CZ20032164A3

CZ20032164A3 - Purifikované obalové proteiny viru hepatitidy C pro diagnostické a terapeutické použití

Info

Publication number: CZ20032164A3
Application number: CZ20032164A
Authority: CZ
Inventors: Geert Maertens; Fons Bosman; Erik Depla
Original assignee: Innogenetics N. V.
Priority date: 2001-01-11
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2003-10-15
Also published as: AR032240A1; CA2400643A1; WO2002055548A2; RU2313363C2; NO20024325D0; PL363175A1; BR0203518A; EP1463753A2; RU2002121632A; CN1547588A; AU2002238502A1; WO2002055548A3; AU2002238502B9; HUP0302416A2; KR20020089371A; MXPA02008886A; AU2002238502B2; WO2002055548A8; TR200202169T1; IL151033A0

Description

PURIFIKOVANÉ OBALOVÉ PROTEINY VIRU HEPATITIDY C PRO DIAGNOSTICKÉ A TERAPEUTICKÉ POUŽITÍ

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně oblasti exprese rekombinantního proteinu, purifikace rekombinantních proteinů, syntetických peptidů, diagnózy HCV infekce, profylaktické léčby proti HCV infekci a prognózy/sledování klinické účinnosti léčby jedince s chronickou hepatitidou nebo prognózy/sledování neléčené nemoci.

Konkrétně se předkládaný vynález týká způsobu purifikace obalových proteinů viru hepatitidy C, použití obalových proteinů HCV purifikovaných podle způsobů popisovaných v předkládaném vynálezu pro diagnózu, profylaxi nebo terapii, použití jednotlivých nebo specifických oligomerních El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 obalových proteinů v testech pro sledování nemoci, a/nebo diagnózu choroby, a/nebo léčbu choroby. Vynález se také týká epitopů El a/nebo E2 obalových proteinů a monoklonálních protilátek proti nim, a také jejich použití v diagnóze, profylaxi nebo léčbě.

Dosavadní stav techniky

E2 protein purifikovaný z buněčných lyzátů podle způsobů popsaných v předkládaném vynálezu reaguje s přibližně 95 % sér pacientů. Tato reaktivita je podobná reaktivitě získané při použití E2 sekretovaného buňkami CHO (Spaete et al., 1992). Nicméně intracelulárhě exprimované forma E2 se může blížeji podobat nativnímu virovému obalovému proteinu, protože obsahuje sacharidové motivy s vysokým obsahem manózy, zatímco

• ·

E2 protein spkretovaný buňkami CHO je dále modifikovaný ga.laktózou a sacharidovými skupinámi sialové kyseliny. Když je amino-koncová pólóvina E2 exprimována v bakulovirovém systému, může být detekováno pouze přibližně 13 až 21 % sér několika skupin pacientů (Inoue et al., 1992). Po expresi E2 v E. coli byla reaktivita HCV sér dokonce nižší a pohybovala se od 14 % (Yokosuka et al., 1992) do 17 % (Mita et al., 1992). Přibližně 75 % HCV sér (a 95 % sér chronických pacientů) je anti-El pozitivní s použitím purifikovaného rekombinantního El proteinu podle předkládaného vynálezu exprimovaného vakcíníí, v ostrém rozporu s výsledky autorů Kohara et al. (1992) a Hsu et al. (1993). Kohara et al. Používali El protein exprimovány virem vakcínie a detekovali anti-El protilátky u 7 až 23 % pacientů, zatímco Hsu et al. detekovali pouze 14/50 (28 %) sér s použitím El exprimovaného bakulovirem.

Tyto výsledky ukazují, že nejenom dobrý expresní systém, ale také dobrý purifikační protokol jsou potřebné pro dosazení vysoké reaktivity obalových proteinů vůči sérům humánních paciehtů. To může být dosaženo s použitím řádného expresního systému a/nebo purifikačních protokolů podle předkládaného vynálezu, které zaručují zachování přirozeného sestaveni/skládání proteinu a purifikačních protokolů podle předkládaného vynálezu, které zaručují eliminaci kontaminujících proteinů, a které zachovávají konformaci, a tedy i peaktivitu HCV obalových proteinů; Množství purifikovaného HCV obalového proteinu potřebného pro diagnostické Screeningové testy je ročně v rozsahu gramů. Pro účely vakcín by bylo potřebné ještě vyšší množství obalového proteinp. Proto může být použit systém viru vakcínie pro selekci nej lepších expresních konstruktů a pro omezéné zvýšení exprese, a pro expresi (produkci) ve velkém (průmyslovém) jednotlivých nebo specifických proteinů obsahujících sacharidy měřítku a purifikaci oligomerních obalových • · • · · · s vysokým obsahem manézy může být výhodně užito několik kmenů kvasinek. Například v případě hepatitidy B byla tvorba HBsAg savčími buňkami mnohem nákladnější ve srovnání s vakcínami pro hepatitidu B pocházejícími z kvasinek.

Cíle vynálezu

Cílem předkládaného vynáldzu je poskytnout nový způsob purifikace r^kombinantně exprimovaných El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů tak, že rekombinantní proteiny jsou přímo použitelné pro diagnostické účely a účely vakcín jako jednotlivé nebo specifické oligomerpí rekombinantní proteiny bez kontaminujících složek namísto agregátů.

Dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout přípravky obsahující purifikované (jednotlivé nebo specifické oligomerní) rekombinantní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 glykoproteiny obsahující konformační epitopy z El a/nebo E2 domén HCV.

Ještě dalším cílem předkládaného vynálezu je poskytnout nové rekombinantní vektorové konstrukty rekombinantnš exprimující El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteiny, a také hostitelské buňky transformované vektorovými konstrukty.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnout způsob přípravy a purifikace rekombinantních HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů.

Cílem předkládaného vynálezu je také poskytnout diagnostická a imunogenní použití rekombinantních HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/P2 proteinů podle předkládaného vynálezu, a také poskytnout soupravy pro diagnostické využití, vakcíny nebo léčiva obsahující kterýkoliv rekombinantní HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 protein podle předkládaného vynálezu.

Dále je cílem předkládaného vynálezu poskytnout nové • · » « • · použití El, E2, a/nebo E1/E2 proteinů nebo jejich vhodných částí pro sledování/prognózy reakce na léčbu pacientů (léčených např. interferonem) trpících HCV infekcí.

Cílem předkládaného vynálezu je také poskytnout použití rekombinantních El, E2, a/nebo E1/E2 proteinů podle předkládaného vynálezu pro HCV spreening a konfirmační protilátkové testy.

Je také cílem předkládaného vynálezu poskytnóut peptidy El a/nebo E2, které mohou být použity pro diagnózu HCV infekce a pro pěstování (produkci) protilátek. Takové peptidy mohou také být použity pro izolaci humánníčh monoklonálních protilátek..

Cílem předkládaného vynálezu je také poskytnout monoklonální protilátky, konkrétně humánní monoklonální protilátky nebo myší monoklonální protilátky, které jsou humanizovány, které reagují specificky s El a/nebo E2 epitopy buď obsaženými v peptidech nebo konformačními epitopy obsaženými v rekombinantních proteinech.

Cílem předkládaného vynálezu je také poskytnout použití anti-El nebo anti-E2 monoklonálních protilátek pro detekci HCV antigenu nebo pro terapii chronické HCV infekce.

Cílem předkládaného vynálezu je také poskytnout soupravy pro sledování/prognózu reakce na léčbu (např. interferonem) u pacientů trpících HCV infekcí ňebo sledování/prognózu výsledku nempci.

Všechny cíle předkládaného vynálezu byly splněny řešením, jehož provedení jsou popsána dále.

Definice

Následující óefinice slouží pro objasnění různých termínů a výrazů použitých v popisu předkládaného vynálezu.

• · · ·

Termín „jednotlivý obalový protein viru hepatitidy C se týká polypeptidů nebo jeho analogu {např. mimotopů) obsahujícího aminokyselinovou sekvenci (a/nebo aminokyselinové analogy) definující alespoň jeden HCV epitop buď El nebo E2 úseku. Tyto jednoduché obalové proteiny v širším smyslu slova mohou být jak monomerní tak homo-oligomerní formy rekombinantně exprímovaných obalových proteinů. Typicky sekvence definující epitop odpovídají aminokyselinové sekvenci buď El nebo E2 úseku HCV (buď identicky nebo substitucí analogů nativního aminokyselinového zbytku, která nezničí epitop). Obecně sekvence definující epitop je dlouhá 3 nebo více aminokyselin, výhodněji je dlouhá 5 nebo více aminokyselin, výhodněji je dlouhá 8 nebo více aminokyselin a ještě výhodněji je dlouhá 10 nebo více aminokyselin. Co se týká konformačních epitopů, délka sekvence definující epitop může podléhat výrazným výkyvům, protože se má za to, že tyto epitopy jsou tvořeny trojrozměrným tvarem antigenu (např. skládáním). Počet aminokyselin definujících epitop může být tedy relativně malý, ale aminokyseliny mohou být široce rozloženy v průběhu celé délky molekuly a jsou přivedeny do správné konformace epitopů skládáním, části antigenu mezi zbytky definujícími epitop nemusí být rozhodující pro konformační strukturu epitopů. Například delece nebo substituce těchto sekvencí nacházejících se uprostřed nemusí ovlivnit konformační epitop, za předpokladu, že sekvence kritické pro konformaci epitopů jsou udržovány (např. cysteiny zapojené do disulfidové vazby, místa glykosylace, apod.). Konformační epitop může také být vytvořen 2 nebo více základními úseky podjednotek homo-oligomeru nebo heterooligomeru.

HCV antigeny podle předkládaného vynálezu zahrnují konformační epitopy El a/nebo E2 (obalových) domén HCV.

Nedávno bylo zjištěno, že El doména, o které se má za to, že ·· ·· • · · odpovídá virovému obalovému proteinu, zahrnuje aminokyseliny 192 až 383 HCV polyproteinu (Hijikata et al., 1991). Při expresi v savčím systému (glykosylovaný) se předpokládá, že má přibližnou molekulovQu hmotnost 35 kD, jak určeno prostřednictvím SDS-PAGE. Předpokládá se, že E2 protein, dříve nazývaný NS1, zahrnuje aminokyseliny 384 až 809 nebo 384 až 746 (Grakouí et al., 1993) HCV polyproteinu, a také je obalový protein. Pří expresi v systému vakcinie (glykosylovaný) se předpokládá, že má zjevnou molekulovou hmotnost přibližně 72 kD na gelu. Rozumí se, že koncové body těchto proteinů jsou přibiižné (např. karboxy-konec E2 může ležet někde v úseku aminokyselin 730 až 820, např. končit aminokyselinou 730, 735, 740, 742-, 744, 745, výhodně 746, 747, 748, 75.0, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820) . E2 protein může také být exprímov£n spolu s El, P7 (aa 747 až 809), NS2 (aa 810 ažl026), NS4A (aa 1658 až 1711) nebo NS4B (aa 1712 až 1972). Exprese společně s těmito dalšími HCV proteiny může být důležitá pro dosažení správného skládání proteinu.

Rozuiríí se také, že izoláty použité v příkladech předkládaného vynálezu hej sou zamýšleny omezovat rozsah vynálezu a že kterýkoliv HCV izolát z typu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nebo každého dalšího hového genotypu HCV je vhodný zdroj El a/nebo E2 sekvence pro praxi předkládaného vynálezu.

El a E2 antigeny používané v předkládaném vynálezu mohou být kompletní virové proteiny, jejich v podstatě kompletní verze nebo jejich funkční fragmenty (např. fragmenty, které nepostrádají sekvence nezbytné pro vytvoření nebo retenci epitopu). Kromě toho HCV antigeny podle předkládaného vynálezu, mohou také zahrnovat další sekvence, které neblokují nebo nezabraňují vytvoření požadovaného konformačního epitópu. Přítomnost nebo nepřítomnost konformačního epitopu může být snadno určena screeningem požadovaného antigenu s protilátkou (polyklonální sérum nebo monoklonální protilátka proti

konformačnímu epitopu) a srovnáním jeho reaktivity S reaktivitou denaturované verze antigenu, která gí podrží pouze lineární epitopy (jestliže vůbec nějaké). V takovém screeningu s použitím polyklonálních protilátek může být výhodné adsorbovat polyklonální sérum nejdříve s denaturovaným antigenem a pozorovat, jestli obsahuje protilátky proti požadovanému antigenu.

HCV antigeny. podle předkládaného vynálezu mohou být vyrobeny kterýmkoliv rékombinantním způsobem, který poskytne požadovaný epitop. Například rekombinantní intracelulární exprese v savčích nebo hmyzích buňkách je výhodný způsob pro poskytnutí glykosylovaných El a/nebo E2 antigenů v „nativní konformaci, jako v případě přírodních HCV antigenů. Kvasinky a mutantní kmeny kvasinek (např. mutanta mnn9 (Khískem et al., 1994) nebo glykosylační mutanty získané selekcí na rezistenci k vanadátu (Balloů et al., 1991)) mohou být ideálně vhodné pro produkci sekretovaných sácharidů s vysokým obsahem manózy, zatímco proteiny sekretované savčími buňkami mohou obsahovat modifikace zahrnující galaktózu nebo sialové kyseliny, které mohou být nežádoucí pro určité diagnostické aplikace nebo aplikace vakcín. Nicméně v úrčitých aplikacích, jak je u proteinů známo., může také být možné a dostatečné exprimovat antigen v dalších rekombinantních hostitelích (jako například E. colí) a renaturovat protein po získání,

Termín „fúzní polypeptid označuje polypeptid, ve kterém je HCV antigen(y) část jednoduchého kontinuálního řetězce aminokyseliny, tento řetězec se nevyskytuje v přírodě. HCV antigeny mohou být připojeny přímo k sobě peptidovými pásy nebo mohou být odpěleny intervenujícími aminokyselinovými sekvencemi. Fúzní polypeptidy mohou také obsahovat aminokyselinové sekvence pro HCV exogenní.

Termín „pevná fáze označuje pevnou látku (nebo těleso), ke které(mu) jsou vázány individuální HCV antigeny nebo fúzní • · • ·· · . ·« ·· ·· ··»· · · · ♦ · • · ·♦ · · ·« · * ·· · · ♦ ·· · · · polypeptid skládající se z HCV antigenů kovalentně nebo nekovalentnímí prostředky, jako například hydrofobní adsorpcí.

Termín „biologický vzorek označuje tekutinu nebo tkáň jednotlivého savce (např. lídoopa, člověka), která normálně obsahuje protilátky produkované jednotlivcem; konkrétně protilátky proti HCV. Tekutina nebo tkáň mohou také obsahovat HCV antigen. Tyto složky jsou v oboru známy a zahrnují bez omezení krev, plazmu, sérum, moč, spinálni tekutinu, lymfu, sekrety dýchacího, střevního nebo močopohlavního traktu, slzy, sliny, mléko, bílé krvinky a myelomy. Tělesné složky zahrnují biologické tekutiny. Termín „biologická tekutina se týká tekutiny získané z organismu. Některé biologické tekutiny jsou použity jako zdroj jiných produktů, jako jsou například koagulační faktory (např. faktor VIII, C), sérový albumin, růstový hormon apod. V takových případech je důležité, že zdroj biologické tekutiny je bez kontaminace virem, jako je například HCV.

Termín „imunologicky reaktivní znamená, že zkoumaný antigen reaguje specificky s anfi-HCV protilátkami přítomnými v tělesné složce HCV infikovaného jednotlivce.

Termín „imunitní komplex označuje spojeni vytvořené, když se protilátka vážé k epitopu na antigenu.

Termín „El, jak se v tomto textu používá, se týká proteinu nebo polypeptidů exprimovaného prvními 400 aminokyselinami HCV polyproteinu, někdy nazývaného jako protein E, ENV nebo S. Ve své přírodní formě to je glykoprotein o velikosti 35 kD, který je nalézán v silné asociaci s membránami. Ve většině přírodních HCV kmenů je El protein kódován viróvým polyproteinem následujícím po C (jádrovém) proteinu. El protein se rozprostírá přibližně od aminokyseliny (aa) 192 přibližně do aa 383 kompletního polyproteinu.

• · ·« ·« ► · · «

99

9 «

Termín „El, jak se v tomto textu používá, zahrnuje také analogy a zkrácené formy, které imunologicky zkříženě reagují s přírodním El a zahrnuje El proteiny genotypů 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nebo kterýkoliv jiný nově identifikovaný HCV typ nebo podtyp.

Termín „E2, jak se v tomto textu používá, se týká proteinu nebo polypeptidu exprimovaného prvními 900 aminokyselinami HCV polyproteinu, někdy nazývaného jako NS1 protein. Ve své přírodní formě to je glykoprotein o velikosti 72 kD, který je nalézán v silné asociaci s membránami. Ve většině přírodních HCV kmenů je E2 protein kódován ve virovém polyproteinu jako protein následující po El proteinu. E2 protein se rozprostírá přibližně od polohy aminokyseliny 384 do polohy aminokyselina 746, další forma E2 se rozprostírá od polohy aminokyseliny 809. Termín „E2, jak se v tomto textu používá, také zahrnuje analogy a zkrácené formy, které imunologicky zkříženě reagují s přírodním E2. Například byla publikována inzerce mnoha kodonů mezi kodon 383 a 384, a také delece aminokyselin 384-387 autory Kato et al. (1992).

Termín „E1/E2, jak se v tomto textu používá, se týká oligomerní formy obalových proteinů obsahující alespoň jednu El složku a alespoň jednu E2 složku.

Termín „specifický oligomerní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 obalový protein se týká všech možných oligomerních forem rekombinantně exprimovaných El a/nebo E2 obalovými^v proteiny, které nejsou agregáty. El a/nebo E2 specifické oligomerní obalové proteiny jsou také nazývány jako homo-oligomerní El nebo E2 obalové proteiny (viz níže).

Termín „jednotlivý nebo specifický oligomerní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 obalový protein se týká jednotlivých monomerních El nebo E2 proteinů (jeden v doslovném smyslu slova), a také specifických oligomerních El a/nebo E2 a/nebo ·· 0000

	10	·· ·· ·« • · · · · · • · »· * · • · · · · · · • · · · · · ·· ·· ·*	·· 00 000· ••<0 0 ·· 0 0« • · 0 0 0 · • · 0 0«· ·· 00 ··
E1/E2	rekombinantně	exprimovaných	proteinů.	Tyto jednotlivé
nebo	specifické	oligomerní	obalové	proteiny . podle

předkládaného vynálezu mohou být dále definovány následujícím vzorcem (El)x(E2)y, kde x je číslo mezi 0 a 100 a y je číslo mezi 0 a 100, za předpokladu, že x a y nejsou oba 0. Když x=l a y=0 obalové proteiny zahrnují monomerní El.

Termín „homo-oligomer, jak se v tomto textu používá, se týká komplexu El a/nebo E2 obsahujícího víc než jeden El nebo E2 monomer, např. El/El dimery, E1/E1/E1 trimery nebo El/El/El/El tetramery a E2/E2 dimery, E2/E2/E2 trimery nebo E2/E2/E2/E2 tetramery, El pentamery a hexamery, E2 pentamery a hexamery nebo homo-oligomery kteréhokoliv vyššího řádu z El nebo E2 jsou všechno „homo-oligomery v rozsahu této definice. Oligomery mohou obsahovat jeden, dva nebo několik různých monomerů El nebo E2 získaných z různých typů nebo podtypů viru hepatitidy C včetně například těch popsaných v mezinárodní přihlášce publikované pod značkou WO 94/25601 a v evropské přihlášce č. 94870166.9, obě podané přihlašovateli předkládaného vynálezu. Tyto smíšené oligomery jsou pořád homo-oligomery v rozsahu tohoto vynálezu a umožňují univerzálnější diagnózu, profylaxi nebo léčbu HCV.

Termín „purifikovaný, jak se v tomto textu používá pro proteiny, se týká přípravku/preparátu, kde požadovaný protein zahrnuje alespoň 35 % složky celkových proteinů v přípravku/preparátu. Požadovaný protein výhodně zahrnuje alespoň 40 %, výhodněji alespoň přibližně 50%, výhodněji alespoň přibližně 60%, ještě výhodněji alespoň přibližně 70%, ještě výhodněji alespoň přibližně 80%, ještě výhodněji alespoň přibližně 90% a nejvýhodněji alespoň přibližně 95% složky celkových proteinů. Přípravek může obsahovat jiné sloučeniny, jako jsou například sacharidy, soli, lipidy, rozpouštědla, apod., bez ovlivnění stanovení procentové čistoty, jak se v tomto textu používá. Termín „izolovaný HCV protein označuje

»4 44»· ♦♦ ·· • 4 · · • · 44

HCV proteinový přípravek, který je alespoň z 35 % čistý.

Termín „v podstatě purifikované proteiny se týká proteinů purif ikovaných tak, že mohou být použity pro in vitro diagnostické metody a jako terapeutická sloučenina. Tyto proteiny jsou v podstatě bez buněčných proteinů, proteinů pocházejících z vektoru nebo dalších HCV virových složek. Obvykle jsou tyto proteiny purifikovány do homogenity (alespoň z 80% čisté, výhodně z 90%, výhodněji z 95%, výhodněji z 97%, výhodněji z 98%, výhodněji z 99%, ještě výhodněji z 99,5% a nejvýhodněji by kontaminující proteiny měly být nedetekovatelné obvyklými metodami, jako SDS-PAGE a barvení stříbrem.

Termín „rekombinantně exprimován použitý v kontextu podle předkládaného vynálezu se týká skutečnosti, že proteiny podle předkládaného vynálezu jsou tvořeny metodami rekombinantní exprese v prokaryota nebo nižších nebo vyšších eukaryota, jak diskutováno podrobně níže.

Termín „nižší eukaryota se týká hostitelských buněk, jako jsou například kvasinky, houby apod. nižší eukaryota jsou obecně (ale ne nezbytně) jednobuněčné organismy. Výhodná nižší eukaryota jsou kvasinky, konkrétně druhy Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia (např. Pichia pastoris), Hansenula (např. Hansenula pollymorpha) , Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces apod. Saccharomyces cerevisiae, S. Carlsbergensis a K. lactis jsou nej častěji používaní kvasinkoví hostitelé a jsou to vhodní houboví hostitelé.

Termín „prokaryota se týká hostitelů, jako jsou například E.coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis nebo Streptomyces. Také tito hostitelé jsou zvažováni v předkládaném vynálezu. Termín „vyšší eukaryota se týká hostitelských buněk pocházejících z vyšších zvířat, jako ·· 0 0·« • 0 ·· • 0 0 · • · 00 • · 4 · • · 0 0 ·· ·· • · 0 ♦ * 4 • 0 · • 0 0 0 •0 00 jsou například savci, plazi, hmyz apod. V přítomný výhodné hostitelské buňky vyšších eukaryota pocházejí od čínského křečka (např. CHO), opice (např. buňky COS a Věro), z ledviny mláděte křečka (BHK), z ledviny vepře (PK15), z buněk 13 králičí ledviny (RK13), humánní osteosarkomová buněčná linie 143 B, humánní buněčná linie HeLa a humánní hepatomové buněčné linie, jako například Hep G2 a hmyzí buněčné linie (např. Spodoptera frugiperda). Hostitelské buňky mohou být poskytovány v suspenzi nebo kultivačních lahvích, tkáňových kulturách, orgánových kulturách apod. alternativně hostitelské buňky mohou také být v transgennich zvířatech.

Termín „polypeptid se týká polymeru aminokyselin a neodkazuje na specifickou délku produktu, takže v definici polypeptidů jsou zahrnovány peptidy, oligopeptidy a proteiny. Tento termín také neodkazuje nebo nevyřazuje modifikace polypeptidů po expresi, například glykosylace, fosforylace apod. v definici jsou zahrnuty polypeptidy obsahující jeden nebo více analogů aminokyselin (včetně například nepřirozených aminokyselin, PNA, apod.), polypeptidy se substituovanými vazbami, a také jinými modifikacemi v oboru známými, jak přirozeně se vyskytujícími tak nevyskytujícími se přirozeně.

acetylace, například

Termín „rekombinantní polynukleotid nebo nukleová kyselina označuje polynukleotid nebo nukleovou kyselinu genomového původu, cDNA, polosyntetického nebo syntetického původu, která na základu svého původu nebo manipulace (1) není spojena s celým polynukleotidem nebo s částí polynukleotidu, se kterým je sdružena v přírodě, (2) je spojena s polynukleotidem jiným, než se kterým je spojena v přírodě nebo (3) v přírodě se nevyskytuje.

Termín „rekombinantní hostitelské buňky, „hostitelské buňky, „buňky, „buněčné linie, „buněčné kultury, a další takové termíny označující mikroorganismy nebo vyšší *· ·«φ« *· 99

9 9 Λ * 9 99 » 9 9 ' * * · 1

99

99 • 9 9 9 9

9 99 9 • · · 9 9 9 • 9 9 9 9

9 9 9 λ eukaryotické buněčné linie pěstované jako jednobuněčné entity, odkazují na buňky, které mohou být nebo byly použity jako příjemci pro rekombinantní vektor nebo jiný transferový polynukleotid a zahrnují potomstvo originální buňky, která byla transfekována. Rozumí se, že potomstvo jedné parentální nutně úplně totožné morfologicky nebo celkovém DNA komplementu s originální buňky nemusí být v genomovém nebo parentální buňkou díky přírodní, náhodné nebo úmyslné mutaci.

Termín „replikon je kterýkoliv genetický prvek, např. plazmid, chromozóm, virus, kozmid, apod., který se chová jako autonomní jednotka polynukleotidové replikace v buňce, tj. je schopná replikace pod svou vlastní kontrolou.

Termín „vektor je replikon dále obsahující sekvence poskytující replikaci a/nebo expresi požadovaného otevřeného čtecího rámce.

Termín „kontrolní sekvence se týká polynukleotidových sekvencí, které jsou nutné pro provádění exprese kódujících sekvencí, k kterým jsou ligovány. sekvencí se liší v závislosti v prokaryota takové kontrolní

Povaha takových kontrolních na hostitelském organismu, sekvence obecně zahrnují promotor, vazebné místo ribozomu a terminátory, v eukaryota promotory, (zesilovací je zahrnuje minimálně obecně takové kontrolní sekvence zahrnují terminátory a v některých příkladech enhancery sekvence). Termín „kontrolní sekvence' všechny složky, jejichž přítomnost je nutná pro expresi a mohou také zahrnovat další složky, jejichž přítomnost je výhodná, například vedoucí sekvence, které řídí sekreci.

Termín „promotor je nukleotidová sekvence, která se skládá z kanonických sekvencí, které umožňují vazbu RNA polymerázy k DNA templátu takovým způsobem, že produkce mRNA je zahájena v normálním iniciačním místě transkripce pro přilehlý strukturální gen.

·· ·· • · · « • · ·« ·» ·»·· ♦ * «·„ • ♦ · » * ♦ • ·« - - ! Ϊ.·· · * ·« se týká postavení vedle sebe, ve vztahu, který jim umožňuje

Termín „operativně spojený kde složky doposud popsané jsou působit jejich zamýšleným způsobem. Kontrolní sekvence „operativně spojená ke kódující sekvenci je ligována tak, že exprese kódující sekvence je dosaženo v podmínkách kompatibilních s kontrolními sekvencemi.

Termín „otevřený čtecí rámec (ORF) je úsek polynukleotidové sekvence, která kóduje polypeptid a neobsahuje stop kodony, tento úsek může představovat část kódující sekvence nebo celou kódující sekvenci.

Termín „kódující sekvence je polynukleotidové sekvence, která je transkribována na mRNA a/nebo translatována na polypeptid, když je umístěna pod kontrolu vhodných regulačních sekvencí. Hranice kódující sekvence jsou určeny start kodonem translace na 5'-konci a stop kodonem translace na 3'-konci. Kódující sekvence může zahrnovat, ale bez omezení, mRNA, DNA (včetně cDNA) a rekombinantní polynukleotidové sekvence.

Jak se v tomto textu používá termín „epitop nebo „antigenní determinanta, znamená aminokyselinovou sekvenci, která je imunoreaktivní. Obecně epitop sestává z alespoň 3 až 4 aminokyselin a obvykleji sestává z alespoň 5 nebo 6 aminokyselin, někdy se epitop skládá přibližně ze 7 až 8 nebo dokonce přibližně z 10 aminokyselin. Jak se v tomto textu používá, epitop určeného polypeptidu označuje epitopy se stejnou aminokyselinovou sekvencí jakou má epitop určeného polypeptidu a jeho imunologické ekvivalenty. Takové ekvivalenty také zahrnují kmen, podtyp (= genotyp) nebo typ (skupinu) specifických variant, např. současně známé sekvence

nebo

kmeny

patří

ke

genotypům

la

, lb

, 1 c,

Id,

le,

if,

2 3 f

2b,

2c,

2d, 2e,

2f,

2g,

2h, 2i,

3a,

3b,

3c,

3d,

3e,

3f,

3g,

4a,

4b,

4c, 4d,

4e,

4f,

4g, 4h,

4i,

4 j,

4k,

41,

5a,

5b,

6a,

6b,

6c,

7a, 7b,

7c,

8a,

8b, 9a, 9b,

10a

nebo

kterémukoliv

dalšímu

nově definovanému HCV (pod)typu. Rozumí se, že aminokyseliny ·· ·· 0· ·· 0· 00·0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 0

0 00 0 0 00 00 · · 0 000 00 000 0 0

00 0 0 00 0 0 00 0 tvořící epitop nemusí být částí lineární sekvence, ale mohou být promíchány jakýmkoliv množstvím aminokyselin, a tak vytvářející konformační epitop.

Termín „imunogenní se týká schopnosti látky vyvolat humorální a/nebo buněčnou reakci, ať už samotné nebo ve spojení s nosičem, v přítomnosti nebo nepřítomnosti adjuvans. Termín „neutralizace se týká imunitní reakce, která blokuje infekčnost infekčního agens, a to buď částečně nebo úplně. Termín „vakcína označuje imunogenní přípravek schopný vyvolat ochranu před HCV, ať už parciální nebo kompletní. Vakcína může také být použitelná pro léčení jedince, v tomto případě je nazývána terapeutickou vakcínou.

Termín „terapeutický se týká přípravku schopného léčení HCV infekce.

Termín „účinné množství se týká množství polypeptidů nesoucího epitop, které je dostatečné pro indukci imunogenní reakce u jednotlivce, kterému je podáváno nebo je jinak zjistitelně imunoreaktivní v zamýšleném systému (např. imunotestu). Výhodně je účinné množství dostatečné pro provádění léčby, jak definováno výše. Přesné nezbytné množství se bude měnit podle aplikace. Pro aplikace vakcín nebo například pro vytvoření polyklonálních antisér/protilátek, se účinné množství může měnit v závislosti na druhu, věku a obecném stavu jednotlivce, závažnosti léčeného chorobného stavu, na vybraném konkrétním polypeptidů a způsobu jeho podávání, apod. Má se také za to, že účinné množství lze nalézt v relativně velkém rozsahu mimo kritický rozsah. Vhodné účinné množství může být snadno určeno s použitím pouze rutinních experimentů. Výhodný rozsah El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů pro profylaxi HCV onemocnění jsou 0,01 až 100 μg/dávka, výhodně 0,1 až 50 μg/dávka. Jednotlivec může * · potřebovat několik dávek, aby dosáhl dostatečné imunitní reakce a následné ochrany před HCV infekcí.

• · ·· ·· · · ···· ···· ···· · · · • · ·· ···· · · · • · · · · · · · ··· · · • ·· · · ·· · · ·· · • · ·· · · ·· ·· ··

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález konkrétně poskytuje způsob izolace nebo purifikace rekombinantního HCV jednotlivého nebo specifického oligomerního obalového proteinu vybraného ze skupiny, kterou tvoří El a/nebo E2 a/nebo E1/E2, pro který je charakteristické, že při lýze transformovaných hostitelských buněk, aby se izoloval rekombinantně exprimovaný protein, je štěpení disulfidové vazby nebo redukce prováděno činidlem štěpícím disulfidovou vazbu.

Podstata těchto „jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů podle vynálezu je v tom, že jsou bez kontaminujících proteinů a že nejsou spojeny disulfidovou vazbou s kontaminujícími složkami.

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou rekombinantně exprimovány v nižších nebo vyšších eukaryotických buňkách nebo v prokaryota. Rekombinantní proteiny podle předkládaného vynálezu jsou výhodně glykosylovány a mohou obsahovat glykosylace s vysokým obsahem manózy, hybridní nebo komplexní. Výhodně jsou proteiny exprimovány savčími buněčnými liniemi, jak je detailně diskutováno v příkladech, nebo kvasinkami, jako například v mutovaných kvasinkových kmenech, jak je také detailně uvedeno v příkladech.

Proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být sekretovány nebo exprimovány ve kompartmentech buňky, jako je například ER nebo Golgiho aparát. Nicméně výhodně proteiny podle předkládaného vynálezu nesou glykosylace s vysokým obsahem manózy a jsou udržovány v ER nebo Golgiho aparátu savčích buněk nebo jsou udržovány v kvasinkách nebo sekretovány kvasinkami, výhodně sekretovány kvasinkovými • fc • fcfcfc • fcfc mutantními kmeny, jako například mutantou mnn9 (Kniskem et al., 1994) nebo od mutantami, které byly vybrány rezistencí k vanadátu (Ballou et al., 1991).

Na expresi HCV obalových proteinů původci vynálezu ukazují, že část volných thiolových skupin cysteinů nezapojených do intra- nebo inter-molekulárních disulfidových můstků, reagují s cysteiny proteinů pocházejících z hostitelských nebo expresních systémů (např. vakcínie) nebo jiných HCV obalových proteinů (jednotlivých nebo oligomerních) a tvoří nespecifické intermolekulární můstky. To má za následek vytváření „agregátů HCV obalových proteinů spolu s kontaminujícími proteiny. Bylo také ukazováno ve WO 92/08734, že „agregáty byly získány po purifikaci, ale nebylo popsáno, které proteinové interakce byly zapojeny. V patentové přihlášce WO 92/08734, rekombinantní E1/E2 protein exprimovaný systémem viru vakcínie byl částečně purifikovaný jako agregát a shledán pouze ze 70% čistý, což činí purifikované agregáty nepoužitelné pro diagnostické, profylaktické nebo terapeutické účely.

Proto hlavní cíl předkládaného vynálezu spočívá v oddělení jednotlivých nebo specifických oligomerních HCV obalových proteinů od kontaminujících proteinů a použití purifikovaných proteinů (> 95% čistý) pro diagnostické, profylaktické a terapeutické účely. Za tímto účelem původci předkládaného vynálezu byli schopní poskytnout důkaz, že agregované proteinové komplexy („agregáty) jsou vytvářeny na základě disulfidových můstků a nekovalentních interakcí proteinprotein. Předkládaný vynález tak poskytuje prostředky pro selektivní štěpení disulfidových vazeb za specifických podmínek a pro oddělení štěpených proteinů od kontaminujících proteinů, které velmi interferují s diagnostickými, profylaktickými a terapeutickými aplikacemi. Volné thiolové skupiny mohou být blokovány (reverzibilně nebo ireverzibilně), * ·· • · · · · · « · ··· · • · · · · ·· · · · · • · · · · · · · *· · · aby se zabránilo opětnému tvoření disulfidových můstků nebo mohou být ponechány oxidovat a oligomerizovat s jinými obalovými proteiny (viz definici homo-oligomeru). Je nutné rozumět, že takové proteinové oligomery jsou. v podstatě odlišné od „agregátů popsaných ve WO 92/08734 a WO 94/01778, protože stupeň kontaminujících proteinů je nedetekovatelný.

Štěpení disulfidové vazby může také být dosaženo:

(1) Oxidací permravenčí kyseliny pomocí cysteové kyseliny, v tomto případě cysteinové zbytky jsou modifikovány do cysteové kyseliny (Moore et al., 1963).

