의 말단 His 코돈과 결합된다.
상기 반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다: pSP72E2H6의 1.33 kbEcoRI/BglII 단편 20 ng, 각 0.2μM의 프라이머 MF30E2/F 및 MF30E2/R, dNTP (각각 0.2 μM), 1 x 완충액 2 (Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834), 2.5U 중합효소 혼합물(Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834)을 함유하는 전체 부피 50 μL.
다음 단계로 구성된 PCR 프로그램 3을 이용하였다:
1. 변성: 95℃에서 5분;
2. 95℃에서 30초간 변성하고, 65℃에서 30초간 결합한 다음 68℃에서 1분간 연장시키는 주기 10회;
3. 4℃에서 종료.
이어, 10 μL 10 x 완충액 2(Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834), 40 μL의 H2O 및 5 μL의 [dATP, dGTP, 및 dTTP (2mM 각각); 10 mM 5-메틸-dCTP]를 상기 PCR 프로그램 3으로부터 얻은 샘플에 부가하고, 다음 단계로 구성된 PCR 프로그램 4를 계속하였다:
1. 변성: 95℃에서 5분;
2. 95℃에서 45초간 변성, 65℃에서 30초간 결합, 및 68℃에서 1분간 연장하는 주기 5회;
3. 4℃에서 종료.
pMF30-유도된 어셉터 플라스미드의 생성
플라스미드 pMF30 (서열번호: 28, 도 13)으로부터 유래한 제2 단편, 암플리콘은 에스. 옥시덴탈리스((S. occidentalis)의 성숙 α-아밀라제의 코돈을 제외하고는 완전한 pMF30 플라스미드이고, 클로닝에 관련된 변경은 프라이머 디자인에 의해 도입되었다. 이하의 프라이머 세트가 사용되었다:
Eam1104I 부위는 밑줄로 표시하였고, 점은 효소의 절단부위를 나타내며; 볼드체로 인쇄한 "cct"는 프라이머 MF30E2/F (상기 참조)의 볼드체 인쇄된 "agg"와 상보적이며; 마킹되지 않은 염기 및 볼드체로 인쇄된 염기는 pMF30중의 에스. 옥시덴탈리스(S. occidentalis)의 α-아밀라제의 코돈의 26개 말단 염기와 결합시킨다);
Eam1104I 부위는 밑줄로 표시하였고, 점은 효소의 절단부위를 나타내며; 볼드체로 인쇄한 "ctg"는 프라이머 MF30E2/R (상기 참조)의 볼드체 인쇄된 "cag"와 상보적이며; 마킹되지 않은 염기는 pMF30중의 에스. 옥시덴탈리스 (S. occidentalis)의 α-아밀라제의 종지코돈의 하류에 있는 pUC18 서열과 결합시킨다).
상기 반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다: 20 ng의BglII-선형화된 pMF30, 각 0.2μM의 프라이머 MF30-링크 및 MF30-Rechts, dNTP (각각 0.2 μM), 1 x 완충액 1 (Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834), 2.5U 중합효소 혼합물(Expand Long Template PCR System; 뵈링거 제조; Cat No. 1681 834)을 함유하는 전체 부피 50 μL. 연장 기간을 1분에서 4분으로 변경한 이외에는 상기 기재한 동일 PCR 프로그램 (프로그램 3 및 4)을 이용하였다.
벡터 pAMY-E2의 생성
E2-H6 암호화 DNA 단편 및 PCR에 의해 얻은 pMF30-유래 어셉터 플라스미드는 1% 아가로오스 겔상에서 겔 전기영동에 의해 각각의 크기별로 제어하였다. PCR 산물을 제조자의 지시에 따라 PCR 산물 정제 키트(Qiagen 제조)에 의해 정제하였다.이어 정제된 단편을 별도로Eam11004I로 분해시켰다. 제조자의 추천에 따라서 T4 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 E2-H6 단편과 pMF30-유래 어셉터 플라스미드의 결찰을 실시하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시키고 몇 개의 클론의 플라스미드 DNA를EcoRI/BamHI 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 선택하고, 그 플라스미드를 pAMY-E2로 명명하며 이하에 나타낸 추가의 변경에 이용하였다.
벡터 pUC18-CL-E2-H6의 생성
α-아밀라제 시그널 서열의 코돈을 조류의 리소짐 프리 서열의 코돈으로 치환하기 위하여 pAMY-E2를 PCR 특이적 돌연변이 처리시켰다. 이것을 "CL"로 표시하며, 조류 리소짐 ORF (서열번호: 1)의 첫째 18개 아미노산에 상응한다. 상기 돌연변이의 경우 이하의 프라이머가 사용되있다:
프라이머의 밑줄 친 5'-영역은 조류의 리소짐 프리 서열의 약 1/2의 DNA 서열을 함유한다. 프라이머 CL2 her는SpeI (이탤릭체) 및EcoRI(이탤릭체, 이중밑줄) 제한부위를 포함한다. 프라이머의 밑줄치지 않은 영역은 E2의 아미노산 잔기 384-392 (CL2 hin)의 코돈과 결합되거나 또는 위치-19 (EcoRI 부위로부터 계산) 프로모터 까지의EcoRI 부위에 있는 "atg" 개시코돈과 결합된다. 이 프라이머는 완전pAMY-E2 벡터를 증폭시키기 위하여 고안되며, 그에 의해 α-아밀라제 시그널 서열의 코돈을 조류의 리소짐 프리-서열의 코돈으로 치환한다.
하기 프로그램에 따라 PCR 반응을 실시하였다:
1. 변성: 95℃에서 15분;
2. 95℃에서 30초간 변성하고, 60℃에서 1분간 결합한 다음 72℃에서 1분간 연장시키는 주기 35회;
3. 4℃에서 종료.
하기 반응 혼합물을 사용하였다: pAMY-E2 (1 ng/μL), 1 μL; 프라이머 CL2 hin (100 μM), 2μL; 프라이머 CL2 (100 μM), 2μL; dNTP (각각 2.5 μM), 8 μL; H2O, 76 μL; Expand Long Template PCR System (뵈링거 제조; Cat No. 1681 834) 완충액 2 (10 x 농축), 10 μL; Expand Long Template PCR System 중합효소 혼합물 (1U/μL), 07.5 μL.
생성한 PCR 산물은 1% 아가로오스 겔상에서 겔 전기영동에 의해 확인하였다. 결찰하기 전에, PCR 단편은 다음과 같이 변경시켰다. T4 중합효소에 의해 3'-A 오버헹을 제거하여 3'- 및 5'-OH 기를 갖는 무딘 말단을 생성하였다. 잔류하는 95 μL의 PCR 반응 혼합물에 1μL의 T4 중합효소 (뵈링거 제조, 1U/μL)를 4 μL dNTP (각각 2.5 mM)와 함께 부가하였다. 이 샘플을 37℃에서 20분간 배양하였다. 이어, 에탄올을 사용하여 DNA를 석출시키고 16 μL 탈이온수에 용해시켰다. 이어, 키나제 처리에 의하여 상기 무딘 말단 PCR 산물에 5'-포스페이트를 부가하였다. 16μL의 용해된 무딘 말단 PCR 산물에 1 μL T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뵈링거 제조; 1U/μL), 2 μL 10배 농축된 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충액 (뵈링거 제조), 및 1 μL ATP (10 mM)를 부가하였다. 이 샘플을 37℃에서 30분간 배양하였다.
상기 키나제 처리된 샘플을 1% 아가로오스 겔상에서 분리하였다. 생성물 밴드를 분리하였다. 제조자의 추천에 따라 겔 추출 키트(Qiagen 제조)에 의하여 아가로오스로부터 DNA를 추출하였다. 정제된 생성물 50 ng을 제조자의 조건에 따라 T4 리가제 (뵈링거)를 사용하여 자가 결찰시켰다. 16℃에서 16시간 동안 배양한 후, 결찰 혼합물중의 DNA를 에탄올에 의해 석출시키고 20 μL 물에 용해시켰다(결찰 샘플).
대장균 DH5αF' 세포는 상기 10 μL의 결찰 샘플을 사용하여 형질전환시켰다. 몇 개의 암피실린 내성 클론은 분리된 플라스미드 DNA의 제한효소 분해에 의해 더 확인하였다. 양성 클론을 pUC18-CL-E2-H6로 명명하고 또 이하에 기재한 바와 같이 추가의 변경에 이용하였다.
셔틀벡터 pFPMT-CL-E2-H6의 생성
pUC18-CL-E2-H6 (CL-E2(384-673)-VIEGR-H6 포함)으로부터 0.966 kbEcoRI/BamHI 단편을 분리하고 이것을EcoRI/BamHI-분해된 pFPMT121 (서열번호: 12, 도 3)에 결찰시켰다. 이 반응의 경우, 제조자의 조건에 따라 T4 리가제 (뵈링거 제조)를 사용하였다. 결찰 샘플중의 DNA를 에탄올을 사용하여 석출시키고 10 μL의 물에 용해시켰다. 이것을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시키고, 제한효소 분석 후 양성 클론을 유지시키고 각각의 플라스미드를 pFPMT-CL-E2-H6 (서열번호: 32, 도 14)로 명명하였다.
실시예 5
pFPMT-CL-K-H6-E1 셔틀벡터의 작성
셔틀벡터의 작성은 다음 2단계를 포함한다.
첫 단계로서, pUC18-FMD-CL-H6-K-E1-H6 작성물은 부위특이적 돌연변이에 의해 작성하였다. pUC18-FMD-CL-E1-H6을 주형(서열번호: 20; 도 7)으로 사용하였다. 하기 프라이머를 사용하였다:
PCR 반응 혼합물은 다음과 같이 구성된다: pUC18-FMD-CL-E1-H6 (2 ng/μL), 1μL; 프라이머 H6K hin neu (100 μM), 2μL; 프라이머 H6KRK her neu (100 μM), 2μL; dNTP (각각 2.5 mM), 8μL; H2O, 76 μL; Expand Long Template PCR System (뵈링거 제조; Cat No. 1681 834) 완충액 2 (10 x 농축), 10 μL; Expand Long Template PCR System 중합효소 혼합물 (1 U/μL), 0.75 μL.
하기 단계로 구성된 PCR 프로그램을 적용하였다:
1. 변성: 95℃에서 15분;
2. 95℃에서 30초간 변성하고, 60℃에서 1분간 결합한 다음 72℃에서 5분간 연장시키는 주기 35회;
3. 4℃에서 종료.
PCR 샘플의 알리쿼트를 1% 아가로오스 겔상에서 분석하여 그 정확한 크기를 확인하였다 (~4.2 kb).
그후 상기 PCR 산물로부터 3'-A 오버헹을 T4 중합효소 반응에 의해 제거하여 3'- 및 5'-OH 기를 갖는 무딘 말단을 생성하였다. 따라서, 잔류하는 95 μL의 PCR 반응 혼합물에 1μL의 T4 중합효소(뵈링거 제조; 1U/μL) 및 4 μL dNTP (각각 2.5 mM)를 부가하였다. 이 샘플을 37℃에서 20분간 배양하였다. 이어, 에탄올을 사용하여 DNA를 석출시키고 16 μL H2O에 용해시켰다.
이어, 키나제 반응에 의하여 상기 무딘 말단 PCR 산물에 5'-포스페이트를 부가하였다. 16 μL의 무딘 말단 PCR 산물에 1 μL T4 폴리뉴클레오티드 키나제(뵈링거 제조; 1U/μL), 2 μL 10배 농축된 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 반응 완충액 (뵈링거 제조), 및 1 μL ATP (10 mM)를 부가하였다. 이 샘플을 37℃에서 30분간 배양하였다.
이어, 샘플을 1% 아가로오스 겔에 가하고 정확한 생성물 밴드를 제조자의 조건에 따라 겔 추출 키트(Qiagen 제조)에 의하여 분리하였다. 정제된 생성물의 50 ng을 제조자의 추천에 따라 T4 리가제 (뵈링거)를 사용하여 자가결찰시켰다. 16℃에서 72시간 동안 배양한 후, 결찰 샘플중의 DNA를 에탄올에 의해 석출시키고 10μL 물에 용해시켰다.
대장균 DH5αF' 세포는 5 μL의 결찰 샘플을 사용하여 형질전환시켰다. 몇 개의 암피실린 내성 클론의 플라스미드 DNA는 제한효소 분해에 의해 확인하며, 양성 클론을 유지시키고 pUC18-FMD-CL-H6-K-E1-H6 (서열번호: 39, 도 17)로 명명하였다.
두 번째 단계로, 전달 벡터는 2개의 단편 결찰에 의해 작성하였다. 하기 작성에서는BclI 접착성 말단을 갖는 단편이 포함되었다.BclI는 메틸화되지 않은 DNA상에서만 그 부위를 절단할 수 있기 때문에, 대장균 dam-균주는 관련된 플라스미드 pUC18-FMD-CL-H6-K-E1-H6 (서열번호: 39, 도 17) 및 pFPMT-CL-E1 (서열번호: 36, 도 16)에 의해 형질전환되었다. 각 형질전환으로부터, 암피실린 내성 콜로니를 선택하여, 액제 배지에서 생장시키고 메틸화되지 않은 플라스미드 DNA를 다음 사용을 위해 준비하였다. 메틸화되지 않은 플라스미드 pUC18-FMD-CL-H6-K-E1-H6 (FMD 프로모터, CL-H6-K 단위의 코돈 및 E1의 개시를 포함)의 1.273 kbBclI/HindIII 단편 및 플라스미드 pFPMT-CL-E1(BclI 부위로부터 개시하는 E1 리딩 프레임의 결실 부분, C-말단 없는 His tag, FMD 프로모터를 제외한 pFPMT121-위치 요소 포함)의 6.057 kbBclI/HindIII 단편을 준비하고 제조자의 명세에 따라 20 μL의 전체 부피의 T4 리가제 (뵈링거 제조)를 사용하여 16℃에서 72시간 동안 결찰시켰다. 이어, 결찰 혼합물을 멸균 이온수중에 떠 있는 니트로셀룰로오스 막 조각에 놓아 결찰 혼합물을 탈염시켰다 (실온에서 30분간 배양). 대장균 TOP10 세포를 5 μL의 탈염 샘플과 함께 전기영동시키는 것에 의해 형질전환시켰다. 생성한 몇 개의 암피실린 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 제한효소 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 유지시키고 pFPMT-CL-H6-K-E1 (서열번호: 40, 도 18)으로 명명하였다.
