MXPA02008886A - Proteinas purificadas de envoltura del virus de hepatitis c para uso diagnostico y terapeutico. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para proteinas de envoltura recombinantes oligomericas simples o especificas del HCV recombinante seleccionadas del grupo que e conforma por E1 y/o E2 y/o E1/E2, caracterizada en que al lisar las celulas huesped transformadas para aislar la proteina que se expresa de forma recombinante una disociacion de enlace de bisulfuro o paso de reduccion se realiza con un agente de disociacion de enlace de bisulfuro. La presente invencion tambien se refiere a una composicion aislada por dicho metodo. La presente invencion tambien se refiere a la aplicacion de diagnostico y terapeutica de estas composiciones. Ademas, la invencion se refiere al uso de la proteina E1 de HCV y peptidos para el pronostico y monitoreo de la efectividad clinica y/o resultado clinico del tratamiento del HCV.

Description

PROTEÍNAS PURIFICADAS DE ENVOLTURA DEL VIRUS DE HEPATITIS C PARA USO DIAGNÓSTICO Y TERAPÉUTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo general de la expresión y purificación de proteínas recombinantes, péptidos sintéticos, diagnóstico de la infección por HCV, tratamiento profiláctico de la infección por HCV y con el pronóstico/ monitoreo de la eficacia clínica del tratamiento de un individuo con hepatitis crónica o el pronóstico/ monitoreo de la enfermedad natural. Más particularmente, la presente invención se relaciona con los métodos de purificación de las proteínas de la envoltura del virus de la hepatitis C, el uso diagnóstico, profiláctico o terapéutico de las proteínas de la envoltura del HCV purificadas de acuerdo a los métodos descriptos en la presente invención, el uso de proteínas de la envoltura aislada u oligomérica específica E1 y/o E2 y/o E1/E2 en ensayos para monitorear y/o diagnosticar y/o tratar la enfermedad. La enfermedad también se relaciona con los epitopes de las proteínas E1 y/o E2 de la envoltura y anticuerpos monoclonales dirigidos a ellos, como así también su uso en el diagnóstico, profilaxis o tratamiento. INTRODUCCIÓN DE LA INVENCIÓN La proteína E2 purificada de lisatos celulares de acuerdo a los métodos descriptos en la presente invención reacciona con aproximadamente el 95% de los sueros de pacientes. Esta reactividad es similar a la obtenida con la E2 segregada por las células CHO (Spaete et al., 1992). No obstante, la forma de expresión intracelular de E2 puede ser más semejante a la proteína de la envoltura viral nativa porque REF. 141169 contiene motivos de carbohidratos ricos en mañosa, mientras que la proteína E2 secretada por las células CHO es modificada adicionalmente con fracciones de galactosa y ácido siálico. Cuando la mitad aminoterminal de E2 se expresa en el sistema baculovirus, sólo aproximadamente 13 a 21 % de los sueros de diversos grupos de pacientes pueden ser detectados (Inoue et al., 1992). Después de la expresión de E2 de E. coli, la reactividad de los sueros HCV fue aún menor y varió entre 14 (Yokosuka et al., 1992) y 17% (Mita et al., 1992). Aproximadamente 75% de los sueros HCV (y 95% de los pacientes crónicos) son anti-E1 positivos utilizando la proteína E1 recombinante purificada, expresada en vaccinia, de la presente invención, en agudo contraste con los resultados de Kohara et al. (1992) y de Hsu et al. (1993). Kohara et al. utilizaron una proteípa E1 expresada en virus vaccipia y detectaron anticuerpos anti-E1 en 7 a 23% de los pacientes, mientras que Hsu et al. sólo detectaron 14/50 (28%) de los sueros utilizando E1 expresada en baculovirus. Estos resultados demuestran que no sólo se requiere un buen sistema de expresión sino también un buen protocolo de purificación para lograr una elevada reactividad de las proteínas de la envoltura con los sueros de pacientes humanos. Esto puede ser obtenido utilizando el sistema de expresión y/o los protocolos de purificación apropiados de la presente invención, que garantizan la conservación del plegamiento natural de la proteína; los protocolos de purificación de la presente invención garantizan la eliminación de las proteínas contaminantes y preservan la conformación y, por lo tanto, la reactividad de las proteínas de la envoltura del HCV. Las cantidades de proteína de la envoltura del HCV purificada necesapa para los ensayos de pesquisa diagnóstica se encuentran en el rango de gramos por año. Para la producción de una vacuna se requerirían cantidades aún mayores. Por lo tanto, el sistema de virus vaccinia podría ser utilizado para seleccionar las mejores construcciones de expresión y para el aumento progresivo limitado, pudiéndose lograr la expresión y purificación a gran escala de proteínas aisladas u oligoméricas específicas de la envoltura conteniendo carbohidratos ricos en mañosa cuando son expresadas en diversas cepas de levaduras. En el caso de la hepatitis B, por ejemplo, la elaboración de HbsAg de células de mamíferos fue mucho más costosa en comparación con las vacunas de hepatitis B derivadas de levaduras. OBJETIVOS DE LA PRESENTE INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo método de purificación para la expresión de las proteínas recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/ E2, de manera tal que tales proteínas recombinantes sean directamente utilizables para fines diagnósticos y de vacunación como proteínas recombinantes simples u oligoméricas específicas sin contaminantes en vez de los agregados. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar composiciones que comprenden glucoproteínas recombinantes de E1 y/o E2 y/o E1/ E2 que comprenden epitopes de conformación de los dominios E1 y/o E2 del HCV. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar nuevas construcciones de vectores recombinantes para la expresión recombinante de proteínas E1 y/o E2 y/o E1/ E2, como así también células huésped transformadas con construcciones de dicho vector. También es otro objetivo de la presente invención proporcionar un método para producir y purificar proteínas recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/ E2 de HCV.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar usos diagnósticos e inmunogénicos de las proteínas recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/ E2 de HCV de la presente invención, como así también proporcionar dispositivos para uso diagnóstico, en vacunas o terapéuticos que comprendan cualquiera de las proteínas recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/ E2 de HCV de la presente invención. Otro objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo uso para las proteínas E1 , E2 y/o E1/ E2 o partes adecuadas de las mismas, para el monitoreo/ pronóstico de la respuesta al tratamiento de los pacientes (por ejemplo, con interferón) que padecen la infección por HCV. También es un objetivo de la presente invención informar el uso de las proteínas recombinantes E1 , E2 y/o E1/E2 de la presente invención para la pesquisa de HCV y pruebas confirmatorias de anticuerpos. También es un objetivo de la presente invención proporcionar péptidos de E1 y/o E2 que pueden ser utilizados para el diagnóstico de la infección por HCV y para la elevación de anticuerpos. Tales péptidos también pueden ser utilizados para aislar anticuerpos monoclonales humanos. También es un objetivo de la presente invención proporcionar anticuerpos monoclonales, más particularmente anticuerpos monoclonales humanos o anticuerpos monoclonales de ratón humanizados, que reaccionan específicamente con epitopes de E1 y/o E2, ya sea comprendidos en péptidos o epitopes de conformación comprendidos en proteínas recombinantes.

También es un objetivo de la presente invención proporcionar usos posibles de los anticuerpos monoclonales anti-E1 o anti-E2 para la detección del antígeno de HCV o para el tratamiento de la infección crónica por HCV. También es un objetivo de la presente invención proporcionar dispositivos para el monitoreo/ pronóstico de la respuesta al tratamiento (por ejemplo, con interferón) de pacientes que sufren una infección por HCV o monitoreo/ pronóstico de la evolución de la enfermedad. Todos los objetivos de la presente invención se consideran cubiertos por las incorporaciones que se presentan a continuación. DEFINICIONES Las siguientes definiciones sirven para ilustrar los diferentes términos y expresiones utilizados en la presente invención. El término "proteína simple de la envoltura del virus de hepatitis C" se refiere a un polipéptido o análogo (es decir, mimotopes) que comprenden una secuencia de aminoácidos (y/o análogos de aminoácidos) que definen al menos un epitope de HCV o la región E1 o E2. Estas proteínas simples de la envoltura, en el sentido amplio de la palabra, pueden ser formas monoméricas u homo-oligoméricas de proteínas de la envoltura expresadas por recombinación. Típicamente, las secuencias que definen el epitope corresponden a la secuencia de aminoácidos de la región E1 o E2 del HCV (ya sea en forma idéntica o mediante la sustitución de análogos del residuo de aminoácidos nativos que no destruyen el epitope). En general, la secuencia que define al epitope tendrá 3 aminoácidos de longitud o más, más típicamente 5 aminoácidos de longitud o más, más típicamente 8 aminoácidos de longitud o más y aún más típicamente, 10 aminoácidos de longitud o más. Con respecto a los epitopes de conformación, la longitud de la secuencia que define al epitope puede estar expuesta a amplias variaciones, debido a que se cree que estos epitopes están formados por la forma tridimensional del antígeno (es decir, el plegamiento). Por lo tanto, los aminoácidos que definen el epitope pueden ser relativamente escasos en número, pero encontrarse ampliamente dispersos en la longitud de la molécula, produciéndose la conformación correcta del epitope mediante el plegamiento. Las porciones del antígeno entre los residuos que definen el epitope no serían críticas para la estructura conformacional del epitope. Por ejemplo, la deleción o sustitución de estas secuencias interpuestas no afectarían la conformación del epitope siempre que se mantengan las secuencias críticas para su conformación (es decir, las cisteínas que intervienen en las ligaduras bisulfuro, sitios de glucosilación, etc.). Un epitope de conformación también puede estar constituido por dos o más regiones esenciales de subunidades de un homooligómero o heterooligómero. Los antígenos de HCV de la presente invención comprenden epitopes de conformación de los dominios E1 y/o E2 (envoltura) del HCV. Se estima que el dominio E1 , que correspondería a la proteína de la envoltura viral incluye a los aminoácidos 192-383 de la glucoproteína de HCV (Hijikata et al., 1991). Se cree que ante la expresión en un sistema de mamífero (glucosilado) tiene un peso molecular aproximado de 35 kDa, según se determina por SDS-PAGE. La proteína E2, anteriormente llamada NS1 , comprendería a los aminoácidos 384-809 o 384-746 (Grakoui et al., 1993) de la poliproteína y también sería una proteína de la envoltura.