(2) Sulfitolýzou (R-S-S-R -> 2 R-SO3) například pomocí sulfitu (SO²‘₃) spolu s řádným oxidantem, jako je například Cu²⁺, v tomto případě cystein je modifikovaný na S-sulfocystein (Bailey a Cole, 1959).

(3) Redukce pomocí merkaptanů, jako je například dithiotreitol (DDT), β-merkaptoethanol, cystein, glutathion červeň, epsilonmerkaptoethylamin nebo thioglykolová kyselina, z nichž jsou běžně používány DTT a β-merkaptoethanol (Cleland, 1964), je výhodný způsob podle tohoto vynálezu, protože způsob může být prováděn ve vodném prostředí a protože cystein zůstane nemodi f i kován.

(4) Redukce pomocí fosfinu (např. Bu3P) (Ruegg a Rudinger, 1977).

Všechny tyto sloučeniny jsou tedy považovány za činidla nebo prostředky pro štěpení disulfidových vazeb podle předkládaného vynálezu.

štěpení předkládaného disulfidové disulfidové vazby (nebo redukce) podle vynálezu je výhodně parciální štěpení vazby (redukce) (prováděno v podmínkách parciálního štěpení nebo v redukčních podmínkách).

Výhodné činidlo pro štěpení disulfidové vazby nebo • · · · ···· ♦ · · · ·« 9

9 99 9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · • ·· · · ·· · · 9 9 9 • · ·· ♦-» · · · · ·· redukční činidlo podle předkládaného vynálezu je dithiotreitol (DTT). Parciální redukce je dosaženo s použitím nízké koncentrace redukčního činidla, tj . pro DTT například rozsah koncentrace přibližně 0,1 až přibližně 50 mM, výhodně přibližně 0,1 až přibližně 20 mM, výhodně přibližně 0,5 až přibližně 10 mM, výhodně více než 1 mM, více než 2 mM nebo více než 5 mM, výhodněji přibližně 1,5 mM, přibližně 2,0 mM, přibližně 2,5 mM, přibližně 5 mM nebo přibližně 7,5 mM.

štěpení disulfidové vazby může také být prováděno v přítomnosti vhodného detergentů (jako příklad prostředku pro štěpení disulfidových vazeb nebo v kombinaci se štěpícím činidlem) schopného oddělit exprimované proteiny, jako je například DecylPEG, EMPIGEN-BB, NP-40, cholát sodný, Triton X100.

Redukce nebo štěpení (výhodně parciální redukce nebo štěpení) je prováděno výhodně v přítomnosti detergentů nebo s ním. Výhodný detergent podle předkládaného vynálezu je Empigen-BB. Množství použitého detergentů je výhodně v rozsahu 1 až 10 %, výhodně více než 3%, výhodněji přibližně 3,5% detergentů, jako je například Empigen-BB.

Obzvláště výhodný způsob jak dosáhnout štěpení disulfidové vazby používá kombinaci klasického činidla pro štěpení disulfidové vazby, jak uvedeno detailně výše, a detergentů (také jak uvedeno detailně výše). Jak zvažováno v příkladech, konkrétní kombinace nízké koncentrace DTT (1,5 až 7,5 mM) a přibližně 3,5% Empigen-BB je prokázaná obzvláště výhodná kombinace redukčního činidla a detergentů pro purifikaci rekombinantně exprimovaných El a E2 proteinů. Pomocí gelové filtrační chromatografií bylo ukázáno, že parciální redukce má za následek produkci eventuálně dimerního El proteinu a separaci tohoto El proteinu od kontaminujících proteinů, které způsobují falešnou reaktivitu při použití v imunotestech.

φφφφ • · · · * · · • · · · · • ·· φ φ φ* φφ φφ φφ

Nicméně je nutné rozumět, kombinace každého redukčního s kterýmkoliv detergentem nebo známým, která učiní cysteiny že také kterákoliv jiná činidla v oboru známého jiným prostředkem v oboru lépe dostupnými, je také v rozsahu předkládaného vynálezu, pokud kombinace dosáhne stejného cíle štěpení disulfidového můstku, jako výhodná kombinace ilustrovaná v předkládaném vynálezu.

Nehledě na redukci disulfidových vazeb, prostředek pro štěpení disulfidové vazby podle předkládaného vynálezu může také zahrnovat kterákoliv výměnná činidla pro disulfidový můstek (kompetitivní činidla, která jsou buď organická nebo proteinové povahy, viz například Creighton, 1988) v oboru známá, která umožňují, aby nastal následující typ reakce:

Rl S - S R2 .+ R3 SH -> Rl S - S R3 + R2 SH *R1, R2: sloučeniny proteinových agregátů *R3 SH: kompetitivní činidlo (organické, proteinové)

Termín „výměnné činidla vyložen tak, že zahrnuje disulfidové vazby, a také vazbu.

pro disulfidový můstek má být činidla pro opětné vytvoření činidla blokující disulfidovou

Předkládaný vynález se také týká způsobů purifikace nebo izolace HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů, jak uvedeno výše, dále zahrnující použití kteréhokoliv blokujícího nebo vazebného činidla pro 5H skupinu v obor známého, jako například vybraném z následujícího seznamu:

Glutathion

5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoová kyselina) nebo bis-(3karboxy-4-nitrofenyl)-disulfid (DTNB nebo Elmannovo činidlo) (Elmann, 1959)

N-ethylmaleimid (NEM, Benesch et al., 1956) ·· ·* ·· • · · · ···· · · , · ·· · · · · ·· · • · · · · · · · · « « · · • ·· · · ·* · · · · · • · ·· ·9 tt tt tt

Ν-(4-dimethylamino-3,5-dinitrofenyl)maleimid nebo Tuppyho maleimid, který poskytuje barvu proteinu

P-chlormercuribenzoát (Grassetti et al., 1969)

4-vinylpyridin (Friedman a Krull, 1969) může být uvolněn po reakci kyselou hydrolýzou akrylonitril, může být uvolněn po reakci kyselou hydrolýzou (Well a Seibles, 1961)

NEM-biotin (např. získaný od firmy Sigma, B1267)

2, 2'-dithiopyridin (Grassetti a Murray, 1967)

4, 4'-dithiopyridin (Grassetti a Murray, 1967)

6, 6'-dithiodinikotinová kyselina (DTDNA, Brown a Cunnigham, 1970)

2, 2'-dithiobis-(5'-nitropyridin) (DTNP, patent Spojených

Států č. 3597160) nebo jiné dithiobis(heterocyklické deriváty) sloučeniny (Grassetti a Murray, 1969)

Přehled citovaných publikací ukazuje, že často různá činidla pro sulfhydrylové skupiny reagují s kolisajícím množství thiolových skupin stejné molekuly proteinu nebo enzymu. Lze uzavřít, že tato změna v reaktivitě thiolových skupin je díky sférickému prostředí těchto skupin, jako je například tvar molekuly a obklopující skupiny atomů a jejich náboje, a také pokud jde o velikost, tvar a náboj z molekuly nebo iontu činidla, často přítomnost adekvátních koncentrací denaturačních prostředků, jako je například dodecylsulfát sodný, urea nebo guanidinhydrochlorid, způsobí dostatečné rozložení proteinové molekuly, aby se umožnil stejný přístup všem činidlům pro thiolové skupiny. Kolísáním koncentrace denaturačního prostředku může být řízena míra rozložení, a tímto způsobem mohou být odhaleny thiolové skupiny s různými stupni reaktivity. Ačkoli doposud většina publikovaných prací • · • · ·

byla prováděna s p-chlormerkuribenzoátem, N-ethylmaleimidem a DTNB, je pravděpodobné, že se další nověji vyvinutá činidla mohou ukázat použitelná stejně. Díky jejich proměnlivým strukturám vypadá ve skutečnosti pravděpodobně, že mohou odpovídat odlišně na změny ve sterickém prostředí thiolových skupin.

Alternativně, podmínky, jako je například nízké pH (výhodně nižší než pH 6) pro zabránění oxidace volných SH skupin, a tedy zabraňující vytváření velkých intermolekulárních agregátů při rekombinantní expresi a purifikaci El a E2 (obalových) proteinů, jsou také v rozsahu předkládaného vynálezu.

Výhodné činidlo blokující SH skupiny podle předkládaného vynálezu je N-ethylmaleimid (NEM). Činidlo blokující SH skupiny může být podáváno během lýzy rekombinantních hostitelských buněk a po výše uvedeném parciálním redukčním postupu nebo po kterémkoliv jiném postupu pro štěpení disulfidových můstků. Činidlo blokující SH skupiny může také být modifikováno kteroukoliv skupinou, která je schopná poskytnout detekovatelnou značku a/nebo kteroukoliv skupinou, která pomáhá imobilizaci rekombinantního proteinu na pevný substrát, např. biotinylovaný NEM.

Metody pro štěpení cysteinových můstků a blokující volné cysteiny také byly popsány v publikacích autorů Darbre (1987), Means a Feeney (1971) a Wong (1993).

Způsob purifikace jednotlivých nebo specifických oligomerních rekombinantních El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů podle předkládaného vynálezu, jak bylo definováno výše, je dále charakterizovaný tím, že obsahuje následující kroky:

lýza hostitelských buněk exprimujících rekombinantní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2, výhodně v přítomnosti činidla

4·· ·· «· · · «· • · · · · 4 4 · · · · « · 4· «··» · · 4 • · · 4·· 4 · 4·· 4 4 • 44 4 444 · · · 4 · blokujícího SH skupiny, jako je například N-ethylmaleimid (NEM) a eventuálně vhodného detergentu, výhodně Empigen-BB, získání HCV obalového proteinu afinitní purifikaci, například pomocí lektinové chromatografie, jako je například lektinová chromatografie s lektinem z čočky nebo imunoafinitní chromatografie s použitím anti-El a/nebo anti-E2 specifických monoklonálních protilátek, pak následuj e redukce nebo štěpení disulfidových vazeb činidlem štěpícím disulfidovou vazbu, jako je například DTT, výhodně také v přítomnosti činidla blokujícího SH skupiny, jako je například NEM nebo Biotin-NEM, a získání redukovaných HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 obalových proteinů například gelovou filtrací (vylučovací chromatografií nebo přes molekulární síta) a eventuálně také další Ni²⁺-IMAC chromatografií a odsolováním.

Je nutné porozumět, že výše uvedené získání může také být prováděno s použitím odborníkovi známé.

kterékoliv jiné vhodné techniky

Výhodné chromatografii s aglutininem chromatografie systémy lektinové chromatografie zahrnuj i (GNA) nebo lektinová znázorněno s aglutininem Galanthus nivalis čočky jedlé (LCA) (čočka), s lektinem z čočky, jak je v příkladech. Další použitelné lektiny zahrnují ty, které jsou rozpoznávány sacharidy s vysokým obsahem manózy, jako například aglutinin z Narcis pseudonarcissus (NPA), aglutinin z Pisum sativum (P5A) nebo aglutinin z Album ursinum (AUA).

Výhodně je způsob použitelný k purifikaci jednotlivého nebo specifického oligomerního HCV obalového proteinu vytvářeného intracelulárně, jak uvedeno detailně výše.

Pro sekretované El nebo E2 nebo E1/E2 oligomery jsou výhodnými lektiny lektiny vázající komplexní sacharidy, jako například aglutinin I z Ricinus communis (RCA I),

Předkládaný vynález konkrétně poskytuje v podstatě purifikované rekombinantní HCV jednotlivé nebo specifické oligomerní obalové proteiny, vybrané ze skupiny, kterou tvoří El a/nebo E2 a/nebo E1/E2, pro které je charakteristické, že byly izolovány nebo purifikovány způsobem, jak byl definovány výše.

Předkládaný vynález se konkrétně týká purifikace nebo izolace rekombinantních obalových proteinů, které jsou exprimovány rekombinantními savčími buňkami, jako je například vakcínie.

Předkládaný vynález se také týká purifikace nebo izolace rekombinantních obalových proteinů, které jsou exprimovány rekombinantními kvasinkami.

Předkládaný vynález se stejně týká purifikace nebo izolace rekombinantních obalových proteinů, které jsou exprimovány rekombinantními bakteriálními (prokaryotickými) buňkami.

Předkládaný vynález také poskytuje rekombinantní vektor obsahující vektorovou sekvenci, sekvenci vhodného prokaryotického, eukaryotického nebo virového nebo syntetického promotoru následovanou nukleotidovou sekvencí umožňující expresi jednotlivých nebo specifických oligomerních El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů podle vynálezu.

Konkrétně předkládaný vynález poskytuje rekombinantní vektor obsahující vektorovou sekvenci, sekvenci vhodného prokaryotického, eukaryotického nebo virového nebo syntetického promotoru následovanou nukleotidovou sekvencí umožňující expresi jednotlivého El nebo El podle vynálezu.

Konkrétně předkládaný vynález poskytuje rekombinantní vektor obsahující vektorovou sekvenci, sekvenci vhodného ·· ·· ·« · * ·· · ·· · ··♦« · · * · ·· · ···· ♦··· * « 4t • · · · · · · · · · « φ « • · · · · · * · · · » « ·· ·· ·· ·· ·» ·· prokaryotického, eukaryotického nebo virového nebo syntetického promotoru následovanou nukleotidovou sekvencí umožňující expresi jednotlivého El nebo E2 podle vynálezu.

Segment HCV cDNA kódující požadovanou El a/nebo E2 sekvenci vloženou do vektorové sekvence může být připojen k signální sekvenci. Signální sekvence může být sekvence ze zdroje jiného než z HCV, např. IgG nebo vedoucí sekvence tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPa) pro expresi v savčích buňkách nebo sekvence a-konjugačního (α-mating) faktoru pro expresi v kvasinkách, ale obzvláště výhodné konstrukty podle předkládaného vynálezu obsahují signální sekvence objevující se v HCV genomu před příslušnými počátečními body El a E2 proteinů. Segment HCV cDNA kódující požadovanou El a/nebo E2 sekvenci vložený do vektoru může také zahrnovat delece např. hydrofobních domén), jak znázorněno v příkladech, nebo E2 hypervariabilní úsek I.

Konkrétně rekombinantní vektory podle předkládaného vynálezu zahrnují nukleovou kyselinu mající HCV cDNA úsek kódující polyprotein počínající v úseku mezi polohami aminokyselin 1 a 192 a končící v úseku mezi polohami 250 a 400 HCV polyproteinu, výhodněji končící v úseku mezi polohami 250 a 341, dokonce výhodněji končící v úseku mezi polohami 290 a 341 pro expresi HCV jednotlivého El proteinu. Nejvýhodněji předkládaný rekombinantní vektor zahrnuje rekombinantní nukleovou kyselinu mající HCV cDNA segment kódující část HCV polyproteinu počínaje v úseku mezi polohami 117 a 192 a končící v kterékoliv poloze v úseku mezi polohami 263 a 326, pro expresi HCV jednotlivého El proteinu. V rozsahu předkládaného vynálezu jsou také formy, které mají první hydrofobní doménu odstraněnou (polohy 264 až 293 plus nebo minus 8 aminokyselin) nebo formy, ke kterým byl přidán 5'koncový ATG kodon a 3'-koncový stop kodon nebo formy, které mají štěpné místo faktoru Xa a/nebo bylo přidáno 3 až 10,

4 • 4

4

4 • 4 4 4 • 4 44 • 4 4 4 »

4 4 4

4 4 9

4 44

4 4 4

4 · výhodně 6 histidinových kodonů.

Konkrétně rekombinantní vektory podle předkládaného vynálezu zahrnují nukleovou kyselinu mající HCV cDNA úsek kódující polyprotein počínající v úseku mezi polohami aminokyselin 290 a 406 a končící v úseku mezi polohami 600 a 820 HCV polyproteinu, výhodněji počínající v úseku mezi polohami 322 a 406, ještě výhodněji počínající v úseku mezi polohami 347 a 406, ještě mnohem výhodněji počínající v úseku mezi polohami 364 a 406 pro expresi HCV jednotlivého E2 proteinu. Nejvýhodněji předkládaný rekombinantní vektor zahrnuje rekombinantní nukleovou kyselinu mající HCV cDNA segment kódující polyprotein počínající v úseku mezi polohami 290 a 406 a končící ve kterékoliv poloze z poloh 623, 650, 661, 673, 710, 715, 720, 746 nebo 809, pro expresi HCV jednotlivého E2 proteinu. Také v rozsahu předkládaného vynálezu jsou formy, ke kterým byl přidán 5'-koncový ATG kodon a 3'-koncový stop kodon nebo formy, které mají štěpné místo faktoru Xa a/nebo bylo přidáno 3 až 10, výhodně 6 histidinových kodonů.

Může být použita celá řada vektorů, aby se dosáhlo rekombinantní exprese HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů podle předkládaného vynálezu. Nižší eukaryota, jako jsou například kvasinky a glykosylační mutantní kmeny jsou typicky transformovány plazmidy nebo jsou transformovány rekombinantním virem. Vektory se mohou replikovat v hostiteli nezávisle nebo se mohou integrovat do hostitelského buněčného genomu.

Vyšší eukaryota mohou být transformována vektory nebo mohou být infikována rekombinantním virem, například rekombinantním virem vakcínie. Techniky a vektory pro inzerci cizorodé DNA do viru vakcínie jsou v oboru dobře známy a využívají například homologní rekombinaci. V oboru je dostupná celá řada sekvencí virových promotorů, možných terminátorových ·· ·#·· ·· · · ·« · * • •99 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9· 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · · · · · 9 9 9

99 99 99 99 99 sekvencí a póly(A) . adičních sekvencí, možných sekvencí enhancerů a možných amplifikačních sekvencí, které jsou všechny vyžadovány pro savčí expresi. Vakcínie je obzvláště výhodná, protože vakcínie zastaví expresi buněčných proteinů hostitele. Vakcínie je také velmi výhodná, protože umožňuje expresi El a E2 proteinů HCV v buňkách nebo jednotlivcích, kteří jsou imunizováni živým rekombinantním virem vakcínie. Pro očkování lidí jsou konkrétně použitelné vektory ptačího pox viru (avipox) a Ankarský Modifikovaný Virus (AMV).

Jsou také známy hmyzí expresní transferové vektory odvozené z bakuloviru polyhedrózy jádra Autographa californica (AcNPV), což je virový expresní vektor nezávislý na pomocném viru. Expresní vektory pocházející z tohoto systému obvykle používají silný virový promotor genu polyhedrinu pro řízení exprese heterologních genů. Různé vektory, a také metody pro zavedení heterologní DNA do požadovaného místa bakuloviru jsou odborníkovi dostupné pro bakulovirovou expresi. V oboru jsou také známy různé signály pro posttranslační modifikaci rozpoznávané hmyzími buňkami.

V rozsahu předkládaného vynálezu je také zahrnut způsob přípravy purifikovaných rekombinantních jednotlivých nebo specifických oligomerních HCV El nebo E2 nebo E1/E2 proteinů, kde cysteinové zbytky zapojené do tvorby agregátů jsou nahrazeny na úrovni sekvence nukleové kyseliny jinými zbytky tak, že je zabráněno vytváření agregátů. Rekombinantní proteiny exprimované rekombinantními vektory nesoucí takové mutované nukleové kyseliny kódující El a/nebo E2 protein jsou také v rozsahu předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se také týká rekombinantních El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů, pro které je charakteristické to, že bylo odstraněno alespoň jedno z jejich glykosylačních míst a následně jsou nazývány glykosylační mutanty. Jak je vysvětleno v příkladech, mohou být požadovány různé glykosylační mutanty • 0

0000

000 0000 00 « • 0 00 00 00 000

00 000 00 000 0 0 • 000 0 00 0 0 00 0

0« 0« 00 00 ·0 pro diagnózu (screening, konfirmaci, prognózu, apod.) a prevenci HCV infekce podle vyšetřovaného pacienta. Například bylo zjištěno, že glykosylační mutanta E2 proteinu postrádající GLY4 zlepšovala reaktivitu určitých sér při diagnóze. Tyto glykosylační mutanty jsou výhodně purifikovány podle způsobu popsaného v předkládaném vynálezu. Předkládaný vynález také předpokládá rekombinantní vektory nesoucí inzert nukleové kyseliny kódující takové El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 glykosylační mutanty, a také hostitelské buňky transformované takovým rekombinantním vektorem.

Předkládaný vynález se také týká rekombinantních vektorů zahrnujících polynukleotid, který také tvoří část předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález se konkrétně týká rekombinantních nukleových kyselin, jak jsou ·reprezentovány v sekv. id. č. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 a 49 nebo v jejich částech.

Předkládaný vynález se také týká hostitelských buněk transformovaných rekombinantním vektorem, jak bylo definováno výše, kde vektor obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 protein, jak byl definován výše, navíc k regulační sekvenci operativně spojené k HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 sekvenci a schopné řízení exprese HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinu.

Eukaryotičtí hostitelé zahrnují nižší a vyšší eukaryotické hostitele, jak byli popsáni v definicích. Nižší eukaryotičtí hostitelé zahrnují v oboru dobře známé kvasinky. Vyšší eukaryotičtí hostitelé zahrnují hlavně v oboru známé savčí buněčné linie a zahrnují mnoho imortalizovaných buněčných linií dostupných z ATCC, včetně buněk HeLa, buněčné linie z vaječníků čínského křečka (CHO), buněčné linie z ledvin mláďat křečků (ΒΗΚ), PK15, RK13 a množství dalších buněčných linií.

φφ φ · φφ • « φ • φ φφ • · φ φφ φφ * φ φ φ φ · φ φ • φ φ φφ φφ • φ φ

Φφφ i u :

Φ Φ φφ

Předkládaný vynález se konkrétně týká rekombinantního El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinu exprimovaného hostitelskou buňkou, jak bylo definováno výše, obsahující rekombinantní vektor, jak bylo definováno výše. Tyto rekombinantní proteiny jsou purifikovány zejména podle způsobu podle předkládaného vynálezu.

Výhodný způsob izolace nebo purifikace HCV obalových proteinů, jak byly definovány výše, je dále charakterizován tím, že obsahuje alespoň následující kroky:

pěstování hostitelských buněk, jak byly definovány výše, transformovaných rekombinantním vektorem podle předkládaného vynálezu nebo známým rekombinantním vektorem exprimujícím El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 HCV obalové proteiny ve vhodném kultivačním médiu, vyvolání exprese vektorové sekvence, jak byla výše, ve vhodných podmínkách, a lýza transformovaných hostitelských buněk, v přítomnosti činidla blokujícího SH skupiny, například N-ethylmaleimid (NEM) a eventuálně detergentu, výhodně Empigen-BB, definována výhodně jako je vhodného získání HCV obalového proteinu afinitní purifikaci, jako například pomocí lektinové chromatografie nebo imunoafinitní chromatografie s použitím anti-El a/nebo anti-E2 specifické monoklonální protilátky, přičemž lektin je výhodně lektin z čočky nebo GNA, pak následuje inkubace eluátu z předchozího kroku s činidlem štěpícím disulfidovou vazbu, jako je například DTT, výhodně následovaná inkubací s činidlem blokujícím SH skupiny, jako jenapříklad NEM nebo Biotin-NEM, a, izolace HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů, například gelovou filtrací • · ··» · *· ♦ · ··

9 9 9 9 9 9 9

9 9· 9 9 99 • · · 9 · 9 9 9 · ···· 9 9 9 9

99 99 99

a eventuálně také následnou Ni²⁺-IMAC chromatografií následovanou odsolováním.

Jako výsledek výše uvedeného postupu mohou být El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteiny vytvářeny ve formě, která se eluuje odlišně od velkých agregátů obsahující složky pocházející z vektorů a/nebo buněčné složky v „mrtvém objemu gelové filtrační kolony nebo IMAC kolony, jako znázorněno v příkladech. Štěpení disulfidového můstku výhodně také vyloučí falešnou reaktivitu způsobenou přítomností proteinů pocházejících z hostitelského a/nebo expresního systému. Přítomnost NEM a vhodného detergentů během lýzy buněk může už částečně nebo dokonce úplně zabránit agregaci mezi HCV obalovými proteiny a kontaminujícími složkami.

Chromatografie Ni²⁺-IMAC následovaná odsolováním je výhodně používána pro konstrukty nesoucí (His) 6,· jak bylo popsáno autory Janknecht et al., 1991 a Hochuli et al., 1988.

Předkládaný vynález se také týká způsobu produkce monoklonálních protilátek v malých zvířatech, jako jdou například myši nebo laboratorní potkani, a také způsobu screeningu a izolace humánních B lymfocytů, které rozpoznávají anti-HCV protilátky, s použitím HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález dále se týká přípravku obsahujícího alespoň jeden z následujících El peptidů, jak jsou uvedeny v tabulce 3:

El-31 (sekv. id. č úseku jádro/El VI,

El-33 (sekv. id. č z El úseku,

56) zahrnující aminokyseliny 181 až 200

57) zahrnující aminokyseliny 193 až 212

El-35 (sekv. id. č. 58) zahrnující aminokyseliny 205 až 224

Φ· ·Φ·Φ φφ φφφφ φφφφ «φ φ φφφφ φφφφ φφφ φ φφ φφφ φφ φφφ φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφ φφ

z El V2 úseku E1-35A (sekv.	(epitop Β) ,	aminokyseliny	208	až	227
id. č.	59)	zahrnuj ící
z El V2 úseku	(epitop	B) .
lbEl (sekv.	id. č.	53)	zahrnuj ící	aminokyseliny	192	až	228
z El úseků (VI, Cl a ¹	72 úseky (obsahující epitop Β))	r
El-51 (sekv.	id. č.	66)	zahrnuj ící	aminokyseliny	301	až	320
z El úseku,
El-53 (sekv.	id. č.	67)	zahrnuj ící	aminokyseliny	313	až	332
z El C4 úseku	(epitop	A),
El-55 (sekv.	id. č.	68)	zahrnuj ící	aminokyseliny	325	až	344

z El úseku.

Předkládaný vynález se také týká přípravku obsahujícího nejméně jeden z následujících E2 peptidů, jak jsou uvedeny v tabulce 3:

Env 67 nebo E2-67 (sekv. id. č. 72) zahrnující aminokyselinové polohy 397 až 416 z E2 úseku (epitop A, rozpoznávaný monoklonální protilátkou 2F10H10, viz obrázek 19),

Env 69 nebo E2-69 (sekv. id. č. 73) zahrnující aminokyselinové polohy 409 až 428 z E2 úseku (epitop A),

Env	23	nebo E2-23 (sekv. id.	č.	86)	zahrnující polohy	583	až
602	z E2 úseku (epitop Ε),
Env	25	nebo E2-25 (sekv. id.	č.	87)	zahrnuj ící	polohy	595	až
614	z E2 úseku (epitop Ε),
Env	27	nebo E2-27 (sekv. id.	č.	88)	zahrnující	polohy	607	až
626	z E2 úseku (epitop Ε) ,
Env	17B	nebo E2-17B (sekv. id.	č.	83)	zahrnuj ící	polohy	547	až
586	z E2 úseku (epitop D) ,
Env	13Β	nebo E2-13B (sekv. id.	č.	82)	zahrnuj ící	polohy	523	až
542	z	E2 úseku (epitop	c,	rozpoznávaný	monoklonální

protilátkou 16A6E7, viz obrázek 19).

φφ φφ φ φ φ φ φφφφ • φ φ φ φ φ φ · • Φ φφ • ♦ · · · φ ♦ φ φ φφ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ

Předkládaný vynález se také týká přípravku obsahujícího alespoň jeden z následujících E2 konformačních epitopů:

Epitop F rozpoznávaný monoklonálními protilátkami 15C8C1, 12D11F1 a 8G10D1H9,

Epitop G rozpoznávaný monoklonální protilátkou 9G3E6,

Epitop H (nebo C) rozpoznávaný monoklonální protilátkou 10D3C4 a 4H6B2, nebo,

Epitop I rozpoznávaný monoklonální protilátkou 17F2C2.

Předkládaný vynález se také týká El nebo E2 specifické protilátky vypěstované po imunizaci peptidovým nebo proteinovým přípravkem, přičemž protilátka je specificky reaktivní s kterýmikoliv polypeptidy nebo peptidy, jak byly definovány výše, a protilátka je výhodně monoklonální protilátka.

Předkládaný vynález se také týká El nebo E2 specifické protilátky, na kterou byl prováděn screening v knihovně variabilních řetězců v plazmidech nebo fágách nebo v populaci humánních B lymfocytů pomocí postupu v oboru známého, přičemž protilátka je reaktivní s kterýmikoliv polypeptidy nebo peptidy, jak byly definovány výše, a protilátka je výhodně monoklonální protilátka.

El nebo E2 specifické monoklonální protilátky podle vynálezu mohou být produkovány kterýmkoliv hybridomem, který lze vytvořit klasickými metodami ze splenocytů zvířete, konkrétně myši nebo laboratorního potkana, imunizovaného proti HCV polypeptidům nebo peptidům podle vynálezu, jak definovány výše, na jedné straně a z buněk myelomové buněčné linie na druhé straně, a které jsou vybrány schopností hybridomů tvořit monoklonální protilátky rozpoznávající polypeptidy, které byly zpočátku použity pro imunizaci zvířat.

Protilátky týkající se vynálezu mohou být značeny vhodnou

A A AA » A A A » A AA

AA

AA AAAA • A « «

AA AA značkou enzymatického, fluorescenčního nebo radioaktivního typu.

Monoklonální protilátky podle tohoto výhodného provedení vynálezu mohou být humanizované verze myších monoklonálních protilátek vytvářené pomocí technologie rekombinantní DNA, vytvářené z různých forem sekvencí myší a/nebo humánní genomové DNA kódující H a L řetězce z cDNA nebo genomových klonů kódujících H a L řetězce.

Alternativně monoklonální protilátky podle tohoto výhodného provedení vynálezu mohou být humánní monoklonální protilátky. Tyto protilátky podle předkládaného provedení vynálezu mohou také pocházet z humánních lymfocytů periferní krve pacientů infikovaných HCV nebo očkovaných proti HCV. Takové humánní monoklonální protilátky jsou připraveny například prostřednictvím populace humánních lymfocytů periferní krve (PBL) myší se závažným kombinovaným imunitním deficitem (SCID) (nedávný přehledný článek viz Duchosal et al., 1992) .

Vynález se také týká použití proteinů nebo peptidů podle vynálezu pro selekci rekombinantních protilátek klonováním celého repertoáru protilátek (Persson et al., 1991).

Protilátky namířené proti peptidům nebo jednotlivým nebo specifickým oligomerním obalovým proteinům pocházejícím z určitého genotypu mohou být použity jako lék, konkrétně pro inkorporaci v imunotestu pro detekci HCV genotypů (pro detekci přítomnosti HCV El nebo E2 antigenu), pro prognózu/sledování HCV infekce nebo jako terapeutické přípravky.

Alternativně se předkládaný vynález také týká použití kterékoliv z výše uvedených El nebo E2 specifických monoklonálních protilátek pro přípravu soupravy pro imunotest pro detekci přítomnosti El nebo E2 antigenu v biologickém vzorku, pro přípravu soupravy pro prognózu/sledování HCV ♦ ♦ 00 «· '»· ·· 0000 0000 0 0 0 · ·« · 00 00 00 0« 000 0 00 000 00 «00 0 0 0 00 0 0 00 0 « 00 0

00 00 ·9 00 00 onemocnění nebo pro přípravu léku pro HCV.

Předkládaný vynález se také týká způsobu pro in vitro diagnózu nebo detekci HCV antigenu přítomného v biologickém vzorku, který obsahuje alespoň následující kroky:

(i) (ii) kontakt biologického vzorku s kteroukoliv z E2 specifických monoklonálních protilátek, definovány výše, výhodně v imobilizované vhodných podmínkách, které umožňují imunitního komplexu,

El a/nebo jak byly formě ve vytvoření odstranění nenavázaných složek, (iii) inkubaci vytvořených imunitních komplexů s heterologními protilátkami, které specificky vážou protilátky přítomné v analyzovaném vzorku, s heterologními protilátkami, které byly konjugovány k detekovatelné značce ve vhodných podmínkách, (iv) detekci přítomnosti imunitních komplexů vizuálně nebo mechanicky (např. pomocí denzitometrie, fluorimetrie, kolorimetrie).

Předkládaný vynález se také týká soupravy pro in vitro diagnózu HCV antigenu přítomného v biologickém vzorku obsahuj ící:

alespoň jednu monoklonální protilátku, jak byla definována výše, přičemž protilátka je výhodně imobilizována na pevném substrátu, pufr nebo složky nutné pro přípravu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito protilátkami a HCV antigeny přítomnými v biologickém vzorku,

- prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci, eventuálně také zahrnutí automatizovaných zařízení pro fcfc fcfc fcfc • fcfcfc fcfc ··» fcfc fcfcfcfc skenování a interpretaci pro posouzení HCV antigenů přítomných ve vzorku z pozorovaného typu vazby.

Předkládaný vynález se také týká přípravku obsahujícího El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 rekombinantní HCV proteiny purifikované podle způsobu podle předkládaného vynálezu nebo přípravku obsahujícího alespoň jeden z peptidů, jak byly popsány výše, pro použití jako léku.

Předkládaný vynález se konkrétně týká přípravku obsahujícího alespoň jeden z výše specifikovaných obalových peptidů nebo přípravku rekombinantního obalového proteinu, jak bylo definováno výše, pro použití jako vakcíny pro imunizaci savce, výhodně lidí, proti HCV, zahrnující podávání dostatečného množství přípravku eventuálně doprovázeného farmaceuticky přijatelným adjuvans(adjuvancii) za vzniku imunitní reakce.

Konkrétně se předkládaný vynález týká použití kteréhokoliv z přípravků, jak byly popsány výše v tomto textu, pro přípravu vakcíny, jak bylo popsáno výše.

Předkládaný vynález se také týká vakcinačního přípravku pro imunizaci savce, výhodně lidí, proti HCV, obsahujícího HCV jednotlivé nebo specifické oligomerní proteiny nebo peptidy pocházející z El a/nebo E2 úseku, jak bylo popsáno výše.

Imunogenní přípravky mohou být připraveny podle metod v oboru známých. Předkládané přípravky zahrnují imunogenní množství rekombinantních El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 jednotlivých nebo specifických oligomerních proteinů, jak bylo definováno výše, nebo El nebo E2 peptidů, jak bylo definováno výše, obvykle spojených s farmaceuticky přijatelným nosičem, dále výhodně obsahující adjuvans.

Očekává se, že jednotlivé nebo specifické oligomerní obalové proteiny podle předkládaného vynálezu, buď El a/nebo E2 a/nebo E1/E2, poskytují obzvláště použitelný vakcinační • 9 99 99 99 99 9999

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 '

9 99 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 · 9 9 9 9 « · · 9 antigen, protože vytvořeni protilátek proti každému El nebo E2 může být více žádoucí než vytvoření protilátek k jinému obalovému proteinu a protože E2 protein je zkříženě reaktivní mezi HCV typy a El protein je typově specifický. Koktejly zahrnující typ 1 E2 proteinu a El proteiny pocházející od několika genotypů mohou být obzvláště výhodné. Koktejly obsahující molární nadbytek El proti E2 nebo E2 proti El mohou také být konkrétně použitelné. Imunogenní přípravky mohou být podávány zvířatům, aby indukovaly produkci protilátek, buď aby poskytly zdroj protilátek nebo indukovaly protektivní imunitu u zvířete.

Farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují každý nosič, který samotný neindukuje produkci protilátek škodlivých jednotlivci, který přijímá přípravek. Vhodné nosiče jsou typicky velké pomalu metabolizované makromolekuly, jako například proteiny, polysacharidy, polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny, polymerni aminokyseliny, aminokyselinové kopolymery a inaktivní virové částice. Takové nosiče jsou odborníkům známy.