실시예 6
한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha )의 형질전환 및 형질전환체의 선택
에이치. 폴리모르파(H. polymorpha) 균주 RB11을 실시예 1 내지 5에 기재된 상이한 어버이 셔틀벡터를 사용한 수식(Roggenkamp, R. 등 1986)에 의하여 형질전환시켰다((Klebe, R. 등 1983)에 의해 기재된 바와 같은 PEG-매개된 DNA 흡수 과정). 각 형질전환의 경우, 72개 우라실-기본영양군(prototrophic) 콜로니를 선택하여 다음 과정에 의해 균주 생성에 이용하였다. 각 콜로니의 경우, 2 mL 액체 배양액을 접종하고 또 선택 배지(YNB/글루코오스, 디프코 제조)중의 시험관에서 48시간 (37℃; 160 rpm; 각도 45°) 동안 생장시켰다. 이 단계를 제1 통과 단계로 정의한다. 상기 제1 통과 단계의 배양액의 150 μL 알리쿼트를 사용하여 2 mL의 신선한 YNB/글루코오스 배지에 접종시켰다. 다시, 상기 배양물을 상기 기재한 바와 같이 배양하였다(제2 통과 단계). 또한, 이러한 통과 단계를 8회 실시하였다. 제3 및 제8 통과 단계후의 배양의 알리쿼트를 사용하여 2 mL의 비-선택적 YPD 배지(디프코 제조)에 접종시켰다. 37℃에서 48시간 동안 배양한 후(160 rpm; 각도 45°; 소위제1 안정화 단계), 이들 YPD 배양물의 150 μL 알리쿼트를 사용하여 신선한 2 mL YPD 배지에 접종시킨 다음 상기 기재한 바와 같이 배양하였다(제2 안정화 단계). 제2 안정화 단계의 배양액의 알리쿼트를 선택성 YNB/한천을 함유하는 플레이트상에 스트리킹하였다. 이들 플레이트를 거시적 콜로니가 보일 때 까지 4일간 배양하였다. 각 분리의 잘 정의된 단일 콜로니를 균주로 정의하고 발현 분석에 사용하였다.
발현분석은 소규모 진탕 플라스크 배양물상에서 실시하였다. 상기 언급한 YNB/한천 플레이트로부터 콜로니를 선발하고 상기 기재한 바와 같이 2 mL YPD에서 접종하여 48시간 동안 배양하였다. 2 mL-알리쿼트를 20 mL 진탕 플라스크 배양물에 대한 종자 배양으로 사용하였다. YPGlyerol (1%)를 배지로 사용하고 진탕 플라스크를 회전 진탕기(200 rpm, 37℃)상에서 배양하였다. 48시간의 생장 후 1% MeOH를 배양액에 부가하여 발현 카세트를 유발시켰다. 상이한 시간 간격으로 1 mL 알리쿼트의 세포 펠릿을 수집하고 추가의 분석때 까지 -20℃에서 저장하였다. 특정 단백질 발현은 SDS-PAGE/웨스턴 블러팅에 의해 분석하였다. 따라서 세포 펠릿은 샘플 완충액(트리스HCl-SDS)에 용해시키고 95℃에서 15분 이상 배양하였다. 15% 폴리아크릴-아미드 겔상에서 단백질을 분리하고 니트로셀룰로오스 막상에 블러팅(웨트-블러트; 중탄산염 완충액)하였다. 블러트는 제1 항체로서 특정 쥐 항-E1 (IGH201) 또는 쥐의 항-E2 (IGH216, WO 96/04385호에서 Maertens 등에 의해 기재)를 사용하고 또 제2 항체로서는 토끼-항-마우스-AP를 사용하여 발색되었다. 염색은 NBT-BCIP를 사용하여 실시하였다. 양성 균주는 다음 연구를 위해 유지하였다.
이들 양성 클론중 5개를 진탕 플라스크 발현 실험에 사용하였다. 각 균주의콜로니를 YNB 플레이트로부터 선택하고 2mL YPD를 접종시키는데 사용하였다. 이들 배양액을 상기와 같이 배양하였다. 상기 세포 현탁액을 사용하여 500 mL 진탕 플라스크중의 100 mL YPD 배지의 제2 종자 배양액을 접종하였다. 이 진탕 플라스크를 회전 진탕기상, 37℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 배양하였다. 상기 종자 배양액의 25 mL 알리쿼트를 사용하여 250 mL YPGlycerol (1%) 배지를 접종하였고 상기 기재한 조건하에, 격벽이 있는 2-1 진탕 플라스크에서 배양하였다. 배양한지 48시간 후 1% MeOH (프로모터 유도)를 부가하고 진탕 플라스크를 상기 기재한 조건하에서 더 배양하였다. 유도한지 24시간 후, 실험을 중지시키고 세포 펠릿을 원심분리에 의해 수집하였다. 5개의 상이한 클론의 발현수준을 SDS-PAGE/웨스턴 블럿(상기와 같은 조건)에 의해 분석하였다. 각 클론의 적정 시리즈를 겔에 로딩하고 가장 생산적인 균주를 선택하여 다음 발효 및 정제 시험용으로 준비하였다.
놀랍게도, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)와 가장 밀접하게 관련된 효모 균주인 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)는 초글리코실화없이도 HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포에 의해 발현된 HCV 엔빌로프 단백질에 그 크기가 필적하는 당 잔기를 갖는 HCV 단백질을 발현할 수 있다.
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 균주 RB11은 부다페스트 조약하에, Mycotheque de 1'UCL (MUCL), Universite Catholique de Louvain, Laboratoire de mycologie, Place Croix du Sud 3 bte 6, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium에 2002년 4월 19일에 MUCL 수탁번호 MUCL43805로 기탁되었다.
실시예 7
pSY1aMFE1sH6a 벡터의 작성
에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 발현 플라스미드는 다음과 같이 작성하였다. E1 코딩 서열은, 무딘 말단으로 만들고(T4 DNA 중합효소를 사용) 또 공급자의 명세에 따라서 T4 DNA 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 pYIG5 벡터(서열번호: 41, 도 19)에 클로닝된 pGEMT-E1sH6 (서열번호: 6, 도 1)로부터NsI1/Eco52I 단편으로 분리되었다. 클로닝은 E1s-H6 암호화 단편을 αMF-코딩 서열에 직접적으로 결합되도록 실시하였다. 결찰 혼합물을 대장균 DH5αF' 세포에서 형질전환시켰다. 이어, 몇 개의 암피실린 내성 클론의 플라스미드 DNA를 제한분해로 분석하고 양성 클론을 유지시켜 pYIG5E1H6 (ICCG3470; 서열번호: 42, 도 20)로 명명하였다.
발현카세트(αMF-서열 및 E1s-코딩 영역과 His-tag를 함유하는)는 pYIG5E1H6의BamHI 단편(2790 bp)으로서BamHI-분해된 대장균/에스.세레비시아애(S. cerevisiae) pSY1 셔틀벡터 (서열번호: 21, 도 43)에 전달되었다. 제조자의 조건에 따라 T4 DNA 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 결찰을 실시하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시키고, 또 몇 개 암피실린 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 제한효소 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 유지시키고 pSY1aMFE1sH6a (ICCG3479; 서열번호: 44, 도 22)로 명명하였다.
실시예 8
pSYYIGSE2H6 벡터의 작성
에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 발현 플라스미드 pSYYIGSE2H6은 다음과 같이 작성하였다. E2 코딩 서열은, 무딘 말단으로 만든(T4 DNA 중합효소를 사용) 다음 제조자의 설계에 따라 T4 DNA 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 pYIG5 벡터(서열번호: 41, 도 19)에 클로닝된 pBSK-E2sH6 (서열번호: 45, 도 23)으로부터SalI/KpnI 단편으로 분리되었다. 클로닝은 E2-H6 암호화 단편을 αMF-코딩 서열에 직접적으로 결합되도록 실시하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시시키고, 몇 개의 암피실린 내성 클론의 플라스미드 DNA를 제한분해로 분석하고 양성 클론을 유지시켜 pYIG5HCCL-22aH6 (ICCG2424; 서열번호: 46, 도 24)으로 명명하였다.
발현카세트(αMF-서열 및 E2(384-673) 코딩 영역과 His-tag를 함유하는)는 pYIG5HCCL-22aH6의BamHI 단편(3281 bp)으로서BamHI 개방된 대장균/에스.세레비시아애(S. cerevisiae) pSY1 셔틀벡터 (서열번호: 43, 도 21)에 전달되었다. 제조자의 조건에 따라 T4 DNA 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 결찰을 실시하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시키고, 또 몇 개 암피실린 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 제한효소 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 유지시키고 pSYYIGSE2H6 (ICCG2466; 서열번호: 47, 도 25)으로 명명하였다.
실시예 9
pSY1YIG7E1s 벡터의 작성
에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 발현 플라스미드 pSY1YIG7E1는 다음과같이 작성하였다. E1 코딩 서열은, 무딘 말단으로 만든 다음 제조자의 설계에 따라 T4 DNA 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 pYIG7 벡터(서열번호: 48, 도 26)에 클로닝된 pGEMT-E1s (서열번호: 6, 도 1)로부터NsI1/Eco52I 단편으로 분리되었다. 클로닝은 E1-암호화 단편을 αMF-코딩 서열에 직접적으로 결합되도록 실시하였다. 결찰 혼합물을 대장균 DH5αF' 세포로 형질전환시키고, 몇 개의 암피실린 내성 클론의 플라스미드 DNA를 제한분해로 분석하고 양성 클론을 유지시켜 pYIG7E1 (서열번호: 49, 도 27)로 명명하였다.
발현카세트(CL 리더 서열 및 E1 (192-326) 코딩 영역 함유)는, pYIG7E1의BamHI 단편 (2790 bp)으로서BamHI-분해된 대장균/에스.세레비시아애(S. cerevisiae) pSY1 셔틀벡터 (서열번호: 43, 도 21)에 전달하였다. 제조자의 조건에 따라 T4 DNA 리가제(뵈링거 제조)를 사용하여 결찰을 실시하였다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 DH5αF' 세포를 형질전환시키고, 또 몇 개 암피실린 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 제한효소 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 유지시키고 pSY1YIG7E1s (서열번호: 50, 도 28)로 명명하였다.
실시예 10
사카로마이세스 세레비시아애( Saccharomyces cerevisiae )의 형질전환 및 형질전환체의 선택
초-글리코실화 문제를 해결하기 위하여, 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae)에서 단백질 과발현을 위해 돌연변이 스크리닝이 고안되었다. 이 스크리닝은 Ballou (Ballou, L. 등 1991)의 방법을 기초로하며, 그에 의해 자연적인 수동 오르토바나데이트-내성 돌연변이를 선택하였다. 초기 균주 선택은 천연의 겔 전기영동후에 관찰된 바와 같이 인버타제의 글리코실화 패턴을 기본으로 하여 실시되었다. 글리코실화 능력이 감소된 균주는 재조합 단백질 반현 실험을 위해 유지시키고 균주 IYCC155로 명명하였다. 돌연변이체의 성질은 더 이상 연구하지 않았다.
상기 글리코실화-결핍 균주 IYCC155는 Elble (Elble, R. 1992)에 의해 기재된 바와 같은 아세트산리튬 방법에 의해 실시예 7 내지 9에 기재된 바와 같이 플라스미드를 형질전환시켰다. 몇 개의 Ura 보충 균주를 선택성 YNB + 2% 한천 플레이트 (디프코 제조)로부터 선택하여 2 ml YNB+2% 글루코오스를 접종시켰다. 이들 배양물을 오르비탈 진탕기상에, 37℃에서 72시간, 200 rpm으로 배양하고, 배양 상층액 및 세포내 분획을 E1 특이적 주위 모노클로날 항체(IGH 201)를 사용하여 발색된 웨스턴 블럿에 의해 E1의 발현에 대해 분석하였다.
사용된 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 글리코실화 결핍 돌연변이주에서 단백질의 발현은 이러한 균주의 차선의 생장 특성에 의해 제한됨으로써 바이오매스 수율 감소를 초래하므로 야생형 S에 대하여 소망하는 단백질의 수율이 낮다. 소망하는 단백질의 수율은 포유동물 세포에서 보다 훨씬 더 높았다.