Ante la expresión en un sistema vaccinia (glucosilado), tendría un peso molecular en gel aparente de aproximadamente 72 kDa. Se entiende que estos puntos de corte de la proteína son aproximaciones (es decir, el extremo carboxiterminal de E2 podría encontrarse en algún lugar en la región de 730-820 aminoácidos, es decir, en los aminoácidos 730, 735, 740, 742, 744, 745, preferiblemente 746, 747, 748, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 809, 810, 820). La proteína E2 también podría expresarse junto con la E1 , P7 (aa 747-809), NS2 (aa810-1026), NS4A (aa1658-1711 ) o NS4B (aa 1712-1972). La expresión, junto con estas otras proteínas de HCV sería importante para obtener el plegamiento correcto de la proteína. También se entiende que los aislamientos utilizados en la sección correspondiente a los ejemplos de la presente invención no tienen la intención de limitar el alcance de la invención y que cualquier aislamiento de HCV de los tipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o cualquier otro nuevo genotipo de HCV es una fuente adecuada de la secuencia de E1 y/o E2 para la práctica de la presente invención. Los antígenos E1 y E2 utilizados en la presente invención pueden ser proteínas virales de longitud completa, sus versiones de longitud sustancialmente completa o sus fragmentos funcionales (es decir, fragmentos que no son la secuencia faltante esencial para la formación o retención de un epitope). Además, los antígenos de HCV de la presente invención también pueden incluir otras secuencias que no bloquean o impiden la formación del epitope de conformación de interés. La presencia o ausencia de un epitope de conformación puede ser determinada fácilmente mediante la identificación del antígeno de interés con un anticuerpo (policlonal sérico o monoclonal contra el epitope de conformación) y comparando su reactividad con la de una versión desnaturalizada del antígeno que sólo conserva epitopes lineales (si es que posee alguno). En tal pesquisa utilizando anticuerpos policlonales, podría ser ventajoso adsorber en primer lugar el suero policlonal con el antígeno desnaturalizado y observar si conserva anticuerpos contra le antígeno de interés. Los antígenos HCV de la presente invención pueden ser sintetizados con cualquier método de recombinación que proporcione el epitope de interés. Por ejemplo, la expresión intracelular recombinante en células de mamíferos o de insectos es un método preferido para proporcionar antígenos E1 y/o E2 glucosilados en la conformación "nativa" como es el caso de los antígenos naturales de HCV. Las células de levaduras y de cepas mutantes de éstas (es decir, mutante mnn 9 (Kriskem et al., 1994) o mutantes de glucosilación depvados por medio de selección de resistencia al vanadato (Ballou et al., 1991 ) serían idealmente adecuadas para la producción de azúcares secretados del tipo con alto contenido de mañosa; mientras que las proteínas secretadas por células de mamíferos pueden contener modificaciones que incluyan galactosa o ácido siálico que serían indeseables para ciertas aplicaciones diagnósticas o de la vacuna. No obstante, también sería posible y suficiente para ciertas aplicaciones, como se conoce para las proteínas, expresar el antígeno en otros huéspedes recombinantes (como E. coli) y renaturalizar la proteína después de la recuperación. El término "polipéptido de fusión" describe a un polipéptido en el cual los antígenos del HCV forman parte de una cadena simple, continua de aminoácidos, que no se encuentra en la naturaleza. Los antígenos de HCV pueden ser conectados directamente entre sí por ligaduras peptídicas o separados por secuencias de aminoácidos interpuestas. Los polipéptidos de fusión también pueden contener secuencias de aminoácidos exógenos al HCV. El término "fase sólida" descpbe a un cuerpo sólido al cual se unen por medios covalentes o no covalentes, como la adsorción hidrofóbica, los aptígenos individuales de HCV o el polipéptido de fusión. El término "muestra biológica" descpbe a un líquido o tejido de un individuo mamífero (es decir, un antropoide, un ser humano) que habitualmente contiene anticuerpos producidos por el individuo, más particularmente, anticuerpos contre el HCV. El líquido o tejido también puede contener antígenos de HCV. Tales componentes son conocidos en el arte e incluyen, sin limitaciones, sangre, plasma, suero, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, secreciones de los aparatos respiratorio, intestinal o genitourinario, lágrimas, saliva, leche, leucocitos y mielomas. Los componentes corporales incluyen a los líquidos biológicos. El término "líquido biológico" se refiere a un líquido obtenido de un organismo. Algunos líquidos biológicos son utilizados como fuente de otros productos, como factores de coagulación (por ejemplo, Factor VIII:C), seroalbúmina, hormona de crecimiento y similares. En tales casos, es importante que la fuente del líquido biológico esté libre de contaminación por virus tales como HCV. El término "inmunológicamente reactivo" significa que el antígeno en cuestión reaccionará específicamente con anticuerpos anti-HCV presentes en un componente corporal de un individuo infectado con HCV. El término "complejo inmune" describe la combinación formada cuando un anticuerpo se une a un epitope sobre un antígeno.