Výhodná adjuvancia pro zvýšení účinnosti přípravku bez omezení zahrnují hydroxid hlinitý (alum), N-acetyimuramyl-Lthreonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), jak zjištěno v patentu Spojených Států č. 4 606 918, N-acetylnormuramyl-L-alanyl-Disoglutamin (nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (MTP-PE) a RIBI, které obsahuje tři složky extrahované z baktérií, monofosforyllipid A, trehalózodimykolát a skelet buněčné stěny (MPL+TDM+CWS) ve 2% emulzi skvalen/Tween 80. Každá ze složek MPL, TDM nebo CWS může také být použita samotná nebo kombinovaná 2 krát 2. Dále mohou být použita adjuvancia, jako například Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) nebo SAF-1 (Syntex). Dále může být použito kompletní Ereundovo adjuvans (CFA) a nekompletní

Freundovo adjuvans (IFA) pro aplikace jiné než lidské a pro výzkumné účely.

♦ · *· «« *·*· * · · · r * · • 9 99 9 · ·· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • ·* · · 9 9 9 9 9 9 9 *· ·· ·· ·· ·· 99

Imunogenní přípravky přijatelná vehikula, jako roztok, glycerol, ethanol, typicky obsahují farmaceuticky je například voda, fyziologický apod. Dále mohou být v takovém vehikulu zahrnuty pomocné látky, jako například smáčedla nebo emulgátory, látky chránící pH, konzervační činidla apod.

Typicky jsou imunogenní přípravky připraveny jako přípravky pro injekce, buď jako kapalné roztoky nebo suspenze, mohou také být připraveny pevné formy vhodné k přípravě roztoku nebo suspenze v kapalných vehikulech před injekcí. Přípravek také může být emulgován nebo opouzdřen v lipozomech pro zesílení účinku adjuvans. El a E2 proteiny mohou také být zavedeny do Imunitních Stimulačních Komplexů spolu se saponiny, například Quil A (ISCOMS).

Imunogenní přípravky použité jako vakcíny zahrnují „dostatečné množství nebo „imunologicky účinné množství obalových proteinů podle předkládaného vynálezu, a také kterékoliv jiné z výše uvedených složek dle potřeby. Imunologicky účinné množství znamená, že podávání tohoto množství jednotlivci, buď v jedné dávce nebo jako část série, je účinné pro léčení, jak bylo definováno výše. Toto množství se mění v závislosti na zdraví a fyzikálním stavu léčeného jedince, taxonomické skupině léčeného jedince (např. primát jiného než lidského původu, primát, apod.), kapacitě imunitního systému jednotlivce syntetizovat protilátky, požadovaném stupni ochrany, formulaci vakcíny, hodnocení situace ošetřujícím lékařem, kmen infikujícího HCV a dalších relevantních faktorech. Očekává se, že množství spadá do relativně širokého rozsahu, které může být určeno rutinními klinickými zkouškami. Obvykle se množství bude lišit od 0,01 do 1000 μg/dávka, konkrétně od 0,1 do 100 μg/dávka.

• 0 «0 • 0 0

00

0 · • 0 «0

0 0 0

0 00 ··

0 0 « 00 00 «000

Jednotlivé nebo specifické oligomerní obalové proteiny mohou také sloužit jako nosiče vakcíny pro prezentaci homologních (např. epitopu T lymfocytů nebo epitopu B lymfocytů z jádra, NS2, NS3, NS4 nebo NS5 úseků) nebo heterologních (non-HCV) haptenů stejným způsobem jako povrchový antigen hepatitidy B (viz evropská patentová přihláška 174 444) . Při tomto použití obalové proteiny poskytují imunogenní nosič schopný stimulovat imunitní reakci na hapteny nebo antigeny konjugované k agregátu. Antigen může být konjugován buď obvyklými chemickými metodami nebo může být klonován do genu kódujícího El a/nebo E2 v lokalizaci odpovídající hydrofilnímu úseku proteinu. Takové hydrofilní úseky zahrnují VI úsek (zahrnující aminokyselinové polohy 191 až 202), V2 úsek (zahrnující aminokyselinové polohy 213 až 223), V3 úsek (zahrnující aminokyselinové polohy 230 až 242), V4 úsek (zahrnující aminokyselinové polohy 230 až 242), V5 úsek (zahrnující aminokyselinové polohy 294 až 303) a V6 úsek (zahrnující aminokyselinové polohy 329 až 336). Další použitelné lokalizace pro inzerci haptenů je hydrofobní úsek (zahrnující přibližně aminokyselinové polohy 264 až 293). V předkládaném vynálezu je ukázáno, že tento úsek může být odstraněn bez ovlivnění reaktivity odstraněného El proteinu s antiséry. Proto v místě delece mohou být vloženy hapteny.

Imunogenní přípravky jsou obvykle podávány parenterálně, typicky injekcí, například subkutánně nebo intramuskulárně. Další formulace vhodné pro jiné způsoby podávání zahrnují perorální formulace a čípky. Dávkování při léčbě může být podle schématu jedné dávky nebo schématu s mnohonásobnými dávkami. Vakcína může být podávána v kombinaci s dalšími imunoregulačními činidly.

Předkládaný vynález se také týká přípravku obsahujícího peptidy nebo polypeptidy, jak bylo popsáno výše, pro in vitro detekci HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku.

·* ·· • · · · • · ·· • · · · * · · ·

Φ· Φ· • · ·· ···· • · • ·

Předkládaný vynález se také týká použití přípravku, jak bylo popsáno výše, pro přípravu soupravy pro imunotest pro detekci HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku.

·· • ·· • · · • · · ·· ·· • I • · « ·· ··

Předkládaný vynález se také týká způsobu pro in vitro diagnózu HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku, obsahující alespoň následující kroky:

(i) kontakt biologického vzorku s přípravkem obsahujícím kterýkoliv z obalových peptidů nebo proteinů, jak bylo definováno výše, výhodně v imobilizované formě ve vhodných podmínkách, které umožní vytvoření imunitního komplexu, přičemž peptid nebo protein může být biotinylovaný peptid nebo protein, který je kovalentně vázán k pevnému substrátu pomocí streptavidinových nebo avidinových komplexů, (ii) odstranění nenavázaných složek, (iii) inkubaci vytvořených imunitních komplexů s heterologními protilátkami, přičemž heterologní protilátky byly konjugovány k detekovatelné značce ve vhodných podmínkách, (iv) detekci přítomnosti imunitních komplexů vizuálně nebo mechanicky (např. pomocí denzitometrie, fluorimetrie, kolorimetrie).

Alternativně se předkládaný vynález také týká kompetitivního imunotestu, ve kterém rekombinantně vytvořený purifikovaný jednotlivý nebo specifický oligomerní protein El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteiny, jak bylo popsáno výše, jsou použity v kombinaci s El a/nebo E2 peptidy, aby kompetovaly o HCV protilátky přítomné v biologickém vzorku.

Předkládaný vynález se také týká soupravy pro určování přítomnosti HCV protilátek v biologickém vzorku obsahující:

alespoň jeden peptidový nebo proteinový přípravek, jak bylo • · · · • · · · ···· ·· · • · ·· ···· ··· • ·· ··· · · · · · · · definováno výše, eventuálně v kombinaci s jinými polypeptidy nebo peptidy z HCV nebo jinými typy HCV, přičemž peptidy nebo proteiny jsou výhodně imobilizovány na pevném substrátu, výhodněji v různých jamkách stejné mikrotitrační destičky ELISA a ještě výhodněji na jednom a tomtéž membránovém pásu,

- pufr nebo složky nutné pro výrobu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito polypeptidy nebo peptidy a protilátkami proti HCV přítomným v biologickém vzorku, prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci, eventuálně také zahrnuje automatizovaná zařízení pro skenování a interpretaci pro posouzení HCV genotypů přítomných ve vzorku z pozorovaného typu vazby.

Způsob imunotestu podle předkládaného vynálezu využívá jednotlivé nebo specifické oligomerní antigeny z El a/nebo E2 domén, které udržují lineární (v případě peptidů) a konformační epitopy (jednotlivé nebo specifické oligomerní proteiny) rozpoznávané protilátkami v sérech jednotlivců infikovaných s HCV. V rozsahu vynálezu je použití například jednotlivých nebo dimerních antigenů, specifických oligomerních antigenů, a také kombinace jednotlivých nebo specifických oligomerních antigenů. HCV El a E2 antigeny podle předkládaného vynálezu mohou být použity v doslova kterémkoliv formátu testu, který používá známý antigen pro detekci protilátek. Samozřejmě formát, který denaturuje HCV měl být odmítán těchto testů je, v kontaktu s tělesnou složkou, která je obsahuje HCV protilátky za podmínek, které umožní antigenů vazbu ke kterékoliv takové protilátce přítomné ve složce. Takové podmínky jsou typicky fyziologická teplota, pH a konformační epitop, by Společným rysem všech nebo adaptován, že antigen je v podezření, že • ·

0 0 0 0 0 0 0 0 0 · • 0 · · · · 0 0 ··· · 0 • 0 0 · 0 00 0 0 00 0 iontová síla s použitím nadbytku antigenu. Inkubace antigenu se vzorkem je následována detekcí imunitních komplexů obsahujících antigen.

Návrh imunotestů je podroben do velké míry variacím a v oboru je známo mnoho formátů. Protokoly mohou například používat pevné fáze nebo imunoprecipitaci. Většina testů zahrnuje použití značené protilátky nebo polypeptidů, značky mohou být například enzymatické, fluorescenční, chemiluminiscenční, radioaktivní nebo molekuly barviva. Jsou také známy testy, které amplifikují signály imunitního komplexu, jejich příklady jsou testy, které používají biotin a avidin nebo streptavidin a imunotesty se značenými enzymy a zprostředkované enzymy, jako jsou například ELISA testy.

Imunotest může bez omezení být v heterogenním nebo v homogenním formátu a standardního nebo kompetitivního typu, v heterogenním formátu je polypeptid typicky vázán k pevné matici nebo podpoře, aby usnadnil separaci vzorku od polypeptidů po inkubaci. Příklady pevné fáze, která může být použita, jsou nitrocelulóza (např. ve formě membrány nebo mikrotitrační jamky), polyvinylchlorid (např. v listech nebo mikrotitračních jamkách), polystyrenlatex (např. v perličkách nebo mikrotitračních destičkách), polyvinylidinfluorid (známý jak Immunolon™) , diazotizovaný papír, nylonové membrány, aktivované perličky a perličky Protein A. Například mikrotitrační destičky Dynatech Imunolon™ 1 nebo Imunolon™ 2 nebo polystyrénové perličky o velikosti 6,35 mm (0,25 palce) (Precision Plastic Balí) mohou být použity v heterogenním formátu. Pevná fáze obsahující antigenní polypeptidy je typicky promyta po separaci od testovaného vzorku a před detekcí navázaných protilátek. V oboru jsou známy oba standardní a kompetitivní formáty.

V homogenním formátu je s kombinací antigenů v roztoku.

testovaný vzorek inkubován

Například to může být za • · • · · · podmínek, kdy budou precipitovat každé komplexy antigenu a protilátky, které jsou vytvořeny. V oboru jsou známy oba standardní a kompetitivní formáty pro tyto testy.

Ve standardním formátu je přímo monitorováno množství HCV protilátek v komplexech protilátky a antigenu. To může být uskutečněno určováním, zda značené anti-xenogenní (např. humánní) protilátky, které rozpoznávají epitop na anti-HCV protilátkách, budou vázat díky vytvoření komplexů. V kompetitivním formátu množství HCV protilátek ve vzorku je odvozováno sledováním kompetitivního účinku na vazbu známého množství značené protilátky (nebo jiného kompetujícího ligandu) v komplexu.

Vytvořené komplexy obsahující anti-HCV protilátku (nebo v případě kompetitivních testů, množství kompetující protilátky) jsou detekovány kteroukoliv z velkého množství známých technik, v závislosti na formátu. Například neznačené HCV protilátky v komplexu mohou být detekovány s použitím konjugátu anti-xenogenního Ig v komplexu se značkou (např. enzymovou značkou).

V imunoprecipitačním nebo aglutinačním formátu testu reakce se mezi HCV antigeny a protilátkou tvoří síť, která precipituje z roztoku nebo suspenze a tvoří viditelnou vrstvu nebo film precipitátu. Jestliže ve zkušebním vzorku není antiHCV protilátka přítomná, není vytvořen žádný viditelný precipitát.

Nyní existují tři specifické typy testů s aglutinací částic (PA). Tyto testy jsou použity pro detekci protilátek k různým antigenům, když je jimi potažena pevná fáze. Jeden typ tohoto testu je hemaglutinační test používající červené krvinky (RBC), které jsou senzitizovány pasivně adsorbujícím antigenem (nebo protilátkou) k RBC. Přidání specifických antigenních protilátek přítomných v tělesné složce, jsou-li » · · • · • ·· přítomny, způsobí, že RBC potažené purifikovaným antigenem aglutinuji.

Aby se vyloučily potenciální nespecifické reakce v hemaglutinačním testu, mohou být v PA použity dva arteficiální nosiče místo RBC. Nejběžnější z nich jsou latexové částice. Nicméně mohou také být použity želatinové částice. Testy používající některý z těchto nosičů jsou založeny na pasivní aglutinaci částic potažených purifikovanými antigeny.

HCV jednotlivé nebo specifické oligomerní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 antigeny podle předkládaného vynálezu skládající se z konformačních epitopů jsou typicky baleny ve formě soupravy pro použití v těch imunotestech. Souprava normálně obsahuje v oddělených nádobkách nativní HCV antigen, kontrolní protilátkové formulace (pozitivní a/nebo negativní), značenou protilátku, když ji formát test vyžaduje a činidla vytvářející signál (např. enzymový substrát), jestliže značka netvoří signál přímo. Nativní HCV antigen může být už navázaný k pevné fázi nebo oddělený s činidly pro jeho vazbu k matrici. Instrukce (např. psané instrukce, pásek, CD-ROM, apod.) pro provádění testu jsou obvykle součástí soupravy.

Imunotesty, které používají nativní HCV antigen, jsou užitečné pro screening krve pro přípravu materiálu, ve kterých chybí potenciálně nakažlivý HCV. Způsob přípravy krevních materiálů obsahuje následující kroky: reakci tělesné složky, výhodně krve nebo krevní složky od dárce krve, s HCV El a/nebo E2 proteiny podle předkládaného vynálezu pro umožnění imunologické reakce mezi HCV protilátkami, jsou-li přítomny, a HCV antigenem. Detekce vytváření komplexů anti-HCV protilátka - HCV antigen jako výsledek reakce. Krev podílející se na krevních přípravcích je od dárců, které neprojevují protilátky k nativním HCV antigenům, El nebo E2.

• · · ·· ·· ·· » · · · · • · ·· 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · • ·· · · ·· · · ·· · ·· ·* ·· ·· ·· ··

V případech pozitivní reaktivity k HCV antigenu, je výhodné opakovat imunotest, aby se zmenšila možnost falešně pozitivních výsledků. Například v rozsáhlém screeningu krve pro produkci krevních produktů (např. transfúze krve, plazma, faktor VIII, imunoglobulin, apod.) „screeningové testy jsou typicky formátovány tak, aby se zvýšila senzitivita (pro pojištění, že neprochází žádná kontaminovaná krev) na účet specifity, tj. je zvýšena frekvence falešně pozitivních výsledků. Je tedy typické dále testovat jen ty dárce, kteří jsou „opakovaně reaktivní, tj. pozitivní ve dvou nebo více bězích imunotestu dodaného vzorku. Nicméně pro potvrzení HCV pozitivity jsou „konfirmační testy typicky formátovány tak, aby se zvýšila specifita (pro pojištění, že nejsou potvrzeny žádné falešně pozitivní vzorky) na účet senzitivity. Proto způsob purifikace popsaný v předkládaném vynálezu pro El a E2 bude velmi výhodný pro zahrnutí jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů do HCV diagnostických testů.

Vybrané pevné fáze mohou zahrnovat polymerní nebo skleněné perličky, nitrocelulózu, mikročástice, jamky mikrotitrační reakční destičky, testovací zkumavky a magnetické perličky. Sloučeniny vytvářející signál mohou zahrnovat enzym, luminiscenční sloučeninu, chromogen, radioaktivní prvek a chemiluminiscenční sloučeninu. Příklady enzymů zahrnují alkalickou fosfatázu, křenovou peroxidázu a β-galaktosidázu. Příklady sloučenin zesilujících signál zahrnují biotin, antibiotin a avidin. Příklady členů vázajících sloučeniny zesilující signál zahrnují biotin, anti-biotin a avidin. Aby se blokovaly účinky látek podobných revmatoidnímu faktoru, je testovaný vzorek podroben podmínkám dostatečně blokujícím účinek látek podobných revmatoidnímu faktoru. Tyto podmínky zahrnují kontakt testovaného vzorku s množstvím anti-humánního IgG za vzniku směsi a inkubaci směsi po dobu a v podmínkách dostatečných pro vznik reakční směsi produktu v podstatě bez • · látek podobných revmatoidnímu faktoru.

Předkládaný vynález dále předpokládá použití El proteinů nebo jejich částí, konkrétně HCV jednotlivých nebo specifických oligomerní El proteinů, jak bylo definováno výše, pro in vitro sledování HCV onemocnění nebo prognózu reakce na léčbu (například Interferonem) pacientů trpících HCV infekcí zahrnující:

inkubaci biologického vzorku od hepatitidou C s El proteinem nebo pacienta s infekcí jeho vhodnou částí v podmínkách umožňujících vytvoření imunologického komplexu, odstranění nenavázaných složek,

- výpočet anti-El titrů přítomných ve vzorku (například na začátku a/nebo v průběhu kúry (interferonové) terapie, sledování neléčeného průběhu HCV onemocnění nebo prognózu reakce na léčbu pacienta založené na množství anti-El titrů zjištěných ve vzorku na začátku léčby a/nebo během léčení.

Může být uzavřeno, že pacienti, kteří projevují 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 nebo výhodně více než 20-násobný pokles výchozích anti-El titrů, jsou osoby, které dlouhodobě setrvale reagují na HCV terapii, konkrétně na terapii interferonem. V příkladech je znázorněno, že anti-El test může být velmi užitečný pro prognózu dlouhodobé reakce na léčbu IFN nebo obecně na léčbu onemocnění virem hepatitidy C.

Bylo zjištěno, že konkrétně následující El peptidy, jak jsou uvedeny v tabulce 3, jsou užitečné pro in vitro sledování HCV onemocnění nebo prognózy reakce na léčbu interferonem pacientů trpících HCV infekcí:

El-31 (sekv. id. č. 56) zahrnující aminokyseliny 181 až 200 úseku jádro/El VI,

El-33 (sekv. z El úseku, id. č. 57) zahrnující aminokyseliny 193 až 212 • · · · ·· · · ·· • · · · · · · · φ φ φ • · · · · · · · · · φ • φφ φφφ φφ φφφ φ φ

	46	• φ Φ ·	φ · φ Φ	Φ Φ
El-35 (sekv. z El V2 úseku	id. č. 58) zahrnující (epitop B),	aminokyseliny	205 až	224
E1-35A (sekv. z El V2 úseku	id. č. 59) zahrnující (epitop B),	aminokyseliny	208 až	227
lbEl (sekv. id. č. 53) zahrnující aminokyseliny z El úseků (VI, Cl a V2 úseky (obsahující epitop B))	192 až r	228
El-51 (sekv. z El úseku,	id. č. 66) zahrnující	aminokyseliny	301 až	320
El-53 (sekv. z El C4 úseku	id. č. 67) zahrnující (epitop A) ,	aminokyseliny	313 až	332
El-55 (sekv.	id. č. 68) zahrnující	aminokyseliny	325 až	344

z El úseku.

Je nutné rozumět, že menší fragmenty výše uvedených peptidů také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Menší fragmenty mohou být snadno připraveny chemickou syntézou a mohou být testovány na jejich schopnost být použity v testu, jak uvedeno detailně výše a v příkladech.

Předkládaný vynález se také týká soupravy pro sledování HCV onemocnění nebo prognózy reakce na léčbu (například interferonem) pacientů trpících HCV infekcí obsahující:

alespoň jeden El protein nebo El peptid, konkrétně El protein nebo El peptid, jak bylo definováno výše,

- pufr nebo složky nutné pro přípravu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito proteiny nebo peptidy a anti-El protilátkami přítomnými v biologickém vzorku, prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci, eventuálně také automatizovaná zařízení pro skenování a interpretaci pro posouzení poklesu anti-El titrů v průběhu léčby.

• · · · • ♦ · · · · · · · · • · ·· ···· 9 « • · · · · · · · ·«· · • 9 · · ··«· · * ·· ·· ·· ·· ··

Je nutné rozumět, že také E2 proteiny a peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být použity do určité míry ke sledování/prognóze HCV léčby, jak ukázáno výše pro El proteiny nebo peptidy, protože také anti-E2 hladiny se snižují ve srovnání s protilátkami k dalším HCV antigenům. Nicméně je nutné rozumět, že by mohlo být možné určovat určité epitopy v E2 úseku, které by také byly vhodné pro použití v testu pro sledování/prognózu HCV onemocnění.

Předkládaný vynález se také týká testu sérotypizace pro detekci jednoho nebo více sérologických typů HCV přítomných v biologickém vzorku, konkrétně pro detekci protilátek různých typů detekovaného HCV spojených v jednom formátu testu, zahrnujícího alespoň následující kroky:

(i) kontakt biologického vzorku analyzovaného na přítomnost HCV protilátek jednoho nebo více sérologických typů s alespoň jedním z El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinových přípravků nebo alespoň jedním z El nebo E2 peptidových přípravků, jak bylo definováno výše, výhodně v imobilizované formě ve vhodných podmínkách, které umožní vytvoření imunitního komplexu, (ii) odstranění nenavázaných složek, (iii) inkubaci vytvořených imunitních komplexů s heterologními protilátkami, přičemž heterologní protilátky jsou konjugované k detekovatelné značce ve vhodných podmínkách, (iv) detekci přítomnosti imunitních komplexů vizuálně nebo mechanicky (např. pomocí denzitometrie, fluorimetrie, kolorimetrie) a posouzení přítomnosti jednoho nebo více přítomných HCV sérologických typů z pozorovaného typu vazby.

Je nutné rozumět, že přípravky proteinů nebo peptidů použité v tomto způsobu jsou rekombinantně exprimované typově ·

• ·· specifické obalové proteiny nebo typově specifické peptidy.

Předkládaný vynález se dále týká soupravy pro sérotypizaci jednoho nebo více sérologických typů HCV přítomných v biologickém vzorku, konkrétně pro detekci protilátek k těmto sérologickým typům HCV obsahující:

alespoň jeden El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 protein nebo El nebo E2 peptid, jak bylo definováno výše,

- pufr nebo složky nutné pro přípravu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito proteiny nebo peptidy a anti-El protilátkami přítomnými v biologickém vzorku, prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci, eventuálně také automatizovaná zařízení pro skenování a interpretaci detekce přítomnosti jednoho nebo více přítomných sérologických typů z pozorovaného typu vazby.

Předkládaný vynález se také týká použití peptidového nebo proteinového přípravku, jak definováno výše, pro imobilizaci na pevném substrátu a inkorporaci do hybridizačního testu s převráceným poměrem fází, výhodně pro imobilizaci jako paralelní linie na pevné fázi, jako například membránovém pásu, pro určování přítomnosti nebo genotypu HCV podle způsobu, jak bylo definováno výše. Kombinace s dalšími typově specifickými antigeny z jiných úseků HCV polyproteinu také je v rozsahu předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález poskytuje způsob purifikace rekombinantních HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů vybraných z El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů, které byly vytvořeny rekombinantním postupem zahrnujícím kontakt proteinů s činidlem štěpícím disulfidovou vazbu nebo redukčním činidlem. Kontakt způsobem podle vynálezu může být prováděn v podmínkách parciálního ♦ * ·♦ ♦ « 1 « · · · ♦ · · « · • · * · * ♦ · · * ♦ ·· * · · ♦ • · · * ♦ » · ♦ štěpení nebo v redukčních podmínkách. Výhodně je činidlo štěpící disulfidovou vazbu dithiotreitol (DTT), výhodně v rozsahu koncentrace 0,1 až 50 mM, výhodně 0,1 až 20 mM, výhodněji 0,5 až 10 mM. Alternativně činidlo štěpící disulfidovou vazbu může být detergent, jako je například Empigen-BB (což je směs obsahující N-docecyl-N,Ndimethylglycin jako hlavní složku), výhodně v koncentraci 1 až 10%, výhodněji v koncentraci 3,5%. Mohou také být použity směsi detergentů, činidel štěpících disulfidovou vazbu a/nebo redukčních činidel. V jednom provedení je opětnému vytvoření disulfidové vazby zabráněno činidlem blokujícím SH skupiny, jako je například N-ethylmaleimid (NEM) nebo jeho derivát. Ve výhodném provedení je opětné vytvoření disulfidové vazby blokováno použitím podmínek nízkého pH.

jako například chromatografií lektinovou s lektinem

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob, jak bylo popsáno v tomto textu, dále zahrnující následující kroky: lýza hostitelských buněk exprimujících rekombinantní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2, volitelně v přítomnosti činidla blokujícího SH, jako je například N-ethylmaleimid (NEM), získání HCV obalových proteinů afinitní purifikaci, chromatografií, jako například z čočky, nebo pomocí imunoafinitní chromatografie s použitím anti-El a/nebo anti-E2 specifických monoklonálních protilátek, redukce nebo štěpení disulfidových vazeb činidlem štěpícím disulfidovou vazbu, jako je například DTT, výhodně také v přítomnosti činidla blokujícího SH, jako je například NEM nebo biotin-NEM, a získání redukovaných El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 obalových proteinů gelovou filtrací a volitelné dodatečně následnou Ni-IMAC chromatografií a odsolováním.

Předkládaný vynález poskytuje přípravek obsahující v podstatě izolované a/nebo purifikované, a/nebo izolované a/nebo purifikované rekombinantní HCV jednotlivé nebo specifické oligomerní rekombinantní obalové proteiny vybrané • · AAAA

AA ·· • · A A • · AA • · · * • A A «

A · A A

AA AA • A A A

A A AA • A A A AA A· z El a/nebo E2 a/nebo E1/E2, který byly výhodně izolovány způsoby popsanými v tomto textu. Ve výhodném provedení byly rekombinantní HCV obalové proteiny podle vynálezu exprimovány v rekombinantních savčích buňkách, jako jsou například vakcínie, rekombinantní kvasinky.

Předkládaný vynález poskytuje rekombinantní vektor obsahující vektorovou sekvenci, sekvenci prokaryotického, eukaryotického nebo virového promotoru a nukleotidovou sekvenci umožňující expresi jednotlivého nebo specifického oligomerního El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinu v operativní kombinaci. V jednom provedení nukleotidová sekvence vektoru kóduje jednotlivý HCV El protein počínající v úseku mezi aminokyselinovými polohami 1 a 192 a končící v úseku mezi aminokyselinovými polohami 250 a 400, konkrétně končící v úseku mezi polohami 250 a 341, dokonce výhodněji končící v úseku mezi polohami 290 a 341. V dalším provedení nukleotidová sekvence vektoru kóduje jednotlivý HCV El protein počínající v úseku mezi aminokyselinovými polohami 117 a 192 a končící v úseku mezi aminokyselinovými polohami 263 a 400, konkrétně končící v úseku mezi polohami 250 a 326. V ještě dalším provedení nukleotidová sekvence vektoru kóduje jednotlivý HCV El protein nesoucí deleci první hydrofobní domény mezi polohami 264 až 293, plus nebo bez 8 aminokyselin. V dalším provedení nukleotidová sekvence vektoru kóduje jednotlivý HCV E2 protein počínající v úseku mezi aminokyselinovými polohami 290 a 406 a končící v úseku mezi aminokyselinovými polohami 600 a 820, konkrétně počínající v úseku mezi polohami 322 a 406, dokonce výhodněji počínající v úseku mezi polohami 347 a 406 a nej výhodněji počínající v úseku mezi polohami 364 a 406 a výhodně končící v kterékoliv aminokyselinové poloze 623, 650, 661, 673, 710, 715, 720, 746 nebo 809. Vektor podle předkládaného vynálezu v jednom provedení obsahuje 5'-koncový ATG kodon a 3'-koncový stop * φ φ φφ φφ ΦΦΦ·

I Φ Φ 1 Φ· ΦΦ kodon operativně spojený k nukleotidové sekvenci. Vektor dále obsahuje v jednom provedení nukleotidovou sekvenci dále obsahující štěpné místo faktoru Xa a/nebo 3 až 10, výhodně 6, histidinových kodonů přidaných na 3'-konci ke kódujícímu úseku. Vektor podle předkládaného vynálezu volitelně obsahuje nukleotidovou sekvenci, kde alespoň jedno glykosylační místo přítomné v El nebo E2 proteinech bylo odstraněno na úrovni nukleové kyseliny.

Předkládaný vynález poskytuje nukleovou kyselinu obsahující kteroukoliv ze sekv. id. č. : 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 a 49 nebo její část. Vektor podle vynálezu může výhodně obsahovat nukleotidovou sekvenci obsahující nukleovou kyselinu obsahující kteroukoliv ze sekv. id. č. : 3, 5, 7, 9, 11, 13, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 a 49 nebo její část.

Přípravek podle předkládaného vynálezu dále obsahuje rekombinantní HCV obalové proteiny, které byly exprimovány vektorem nebo jsou expresní produkt vektoru popsaného v tomto textu.

Předkládaný vynález poskytuje hostitelskou buňku transformovanou alespoň jedním rekombinantním vektorem, jak popsáno v tomto textu, kde vektor obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 protein, jak bylo popsáno v tomto textu, kromě regulační sekvence operativní v hostitelské buňce a schopné regulace exprese HCV El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinu. Navíc předkládaný vynález poskytuje rekombinantní El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 protein exprimovaný hostitelskou buňkou podle vynálezu.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob, popsáno v tomto textu, obsahující následující kroky hostitelské buňky, jak bylo popsáno v tomto textu, jak bylo pěstování která byla ·· ···«

	52	• fc • fcfc fc · « fcfc • fcfc • ·	• fc fcfc • · · • fc · · • fcfc · • fcfc • fc fcfc	• fc fcfc • · fcfc fcfc fcfc fc fcfcfc · fcfc fcfc • fc fcfc
transformována rekombinantním vektorem,	jak	bylo	popsáno
v tomto	textu, ve vhodném kultivačním	médiu,	což	způsobí
expresi	nukleotidové sekvence vektoru,	jak	bylo	popsáno

v tomto textu, ve. vhodných podmínkách, lýzu transformovaných hostitelských buněk, výhodně v přítomnosti činidla blokujícího SH skupiny, jako je například N-ethylmaleimid (NEM), získání HCV obalového proteinu afinitní purifikaci například lektinovou chromatografií nebo imunoafinitní chromatografií s použitím anti-El a/nebo anti-E2 specifických monoklonálních protilátek, přičemž lektin je výhodně lektin čočky, následovanou inkubací eluátu z předchozího kroku s činidlem štěpícím disulfidovou vazbu, jako je například DTT, výhodně také v přítomnosti činidla blokujícího SH skupiny, jako je například NEM nebo biotin-NEM, a izolaci HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinů gelovou filtrací a eventuálně také další Ni²⁺-IMAC chromatografií a odsolováním.

Předkládaný vynález poskytuje přípravek obsahující alespoň

jeden	z následujících	El	a/nebo E2 peptidů:
El-31	(sekv. id. č.	56)	zahrnující aminokyseliny 181 až 200
úseku	jádro/El VI,
El-33	(sekv. id. č.	57)	zahrnující aminokyseliny 193 až 212
z El	úseku,
El-35	(sekv. id. č.	58)	zahrnující aminokyseliny 205 až 224
z El '	V2 úseku (epitop	Β) ,
E1-35A (sekv. id. č.	59)	zahrnující aminokyseliny 208 až 227
z El '	V2 úseku (epitop	Β) ,
lbEl	(sekv. id. č.	53)	zahrnující aminokyseliny 192 až 228
z El i	úseků (VI, Cl a V2 úseky (obsahující epitop B)),
El-51	(sekv. id. č.	66)	zahrnující aminokyseliny 301 až 320

z El úseku, • 9 9 · • · · • 99

9 9

99

9999

9 ·« * · · · • · ·· • · · 9 ♦ · 9 9

El-53	(sekv.	id.	č.	67)	zahrnuj ící	aminokyseliny	313	až	332
z El	C4 úseku	(epitop	A) ,
El-55	(sekv.	id.	č.	68)	zahrnuj ící	aminokyseliny	325	až	344

z El úseku,

Env 67 nebo E2-67 (sekv. id. č. 72) zahrnující aminokyselinové polohy 397 až 416 z E2 úseku (epitop A),

Env	23 nebo E2-23 (sekv. id.	č.	86)	zahrnuj ící	polohy	583	až
602	z E2 úseku (epitop Ε),
Env	25 nebo E2-25 (sekv. id.	č.	87)	zahrnující	polohy	595	až
614	z E2 úseku (epitop Ε),
Env	27 nebo E2-27 (sekv. id.	č.	88)	zahrnující	polohy	607	až
626	z E2 úseku (epitop Ε),
Env	17Β nebo E2-17B (sekv. id.	č.	83)	zahrnuj ící	polohy	547	až
566	z E2 úseku (epitop D) ,
Env	13B nebo E2-13B (sekv. id.	č.	82)	zahrnuj ící	polohy	523	až
542	z E2 úseku (epitop C).

Předkládaný vynález poskytuje přípravek obsahující alespoň jeden z následujících E2 konformačních epitopů:

Epitop F rozpoznávaný monoklonálními protilátkami 15C8C1, 12D11F1 a 8 G10D1H9,

Epitop G rozpoznávaný monoklonální protilátkou 9G3E6,

Epitop H (nebo C) rozpoznávaný monoklonálními protilátkami 10D3C4 a 4H6B2,

Epitop I rozpoznávaný monoklonální protilátkou 17F2C2.

Předkládaný vynález poskytuje El a/nebo E2 specifickou monoklonální protilátku vypěstovanou po imunizaci přípravkem, jak bylo popsáno v tomto textu. Protilátky podle předkládaného * » · · · ·

·« · · • · 9 · • Φ · φ	*» ttt · • · ·
• · · · · • · · 4	• · · • · · ·
·· tt	• · · · ·· ··
lék,	pro
přítomnosti
nemoci	nebo

• · »· • · · · • · · · ·· ·· vynálezu mohou být použity, například jako inkorporaci do soupravy pro imunotest pro detekci

HCV El nebo E2 antigenu, pro prognózu/sledování pro sledování terapie HCV. Předkládaný vynález poskytuje použití z El a/nebo E2 specifické monoklonální protilátky, jak bylo popsáno v tomto textu, pro přípravu soupravy pro imunotest pro detekci HCV El nebo E2 antigenu, pro přípravu soupravy pro prognózu/sledování HCV onemocnění nebo pro přípravu HCV léku.

Předkládaný vynález poskytuje způsob in vitro diagnózy HCV antigenu přítomného v biologickém vzorku, obsahující alespoň následující kroky:

(i) kontakt biologického vzorku s El a/nebo E2 specifickou monoklonální protilátkou, jak bylo popsáno v tomto textu, výhodně v imobilizované formě ve vhodných podmínkách, které umožní vytvoření imunitního komplexu, (ii) odstranění nenavázaných složek, (iii) inkubaci vytvořených imunitních komplexů s heterologními protilátkami, přičemž heterologní protilátky jsou konjugované k detekovatelné značce ve vhodných podmínkách, (iv) detekci přítomnosti imunitních komplexů vizuálně nebo mechanicky.

Předkládaný vynález poskytuje soupravu pro určování přítomnosti HCV antigenu přítomných v biologickém vzorku, která zahrnuje alespoň následující: alespoň jednu El a/nebo E2 specifickou monoklonální protilátku, jak bylo popsáno v tomto textu, výhodně v imobilizované formě na pevném substrátu, pufr nebo složky nutné pro výrobu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito protilátkami a HCV antigeny přítomnými v biologickém vzorku a volitelně prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci.

•4 4444

4 4 4

4 44

9 4 4

9 9 ·

44

4 «4 4» • ·· « 4 49

4 4

4

9

Přípravek podle předkládaného vynálezu může být poskytován ve formě léku.