실시예 11
pPICZalphaD'E1sH6 및 pPICZalphaE'E1sH6 벡터의 작성
셔틀벡터 pPICZalphaE'E1sH6은 pPICZalphaA 벡터 (Invitrogen 제조; 서열번호: 51, 도 29)로부터 출발하여 작성하였다. 첫 단계로서, 상기 벡터를 변경시켜 E1 코딩 서열이 KEX2 또는 STE13 가공 프로테아제의 절단부위 바로 뒤에 클로닝되도록 하였다. 따라서 pPICZalphaA를XhoI 및NotI로 분해시켰다. 분해물을 1% 아가로오스 겔상에서 분리하고 3519 kb 단편(벡터의 주요 부분)을 분리하고 겔 추출 키트(Qiagen 제조)에 의해 정제하였다. 이 단편은 특정 올리고뉴클레오티드의 존재하, 제조자의 조건에 따라서 T4 중합효소(베링거 제조)를 사용하여 결찰시켜 pPICZalphaD' (서열번호: 52, 도 30) 또는 pPICZalphaE' (서열번호: 53, 도 31)을 얻었다.
하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.
- pPICZalphaD' 작성용:
결합후, 하기 링커 올리고뉴클레오티드를 얻음:
- pPICZalphaE' 작성용
결합후, 하기 링커 올리고뉴클레오티드를 얻음:
이들 셔틀벡터 pPICZalphaD' 및 pPICZalphaE'를 각 가공 프로테아제 KEX2 및 STE13의 절단부위 바로 뒤에 있는 클로닝 부위에 새롭게 도입하였다. E1-H6 코딩 서열은 pGEMT-E1sH6 (서열번호: 6, 도 1)로부터NsI1/Eco52I 단편으로 분리하였다. 분해물을 1% 아가로오스 겔상에서 분리한 후 겔 추출 키트(Qiagen 제조)를 사용하여 단편을 정제하였다. 생성한 단편은 무딘 말단(T4 DNA 중합효소)이며 가공 프로테아제 절단부위 바로 뒤의 pPICZalphaD' 또는 pPICZalphaE'에 결찰시켰다.
결찰 혼합물을 대장균 TOP10F' 세포로 형질전환시키고 몇 개의 제오신 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 제한효소 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 유지시키고 pPICZalphaD'E1sH6 (ICCG3694; 서열번호: 58, 도 32) 및 pPICZalphaE'E1sH6 (ICCG3475; 서열번호: 59, 도 33)으로 명명하였다.
실시예 12
pPICZalphaD'E2sH6 및 pPICZalphaE'E2sH6 벡터의 작성
셔틀벡터 pPICZalphaD' 및 pPICZalphaE'는 실시예 11에 기재한 바와 같이 작성하였다.
E2-H6 코딩 서열은 pBSK-E2sH6 (서열번호: 45, 도 23)으로부터SalI/KpnI 단편으로서 분리하였다. 분해물을 1% 아가로오스 겔상에서 분리한 후 겔 추출 키트(Qiagen 제조)에 의해 단편을 정제하였다. 생성한 단편을 무딘 말단(T4 DNA 중합효소 사용)으로 만든 다음 각 가공 프로테아제 절단 부위 바로 뒤에 있는 pPICZalphaD' 또는 pPICZalphaE'에 결찰시켰다.
결찰 혼합물을 대장균 TOP10F'세포로 형질전환시키고 몇 개의 제오신 내성 콜로니의 플라스미드 DNA를 제한효소 분해에 의해 분석하였다. 양성 클론을 유지시키고 pPICZalphaD'E2sH6 (ICCG3692; 서열번호: 60, 도 34) 및 pPICZalphaE'E2sH6 (ICGG3476; 서열번호: 61, 도 35)로 명명하였다.
실시예 13
피치아 파스토리스( Pichia pastoris )의 형질전환 및 형질전환체의 선택
실시예 11 및 12에 기재된 바와 같은 피. 파스토리스(P. pastoris) 셔틀벡터를 사용하여 제조자의 조건(Invitrogen 제조)에 따라 피. 파스토리스(P. pastoris) 세포를 형질전환시켰다. E1- 및 E2-생성 균주를 다음 특징화를 위해 유지시켰다.
초글리코실화가 보통 존재하지 않고(Gellissen, G. 2000) 또 전에는 dengue 바이러스 E 단백질을 GST 융합물(Sugrue, R. J. 등, 1997)로서 발현하기 위해 사용된 점에서 공지된 효모 균주인 피. 파스토리스(P. pastoris)에서 HCV 엔빌로프 단백질을 발현시켰다. 생성한 피.파스토리스(P. pastoris)-발현된 HCV 엔빌로프 단백질은 야생형 사카로마이세스 균주에서 관찰된 글리코실화에 필적하는 글리코실화를 나타내었다. 보다 자세하게는, 피. 파스토리스(P. pastoris)에 의해 생산된 HCV 엔빌로프 단백질은 초글리코실화되었다(형질전환된 피. 파스토리스 세포로부터 분리된 단백질의 웨스턴-블럿에서 검출된 발현 산물의 분자량을 기준).
실시예 14
사카로마이세스 세레비시아애( Saccharomyces cerevisiae ), 한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha ) 및 피치아 파스토리스( Pichia pastoris )에 대한 배양 조건
사카로마이세스 세레비시아애( Saccharomyces cerevisiae )
세포 뱅킹
선택된 재조합 클론중에서 마스터 세포 뱅크 및 작용 세포 뱅크를 제조하였다.
중간-지수적으로 생장한 진탕 플라스크 배양액으로부터 냉동-바이얼을 준비하였다(발효 종자 배양액에서와 같은 배양조건, 하기 참조). 글리세롤을 냉동보호제로서 부가하였다(50% 최종 농도).
발효
종자 배양은 냉동저장된 작용 세포 뱅크 바이얼로부터 개시하여 2L 엘렌마이어 진탕 플라스크중의 500 mL 배지(2% 수크로오스 보충된 YNB, 디프코 제조)에서 37℃, 200 rpm으로 48시간 동안 생장시켰다.
발효는 작용부피가 15 L인 Biostat C 발효기(B. Braun Int., Melsungen, 독일)중에서 전형적으로 실시하였다. 발효 배지는 1% 효모 추출액, 2% 펩톤 및 탄소 공급원으로서 2% 수크로오스를 함유하였다. 폴리-에틸렌 글리콜은 소포제로서 사용하였다.
발효하는 동안 온도, pH 및 용존산소는 전형적으로 제어되며, 적용가능한 세트 포인트는 하기 표 1에 요약하였다. 용존 산소는 교반/통기에 의해 계단식으로제어하였다. NaOH (0.5M) 또는 H3PO4용액 (8.5%)를 부가하는 것에 의해 pH를 제어하였다.
10% 종자-배지를 부가하는 것에 의해 발효를 개시하였다. 생장기 동안 수크로오스 농도는 HPLC 분석(Polysphere Column OAKC Merck 제조)에 의해 오프라인으로 조절하였다.
생장상 동안 용존 산소는 계단식으로 제어(교반/통기)하였다. 수크로오스를 완전히 대사시킨 후 이종 단백질 생산은 약 0.5% 농도(오프라인 HPLC 분석, Polysphere OAKC 칼럼)로 유지시키기 위하여 EtOH를 계단식으로 보충한 내인성 생산된 에탄올에 의해 유발되었다. 상기 유도 상 동안, 용존 산소는 공기량 및 교반 속도의 수동 조작을 통하여 5% 미만의 공기-포화으로 제어된다.
전형적으로, 발효는 유도한지 48 내지 74시간 후에 수확되며, 탄젠트 유동 여과에 의해 농축시킨 다음 농축된 세포 현탁액을 원심분리시킴으로써 세포 펠릿을 얻었다. 즉시 분석하지 않으면, 세포 펠릿은 -70℃에서 저장하였다.
한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha )
세포 뱅킹
선택된 재조합 클론중에서 마스터 세포 뱅크 및 작용 세포 뱅크를 제조하였다.
중간-지수적으로 생장한 진탕 플라스크 배양액으로부터 냉동-바이얼을 준비하였다(발효 종자 배양액에서와 같은 배양조건, 하기 참조). 글리세롤을 냉동보호제로서 부가하였다(50% 최종 농도).
발효
종자 배양은 냉동저장된 작용 세포 뱅크 바이얼로부터 개시하여 2L 엘렌마이어 진탕 플라스크중의 500 mL 배지(YNB, 디프코 제조)에서 37℃, 200 rpm으로 48시간 동안 생장시켰다.
발효는 작용부피가 15 L인 Biostat C 발효기(B. Braun Int., Melsungen, 독일)중에서 전형적으로 실시하였다. 발효 배지는 1% 효모 추출액, 2% 펩톤 및 탄소 공급원으로서 1% 글리세롤을 함유하였다. 폴리-에틸렌 글리콜은 소포제로서 사용하였다.
발효하는 동안 온도, pH 및 용존산소는 전형적으로 제어되며, 적용가능한 세트 포인트는 하기 표 2에 요약하였다. 용존 산소는 교반에 의해 계단식으로 제어하였다. NaOH (0.5M) 또는 H3PO4용액 (8.5%)를 부가하는 것에 의해 pH를 제어하였다.
10% 종자-배지를 부가하는 것에 의해 발효를 개시하였다. 생장기 동안 글리세롤 농도는 오프라인 (Polysphere Column OAKC Merck)으로 조절하였고 완전히 글리세롤을 소비한 지 24시간 후 1% 메탄올을 부가하여 이종 단백질 발현을 유발하였다. 발효는 유도한지 24 시간 후에 수확되며, 탄젠트 유동 여과에 의해 농축시킨 다음 농축된 세포 현탁액을 원심분리시킴으로써 세포 펠릿을 얻었다. 즉시 분석하지 않으면, 세포 펠릿은 -70℃에서 저장하였다.
피치아 파스토리스( Pichia pastoris )
재조합 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)를 사용한 소규모 단백질 생산실험은 진탕 플라스크 배양으로 설계하였다. 종자 배양은 YPD 배지(디프코 제조)에서 철야로 생장하였다. 초기 배지 pH는 4.5로 정하였다. 진탕 플라스크를 회전 진탕기상에서 200-250 rpm으로 37℃에서 배양하였다.
소규모 생산은 전형적으로 2L 진탕 플라스크내의 500 mL 규모로 실시하였고 1% 효모 추출액, 2% 펩톤(디프코 제조) 및 탄소 공급원으로서 2% 글리세롤을 함유하는 발현배지중에서 10% 접종시키는 것에 의해 개시하였다. 배양 조건은 종자 배양과 동일하다. 접종한 지 약 72시간 후 1% MeOH를 부가하는 것에 의해 배양을 개시하였다. 유도한 지 24시간 후 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 즉시 분석하지 않을 경우, 세포 펠릿은 -70℃에서 저장하였다.
실시예 15
선택된 효모 세포에서 발현된 MFα-E1-H6 및 MFα-E2-H6 단백질로부터 리더 펩티드의 제거
에스. 세레비시아애(S. cerevisiae)의 α-메이팅 인자 (αMF) 리더 서열을 갖는 HCV E1 및 E2 단백질 작성물의 글리코실화 결핍 균주 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae)에서 발현산물을 더욱 분석하였다. 유전형 1b HCV E1s (aa 192-326) 및 HCV E2s (VIEGR (서열번호: 69)-서열에 의해 연장된 aa 383-673)는 C-말단 his-tagged (H6, HHHHHH, 서열번호: 63; 상기 HCV 단백질은 본 실시예에서 αMF-E1-H6 및 αMF-E2-H6으로 명명됨) 단백질로 발현되기 때문에, 효모 세포의 염화 구아니디늄 (GuHCl)-용해화후 발현된 산물의 신속하고도 효과적인 정제는 Ni-IDA (Ni-이미노디아세트산)상에서 실시하였다. 320 mM (4% w/v) 아황산나트륨 및 65 mM (2% w/v) 테트라티온산 나트륨의 존재하, 실온(RT)에서 단백질을 철야로 술폰화하였다. 냉동-해동 주기후 용균물을 원심분리(10,000 g, 30 분, 4℃)에 의해 깨끗하게 만들고 Empigen (Albright & Wilson 제조, UK) 및 이미다졸을 최종 농도 1% (w/v) 및 20 mM로 각각 상층액에 부가하였다. 샘플을 여과하고(0.22 μM) 또 Ni-IDA 세파로오스 FF 칼럼상에 걸고, 50 mM 인산염, 6M GuHCl, 20 mM 이미다졸이 보충된 1% Empigen (완충액 A)으로 평형으로 유지시켰다. 이 칼럼은, 280 nm에서 흡수도가 기저 레벨에 도달할 때 까지 20 mM 및 50 mM 이미다졸을 각각 함유하는 완충액 A로 순차적으로 세척하였다. 완충액 D, 50 mM 포스페이트, 6M GuHCl, 0.2% (E1의 경우) 또는 1% (E2의 경우) Empigen, 200 mM 이미다졸을 적용하는 것에 의해 his-태깅된 산물을 용출시켰다. 용출된 물질을 SDS-PAGE 및 E1 (IGH201) 또는 E2(IGH212)에 대해 특이적인 특정 모노클로날 항체를 사용하는 웨스턴-블럿에 의해 분석하였다.
E1-산물은 에드만 분해에 의해 즉시 분석하였다.