"E1", como es utilizado aquí, se refiere a una proteína o polipéptido expresado en los primeros 400 aminoácidos de una poliproteína de HCV, en ocasiones denominada proteína E, ENV o S. en su forma natural es una glucoproteína de 35 kDa firmemente asociada con membranas. En la mayoría de las cepas naturales de HCV, la proteína E1 es codificada en la poliproteína viral después de la proteína C (central). La proteína E1 se extiende, aproximadamente, desde el aminoácido (aa) 192 hasta aproximadamente! aminoácido 383 de la longitud completa de la poliproteína. El término "E1", como es utilizado aquí, incluye análogos y formas truncadas que reaccionan inmunológicamente en forma cruzada con la E1 natural e incluye a las proteínas E1 de los genotipos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o cualquier otro tipo o subtipo de HCV identificado recientemente. "E2", como es utilizado aquí, se refiere a una proteína o polipéptido expresado en los primeros 900 aminoácidos de una poliproteína HCV, en ocasiones denominada proteína NS1. en su forma natural es una glucoproteína de 72 kDa fuertemente asociada con membranas. En la mayoría de las cepas naturales de HCV, la proteína E2 es codificada en la poliproteína viral después de la proteína E1. Esta se extiende desde la posición del aminoácido 384 hasta la del aminoácido 746, aproximadamente; otra forma de E2 se extiende hasta la posición del aminoácido 809. el término "E2", como se utiliza aquí, también incluye análogos y formas truncadas que reaccionan inmunológicamente en forma cruzada con ia E2 natural. Por ejemplo, Kato et al. (1992) informaron inserciones de múltiples codones entre el codón 383 y 384, así como eliminaciones de los aminoácidos 384-387.

"E1/ E2", como se utiliza aquí, se refiere a una forma oligomérica de proteínas de la envoltura que contiene al menos un componente E1 y al menos un componente E2. El término "proteínas de la envoltura E1 y/o E2 y/o E1/ E2 oligoméricas específicas" se refiere a proteínas E1 o E2 monoméricas simples (simples en el sentido estricto de la palabra), así como proteínas oligoméricas E1 y/o E2 y/o E1/ E2 oligoméricas específicas expresadas por recombinación. Estas proteínas de la envoltura, simples u oligoméricas específicas, de acuerdo a la presente invención, pueden ser definidas, además, por la siguiente fórmula (E1)x(E2)y, en donde x puede ser un número entre 0 y 100 e y, un número entre 0 y 100, siempre y cuando no sean ambos iguales a 0. Con x=1 e y=0, tales proteínas de la envoltura ¡ncluyen a la E1 monomérica. El término "homooligómero", como es utilizado aquí se refiere a un complejo de E1 y/o E2 que contiene más de un monómero E1 o E2, es decir, dímeros E1/ E1 , trímeros E1/ E1/ E1 o tetrámeros E1/ E1/ E1/ E1 y dímeros E2/ E2, trímeros E2/ E2/ E2 o tetrámeros E2/ E2/ E2/ E2, pentámeros y hexámeros E1 , pentámeros y hexámeros E2 o cualquier homooligómero de E1 o E2 de un orden más elevado, son todos "homooligómeros" de acuerdo al alcance de esta definición. Los oligómeros pueden contener uno, dos o varios monómeros diferentes de E1 o E2 obtenidos de diferentes tipos o subtipos de virus de hepatitis C, incluyendo, por ejemplo, los descriptos en una aplicación internacional publicada como WO 94/25601 y la aplicación europea N° 948701166.9, de acuerdo a las presentes aplicaciones. Tales oligómeros mixtos aún son homooligómeros de acuerdo al alcance de esta invención y podrían permitir un diagnóstico, profilaxis o tratamiento más universales del HCV.

El término "purificado", según se aplica a las proteínas mencionadas aquí, se refiere a una composición en la cual la proteína deseada comprende al menos el 35% del componente proteico total de la composición. La proteína deseada preferiblemente comprende al menos el 40%, más prefepblemente al menos 50% y más prefepblemente al menos 60%, aún más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente al menos 95% del componente proteico total. La composición puede contener otros compuestos como carbohidratos, sales, lípidos, solventes y similares, sin afectar la determinación del porcentaje de pureza como se utiliza aquí. Una proteína HCV "aislada" debe tener una composición de proteína HCV con al menos un 35% de pureza. El término "proteínas esencialmente purificadas" se refiere a las proteínas purificadas de manera tal que pueden ser utilizadas para métodos de diagnóstico ¡n vitro y como compuesto terapéutico. Estas proteínas carecen sustancialmente de proteínas celulares, proteínas derivadas de vectores u otros componentes virales de HCV. Habitualmente estas proteínas son purificadas hasta la homogeneidad (al menos 80% de pureza, preferiblemente 90%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 97%, más preferiblemente 98%, más preferiblemente 99%, aún más preferiblemente 99,5% y más preferiblemente, las proteínas contaminantes deben ser indetectables con los métodos convencionales como la tinción con SDS-PAGE y argéntica. El término "expresión recombinante", utilizado en el contexto de la presente invención, se refiere al hecho que las proteínas de la presente invención son producidas por métodos recombinaptes de expresión, ya sea en procariotas o en eucariotas inferiores o superiores como se comenta en detalle más adelante. El término "eucariota inferior" se refiere a células huésped como levaduras, hongos y similares. Los eucariotas inferiores en general (pero no necesariamente) son unicelulares. Los eucariotas inferiores preferidos son levaduras, en especial especies de Saccharomvces. Schizosaccharomvces, Kluveromvces, Pichia (por ejemplo, Pichia pastoris). Hansenula (por ejemplo, Hansenula polvmorpha), Yarowia, Schwaniomyces, Schizosaccharomvces, Zvgosaccharomyces y similares. Saccharomvces cerevisiae, S. carlshergensis y K. lactis son las levaduras huésped utilizadas con mayor frecuencia y son hongos huésped convenientes. El término "procariotas" se refiere a huéspedes como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomvces. Estos huéspedes también son contemplados en la presente invención. El término "eucariota superior" se refiere a células huésped derivadas de animales superiores, como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células huésped eucariotas superiores preferidas actualmente son las derivadas de hámster chino (por ejemplo, CHO), mono (por ejemplo, células COS y Vero), riñon de hámster lactante (BHK), riñon de cerdo (PK15), células 13 de riñon de conejo (RK13), la línea celular 143 B de osteosarcoma humano, la línea de células humana HeLa y líneas celulares humanas de hepatoma, como Hep G, y líneas celulares de insectos (por ejemplo, Spodoptera frugiperda). Las células huésped pueden ser provistas en suspensión o en cultivos en frascos, cultivos de tejidos, cultivos de órganos y similares. Alternativamente, las células huésped también pueden ser de animales transgénicos. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto; por lo tanto, péptidos, oligopéptidos y proteínas son incluidos en la definición de polipéptido. Este término tampoco se refiere ni excluye a las modificaciones del polipéptido después de la expresión, por ejemplo, glucosilaciones, aceti laciones, fosforilaciones y similares. En la definición se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, PNA, etc.), polipéptidos con ligaduras sustituidas, como así también con otras modificaciones conocidas en el arte, tanto producidas naturalmente como no naturales. El término "polinucleótido o ácido nucleico recombinante" designa a un polinucleótido o ácido nucleico de origen genómico, cADN, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (1) no se asocia con todo el polinucleótido o con una porción de él al cual se encuentra asociado en la naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido diferente al que se une en la naturaleza o (3) no existe en la naturaleza. Los términos "células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos que denotan microorganismos o líneas celulares eucariotas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refiere a células que pueden ser o han sido utilizadas como receptoras de un vector recombinante o de otro polinucléotido de transferencia e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Se comprende que la progenie de una única célula parental no necesariamente será completamente idéntica en morfología o en ADN genómico o total complementario a la célula madre original, debido a mutación natural, accidental o deliberada. El término "replicón" es cualquier elemento genético, por ejemplo, un plásmido, un cromosoma, un virus, un cósmido, etc., que se comporta como unidad autónoma de replicación polinucleótida en una célula, es decir, capaz de replicarse bajo su propio control. El término "vector" es un replicón que comprende además secuencias que aseguran la replicación y/o expresión de un marco de lectura abierto deseado. El término "secuencia control" se refiere a secuencias polinucleótidas necesarias para efectuar la expresión de las secuencias de codificación a las cuales están ligadas. La naturaleza de tales secuencias de control difiere según el organismo huésped; en los procariotas, tales secuencias de control en general incluyen el promotor, un sitio de unión ribosomal y terminadores; en los eucariotas, en general, tales secuencias de control incluyen promotores, terminadores y, en algunos casos, potenciadores. El término "secuencias de control" incluye, como mínimo, a todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líderes que gobiernan la secreción. El término "promotor" es una secuencia de nucleótidos que está constituida por secuencias de consenso que permiten la unión de la ARN polimerasa al molde de ADN en forma tal que se inicia la producción de ARNm en el sitio de iniciación normal de la transcripción para el gen estructural adyacente.

La expresión "operativamente unido" se refiere a la yuxtaposición en la cual los componentes descriptos se encuentran en una relación que les permite funcionar como estaba indicado. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia de codificación está ligada en forma tal que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. Un "marco de lectura abierto" (MLA) es una región de una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido y no contiene codones de detención; esta región puede representar una porción de una secuencia codificante o una secuencia codificante total. Una "secuencia codificante" es una secuencia de polinucleótido que es transcripta a ARNm y/o traducida a polipéptido cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por una traducción del codón de inicio en el terminal 5' y una traducción del codón de detención en el terminal 3'. Una secuencia de codificación puede incluir, aunque sin limitarse a ello, ARNm, ADN (incluyendo ADNc) y secuencias recombinantes de polinucleótidos. "Epitope" o "determinante antigénico", como es utilizado aquí, designa a una secuencia de aminoácido que es inmunorreactiva. En general, un epitope consiste en al menos 3 o 4 aminoácidos y más habitualmente, en 5 o 6 aminoácidos; en