Předkládaný vynález poskytuje přípravek, jak bylo popsáno v tomto textu, pro použiti jako vakcíny pro imunizaci savce, výhodně lidí, proti HCV, obsahující podávání účinného množství přípravku volitelně doprovázeného farmaceuticky přijatelnými adjuvancii pro vyvolání imunitní reakce.

Předkládaný vynález poskytuje způsob použití přípravku, jak bylo popsáno v tomto textu, pro přípravu vakcíny pro imunizaci savce, výhodně lidí, proti HCV, obsahující podávání účinného množství přípravku volitelně doprovázeného farmaceuticky přijatelnými adjuvancii pro vyvolání imunitní reakce.

Předkládaný vynález poskytuje vakcinační přípravek pro imunizaci savce, výhodně lidí, proti HCV, který obsahuje účinné množství přípravku obsahujícího El a/nebo E2 obsahujícího přípravku, jak bylo popsáno v tomto textu, volitelně také doprovázeného farmaceuticky přijatelnými adjuvancii.

Přípravek podle předkládaného vynálezu může být poskytován ve formě pro in vitro detekci HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku. Předkládaný vynález také poskytuje způsob přípravy soupravy pro imunotest pro detekci HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku a způsob detekce HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku s použitím soupravy podle vynálezu pro diagnózu HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku. Takový způsob podle předkládaného vynálezu zahrnuje alespoň následující kroky:

kontakt biologického vzorku s přípravkem, jak bylo popsáno v tomto textu, výhodně v imobilizované formě ve vhodných podmínkách, které umožní vytvoření imunitního komplexu s HCV protilátkami přítomnými v biologickém (i) • · φφ φφ • » · φ • · · φ • φ t φ • 9 · ·

ΦΦ »· φφ Β«φφ • · ♦ · Φ φ • ·Φ ΦΦΦ

Φ Φ ΦΦΦ Φ Φ

Φ ·Φ Φ Φ ΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ

	vzorku,
(ii)	odstranění nenavázaných složek,
(iii)	inkubaci vytvořených	imunitních	komplexů
	s heterologními protilátkami,	přičemž	heterologní
	protilátky jsou konjugované k vhodných podmínkách,	detekovatelné značce ve
(iv)	detekci přítomnosti imunitních mechanicky.	komplexů	vizuálně nebo

Předkládaný vynález poskytuje soupravu pro určování přítomnosti HCV protilátek přítomných v biologickém vzorku, obsahující: alespoň jeden peptidový nebo proteinový přípravek, jak bylo popsáno v tomto textu, výhodně v imobilizované formě na pevném substrátu, pufr nebo složky nutné pro přípravu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito proteiny nebo peptidy a protilátkami proti HCV přítomnými v biologickém vzorku, a volitelně prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci.

Předkládaný vynález poskytuje způsob in vitro sledování HCV onemocnění nebo určení reakce pacienta trpícího HCV infekcí na léčbu, výhodně interferonem, způsob zahrnuje: inkubaci biologického vzorku od pacienta s HCV infekcí s El proteinem nebo jeho vhodnou částí v podmínkách umožňujících vytvoření imunologického komplexu, odstranění nenavázaných složek, výpočet anti-El titrů přítomných ve vzorku na začátku léčení a během léčení, sledování neléčeného průběhu HCV onemocnění nebo určení reakce na léčbu pacienta založené na množství anti-El titrů zjištěných ve vzorku na začátku léčby a/nebo během léčby.

Předkládaný vynález poskytuje soupravu pro sledování HCV onemocnění nebo prognózy reakce na léčbu, konkrétně interferonem, pacientů trpících HCV infekcí, kde souprava obsahuje: alespoň jeden El protein nebo El peptid, konkrétně ·* ·· »«·· ·· ·* ··

9 4 9 4 9 9 4

9 49 9 9 44 • · · 9 4 4 4 4 4

9 4 9 4 9 4 9

94 44 44

4 9 9

94

El protein nebo El peptid, jak bylo popsáno v tomto textu, pufr nebo složky nutné pro přípravu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito proteiny nebo peptidy a anti-El protilátkami přítomnými v biologickém vzorku a volitelně, prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci, volitelně také automatizovaná zařízení pro skenování a interpretaci pro posouzení poklesu anti-El titrů v průběhu léčby.

Předkládaný vynález poskytuje test sérotypizace pro detekci jednoho nebo více sérologických typů HCV přítomných v biologickém vzorku, konkrétně pro detekci protilátek různých typů detekovaného HCV spojených v jednom formátu testu, zahrnujícího alespoň následující kroky: (i) kontakt biologického vzorku analyzovaného na přítomnost HCV protilátek jednoho nebo více sérologických typů s alespoň jedním z El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 proteinových přípravků, jak bylo popsáno v tomto textu, nebo alespoň jeden z El nebo E2 peptidových přípravků popsaných v tomto textu, výhodně v imobilizované formě ve vhodných podmínkách, které umožní vytvoření imunitního komplexu, (ii) odstranění nenavázaných složek, (iii) inkubaci vytvořených imunitních komplexů s heterologními protilátkami, přičemž heterologní protilátky jsou konjugované k detekovatelně značce ve vhodných podmínkách přítomnosti imunitních komplexů (např. pomocí denzitometrie, a posouzení přítomnosti jednoho nebo více přítomných HCV sérologických typů z pozorovaného typu vazby.

Předkládaný vynález poskytuje soupravu pro sérotypizaci jednoho nebo více sérologických typů HCV přítomných v biologickém vzorku, konkrétně pro detekci protilátek k těmto sérologickým typům HCV obsahující: alespoň jeden El a/nebo E2 a/nebo E1/E2 protein, jak bylo popsáno v tomto textu, nebo El a volitelné (iv) detekci vizuálně nebo mechanicky fluorimetrie, kolorimetrie)

Ή *4

9 9 9

9 99 • · · · • 9 9 9

9 »» ·* «·

9 9 9

9 99 ·* ····

9 9 ·

99

9 9

9 9 9

99 nebo Ε2 peptid, jak bylo popsáno v tomto textu, pufr nebo složky nutné pro přípravu pufru umožňujícího vazebnou reakci mezi těmito proteiny nebo peptidy a anti-El protilátkami přítomnými v biologickém vzorku, volitelně prostředky pro detekci imunitních komplexů vytvořených v předchozí vazebné reakci, volitelně také automatizovaná zařízení pro skenování a interpretaci detekce přítomnosti jednoho nebo více přítomných sérologických typů z pozorovaného typu vazby.

Předkládaný vynález poskytuje peptidový nebo proteinový přípravek, jak bylo popsáno v tomto textu, pro imobilizaci na hybridizačního testu pro imobilizaci jako adjuvans, vynálezu pevném substrátu a inkorporaci do s převráceným poměrem fází, výhodně paralelní linie na pevné fázi, jako například membránovém pásu, pro určování přítomnosti nebo genotypu HCV podle způsobu, jak bylo popsáno v tomto textu.

Předkládaný vynález poskytuje terapeutický vakcinační přípravek obsahující terapeuticky účinné množství: přípravku obsahujícího alespoň jeden z purifikovaných rekombinantních HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních rekombinantních obalových proteinů vybraných ze skupiny El proteinu a E2 proteinu a volitelně farmaceuticky přijatelné HCV obalové proteiny vakcíny podle předkládaného jsou volitelně tvořené rekombinantními savčími buňkami nebo rekombinantními kvasinkami. Vynález poskytuje terapeutický vakcinační přípravek obsahující terapeuticky účinné množství přípravku obsahujícího alespoň jeden z následujících El a E2 peptidů:

El-31 (sekv. id. č. úseku jádro/El VI,

El-33 (sekv. id. č, z El úseku,

56) zahrnující aminokyseliny 181 až 200

57) zahrnující aminokyseliny 193 až 212

El-35 (sekv. id. č. 58) zahrnující aminokyseliny 205 až 224 ·· ··?· * · · • · · • · ♦ · • · · · ·· ·· ·« ·· ·· ·« • · · · · * ft · • · ·· · · ·· • · · · o · · « · ···· ···· ·· í« ·· ··

z El	V2 úseku (epitop	B) ,
E1-35A (sekv. id. č.	59)	zahrnuj ící	aminokyseliny	208	až	227
z El	V2 úseku (epitop	B) ,
lbEl	(sekv. id. č.	53)	zahrnuj ící	aminokyseliny	192	až	228

z El úseků (VI, Cl a V2 úseky (obsahující epitop B)),

El-51	(sekv.	id.	č.	66)	zahrnuj ící	aminokyseliny	301	až	320
z El úseku,
El-53 (sekv.	id.	č.	67)	zahrnuj ící	aminokyseliny	313	až	332
z El C4 úseku	(epitop	A),
El-55	(sekv.	id.	č.	68)	zahrnuj ící	aminokyseliny	325	až	344

z El úseku,

Env 67 nebo E2-67 (sekv. id. č. 72) zahrnující aminokyselinové polohy 397 až 418 z E2 úseku (epitop A),

Env	23 nebo E2-23 (sekv. id. č.	86)	zahrnuj ící	polohy	583	až
602	z E2 úseku (epitop E) ,
Env	25 nebo E2-25 (sekv. id. č.	87)	zahrnuj ící	polohy	595	až
614	z E2 úseku (epitop E),
Env	27 nebo E2-27 (sekv. id. č.	88)	zahrnuj ící	polohy	607	až
626	z E2 úseku (epitop E),
Env	17B nebo E2-17B (sekv. id. č.	83)	zahrnuj ící	polohy	547	až
586	z E2 úseku (epitop D) a
Env	13B nebo E2-13B (sekv. id. č.	82)	zahrnuj ící	polohy	523	až
542	z E2 úseku (epitop C).

Předkládaný vynález poskytuje způsob léčení savce, jako například člověka, infikovaného HCV, obsahující podávání účinného množství přípravku, jak bylo popsáno v tomto textu, jako například výše popsaných vakcín a volitelně, farmaceuticky přijatelného adjuvans. V jednom provedení • ·· · • · · · · • · přípravek podle vynálezu je podáván v kombinaci s antivirovou terapií nebo v průběhu antivirové terapie, buď brzy před nebo po nebo současně.

Předkládaný vynález poskytuje přípravek obsahující alespoň jeden purifikovaný rekombinantní HCV rekombinantní obalový protein vybraný ze skupiny El proteinu a E2 proteinu a volitelně adjuvans. Ve výhodném provedení přípravek obsahuje alespoň jeden z následujících El a E2 peptidů:

El-31 (sekv. id. č. úseku jádro/El VI,	56)	zahrnuj ící	aminokyseliny	181	až	200
El-33 (sekv. z El úseku,	id. č.	57)	zahrnuj ící	aminokyseliny	193	až	212
El-35 (sekv. z El V2 úseku	id. č. (epitop	58) Β) ,	zahrnující	aminokyseliny	205	až	224
E1-35A (sekv. z El V2 úseku	id. č. (epitop	59) Β) ,	zahrnuj ící	aminokyseliny	208	až	227
lbEl (sekv. id. č. . z El úseků (VI, Cl a '	53) zahrnující aminokyseliny V2 úseky (obsahující epitop B))	192 /	až	228
El-51 (sekv. z El úseku,	id. č.	66)	zahrnuj ící	aminokyseliny	301	až	320
El-53 (sekv. z El C4 úseku	id. č. (epitop	67) A),	zahrnuj ící	aminokyseliny	313	až	332
El-55 (sekv. z El úseku,	id. č.	68)	zahrnuj ící	aminokyseliny	325	až	344
Env 67 nebo E2-67 (sekv.	id. č. 72)	zahrnující aminokyselinové

polohy 397 až 418 z E2 úseku (epitop A),

Env 23 nebo E2-23 (sekv. id. č. 86) zahrnující polohy 583 až 602 z E2 úseku (epitop E), * · · · · · • · • · • · ·· ·· ί · · · · ’ · · · · ; · · · · · • · · · ·· ··

Env 25 nebo E2-25 (sekv. id. č. 87) zahrnující polohy 595 až 614 z E2 úseku (epitop Ε),

Env 27 nebo E2-27 (sekv. id. č. 88) zahrnující polohy 607 až 626 z E2 úseku (epitop Ε),

Env 17B nebo E2-17B (sekv. id. č. 83) zahrnující polohy 547 až 586 z E2 úseku (epitop D) a

Env 13B nebo E2-13B (sekv. id. č. 82) zahrnující polohy 523 až 542 z E2 úseku (epitop C).

Předkládaný vynález poskytuje terapeutický přípravek pro indukci HCV-specifických protilátek obsahující terapeuticky účinné množství přípravku obsahujícího E1/E2 komplex vytvořený z purifikovaných rekombinantních HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních rekombinantních El nebo E2 proteinů a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans. Rekombinantní HCV obalové proteiny podle vynálezu mohou být tvořeny rekombinantními savčími buňkami nebo jsou rekombinantní HCV obalové proteiny tvořeny rekombinantními kvasinkami. Předkládaný vynález poskytuje způsob léčení savce, jako je například člověk, infikovaného HCV zahrnující podávání účinného množství přípravku, jak bylo popsáno v tomto textu a, volitelně farmaceuticky přijatelného adjuvans. Předkládaný vynález poskytuje terapeutický přípravek pro indukci HCVspecif ických protilátek obsahující terapeuticky účinné množství přípravku obsahujícího alespoň jeden purifikovaný rekombinantní HCV jednotlivý nebo specifický oligomerní rekombinantní obalový protein vybraný ze skupiny El proteinu a E2 proteinu a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans.

····

Popis obrázků

Obrázek 1: Restrikční mapa plazmidu pgpt ATA 18

Obrázek 2: Restrikční mapa plazmidu pgs ATA 18

Obrázek 3: Restrikční mapa plazmidu pMS 66

Obrázek 4: Restrikční mapa plazmidu pv HCV-11A

Obrázek 5: hladiny anti-El u osob nereagujících na léčbu IFN

Obrázek 6: hladiny anti-El u osob reagujících na léčbu IFN

Obrázek 7: hladiny anti-El u pacientů s kompletní reakcí na léčbu IFN

Obrázek 8: hladiny anti-El u osob reagujících neúplně na léčbu IFN

Obrázek 9: hladiny anti-E2 u osob nereagujících na léčbu IFN

Obrázek 10: hladiny anti-E2 u osob reagujících na léčbu IFN

Obrázek 11: hladiny anti-E2 u osob reagujících neúplně na léčbu IFN

Obrázek 12: hladiny anti-E2 u osob reagujících úplně na léčbu IFN

Obrázek 13: Humánní anti-El reaktivita kompetující s peptidy

Obrázek 14: Kompetice reaktivity anti-El monoklonální protilátek s peptidy

Obrázek 15: hladiny anti-El (epitop 1) u osob nereagujících na léčbu IFN

Obrázek 16: hladiny anti-El (epitop 1) u osob reagujících na léčbu IFN

Obrázek 17: hladiny anti-El (epitop 2) u osob nereagujících na léčbu IFN

Obrázek 18: hladiny anti-El (epitop 2) u osob reagujících na

léčbu IFN

Obrázek 19: Kompetice reaktivity anti-E2 monoklonální protilátek s peptidy

Obrázek 20: Humánní anti-E2 reaktivita kompetující s peptidy

Obrázek 21: Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. Sekvence nukleové kyseliny kódující El nebo E2 protein podle předkládaného vynálezu mohou být translatovány (sekv. id. č. 3 až 13, 21 až 31, 35 a 41 až 49 jsou translatovány ve čtecím rámci počínaje od zbytku čísla 1, sekv. id. č. 37 až 39 jsou translatovány ve čtecím rámci počínaje od zbytku čísla 2) na aminokyselinové sekvence příslušných El nebo E2 proteinů, jak ukázáno v seznamu sekvencí.

Obrázek 22: výsledky ELISA získané z frakcí eluátu z chromatografie s lektinem čočky ze 4 různých El purifikaci buněčných lyzátů infikovaných vvHCV39 (typ lb) , vvHCV40 (typ lb), vvHCV62 (typ 3a) a vvHCV63 (typ 5a).

Obrázek 23: Eluční profily získané z chromatografie s lektinem čočky ze 4 různých El konstruktů založené na hodnotách, jak ukázány na obrázku 22.

Obrázek 24: ELISA výsledky získané z frakcí získaných po gelové filtrační chromatografií ze 4 různých El purifikaci buněčných lyzátů infikovaných vvHCV39 (typ lb) , vvHCV40 (typ lb), vvHCV62 (typ 3a) a vvHCV63 (typ 5a).

Obrázek 25: Profily získané z purifikaci El proteinů typu lb (1) , typu 3a (2) a typu 5a (3) (z RK13 buňky infikovaných vvHCV39, vvHCV62 a vvHCV63, v daném pořadí, purifikované na lektinu z čočky a redukované jako v příkladu 5,2 - 5,3) a standard (4) . Vrcholy označené „1, „2 a „3, představují vrcholy čistého El proteinu (viz obrázek 24, El reaktivita hlavně ve frakcích 26 až 30).

	64	·· ·· * · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ··	• « • · • · • ♦ · • · • ·	.··. .··.···; . . · · · ; · · · · * .. · · · · ·· ·· ··
Obrázek 26: Barvení	stříbrem	SDS-PAGE,	jak	bylo popsáno
v příkladu 4, surového	lyzátu El	WHCV4 0	(typ	lb) (dráha 1) ,

pool 1 z gelové filtrace z vvHCV40 představující frakce 10 až 17, jak ukázáno na obrázku 25 (dráha 2), pool 2 z gelové filtrace z vvHCV40 představující frakce 18 až 25, jak ukázáno na obrázku 25 (dráha 3) a El pool (frakce 26 až 30) (dráha 4).

Obrázek 27: blot se streptavidinem a alkalickou fosfatázou frakcí z gelové filtrace El konstruktů 39 (typ lb) a 62 (typ 3a). Proteiny byly značeny NEM-biotinem. Dráha 1: výchozí konstrukt 39 po gelové filtraci, dráha 2: frakce 26 konstruktu

39, dráha	3: frakce	27	konstruktu	39, dráha	4: frakce	28
konstruktu	39, dráha	5:	frakce 29	konstruktu	39, dráha	6:
frakce 30	konstruktu	39,	dráha 7 frakce 31	konstruktu	39,
dráha 8:	ukazatel molekulové hmotnosti, dráha 9: výchozí
konstrukt	62 po gelové	filtraci,	dráha 10: frakce	26
konstruktu	62, dráha	11:	frakce 27	konstruktu	62, dráha	12:
frakce 28	konstruktu	62,	dráha 3: frakce 2 9	konstruktu	62,
dráha 14:	frakce 30	konstruktu 62	, dráha	15: frakce	31
konstruktu	62.
Obrázek 28:	Barvení stříbrem gelu po	SDS-PAGE frakcí z gelové
filtrace z	WHCV39 (Els,	typ lb) a	WHCV62	(Els, typ	3a)
prováděné v totožných	podmínkách jako	na obrázku 26. Dráha	1:

výchozí konstrukt 39 po gelové filtraci, dráha 2: frakce 26 konstruktu 39, dráha 3: frakce 27 konstruktu 39, dráha 4: frakce 28 konstruktu 39, dráha 5: frakce 29 konstruktu 39, dráha 6: frakce 30 konstruktu 39, dráha 7 frakce 31 konstruktu 39, dráha 8: ukazatel molekulové hmotnosti, dráha 9: výchozí konstrukt 62 po gelové filtraci, dráha 10: frakce 26 konstruktu 62, dráha 11: frakce 27 konstruktu 62, dráha 12:

frakce 28 konstruktu 62, dráha 13: frakce 29 konstruktu 62, dráha 14: frakce 30 konstruktu 62, dráha 15: frakce 31 konstruktu 62.

Obrázek 29: analýza Western blot s anti-El myší monoklonální • · protilátkou 5E1A10 podávající kompletní přehled purifikačního postupu. Dráha 1: surový lyzát, dráha 2: po průtoku z chromatografie s lektinem z čočky, dráha 3: promytí Empigenem BB po chromatografií s lektinem z čočky, dráha 4: eluát z chromatografie s lektinem z čočky, dráha 5: po průtoku při koncentrování eluátu z chromatografie s lektinem z čočky, dráha 6: pool El po vylučovací chromatografií (gelové filtraci).

Obrázek 30: OD280 profil (souvislá čára) z chromatografie s lektinem z čočky E2 proteinu z RK13 buněk infikovaných vvHCV44. Tečkovaná čára představuje E2 reaktivitu, jak byla detekována testem ELISA (jak uvedeno v příkladu 6).

Obrázek 31A: OD280 profil (souvislá čára) z gelové filtrační chromatografie s lektinem z čočky poolu E2 proteinu z RK13 buněk infikovaných vvHCV44, kdy je E2 pool aplikován bezprostředně na kolonu pro gelovou filtraci (neredukující podmínky). Tečkovaná čára představuje E2 reaktivitu, jak byla detekována testem ELISA (jak uvedeno v příkladu 6),

Obrázek 31B: OD280 profil (souvislá čára) z gelové filtrační chromatografie s lektinem z čočky poolu E2 proteinu z RK13 buněk infikovaných vvHCV44, kdy E2 pool byl redukován a blokován podle příkladu 5.3 (redukující podmínky). Tečkovaná čára představuje E2 reaktivitu, jak byla detekována testem ELISA (jak uvedeno v příkladu 6).

Obrázek 32: Ni²⁺-IMAC chromatografie a reaktivita v testu ELISA E2 proteinu, jak byl exprimován z vvHCV44 po gelové filtraci v redukčních podmínkách, jak ukázáno na obrázku 31B.

Obrázek 33: Barvení stříbrem SDS-PAGE 0,5 gg purifikovaného E2 proteinu získaného elucí 200mM imidazolem (dráha 2) a promytí 30mM imidazolem (dráha 1) z Ni²⁺-IMAC chromatografie, jak ukázáno na obrázku 32.

Obrázek 34: OD profily odsolování purifikovaného E2 proteinu

získané 200 mM imidazolem, jak ukázáno na obrázku 33, s úmyselm odstranit imidazol.

Obrázek 35A: Hladiny protilátek k různým HCV antigenům (jádro 1, jádro 2, E2HCVR, NS3) pro NR a LTR následované během léčby a po období 6 až 12 měsíců po léčbě určené pomocí metody LIAscan. Průměrné hodnoty jsou označeny křivkou s prázdnými čtverečky.

Obrázek 35B: Hladiny protilátek k různým HCV antigenům (NS4, NS5, El a E2) pro NR a LTR následované během léčby a po období 6 až 12 měsíců po léčbě určené pomocí metody LIAscan. Průměrné hodnoty jsou označeny křivkou s prázdnými čtverečky.

Obrázek 36: Průměrné hladiny El protilátky (ElAb) a E2 protilátky (E2Ab) ve skupinách LTR a NR.

Obrázek 37: Průměrné hladiny El protilátky (ElAb) pro osoby nereagující (NR) a dlouhodobě reagující osoby (LTR) pro typ 1b a typ 3a.

Obrázek 38: Relativní polohy na mapě anti-E2 monoklonálních protilátek.

Obrázek 39: Parciální deglykosylace HCV El obalového proteinu. Lyzát z buněk RK13 infikovaných vvHCVIOA byl inkubován s různými koncentracemi glykosidáz podle instrukcí výrobce. Pravý panel: glykopeptidáza F (PNGase F) . Levý panel: endoglykosidáza H (Endo H).

Obrázek 40: Parciální deglykosylace HCV E2 obalových proteinů. Lyzáty z buněk RK13 infikovaných vvHCV64 (E2) a infikovaných vvHCV41 (E2s) byly inkubovány s různými koncentracemi glykopeptidázy F (PNGase F) podle instrukcí výrobce.

Obrázek 41: in vitro mutageneze HCV El glykoproteinů. Mapa mutovaných sekvencí a vytvoření nových restrikčních míst.

Obrázek 42A: in vitro mutageneze HCV El glykoproteinu (část 1). První krok PCR amplifikace.

·* 99

A 9

Obrázek 42B: in vitro mutageneze HCV El glykoproteinů (část 2). Překrývající se extenze a sdružená („nested) PCR.

Obrázek 43: in vitro mutageneze HCV El glykoproteinů. Mapa PCR mutovaných fragmentů (GLY-# a OVR-#) syntetizovaných během prvního kroku amplifikace.

Obrázek 44A: Analýza Western bloty El glykoproteinových mutant exprimovaných v HeLa (vlevo) a RK13 (vpravo) buňkách. Dráha 1: divoký typ W (virus vakcínie), dráha 2: originální El protein (vvHCV-10A), dráha 3: El mutanta Gly-1 (vvHCV-81), dráha 4: El mutanta Gly-2 (vvHCV-82), dráha 5: El mutanta Gly-3 (vvHCV83), dráha 6: El mutanta Gly-4 (vvHCV-84), dráha 7: El mutanta Gly-5 (vvHCV-85), dráha 8: El mutanta Gly-6 (vvHCV-86).

Obrázek 44B: Analýza El glykosylačních mutant virů vakcínie pomocí PCR amplifikace/restrikce. Dráha 1: El (vvHCV-10A), BspEI, dráha 2: El.GLY-1 (vvHCV-81), BspEI, dráha 4: El (vvHCV-lOA), Sací, dráha 5: El.GLY-2 (vvHCV-82), Sací, dráha 7: El (vvHCV-lOA), Sací, dráha 8: El.GLY-3 (vvHCV-83), Sací, dráha 10: El (vvHCV-10A), Stul, dráha 11: El.GLY-4 (vvHCV-84), Stul, dráha 13: El (vVHCV-10A), Smál, dráha 14: El.GLY-5 (vvHCV-85), Smál, dráha 16: El (vvHCV-10A), Stul, dráha 17: El.GLY-6 (vvHCV-86), Stul, dráhy 3-6-9-12-15: ukazatel nízkých molekulových hmotností, pBluescript SK+, Mspl.

Obrázek 45: elektroforéza v SDS polyakrylamidovém gelu rekombinantního E2 exprimovaného v S. Cerevisiae. Inokuláty byly pěstovány v leucin-selektivním médiu po dobu 72 hodin a naředěny 1/15 kompletním médiem. Po 10 dnech kultivace ve 28 °C byly odebrány vzorky média. Ekvivalent 200 μΐ kultivačního supernatantu koncentrovaného vakuovou centrifugou Speedvac bylo vloženo na gel. Byly analyzovány dvě nezávislé transformanty.

Obrázek 46: elektroforéza v SDS polyakrylamidovém gelu rekombinantního E2 exprimovaného v mutantě S. Cerevisiae ·* *· * * « « • » ·· • ♦ Φ φ • 9 · · ·· ΦΦ deficitní v glykosylaci. Inokuláty byly pěstovány v leucinselektivním médiu po dobu 72 hodin a naředěny 1/15 kompletním médiem. Po 10 dnech kultivace ve 28 °C byly odebrány vzorky média. Ekvivalent 350 μΐ kultivačního supernatantu koncentrovaného iontoměničovou chromatografii bylo vloženo na gel.

Obrázek 47: Profil šimpanzů a plán imunizace.

Obrázek 48: Buněčná reakce po 3 imunizacích.

Obrázek 49: Evoluce buněčné reakce po opakovaných El imunizacích.

Obrázek 50: Buněčná reakce po NS3 imunizacích.

Tabulka 1: Charakteristické vlastnosti příslušných klonů a primerů použitých pro amplifikaci pro konstrukci různých forem El proteinu, jako ukázáno v příkladu 1.

Tabulka 2: Shrnutí anti-El testů

Tabulka 3: Syntetické peptidy pro kompetitivní studie

Tabulka 4: Změny hladin obalových protilátek v průběhu času.

Tabulka 5: Rozdíl mezi LTR a NR.

Tabulka 6: Kompetitivní experimenty mezi myšími E2 monoklonálními protilátkami.

Tabulka 7: Primery pro konstrukci El glykosylačních mutant. Tabulka 8: Analýza El glykosylačních mutant testem ELISA. Tabulka 9: Profil myší Balb/c, El s adjuvans.

Tabulka 10: Humorální reakce: počet imunizací vyžadovaných pro různé hladiny El-protilátek.

·· ·· • * · · ♦ ♦ ·· • · ♦ · • · · · ·» «X» *· ·*·· ** • · ·« • « • · ·· • · I ·· ··

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Klonování a exprese El proteinu viru hepatitidy C

1. Konstrukce rekombinačních vektorů viru vakcínie

Rekombinační plazmid vakcínie pgptATAlS je modifikovaná verze pATA18 (Stunnenberg et al, 1988) s další inzercí obsahující gen xantin-guaninfosforibosyltransferázy z E. coli pod kontrolou prostředního promotoru 13 viru vakcínie (obrázek 1). Plazmid pgsATA18 byl konstruován zavedením oligonukleotidové spojovací sekvence, id. č. 1/94, obsahující stop kodony ve třech čtecích rámcích do vektoru pATA18 štěpeného Pstl a HindlII. To vytvořilo zvláštní PacI restrikční místo (obrázek 2) . Originální HindlII místo nebylo obnoveno.

Oligonukleotidové spojovací sekvence, id. č. 1/94:

5’ G GCATGC AAGCTT AATTAATT 3'

3' ACGTC CGTACG TTCGAA TTAATTA TCGA 5'

Pstl Sphl HindlII PacI (HindlII)

Aby se usnadnila rychlá a účinná purifikace, pomocí Ni^z+chelatace geneticky upravených histidinových úseků fúzovaných k rekombinantním proteinům, rekombinační vektor pMS66 vakcínie byl navržen, aby exprimoval sekretované proteiny s další karboxy-koncovou histidinovou značkou. Oligonukleotidové spojovací sekvence, se sekv. id. č. 2195, obsahující unikátní místa pro 3 restrikční enzymy vytvářející tupé konce (Smál, Stul a PmlI/BbrPI) byla syntetizována tak, že karboxy-koncová část kterékoliv cDNA mohla být vložena ve shodném čtecím rámci se sekvencí kódující štěpné místo proteázy faktoru Xa následovanou nukleotidovou sekvencí kódující 6 histidinů a 2 stop kodony (nové PacI restrikční místo bylo také vytvořeno po směru od 3' konce) . Tento oligonukleotid se sekv. id. č. 2/95 byl zaveden mezi místa Xmal a Pstl z pgptATA18 (obrázek 3). Oligonukleotidová spojovací sekvence, id. č. 2/95:

5' CCGGGGAGGCCTGCACGTGATCGAGGGCAGACACCATCACCACCATCACTAATAGT

TAATTAACTGCA 3'

3'CCTCCGGACGTGCACTAGCTCCCGTCTGTGGTAGTGGTGGTAGTGATTATCAATTAATTG

Xmal Pstl

Plazmid pgptATA-18 obsažený v Escherichia coli MC1061 (lambda) byl uložen podle podmínek Budapešťské smlouvy v BCCM/LMBP (Belgian Coordinated Collections of microorganisms/ Laboratorium voor Moleculaire Biologie Plasmidencollectie, Universiteit Gent, K. L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Ghent,

Belgie) a nese přístupové číslo LMBP4486. Uvedený depozit byl učiněn 9. ledna 2002.

Příklad 2

Konstrukce HCV rekombinantních plazmidů

2.1. Konstrukty kódující různé formy El proteinu

Produkty polymerázové řetězové reakce (PCR) byly získány ze vzorků séra izolací RNA a následnou reverzní transkripcí a PCR, jak bylo popsáno dříve (Stuyver et al., 1993b). Tabulka 1 ukazuje vlastnosti- příslušných klonů a primery použité pro amplifikaci. PCR fragmenty byly klonovány do plazmidů pSP72 (Promega) štěpených Smál. Následující klony byly vybrány pro inzerci do rekombinačních vektorů vakcínie: HCCI9A (sekv. id.

• · • · • · · · • · ·

č. 3), HCCI10A (sekv. id. č. 5), HCCI11A (sekv. id. č. 7), HCCI12A (sekv. id. č. 9), HCCI13A (sekv. id. č. 11) a HCCI17A (sekv. id. č. 13), jak ukázáno na obrázku 21, cDNA fragmenty obsahující El-kódující úseky byly štěpeny restrikčními enzymy EcoRI a HindlII z příslušných pSP72 plazmidů a vloženy do EcoRI/HindlII štěpeného pgptATA-18. rekombinačního vektoru vakcínie (popsáno v příkladu 1) , po směru od pozdního promotoru 11K viru vakcínie. Příslušné plazmidy byly nazvány pvHCV-9A, pvHCV-10A, pvHCV-llA, pvHCV-12A, pvHCV-13A a pvHCV17A, z nich je pvHCV-llA ukázán na obrázku 4.

2.2. Deleční mutanty hydrofobního úseku El

Klon HCCI37, obsahující deleci kodonů Asp264 až Val487 (nukleotidy 790 až 861, úsek kódující hydrofobní doménu I) byl vytvářen takto: 2 PCR fragmenty byly vytvořeny z klonu HCCI10A sadou primerů HCPr52 (sekv. id. č. 16)/HCPrlO7 (sekv. id. č. 19) a HCPrlO8 (sekv. id. č. 20)/HCPr54 (sekv. id. č. 18). Tyto primery jsou ukázány na obrázku 21. Dva PCR fragmenty byly purifikovány z agarózového gelu po elektroforéze a 1 ng každého fragmentu byl použit společně jako templáty pro PCR s primery HCPr52 (sekv. id. č. 16) a HCPr54 (sekv. id. č. 18) . Výsledný fragment byl klonován do Smál štěpeného pSP72 vektoru a klony obsahující deleci byly snadno identifikovány díky deleci 24 kodonů (72 párů bází). Byl vybrán plazmid pSP72HCCI37 obsahující klon HCCI37 (SEKV ID 15) . Rekombinantní plazmid vakcínie obsahující kompletní El cDNA postrádající hydrofobní doménu I byl konstruován inzercí HCV sekvence obklopují deleci (fragment štěpený Xmal a BamHI z vektoru pSP72-HCCl37) do míst Xmal-BamHI plazmidů vakcínie pvHCV-lOA. Výsledný plazmid byl nazván pvHCV-37. Po potvrzujícím sekvencování byl z tohoto vektoru pvHCV-37 (štěpeného EcoRII a BstEII) izolován amino-koncový úsek obsahující interní deleci a znovu vložen do EcoRI a BstEII štěpeného plazmidů pvHCV-llA.

► « • · ·

Očekávalo se, že tento konstrukt exprimuje El protein s oběma odstraněnými hydrofobními doménami a byl nazván pvHCV-38. El kódující úsek klonu HCCI38 je reprezentován sekv. id. č. 23.

Protože hydrofilní úsek v karboxy-koncové části El (teoreticky se prostírající kolem aminokyselin 337-340) nebyl úplně zahrnut v konstruktu pvHCV-38, byl izolován větší El úsek postrádající hydrofobní doménu I z plazmidu pvHCV-37 štěpením EcoRI/BamHI a klonován do EcoRI/BamHI štěpeného vektoru pgsATA-18. Výsledný plazmid byl nazván pvHCV-39 a obsahoval klon HCCI39 (sekv. id. č. 25) . Stejný fragment byl štěpen z pvHCV-37 vektoru enzymem BamHI (jehož přesahující konce byly doplněny Klenow-fragmentem DNA polymerázy I (Boehringer)) a následně EcoRI (5' kohezivní konec). Tato sekvence byla vložena do EcoRI a BbrPI štěpeného vektoru pMS66. To mělo za následek klon (HCCI40 (sekv. id. č. 27) v plazmidu pvHCV-40, obsahující úsek 6 histidinů ve své karboxy-koncové části.

2.3. El jiných genotypů

Klon HCCI62 (sekv. id. č. 29) byl získán z typu 3a od pacienta infikovaného chronickou hepatitidou C (sérum BR36, klon BR36-9-13, sekv. id. č. 19 ve WO 94/25601 a viz také Stuyver et al. 1993a) a HCCI63 (sekv. id. č. 31) byl získán z typu 5a od dítěte infikovaného hepatitidou po transfúzi (sérum BE95, klon PC-4-1, sekv. id. č. 45 ve WO 94/25601).