이 단계에서, SDS-PAGE는 HCV E2에 대한 아주 복잡한 단백질 밴드 그림을 나타내므로, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분별처리(fractionation)를 실시하였다. Ni-IDA 용출액을 한외여과(MWCO 10 kDa, 세??리플러스, 아미콘, 밀리포어)에 의해 농축시키고 PBS, 1% Empigen 또는 PBS, 3% Empigen중의 Superdex G200 (10/30 또는 16/60; 파마시아 제조)상에 걸었다. E2 생성물을 함유하며 Mr 범위가 ~80 kDa 내지 ~45 kDa인 용출 분획, SDS-PAGE (도 38)상의 이동을 기초로 하여 도 37에서의 용출 프로필의 분획 17-23을 모아서 알킬화시켰다 (실온에서 10 mM DTT를 사용하여 3시간 동안 배양시킨 다음 30 mM 요오도-아세트아미드를 사용하여 실온에서 3시간 동안 배양하였다). 아미노 말단 서열결정을 위한 샘플을 Endo H (로쉐 바이오케미컬스 제조)로 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 글리코실화된 E2 생성물 및 탈글리코실화된 E2 생성물을 말단 서열결정을 위해 PVDF-막상에 블러팅시켰다.글리코실화된 E2 및 탈글리코실화된 E2의 아미도-블랙 염색된 블럿을 도 39에 도시한다.
E1 및 E2 정제 산물의 서열결정은 HCV 엔빌로프 단백질로부터 시그널 서열의 제거가 오직 부분적으로만 생긴다는 실망스런 관찰을 초래한다(표 3). 또한, 부생성물(분해 산물 및 리더 서열 또는 그의 일부를 여전히 함유하는 생성물)의 대다수는 글리코실화되어 있다. 이러한 글리코실화는 N-글리코실화 부위를 함유하는 시그널 서열의 비-절단 단편상에서도 부분적으로 존재한다. 이러한 부위는 돌연변이되어 글리코실화가 적은 부생성물을 초래한다. 그러나, 더욱 문제가 되는 것은 일부 절단된 생성물이 소망하는 완전한 엔빌로프 단백질과 비교하여 1 내지 4개 아미노산 상이점을 갖는 점이다. 따라서, 상이한 발현산물 사이의 생화학적 특징을 충분히 구별할 수 없기 때문에, 정확하게 처리된 생성물의 정제도 실질적으로 불가능하다. 분해 생성물의 일부는 Kex-2와 유사한 절단(예컨대 아르기닌 이후의 절단인 E1의 aa 196 이후에 관측된 절단)의 결과일 수 있으며, 이것은 α-메이팅 인자 리더의 절단을 필요로하므로 상기 필수 과정을 방해함없이 차단될 수 없다.
에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) IYCC155를 pSY1YIG7E1s (서열번호: 50, 도 28)를 사용하여 형질전환시켜 유도된 E1을 다량생산하는 클론을 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) IYCC155를 pSY1aMFE1sH6aYIG1E1s (서열번호: 44, 도 22)로써 형질전환시켜 유도된 고생산 클론과 비교하였다. E1 단백질의 세포내 발현은 도입한지 2 내지 7일 후에 E1 특이적 모노클로날 항체(IGH 201)를 사용하는 웨스턴-블럿에 의하여 평가하였다. 도 40으로부터 판명할 수 있듯이, 최대 발현은 양쪽 균주 공히 2일 후에 관찰되었지만, 양쪽 균주에 대한 발현 패턴은 완전히 상이하였다. α-메이팅 인자 리더를 갖는 발현은 아주 복잡한 밴드 패턴을 초래하는데, 이는 리더의 가공이 효과적이지 않다는 사실로부터 기인한다. 이는 상이한 아미노 말단을 갖는 몇 개의 발현 산물을 초래하고 또 그 일부는 1 내지 5개 N-글리코실화에 의해 변경된다. 그러나, CL 리더와 함께 발현된 E1의 경우, 제한된 개수의 분명한 밴드가 관찰되며, 이는 정확한 CL 리더 제거가 고효율로 이루어졌음을 반영하며 또 이러한 정확하게 가공된 물질만이 N-글리코실화(1 내지 5개 사슬)에 의해 변경될 수 있다는 사실은 동일 CL 리더를 사용하여 발현된 한세눌라-유도된 E1에서 관찰된 바와 같다(실시예 16 참조).
E1에 대해 특이적인 모노클로날 항체(IGH201)를 생산하는 하이브리도마 세포주는 부다페스트 조약하에, European Collection of Cell Cultures, Centre for Applied Microbilogy & Research (영국 윌셔 에스피4 0제이지이, 살리스베리 소재)에 수탁번호 ECACC 98031216으로 1998년 3월 12일에 기탁되었다. E2에 대한 특이적인 모노클로날 항체(IGH212)는 WO 96/04385호에서 Maertens 등에 의해 실시예 7.4에 항체 12D11F2로서 기재되어있다.
주: 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 및 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에서 발현된 αMF-E1-H6 및 αMF-E2-H6 단백질의 N-말단의 동정. N-말단 서열결정을 기준으로 하여, 천연 E1-H6 및 E2-H6의 N-말단의 양을 산출할 수있었다("성숙"은 αMF 시그널 서열이 정확하게 제거된 것을 지시한다). 단백질 산물의 전체량은 에드만 분해에 의해 회수된 피이크의 세기를 기초로하여 단백질의 pmol로 산출하였다. 이어, 각 특정 단백질(즉, 각각의 "검출된 N-말단"에 대하여)에 대하여, 전체량에 대한 몰%를 산출하였다.
실시예 16
대량생산에 적합한 효모에서 E1 작성물의 발현 및 정제
에스.세레비시아애 αMF 리더 펩티드를 치환하기 위하여 몇 개의 다른 리더 서열, 즉 CHH(카르시누스 마에나스(Carcinus maenas) 고혈당 호르몬의 리더 서열), Amyl1 (에스. 옥시덴탈리스(S.occidentalis)로부터 아밀라제의 리더 서열), Gam1 (에스. 옥시덴탈리스(S.occidentalis)로부터 글루코아밀라제의 리더 서열), Phy5 (진균의 피타제로 부터의 리더 서열), pho1 (피치아 파스토리스(Pichia pastoris)로 부터의 산 포스파타제의 리더 서열) 및 CL (조류의 리조짐 C, 1,4-베타-N-아세틸무라미다제 C의 리더)를 사용하여 E1-H6(즉, C-말단 his-태그를 갖는 E1)에 결찰시켰다. 모든 구조물을 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 발현시키고 생성한 세포 용균물 각각을 웨스턴 블럿 분석처리하였다. 상기에 의해, 리더 또는 시그널 서열 또는 펩티드의 제거정도는 CL이 리더 펩티드로 사용된 구조물을 제외하고는 극히 낮다는 것을 결론지을 수 있다. 이것은 Ni-IDA 정제된 물질의 에드만 분해에 의해 CHH-E1-H6 구조물에 대해서도 확인되었다: 몇 개의 상이한 서열이 회수되긴 했으나 완전히 절단된 생성물은 검출되지 않았다 (표 4 참조).
주: SDS-PAGE 및 PVDF-막으로 블러팅하는 것에 의해 분리한 후 상이한 단백질 밴드의 N-아미노산 서열결정을 기초로 하여 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에서 발현된 CHH-E1-H6 단백질의 N-말단의 동정.
상기 기재한 바와 같이, 세포 용균물의 웨스턴-블럿에 의해 E1 특이적 단백질 밴드 패턴이 밝혀졌으며, 이는 CL 리더 펩티드의 정확한 제거 정도가 높음을 나타낸다. 이는 상기 리더가 효모로부터 유래한 것이 아니기 때문에 놀라운 것이다. GuHCl 용해되고 Ni-IDA 정제된 물질의 에드만 분해에 의해 아미노산 서열결정하면 84%의 E1 단백질이 정확하게 제거되며 또 그 물질은 분해 산물을 실질적으로 갖지 않음이 확인되었다. 16%의 가공되지 않은 물질이 존재하지만, 이 물질은 글리코실화되지 않은 것이어서 혼합물로부터 용이하게 제거될 수 있어 정확하게 절단되고 글리코실화된 E1을 특이적으로 농축시킬 수 있다. 이러한 농축방법은 렉틴상의 친화성 크로마토그래피이며, 다른 사항에 대해서는 실시예 19에 나타낸 바와 같다. 다르게는, 소수성 특징이 더 큰 비-글리코실화 물질을 선택사용하여 다른 농축과정을 최적화할 수 있다. CL-H1-H6 단백질로부터 CL 리더 펩티드를 정확하게 제거하는 것은 질량 분광계에 의해 확인하며, 이에 의해 유전형 1b E1의 5개의 N-글리코실화 부위중 4개 까지가 점유될 수 있음이 확인되며, 서열 NNSS (아미노산 233-236; 서열 번호: 73)는 단일 N-글리코실화 부위로 간주될 수 있다.
실시예 17
한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha )에서 CL-E2-H6 암호화 구조물로부터 발현된 HCV E2 단백질의 정제 및 생화학적 특징
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 발현된 CL-E2-VIEGR-H6 (본 실시예에서는 "CL-E2-H6"으로도 표시됨) 단백질로부터 CL 리더 펩티드를 제거하는 효율을 분석하였다. HCV E2s (aa 383-673)은 his-태깅된 단백질로 발현되기 때문에, 수집된 세포의 GuHCl-용해후 발현된 단백질의 신속하고 효과적인 정제를 Ni-IDA상에서 실시하였다. 간단히 말해, 세포 펠릿을 30 mM 인산염, 6M GuHCl, pH 7.2 (9 mL 완충액/g 세포)에 재현탁시켰다. 이 단백질을 320 mM (4% w/v) 아황산나트륨 및 65 mM (2% w/v) 테트라티온산 나트륨 존재하, 실온에서 철야로 술폰화시켰다. 냉동-해동 주기 후 용균물을 원심분리(10,000 g, 30분, 4℃)에 의해 깨끗하게 만들었다. Empigen BB (Albright & Wilson) 및 이미다졸을 최종 농도 1% (w/v) 및 20 mM로 각각 부가하였다. 다른 추가의 크로마토그래피 단계를 Åkta FPLC 워크스테이션(파마시아 제조)상에서 실시하였다. 샘플을 0.22 ㎛ 포어 크기의 막(셀룰로오스 아세테이트)을 통하여 여과시키고 Ni-IDA 칼럼(Ni2+가 로딩된 Chelating Sepharose FF, 파마시아 제조)상에 걸고, 50 mM 인산염, 6 M GuHCl, 20 mM 이미다졸이 보충된 1% Empigen BB, pH 7.2 (완충액 A)를 사용하여 280 nm에서 흡수도가 기저 레벨에 도달할 때 까지 평형처리시켰다. 완충액 D, 50 mM 인산염, 6M GuHCl, 0.2 % Empigen BB (pH 7.2), 200 mM 이미다졸을 적용하는 것에 의해 his-태깅된 생성물을 용출시켰다. 정제된 물질은 SDS-PAGE 및 E2에 특이적인 특정 모노클로날 항체(IGH212)를 사용하는 웨스턴-블럿에 의해 분석하였다(도 41). IMAC-정제된 E2-H6 단백질은 에드만 분해에 의해 N-말단 서열결정처리시켰다. 이 단백질을 N-글리코시다제 F(로쉐 제조) (0.2 U/㎍ E2, PBS3% empigen BB중 37℃에서 1시간 배양)처리시키거나 또는 미처리 상태로 둔다. 글리코실화된 E2-H6 단백질 및 탈글리코실화된 E2-H6 단백질을 SDS-PAGE처리시키고 PVDF-막상에 블러팅하여 아미노산 서열결정하였다(분석은 PROCISETM492 단백질 서열결정기(어플라이드 바이오시스템스 제조) 상에서 실시하였다). 이 단계에서 SDS-PAGE는 일부 분해 산물을 나타내므로, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분별처리를 실시하였다. Ni-IDA 용출액을 한외여과(MWCO 10kDa, 센트리플러스, 아미콘, 밀리포어)에 의해 농축시키고 PBS, 1% Empigen BB중의 Superdex G200 (파마시아 제조)상에 로딩하였다. SDS-PAGE상에서의 이동을 기준으로 하여 ~30kDa 내지 ~70kDa사이의 Mr을 갖는 완전한 E2s 관련 생성물을 함유하는 용출 분획을 모아서 알킬화시켰다 (5 mM DTT를 사용하여 37℃에서 30분간 배양한 다음 20 mM 요오도아세트아미드를 사용하여 37℃에서 30분간 배양함). IMAC 정제후 있을 수 있는 분해 생성물은 크기 배제 크로마토그래피에 의해 완전한 생성물을 분별하는 것에 의해 극복될 수 있다. 예상치 못한 양호한 결과를 얻었다. N-말단 서열결정화를 기준으로 하여, CL 리더 펩티드가 제거된 E2 생성물의 양을 산출할 수 있었다. 단백질 생성물의 전체 양은 에드만 분해에 의해 회수된 피이크의 세기를 기본으로 하여 단백질의 pmol로 계산하였다. 이어, 각 특정 단백질(예컨대 각 "검출된 N-말단")의 경우, 전체양에 대한 몰%를 산출하였다. 현재의 실험에서, E2-H6의 정확한 N-말단만이 검출되었으며 또 E2 단백질에 포함되지 않는 E2 단백질의 아미노산을 갖지 않거나 또는 N-말단 아미노산을 함유하는 E2-H6 변이체는 존재하지 않았다. 결론적으로, 에이치. 폴리모르파 (H. polymorpha)에 의해 CL-E2-H6 단백질로서 발현된 E2-H6 단백질은 시험관에서 추가의 가공없이 95% 이상의 정확하게 절단된 단백질로서 분리되었다. 이것은 E2-H6 단백질에 대한 αMF-E2-H6 단백질의 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의한 리더 펩티드 제거의 충실성과 명확한 대조를 이루며, 분리된 단백질의 25%로 발생하는 것으로 계산되었다 (표 3 참조).