ocasiones el epitope consiste en 7 u 8 aminoácidos o incluso, en 10 aminoácidos. Como es utilizado aquí, un epitope de un polipéptido designado denota epitopes con la misma secuencia de aminoácidos que el epitope en el polipéptido designado y sus equivalentes inmunológicos. Tales equivalentes también incluyen variantes específicas de cepa, subtipo (= genotipo) o tipo (= grupo), por ejemplo, de las secuencias o cepas actualmente conocidas pertenecientes a los genotipos 1a, 1b, 1c, 1 d, 1e, 1f, 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3a, 3b, 3c, 3d, 3e, 3f, 3g, 4a, 4b, 4c, 4d, 4e, 4f, 4g, 4h, 4¡, 4j, 4k, 41, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c, 7a, 7b, 7c, 8a, 8b, 9a, 9b, 10a o cualquier otro (sub)tipo recientemente definido de HCV. Se debe comprender que los aminoácidos que constituyen el epitope no necesariamente forman parte de una secuencia lineal, sino que pueden estar interpuestos entre cualquier número de aminoácidos, formando un epitope de conformación. El término "inmunogénico" se refiere a la capacidad de una sustancia de causar una respuesta humoral y/o celular, ya sea cuando está sola o unida a un transportador, en presencia o ausencia de un adyuvante. Por "neutralización" se entiende una respuesta inmunológica que bloquea la infectividad, ya sea en forma parcial o completa, de un agente infeccioso. Una "vacuna" es una composición inmunogénica capaz de originar protección contra el HCV, parcial o completamente. Una vacuna también puede ser útil para el tratamiento de un individuo, en cuyo caso se denomina vacuna terapéutica. El término "terapéutico" se refiere a una composición capaz de tratar la infección por HCV. El término "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad de polipéptido que posee el epitope suficiente para inducir una respuesta inmunogénica en el individuo al cual es administrado o que reacciona inmunológicamente en cantidades detectables en el sistema al cual está destinado (por ejemplo, inmunoensayo). Preferiblemente, la cantidad efectiva es suficiente para efectuar el tratamiento, como se definió anteriormente. La cantidad exacta necesaria variará de acuerdo a la aplicación. Para las aplicaciones de vacunas o para la generación de antisueros/ anticuerpos policlonales, por ejemplo, la cantidad efectiva podrá variare según la especie, la edad y la condición general del individuo, la severidad de la afección a tratar, el polipéptido particular seleccionado y su modo de administración, etc. También se cree que se encontrarán cantidades efectivas en un rango relativamente amplio, no crítico. Una cantidad efectiva apropiada puede ser determinada fácilmente utilizando sólo la experimentación de rutina. Los rangos preferidos de las proteínas de la envoltura aisladas u oligoméricas específicas E1 y/o E2 y/o E1/ E2 para la profilaxis de la enfermedad por HCV son de 0,01 a 100 µg/ dosis, preferiblemente de 0,1 a 50 µg/ dosis. Pueden requerirse varias dosis por individuo con el fin de lograr una respuesta inmunológica suficiente y la protección ulterior contra la enfermedad por HCV. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Más particularmente, la presente invención contempla un método para aislar o purificar proteína de la envoltura simple u oligomérica específica de HCV seleccionada del grupo consistente en E1 y/o E2 y/o E1/ E2, caracterizada porque al lisar las células huésped transformadas para aislar la proteína expresada por recombinación, se produce un paso de disociación o reducción de una ligadura bisulfuro con un agente que rompe esta ligadura. La esencia de estas proteínas "simples u oligoméricas específicas" de la envoltura de la invención es que están libres de proteínas contaminantes y que no están unidas por ligaduras bisulfuro a los contaminantes.

Las proteínas, de acuerdo a la presente invención, son expresadas por recombinación en células eucariotas inferiores o superiores o en procariotas. Las proteínas recombinantes de la presente invención se encuentran, preferiblemente, glucosiladas y pueden contener glucosilaciones ricas en mañosa, híbridas o complejas. Preferiblemente, dichas proteínas son expresadas en líneas celulares de mamíferos, como se expresa en detalle en la sección correspondiente a Ejemplos o en levaduras tales como cepas mutantes de levaduras, como también se detalla en la sección correspondiente a Ejemplos. De acuerdo a la presente invención, las proteínas pueden ser secretadas o expresadas en componentes de la célula, como el RE o el aparato de Golgi. No obstante, preferiblemente, las proteínas de la presente invención poseen glucosilaciones ricas en mañosa y son retenidas en el RE o el Aparato de Golgi de las células de mamíferos o son retenidas o secretadas de las células de levaduras, preferiblemente secretadas de cepas mutantes de levaduras como el mutante mnn9 (Kriskem et al., 1994) o de mutantes que han sido seleccionados por medio de la resistencia al vandato (Ballou et al., 1991 ). Ante la expresión de las proteínas de la envoltura de HCV, los presentes inventores podrían demostrar que algunos de los grupos tilo libres de cisteínas que no intervienen en puentes bisulfuro intramoleculares o intermoleculares, reaccionan con cisteínas de proteínas derivadas del sistema de expresión del huésped (por ejemplo, vaccinia) o de otras proteínas de la envoltura del HCV (simples u oligoméricas) y forman puentes intermoleculares aespecíficos. Esto resulta en la formación de "agregados" de proteínas de la envoltura de HCV junto con proteínas contaminantes.