2.4. E2 konstrukty

HCV E2 PCR fragment 22 byl získán ze séra BE11 (genotyp lb) pomocí primerů HCPrlO9 (sekv. id. č. 33) a HCPr72 (sekv. id. č. 34) s použitím techniky izolace RNA, reverzní transkripce a PCR, jak bylo popsáno v Stuyver et al., 1993b a

0000 «<

0 0 4

0 00

0 0 I

0 0 <

0 0

00 » « 0 I • · 00 » 0 0 4 » 0 0 4

00 fragment byl klonován do Smál štěpeného pSP72 vektoru. Klon HCCI22A (sekv. id. č. 35) byl štěpen s Ncol/AlwNI nebo BamHI/AlwNI a přesahující konce fragmentů byly zatupeny (Ncol a BamHI místa s Klenow DNA Polymerázou I (Boehringer) a AlwNI s T4 DNA polymerázou (Boehringer)). BamHI/AlwNI cDNA fragment pak byl vložen do vektoru vakcínie pgsATA-18, který byl linearizován štěpením EcoRII a HindlII a jehož kohezivní konce byly doplněny Klenow DNA Polymerázou (Boehringer). Výsledný plazmid byl nazván pvHCV-41 a kódoval E2 úsek od aminokyseliny Met347 k Gln673, zahrnující 37 aminokyselin (od Met347 .do Gly383) El proteinu, které mohou sloužit jako signální sekvence. Stejná HCV cDNA byla vložena do EcoRI a BbrPI štěpeného vektoru pMS66, jehož konce byly následně zatupeny Klenow DNA Polymerázou. Výsledný plazmid byl nazván pvHCV-42, a také kódoval aminokyseliny 347 až 683. Ncol/AlwNI fragment byl vložen podobně do stejných míst vektorů vakcínie pgsATA-18 (pvHCV-43) nebo pMS-66 (pvHCV-44). pvHCV-43 a pvHCV-44 kódovaly aminokyseliny 364 až 673 z HCV polyproteinu, jehož aminokyseliny 364 až 383 byly získány z přírodního karboxykoncového úseku El proteinu kódujícího signální sekvenci pro E2 a aminokyselin 384 až 673 ze zralého E2 proteinu.

2.5. Vytvoření rekombinantních virů HCV-vakcínie

Buňky RK13 z králičích ledvin (ATCC CCL 37), buněčná linie humánního osteosarkomu 143B deficitní v thymidinkináze (TK-) (ATCC CRL 8303), HeLa (ATCC CRL 2) a Hep G2 (ATCC HB 8065) buněčné linie byly získány od American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md, USA) . Buňky byly pěstovány v Eagleho médiu modifikovaném podle Dulbecca (DMEM) doplněném 10% fetálním telecím sérem a Earleovými solemi (EMEM) pro RK13 a 143 Β (TK-) a glukózou (4 g/1) pro Hep G2. Kmen WR viru vakcínie (Western Reserve, ATTC VR119) byl rutinně propagován buď v buňkách 143B nebo RK13, jak bylo popsáno dříve (Panicali ** 44 49 44 4944

9 4 4 k · · 4 * * fc • · ·* · · fcfc 4 4 4

4 9 4 4 4 4 4 4 9 4 · * • ••fc fcfcfcfc · * · · • fc fc« 94 44 44 44 & Paoletti, 1982, Piccini et al., 1987, Mackett et al. , 1982,

1984 a 1986). Konfluentní monovrstva buněk 143B byla infikována divokým typem viru vakcínie v násobku infekce (m.o.i.) 0,1 ( = 0,1 jednotky tvořící plaky (PFU) na buňku).

Dvě hodiny později byl rekombinační plazmid vakcínie transfekován do infikovaných buněk ve formě koprecipitátu fosfátu vápenatého obsahujícího 500 ng plazmidové DNA pro umožnění homologní rekombinace (Graham & van der Eb, 1973, Mackett et al., 1985). Rekombinantní viry exprimující protein xantin-guaninfosforibosyltransferázu (gpt) z Escherichia coli byly selektovány na buňkách RK13 králičích ledvin inkubován v selekčním médiu (EMEM obsahující 25 pg/ml kyselina mykofenolové (MPA), 250 ng/ml xantinu a 15 ng/ml hypoxantinu, Falkner a Moss, 1988, Janknecht et al, 1991). Jednotlivé rekombinantní viry byly purifikovány na čerstvých monovrstvách buněk RK13 pod 0,9% agarózou v selekčním médiu. Byly vybrány rekombinantní viry deficitní v thymidinkináze (TK-), a pak purifikovány tvorbou plaků na čerstvých monovrstvách humánních buněk 143B (TK-) v přítomnosti 25 pg/ml 5-brom-2'-deoxyuridinu. Zásobní roztoky purifikovaných rekombinantních virů HCVvakcínie byly připraveny infekcí buď humánních buněk 143B nebo králičích buněk RK13 v m.o.i. 0,05 (Mackett et al, 1988). Inzerce HCV cDNA fragmentu do rekombinantních virů vakcínie byla potvrzena na alikvotu (50 μΐ) buněčného lyzátu po MPA selekci prostřednictvím PCR s primery použitými ke klonování příslušných HCV fragmentů (viz tabulka 1). Rekombinantní vakcínie-HCV viry byly nazvány podle čísla rekombinačního plazmidu vakcínie, např. rekombinantní virus vakcínie vvHCV10A pocházel z rekombinace kmene WR divokého typu s plazmidem pvHCV-10A.

Příklad 3

Infekce buněk rekombinantními viry vakcínie

Konfluentní monovrstva buněk RK13 byla infikována v m.o.i. 3 rekombinantními viry HCV-vakcínie, jak byly popsány v příkladu 2. Pro infekci byla buněčná monovrstva dvakrát promyta fyziologickým roztokem pufrovaným fosfáty, pH 7,4 (PB$), a zásobní roztok rekombinantního viru vakcínie byl naředěn v MEM médiu. 200 μΐ virového roztoku bylo přidáno na 10⁶ buněk tak, že m.o.i. byl 3 a inkubováno po dobu 45 minut ve 24 °C. Virový roztok byl odsát a byly přidány 2 ml kompletního růstového médiá (viz příklad 2) na 10⁶ buněk. Buňky byly inkubovány po dobu 24 hodin ve 37 °C, kdy probíhala exprese HCV proteinů.

Příklad 4

Analýza rekombinantních proteinů Western bloty

Infikované buňky byly dvakrát promyty PBS, přímo lyžovány lyzačním pufrem (50 mM Tris.HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM MgCl₂, 1 g/ml aprotinin (Sigma, Bornem, Belgie) ) nebo odděleny od láhví inkubací v 50 mM Tris.HCl pH 7,5/10 mM EDTA/150 mM NaCl po dobu 5 minut a sebrány centrifugací (5 minut v 1000 g). Buněčný pelet pak byl resuspendován ve 200 μΐ lyzačního pufru (50 mM Tris.HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 150 mM

NaCl, 5 mM MgCl₂, aprotinin, 1% Triton X-100) na 10⁶ buněk. Buněčné lyzáty byly čištěny po dobu 5 minut ve 14 000 rpm v Eppendorfově centrifuze, aby se odstranily nerozpustné • · · ·

buněčná zbytky. Proteiny z 20 μΐ lyzátu byly odděleny elektroforézou v dodecylsulfát sodný-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). Proteiny pak byly přeneseny elektrotransferem z gelu na nitrocelulózovou membránu (Amersham) s použitím přístroje pro transfer Hoefer HSI chlazeného na 4 °C po dobu 2 hodin při 100 V konstantního napětí, v transferovém pufru (25 mM Tris.HCl pH 8,0, 192 mM glycin, 20% (objem/objem) methanol). Nitrocelulózové filtry byly blokovány s Blotto (5 % (hmotnost/objem) odtučněný instantní mléčný prášek v PBS, Johnson et al., 1981) a inkubovány s primární protilátkami naředěnými v Blotto/0,1 % Tween 20. Obvykle humánní negativní kontrolní sérum nebo sérum pacienta infikovaného HCV bylo 200 krát naředěn a preinkubováno po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s 200 krát naředěným buněčným lyzátem infikovaným virem vakcínie divokého typu, aby se snížila nespecifická vazba. Po promytí s Blotto/0,1% Tween 20, byly nitrocelulózové filtry inkubovány s roztokem substrátu alkalické fosfatázy naředěným Blotto/0,1 % Tween 20. Po promytí s 0,1% Tween 20 v PBS byly filtry inkubovány se substrátovým roztokem alkalické fosfatázy (100 mM Tris.HCl pH 9,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 0, 38 gg/ml nitrotetrazoliové modři, 0,165 μg/ml 5-brom4-chlor-3-indolylfosfátu). Všechny kroky, kromě elektrotransferu, byly prováděny při teplotě místnosti.

Příklad 5

Purifikace rekombinantního proteinu El nebo E2

5.1. Lýza

Infikované buňky RK13 (nesoucí konstrukty El nebo E2) byly 2 krát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfáty (PBS) • ·

a odděleny z kultivačních nosičů inkubací v PBS obsahujícím 10 mM EDTA. Oddělené buňky byly promyty dvakrát PBS a 1 ml lyzačního pufru (50 mM Tris.HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM MgCl₂, 1 μg/ml aprotinin (Sigma, Bornem, Belgie) obsahující 2 mM biotinyiovaný N-ethylmaleimid (biotin-NEM) (Sigma) byl přidán na 10⁵ buněk ve 4 °C. Tento lyzát byl homogenizován v zařízení „douncer typu B a ponechán při teplotě místnosti po dobu 0,5 hodiny. Dalších 5 objemů lyzačního pufru obsahujícího 10 mM N-ethylmaleimid (NEM, Aldrich, Bornem, Belgie) bylo přidáno k primárnímu lyzátu a směs byla nechána při teplotě místnosti po dobu 15 minut.

Nerozpustná buněčná debris byla	purifikována	z roztoku
centrifugací v Beckman JA-14 rotoru	ve	14 000 rpm	(30100 g
v r_max) po dobu 1 hodiny ve 4 °C.
5.2. Lektinová chromatografie
Purifikovaný buněčný lyzát	byl	nanesen	rychlostí
1 ml/minutu na kolonu Sepharose 48	(0,8	x 10 cm)	s lektinem

z čočky (Pharmacia), která byla ekvilibrována 5 objemy kolony lyzačního pufru rychlostí z 1 ml/minutu. Kolona s lektinem z čočky byla promyta 5 až 10 objemy kolony pufru 1 (0,lM fosfát draselný pH 7,3, 500 mM KC1, 5% glycerol, 1 mM 6-NH₂hexanová kyselina, 1 mM MgCl₂ a 1% DecylPEG (KWANT, Bedum, Nizozemí). V některých experimentech byla kolona následně promyta 10 objemy kolony pufru 1 obsahujícího 0,5% Empigen-BB (Calbiochem, San Diego, CA, USA) místo 1% DecylPEG. Navázaná látka byla eluována aplikací elučního pufru (10 mM fosfát draselný pH 7,3, 5% glycerol, 1 mM hexanová kyselina, 1 mM

MgCl₂, 0,5% Empigen-BB a 0,5 M α-methylmannopyranosid) . Eluovaná látka byla frakcionována a na frakcích byl prováděn screening na přítomnost El nebo E2 proteinu pomocí testu ELISA, jak bylo popsáno v příkladu 6. Obrázek 22 ukazuje ELISA • · • · · · * · · • · • 444 » _e • · ·· · · • · · · · « · ·· ·· výsledky získané z frakcí eluátu na lektinu z čočky ze 4 různých El purifikaci buněčných lyzátů infikovaných vvHCV39 (typ lb) , vvHCV40 (typ lb) , vvHCV62 (typ 3a) a vvHCV63 (typ 5a) . Obrázek 23 ukazuje profily získané z hodnot ukázaných na obrázku 22. Tyto výsledky ukazují, že lektinová afinitní kolona může být použita pro obalové proteiny různých typů HCV.

5.3. Koncentrace a parciální redukce

El- nebo E2- pozitivní frakce byly spojeny a koncentrovány na přístroji Centricon 30 kD (Amicon) centrifugací po dobu 3 hodin v 5 000 rpm v Beckman JA-20 rotoru ve 4 °C. V některých experimentech byly El- nebo E2- pozitivní frakce spojeny a koncentrovány evaporací dusíku. Ekvivalent 3.10⁸ buněk byl koncentrován přibližně na 200 μΐ. Pro parciální redukci byl k těmto 200 μΐ přidán 30% Empigen-BB (Calbiochem, San Diego, CA, USA) v konečné koncentraci 3,5 % a pak byl přidán 1M DTT v H₂O v konečné koncentraci 1,5 až 7,5 mM a inkubován po dobu 30 minut ve 37 °C. Pak byl přidán NEM (1M v dimethylsulfoxidu) v konečné koncentraci 50 mM a ponechán reagovat dalších 30 minut ve 37 °C, aby se blokovaly volné sulfhydrylové skupiny.

5.4. Gelová filtrační chromatografie

Kolona Superdex-200 HR 10/20 (Pharmacia) byla ekvilibrována 3 objemy kolony PBS/3% Empigen-BB. Redukovaná směs byla injikována do smyčky pro vzorek o objemu 500 μΐ zařízení Smart System (Pharmacia) a pro gelovou filtraci byl přidán PBS/3% Empigen-BB pufr. Frakce 250 μΐ byly sbírány z V_ok V_t. Na frakcích byl prováděn screening na přítomnost El nebo E2 proteinu, jak bylo popsáno v příkladu 6.

Obrázek 24 ukazuje výsledky textu ELISA získané z frakcí získaných po gelové filtrační chromatografii ze 4 různých El • · purifikaci buněčných lyzátů infikovaných vvHCV39 (typ 1 b) , vvHCV40 (typ 1 b) , vvHCV62 (typ 3a) a vvHCV63 (typ 5a) . Obrázek 25 ukazuje profily získané z purifikaci El proteinů typů lb, 3a a 5a (z buněk RK13 infikovaných vvHCV39, vvHCV62 a vvHCV63, v daném pořadí, purifikované na lektinu z čočky a redukovaných, jak bylo uvedeno v předchozích příkladech). Vrcholy označené „1, „2 a „3, představují vrcholy čistého El proteinu (El reaktivita hlavně ve frakcích 26 až 30) . Tyto vrcholy ukazují velmi podobné molekulové hmotnosti přibližně 70 kD, odpovídající dimernímu El proteinu. Další vrcholy v těchto třech profilech představují virus vakcínie a/nebo buněčné proteiny, které mohly být odděleny z El jen díky redukčnímu kroku, jak ukázáno v příkladu 5.3. A díky následné gelové filtraci v přítomnosti řádného detergentu. Jak ukázáno na obrázku 26, pool 1 (představující frakce 10 až 17) a pool 2 (představující frakce 18 až 25) obsahují kontaminující proteiny nepřítomný v El poolu (frakce 26 až 30) . Vrcholové frakce El byly puštěny na SDS/PAGE a blotovány, jak bylo popsáno v příkladu 4. Proteiny značené NEM-biotinem byly detekovány streptavidinem-alkalickou fosfatázou, jak ukázáno na obrázku 27. Je snadné pozorovat, že, mezi jiným, kontaminující proteiny o velikosti 29 kD a 45 kD přítomné před gelovou filtrační chromatografií (dráha 1) jsou přítomné pouze ve velmi nízkých hladinách ve frakcích 26 až 30. Pás přibližně v 65 kD reprezentuje El dimerní formu, která nemohla být úplně rozložena na monomerní El formu. Podobné výsledky byly získány pro typ 3a El proteinu (dráhy 10 až 15), který vykazuje rychlejší pohyblivost na SDS/PAGE díky přítomnosti pouze 5 sacharidů místo 6. Obrázek 28 ukazuje barvení stříbrem SDS/PAGE gelu prováděného v totožných podmínkách, jak jsou uvedeny na obrázku 26. Kompletní přehled purifikačního postupu je podán na obrázku 29.

Přítomnost purifikovaného El proteinu byla dále potvrzena • ·· ·

Western bloty, jak bylo popsáno v příkladu 4. Vypadá to, že dimerní El protein neagregoval a je bez kontaminujících složek. Podtyp lb El proteinu purifikovaný z buněk infikovaných vvHCV40 podle výše uvedeného schématu byl aminokoncově sekvencován na přístroji pro sekvencování 477 PerkinsElmer a vypadá to, že obsahuje tyrosin jako první zbytek. To potvrdilo, že El protein byl štěpen signální peptidázou ve správné poloze (mezi A191 a Y192) od své signální sekvence. Toto potvrdilo zjištění autorů Hijikata et al. (1991), že amino-konec zralého El proteinu začíná v aminokyselinové poloze 192.

5.5. Purifikace E2 proteinu

E2 protein (aminokyseliny 384 až 673) byl purifikován z buněk RK13 infikovaných vvHCV44, jak ukázáno v příkladech 5.1 až 5.4. Obrázek 30 ukazuje OD280 profil (souvislá čára) z chromatografie s lektinem z čočky. Tečkovaná čára reprezentuje E2 reaktivitu, jak byla detekována testem ELISA (viz příklad 6) . Obrázek 31 ukazuje stejné profily získané z gelové filtrační chromatografie z E2 poolu z lektinu z čočky (viz obrázek 30), jehož část byla redukována a blokována podle metody, jak byla uvedena v příkladu 5.3. A jehož část byla okamžitě aplikována na kolonu. Obě části E2 poolu byly puštěny na samostatné gelové filtrační kolony. Může demonstrováno, že E2 tvoří kovalentně spojené agregáty s kontaminujícími proteiny, jestliže nebyla prováděna žádná redukce. Po redukci a blokování byla většina kontaminujících proteinů vyloučena do V_o frakce. Jiné kontaminující proteiny purifikované společně s E2 proteinem nebyly nadále kovalentně spojeny s E2 proteinem, protože tyto kontaminující složky mohly být odstraněny v následujícím kroku. Obrázek 32 ukazuje další Ni²⁺IMAC purifikační krok prováděný pro purifikaci E2 proteinu. Tato afinitní purifikace používá 6 histidinových zbytků • 9 ·· ·« • · · ^ · · ·· · · * · ·· · ♦ · · • · · · · · · ·· ·· ·· « přidaných k E2 proteinu, jak byl exprimován

WHCV4 4 .

Kontaminující proteiny buď prošly přes kolonu nebo mohly být odstraněny promytím 30mM imidazolem. Obrázek 33 ukazuje stříbrem obarvený SDS-PAGE 0,5 gg purifikovaného E2 proteinu a promytí 30mM imidazolem. čistý E2 protein mohl být snadno získán elucí 200mM imidazolem. Obrázek 34 ukazuje další odsolování určené pro odstranění imidazolu a pro přechod k požadovanému pufru, jako je např. PBS, uhličitanový pufr, fyziologický roztok.

Počínaje přibližně s 50 000 cm² buněk RK13 infikovaných vvHCVHA (nebo vvHCV40) pro produkci El nebo vvHCV41, vvHCV42, vvHCV43 nebo vvHCV44 pro produkci E2 proteinu, postupy popsané v příkladech 5.1 až 5.5 umožní purifikaci přibližně 1,3 mg El proteinu a 0,6 mg E2 proteinu.

Je také nutné poznamenat, že sekretovaný E2 protein (tvořící přibližně 30-40%, 60-70% v intracelulární formě) je charakterizovaný tvorbou agregátů (oproti očekáváním). Stejný problém je tedy předložen pro purifikaci sekretovaného E2. Sekretovaný E2 může být purifikován tak, jak bylo popsáno výše.

Přiklad 6

ELISA pro detekci anti-El nebo anti-E2 protilátek nebo pro detekci El nebo E2 proteinů

Jamky mikrotitračních destiček Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dánsko) byly potaženy 1 objemem (např. 50 μΐ nebo 100 μΐ nebo 200 μΐ) na jamku roztoku streptavidinu o koncentraci 5 gg/ml (Boehringer Mannheim) v PBS po dobu 16 hodin ve 4 °C nebo po dobu 1 hodiny ve 37 °C. Alternativně byly jamky potaženy 1 • φ • · φ · objemem aglutininu z Galanthus nivalis (GNA) o koncentraci 5 pg/ml v pufru 50 mM uhličitanu sodném, pH 9,6, po dobu 16 hodin ve 4 °C nebo po dobu 1 hodiny ve 37 °C. V případě povlaku GNA byly destičky 2 krát promyty 400 μΐ promývacího roztoku ze soupravy Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgie). Nenavázané potažené povrchy byly blokovány 1,5 až 2 objemy blokujícího roztoku (0,1% kasein a 0,1% NaNg v PBS) po dobu 1 hodiny ve 37 °C nebo po dobu 16 hodin ve 4 °C. Blokující roztok byl odsát. Purifikovány El nebo E2 byl naředěn na 100-1000 ng/ml (koncentrace měřená v A = 280 nm) nebo frakce z kolony, na kterých byl prováděn screening na El nebo E2 (viz příklad 5) , nebo El nebo E2 v nepurifikovaných buněčných lyzátech (příklad 5.1.) byly naředěny 20 krát v blokujícím roztoku a 1 objem El nebo E2 roztoku byl přidán do každé jamky a inkubován po dobu 1 hodiny ve 37 destičkách potažených streptavidinem mikrotitrační destičky byly promyty promývacího roztoku ze soupravy Innotest HCV (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgie). Vzorky séra byly naředěny 20 krát nebo monoklonální anti-El nebo anti-E2 protilátky byly naředěny na koncentraci 20 ng/ml ve ředidlem pro vzorek ze soupravy Innotest HCV Ab III a 1 objem roztoku byl ponechán reagovat s El nebo E2 proteinem po dobu 1 hodiny ve 37 °C.

Jamky mikrotitrační destičky byly promyty 5 promývacího roztoku ze soupravy Innotest (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgie). Navázané protilátky byly detekovány inkubací v každé jamce po dobu 1 hodiny ve 37 °C se sekundární protilátkou konjugovanou s peroxidázou, kozí antihumánní nebo anti-myší IgG, (DAKO, Glostrup, Dánsko) naředěnou 1/80 000 v 1 objemu ředidla pro konjugát ze soupravy Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwsindrecht, Belgie) a barevné změny bylo dosaženo přidáním substrátu ze soupravy Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgie) naředěného 100 krát 'C na Jamky obj emem Ab III nebo GNA. 3 krát 1 μΐ

III krát 400

HCV Ab • · • · · · • · 9 9 • 9 99 • ♦ 9 9 • 9 9 9 • 9 99 v 1 objemu substrátového roztoku ze soupravy Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgie) po dobu 30 minut ve 24 °C po promytí destiček 3 krát 400 μΐ promývacího roztoku ze soupravy Innotest HCV Ab III (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgie).

Příklad 7

Sledování skupin pacientů s různými klinickými profily

7.1. Sledování anti-El a anti-E2 protilátek

Současné diagnostické testy na virus hepatitidy C (HCV) byly vyvinuty pro screening a potvrzení přítomnosti HCV protilátek. Nezdá se, že tyto testy poskytují informaci použitelnou pro sledování léčby nebo pro prognózu výsledku onemocnění. Nicméně, jako v případě hepatitidy B, detekce a kvantifikace anti-obalových protilátek se může v klinické situaci ukázat jako užitečnější. Aby se vyšetřila možnost použití titru anti-El protilátky a titru anti-E2 protilátky jako prognostických ukazatelů výsledku onemocnění hepatitidou C, řada pacientů léčených IFN-α dlouhodobě udržovanou reakcí (definovaní jako pacienti s normálními hladinami transamináz a negativním testem HCV-RNA (PCR v 5' nekódujícím úseku) v krvi po období alespoň 1 rok po léčbě) byla srovnána s pacienty, kteří nevykazovali žádnou reakci nebo vykazovali biochemickou reakci s relapsem na konci léčení.

Skupina 8 pacientů léčených IFN-α s dlouhodobě udržovanou reakcí (LTR, sledovaní 1 až 3,5 roků, 3 typu 3a a 5 typu 1 b) byla srovnána s 9 pacienty vykazujícími nekompletní reakce na léčbu (NR, sledovaní 1 až 4 roky, 6 typu lb a 3 typu 3a). Typ lb (vvHCV-39, viz příklad 2.5.) a 3a El (vvHCV-62, viz příklad • · · · • · 9 « · ♦ • · · • · · « ·· ··

2.5.) proteinů byly exprímovány systémem viru vakcínie (viz příklady 3 a 4) a purifikovány k homogenitě (příklad 5). Vzorky pocházející z pacientů infikovaných typem lb viru hepatitidy C byly testovány na reaktivitu s purifikovaným typem lbEl proteinu, zatímco vzorky typu 3a infekce byly testovány na reaktivitu anti-typ 3a El protilátek v testu ELISA, jak bylo popsáno v příkladu 6.

Genotypy virů hepatitidy C infikující různé pacienty byly určovány genotypizací pomocí testu Inno-LiPA (Innogenetics, Zwijndrecht, Belgie). Obrázek 5 ukazuje poměry signálů k pozadí anti-El u těchto pacientů sledovaných v průběhu léčebné kúry interferonem a během období sledování po léčbě. V případech LTR byly souhlasně vykazovány rychle klesající hladiny anti-El (s kompletním vymizením ve 3 případech), zatímco hladiny anti-El u NR případů zůstaly přibližně konstantní, část získaných dat anti-El je ukázána v tabulce 2 jako průměr poměrů S/N ± SD (průměrný titr anti-El). Titr anti-El mohl být odvozen z poměru signálu k pozadí, jak ukázáno v obrázcích 5, 6, 7 a 8.

Již na konci léčby mohly být pozorovány zřetelné rozdíly mezi těmito 2 skupinami. Titry protilátky anti-El klesaly 6,9 krát u LTR, ale jen 1,5 krát u NR. Na konci sledování titry anti-El klesly až 22,5 krát u pacientů s udržovanou reakcí a byly dokonce mírně zvýšeny u NR. Proto na základě těchto dat snížení hladin protilátek anti-El během sledování terapie IFN-α koreluje s dlouhodobou udržovanou reakcí na léčbu. Anti-El test může být velmi užitečný pro prognózu dlouhodobé reakce na léčbu IFN nebo obecně na léčbu onemocnění hepatitidou C.

Toto zjištění nebylo očekáváno. Naopak původci očekávali zvýšení hladin protilátek anti-El během léčebné kúry IFN u pacientů s dlouhodobou reakcí. Jako v případě hepatitidy B, φ φ » · Φ • Φ · • ΦΦ • Φ ♦ • Φ Φ

ΦΦΦΦ φ

φ φ

φ φ • φ virus je protilátek.

odstraněn, odstraněn jako důsledek sérokonverze anti-HBsAg

Také u mnoha jiných virových infekcí je virus když jsou zvýšeny obalové protilátky. Nicméně v experimentech předkládaného vynálezu anti-El protilátky jasně klesaly u pacientů s dlouhodobou reakcí na léčbu, zatímco hladina protilátek zůstala přibližně na stejném stupni u pacientů nereagujících na léčbu. Ačkoli výsledek těchto experimentů nebyl očekáván, toto ne zcela zjevné zjištění může být velmi důležité a použitelné pro klinickou diagnózu HCV infekcí. Jak ukázáno na obrázcích 9, 10, 11 a 12, hladiny anti-E2 reagovaly velmi odlišně u stejných studovaných pacientů a nebyl pozorován žádný zřejmý pokles titrů, co se týkalo anti-El protilátek. Obrázek 35 uvádí kompletní přehled z pilotní studie.

Jak může být odvozeno z tabulky 2, titry anti-El byly v průměru alespoň 2 krát vyšší na začátku léčby u osob dlouhodobě reagujících ve srovnání s osobami neúplně reagujícími na léčbu. Proto měření titru anti-El protilátek na začátku léčby nebo sledování pacienta během infekce a měření anti-El titru se může stát užitečným ukazatelem pro klinickou diagnózu hepatitidy C. Kromě toho se může stát žádoucí použití více definovaných úseků El nebo E2 proteinů, jak je ukázáno v příkladu 7.3.

7.2. Analýza El a E2 protilátek u větší skupiny pacientů

Pilotní studie vedla původce k tomu, aby uzavřeli, že v případě, kdy byla infekce kompletně odstraněna, protilátky k HCV obalovým proteinům se měnily rychleji než protilátky k obvykleji studovaným HCV antigenům, přičemž El protilátky se měnily nejintenzivněji. Původci proto zahrnuli více LTR a 3a, a dále doplnili skupinu takže obě skupiny zahrnovaly po infikovaných typem lb přizpůsobenou sérií NR,

• 9999 • 9

9 • « ·· pacientech. Bylo také analyzováno několik osob reagujících částečně (PR) a reagující osoby s relapsem (RR).

Obrázek 36 zobrazuje průměrné hladiny El protilátek (ElAb) a E2 protilátek (E2Ab) u skupin LTR a NR a tabulky 4 a 5 ukazují statistické analýzy. V této větší skupině vyšší hladiny protilátek El před terapií IFN-α byly spojeny s LTR (P < 0,03). Protože mnohem vyšší hladiny El protilátek byly pozorovány u typem 3a infikovaných pacientů ve srovnání s typem lb infikovaných pacientů (obrázek 37) , byl vzat do úvahy genotyp (tabulka 4). V typem lb infikované skupině LTR pacienti také měli vyšší hladiny protilátek El než NR na začátku léčby [P < 0,05], omezený počet typem 3a infikovaných NR neumožnil statistickou analýzu.

Z hladin protilátek monitorovaných u LTR během 1,5-letého období sledování, byly pouze protilátky El odstraněny rychle ve srovnání s hladinami měřenými na začátku léčby [P = 0,0058, konec terapie, P = 0, 0047 a P = 0,0051 v 6 a 12 měsících po terapii, v daném pořadí]. Tato clearance zůstala významnou u typem. 1 nebo typem 3 infikovaných LTR (průměrné P hodnoty < 0,05). Tato data potvrdila počáteční nález, že hladiny ElAb klesají rychle v rané fázi rozlišování. Zdá se, že tato vlastnost je nezávislá na virovém genotypu. U NR, PR nebo RR nebyly pozorovány žádné změny kterékoliv z protilátek měřených během období sledování. U pacientů, kteří odpovídali příznivě na léčbu normalizací hladin ALT a- byli během léčby HCV-RNA negativní, byl významný rozdíl mezi setrvale reagujícími osobami (LTR) a reagujícími osobami s relapsem (RR) . Na rozdíl od LTR, RR nevykazovali žádné snížení hladin El protilátek, signalizujících přítomnost okultní HCV infekce, která nemohla být prokázána ani PCR nebo jinými klasickými technikami pro detekci HCV RNA, ani zvýšenými hladinami ALT. Zdá se, že nepatrné množství virové RNA, stále přítomné v RR skupině během léčby, je schopné stimulace anti-El B lymfocytů. Anti-El ··

• 99 9 ·· ♦· • » * ♦ * ·· • ♦ · • · · ·· 99 sledování nemusí proto být schopné rozlišovat jen LTR od NR, ale také RR.

7.3. Sledování protilátek k definovaným úsekům El proteinu

Ačkoliv molekulárně biologický přístup identifikace HCV antigenu měl za následek nebývalý průlom v rozvoji virové diagnostiky, způsob imunitního screeningu knihoven lambda gtll převážně poskytujících lineární epitopy rozptýlené v úsecích jádra a nestrukturálních úsecích a analýza obalových úseků musely čekat na klonování a expresi E1/E2 úseku v savčích buňkách. Tento přístup ostře kontrastuje s mnoha jinými virovými infekcemi, u kterých epitopy obalových úseků byly zmapovány již dlouho před rozluštěním genomové struktury. Takové epitopy a odpovídající protilátky často měly neutralizují aktivitu použitelnou pro vývoj vakcín a/nebo umožnily vývoj diagnostických testů s klinickým nebo prognostickým významem (např. protilátky proti povrchovému antigenu hepatitidy B).

Jelikož dodnes nejsou dostupné žádné HCV vakcíny nebo testy umožňující klinickou diagnózu a prognózu onemocnění hepatitidou C, charakterizace virových obalových úseků vystavených imunitnímu dozoru může významně přispět k novým směrům diagnózy a profylaxi HCV.

Několik 20-merních peptidů (tabulka 3), které se navzájem překrývají o 8 aminokyselin, byly syntetizovány podle dříve popsaného způsobu (EP-A-0 489 968) na základě HC-J1 sekvence (Okamota et al, 1990) . žádný z nich kromě peptidu env35 (také nazývaného El-35) nebyl schopný detekovat protilátky v séru v přibližně 200 případech HCV. Pouze 2 séra mírně reagovala s env35 peptidem. Nicméně pomocí testu anti-El ELISA, jak bylo popsáno v příkladu 6, bylo možné objevit další epitopy takto: test anti-El ELISA, jak bylo popsáno v příkladu 6, byl • 4 « · ·

« 4 4 • 4 4 *4

4 4

44 • · · · •4 4

4« ·

·· · ·4 4

4« modifikován smícháním 50 pg/ml El peptidu s naředěným humánním sérem v poměru 1/20 v ředidle pro vzorek. Obrázek 13 ukazuje výsledky reaktivity humánních sér k rekombinantnímu El proteinu (exprimovanému vvHCV-40) , v přítomnosti jednotlivého El peptidu nebo směsi El peptidů. Zatímco pouze 2 % séra mohlo být detekováno pomocí El peptidů, kterými byly potaženy pásy pro imunotest v řádkovém formátu, přes polovinu sér obsahovalo anti-El protilátky, které mohly kompetovat se stejnými peptidy, když byly testovány na rekombinantním El proteinu. Několik z myších monoklonálních protilátek získaných z Balb/C myší po injekci purifikovaného El proteinu následně reaktivně kompetovala o El s jednotlivými peptidy (obrázek 14). Úsek env53 obsahoval nepochybně převládající epitop, protože přidání env53 mohlo podstatně kompetovat reaktivně s několika séry s El a byly také detekovány protilátky k env31 úseku. Toto zjištění bylo překvapivé, protože env53 a env31 peptidy nevykazovaly žádnou reaktivitu, když byly potaženy přímo na pevné fázi.