실시예 18
CL-H6-K-E1 암호화 구조물로부터 한세눌라 폴리모르파( Hansenula polymorpha )에서 발현된 HCV E1 단백질의 정제 및 생화학적 특징 및 H6-함유 단백질의 시험관내 가공
한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)에서 발현된 CL-H6-K-E1로부터 CL 리더 펩티드의 제거 효율 뿐만 아니라 h6(his-tag)-어댑터 펩티드 및 Endo Lys-C 가공부위를 제거하기 위한 시험관내 가공의 효율을 분석하였다. HCV E1s(aa 192-326)은 N-말단 His-K-태깅된 단백질 CL-H6-K-E1으로서 발현되기 때문에, 실시예 17에 기재된 바와 같이 신속하고 효과적인 정제를 실시할 수 있다. H6-K-E1 ( 및 가능하게는 잔류 CL-H6-K-E1) 단백질의 IMAC-크로마토그래피 정제의 용출 프로필은 도 42에 도시한다. SDS-PAGE 및 겔의 은 염색 그리고 E1에 특이적인 특정 모노클로날 항체(IGH201)를 사용한 웨스턴-블럿 분석(도 43) 후, 재조합 E1s 생성물을 함유하는 용출 분획(63-69)을 모으고('IMAC 푸울') 또 철야로 엔도프로테아나제 Lys-C (로쉐) 처리 (효소/기질 비 1/50 (w/w), 37℃)시킴으로써 H6-K-융합 테일을 제거하였다. 비-처리 융합 생성물의 제거는 Ni-IDA 칼럼상에서 음성 IMAC 크로마토그래피 단계에 의해 실시함으로써 Endo-Lys-C-가공된 단백질을 유동 분획으로 수집하였다. 여기서 Endo-Lys-C 분해된 단백질 샘플을 10 mM NaH2PO4.3H2O, 1% (v/v) Empigen B, pH 7.2 (완충액 B)에 의해 10배 희석시킨 후 Ni-IDA 칼럼상에 적용한 다음 280 nm에서 흡수도가 기저 레벨에 도달할 때 까지 완충액 B를 사용하여 세척하였다. 유량을 상이한 분획(1-40)으로 수집한 다음 E1s-생성물이 존재하는지 스크리닝하였다(도 44). N-말단 H6-K (및 가능하게는 잔류 CL-H6-K) 테일이 제거 (SDS-PAGE에서의 이동을 기준으로 하여 ~15 kDa 내지 ~30 kDa 범위의 Mr을 가짐)된 다음, 은 염색 또는 E1에 대하여 특이적인 특정 모노클로날 항체(IGH201)를 사용하여 웨스턴 블럿 분석시켜 온전한 E1을 함유하는 분획(7-28)을 모아서 알킬화시켰다 (5 mM DTT를 사용하여 37℃에서 30분간 배양한 다음 20 mM 요오도아세트아미드를 사용하여 37℃에서 30분간 배양함).
상기 물질을 N-말단 서열결정처리(에드만 분해)하였다. 단백질 샘플은 N-글리코시다제 R (로쉐 제조) (0.2U/㎍ E1, PBS/3% empigen BB중 37℃에서 1시간 배양)로 처리되거나 또는 미처리 상태로 보존한다. 글리코실화된 E1 단백질 및 탈글리코실화된 E1 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리하였고 PVDF-막상에 블러팅하여 에드만 분해(PROCISETM492 단백질 서열기(어플라이드 바이오시스템스 제조)상에서 분석을 실시함)에 의해 더욱 분석하였다. N-말단 서열결정화를 기본으로 하여 정확하게 가공된 E1 생성물의 양을 산출할 수 있었다 (가공은 H6-K-서열의 정확한 절단을 포함함). 단백질 생성물의 전체 양은 에드만 분해에 의해 회수된 피이크의 세기를 기준으로 하여 단백질의 pmol로 산출하였다. 이어, 특정 단백질(즉, 각 "검출된 N-말단")의 경우, 전체에 대한 몰%를 산출하였다. 현재 실험에서, E1의 정확한 N- 말단만이 검출되었고 또 H6-K-E1의 다른 가공 변이체의 N-말단은 검출되지 않았다. 이를 기준으로 하여, E1 단백질에 대한 H6-K-E1의 E1 (및 가능하게는 잔류하는 CL-H6-K-E1) 단백질의 Endo Lys-C에 의한 시험관내 가공은 95% 이상의 충실성을 갖도록 생성하는 것으로 산출되었다.
실시예 19
저-글리코실화된 형태의 HCV E1의 헤파린에 의한 특이적 제거
효모 세포로부터 HCV 엔빌로프 단백질을 특이적으로 정제하기 위한 단계를 찾기 위하여 헤파린과의 결합을 평가하였다. 헤파린은 몇 개의 바이러스에 결합하는 것으로 알려져 있으므로 HCV 엔빌로프에 대한 결합은 이미 제시된 바 있었다 (Garson, J. A. 등 1999). 이러한 가능한 결합을 분석하기 위하여, 헤파린을 비오티닐화시키고 HCV E1과의 상호작용을 마이크로티터플레이트에서 분석하며, 이때 마이크로티터플레이트는 에이치.폴리모르파로부터의 술폰화된 HCV E1, 에이치. 폴리모르파로부터 알킬화된 HCV E1 (양쪽 모두 실시에 16에 기재된 바와 같이 제조됨) 및 백시니아 발현벡터로 감염된 포유동물 세포 배양액으로부터 알킬화된 HCV E1으로 피복된 것이다. 놀랍게도, 강한 결합은 에이치.폴리모르파로부터의 술폰화된 HCV E1에 의해서만 관찰될 수 있었던 반면에, 포유동물 세포 배양액으로부터의 알킬화된 HCV E1과의 결합은 전혀 존재하지 않았다. 웨스턴-블럿에 의하여, 본 발명자는 상기 결합은 HCV E1 단백질 혼합물의 저분자량 밴드, 즉 저-글리코실화된 성숙 HCV E1s에 특이적(도 45)이라는 것을 알 수 있었다. 도 45는 술폰화 결합의 제거시 저분자량 E1 (레인 4)이 여전히 관찰되기 때문에 술폰화는 헤파린 결합에 필수적이 아니라는 것을 나타낸다. 그러나, 알킬화는 상기 결합력을 실질적으로 감소시키는데, 이는 본 실시예에 사용된 특정의 알킬화제(요오도-아세트아미드)에 의해 유발될 수 있다. 이러한 발견은 또한 본 발명자들이 고도의 글리코실화를 갖는 (즉, 더 많은 글리코실화 부위가 점유됨) HCV E1 단백질 제제를 위하여 HCV E1 제제를 농축시킬 수 있기 때문에 효모용 CL-HCV-엔빌로프 발현 카세트의 공업적 능력도 나타낸다.
실시예 20
바이러스-유사 입자(virus-like particle: VLP)의 형성 및 분석
에이치. 폴리모르파에서 발현된 HCV E1 및 E2 엔빌로프 단백질이 VLP로 전환(실시예 16 내지 18)하는 것은 WO99/67285호에서 데프라 등에 의해 및 WO01/30815호에서 보스만 등에 의해 기재된 바와 같이 실질적으로 실시하였다. 간단히 말해, HCV 엔빌로프 단백질이 발현되는 형질전환된 에이치. 폴리모르파의 배양후, 세포를 수집하고 GuHCl에서 용균시키고 또 실시예 17에 기재된 바와 같이 술폰화시켰다. His-태그된 단백질을 IMAC에 의해 정제한 다음 실시예 17에 기재된 바와 같이 한외여과에 의해 농축시켰다.
술폰화된 Cys-티올 기를 갖는 HCV 엔빌로프 단백질의 VLP-형성
분리과정 동안 술폰화된 농축 HCV 엔빌로프 단백질은 환원처리시키지 않고 크기 배제 크로마토그래피 칼럼(Superdex G200, 파마시아 제조)상에 로딩하고 PBS, 1% (v/v) Empigen으로 평형화시켰다. 용출 분획은 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 상대적 Mr이 ~29 내지 ~15 kD (SDS-PAGE 이동도 기본)인 분획을 모으고 농축해서 Superdex G200에 로딩하여 PBS, 3%(w/v) 베타인으로 평형화시켜 바이러스-유사 입자 형성(VLP)을 유발하였다. 분획을 모으고, 농축시키며 PBS, 0.5% (w/v) 베타인을 사용하여 탈염시켰다.
비가역적으로 수식된 Cys-티올 기를 갖는 HCV 엔빌로프 단백질의 VLP 형성
분리과정 동안 술폰화된 농축 HCV 엔빌로프 단백질을 환원처리(PBS중 5 mM DTT존재하에서 배양)시켜 술폰화 Cys-티올기를 유리 Cys-티올기로 전환시켰다. 비가역적 Cys-티올 수식은 (i) 20 mM 요오도아세트아미드 존재하에서 30분간 배양하거나, 또는 (ii) 5 mM N-에틸말레이미드 (NEM) 및 15 mM 비오틴-N-에틸말레이미드의 존재하에 30분간 배양하는 것에 의해 실시하였다. 이 단백질을 크기 배제 크로마토그래피 칼럼(Superdex G200, 파마시아 제조)상에 로딩하며, 요오도아세트아미드 블로킹인 경우 PBS, 1% (v/v) Empigen을 사용하여 평형화시키거나, 또는 NEM 및 비오틴-NEM에 의한 블로킹의 경우 PBS, 0.2% CHAPS를 사용하여 평형화시켰다. 용출된 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 상대적 Mr이 ~29 내지~15 kD (SDS-PAGE 이동도 기본)인 분획을 모으고 농축해서 Superdex G200에 로딩하여 PBS, 3%(w/v) 베타인으로 평형화시켜 바이러스-유사 입자 형성(VLP)을 유발하였다. 분획을 모으고, 농축시키며 또 요오도아세트아미드 블로킹인 경우 PBS, 0.5% (w/v) 베타인을 사용하여 탈염시키거나, 또는 NEM 및 비오틴-NEM을 사용한 블로킹인 경우 PBS, 0.05% CHAPS를 사용하여 탈염시켰다.
가역적으로 수식된 Cys-티올 기를 갖는 HCV 엔빌로프 단백질의 VLP 형성
분리과정 동안 술폰화된 농축 HCV 엔빌로프 단백질을 환원처리(PBS중 5 mM DTT 존재하에서 배양)시켜 술폰화 Cys-티올기를 유리 Cys-티올기로 전환시켰다. 가역적 Cys-티올 수식은 디티오디피리딘 (DTDP), 디티오카르바메이트(DTC) 또는 시스테인의 존재하에서 30분간 배양하는 것에 의해 실시하였다. 이 단백질을 크기 배제 크로마토그래피 칼럼(Superdex G200, 파마시아 제조)상에 로딩하고, PBS, 1% (v/v) Empigen으로 평형화시켰다. 용출된 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿에 의해 분석하였다. 상대적 Mr이 ~29 내지 ~15 kD (SDS-PAGE 이동도 기본)인 분획을 모으고 농축해서 Superdex G200에 로딩하여 PBS, 3%(w/v) 베타인으로 평형화시켜 바이러스-유사 입자 형성(VLP)을 유발하였다. 분획을 모으고, 농축시키며 또 PBS, 0.5% (w/v) 베타인을 사용하여 탈염시켰다.
에이치.폴리모르파-발현된 E2-H6의 VLP를 얻기 위한 PBS, 3% (w/v) 베타인을 사용한 크기 배제 크로마토그래피의 용출 프로필은 도 46 (술폰화됨) 및 도 47(요오도아세트아미드를 사용하여 알킬화됨)에 도시되어 있다.
에이치.폴리모르파-발현된 E1의 VLP를 얻기 위한 PBS, 3% (w/v) 베타인을 사용한 크기 배제 크로마토그래피의 용출 프로필은 도 48 (술폰화됨) 및 도 49(요오도아세트아미드를 사용하여 알킬화됨)에 도시되어 있다. 생성한 VLP는 도 50에 도시한 바와 같이 SDS-PAGE 및 웨스턴-블럿에 의해 분석하였다.
에이치.폴리모르파-발현된 HCV 엔빌로프 단백질에 의해 형성된 VLP의 크기 분석
VLP 입자 크기는 동적광산란(Dynamic Light Scattering)에 의해 측정하였다. 광 산란 실험의 경우, 입자 크기 분석기 (모델 Zetasizer 1000 HS, 영국 워세스터 말버른에 소재하는 말버른 인트스루먼트 리미티드 제조)를 이용하며, 이것은 광자 상관관계 분광계(PCS) 소프트웨어에 의해 제어되었다. 광자 상관관계 분광계 또는 동적광산란(DLS)은 브라운 운동을 측정하여서 그것을 입자 크기와 관련시키는 광학적 방법이다. 연속적인, 가시 레이저 비임으로부터 광은 현탁액중의 거대분자 또는 입자의 앙상블을 직접 통과하고 브라운 운동하에서 이동한다. 레이저 광의 일부는 입자에 의해 산란되며 이러한 산란광은 광증배관에 의해 측정된다. 산란광의 세기변동은 전기적 펄스로 전환되어 상관검출기로 공급된다. 이로써 컴퓨터를 거치는 자기상관함수가 생성되며, 적합한 데이터 분석을 실시한다. 사용된 레이저는 고정파장 633 nm을 갖는 10 mW 단색성, 간섭성 He-Ne 레이저이다. 각 샘플의 경우, 3 내지 6회의 연속 측정을 실시하였다. 이 실험의 결과를 하기 표 5에 수록한다.
주: 에이치. 폴리모르파(H. polymorpha)에 의해 발현된 HCV 엔빌로프 단백질의 표시된 VLP-조성에 대한 동적광산란 분석의 결과. VLP 입자 크기는 입자의 평균 직경으로 나타낸다.