También se demostró en WO 92/08734 que se obtuvieron "agregados" después de la purificación, pero no se describió qué interacciones proteicas participaban. En la reivindicación de la patente WO 92/08734, la proteína recombinante E1/ E2 expresada con el sistema del virus vaccinia era parcialmente purificada como agregados y sólo se la encontró en un 70% en estado puro, por lo que los agregados purificados no eran útiles para fines diagnósticos, profilácticos o terapéuticos. Por lo tanto, un objetivo fundamental de la presente invención reside en la separación de proteínas de la envoltura de HCV, simples u oligoméricas específicas, de las proteínas contaminantes y utilizar las proteínas purificadas (> 95% de pureza) para fines diagnósticos, profilácticos o terapéuticos. Para estos fines, los inventores proporcionaron evidencias de la formación de complejos de proteínas agregadas ("agregados") sobre la base de puentes bisulfuro e interacciones no covalentes entre una proteína y otra. La presente invención proporciona un medio para clivar selectivamente las ligaduras bisulfuro bajo condiciones específicas y para separar las proteínas olivadas de las proteínas contaminantes que interfieren considerablemente con las aplicaciones diagnósticas, profilácticas y terapéuticas. Los grupos tiol libres pueden ser bloqueados (en forma reversible o irreversible) con el fin de impedir la reformación de los puentes bisulfuro o pueden ser dejados para que se oxiden y oligomericen con otras proteínas de la envoltura (véase la definición de homooligómero). Se debe comprender que tales oligómeros de proteínas son esencialmente diferentes de los "agregados" descriptos en WO 92/08734 y WO 94/01778, debido a que el nivel de proteínas contaminantes es indetectable. Dicha disociación de la ligadura bisulfuro también puede ser realizado mediante: (1 ) oxidación con ácido perfórmico por medio del ácido cisteico, en cuyo caso los residuos de cisteína son modificados en ácido cisteico (Moore et al., 1963). (2) Sulfitólisis (R-S-S-R 62 R-SO"3) por ejemplo por medio de sulfito (S02"3) junto con un oxidante adecuado tal como Cu2+, en cuyo caso la cisteína se modifica a S-sulfocisteína (Bailey y Colé, 1959). (3) Reducción por medio de mercaptanos, tales como el ditiotreitol (DDT), ß-mercapto-etanol, cisteína, glutatión Red, e-mercapto-etilamina o ácido tioglicólico, de los cuales DTT y ß-mercapto-etanol se usan con frecuencia (Cleland, 1964), constituye el método preferido de la presente invención debido a que el método puede llevarse a cabo en un entorno acuoso y la cisteína permanece ¡nmodificada. (4) Reducción por medio de una fosfina (por ej. Bu3P) (Ruegg y Rudinger, 1977). Todos estos compuestos deben considerarse, así, agentes o medios para separar enlaces de bisulfuro, de acuerdo con la presente invención. Dicho paso de separación (o reducción) del enlace de bisulfuro de la presente invención es, con preferencia, un paso parcial de separación (reducción) del enlace de bisulfuro (llevado a cabo en condiciones de separación o reducción parcial). Un agente preferido de separación o reducción del enlace de bisulfuro de acuerdo con la presente invención es el ditiotreitol (DTT). La reducción parcial se obtiene empleando una concentración baja de dicho agente reductor, es decir para el DTT, por ejemplo en el rango de concentración comprendido entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mM, con preferencia entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 20 mM, con preferencia entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 10 mM, con preferencia más de 1 mM, más de 2 mM o más de 5 mM, más preferentemente aún aproximadamente 1 ,5 mM, aproximadamente 2,0 mM, aproximadamente 2,5 mM, aproximadamente 5 mM o aproximadamente 7,5 mM. Dicho paso de separación del enlace de bisulfuro también puede llevarse a cabo en presencia de un detergente adecuado (como ejemplo de un medio para separar enlaces de bisulfuro, o en combinación con un agente separador) que sea capaz de disociar las proteínas expresadas, tal como Decil PEG, EMPIGEN-BB, NP- 40, colato sódico, Tritón X-100). El mencionado paso de reducción o separación (con preferencia, un paso de reducción o separación parcial) se lleva a cabo con preferencia en presencia de (con) un detergente. Un detergente preferido de acuerdo con la presente invención es Empigen-BB. La cantidad de detergente empleada se encuentra con preferencia comprendida en el rango de 1 a 10%, con preferencia más de 3%, más preferentemente aún en aproximadamente 3,5% de un detergente tal como Empigen-BB. Un método particularmente preferido para obtener la separación del enlace de bisulfuro emplea una combinación de un agente clásico de separación del enlace de bisulfuro, como ya se detallara con anterioridad, y un detergente (como también se detallara con anterioridad). Tal como se contempla en la sección de Ejemplos, la combinación particular de una baja concentración de DTT (de 1 ,5 a 7,5 mM) y aproximadamente 3,5% de Empigen-BB ha demostrado resultar una combinación particularmente preferida de agente reductor y detergente para la purificación de proteínas E1 y E2 expresadas en forma recombinante. Sometida a cromatografía por filtración de gel, dicha reducción parcial demostró dar como resultado la producción de proteína E1 posiblemente dimérica, y la separación de esta proteípa E1 de proteínas contaminantes que generaban falsa reactividad con su uso en ensayos inmunológicos. No obstante, debe comprenderse que también cualquier otra combinación de cualquier agente reductor conocido en la técnica, con cualquier detergente u otro medio conocido en la técnica para tornar las cisteínas más fácilmente accesibles, quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención, en la medida en que dicha combinación logre el mismo objeto de separación del puente de bisulfuro como la combinación preferida que se ejemplifica en la presente invención. Además