Proto byly peptidy syntetizovány s použitím technologie popsané přihlašovatelem dříve (ve WO 93/18054). Byly syntetizovány následující peptidy: peptid env35A-biotin

NH₂-SNSSEAADMIMHTPGCV-GKbiotin (sekv. id. č. 51)

Zahrnující aminokyseliny 208 až 227 z HCV polyproteinu v El úseku

Peptid biotin-env53 ('epitop A') biotin-GG-ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL-COOH (sekv. id. č. 52) zahrnující aminokyseliny 313 až 332 z HCV polyproteinu v El úseku

Peptid lbEl ('epitop B')

H₂N-YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK-biotin (sekv.

id. č. 53) • · · • * ♦ ·· ·♦ · • · · • · • ·

zahrnující aminokyseliny 192 až 228 z HCV polyproteinu v El úseku a srovnány s reaktivitami peptidů Ela-BB (biotin-GGTPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL, sekv. id. č. 54) a Elb-BB (biotin-GGTPTLAARDASVPTTTIRRHVDLL, sekv. id. č. 55), které pocházejí ze stejného úseku sekvencí genotypu la a lb v daném pořadí a které byly popsány na IXth International virology meeting v Glasgow, 1993 ('epitop C'). Reaktivita panelu HCV sér byla testována na epitopech A, B a C a epitop B byl také srovnáván s env35A (ze 47 HCV-pozitivních sér bylo 8 pozitivní na epitop B a žádné nereagovalo s env35A). Reaktivita k epitopům A, B a C byla testována přímo na biotinylovaných peptidech (50 μg/ml) navázaných na streptavidinem potažených destičkách, jak bylo popsáno v příkladu 6. Epitopy A a B byly nepochybně nejreaktivnější, zatímco epitopy C a env35A-biotin byly mnohem méně reaktivní. Stejná série pacientů, která byla monitorována na reaktivitu ke kompletnímu El proteinu (příklad 7.1.), byla testována na reaktivitu k epitopům A, B a C. Malá reaktivita byl pozorován k epitopu C, zatímco epitopy A a B reagovaly s většinou sér, jak ukázáno na obrázcích 15, 16, 17 a 18. Nicméně nezdálo se, že protilátky proti nejreaktivnějŠímu epitopu (epitop A) předpovídaly remisi nemoci, zatímco antilbEl protilátky (epitop B) byly přítomny téměř výlučně u dlouhodobě reagujících osob na začátku IFN léčby. Proto bylo ukázáno, že anti-lbEl (epitop B) protilátky a anti-env53 (epitop A) protilátky jsou užiteční ukazatelé prognózy onemocnění hepatitidou C. Epitop env53 může být výhodně použit pro detekci zkříženě reaktivních protilátek (protilátky, které reagují zkříženě mezi hlavními genotypy) a protilátky k env53 úseku mohou být velmi užitečné pro univerzální detekci El antigenu v séru nebo jaterní tkáni. Monoklonální protilátky, které rozpoznávají env53 úsek reagovaly s náhodnou knihovnou epitopů. Ve 4 klonech, které reagovaly při imunitním

« · • · • φ • * φ φφ screeningu s monoklonální protilátkou 5E1A10, byla přítomna sekvence -GWD-. Pro její analogii s univerzální HCV sekvencí přítomnou ve všech HCV variantách v env53 úseku, se předpokládá, že sekvence AWD obsahuje základní sekvenci z env53 zkříženě reaktivního myšího epitopu. env31 nepochybně také obsahuje variabilní úsek, který může obsahovat epitop v amino-koncové sekvenci -YQVRNSTGL- (sekv. id. č. 93) a může být použitelný pro diagnózu. env31 nebo El-31, jak ukázáno v tabulce 3, je část peptidu lbEl. Peptidy El-33 a El-51 také reagovaly do určité míry s myšími protilátkami a peptid El-55 (obsahující variabilní úsek 6 (V6) , zahrnující aminokyselinové polohy 329-336) také reagoval s některými séry pacientů.

Anti-E2 protilátky nepochybně sledovaly jiný typ než antiEl protilátky, obzvláště u pacientů s dlouhodobou reakcí na léčbu. Proto je jasné, že pokles anti-obalových protilátek nemohl být měřen tak účinně testem používajícím rekombinantní E1/E2 protein jako testem používajícím jednotlivý anti-El nebo anti-E2 protein. Anti-E2 reakce by nepochybně zastřela anti-El reakci v testu měřícím oba druhy protilátek současně. Proto bylo ukázáno, že schopnost testovat anti-obalové protilátky k jednotlivým El a E2 proteinům je použitelná.

7.4. Mapování anti-E2 protilátek

Ze 24 anti-E2 Mab jen tři kompetovaly o reaktivitu k rekombinantnímu E2 s peptidy, z nichž dva reagovaly s HVRI úsekem (peptidy E2-67 a E2-69, označené jako epitop A) a jeden, který rozpoznával epitop kompetovaný peptidem E2-13B (epitop C) . Většina myších protilátek rozpoznávala konformační anti-E2 epitopy (obrázek 19) . Humánní reakce na HVRI ' (epitop A) a v menším rozsahu na HVRII (epitop B) a třetí lineární úsek epitopu (kompetovaný peptidy E2-23, E2-25 nebo E2-27, označený epitop E) a čtvrtý lineární úsek epitopu (kompetovaný • 0 *

• 0 « • «0 • · « • · 0 ’ ·* 0 ·· «« •0 «0 » »« « » · *♦ ί · · · » · « 0

0« 0« >•0 0 0 peptidem Ε2-17Β, epitop D) byly také často pozorovány, ale většina sér reagovala s konformačními epitopy (obrázek 20) . Tyto konformační epitopy mohly být seskupeny podle svých relativních poloh takto: IgG protilátky v supernatantu hybridomů 15C8C1, 12D11F1, 9G3E6, 8G10D1H9, 10D3C4, 4H6B2, 17F2C2, 5H6A7, 15B7A2 rozpoznávající konformační epitopy byly purifikovány pomocí protein A afinitní chromatografie a výsledné IgG v koncentraci 1 mg/ml byly biotinylovány v borátovém pufru v přítomnosti biotinu. Biotinylované protilátky byly odděleny od volného biotinu gelovou filtrační chromatografií. Spojené frakce biotinylovaných protilátek byly naředěny 100 až 10 000 krát. E2 protein navázaný k pevné fázi byl detekován biotinylovaným IgG v přítomnosti 100 násobného množství nebiotinylované kompetující protilátky a pak byl detekován streptavidinem značeným alkalickou fosfatázou.

Procenta kompetice jsou uvedena v tabulce 6. Na základě těchto výsledků mohly být znázorněny 4 úseky konformačního anti-E2 epitopu (epitopy F, G, H a I) (viz obrázek 38). Alternativně tyto Mab mohou rozpoznávat mutantní lineární epitopy, které nejsou reprezentovány peptidy použitými v této studii. Mab 4H6B2 a 10D3C4 kompetovaly o reaktivitu s 16A6E7, ale na rozdíl od 16A6E7 nerozpoznávaly peptid E2-13B. Tyto Mab mohou rozpoznávat varianty stejného lineárního epitopu (epitop C) nebo rozpoznávají konformační epitop, který je stericky bráněn nebo mění konformaci po vazbě 16A6E7 k úseku E2-13B (epitop H).

*· ·*··

Příklad 8

El glykosylační mutanty

8.1 Úvod

El protein kódovaný vvHCVIOA a E2 protein kódovaný vvHCV41 až 44 exprimovaný savčími buňkami obsahuje 6 a 11 sacharidových skupin, v daném pořadí. To mohlo být ukázáno inkubací lyzátu buněk RK13 infikovaných vvHCVIOA nebo infikovaných vvHCV44 s klesajícími koncentracemi glykosidáz (PNGase F nebo Endoglykosidáza H, (Boehringer Mannhein Biochemica) podle istrukcí výrobce), takže proteiny v lyzátu (včetně El) jsou částečně deglykosylovány (obr. 39 a 40, v daném pořadí).

Mutanty postrádající některá glykosylační místa mohou umožňovat selekci obalových proteinů se zlepšenou imunologickou reaktivitou. Například u HIV bylo zjištěno, že proteiny gpl20 postrádající určité vybrané sacharidové adiční motivy jsou obzvláště užitečné pro diagnostické nebo vakcinační účely. Přidání nového oligosacharidového postranního řetězce do hemaglutininu „únikové („escape) mutanty chřipkového viru A/Hong Kong/3/68 (H3N2) zabrání reaktivitě s neutralizující monoklonální protilátkou (Skehel et al, 1984). Když byla zavedena nová glykosylační místa do hemaglutininu chřipky místně specifickou mutagenezí, byly pozorovány překvapivé antigenní změny svědčící pro to, že sacharidy slouží jako modulátor antigenicity (Gallagher et al., 1988). V další analýze bylo odstraněno 8 sacharidových adičních motivů povrchového proteinu gp70 viru myší Friendovy leukémie. Ačkoli sedm mutací neovlivnilo infekčnost viru, mutace čtvrtého glykosylačního signálu vzhledem k aminokoncové části měla za následek neinfekční fenotyp (Kayman et ··· · ' A - *· ·· * * ♦ » · a íí · · · ·» · * · · • · « .

* · a <

9 9 9 al., 1991). Kromě toho v oboru je známo, že přidání N-navázaných sacharidových řetězců je důležité pro stabilizaci skládání meziproduktů, a tedy pro účinné skládání, prevenci špatného složení a degradace v endoplazmatickém retikulu, oligomerizace, biologické aktivity a transportu glykoproteinů (viz přehledy Rose et al., 1988, Doms et al., 1993, Helenius, 1994).

Po porovnání sekvencí HCV genotypů různých obalových proteinů může být odvozeno, že není vyžadováno všech 6 glykosylačních míst na HCV podtypu lbEl proteinu pro řádné skládání a reaktivitu, protože některá místa v určitých (pod)typech nejsou přítomna. čtvrtý sacharidový motiv (na Asn251) , přítomný u typů lb, 6a, 7, 8 a 9, chybí u všech dnes známých dalších typů. Tento sacharidový adiční motiv může být mutován za vzniku typu lbEl proteinu se zlepšenou reaktivitou. Také sekvence typu 2b ukazují zvláštní glykosylační místo v úseku V5 (na Asn299). Izolát S83, patřící ke genotypu 2c, dokonce postrádá první sacharidový motiv ve VI úseku (na Asn) , zatímco je přítomný na všech dalších izolátech (Stuyver et al., 1994). Nicméně dokonce u kompletně konzervativních sacharidových adičních motivů nemusí být přítomnost sacharidu vyžadována pro skládání, ale může mít úlohu pro únik imunitnímu dozoru. Proto identifikace sacharidových adičních motivů, které nejsou vyžadovány pro řádné skládání (reaktivitu) není zřejmá a každá mutanta musí být analyzována a testována na reaktivitu. Mutageneze glykosylačního motivu (sekvence NXS nebo NXT) může být dosaženo buď mutací kodonů pro N, S nebo T takovým způsobem, že tyto kodony kódují aminokyseliny odlišné od N v případě N, a/nebo aminokyseliny odlišné od S nebo T v případě S a v případě T. Alternativně X poloha může být mutována na P, protože je známo, že NPS nebo NPT nejsou často modifikovány sacharidy. Po potvrzení, které sacharidové adiční motivy jsou vyžadovány pro skládání a/nebo ► 1

6« reaktivitu a které nejsou, mohou být dělány kombinace těchto mutací.

···· «

8.2. Mutageneze El proteinu

Všechny mutace byly prováděny na El sekvenci z klonu HCCI10A (sekv. id. č. 5). První kolo PCR bylo prováděno s použitím sense primeru „GPT (viz tabulka 7) zaměřeným na GPT sekvenci lokalizovanou v protisměru pozdního promotoru 11K vakcínie a antisense primeru (nazvaného GLY#, přičemž # reprezentuje počet glykosylačních míst, viz obr. 41) obsahujícího požadovanou změnu báze, aby se dosáhlo mutageneze. šest GLY# primeru (každý specifický pro dané glykosylační místo) bylo navrženo takto:

Modifikace kodonu kódujícího N-glykosylovaný Asn (AAC nebo AAT) na Gin kodon (CAA nebo CAG) . Byl vybrán glutamin, protože je velmi podobný asparaginu (obě aminokyseliny jsou neutrální a obsahují nepolární zbytky, glutamin má delší postranní řetězec (ještě jedna -CH₂- skupina).

Zavedení umlčených mutací v jednom nebo několika kodonech po směru od glykosylačního místa, aby se vytvořilo nové unikátní nebo vzácné (např. druhé Smál místo pro ElGly5) místo restrikčního enzymu. Bez modifikace aminokyselinové sekvence tato mutace poskytne způsob, jak rozlišit mutované sekvence od originální El sekvence (pvHCV-10A) nebo jednu od druhé (obrázek 41) . Toto další restrikční místo může také být použitelné pro konstrukci nových hybridních (dvojnásobných, trojnásobných, apod.) glykosylačních mutant.

nukleotidů prodlužuje 5' z prvního neodpovídajícího nukleotidu a 12 až 16 nukleotidů nastavuje 3 konec. Tabulka 7 zobrazuje sekvence šesti GLY#-primerů překrývajících sekvence N-spojených glykosylačních míst.

• · . ·· *· ; ·» · · • · ·· · ί 1! · · · ¹ · · · · ·· ·♦ •· ·· • · · • ·« > · · • · · ·· *· ·· ···«· ¹ · · <

·· ·«

Pro místně cílenou mutagenezi bylo použito metody chybného párování („mispriming) nebo „prodlužování překrývajících se úseků („overlap extension) (Horton, 1993). Koncept je znázorněn na obrázcích 42 a 43. Nejdříve byly amplifikovány dva oddělené fragmenty z cílového genu pro každé mutované místo. PCR produkt získaný z 5' konce (produkt GLY#) byl (viz tabulka 7) a amplifikován s 5' s příslušnými 3' sense GPT primerem antisense GLY# primery. Druhý fragment (produkt OVR#) byl amplifikován s 3' antisense TKR primerem a příslušnými 5' sense primery (OVR# primery, viz tabulka 7, obrázek 43).

OVR# primery cílí část sekvence GLY# primeru. Proto tyto dvě skupiny PCR produktů sdílejí překrývající se úsek totožné sekvence. Když jsou tyto meziprodukty smíchány (GLY-1 s OVR-1, GLY-2 s OVR-2, apod.), denaturovány při vysoké teplotě a opět napojeny, horní sense vlákno produktu GLY# může nasedat k antisense vláknu produktu OVR# (a naopak) takovým způsobem, že tato dvě vlákna slouží jako primery pro sebe navzájem (viz obr. 42.B.). Extenze (prodloužení) nasednutého překrývajícího se úseku Taq polymerázou během dvou PCR cyklů vytvořila mutantní molekulu ElGly#, která nese mutaci Dostatečná množství kompletní porušující glykosylační místo čísla #.

E1GLY# produktů pro klonování byly vytvořeny ve třetím PCR pomocí běžného souboru dvou vnitřních sdružených primerů. Tyto dva nové primery příslušně překrývají 3' konec promotoru 11K vakcínie (sense GPT-2 primer) a 5' konec místa thymidinkinázy vakcínie (antisense TKR-2 primer, viz tabulka 7). Všechny PCR podmínky byly prováděny podle popisu v práci autorů Stuyver et al. (1993).

Každý z těchto PCR produktů byl klonován EcoRI/BamHI štěpením do EcoRI/BamHI štěpeného vektoru vakcínie obsahujícího originální El sekvenci (pvHCV-10A).

Vybrané klony byly analyzovány na délku inzertu ·· ·· • · ί* • · ·· „ • · · · ♦ · • · · · · ·· ·· ···..··. .·♦···· • ·· · · .· :·?··· ·.

·· ·· » · · , »· ··

EcoRI/BamHI štěpením a na přítomnost každého z nových restrikčních míst. Sekvence překrývajících se mutovaných míst byly potvrzeny dvojvláknovým sekvencováním.

8.3. Analýza El glykosylačních mutant

Vycházeje ze 6 plazmidů obsahujících mutantní El sekvence, jak bylo popsáno v příkladu 8.2, byly tvořeny rekombinantní viry vakcínie rekombinací s virem vakcínie divokého typu, jak bylo popsáno v příkladu 2.5. Ve stručnosti, kultivační láhve o objemu 175 cm² se subkonfluentními buňkami RK13 byly infikovány 6 rekombinantními viry vakcínie nesoucími mutantní El sekvence, a také viry vvHCV-10A (nesoucími nemutovanou El sekvenci) a viry vakcínie divokého typu. Buňky byly lyžovány po 24 hodinách infekce a analyzovány Western bloty, jak bylo popsáno v příkladu 4 (viz obrázek 44A). Všechny mutanty ukazovaly rychlejší pohyblivost (odpovídající menší molekulové hmotnosti přibližně 2 až 3 kD) na SDS-PAGE než originální El protein, což potvrzovalo, že nebyla přidána jedna sacharidová skupina. Rekombinantní viry byly také analyzovány PCR a analýza restrikčními enzymy, aby se potvrdila totožnost různých mutant. Obrázek 44B ukazuje, že všechny mutanty (jak ukázáno na obrázku 41) obsahovaly očekávaná další restrikční místa. Jiná část buněčného lyzátu byla použita k testování reaktivity různých mutant testem ELISA. Lyzáty byly naředěny 20 krát a přidány do jamek mikrotitrační destičky potažených lektinem GNA, jak bylo popsáno v příkladu 6. Zachycené (mutantní) El glykoproteiny byly ponechány reagovat s 20 krát naředěnými séry 24 HCV infikovaných pacientů, jak uvedeno v příkladu 6. Hodnoty poměru signálu k pozadí (S/N) (OD GLY#/OD divokého typu) pro šest mutant a El jsou ukázány v tabulce 8. Tabulka také ukazuje poměry mezi S/N hodnotami GLY# a El proteinů. Je nutné rozumět, že přístup používající buněčné lyzáty různých mutant pro srovnání reaktivity se séry pacientů • · • · • · · · · ♦ · ·· · • · · · · · • · · · · ·· · · může mít za následek postřeh, že jsou důsledkem různých hladin exprese než hladin reaktivity. Takové potíže mohou být překonány purifikaci různých mutant, jak bylo popsáno v příkladu 5 a testováním totožných množství všech různých El proteinů. Nicméně výsledky ukázané v tabulce 5 již prokázaly, že odstranění 1. (GLYl), 3. (GLY3) a 6. (GLY6) glykosylačního motivu snižuje reaktivitu některých sér, zatímco odstranění 2. A 5. Místo ne. Zdá se, že odstranění GLY4 zlepšuje reaktivitu některých sér. Tato data indikují, že různí pacienti reagují odlišně na glykosylační mutanty podle předkládaného vynálezu. Takové mutanta El proteinů mohou být tedy použitelné pro diagnózu (screening, potvrzení, prognózu, apod.) a prevenci HCV onemocnění.

Příklad 9

Exprese HCV E2 protein v glykosylačně deficitních kvasinkách

E2 sekvence odpovídající klonu HCCL41 byla vybavena pre/pro signální sekvencí α-konjugačního faktoru („a-mating factor”), vloženou do kvasinkového expresního vektoru a buňky S. Cerevisiae transformované tímto konstruktem sekretovaly E2 protein do růstového média. Bylo pozorováno, že většina glykosylačních míst byla po expresi takového konstruktu v kmenech S. Cerevisiae modifikována glykosylacemi s vysokým obsahem manózy (obrázek 45). To mělo za následek příliš vysoký stupeň heterogenity a zakrytí reaktivity, což není žádoucí ani pro vakcínu ani pro diagnostické účely. Aby se překonal tento problém, mutanty S. Cerevisiae s modifikovanými glykosylačními dráhami byly vytvořeny selekcí z klony rezistentních na vanadát. Tyto klony byly analyzovány na modifikované glykosylační dráhy analýzou molekulové hmotnosti ·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· a heterogenity glykoproteininvertázy. Toto umožnilo původcům identifikovat různé glykosylačně deficitní mutanty S. Cerevisiae. E2 protein byl následovně exprimován v některé ze selektovaných mutant a ponechán reagovat s monoklonální protilátkou, jak bylo popsáno v příkladu 7, na Western blotech, jak bylo popsáno v příkladu 4 (obrázek 46).

Přiklad 10

Obecná využitelnost

Předkládané výsledky ukazují, že je vyžadován nejen dobrý expresní systém, ale také dobrý purifikační protokol pro dosažení vysoké reaktivity HCV obalových proteinů se séry humánních pacientů. To může být dosaženo s použitím řádného expresního systému pro HCV obalový protein a/nebo purifikačních protokolů podle předkládaného vynálezu, které zaručují zachování přírodního skládání proteinu a purifikačních protokolů podle předkládaného vynálezu, které garantují eliminaci kontaminujících proteinů a které zachovávají konformaci, a tedy reaktivitu HCV obalových proteinů. Množství purifikovaného HCV obalového proteinu potřebného pro diagnostické screeningové testy je v rozsahu gramů za rok. Pro účely vakcín by bylo potřebné ještě vyšší množství obalového proteinu. Proto systém viru vakcínie může být použit pro selekci nej lepších expresních konstruktů a pro omezené přenesení do většího měřítka a exprese ve velkém měřítku a purifikace jednotlivých nebo specifických oligomerních obalových proteinů obsahujících sacharidy s vysokým obsahem manózy může být dosaženo při expresi několika kmeny kvasinek. Například v případě hepatitidy B výroba HBsAg ze savčích buněk byla mnohem nákladnější ve • · · · • · • · fr • · srovnání s vakcínami pro hepatitidu B pocházejících z kvasinek.

Způsob purifikace popsaný v předkládaném vynálezu může také být použit pro virové obalové proteiny obecně. Příklady jsou proteiny pocházející z Flavivirů, nově objevených virů hepatitidy GB-A, GB-B a GB-C, Pestivirů (jako například virus bovinního virového průjmu (BVDV), virus cholery vepřů (HCV), „Border Disease Virus (BDV)), ale také méně příbuzné viry, jako například virus hepatitidy B (hlavně pro purifikace HBsAg).

Způsob purifikace obalových proteinů podle předkládaného vynálezu může být použit pro intracelulárně, a také extracelulárně exprimované proteiny v buňkách nižších nebo vyšších eukaryota nebo v prokaryota, jak je uvedeno detailně v popise.

Přiklad 11

Průkaz profylaktické a terapeutické použitelnosti

Onemocnění jater šimpanzů chronicky infikovaných HCV může být redukováno imunizací s El. Nicméně byly nutné mnohonásobné imunizace, aby se dosáhlo významné imunitní reakce. Odborník si uvědomí, že virová persistence je vytvářena imunitní je buď organizována virem samotným nebo se analyzovalo, jestliže taková imunitní modulace existuje u HCV, byla srovnávána imunitní reakce proti El a NS3 u naivních a chronicky infikovaných šimpanzů. Protože byla předvídána menší reakce u chronicky infikovaných zvířat, byla tato skupina zvířat vybrána pro pečlivější plán imunizace zahrnující: použití adjuvans, o kterém bylo na myších modulací, která hostitelem. Aby • ·

100

prokázáno, že je silnější pro indukci buněčné reakce (tabulka 9) ve srovnání s alumem, což bylo adjuvans použité pro naivní zvířata a imunizační program pro chronicky infikovaná zvířata se skládal z 12 imunizací ve srovnání s 6 pro naivní zvířata (obr. 47).

Ačkoli počet imunizovaných zvířat neumožnil statistický rozbor, v humorálních reakcích může být detekována následující jasná tendence (tabulka 10) : počet imunizací pro sérokonverzi je nižší u naivních zvířat a velikost imunitní reakce byla podstatně větší u naivních zvířat, 2/3 infikovaných zvířat nedosáhly hladiny 10 interních jednotek, dokonce ani po 12 imunizacích.

Analýza buněčné reakce po třech imunizacích odhalila ještě větší rozdíl (obr. 48a-d) včetně: El-specifická proliferace T lymfocytů byla téměř neexistující u chronicky infikovaných zvířat, zatímco jasná stimulace může být viděna u naivního uspořádání, měření IL-2 potvrdila, že nízká stimulace kompartmentu T lymfocytů u chronických nosičů, a nepochybná Th2 (IL-4) reakce u naivních zvířat byla indukována, jak bylo očekáváno u vakcíny obsahující alum jako adjuvans.

To potvrzuje, že alespoň El imunizace poskytuje profylaktický účinek u naivních zvířat a svědčí pro to, že E2 a/nebo kombinace El a E2 proteinů a/nebo peptidů může poskytnout použitelné terapeutické a/nebo profylaktické výhody u naivních zvířat.

„Zhoršení indukce jak buněčné tak humorální reakce proti HCV El antigenu může být pouze částečně překonáno mnohonásobnými imunizacemi, jak prokázáno následujícími výsledky: bylo pozorováno zvýšení titru protilátek po každé injekci, ale hladiny jako u naivních zvířat nebyly dosaženy u 2/3 zvířat a proliferativní reakce T lymfocytů zůstaly velmi nízké (obr. 49) . Výsledky testu ELISPOT ukazují nicméně menší

101 zvýšení IL-2 (neukázáno) , žádnou změna v IFN-g (neukázáno) a zvýšení IL-4 (obr. 49), které indikuje, že reakce Th2 typu jsou snadněji indukované. Bylo pozorováno, že IL-4 zůstává na nízkém stupni ve srovnání s hladinou dosaženou po třech imunizacích u naivních zvířat.

Zcela podobné pozorování bylo učiněno u NS3 imunizací, kdy bylo použito ještě silnější adjuvans (RIBI) u chronicky nemocného šimpanze. Ve srovnání s formulací s alumem u naivních zvířat bylo zaznamenáno následující: indukované protilátkové titry jsou srovnatelné u obou skupin (neukázáno) a jak sekrece cytokinů tak proliferace T lymfocytů je téměř nepřítomná u zvířat chronicky nemocných ve srovnání s reakcemi naivních zvířat (obr. 49a-b).

V současné době existují některé indikace, že imunitní reakce proti HCV u chronických nosičů jsou nízké nebo alespoň nedostačující pro umožnění clearance infekce. Výše uvedené výsledky podporují hypotézu, že chronických nosičů může být poškozen nereagují na HCV antigeny tak účinně jako v naivní situaci.

imunitní systém HCV a že chroničtí nosiči

Ve studii autorů Wiedmann et al. (Hepatology, 2000, 31:

230-234:

vakcinace proti HBV byla méně účinná

HCV chronických nosičů, což ukazuje, že takové imunitní zhoršení není omezeno na HCV antigeny. Autoři De Maria et al. (Hepatology, 2000, 32: 444-445) tato data potvrdili a navrhovali upravené vakcinační dávkovači režimy pro HCV pacienty. Data předložená v tomto textu ukazují, že zvýšení počtu imunizací může opravdu zesílit humorální reakce, ale že buněčné (obzvláště Thl) reakce je obtížné indukovat, dokonce i když jsou použita silná adjuvancía. Může být výhodné začít imunizaci v době antivirové terapie, když imunitní systém je náchylnější k reakci.

• · · ·

102 • · · ·· ··

Tabulka 1

Rekombinantní plazmidy vakcinie a viry

Název plazmidu	Název	Konstrukce subklonu cDNA	Délka (nt/aa)	Vektor použitý pro inzerci
pvHCV-lSA	E1s	EcoR 1 - Hind III	472/157	pgptATA-18 j
pvHCV-12A	E1s	EcoR I - Hind III	472/158	pgptATA-18 \|
pvHCV-9A	E1	EcoRI-HindII!	'631/211	pgptATA-18
pvHCV-UA	Els	EcoRI-Hind lil	625/207	pgptATA-18
pvHCV-17A	Els	.. EcoRI-HindIII	625/208	. pgptATA-18
pvHCV-10A	El	.EcoRI-Hind II!	783/252 '	pgptATA-18 ·
pvHCV-ISA	jádro	Acc 1 (KI) - EcoR 1 (KI)	403/130	pgptATA-18 I
pvHCV-34	jádro	' · Acc 1 (W) - Fsp 1	595/197' .	pgptATA-18 \|
pvHCV-33	jádro-E1	Acc 1 (KI)	1150/380	pgptATA-18 l
pvHCV-35	jádro-E1b.his	EcoR 1 - BamH 1 (KI)	1032/352.	pMS-68 \|
pvHCV-36	jádro-E1n.hls	EcoR 1 - Nco 1 (W)	1106/376	pMS-66
pvHCV-37	E1i	Xma 1 - BamH 1	711/239	pvHCV-10A
pvHCV-38	Elis	EóoRI-BstEII	553/183	pvHCV-11A
pvHCV-39	E1ib	EcoR 1 - 'BamH 1	960/313	pgsATA-18
pvHCV-40 .	E1ib.hls	' EcoR 1 - BamH 1 (KI)	- 960/323	pMS-66
pvHCV-41	E2bs	BamH 1 (KI)-AlwN 1 (74)	1005/331	pgsATA-18
pvHCV-42	E2bsJiís	BamH I (KI)-AlwN I (T4)	1005/341	pMS-66
pvHCV-43	E2ns	Nco 1 (KI) - AlwN 1 (T4)	932/314	pgsATA-18
pvHCV-44	E2ns.hls	Nco I (KI) - AlwN-l (T4)	932/321 .	pMS-66
• pvHCV-62 .	E1s (type 3a)	EcoR 1 - HindlII	625/207 . '	• pgsATA-18
pvHCV-63	E1s(type5)	EcoRI-HindIII	625/207	pgsATA-18
pvHCV-64	E2	BamH 1 - Hind Itl	1410/483	pgsATA-18
pvHCV-65	E1-E2	BamH 1 - Hind lil	2072/691	pvHCV-10A
pvHCV-SS .	jádro-E1-E2	BamH 1 - Hind III	2427/809	pvHCV-33

nt: nukleotid aa: aminokyselina KI: doplnění užitím Klenow DNA Pol

T4 : doplnění užitím T4 DNA Pol

Poloha: poloha aminokyseliny v HCV polyproteinové sekvenci

103

Tabulka 1 - pokračování

Rekombinantní plazmidy vakcínie a viry

Název plazmidu	Název	Konstrukce subklonu HCV cDNA	Délka (nt/aa)	Vektor I použitý pro inzerci
pvHCV-81	ET-GLY 1	EcoRI - BamH I	783/262	pvHCV-10A
pvHCV-82	ET-GLY 2	EcoRI BamH I	783/262	pvHCV-10A
pvHCV-B3	ΕΓ-GLY 3	EcoRI - BamH I	7B3/262	pvHCV-10A
pvHCV-84.	ΕΓ-GLY 4	,-'EcoRI-BamHI	.783/262 '	pvHCV-10A
pvHCV-85 '	ET-GÍ.Y 5	EcoRI-BamH i	783/262	pvHCV-10A í
pvHCV-86	ET-GLY 8	EcoRI - BamH I	783/262	pvHCV-10A j

nt: nukleotid aa: aminokyselina KI: doplnění užitím Klenow DNA Pol

T4: doplnění užitím T4 DNA Pol

Poloha: poloha aminokyseliny v HCV polyproteinové sekvenci

Tabulka 2

Shrnutí anti-El testů

S/N ± SD (průměrný titr anti-El)

	Začátek léčby	Konec léčby	Sledováni
LTR	6.94 + 2.29(1*3946)	4.46 ± 2.69 (1568)	259 + 2.69 (1:175)
NR	5.77 + 3.77(1*1607) '	5.291359(1*1080)	6.08+3.73 (11978)

LTR: dlouhodobě udržovaná reakce po dobu delší než 1 rok NR: žádná reakce, reakce s relapsem nebo parciální reakce

9 • · · ·

		• ·	•9 99	·· 99 99
		104
Tabulka	3
Syntetické peptidy pro kompetitivní	studie
PROTEIN	PEPTID	AMINOKYSELINOVÁ SEKVENCE	POLOHA	SEKV. ID. Č.
E1	Ě1-31	LLSCLTVPASAYQVRN5TGL	161-200	56
	E1-33	QVŘNSTGLYHVTNDCPNSSI'	193-212	57
	E1-35	NDCPNSSIVYEAHQAILHTP	205-224	58
	E1-35A	ŠNSŠh/YÉAADMIMHTPGCV	208-227	59
	E1-37	HOAILHTPGCVPCVREGNVS	217-236	60
	E1-39	CVREGNVSRCWVAMTPTVAT	229-248	51
	E1-41	AMTPTVATRDGKLPATQLRfl ·	241-260	62
	E1-43	LPATQLRRHIDLLVGSATLC	253-272	63
	E1-45	LVGSATLCSALYVGDLCGSV ·	265-284	64
	E1-49	QLFTFSPRRHWTTQGCNCSI	289-308	65
	E1-51	TQGCNCSlYPGHITGHRMAW	301-320	66
	E1-53	ÍTGHRMAWDMMMNWSPTAAL	313-332	67
	E1-55	NWSPTAALVMAQLLRIPQAI	325-344	68
	E1-57	LLRIPQAILDMIAGAHWGVL	337-35S	69
	E1-59	AGAHWGVLAGIAYFSMVGNM	349-368	70
	E1-63	WLLLFAGVDAETÍVSGGQA	373-392	71
E2	E2-67	SGLVSLFTPGAKQNIQLINT	397-415	72
	E2-69	QNIQLJNTNGSWHINSTALN	409-428	73
	E2-53B	LNCNESLNTGWWLAGUYQHK	427-446	74
	E2-$1B	AGUYQHKFNSSGCPERLAS	439-458	75
	E2-1B	gcperLascrpltdfdqgwg	451-470	76 '
	E2-3B	TDFOQGWGPISYANGSGPOQ	463-482	77
	E2-5B	ANGSGPOQRPYCWHYPPKPC	475-494	78
	E2-7B	WHYPPKPCGIVPAKSVCGPV	487-506	79
	E2-9B	AKSVCGPVYCFTPSPVWGT	499-518	80
	E2-11B	PSPWVGTTDRSGAPTYSWG	511-530	81
	E2-138	GAPTYSWGENDTDVFVLNNT	523-542	62
	E2-17B	GNWFGCTWMNSTGFTKVCGA	547-565	83
	E2-19B	GrTKVCGAPPVCIGGAGNNT	559-578	84
	E2-21 '	IGGAGNNTÍHCPTDCFRKHP	571-590	85
	E2-23	TDCFRKHPDATYSRCGSGPW	583-602	86
	E2-25	SRCGSGPWrrpŘCLVDYPYR	595-614	87
	E2-27	CLVDYPYHLWHYPCTINYTI	607-823 ·	88
•	E2-29	PCTINYTIFKIRMYVGGVEH	619-638	89
	E2-31	MYVGGV&O.EAACNWPGE	631-650	90
	E2-33	ÁCNWTPGERCDLEDRDRSEL	643-662	91
	E2-35	' EDRĎRSELSPLLLTrrQWQV	655-574	92

• · « ·

LO

O nj *

H ·· ·· ·« * * · · « « • · ·· 9 9 • · · · * ♦ · • · « · · ·

9999 99

I • ·

•β

X β

ω •H

O (fl tt

CM <D •rl

X β

X m

jH β

X

0) rd

O β

ω (fl >υ β

X!

>Φ

X °B

P tt

X ω x '<fl I—i H X O P tt

X o 5>i > O i—I (fl X o β

H

X (0 (fl β

>0) e

N «Et a

«

5* ,S aa í= <s a s β 5 i?

o c

g B a

P-.

5!

_ o 5 S « ea S S a a «

Si » C e «£» n a e> «3

6» «» «R

Ve Ve řj ef er S

Ve P P S 3 S «*. R «I <S eť ·· *-» c *ra •ra >

> o « O TJ ra tj ra '5. Jí « ra « _oΦ o o o £ # ra $ c c c ^c

S ^fc ™ (O rΦ •H tt (fl

P

Φ

X β

X

X '(0 >υ o

tt (0 β

•P &

β β

W

Ή

Ν

Η

X

Ο β

X ο

X β

β β

'β β

>

ο

Ρ ω

β ι—I

X β

X *

LO ο

«·.

ο

V

ÍP

X ο

β

X

CU •X

-X <ο ο

(L)

Ή

Ό

4-1

W

Ή

4->

<ϋ

Ο

Tabulka

Οί <ΰ (Τ

Fl

F

Ή

Ν

0) ε

I-1

Ή

XS

Ν

Ο

Ρί §

Ε

5?

Ž·,

Ο

Sr ^cg -g za JZ

S CL» '**· C tfi

S 5 íS Z3 φφ ·· • · φ φ • φ ·♦ φ φ φ φ φ · φ · φφ φφ

co	tfj	v*	σ>
f*.	A	€0	CM
O	CM	O	co
v*	Ί···	co ,	co
O	a	σ	c>

1π S Ο»

Ο δ 04 ο ο ο

CM

S

Φ
o.	Φ ‘5.
ra
Φ	ra
jz	Φ
Φ	o
33	Φ
8	c o
0-

O s

W o

o

E ta o

I (Z>

o o

E

CM ♦ · φ φ φ φ · φ · · φ φ φ φφ ΦΦΦ • φ · φ·· φ φ φφφφ φφφφ • Φ φφ φφ *φ

ID

O

·.