에이치.폴리모르파로부터 유도된 술폰화된 HCV E1는 여전히 한세눌라로부터 유도된 알킬화된 HCV E1과 동일한 크기 범위를 갖는 입자를 형성한다는 관찰은 놀라운 것이다. 술폰화의 결과로서 네가티브 변화의 높은 순수 증가(8개 이하의 Cys-티올 기가 HCV E1상에서 수식될 수 있다)는 서브유닛 간의 이온 반발을 유도할 것이므로 상기와 같은 효과는 예상치 못한 것이었다. 시험된 다른 가역적 시스테인 수식제는 입자 형성을 허용하였지만, 이런 방식으로 생성된 HCV E1은 술폰화된 물질에 비하여 안정하지 않은 것으로 밝혀져, HCV E1의 디술피드-기제 응집을 초래하게 된다. 이들 다른 가역적 블로커(blocker)를 사용하기 위하여, 다른 최적 조건이 필요할 수 있다.
실시예 21
한세눌라-생성된 HCV E1-H6 및 백시니아-감염된 포유동물 세포로부터 생산된HCV E1의 항원성 등가
WO 99/67285호에서 Depla 등에 의해 기재한 바와 같이, 한세눌라-생산된 HCV E1-H6과 HCV 만성 보균자 혈청과의 반응을 HCV-재조합 백시니아 바이러스 감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E1의 반응성과 비교하였다. 시험된 양쪽 HCV-E1 제제는 VLP로 구성되었으며, HCV E1 제제는 NEM 및 비오틴-NEM에 의해 알킬화되어 있었다. 양쪽 HCV E1 VLP-제제와 HCV 만성 보균자 혈청과의 반응성은 ELISA에 의해 결정하였다. 결과를 하기 표 6에 수록한다. 표 6으로부터 알 수 있듯이, HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포에서 발현된 HCV E1과 에이치.폴리모르파에서 발현된 HCV E1 사이에는 반응성에서 아무런 차이가 나타나지 않았다.
주: 포유동물 세포 배양액에서 생산된 E1 또는 에이치.폴리모르파에서 생산된 E1의 항원성을, 인간 HCV 만성 보균자로부터 얻은 혈청 패널상에서 평가하였다. 이를 위하여, 비오티닐화된 E1을 스트렙트아비딘 피복된 ELISA 플레이트에 결합시켰다. 그후, 인간 혈청을 1/20 희석하여 부가하고 또 혈청으로부터 E1에 결합된 면역글로불린은 퍼옥시다제로 라벨링된 토끼-항-인간 IgG-Fc 특이적 이차 항체를 이용하여 검출하였다. 결과는 OD값으로 표시한다. 평균치는 시험한 모든 혈청 샘플의 OD값의 평균치이다.
실시예 22
한세눌라 생산된 HCV E1-H6 및 백시니아-감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E1의 면역원성 등가
WO 99/67285호에서 Depla 등에 의해 기재한 바와 같이, 한세눌라-생산된 HCV E1-H6의 면역원성을 HCV-재조합 백시니아 바이러스 감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E1의 면역원성반응성과 비교하였다. 시험된 양쪽 HCV-E1 제제는 VLP로 구성되었으며, HCV E1 단백질은 요오도아세트아미드에 의해 알킬화되었다. 양쪽 VLP 제제는 알룸과 함께 제형화되며 Balb/c 마우스에 주사하였다(각 주사당 3주 간격으로 3회 근육내/피하주사하며 각 주사는 0.13% Alhydrogel(덴마크 수퍼포스 제조)을 함유하는 125 ㎕중의 5㎍ E1으로 구성된다). 3회 면역화시킨지 10일 후 마우스로부터 혈액을 채취하였다.
이 실험 결과를 도 51에 도시한다. 도 51의 상부의 경우, 포유동물 세포에서 생산된 E1의 VLP에 의해 면역화되어 형성된 항체를 측정하였다. 항체 역가는 ELISA (실시예 21 참조)에 의해 측정하였으며, 이때 포유동물 세포에서 생산된 "E1"("M") 또는 한세눌라-생산된 E1 ("H")는 ELISA 고형 지지체상에 직접적으로 피복시킨 후 ELISA 플레이트를 카세인으로 블로킹하였다. 도 5의 하부의 경우, 한세눌라-생산된 E1의 VLP에 의해 면역화된 후 생성된 항체를 측정하였다. 항체 역가는 ELISA (실시예 21 참조)에 의해 측정하였으며, 이때 포유동물 세포에서 생산된 "E1" ("M") 또는 한세눌라-생산된 E1 ("H")를 ELISA 고형 지지체상에 직접적으로 피복시킨 후 ELISA 플레이트를 카세인으로 블로킹하였다.
측정된 항체 역가는 종점 역가이었다. 종점 역가는 혈청을 희석시켜 결정하며, 에세이의 바탕시험의 평균의 2배에 상당하는 OD(ELISA에 의해 측정됨)를 초래한다.
도 51은 양쪽 E1 조성물의 면역원성 특성 사이에 현저한 차이가 없고 또 측정된 항체 역가는 종점 역가를 실시하기 위한 ELISA에 사용된 항원과는 독립적이라는 것을 도시한다.
효모-유도된 HCV E1은 백신처리시 포유동물 세포 배양액으로부터 유도된 알킬화된 HCV E1을 사용한 백신처리시 얻을 수 있는 보호반응과 유사한 보호반응을 유발하였다. 후자의 반응은 급성 감염 이후 HCV의 만성적 발병을 예방할 수 있다.
실시예 23
술폰화된 한세눌라-생산된 HCV E1-H6의 항원성 및 면역원성 프로필
한세눌라-생산된 HCV E1-H6과 HCV 만성 보균자 혈청의 반응성을, WO 99/67285호에서 Depla 등에 의해 기재된 바와 같이, HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E1의 반응성과 비교하였다. 시험된 양쪽 HCV-E1 제제는 VLP로 구성되었으며, 이때 한세눌라-생산된 HCV E1 단백질은 술폰화되고 또 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E1은 알킬화되었다. 결과를 표 7에 나타낸다. 전체적(평균) 반응성이 동일하였지만, 개별 혈청에 대해 주요한 차이가 확인되었다. 이것은 술폰화된 물질이 알킬화된 HCV E1과는 상이한 방식으로 그의 항원결정부위의 일부를 제공한다는 사실을 의미한다.
술폰화된 한세눌라-생산된 HCV E1-H6의 면역원성을 알킬화된 한세눌라-생산된 HCV E1-H6의 면역원성과 비교하였다. 시험한 양쪽 HCV-E1 제제는 VLP로 구성되었다. 양쪽 VLP 제제를 알룸과 함께 제제화해서 Balb/c 마우스에 주사하였다((각 주사당 3주 간격으로 3회 근육내/피하주사하며 각 주사는 0.13% Alhydrogel(덴마크 수퍼포스 제조)을 함유하는 125 ㎕중의 5㎍ E1으로 구성된다. 3회 면역화시킨지 10일 후 마우스로부터 혈액을 채취하였다.
항체 역가는 실시예 22에 기재된 것과 유사하게 측정하였다. 놀랍게도, 술폰화된 물질을 사용한 면역화는 역가를 평가하기 위한 ELISA에 사용된 항체와 상관없이 더 높은 항체 역가를 초래하였다 (도 51; 상부 패널: 알킬화된 E1에 대해 생성된 항체의 적정; 하부 패널: 술폰화된 E1에 대하여 생성된 항체의 적정; "A": ELISA 플레이트상에 피복된 알킬화된 E1; "S": ELISA 플레이트상에 피복된 술폰화된 E1). 그러나, 상기 실험에서 개별 역가는 분석에 사용된 항원에 따라 상이한데, 이는 HCV 환자의 혈청에서 주목된 관찰을 확인시켜주는 것이다. 따라서, 시스테인 티올 기가 가역적 방식으로 수식된 HCV E1은 면역원성이 더 높으므로 HCV(만성 감염)로부터 보호하는 백신으로서 능력이 더 높다. 또한, 비가역적 블로킹에 의해 유발된 신-항원결정부위에 대한 반응의 유도는 덜 생길 것이다.
주: 알킬화된 E1 (포유동물 세포 배양액에서 생산) 또는 술폰화된 E1-H6 (에이치.폴리모르파에서 생산)의 항원성을, 인간 HCV 만성 보균자로부터 얻은 혈청 패널 및 대조용 혈청("혈액 공여자 혈청") 패널상에서 평가하였다. 이를 위하여 E1을 ELISA 플레이트에 결합시키고 상기 플레이트를 카세인으로 포화시켰다. 인간 혈청을 1/20 희석시켜 부가하고 또 결합된 면역글로불린은 퍼옥시다제로 라벨링된 토끼-항-인간 IgG-Fc 특이적 이차 항체를 이용하여 검출하였다. 결과는 OD값으로 표시한다. 평균치는 시험한 모든 혈청 샘플의 OD값의 평균치이다.
실시예 24
한세눌라-생산된 HCV E1-H6 및 백시니아-감염된 포유동물 세포에서 생산된HCV E1과 백신처리된 침팬지로부터 얻은 혈청과의 동일한 항원 반응성
HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 E1 및 한세눌라에 의해 생산된 E1-H6 (양쪽 모두 알킬화됨)과 백신 처리된 침팬지의 혈청 과의 반응 및 모노클로날항체와의 반응을 비교하였다. 상기 E1 단백질을 ELISA 플레이트에 직접 피복한 다음 카세인을 사용하여 상기 플레이트를 포화시켰다. ELISA 플레이트에 피복된 E1 단백질에 결합하는 항체의 종점 역가를 침팬지 혈청에 대해 및 특정 쥐의 모노클로날 항체에 대해 측정하였으며, 이들 모두는 포유동물 세포에 의해 생산된 E1에 의해 면역화된 동물로부터 얻었다. 종점 역가 측정은 실시예 22에 기재된 바와 같이 실시하였다. 사용한 쥐의 모노클로날 항체는 IGH201 (실시예 25 참조), IGH198 (IGH198 = 23C12, WO96/04385호에 Maertens 등에 의해 기재됨), IGH203 (IGH203 = 15G6, WO96/04385호에서 Maertens 등에 의해 기재됨) 및 IGH202 (IGH202 = 3F3, WO99/50310호에 Maertens 등에 의해 기재됨)이었다.
도 53으로부터 알 수 있듯이, 한세눌라 또는 포유동물 세포에 의해 생산된 E1 단백질과 시험할 때, 7개의 상이한 침팬지의 반응성은 동일하였다. HCV E1에 대한 모노클로날 항체의 반응성 또한 거의 동일하였다. 예방적 백신 연구에는 2개의 침팬지(요란 및 마티)를 이용하였고 또 면역검사(challlenge)시 급성 감염을 일소시킬 수 있었던 반면에 대조용 동물은 감염을 일소시키지 못하였다. 5개의 다른 침팬지(톤, 필, 마셀, 페기, 펨마)를 치료적 백신 연구에 이용하였고, 혈청중의 ALT 및/또는 HCV E1 면역화시 간 생검에서 조직학적 활성 지수에 의해 측정된 바와 같이, 간 손상의 감소를 나타내었다.
이 실험에서 얻은 결과는 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) 및 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서 HCV E2 단백질을 발현시켰던 무스틸리와 그 동료(Mustilli, A.C. 등, 1999)의 발견과는 완전히 상이하였다. 그러나, 정제된 효모-생산된 E2는 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E2에 의해 면역화된 침팬지로부터 얻은 혈청을 사용하는 경우 반응성이 더 낮은 반면에, 모노클로날 항체와의 반응성은 효모 생산된 HCV E2에 대해 더 높은 점에서 포유동물 세포(CHO) 세포에 의해 생산된 HCV E2와는 상이하였다.
실시예 25
형광 보조된 탄수화물 전기영동(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis: FACE)에 의한 HCV E1의 글리코실화 프로필
한세눌라-생산된 HCV E1 및 HCV-재조합 백시니아 바이러스-감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 HCV E1의 글리코실화 프로필을 WO99/67285호에서 Depla 등에 의해 기재된 바와 같이 비교하였다. 이것은 형광보조된 탄수화물 전기영동(FACE)에 의해 실시하였다. 포유동물 세포 또는 한세눌라에 의해 생산된 E1s로부터 펩티드-N-글리코시다제(PNGase F)에 의해 올리고당을 방출시키고 ANTS로 라벨링하였다(E1 단백질은 PNGase F 분해전에 요오도아세트아미드에 의해 알킬화시켰다). ANTS-라벨링된 올리고당은 21% 폴리아크릴아미드 겔상에서 PAGE에 의해 15 mA의 전류로 4℃에서 2 내지 3시간 동안 분리하였다. 도 54로부터, 포유동물 세포에 의해 생산된 E1 및 한세눌라에 의해 생산된 E1-H6상의 올리고당은 7 내지 11 단당류의 중합도를 갖는 올리고말토오스처럼 이동한다고 결론지을 수 있었다. 이것은 한세눌라 발현 시스템은 놀랍게도 초글리코실화되지 않고 또 포유동물 세포에서 생산된 E1 단백질에 부가된 당쇄와 유사한 길이를 갖는 당쇄를 갖는 E1 단백질을 초래한다는 것을 나타낸다.
실시예 26
사카로마이세스( Saccharomyces )- 및 한세눌라( Hansenula )-생산된 E1s 및 HCV-재조합 백시니아 바이러스 감염된 포유동물 세포에 의해 생산된 E1s로부터 유도된 N-결합된 올리고당의 서열결정화
사카로마이세스(Saccharomyces) 또는 한세눌라(Hansenula) 배양액(실시예 15-16 참조) 또는 HCV-재조합 백시니아 바이러스 (WO96/04385호에서 Maertens 등 참조)에 감염된 RK13 세포의 배양액으로부터 정제되고 PBS, 05% 베타인중에 존재하는 E1s (225 ㎍)를 탈글리코실화 배양 완충액 (50 mM Na2PO4, 0.75% Nonidet P-40)을 사용하여 희석시켜 최종 농도 140 ㎍/mL로 만들었다. 이 용액의 pH를 농축 H3PO4를 사용하여 pH 5.5로 조정하였다. 이 용액에 2U PNGase F (플라보박테륨 메니고셉티쿰(Flavobacterium menigosepticum)의 펩티드-N4-(아세틸-베타-글루코사미닐)-아스파라긴 아미다제; EC 3.5.1.52; 로쉐로부터 구입)를 부가하고 그 샘플을 37℃에서 철야로 배양하였다. 철야 배양후, 용액의 pH는 농축 H3PO4를 사용하여 pH 5.5로 조정하였다. 4부피의 아세톤(-20℃에서)을 부가하는 것에 의해 단백질 및 올리고당을 석출시키고 또 그 혼합물을 -20℃에서 15분간 배양하였다. 샘플을 4℃에서 13000 rpm으로 5분간 원심분리시켰다. 아세톤 상층액을 제거하고 펠릿은 -20℃에서 1시간 배양한 후 150 μL 빙냉된 60% 메탄올을 부가하였다. 방출된 올리고당을 함유하는 메탄올 상층액을 수집하고 회전 증발기(SpeedVac 제조)에 의해 건조시켰다.
건조된 E1s 글리칸 뿐만 아니라 기준 올리고당 (모두 Glyko 제조, 영국 비세스터 소재; 도 55 참조) Man-9 (11 당단류 단위), Man-8 (10 단당류 단위), Man-7 (9 단당류 단위), Man-6 (8 단당류 단위) 및 Man-5 (7 단당류 단위)를 5 μL의 2-아미노벤즈아미드 (2-AB) 라벨링제(30% HOAc/70% DMSO중의 ±0.35 M 2-AB+ ± 1M NaCNBH3)중에 용해시켜 최종 글리칸 농도 5 내지 100 μM로 만들었다. 상기 글리칸 용액을 65℃에서 2시간 동안 배양하였다. 30분 후, 샘플을 보르텍스에 의해 혼합하였다. 결합시킨 후, 과량의 2-AB를 제거하였다. 샘플을 16-μL 정제수(MilliQ)로 희석시키고 Sephadex G-10 칼럼(직경 1 cm, 높이 1.2 cm, 아머샴 바이오사이언스 제조; VacElut 시스템(바리언)에 결합됨)에 부가한 다음 칼럼을 건조시켰다.
2 x 100 μL 정제수(MilliQ)를 칼럼에 적용함으로써 라벨링된 올리고당을 용출시켰다. 기준 탄수화물(Man-9, Man-8, Man-7 및 Man-6)의 용출액을 건조시키고 HPLC 분석할 때 까지 -70℃에서 저장하였다. E1s 샘플 분만 아니라 Man-9 기준 글리칸의 용출물을 4개의 PCR 튜브에 분포시키고 건조시켰다. 표 8에 약술된 반응을 실시하였으며, 이들 반응 모두는 37℃에서 철야로 진행되며, 다만 튜브 3에서의 반응은 1시간 후에 종료되었다. 사용된 엑소글리코시다제 효소(모두 Glyko로부터 구입, 영국 비세스터 소재)의 최종 농도는 다음과 같았다: α1-2 만노시다제의 경우(아스페르길루스 사이토이): 2 ml/mL; α-만노시다제 (Jack Bean): 50 U/mL; 및 β-만노시다제 (헬릭스 포마티아(Helix pomatia)): 4 U/mL.
도 56은 치토바이오스에 결합된 10개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스를 도시한다. 각 말단 만노오스 잔기는 α1-3 결합에 의해 비-말단 만노오스 잔기에 결합된다. 도 56의 올리고만노오스는 엑소글리코시다제 α1-2 만노시다제에 의해 절단에 완전히 내성이다. 도 56의 올리고만노오스를 엑소글리코시다제 α-만노시다제와 장기간(철야) 배양하면 모든 α-결합(α 1-2, α1-3, α1-6)의 절단을 초래하지만, β-결합은 절단시키지 않는다. 따라서 생성한 올리고당은 4'-β-만노실 치토바이오스일 것이다. 이 4'-β-만노실 치토바이오스 잔기는 엑소글리코시다제 β만노시다제의 작용을 통하여 만노오스 및 치토바이오스로 전환될 수 있다. 공급자(Glyko)의 명세에 따르면, α-만노시다제는 기준 올리고당 Man-6(도 55.D 참조)을 4'-β-만노실 치토바이오스로 완전히 전환시키고 또 β-만노시다제에 의한 만노오스 및 치토바이오스로 더 전환되는 것은 완전한 것으로 보고되어 있다.
도 57은 치토바이오스에 결합된 9개 만노오스 잔기로 구성된 고급 올리고만노오스를 도시한다. 이 올리고만노오스에서, 1개 말단 만노오스 잔기는 α1-2 결합에 의해 비-말단 만노오스 잔기에 결합된다. 엑소글리코시다제 α1-2 만노시다제의 작용시, 상기 α1-2-결합된 만노오스는 제거될 것이다. 이어 α-만노시다제 및 β-만노시다제를 작용시키면, 도 56의 올리고만노오스에 기재된 바와 같은 반응 생성물을 얻을 것이다. 공급자(Glyko)의 명세에 따르면, α1-2 만노시다제는 기준 올리고당 Man-9 및 Man-6을 Man-5 (도 55 참조)로 >90%의 효율로 전환시킬 수 있다.
도 58은 치토바이오스에 결합된 9게 만노오스 잔기로 구성된 기준의 고급 올리고만노오스 Man-9를 도시한다. 이 올리고만노오스에서, 모든 말단 만노오스 잔기는 α1-2 결합에 의해 비-말단 만노오스 잔기에 결합되어 있다. 엑소글리코시다제 α1-2 만노시다제를 작용시키면, Man-9는 공급자의 명세에 따른 >90%의 효율로 Man-5로 전환될 것이다. 이어 α-만노시다제를 사용하여 분해하면 Man-5를 4'-β-만노실 치오바이오스로 전환할 것이다.
표 8에 나타낸 바와 같이 상이한 반응 튜브의 함량을 원심분리성 진공 증발기 또는 냉동건조기에서 건조시키고 HPLC 분석까지 -70℃에서 저장하였다. 칼럼에 부가하기 전에, 각 샘플(E1s 및 기준용)을 25 μL 물에 용해시켜서 WatersAlliance HPLC 스테이션에 결합된 TSK gel-Amide-80 (0.46 x 25 cm, 토소 바이오셉 제조)상에 로딩시켰다.
올리고당의 분리는 주위온도에서 1.0 mL/분으로 실시하였다. 용매 A는 아세토니트릴중의 0.1% 아세트산으로 구성되며 또 용매 B는 물중의 0.2% 아세트산-0.2% 트리에틸아민으로 구성되었다. 2-AB 라벨링된 올리고당의 분리는 5개 칼럼 부피에 대해 28% B 이소크래틱을 사용한 다음 15개 칼럼 부피에 대해 45% B로 선형적으로 증가시켜 실시하였다.
기준 올리고당 Man-6은 53±1 분간 용출시켰고, Man-7은 59±분간 용출시켰으며, Man-8은 67±2분간, 그리고 Man-9는 70±1분간 용출시켰다; 4'-β-만노실 치토바이오스는 10±1분간 용출시켰고 또 치토바이오스는 6±1분간(도시하지 않음) 용출시켰다. 이것은 엑소글리코시다제없이 철야 배양한 후(도 63의 크로마토그램의 트레이스1; Man-9), α1-2 만노시아제를 사용하여 철야 배양한 후(도 63의 크로마토그램의 트레이스 2); Man-5 및 Man-6의 혼합물), α-만노시다제를 사용하여 1시간 또는 철야 배양한 후 (도 63의 크로마토그램의 트레이스 3 및 4; 4'-β-만노실 치토바이오스) 및 α- 및 β-만노시다제를 사용하여 철야 배양한 후 (도 6의 크로마토그램의 트레이스 5; 치토바이오스), Man-9의 반응 생성물에 대해 예시한 것이다. 도 63의 크로마토그램의 트레이스 6은 공급된 용매 구배를 나타낸다.
엑소글리코시다제없이 사카로마이세스-생산된 E1s(PNGaseF 처리한 후 얻음)의 올리고당의 반응생성물은 주로 59±1분(15%), 67±1분(45%), 70±1분(25%) 및 75±1분(15%)에서 용출되는 주로 4개 탄수화물이었다. 사카로마이세스-생산된 E1s에서 Man(8)-GlcNAc(2) 및 Man(9)GlcNAc(2)의 전체 함량은 ~65% 이었다. α1-2 만노시다제와의 반응에서는 오직 70±1분의 체류시간을 갖는 탄수화물만이 사라졌다. 75±1분의 체류시간을 갖는 탄수화물의 세기 및 67±1분의 체류시간을 갖는 탄수화물의 세기는 증가하였다. 이것은 모두 말단 만노오스 단위는 α(1-2) 구조를 갖는다는 것을 의미한다. α 만노시다제와 철야 배양한 후 모든 탄수화물 사슬은 4'-β-만노실 치토바이오스로 환원된다. 이것은 탄수화물은 고 만노오스이고 또 1개를 제외한 모든 만노오스 잔기는 α 구조를 갖는다는 것을 의미한다. 상기 4'-β-만노실 치토바이오스 잔기를 치토바이오스로 환원시키는 것은 β-만노시다제를 사용하여 철야 배양한 후 분명하였다. 생성한 크로마토그램을 도 64에 도시하며, 이것은 도 63의 크로마토그램에 기재된 것과 동일한 조건하에서 얻은 것이었다. 결과를 하기 표 9에 수록한다.
백시니아 감염된 세포에 의해 생산된 E1s을 사용하여 동일 실험을 반복하면 놀랍게도 완전히 상이한 그림을 나타내었다. 효소를 사용하지 않은 반응에서, 탄수화물의 복합체 혼합물이 존재하였다(도 65 및 표 9 참조). 단당류(8)-GlcNAc(2) 및 단당류(9)-GlcNAc(2)의 전체 함량은 37% 이었다. α1-2 만노시다제를 사용한 반응후, 체류시간이 70±1분 및 59±1분인 탄수화물은 사라졌다. α 만노시다제를 사용하여 철야 배양한 후, 단당류(6)-GlcNAc(2)의 실제 양은 4'-만노실 치토바이오스 생성물과 함께 유지되었다. 이것은 올리고당 브랜치의 1개는 α만노시다제 분해를 견딘다는 것을 나타낸다. 이것은 N-결합된 올리고당의 Manα(1-2) 말단 브랜치에 결합된 1 또는 2개의 글루코오스 잔기의 존재에 의해 설명될 수 있다. 글루코오스-함유 올리고당의 임의 구조는 도 62에 도시되어 있다. 글루코오스 함유 올리고당의 가능한 반응 생성물은 표 10에 나타내어져 있다. α1-2 만노시다제 반응후에는 Man-7-등가의 올리고당(즉, 9개 단당류로 구성된 올리고당)은 존재하지 않는 것처럼, 이들 글루코오스 잔기는 도 62에 도시된 올리고당 구조의 B-브랜치에 결합될 것으로 보인다. 그러나, 도 62에 도시된 올리고당의 A- 및 B-브랜치 모두는 글루코오스에 의해 부분적으로 종료되어 있는 것은 배제할 수 없다.
4'-β-만노실 치토바이오스 잔기를 치토바이오스로 환원하는 것은 β만노시다제와의 철야 배양후 분명하였다. 그 결과 얻은 크로마토그램은 도 65에 도시되어 있으며, 이것은 도 63-64의 크로마토그램에 기재된 것과 동일한 조건하에서 얻었다.
얻은 결과를 하기 표 9에 수록한다.
한세눌라-생산된 E1s를 사용하여 동일한 실험을 반복하면 놀랍게도 완전히 상이한 그림을 나타내었다. 효소를 사용하지 않는 반응에서는 주로 체류시간이 67±2분 및 70±1분인 2개의 탄수화물이 존재하며, 각각 Man-8 및 Man-9에 상응한다. 한세눌라-생산된 E1s에서 Man(8)-GlcNAc(2) 및 Man(9)GlcNAc(2)의 전체 함량은 ~90% 이었다. α1-2 만노시다제와 반응한 후, 탄수화물은 주로 체류시간 45±1분의 Man-5 및 체류시간 53±1분인 Man-6으로 환원되었다. α만노시다제와의 철야 배양후, 모든 탄수화물 사슬은 4'-β-만노실 치토바이오스 잔기로 환원되었다. 이것은 탄수화물은 고만노오스형이며 또 1개를 제외한 모든 만노오스 잔기는 α구조를 갖고 있음을 의미한다. 4'-β-만노실 치토바이오스 잔기가 치토바이오스로 환원하는 것은 β-만노시다제와의 철야 반응후 분명하였다. 그 결과 얻은 크로마토그램을 도 66에 도시하며, 이것은 도 63 내지 65의 크로마토그램에 기재된 것과 동일한 조건하에서 얻은 것이었다.