O v

4->

O

C

Ό

O

Λ

O-i

-K ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · * · • · 99 9 9 ·· · · · • * · · t · « · ··· · · · · 9 9 9 9 9 9 9 · 9

9» 99 99 99 9· ·· ··· ·

Kompetiční experimenty mezi myšími E2 monoklonálními protilátkami

. Q 002;

Cl o α 2 o α 03 Z

U7 W CV

Q o wZ

Ol

OJ I < oj < v“ m <g o ta I co w oj

O

C >φ

Ό 'fO >

O

M

Cu <u o

II

Q

Z ♦· • 0 0 ·

0 0« « 0 0 0

0 0 0 «0 • 0 0000 *< 00 • 0 0 0 · · *

0 00 0 0 « • 00 000 0 « 0 ·0 0 0 0« · 0· 00 00 00

O r-1

H u

o w

-H o

β o

>

AC

0)

CO

Ή c

i—I 'tri β •H

Cn o

«leioie iDieigiaioioiaialaiÍgibtb

Tabulka

co

Ifl

co

v-

CM

co

Ul

co

CM

T~

CM

>-

cd

Cd

|1

Η

_k <

>-

>

_l

-J

>

·>

>

Q_

Q. ÍH

ií

ΓΠ

o

O

H

r~

o

t—

CM

co

VO

co

b-

CO

Ol

O

CO

oo

Ol

o

O

o

O

o

σι

Ol

O)

Ol

V“

'f“

T-

V-

v-

v~

v-

μ

>ó

>Ó

>ó

>o

>ó

>o

>ó

>o

>ci

>ó

>6

>o

>ó

<5

φ

T3

TJ

tj

TJ

T5

TJ

T5

TJ

tj

T>

T5

TJ

TÍ

Ε

>

Jsť

Λί

JZ

_y:

v-

v*

£

β

Φ

Q)

Φ

<l>

(1)

a>

Φ

(!)

CD

Φ

Oli

cz)

(Z)

ω

cz)

w

czi

w

czj

ω

cz)

CZ)

CZl

ω

CZl

CZ)

H β

O

o
μ	Αί
co
Ή	ε
ε	φ
Ή	Ό Φ
β	ι—1
>υ	-β
a:	Ν
•Η	>
β
+->	Φ
C0	υ
Ο	β
β	μ
Ή	β ε
>co
1-1	Ή
β	Ό
Ό	β
Ή	> β
•η	μ
β	co
>	Ό
β	Φ
μ	>β
C0	a

φ	ε
>β	φ
a	ε
5*ί	C0 Ή
Ό	a
•Η
μ	ε
ο
Φ	β
ι—1	>υ
λ:	β
β	μ
β
β)	Ό
β	Η
φ	μ
>Ν	ο
β	φ
μ	ι—1
Ό	AJ
ο	β
CU	Ζ

* 0 · · • 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 • 0 00

0« σ>

o

Analýza El glykosylačních mutant testem ELISA cMrtrtrtrse*-© ·- D N □ B bN B rt tn *- ** ts cm 0 os o — tn b. rt r> N s « in D V Ol to o ř. o; _w- N; W *- cs — rt — N — rt<M©rtCM0« — »oo«r· o tn νγ-οο b o b. rt o ts o> tg TM 0 © US 0 CS 10

N VTN

ONPte^bbN ‘v-covinvotani «— |M 0 0 09 Ρ» O 0 CS — ©—· b- © onebNb-’r s ·· * o β β tm' pm w to r> oi oí ca n dwssta ffl o n r< o n*. w ·— OJ CM U7 Ot tt US O 0 ts O 0 rt tn η β o — o o o b ο α n b b ® o- r· r· ri r· ·“ * ta rss tn Noo β o r* tn x η β » -VOttllTOO NO o o r o a Ott N.O iň 0 to rt o» tn rt tt — —· PÍ rA b-tOCSíS^TMttrS r o o»i0 — to to rt.ra 0 rs tt o b. O » o 0 rs tm b. to rt 0 0 *- 0 β «»~ oi oí η *— OJ rt OJ a rc dnnos® r-ftrDONN Ot ca *- rr bs O 3~ o nnr-v v a © rt r> b> © o a aa a «9 O* f* β us — β β io — rt m » - — *-·· rt »*.

o a - ~ ta 3· *N 0 tt C» rt *ζ rt 0 b. rt

OJ OJ ** OJ rt

D NOb O Γ7*“ ▼ rt oj ® rt τζ to cm oí rí oí tm oj

Ď tt v U) W C O rt r*. b» ·— O rt 04 NOtVO N r- O O C Vb β 17 N D V O B r O O rt OÍ ~ Ot 0» pi CM *· n r? τ w B >7 > >: ξ >. >T ooooooiu XXXXZ Z Z to w 03 m to ta to n ta b. o 0 o to P4 0 V b> rt b. tt O* — X O O O *· t tt π/ μ σι c in 01 -OlOObsCStOO ' Z v ttttN © tt : oj 04 oí oj -v tm oí ri rt rt oj 0 — — CD n v ss. - β © tn tm o ot tn ©

IQ tt 0 0 TM rt I^eowo^cMrata

S^!Ztt«»of©o>*-^;to « 0 <0 *- 10 0 bΤ N« Ctt” Π N 04 tt O NO r- N tfl a *· Q.W OJ rt 04 •0 cm © *- 0 0 aa O rt Ow β rt rt b. tb; © «. -r 0 o- _· — o*·* TM *“ * n tt v«ň ~ o<rt N B - b - 0 t0 rt a tt b« p· m c n β « Ifl β b tňfj

B 0 n © ·** b> 0 *ζ to rt _n 0 v o oí ~ *· ·· ol oiertr-«^0rt« CMrtOO — KS.rt© b· b- rt o 0 bo Γ4 03 0 **. rt rt O b. o to σι cn ta o 0 O- — rs* rt oj *s-n^-mobsrtrt n ntsnntt o τ O «— © O 0 © rt O O B rt rt v- 0 rs » 0 a b » rs n to nn. · ' . 0 O* rt rt 0 0 rt o bo rt O 0 0 0 « <Db o->₍ 0 0 rt oí rí rt o 0 σ··~ <O b (4 iS » srt O brt 0 bts ÍN

O. br v O O 0

V np rt rt β — » rt 0 TM bo 0 eo rt *· n ritt b- ** rt OJ rt TM 0 O CM » « O OJ ts n moNto·· <1- b> o~* 0 (M> rt b· *- rt rt b- o rt β» cm n o~ ^ «·* α 0 oí ri tt rt b> 0 «-> o* o ta cm o~ v « *« 0 0 « rt £ o £ β 0 0

N O O rt -rt tt tt b bo-NlfiOV’“* rtfMtt0rt(MO0 bs b. rt 0 poj rt es bs r> 0 rt rt rt © ·» r> *· © » 0 a n ot 10 o 0 n n Oí CM’CM 0 OJ OJ OJ <D 0 Ol 0 O N 0*0 *-DrtOJttO-ttrt <r> 0 0 rt tt rt rt 0 0 0 rt 0 TM tt ta tn v 0 n ř* 0 e» o o © π tt n r> tm 0 os oj ca τ’©·™©©©©» rt 0» © 0 0 b* oj rs *· 0 κ 0 o- js. 0 OJ rt o OJ TM 0 lb; 0 O ř* rt 0 Ο_φ . ra ri rt 0 rs oí rt rtrtrttntMrtfMwrt©*-«3(Mrt0b0 n © es β» r·n b- r> — o tsi rs rs 0 0 0 rt e> 0 04 ÍO b-. W 01 rt rt rs oí ol to oí o< rt rt**ocra«D0*“oJ rt00rtrt©0s0 0 0 0 rt 0 —

SD O 0 Π 0 0

—4 <bJ wl a_J arJ sro οασοοοω

2ZZZ2ZZ to Ϊ0 W 60 » CO 60 s» w r~ r·

4s

O rj O O o b. «— b.

o u ® . rt rt rt Ol Ο» N D Γ4 ffl b

Λ >·. 0 ο» tt Q JR 0 b. tt e O rs 0 rt SS Ot rt tt to m rt Pt rt

0 0 a rs b·

TM tt O es tt b0 b; CD 0 b» » © © O o o «· TM 0 «q> 0 0 O rt 0 0 o> r* rt 0 rt OJ tt — tm rt oj © oj rs ts rt rt b. 00 b· 0» tt

O tt

O © © rt o

0 br 0 © rt rt 0 a rt rt tfl O 0 _? tt tt rt 0 « rt β cm CM CM tt b. rt 0 tt rt O b. 0 ui tm cn »n «*» b. β» oA tt O rt O> © © © -ro* © n b- m oj o) m CM © *- 0 TM Ο» OJ b. S rt « ©b - b N η β rt © c*. O b- 0 b. » o-α d·^ o

b. o b- — b- ί- rt o- o- © s- rt © 0 a b. m o tm oj rt a tfí’in rt m 0» 0 rt r» o* — q* 0 0 tt 0 *- O> *· 0 rt TM TM 0 © *· b. *. br O TM b. © br rt bo O- b·** κ er> a to 0 0 b- 0 o © 0' d © o

O rt Ml 0 « tt PM — rt © rt © ©fMrtrtoCM rt to O O b. Ο» 0 s- 0 O b* 0 0 0 d o o o d »OJttrt0*· — O b. Ul rt tt *- b. US © rt eert©»01 bs bo 0 0 n* bo rt 0 rt rt rt tt cm N tt ·- rt rt rt CM b. a b> 0» 0 0 0 0 OJ b. tt CM o rt o 0 o- o 0 D CR A q tt o *-’©’© a* « © rt CM Oí © tt rt rt 0 rt © O TM rt 0 bs © . b. Ui 0 0 br © b. n O O rt tt 0 bo 0 © 0 b· o a o* d a rt b* tt rt 10 tt β b a bv-o b csi 0 rt es rt 0 — v rt r» o- O rt a 0 rt rt tt *0 o q* 0 - C® cí © © © rt tt rt rt TM 0- w 0 © 0 0 rt o 0 rt o tt 0 rt 0 0 © — 0 β 0 «Μ o μ- tn rt _o* a ca 0 α β © o © d

CM rt r- 0 b. b- ® b. © tt a rt P4 rj a oí © rt tt cs rt © b. ut *· ICtSbT-ON tt bs bo b. to © © a d v· o’ © o- » © rt bo b- o

K rt rt 0 — b- ·»\S ®. ®. ^e. ®.

to Q O Q O O O rt* ra cn tm © *~rt0rS0o— — oí © T- rt 0 rt rs a 10 PM Cfl © 0 bo tt[O 0 C3 d © O- © bo O bs OJ bs rt ·- CD bs 0 0 «*·. 0 rs eo « u> b- rt rt o © b· 0 sr o cn b- tt 0 0 » d d © © rt ws 0 OJ b*· Λ·Ο 10 O.trs o— 0 en 0» 0

U> — b N b

CM0 0 0*o$ tt α e> o—or·©'·—*— rt CM tt 0 CM 0 r- w a in o π |Q rt 0 0 © w © bo © rs — © g © ts o 0 0 © tt ©’ d oí d rt β bs rs 10 © .0- rt oj rn 10 © N © O © © rt 0 0 tm a rt o en tt o 0 rí ©! a ⁰

U]. tu tu IX) tu US Ň M Jř ϊΒ δ a«J aaJ —4 wJ rj rJ

0000(5 0 tu ωω uj ω 0» rt rt «5 >->·>- >0 >» U -J -4 -J oJ o o o o o

GLYB/U1 0.907134 0.705217 0.054737 0.704104 0.79299 0.72221 0.543702 0.724603 0.519396 1.097197 0.70003 0.992818 13.58091 Ofl 10330

9

110 ·· ♦·

9 9 9

9 99

9 9 9

99

9

9 • 9

9

Tabulka 9

Profil El s adjuvans u Balb/c myší

	alum	adjuvans T lymfocytů	RBI
titr protilátek (průměr ± SD, n=6	. 96000 ±101000	62000±600M	176000±149000’
izotypy protilátek	IgGI	)gG1/Zb	lgG1(2a
proliferace T ly ve slezině¹ (n=3)	. 11750(20)	48300(30)	26000(3/3)
proliferace T ly v lymf. uzlině²	. žádná spec. stimulace	4000	8000
profil cytokinů (slezina)	IW ·	iFN-g/IW	IFW-g/IW

^xpo .třech s.c/i.m. imunizacích byly 3 náhodně vybrané myši analyzovány individuálně, výsledek je vyjádřen jako průměr specifických cpm získaný po 4 dnech El stimulace (1 μς/ml), číslo v závorkách se týká počtu myší se specifickou stimulací vyšší než pozadí ²po jedné imunizaci do plosky nohy (n=2) je výsledek vyjádřen jako průměr specifických cpm získaný po 5 dnech El stimulace (1 μς/πιΐ)

Tabulka 10

Humorální reakce: počet imunizací požadovaných pro různé hladiny E-l protilátek

'Zvíře	Stav	Sérokon verze’	>1U/mP	> 10-U/ml
Marcel	chronický	• 3	4	5
Peggy	chronický	3	5	>12
Femma	chronický	4	5	>12
Yaran	'naivní	3	4	5
Marti	naivní -	2	3	5

111 • fc ·· • fcfcfcfc • fc fcfc fcfcfc fcfc fc • fcfcfcfc • fc fcfc • fc ·♦·· ·· definovaná jako signál z testu ELISA vyšší než mezní stupeň, jestliže před imunizací nebyly přítomné žádné El-protilátky, v jiných případech pozorování titru vyššího než 3 jednotlivé časové body oproti titrům před imunizací byl považován za bod sérokonverze.

²jednotka je definována takto: hladina El protilátek u humánních chronických nosičů před terapií interferonem a infikovaných genotypem lb je < 0,1 μ/ml pro 50 % pacientů, mezi 0,1 až 1 μ/ml pro 25 % pacientů a > 1 U/ml u zbývajících 25 % pacientů, n=58

Příklad 12

Imunizace šimpanze chronicky infikovaného HCV podtypem lb

Šimpanz (Phil) infikovaný už více než 13 let (5015 dnů před imunizací) HCV kmenem podtypu lb byl očkován El (aa 192 až 326), který pochází z odlišného kmene genotypu lb, s 95,1% identitou na aminokyselinové úrovni (viz také tabulka 2 z WO 99/67285, jež je celá zahrnuta formou odkazu v tomto textu) a který byl připraven tak, jak je popsáno v příkladech 1 až 3 ve WO 99/67285. Šimpanz dostal celkem 6 intramuskulárních imunizací, pokaždé 50 pg El v PBS/0,05% CHAPS smíchaném s RIBI R-730 (MPLA+TDM+CWS) podle protokolu výrobce (Ribi lne. Hamilton, MT) . 6 imunizací bylo podáno ve dvou sériích tří injekcí se třítýdenním intervalem a s pauzou 6 týdnů mezi těmito dvěma sériemi. Počínaje 150 dnů před imunizací, během období imunizace a až do 1 roku po imunizaci (viz níže a WO 99/67285) byly u šimpanze kontinuálně sledovány různé parametry ukazující aktivitu nemoci indukované HCV. Tyto • Φ ·φφ» «φ φφ φφ φφ φφφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφφφ φφφ φ φφ φφφ φφ φφφ φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφ φφ

112 parametry zahrnovaly biochemické vyšetření krve, ALT, AST, yGT, biochemické parametry v krvi, virovou infekci v séru, virovou infekci v játrech a histologické vyšetření jater. Kromě toho imunitní odpověď na imunizaci byla monitorována jak na humorální, tak na buněčné úrovni. Během tohoto období bylo také Sledováno, zde se u zvířete nevyskytly jakékoliv vedlejší účinky imunizace, jako například změna chování, klinické příznaky, změna tělesné hmotnosti, teplota a lokální reakce (zarudnutí, otok, indurace). Tyto účinky nebyly detekovány.

ALT hladiny (a zejména yGT, data neukázána) nepochybně poklesly, jakmile protilátková hladina proti El dosáhla svého maxima (obrázek 8 z WO 99/67285). Hladina ALT začala znovu poněkud rychle stoupat, jakmile začala hladina protilátek klesat, ale yGT zůstávala na nižší úrovni, dokud anti-El zůstávala detekovatelné.

Antigen E2 v játrech poklesl na téměř nezjistitelné hladiny během období, ve kterém byla detekovatelné anti-El, a E2 antigen znovu stoupal krátce po vymizení těchto protilátek. Když se v játrech stal nezjistitelný jádrový antigen a antigen E2, zánět jater významně ustoupil (viz také tabulka 3 z WO 99/67285). To je hlavní důkaz, že vakcína snižuje jaterní poškození, pravděpodobně odstraněním, alespoň částečným, virových antigenů z jejich hlavního cílového orgánu, jater.

Virémie v séru, jak měřeno přístrojem Amplicor HCV Monitor (Roche, Bazilej, Švýcarsko), zůstávala přibližně nezměněna během celého trvání studie.

.Detailnější analýzy humorální odpovědi odhalily, že maximální koncový titr dosáhl 14,5 x 10³ (po šesté imunizaci) a že tento titr klesl na nezjistitelné hodnoty 1 rok po imunizaci (obrázek 8 z WO 99/67285). Obrázek 9 ukazuje, že

113

0« «00»

0« « «000 000* 00 0 0000 000* 0· 0 0 »0 »00 0» 000 0 0 « 00 0 0 » 0 0 0 00 0

0» 00 «0 *· 00 hlavní epitopy, které mohou být napodobeny peptidy, rozpoznávané B buňkami, jsou lokalizovány v N-koncové oblasti E2 (peptidy V1V2 a V2V3, pro detaily o použitých peptidech viz tabulku 4 z WO 99/67285). Protože reaktivita proti rekombinantnímu El je vyšší a déle trvá, může být také z tohoto obrázku odvozeno, že protilátky rozpoznávající tyto peptidy představují pouze část celkové protilátkové populace proti El. Zbývající část je namířena proti epitopům, které nemohu být peptidy napodobeny, tj. diskontinuálním epitopům. Tyto epitopy jsou přítomné pouze na kompletní molekule El nebo dokonce na struktuře podobné částici. Taková imunitní odpověď proti El je unikátní, alespoň při srovnání s reakcí, které je normálně pozorována u humánních chronických nosičů HCV (WO 96/13590, Maertens et al.) a u šimpanzů (van Doorn et al., 1996), u kterých stoupají anti-El protilátky při přirozeném průběhu infekce. U těchto pacientů je anti-El částečně také namířena proti diskontinuálním epitopům, ale větší část je namířena proti epitopu C4 (± 50 % pacientova séra) a menší část proti V1V2 (kolísající od 2 do 70 % v závislosti na genotypu) a reaktivita proti V2V3 byla zaznamenána pouze výjimečné (Maertens et al., 1997).

Analýza T buněčné reaktivity ukázala, že také tento kompartment imunitního systému je stimulován specificky vakcínou, protože stimulační index těchto T buněk stoupl z 1 na 2,5 a zůstal poněkud zvýšený během sledovaného období (obrázek 10 z WO 99/67285) . Je to tato T buněčná reaktivita, která je pozorována pouze u osob reagujících dlouhodobě na terapii interferonem (viz PCT/EP 94/03555, autoři LerouxRoels et al., Leroux-Roels et al., 1996).

114 ·· ·· 4« ·« 44 ’♦*·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 99 9 9 9

9 9 · · · 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 99 ·9

Příklad 13

Imunizace chronického nosiče HCV odlišným podtypem

Šimpanz (Ton) infikovaný už více než 10 let (3809 dnů před imunizací) HCV genotypu la byl očkován El z genotypu lb, pouze s 79,3% identitou na aminokyselinové úrovni (viz také tabulka 2 z WO 99/67285) a který byl připraven tak, jak je popsáno v předcházejících příkladech. Šimpanz dostal celkem 6 intramuskulárních imunizací 50 pg El v PBS/0,05% CHAPS pokaždé smíchaném s RIBI R-730 podle protokolu výrobce (Ribi lne. Hamilton, MT). 6 imunizací bylo podáno ve dvou sériích tří injekcí se třítýdenním intervalem a s pauzou 4 týdnů mezi těmito dvěma sériemi. Počínaje 250 dnů před imunizací, během období imunizace a až do 9 měsíců po imunizaci (viz níže a WO 99/67285) byly u šimpanze kontinuálně sledovány různé parametry ukazující aktivitu nemoci indukované HCV. Tyto parametry zahrnovaly biochemické vyšetření krve, ALT, AST, yGT, biochemické parametry v krvi, virovou infekci v séru, virovou infekci v játrech a histologické vyšetření jater. Kromě toho imunitní odpověď na imunizaci byla monitorována jak na humorální, tak na buněčné úrovni. Během tohoto období bylo také sledováno, zda se u zvířete nevyskytly jakékoliv vedlejší účinky imunizace, jako například změna chování, klinické příznaky, změna tělesné hmotnosti, teplota a lokální reakce (zarudnutí, otok, indurace). Tyto účinky nebyly detekovány.

ALT hladiny (a hladiny yGT, data neukázána) nepochybně poklesly, jakmile protilátkové hladina proti El dosáhla svého maxima (obrázek 11). Hladiny ALT a yGT začaly znovu stoupat, jakmile začala hladina protilátek klesat, ale ALT a yGT ·· ·· «» ·φ ·· ·»·· • · · · ·*·· ·· · • · ·» ···· ··· • · · · · 9 · · · · · · « ···· · · · ♦

99 99 99 99 99

115 zůstávala na nižší úrovni během celého období sledování. Hladiny ALT byly dokonce po vakcinaci sníženy (62 ± 6 U/l) ve srovnání s obdobím před vakcinaci (85 ± 11 U/l). Protože v séru bylo objeveno méně ukazatelů tkáňového poškození, byly tyto nálezy první indikace, že vakcinace indukovala zlepšení jaterního onemocnění.

Hladiny antigenu E2 se staly nezjistitelné v období, ve kterém titr anti-El zůstával vyšší než 1,0 χ 10³, ale staly se opět zjistitelné v období snížení hladin El protilátky. Spolu s vymizením HCV antigenů zánět jater výrazně ustoupil od mírné chronické aktivní hepatitidy k minimální formě chronické perzistentní hepatitidy (tabulka 3 z WO 99/67285). To je další hlavní důkaz, že vakcína snižuje jaterní poškození, pravděpodobně odstraněním, alespoň částečným, virových antigenů z jejich hlavního cílového orgánu, jater.

Virémie v séru, jak měřeno přístrojem Amplicor HCV Monitor (Roche, Bazilej, Švýcarsko), zůstávala na přibližně stejných hladinách během celého trvání studie. Detailnější analýzy humorální odpovědi odhalily, že maximální koncový titr dosáhl 30 χ 10³ (po šesté imunizaci) a že tento titr klesl na 0,5 χ 10³ devět měsíců po imunizaci (obrázek 11 z WO 99/67285). Obrázek 12 z WO 99/67285 ukazuje, že hlavní epitopy, které mohou být napodobeny peptidy a jsou rozpoznávané B buňkami, jsou lokalizovány v N-koncové oblasti (peptidy V1V2 a V2V3, pro detaily o použitých peptidech viz tabulku 4 z WO 99/67285). Protože reaktivita proti rekombinantnímu El je vyšší a déle trvá, může být také z tohoto obrázku odvozeno, že protilátky rozpoznávající tyto peptidy představují pouze část celkové protilátkové populace proti El. Zbývající část je nejpravděpodobněji namířena proti epitopům, které nemohu být peptidy napodobeny, tj. diskontinuálním epitopům. Tyto epitopy jsou pravděpodobně přítomné pouze na kompletní molekule El nebo dokonce na

116 struktuře podobné částici. Takové imunitní odpověď proti El je unikátní, alespoň při srovnání s reakcí, které je normálně pozorována u humánních chronických nosičů HCV, kteří mají detekovatelné anti-El. U těchto pacientů, je anti-El částečně také diskontinuální, ale větší část je namířena proti epitopu C4 (50 % sér pacientů) a menší část proti V1V2 (kolísající od 2 do 70 % v závislosti na genotypu) a výjimečně byla zaznamenána reaktivita proti V2V3 (Maertens et al., 1997). Protože tento šimpanz je infikován s la izolátem, byla protilátkové odpověď také vyhodnocena na zkřížená reaktivitu s El-la antigenem. Jak lze vidět na obrázku 13 z WO 99/67285, tyto zkříženě reagující protilátky opravdu vznikají, i když tvoří pouze část celkové protilátkové populace. Významná je korelace mezi opětným výskytem virového antigenu v játrech a vymizením zjistitelných anti-laEl protilátek v séru.

Analýza T buněčné reaktivity ukázala, že také tento kompartment imunitního systému je stimulován specificky vakcínou, protože stimulační index těchto T buněk stoupl z 0,5 na 5 a zůstal zvýšený během sledovaného období (obrázek 14 z WO 99/67285) .

Příklad 14

Opětné podávání upomínací dávky El chronickým nosičům HCV

Protože protilátkové titry, jak pozorováno v příkladech 12 a 13 nebyly trvalé a časem se snižovaly, dokonce na nezjistitelné hladiny u šimpanze infikovaného lb, bylo zkoumáno, jestliže může být tato protilátkové odpověď opět zvýšena podáním další upomínací dávky. Oba šimpanzi byli opět imunizováni třemi po sobě jdoucími intramuskulárními : · · · ........ .

·..··..· ·..··..· ·..··..·

117 imunizacemi s třítýdenním intervalem (50 pg El smíchaného s adjuvans RIBI) . Jak lze soudit z obrázků 8 a 11 z WO 99/67285, reakce anti-El mohla být opravdu posílena, virový antigen v játrech opět klesl pod detekční limit, třebaže virová infekce v séru zůstala u Tona konstantní (obrázek 11 z WO 99/67285). Poprvé během sledovaného období byla měřena virémie < 10⁵ ekvivalentů genomu na ml.

Pozoruhodný je nález, že, jak již byl případ první série imunizací, šimpanz infikovaný podtypem lb HCV kmene (Phil) odpovídal nižšími titry anti-El, než šimpanz infikovaný podtypem la HCV kmene (maximální titr v prvním kole 14,5 x 10³ proti 30 x 10³ pro Tona a po dalších upomínacích dávkách pouze 1,2 x 10³ pro Phila proti 40 x 10³ pro Tona). Ačkoliv prospěšný účinek se zdál být u obou zvířat podobný, bylo možné z tohoto pokusu uzavřít, že imunizace chronického nosiče proteinem El pocházejícím z jiného podtypu nebo genotypu může být obzvláště prospěšná pro dosažení vyšších titrů, možná obchází předem existující a specifickou imunosupresi vyskytující se u hostitele a indukovanou infikujícím podtypem nebo genotypem. Alternativně mohou nižší titry pozorované v homologním uspořádání (vakcína lb + infekce lb) indikovat vazbu velkého množství protilátek na virus. Indukované protilátky mohou mít tudíž neutralizující kapacitu.

Příklad 15

Průkaz profylaktické použitelnosti El vakcinace u šimpanze

HCV Els protein (aminokyseliny 192 až 326) byl exprimován ve Věro buňkách s použitím rekombinantního viru • · · ·

118 vakcínie HCV11B. Tento virus vakcínie je v podstatě totožný s vvHCVHA (jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 6 150 134, jehož celý obsah je zahrnut formou odkazu), ale byl pasážován z RK13 na Věro buňky. Protein byl purifikován (chromatografii s lektinem z čočky, redukční alkylací a vylučovací chromatografii) v podstatě tak, jak bylo popsáno v příkladu 9 PCT/E99/04342 (WO 99/67285), při použití jodacetamidu jako alkylačního činidla pro cysteiny. Po purifikaci byl 3% empigen-BB vyměněn za 3% betain vylučovací chromatografii, jak bylo popsáno v příkladu 1 PCT/E99/04342, tento postup umožní získat Els jako částice. Nakonec byl materiál odsolen do PBS obsahující 0,5% betain a Els koncentraci 500 gg/ml. Tento El byl smíchán se stejným objemem 1,3% Alhydrogelu (Superfos, Dánsko) a nakonec dále naředěn 8 objemy 0,9% NaCl za vzniku El s adjuvans alumem v koncentraci 50 gg El/ml a 0,13% Alhydrogel.

HCV E2deltaHVRI (aminokyseliny 412 až 715) byl exprimován a purifikován z Věro buněk v podstatě tak, jak bylo popsáno pro El, s použitím rekombinantního viru vakcínie HCV101, který byl rekombinován z pvHCV-101 popsaného v příkladu 8 PCT/E99/04342 a divokého typu viru vakcínie.

Také E2deltaHVRI se choval jako částice (měřeno dynamickým rozptylem světla) po výměně empigenu za betain.

Bylo vybráno pět šimpanzů, kteří byli testováni jako negativní, co se týče protilátek HCV-RNA a HCV. Jedno ze zvířat (Huub) nebyl imunizován, 2 zvířata dostala 6 imunizací s 50 gg El s adjuvans alumem (Marti a Yoran), zatímco zbývající 2 zvířata dostala 6 imunizací s 50 gg E2deltaHVRI s adjuvans alumem (Joost a Karlien). Všechny imunizace byly podávány intramuskulárně s 3 týdenní m intervalem. Humorální a buněčné imunitní reakce byly stanoveny u každého zvířete proti antigenu, kterým byla zvířata imunizována a u každého ·· » « • · • ·· · • ·

119 » · · <

» · · ·· · · zvířete byly detekovány oba typy reakce, jak je ukázáno v tabulce 11.

Tabulka 11

Protilátkové titry byly určovány testem ELISA dva týdny po 6. Imunizaci. Sériová ředění vzorku byla srovnána s laboratorním standardem (tento laboratorní standard byl definován tak, že má 1000 mU/ml El nebo anti-E2deltaHVRI protilátky, a je to směs tří sér od chronického nosiče HCV vybraného na základě vysokého anti-obalového titru). Stimulační index, který odráží buněčnou imunitní reakci, byl získán kultivací PBMC, odebraných zvířatům dva týdny po třetí imunizaci, v přítomnosti nebo nepřítomnosti obalového antigenu a určením množství tritiem značeného thymidinu inkorporovaného do těchto buněk během pulsu 18 hodin po 5 dnech kultivace. Stimulační index je poměr thymidinu inkorporovaného do buněk pěstovaných s obalovým antigenem proti buňkám pěstovaným bez antigenu. Stimulační index > 3 je považován za pozitivní signál.

Reakce anti-El J	Reakce anti-E2deltaHVRI
	Titr protilátek	Stimulační index	Titr protilátek	Stimulační index
Yoraa	14110	10.9
Marií	5630	14.2
Joost			3210	85
Karliea			1770	11.2

Tři týdny po poslední ze 6 imunizací všechna zvířata včetně kontrolního byla stimulována 100 CID (CID - infekční dávka pro šimpanze) inokula genotypu lb (J4.91, laskavě • · • · • · · ·

120 poskytnuto Dr. J. Bukh, NIH, Bethesda, Maryland). Divergence aminokyselinové sekvence mezi vakcinačními proteiny a izolátem J4.91 (informace o jeho sekvenci je dostupná pod přístupovým číslem BAA01583) je 7% (9 ze 135 aminokyselin) pro Els a 11% (32 ze 304 aminokyselin) pro E2deltaHVRI, proto tedy je tato stimulace považována za heterologní a odráží skutečnou „živou stimulaci.

Všichni šimpanzi se stali HCV-RNA pozitivní (určeno Monitor HCV, Roche, Basilej, Švýcarsko) 7. Den po stimulaci a první vrchol ALT a yGT byl měřen mezi 35. A 63. dnem. To dokazuje, že se u všech šimpanzů vyvolala akutní hepatitida. Je pozoruhodné, že obě zvířata imunizovaná El infekci odstranila, zatímco zvířata s E2deltaHVRI a kontrolní zvíře ne. To je dokázáno faktem, že zvířata imunizovaná El ztratila HCV-RNA (určováno Monitor HCV, Roche, Basilej, Švýcarsko) v 98. den (Yoran) a 133. den (Marti) a zůstala negativní až do dne 273 při měsíčním testování. Všechna ostatní zvířata zůstala zatím RNA-pozitivní během celého období sledování 273 dnů, s hodnotami ALT a gammaGT nevracejícími se k normálním, jako u šimpanzů imunizovaných El, ale postupně se zvyšuj ícími.

Závěrem	původci	ukázali,	že El imunizace mění	anamnézu
neléčené HCV	infekce	prevencí	rozvoje do chronické	infekce,
což je hlavní	zdravotní problém	spojený s HCV.
Příklad 16
Podobné El	reakce,	které	umožnily odstranění	infekce

u šimpanze, mohou být indukovány u člověka

Aby se dosáhlo profylaktického účinku El imunizace u ««

121 člověka, je nutné, aby podobné imunitní reakce ve srovnání se šimpanzem mohly být indukovány u člověka. Proto původci očkovali 20 humánních dobrovolníků mužského pohlaví, u kterých nebyla detekována anti-El reakce (humorální nebo buněčná), 3 dávkami 20 pg Els formulovaného v 0,5 ml 0,13% Alhydrogelu. Všechny imunizace byly podávány intramuskulárně s 3 týdenním intervalem. Jak ukázáno v tabulce 12, u 17 z 20 dobrovolníků se opravdu vyvolala významná humorální a buněčná imunitní reakce proti El, a to bez vážných vedlejších účinků. Jen 1 dobrovolník (pacient 021) byl považován za nereagujícího, protože ani humorální ani buněčná reakce nebyla nad hraniční hladinou po 3 imunizacích El. Pozorování, že humorální reakce je nižší ve srovnání se šimpanzem se vztahují k faktu, že byly podány pouze 3 imunizace po 20 μg a ne 6 imunizací po 50 μg.

Tabulka 12

Protilátková titry byly určovány testem ELISA dva týdny po třetí imunizaci. Sériová ředění vzorku byla srovnána s laboratorním standardem (tento laboratorní standard byl definován tak, že má 1000 mU/ml El nebo anti-E2deltaHVRI protilátky, a je to směs tří sér od chronického nosiče HCV vybraného na základě vysokého anti-obalového titru). Stimulační index (buněčná imunitní reakce) byl získán kultivací PBMC, odebraných jedincům dva týdny po třetí imunizaci, v přítomnosti nebo nepřítomnosti 1 μg Els a určením množství tritiem značeného thymidinu inkorporovaného do těchto buněk během pulsu 18 hodin po 5 dnech kultivace. Stimulační index je poměr thymidinu inkorporovaného do buněk • · ··

122 pěstovaných s obalovým antigenem proti buňkám pěstovaným bez antigenu. Stimulační index > 3 je považován za pozitivní signál.

Pacient č.	Titr protilátek	Stimulační index
002	1370	30.9
003	717 .	132
004	800 .	9.1
007	680	3.8
008	1026	3.9
009	325	4,6
010	898	7.7
011	284 ...	4.1 ·,,
012	181	3.6
013	<20	3.5
014	49	4.6
015	228	3.8
016	324	4.1 1
017	<20*	6.2
•018	<20	6.7
019	624	3.1
020	84	5.5
021	<20	2.1
022	226	2.7
023	163	7.6

*tento jedinec je považován za anti-El pozitivního po imunizaci, protože bylo pozorováno významné zvýšení signálu v testu ELISA mezi vzorkem před imunizací a vzorkem po třech imunizacích, nicméně titr je velmi nízký a neumožňuje přesné stanovení.

• · · ·

123

Příklad 17

Podávání upomínací dávky pro El reakce u očkovaných zdravých dobrovolníků z 20 humánních dobrovolníků z příkladu 16 byla ještě jednou podávána upomínací dávka 20 μς Els formulovaného v 0,5 ml 0,13% Alhydrogelu 26. týden (tj. 20 týdnů po třetí imunizaci). 2 týdny po této další imunizaci byly znovu určovány protilátkové titry a buněčné imunitní reakce. U všech jedinců protilátkový titr klesal během 20 týdenní intervalu, ale mohl snadno být posílen touto další imunizací na hladinu stejnou nebo vyšší, než byl hladina pozorovaná 8. týden. V průměru byl protilátkový titr dvakrát tak vysoký po této upomínací dávce ve srovnání s titrem v 8. týdnu a 7 krát tak vysoký ve srovnání s titrem v 26. týdnu (tabulka 13).

Tabulka 13

Protilátkové titry byly určovány testem ELISa dva týdny (= týden 8) a 20 týdnů (= týden 26) po třetí imunizaci a nakonec také 2 týdny po upomínací dávce (= týden 28). Sériová ředění vzorku byla srovnána s laboratorním standardem (tento laboratorní standard byl definován tak, že má 1000 mU/ml El protilátky, a je to směs tří sér od chronického nosiče HCV vybraného na základě vysokého anti-obalového titru). Pro přesné srovnání určení titru v 8. týdnu bylo opakováno ve stejném testu, jako pro vzorky z 26. a 28. týdne, což vysvětluje rozdíly při srovnání s tabulkou 12 z příkladu 16.

•0 00 • 0 · 0 • 0 00 • ·0 « • « 0 · •0 ·0 • 0

124

Pacient č.	^f Titr protilátek
	8. týden	26. týden	28. týden
002	1471	443	3119
003	963	95	2355
004	1006	409	2043
007	630	.65	541
008	926	81	819
009	704	77	269
010	1296	657	3773
011	253	65	368
012·	254	148	760
013	36	<20	166
014	53	40	123 '
018	159	45	231
017	109	39	568
018	43	23·	50

j 019	425 .	157	Ϊ894
020	73	33	113
021	25	<20	26
022	280	150	'357
024	177	81	184
iprůměr ,	487	138	936

Je pozoruhodné, že reakce T lymfocytů byly pro většinu jednotlivců stále vysoký po 20-týdenním intervalu. Když se vezme do úvahy normalizace reakce na tetanus, která je přítomná u většiny jednotlivců jako důsledek předchozích vakcinací, neexistuje žádná změna geometrického průměru stimulačního indexu. Po další upomínací dávce, když se vezme do úvahy normalizace reakce na tetanus, nebyla zaznamenána žádná změna (obrázek 51) . To potvrzuje, že silná reakce T pomocných lymfocytů byla indukována po 3 imunizacích El a indikuje, že tyto imunizace indukovaly již velmi dobře paměťové T pomocné lymfocyty, což nevyžaduje, přinejmenším po období 6 měsíců, podávání dalších upomínacích dávek.

• 4 ·· • · 4 • 44 «

• 4

125 • * 44 4 • · * · 4 4 • · 4 4 4 • · 44

4 « 4 •4 4

Vysvětlivky k obrázku 51: Stimulační index (buněčná imunitní reakce) byl získán kultivací PBMC (10⁵ buněk) odebraných jedincům před imunizací (týden 0), dva týdny po třetí imunizaci (týden 8), před upomínací imunizací (týden 26) a dva týdny po upomínací imunizaci (týden 28) , v přítomnosti nebo nepřítomnosti 3 pg rekombinantního Els nebo 2 pg tetanického toxoidu a určením množství tritiovaného thymidinu inkorporovaného do těchto buněk během pulsu 18 hodin po 5 dnech kultivace. Stimulační index je poměr thymidinu inkorporovaného do buněk pěstovaných s obalovým antigenem oproti buňkám pěstovaným bez antigenu. Vzorky z týdne 0 a 8 byly vyšetřovány v prvním testu (A) , zatímco vzorky z týdnů 26 a 28 byly vyšetřovány v druhém testu (Β) , kdy byly vzorky z týdnu 0 analyzovány znovu. Výsledky jsou vyjádřeny jako geometrický průměr stimulačního indexu všech 20 (experiment A) nebo 19 (experiment B) dobrovolníků.

Kromě toho byl měřen cytokin Thl interferon-gama a cytokin Th2 interleukin-5 v supernatantech kultur PBMC vzorků odebraných v týdny 26 a 28 a znovu stimulovaných El. Jak lze usuzovat z obrázku 52, převládající cytokin sekretovaný PBMC stimulovanými El je interferon-gama. Je velmi překvapující, že byla pozorována silná reakce přesměrovaná k Thl u El s adjuvans alumem, protože je známo, že alum je induktor Th2. Ještě jednou výsledky potvrdily, že byla indukována dobrá reakce paměťových T lymfocytů, protože před konečnou upomínací dávkou (týden 26) byla pozorována již velmi silná reakce. Bylo zjištěno, že sekrece interferonu-gama byla specifická, protože v dalším experimentu původci nepozorovali žádný rozdíl mezi sekrecí interferonu-gama mezi El stimulovanými buněčnými kulturami a nestimulovanými buněčnými kulturami od těchto dobrovolníků při použití vzorků odebraných v týden 0.

Vysvětlivky k obrázku 52: PBMC (10⁵ buněk) odebrané ··♦·

126 • ·· • · · • ·· • · · • · · * · · jedincům před upomínací imunizací (týden 26) a dva týdny po upomínací imunizaci (týden 28) byly pěstovány v přítomnosti 3 pg rekombinantního Els (El) nebo 2 pg tetanického toxoidu (TT) nebo bez antigenů (Bl). Cytokiny byly měřeny v supernatantu odebraném po 24 hodinách (interleukin-5) nebo po 120 hodinách (interferon-gama) pomocí testu ELISA. Stimulační index je poměr cytokinů měřeného v supernatantech buněk pěstovaných s obalovým antigenem proti buňkám pěstovaným bez antigenů. Výsledky jsou vyjádřeny jako geometrický průměr v pg cytokinu/ml sekretovaného všemi 19 dobrovolníky. Vzorkům s množstvím cytokinů pod limitem detekce byla přiřazena hodnota detekčního limitu. Podobně vzorkům s extrémně vysokými koncentracemi cytokinů vybočujícími z lineárního rozsahu testu byla přiřazena hodnota limitu lineárního rozsahu testu.

Příklad 18

Jemné mapování buněčné reakce proti El u očkovaných zdravých dobrovolníků

Aby se zmapovaly El specifické reakce byla syntetizována řada 20-merních peptidů s použitím standardních Fmoc chemických postupů, s překrýváním 8 aminokyselin a pokrývající celou sekvenci Els. Všechny peptidy byly na Ckonci amidovány a na N-konci acetylovány, s výjimkou IGP 1626, který má volný amino-konec.

IGP 1626 YEVRNVSGIYHVTNDCSNSS (aminokyseliny 192 až 211)

IGP 1627 TNDCSNSSIVYEAADMIMHT (aminokyseliny 204 až 223) • φ • φ φφφφ

127 • Φ φφ • φ φ 1 • φ φφ φ Φ Φ I • Φ Φ 4 Φ· ΦΦ • Φ Φ

Φ ΦΦ Φ Φ Φ

Φ Φ Φ » ΦΦ

IGP	1628	AADMIMHTPGCVPCVRENNS	(aminokyseliny	216	až	235)
IGP	1629	PCVRENNSSRCWVALTPTLA	(aminokyseliny	228	až	247)
IGP	1630	VALTPTLAARNASVPTTTIR	(aminokyseliny	240	až	259)
IGP	1631	SVPTTTIRRHVDLLVGAF	(aminokyseliny	252	až	271)
IGP	1632	LLVGAFCSAMYVGDLCGS	(aminokyseliny	264	až

283) )

IGP	1633	YVGDLCGSVFLVSQLFTISP	(aminokyseliny	276 až	295)
IGP	1634	SOLFTISPRRHETVQDCNCS	(aminokyseliny	288 až	307)
IGP	1835	TVQDCNCSIYPGHITGHRMA	(aminokyseliny	300 až	319)
IGP	1636	HITGHRMAWDMMMNWSPTTA	(aminokyseliny	312 až	331)
	PBMC	od 14 různých zdravých	dárců neočkovaných	s Els

nebo 10 dárců očkovaných s Els byly pěstovány v přítomnosti 25 gg/ml (neočkované osoby) nebo 10 pg/ml (očkované osoby, vzorky odebrány třetí nebo upomínací injekci) každého peptidů samostatně. Jak lze usuzovat z obrázku 53, peptidy IGP 1627, 1629, 1630, 1631, 1633, 1635 a 1635 všechny indukovaly významně vyšší reakce u očkovaných osob ve srovnání s neočkovanými osobami. Při použití stimulačního indexu 3 jako limitu, peptidy IGP 1627, 1629, 1631 a 1635 byly nej častěji rozpoznávány (t j. rozpoznávány alespoň polovinou očkovaných testovaných osob). Tento experiment dokázal, že reakce T lymfocytů indukované Els pocházejícím ze savčí tkáňové kultury jsou specifické proti El, protože tyto reakce nemohou být zrušeny stejným Els pocházejícím ze savčí tkáňové kultury, ale také syntetickými peptidy. Kromě toho tento experiment vyznačil, že nejvíce imunogenní domény T lymfocytů v El jsou lokalizovány mezi aminokyselinami 204 až 223, 228 až 271, 276 až 295, 300 až 331 a konkrétněji dokonce mezi aminokyselinami 204 až 223, 228 až 247, 252 až 271 a 300 až • · · ·«

128 «9 ·« «9 • · · 1 • · 99 • · 9 · • · * « ·· ·· ·* ·« » * Φ 4 » · ·♦ > » · « ► · * « ·· ··

319.

Vysvětlivky k obrázku 53: Stimulační index (buněčná imunitní reakce) byl získán kultivací PBMC (3 χ 10⁵ buněk), v přítomnosti nebo nepřítomnosti peptidů a určením množství tritiovaného thymidinu inkorporovaného do těchto buněk během pulsu po 5 až 6 dnů kultivace. Stimulační index je poměr thymidinu inkorporovaného do buněk kultivovaných s peptidem proti buňkám pěstovaným bez peptidu. Výsledky jsou vyjádřeny jako individuální hodnoty pro očkované osoby (horní panel) nebo neočkované nebo kontroly (nižší panel).

Předkládaný vynález tudíž také poskytuje následující El peptidy, proteiny, přípravky a soupravy, které je obsahují, sekvence nukleové kyseliny kódující tyto peptidy a proteiny, které je obsahují, a způsoby jejich výroby a použití, jak je obecně popsáno v tomto textu pro další El a příbuzné peptidy podle předkládaného vynálezu.

IGP 1626 č. 112),	zahrnuj ící	polohy	192	až	211	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1627 č. 113),	zahrnuj ící	polohy	204	až	223	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1628 č. 114),	zahrnuj ící	polohy	216	až	235	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1629 č. 115),	zahrnuj ící	polohy	228	až	247	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1630 č. 116),	zahrnuj ící	polohy	240	až	259	z	El	úseku	(sekv.	id.

IGP 1631 zahrnující polohy 252 až 271 z El úseku (sekv. id.

129

č. 117),

IGP 1632 č. 118),	zahrnuj ící	polohy	264	až	283	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1633 č. 119),	zahrnující	polohy	276	až	295	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1634 č. 120),	zahrnuj ící	polohy	288	až	307	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1635 č. 121),	zahrnující	polohy	300	až	319	z	El	úseku	(sekv.	id.
IGP 1636	zahrnuj ící	polohy	312	až	331	z	El	úseku	(sekv.	id.

č. 122).

SEZNAM LITERATURY

Bailey, J. A Cole, R. (1959) J. Biol. Chem. 234, 1733-1739.

Balloů, L., Hitzeman, R., Lewis, M. & Bantou, C. (1991) PNAS 88, 3209-3212.

Benesch, R., Benesch, R. E., Gutcho, M. & Lanfer, L. (1956) Science 123, 981.

Cavins, J. & Friedman. (1970) Anal. Biochem. 35, 489.

Cleland, W. (1964) Biochemistry 3, 480.

Creighton, E. (1988) BioEssays 8, 57.

Darbre, A., John Wiley & Sons Ltd. (1987) Practical Protein Chemistry- A Handbook.

·· • t

130 ·· • · • · • 9

9 ·

♦ · *· ·

« 9 • · · • · ·· ·«»« ·

Darbre, A., Chemistry p

Doms et al,

Ellman, G.

Falkner, F.

Friedman, M 37, 630.

John Wiley & Sons Ltd. (1987) Practical . 69-79.

(1993), Virology 193, 545-562.

(1959) Arch. Biochem, Biophys. 82, 70.

& Moss, B. (1988) J. Virol. 62, 1849-1854 . & Krull, (1969) Biochem. Biophys. Res.

Protein

Commun.

Gallagher J. (1988) J. Cell Biol. 107, 2059-2073.

Glazer, A., Delange, R., Sigman, D. (1975) North Holland publishing company, Elsevier, Biomedical. Part: Modification of protein (p. 116) .

Graham, F. & van der Eb, A. (1973) Virology 52, 456-467.

Grakoui et at. (1993) Journal of Virology 67: 1385-1395.

Grassetti, D. & Murray, J. (1969) Analyt. Chim. Acta. 46, 139.

Grassetti, D. & Murray, J. (1967) Arch. Biochem Biophys. 119, 41.

Helenius, Mol. Biol. Cell (1994), 5: 253-265.

Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M. & Shimotohno, K. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. U. S. A. 88 (13): 5547-51.

Hochuli, E., Bannwarth, W., Dóbeli, H., Gentz, R. , Stuber, D. (1988) Biochemistry 88, 8976.

Hsu, H., Donets, M., Greenberg, H. & Feinstone, S. (1993) Hepatology 17: 763-771.

131

Inoue, Y., Suzuki, R., Matsuura, Y., Harada, S., Chiba, J. , Watanabe, Y., Saito, I. & Miyamura, T. (1992) J. Gen. Virol. 73: 2151-2154.

Janknecht, R., de Martynoff, G. Et al., (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 8972-8976.

Kayman (1991) J. Virology 65, 5323-5332.

Kato, N., Oostuyama, Y., Tanaka, T., Nakagawa, M., Murais,

K., Ohkoshi, S., Hijikata, M., Shimitohno, K. (1992) Virus Res. 22: 107-123.

Kniskern, P., Hagopian, A., Burke, P., Schutz, L., Montgomery, D., Hurni, W., Yu ap C., Schulman, C., Maigetter, R., Wampler, D., Kubek, D., Sitrin, R., West, D., Ellis, R., Miller, W. (1994) Vaccine 12: 1021-1025.

Kohara, Μ., Tsukiyama-Kohara, Κ., Maki, N., Asano, K., Yoshizawa, Κ., Miki, Κ., Tanaka, S., Hattori, N., Matsuura, Y., Saito, I., Miyamura, T. & Nomoto, A. (1992) J. Gen. Virol. 73: 2313-2318.

Mackett, practical	M., Smith, G. & Moss, . approach (Ed. Glover,	B. D.	(1985) In: „DNA cloning: a ) IRL Press, Oxford.
Mackett,	Μ. ,	& Smith, G. (1986)	J.	Gen. Virol. 67, 2067-2082.
Mackett, 864 .	M.,	Smith, G. & Moss,	B.	(1984) J. Virol, 49, 857-
Mackett, Sci. USA	M., 79,	Smith, G. & Moss, 7415-7419.	B.	(1984) Proč. Nati. Acad.
Means, G.	(1971) Holden Day, lne

Moore, S. (1963) J. Biol. Chem. 238,235-237

Means, G. & Feeney, R. (1971) Holden Day p. 105 & p. 217.

Mita, E., Hayashi, N., Ueda, Κ., Kasahara, A., Fusamofo, H.,

Takamizawa, A., Matsubara, Κ., Okayama, H. & Kamada T. (1992)

Biochem. Biophys. Res. Comm. 183: 925-930.

• β fcfc··

132

Okamoto, H., Okada, S., Sugiyama, Y., Yotsumoto, S., Tanaka, T., Yoshizawa, H., Tsuda, F., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1990) Jpn. J. Exp. Med. 60167-177.

Panicali & Paoletti (1982) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931.

Piccini, A., Perkus, M. & Paoletti, E. (1987) Meth. Enzymol. 153, 545-563.

Rose (1988) Annu. Rev. Cell Biol. 1988,4: 257-288.

Ruegg, V. A Rudinger, J. (1977) Methods Enzymol. 47, 111-116.

Shan, S. & Wong (1993) CRC-press p. 30-33.

Spaete, R., Alexander, D., Rugroden, M., Choo, Q., Berger, K., Crawford, Κ. , Kuo, C., Leng, S., Lee, C., Ralston, R. , et al. (1992) Virology 188 (2): 819-30.

Skehel, J., (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81,1179-1783.

Stunnenberg, H., Lange, H., Philipson, L., Miltenburg, R. & van der Vliet, R. (1988) Nucl. Acids Res. 16, 2431-2444.

Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A., DeLeys, R. & Maertens, G. (1993a) Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 635641.

Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A., Duhamel, M., Vanderborght, B., Van Heuverswyn, H., & Maertens, G. (1993b) J. Gen. Virol. 74, 1093-1102.

Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A., Hernandez, F., Delaporte, E., Maertens, G. (1994), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 10134-10138.

Weil, L. & Seibler, S. (1961) Arch. Biochem. Biophys. 95, 470.

·» »«·

133 .·« ♦» ·· ,, ϊ ϊ · · · · ·

Yokosuka, 0., Ito, Υ., Imazeki, F., Ohto, Μ. & Omata, Μ. (1992) Biochem. Biophys. Res. Commun. 189: 565-571.

Miller P, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts'o P (1979) Biochemistry 18: 5134-43.

Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1991) Science 254: 1497-500.

Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1993) Nucleic-AcidsRes. 21: 197-200.

Asseline U, Delarue M, Lancelot G, Toulme F, Thuong N (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 3297-301.

Matsukura M, Shinozuka K, Zon G, Mitsuya H, Reitz M, Cohen J, Broder S (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7706-10.

WO 96/ 04385 (PCT/ EP95/ 03031) - Purified Hepatitis C Virus Envelope Proteins for Diagnostic a Therapeutic Use.

Všechny odkazy citované v tomto textu jsou v předkládané přihlášce zahrnuty formou odkazu.

Claims

PATENTOVÉ // ^5-Ζ/έΫ

NÁROKY

1. Profylaktický vakcinační přípravek vyznačuj ící se t i m, že obsahuje profylakticky účinné množství alespoň jednoho purifikovaného HCV jednotlivého nebo specifického oligomerního rekombinantního obalového proteinu vybraného z El proteinu, E2 proteinu a částí El a E2 proteinů, a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans.
2. Profylakticky vakcinační přípravek vyznačuj ící se t i m, že obsahuje profylakticky účinné množství kombinace alespoň dvou purifikovaných HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních rekombinantních obalových proteinů vybraných z El proteinů pocházejících z různých HCV genotypů nebo podtypů, E2 proteinů pocházejících z různých HCV genotypů nebo podtypů a částí El a E2 proteinů, a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans.

3. Profylaktický vakcinační přípravek vyznačuj ící se t i m, že obsahuje profylakticky účinné množství alespoň jednoho z následujících El a E2 peptidů:

El-31 zahrnující aminokyseliny 181 až 200 úseku jádro/El VI (sekv. id. č. 56),

El-33 zahrnující aminokyseliny 193 až 212 z El úseku (sekv. id. č. 57) ,

El-35 zahrnující aminokyseliny 205 až 224 z El V2 úseku (sekv. id. č. 58),

E1-35A zahrnující aminokyseliny 208 až 227 z El V2 úseku (sekv. id. č. 59), lbEl zahrnující aminokyseliny 192 až 228 z El úseku VI, Cl a V2 úseků (sekv. id. č. 53),

El-51 zahrnující aminokyseliny 301 až 320 z El úseku (sekv.

• μ

135 ·· • ·« • · • · ♦ • · · • 0 »

·· ·· ·» ·· • * · • ·· • · · • · · ·· ·<··· • · ·· id. č. 66),

El-53 zahrnující aminokyseliny 313 až 332 z El C4 úseku (sekv. id. č. 67),

El-55 zahrnující aminokyseliny 325 až 344 z El úseku (sekv. id. č. 68),

Env 67 nebo E2-67 zahrnující aminokyselinové polohy 397 až 418 z E2 úseku (sekv. id. č. 72) ,

Env 69 nebo E2-69 zahrnující aminokyselinové polohy 409 až 428 z E2 úseku (sekv. id. č. 73),

Env 23 nebo E2-23 (sekv. id. č. 86), zahrnuj ící polohy 583 až 602 z E2 úseku Env 25 nebo E2-25 (sekv. id. č. 87), zahrnuj ící polohy 595 až 614 z E2 úseku Env 27 nebo E2-27 (sekv. id. č. 88) , zahrnující polohy 607 až 626 z E2 úseku Env 17B nebo E2-17B (sekv. id. č. 83), zahrnuj ící polohy 547 až 586 z E2 úseku Env 13B nebo E2-13B (sekv. id. č. 82), zahrnuj ící polohy 523 až 542 z E2 úseku IGP 1626 zahrnující č. 112), polohy 192 až 211 z El úseku (sekv . id. IGP 1627 zahrnující č. 113), polohy 204 až 223 z El úseku (sekv . id. IGP 1628 zahrnující č. 114), polohy 216 až 235 z El úseku (sekv . id. IGP 1629 zahrnující č. 115), polohy 228 až 247 z El úseku (sekv . id. IGP 1630 zahrnující č. 116), polohy 240 až 259 z El úseku (sekv . id. IGP 1631 zahrnující č. 117), polohy 252 až 271 z El úseku (sekv . id. IGP 1632 zahrnující polohy 264 až 283 z El úseku (sekv . id.

č. 118), • ·· · • ·

136

IGP 1633 č. 119), zahrnuj ící polohy 276 až 295 z El úseku (sekv. id. IGP 1634 č. 120), zahrnuj ící polohy 288 až 307 z El úseku (sekv. id. IGP 1635 č. 121) a zahrnuj ící polohy 300 až 319 z El úseku (sekv. id. IGP 1636 zahrnující polohy 312 až 331 z El úseku (sekv. id.

č. 122), a, volitelně, farmaceuticky přijatelné adjuvans.

4. Profylaktický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje profylakticky účinné množství alespoň jednoho purifikovaného HCV jednotlivého nebo specifického oligomerního rekombinantního obalového proteinu vybraného z El proteinu, E2 proteinu a částí El a E2 proteinů, a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans.
5. Profylaktický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje profylakticky účinné množství kombinace alespoň dvou purifikovaných HCV jednotlivých nebo specifických oligomerních rekombinantních obalových proteinů vybraných z El proteinů pocházejících z různých HCV genotypů nebo podtypů, E2 proteinů pocházejících z různých HCV genotypů nebo podtypů a částí El a E2 proteinů, a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans.

6. Profylaktický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje profylakticky účinné množství alespoň jednoho z následujících El a E2 peptidů:

El-31 zahrnující aminokyseliny 181 až 200 úseku jádro/El VI (sekv. id. č. 56) ,

El-33 zahrnující aminokyseliny 193 až 212 z El úseku (sekv. id. č. 57) ,

137 • 4 · 4 4 4 4 4 ·· · • 4·· 4 444 4 4 4

4 44 444 44 444 4 4

El-35 zahrnující aminokyseliny 205 až 224 z El V2 úseku (sekv. id. č. 58), E1-35A zahrnující aminokyseliny 208 až 227 z El V2 úseku (sekv. id. č. 59), lbEl zahrnující aminokyseliny 192 až 228 z El úseku VI, Cl a

V2 úseků (sekv. id. č. 53),

El-51 zahrnující aminokyseliny 301 až 320 z I SI úseku (sekv. id. č. 66) , El-53 zahrnující aminokyseliny 313 až 332 z El C4 úseku (sekv. id. č. 67), El-55 zahrnující aminokyseliny 325 až 344 z El úseku (sekv. id. č. 68), Env 67 nebo E2-67 zahrnující aminokyselinové polohy 397 až 418 z E2 úseku (sekv. id. č. 72 ), Env 69 nebo E2-69 zahrnující aminokyselinové polohy 409 až 428 z E2 úseku (sekv. id. č. 73), Env 23 nebo E2-23 zahrnující polohy 583 až 602 z E2 úseku (sekv. id. č. 86), Env 25 nebo E2-25 zahrnující polohy 595 až 614 z E2 úseku (sekv. id. č. 87), Env 27 nebo E2-27 zahrnující polohy 607 až 626 z E2 úseku (sekv. id. č. 88), Env 17B nebo E2-17B zahrnující polohy 547 až 586 z E2 úseku (sekv. id. č. 83), Env 13B nebo E2-13B zahrnující polohy 523 až 542 z E2 úseku

(sekv. id. č. 82),

IGP 1626 zahrnuj ící polohy 192 až 211 z El úseku (sekv. id. č. 112), IGP 1627 zahrnuj ící polohy 204 až 223 z El úseku (sekv. id. č. 113) , IGP 1628 zahrnuj ící polohy 216 až 235 z El úseku (sekv. id. č. 114) , IGP 1629 zahrnuj ící polohy 228 až 247 z El úseku (sekv. id.

138

č. 115),

IGP 1630 č. 116), zahrnuj ící polohy 240 až 259 z El úseku (sekv. id. IGP 1631 č. 117), zahrnuj ící polohy 252 až 271 z El úseku (sekv. id. IGP 1632 č. 118), zahrnuj ící polohy 264 až 283 z El úseku (sekv. id. IGP 1633 č. 119), zahrnující polohy 276 až 295 z El úseku (sekv. id. IGP 1634 č. 120), zahrnuj ící polohy 288 až 307 z El úseku (sekv. id. IGP 1635 č. 121) a zahrnující polohy 300 až 319 z El úseku (sekv. id. IGP 1636 zahrnující polohy 312 až 331 z El úseku (sekv. id.

č. 122), a, volitelně, farmaceuticky přijatelné adjuvans.

7. Profylaktický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že indukuje HCV-specifické protilátky.
8. Profylaktický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že stimuluje aktivitu T lymfocytů.
9. Profylaktický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 vyznačující se tím, že je schopný vyvolat ochranu proti následné infekci HCV genotypem nebo podtypem odlišným od HCV genotypu nebo podtypu nebo HCV genotypů nebo podtypů, ze kterých pocházejí El, E2 nebo E1/E2 proteinové komplexy.

• · • · ·· · · · · • · · · · · · ·

139

10. Léčivý vakcinační přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho z následujících El a E2 peptidů:

El-33 zahrnující aminokyseliny 193 až 212 z El úseku (sekv. id. č. 57),

El-35 zahrnující aminokyseliny 205 až 224 z El V2 úseku (sekv. id. č. 58) ,

E1-35A zahrnující aminokyseliny 208 až 227 z El V2 úseku (sekv. id. č. 59) , lbEl zahrnující aminokyseliny 192 až 228 z El úseku VI, Cl a V2 úseků (sekv. id. č. 53),

El-51 zahrnující aminokyseliny 301 až 320 z El úseku (sekv. id. č. 66), El-53 zahrnující aminokyseliny 313 až 332 z El C4 úseku (sekv. id. č. 67) Z El-55 zahrnující aminokyseliny 325 až 344 z El úseku (sekv. id. č. 68),

Env 67 nebo E2-67 zahrnující aminokyselinové polohy 397 až 418 z E2 úseku (sekv. id. č. 72),

Env 23 nebo E2-23 zahrnuj ící polohy 583 až 602 z E2 úseku (sekv. id. č. 86), t Env 25 nebo E2-25 zahrnuj ící polohy 595 až 614 z E2 úseku (sekv. id. č. 87) , Env 27 nebo E2-27 zahrnuj ící polohy 607 až 626 z E2 úseku (sekv. id. č. 88) , Env 17B nebo E2-17B zahrnující polohy 547 až 586 z E2 úseku (sekv. id. č. 83) , Env 13B nebo E2-13B zahrnuj ící polohy 523 až 542 z E2 úseku

(sekv. id. č. 82), > · · • · · • · · • · · · • · · · • ·

140

IGP 1626 zahrnující č. 112), polohy 192 až 211 z El úseku (sekv. id. IGP 1627 zahrnující polohy 204 až 223 z El úseku (sekv. id. č. 113), IGP 1628 zahrnující č. 114), polohy 216 až 235 z El úseku (sekv. id. IGP 1629 zahrnující polohy 228 až 247 z El úseku (sekv. id. č. 115), IGP 1630 zahrnující Č. 116), polohy 240 až 259 z El úseku (sekv. id. IGP 1631 zahrnující č. 117), polohy 252 až 271 z El úseku (sekv. id. IGP 1632 zahrnující polohy 264 až 283 z El úseku (sekv. id. č. 118), IGP 1633 zahrnující polohy 276 až 295 z El úseku (sekv. id. č. 119), IGP 1634 zahrnující polohy 288 až 307 z El úseku (sekv. id. č. 120), IGP 1635 zahrnující polohy 300 až 319 z El úseku (sekv. id. č. 121) a IGP 1636 zahrnující polohy 312 až 331 z El úseku (sekv. id. č. 122) , a, volitelně, farmaceuticky přijatelné adjuvans. 11. Léčivý přípravek v y z n a Č ' u j i c í s e tím, že

obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho z následujících El a E2 peptidů:

El-31 zahrnující aminokyseliny 181 až 200 úseku jádro/El VI (sekv. id. č. 56) Z El-33 zahrnující id. č. 57), aminokyseliny 193 až 212 z El úseku (sekv. El-35 zahrnující (sekv. id. č. 58) aminokyseliny r 205 až 224 z El V2 úseku

• · · · φφφφ φ φ φ • · ·· φ · φφ · · φ • 9 9 9 9 9 9 9 Φφφ Ο φ • Φφφ ΦΦΦΦ φφφφ

99 ·· φφ φ> φφ φ,

141

Ε1-35Α zahrnující aminokyseliny 208 až 227 z El V2 úseku (sekv. id. č. 59), lbEl zahrnující aminokyseliny 192 až 228 z El úseku VI, Cl a V2 úseků (sekv. id. č. 53),

El-51 zahrnující aminokyseliny 301 až 320 z El úseku (sekv. id. č. 66) ,

El-53 zahrnující aminokyseliny 313 až 332 z El C4 úseku (sekv. id. č. 67),

El-55 zahrnující aminokyseliny 325 až 344 z El úseku (sekv. id. č. 68),

Env 23 nebo E2-23 (sekv. id. č. 86), zahrnuj ící polohy 583 až 602 z E2 úseku Env 25 nebo E2-25 (sekv. id. č. 87) , zahrnuj ící polohy 595 až 614 z E2 úseku Env 27 nebo E2-27 (sekv. id. č. 88), zahrnující polohy 607 až 626 z E2 úseku Env 17B nebo E2-17B (sekv. id. č. 83), zahrnující polohy 547 až 586 z E2 úseku Env 13B nebo E2-13B (sekv. id. č. 82), zahrnuj ící polohy 523 až 542 z E2 úseku IGP 1626 zahrnující č. 112), polohy 192 až 211 z El úseku (sekv . id. IGP 1627 zahrnující č. 113), polohy 204 až 223 z El úseku (sekv . id. IGP 1628 zahrnující č. 114), polohy 216 až 235 z El úseku (sekv . . id. IGP 1629 zahrnující č. 115), polohy 228 až 247 z El úseku (sekv . id. IGP 1630 zahrnující polohy 240 až 259 z El úseku (sekv . id.

« · • · · · · · ·· w ·· ·* · » · ·

142

č. 116),

IGP 1631 č. 117), zahrnuj ící polohy 252 až 271 z El úseku (sekv. id. IGP 1632 č. 118), zahrnuj ící polohy 264 až 283 z El úseku (sekv. id. IGP 1633 č. 119), zahrnuj ící polohy 276 až 295 z El úseku (sekv. id. IGP 1634 č. 120), zahrnuj ící polohy 288 až 307 z El úseku (sekv. id. IGP 1635 č. 121) a zahrnuj ící polohy 300 až 319 z El úseku (sekv. id. IGP 1636 zahrnuj ící polohy 312 až 331 z El úseku (sekv. id.

č. 122), a, volitelně, farmaceuticky přijatelné adjuvans.

12. Terapeutický přípravek podle nároku 10 nebo 11 vyznačující se tím, že indukuje HCV-specifické protilátky. 13. Terapeutický přípravek podle nároku 10 nebo 11 vyznačující se tím, že stimuluje aktivitu T lymfocytů.

14. Terapeutický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 10 až 13 vyznačující se tím, že je terapeuticky účinný u HCV nosiče infikovaného HCV genotypem nebo podtypem odlišným od HCV genotypu nebo podtypu nebo HCV genotypů nebo podtypů, ze kterých pocházejí El, E2 nebo E1/E2 proteinové komplexy.

15. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden z následujících El a E2 peptidů:

IGP 1626 zahrnující polohy 192 až 211 z El úseku (sekv. id.

* * ·» « * ♦· · · · · 9 ·

4 9 4.4 4 4 9 · · 4 • 44 * · ·» v 4 ·

« 4 4 143 4 · 4 4 4.4 4 4 4 · č. 112), IGP 1627 zahrnuj ící polohy 204 až 223 z El úseku (sekv. id. č. 113), IGP 1628 zahrnuj ící polohy 216 až 235 z El úseku (sekv. id. č. 114), IGP 1629 zahrnuj ící polohy 228 až 247 z El úseku (sekv. id. č. 115), IGP 1630 zahrnuj ící polohy 240 až 259 z El úseku (sekv. . id. č. 116), IGP 1631 zahrnuj ící polohy 252 až 271 z El úseku (sekv. id. č. 117), IGP 1632 zahrnuj ící polohy 264 až 283 z El úseku (sekv. id. č. 118), IGP 1633 zahrnuj ící polohy 276 až 295 z El úseku (sekv. id. č. 119), IGP 1634 zahrnuj ící polohy 288 až 307 z El úseku (sekv. id. č. 120), IGP 1635 zahrnuj ící polohy 300 až 319 z El úseku (sekv. id. č. 121) a IGP 1636 zahrnující polohy 312 až 331 z El úseku (sekv. id. č. 122), a, volitelně , farmaceuticky přijatelné adjuvans. 16. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 4, 5, 7 až 9 a 12 až 14 v y z n a č u jící s e t i m, že cysteiny

rekombinantních HCV obalových proteinů jsou blokovány nebo podle kteréhokoliv z nároků 3, 6, 10, 11 a 15, kde cysteiny El a E2 peptidů jsou blokovány.

17. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 4, 5, 7 až 9 a 12 až 14 vyznačující se tím, že rekombinantní HCV obalové proteiny jsou přidány jak částice podobné virovým částicím.

• ·« ·

1 144 ·· ·· ·· ·· ·· *··* ·«·♦ · • · ·· φ » ·· · • · · · ♦ · · · · · « • ·· · ♦ · « · • » 18. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 4, 5, 7 až 9 a 12 až 14 v y z n a č u j ící se t í m, že rekombinantni HCV El obalový protein je Els protein • 19. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1, 2, 4, 5, 7 až 9 a 12 až 14 v y z n a č u j ící se t í m, že rekombinantni HCV obalové proteiny jsou vytvářeny

rekombinantními savčími buňkami, rekombinantními kvasinkami nebo rekombinantním virem.
20. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 3, 6, 10, 11 a 15 vyznačující se tím, že peptidy jsou rekombinantni peptidy nebo syntetické peptidy.
21. Imunogenní přípravek vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantni virus umožňující expresi alespoň jednoho HCV rekombinantního obalového proteinu vybraného z El proteinu a/nebo E2 proteinu a částí El a E2 proteinů, a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans.
22. Vakcinační přípravek vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantni virus umožňující expresi alespoň jednoho HCV rekombinantního obalového proteinu vybraného z El proteinu a/nebo E2 proteinu a částí El a E2 proteinů, a volitelně farmaceuticky přijatelné adjuvans.
23. Přípravek podle nároku 21 nebo 22 vyznačující se tím, že je účinný proti HCV genotypu nebo podtypu odlišnému od HCV genotypu nebo podtypu, ze kterého pochází El protein a/nebo E2 protein nebo jejich části.

• · · ·

9 9 9 « * 9 99

9 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 ··

99 99

9 9 9 9

9 9 99

9 9 9 9

9 9 9 · ♦ · »»

145

24. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23 vyznačuj i protilátky. c i se t i m, že indukuje HCV-specifické 25. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 21 až 23 vyznačuj i c i se tím, že stimuluje aktivitu

T lymfocytů.
26. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 21 až 25 vyz na čující se tím, že rekombinantní virus je rekombinantní virus vakcínie, rekombinantní virus avipox nebo rekombinantní Ankarský Modifikovaný Virus.