얻은 결과를 하기 표 9에 수록한다.
주: 사카로마이세스("Sc") 및 한세눌라("Hp")-생산된 E1s 뿐만 아니라 HCV-재조합 백시니아-감염된 포유동물 세포("Vac")에 의해 생산된 E1s로부터 유도된 올리고만노오스를 분해시켜 얻은 올리고만노오스. 크로마토그램 체류시간("Rt", 분) 및 전체 올리고만노오스 함량(전체 줄)에 상대적인 소정 올리고만노오스의 % 뿐만 아니라 도 55-62중의 하나를 기준으로 하여 표시한 각각 관찰된 올리고만노오스의 가장 유망한 구조를 갖는 상이한 올리고만노오스를 나타내었다. 말단 α1-3 만노오스를 갖는 올리고만노오스는 "O"로 표시하였다. 말단 글루코오스를 갖는 올리고만노오스는 "*"로 표시하였고, 일부 참조용은 "62*로부터"로 표시하였는데, 이것은 이 구조가 도 62에 도시된 구조로부터 유도될 수 있음을 의미한다. "1"은 엑소글리코시다제를 사용하지 않는 "반응"이고, "2"는 α1-2 만노시다제를 사용한 반응이다. 체류시간 45±1분인 올리고만노오스는 치토바이오스에 결합된 5개의 만노오스 잔기를 포함하는 올리고만노오스로 추정된다. 체류시간 75±1분인 올리고만노오스는 치토바이오스에 결합된 10개 만노오스 잔기를 포함하는 올리고만노오스로 추정된다.
실시예 27
재조합 HCV E1에서 N-글리코실화 부위의 점유
점유된 N-글리코실화 부위의 양에 따라서, E1s은 SDS-PAGE 분석에서 상이한이동특성을 나타낸다. 이러한 특성을 기본으로 하여, E1 생성물중의 점유된 N-글리코실화 부위의 평균 양을 산출할 수 있었다. 지금까지, 정제된 E1-생성물의 샘플을 SDS-PAGE처리시키고 코마씨 브릴리언트 블루 염색(도 67)시킨 다음 ImageMaster 1D 프라임 소프트웨어 패킷(파마시아 제조)을 이용하여 분석하였다. 요컨대, 특정 단백질 밴드에 대해 겔을 스캐닝하고 또 % 점유(상이한 밴드의 전체 세기에 대한 그의 세기, 따라서 모든 밴드의 합은 100%임)를 산출하였다 (표 11). 각 특정 단백질 밴드는 동일한 개수의 점유된 N-글리코실화 부위를 갖는 E1s-분자를 나타낸다.
얻은 결과는 한세눌라-생산된 E1-생성물의 대부분(>90%)은 백시니아 발현 계(WO 96/04385호에서 Maertens 등에 의해 기재됨)로부터 얻은 E1s 보다 N-글리코실화 부위가 1개 이상 더 적다. 백시니아 유도된 E1 생성물에서 모든 N-글리코실화 부위가 점유 (E1의 위치 233-236상의 점유서열 "NNSS"(서열번호: 73)은 1개 글리코실화 부위로 간주됨)되어 있다고 가정하면, 한세눌라-발현된 E1 단백질에서 점유된 N-글리코실화 부위는 전체 가능한 N-글리코실화 부위의 80%를 초과하지 않는다고 결론짓는 것이 안전하다.
주: 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 백시니아/베로 발현 계로부터 얻은 E1 단백질에서 점유된 N-글리코실화 부위의 평균 개수를 SDS-PAGE 및 쿠마씨 브릴리언트 블루 염색 세기 분석에 의해 산출함. 단백질 밴드는 분자량으로 나타낸다. 도 67 참조.
실시예 28
재조합 HCV E2에서 N-글리코실화 부위의 점유
한세눌라에 의해 생산된 E2-H6 단백질 200 ㎍을 PNGaseF를 사용하여 탈글리코실화시켰다. 탈글리코실화된 E2s-H6을 미니-겔(10 ㎍/레인)상에 로딩시켰다. 단백질 밴드를 트립신 및 endo Asp-N으로 분해시켰다. 생성한 펩티드의 질량은 Maldi-MS(건조된 방울 및 박층법)에 의해 측정하였다. 이 방법은 N-글리코실화 정도를 측정하기 위해 이용될 수 있다: 효소 PNG-ase F를 사용하여 탈글리코실화시키는 동안, 완전한 당쇄를 절단시키고, 그와 동시에 아스파라긴(N)을 아스파탐산(D)으로 가수분해시킨다. 이들 2개 아미노산 간의 질량 차이는 1 Da이며, 이것은 질량 분광시험에 의해 측정될 수 있다. 부가적으로, N에서 D로 가수분해하는 것은 Asp-N 효소에 대한 새로운 절단부위를 만든다.
E2s에서 가능한 글리코실화 부위는 N417, N423, N430, N448, N478, N532, N540, N556, N576, N623및 N645(도 68 참조)이다. Maldi-MS 분석에 의하면, 각 이들 글리코실화 부위의 경우 N-글리코실화가 완전하지 않은데, 이는 PNGaseF를 사용하여 탈글리코실화시킨 후, 펩티드는 글리코실화 부위에 N 또는 D를 갖는(질량 차이 1 Da) 것으로 밝혀졌기 때문이다. N-잔기에 대한 D-잔기의 비율은 한세눌라에 의해 발현되며 분석된 샘플내에 당쇄에 의해 단일 N-글리코실화 부위로 존재하는 모든 E2 단백질에 대한 평균 점유율을 나타낸다. 이들 결과를 하기 표 12 내지 14에 수록한다.
상기 결과로부터, 평균해서 각 글리코실화 부위는 54% 정도 글리코실화됨이 산출되었다.
실시예 29
혈액 공여자 혈청과 사카로마이세스 또는 한세눌라에 의해 생산된 HCV E1의 반응성
사카로마이세스에 의해 생산된 E1s-H6 (α-MF 리더를 갖도록 발현) 및 한세눌라에 의해 생산된 E1s-H6 (CL 리더를 갖도록 발현)을 실시예 15 및 16에 기재된 바와 같이 정제하고 또 마지막으로 실시예 20에 기재된 바와 같이 알킬화처리 및 VLP 형성시켰다. 모든 단백질을 마이크로티터플레이트상에 0.5 ㎍/mL (37℃에서 1시간)으로 직접 흡착시키고 HCV-걸러진 혈청으로 플레이트(PBS-0.1% 카세인, 1시간, 37℃)를 블로킹시킨 후 음성 혈액 공여자를 1/20 (PBS-0.5% 카세인, 10%(w/v) 수크로오스, 0.2% (v/v) 트리톤 X-705, 1시간, 37℃)로 희석시켜 배양하였다. 마지막으로, 퍼옥시다제에 결합된 이차 토끼 항-인간 IgG-FC특이적 항혈청(Dako, 덴마크)을 1/50000 (PBS-0.1% 카세인, 1시간, RT)의 희석율로 사용하여 결합을 검출한 다음 발색처리시켰다. 모든 단계 사이에 플레이트를 PBS-0.05% (w/v) 트윈-20을 사용하여 3회 세척하였다. 대조를 위하여, WO99/67285호에서 Depla 등에 의해 기재된 바와 같이 생산되고 정제된 포유동물 세포 유도된 Els에서도 동일한 방식으로 혈청을 분석하였다.
ELISA에 대한 컷오프는 배경치(즉, 스트렙트아비딘이 웰에 흡착된 이외는 동일한 설정에서 모든 혈청의 반응성)의 평균의 2배값으로 설정되었다.
표 15로부터, 많은(75%) 혈청은 사카로마이세스-생산된 E1 에 대하여 컷오프 이상의 반응성을 나타내지만, 한세눌라-생산된 E1에 대해서는 소수의 혈청(6%)만이 컷오프 이상의 반응성을 나타내었다. 이러한 반응성 차이는 실시예 26에서도 분명한 바와 같이 사카로마이세스-생산된 E1상에 있는 α1-2 만노오스에 결합된 말단 α1-3 만노오스의 존재에 기인한 것이었다. Young과 그의 동료들(1998)은 이미 상기 유형의 만노오스는 인간 혈청과 사카로마이세스-유도 만난과의 반응성에 관여한다는 것을 이미 보고하였다. 사카로마이세스 유도 E1에 대한 반응성이 상기 유형의 만노오스 잔기에 기인한 것임을 더 확인하기 위하여, 희석 완충액에 부가된 1 또는 5 mg/mL 만난(시그마 제조)과 예비배양(37℃에서 1시간)된 혈액공여자 혈청을 희석시킴으로써 사카로마이세스-생산된 E1상에서의 ELISA를 반복하였다. 표 16으로부터 판정되듯이, 만난과의 예비배양은 상기 E1과 혈액공여자 혈청과의 반응을농도 의존적 방식으로 분석된 1개(F556) 혈청에 대해 바탕치까지 감소시켰다. (평균 OD는 5 mg 만난/mL을 사용한 경우 만난에 의한 경쟁없이 0.24로 감소되었다)
참고목록

Claims (33)

  1. 진핵생물 세포에서의 발현산물이고 또 N-글리코실화 부위의 평균 80% 까지가 코어-글리코실화되어 있는 것을 특징으로 하는, 한 개 이상의 N-글리코실화 부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 코어-글리코실화 부위의 70% 이상이 8 내지 10개 만노오스를 함유하는 올리고만노오스에 의해 글리코실화되는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, Man(8)GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위에 대한 Man(7)GlcNAc(2) 구조를 갖는 올리고만노오스에 의해 코어-글리코실화된 부위의 비율이 0.45 이하인 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고만노오스는 10% 미만의 말단 α1,3 만노오스를 함유하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 효모 세포에서의 발현산물인 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 효모 세포가 한세눌라(Hansenulla) 세포인 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서, HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편에 결합된 조류의 리소짐(lysozyme) 리더 펩티드 또는 그의 기능적 변이체를 포함하는 단백질로부터 유도되는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  8. 제 7항에 있어서, 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 단백질로부터 유도되는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
    CL-[(Al)a-(PS1)b-(A2)c]-HCVENV-[(A3)d-(PS2)e-(A4)f]
    식중에서,
    CL은 조류의 리소짐 리더 펩티드 또는 그의 기능적 등가물이고,
    A1, A2, A3 및 A4는 상이하거나 동일할 수 있는 어댑터(adptor) 펩티드이며,
    PS1 및 PS2는 상이하거나 동일할 수 있는 가공 부위이고,
    HCVENV는 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부이며,
    a, b, c, d, e 및 f는 0 또는 1이고, 또
    경우에 따라, A1 및/또는 A2는 PS1의 일부이고 및/또는 A3 및/또는 A4는 PS2의 일부임.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 조류의 리소짐 리더 펩티드 CL은 서열번호: 1에 정의된 아미노산 서열을 갖는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  10. 제 8항에 있어서, A는 서열번호: 63-65, 70-72 및 74-82로부터 선택된 아미노산 서열을 갖고, PS는 서열번호: 66-68 및 83-84으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖거나, 또는 PS는 Lys-Lys, Arg-Arg, Lys-Arg 및 Arg-Lys와 같은 이염기성 부위 또는 Lys와 같은 일염기성이며, 또 HCVENV는 서열번호: 85-98 및 그의 단편으로부터 선택되는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  11. 제 1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 단량체, 동종이합체, 이종이합체, 동종올리고머 및 이종올리고머로 구성된 군으로부터 선택된 구조에 포함되는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  12. 제 1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스-유사 입자에 포함되는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  13. 제 1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서, 시스테인 티올 기가 화학적으로 수식된 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  14. 제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 항원성인 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  15. 제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, 면역원성인 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  16. 제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, T-세포 항원결정부위를 포함하는 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편.
  17. 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물.
  18. 제 17항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하며 또 의약인 조성물.
  19. 제 17항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함하며 또 백신인 조성물.
  20. 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 분리된 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 단편을 생산하는 방법.
  21. (i) 제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를, HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부와 항-HCV 항체의 복합체화를 허용하는 조건하에서 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플과 접촉시키는 단계,
    (ii) (i)에서 형성된 복합체를 검출하는 단계, 및
    (iii) (ii)으로부터 상기 샘플에서 항-HCV 항체의 존재를 유추하는 단계를 포함하는, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플에서 항-HCV 항체의 존재를 검출하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 단계(i)에서의 접촉은 경쟁 조건하에서 생기는 방법.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부는 고형 지지체에 부착되는 방법.
  24. 제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는, 항-HCV 항체를 포함할 것으로 추정되는 샘플에서 항-HCV 항체의 존재를 검출하기 위한 진단 키트.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부가 고형 지지체에 부착되어 있는 진단 키트.
  26. 제 1항 내지 제16항중 어느 한 항에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 의약.
  27. 제 1항 내지 제16항중 어느 한 항에 따른 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부를 포함하는 백신.
  28. 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부 및 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 포유동물에서 HCV-특이적 면역반응을 유발하는 약제학적 조성물.
  29. 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부 및 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 포유동물에서 HCV-특이적 항체를 유발하기 위한 약제학적 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 16항중 어느 한 항에 따른 유효량의 HCV 엔빌로프 단백질 또는 그의 일부 및 경우에 따라 약제학적으로 허용되는 보조제를 포함하는, 포유동물에서 T-세포 작용을 유발하기 위한 약제학적 조성물.
  31. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 예방적 조성물인 약제학적 조성물.
  32. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 치료적 조성물인 약제학적 조성물.
  33. 제 28항 내지 제 30항중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 약제학적 조성물.
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