de reducir los enlaces de bisulfuro, un medio para separar el enlace de bisulfuro de acuerdo con la presente invención también puede incluir cualquier agente de intercambio del puente de bisulfuro (siendo el agente competitivo orgánico o proteináceo, véase por ejemplo Creighton, 1988) conocido en la técnica, que permita que tenga lugar el siguiente tipo de reacción: R1 S - S R2 + R3 SH 6 R1 S - S R3 + R2 SH * R1 , R2: compuestos de agrupaciones de proteína * R3 SH: agente competitivo (orgánico, proteináceo) El término "agente de intercambio del puente de bisulfuro" debe interpretarse como inclusivo de los agentes reformadores del enlace de bisulfuro y también los agentes bloqueadores del enlace de bisulfuro. La presente invención también se relaciona con métodos para purificar o aislar proteínas de envoltura oligoméricas solas o específicas de HCV, tal como ya se explicara, y también comprende el uso de cualquier reactivo enlazador o bloqueador del grupo SH, conocido en la técnica, tales como los que pudieran seleccionarse de la siguiente lista: glutatión - 5,5'-d¡tiobis-(ácido 2-nitrobenzoico) o bis-(3-carboxi-4-nitrofenil)-bisulfuro (reactivo de Ellman o DTNB) (Elmann, 1959) N-etilmaleimida (NEM; Benesch y colaboradores, 1956) N-(4-dimetilamino-3,5-dinitrofenil) maleimida o maleimida de Tuppy, que otorga color a la proteína - P-cloromercuribenzoato (Grassetti y colaboradores, 1969) 4-vinilpiridina (Friedman y Krull, 1969) que puede ser liberada luego de reacción mediante hidrólisis acida acrilonitrilo, que puede ser liberado luego de reacción mediante hidrólisis acida (Weil y Seibles, 1961 ) - NEM-biotina (por ej. obtenida de Sigma B1267) 2,2'-dit¡opiridina (Grassetti y Murray, 1967) 4,4'-ditiopiridina (Grassetti y Murray, 1967) ácido 6,6'-ditiodin¡contín¡co (DTADN; Brown y Cunningham, 1970) 2,2'-ditiobis-(5'-nitropiridina) (DTNP; Patente Estadounidense 3597160) u otro compuesto ditiobis (derivado heterocíclico) (Grassetti y Murray, 1969) Un estudio de las publicaciones citadas muestra que, con frecuencia, diferentes reactivos de los grupos sulfidrilo reaccionarán con diversos números de grupos tiol de la misma proteína o molécula de enzima. Puede llegarse a la conclusión de que esta variación en la reactividad de los grupos tiol es debida al entorno estérico de estos grupos, tal como la forma de la molécula y los vecinos grupos de átomos y sus cargas, así como también el tamaño, forma y carga del ion o la molécula reactiva. Con frecuencia, la presencia de concentraciones adecuadas de desnaturalizantes tales como el dodeciisulfato sódico, urea o clorhidrato de guanidina provocarán un desdoblamiento suficiente de la molécula de proteína como para permitir igual acceso a todos los reactivos de grupos tiol. Al variar la concentración de desnaturalizante, el grado de desdoblamiento puede controlarse y, de esta forma, pueden revelarse grupos tiol con diferentes grados de reactividad. Si bien hasta el momento la mayor parte del trabajo informado se llevó a cabo con p-cloromercuribenzoato, N-etilmaleimida y DTNB, es probable que los otros reactivos desarrollados más recientemente también demuestren ser útiles. Debido a sus estructuras diversas, parece probable, en efecto, que puedan responder de manera diferente a los cambios en el entorno estérico de los grupos tiol. En forma alternativa, también quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención condiciones tales como un bajo pH (con preferencia pH inferior a 6) para evitar que los grupos SH libres oxiden y, así, evitar la formación de grandes agrupaciones intermoleculares al producirse la purificación y expresión recombinante de proteínas E1 y E2 (envolventes), que también quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Un reactivo bloqueador del grupo SH preferido, de acuerdo con la presente invención, es la N-etilmaleimida (NEM). Dicho reactivo bloqueador del grupo SH puede administrarse durante lisis de las células huésped recombinantes y luego del proceso de reducción parcial que se mencionara con anterioridad, o luego de cualquier otro proceso para separar puentes de bisulfuro. Dicho reactivo bloqueador del grupo SH también puede modificarse con cualquier grupo capaz de proveer un rótulo detectable y/o cualquier grupo que colabore en la inmovilización de dicha proteína recombinante en un sustrato sólido, por ejemplo NEM biotinilizado. Los métodos para separar puentes de cisteína y bloquear cisteínas libres también se describieron en Darbre (1987), Means y Feeney (1971 ) y Wong (1993). Un método para purificar proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 recombinantes oligoméricas solas o específicas, de acuerdo con la presente invención, como ya se definiera con anterioridad, está caracterizado también porque comprende los siguientes pasos: someter a lisis las células huésped que expresan E1 y/o E2 y/o E1/E2 recombinantes, con preferencia en presencia de un agente bloqueador del grupo SH tal como N-etilmaleimida (NEM), y posiblemente un detergente adecuado, con preferencia Empigen-BB, recuperar dicha proteína envolvente de HCV mediante purificación por afinidad, por ejemplo por medio de cromatografía de lectina, como por ejemplo cromatografía de lentil-lectina o cromatografía de inmunoafinidad empleando anticuerpos monoclonales específicos anti-E 1 y/o anti-E2, seguido por - reducción o separación de enlaces de bisulfuro con un agente separador del enlace de bisulfuro, tal como DTT, con preferencia también en presencia de un agente bloqueador del grupo SH, tal como NEM o Biotin-NEM, y recuperar las proteínas de envoltura E1 y/o E2 y/o E1/E2 de HCV reducidas, por ejemplo a través de filtración de gel (cromatografía por exclusión de tamaño o tamizado molecular), y posiblemente también mediante un paso adicional de cromatografía de Ni2+-IMAC y desalinización. Debe comprenderse que los pasos de recuperación mencionados con anterioridad también pueden llevarse a cabo mediante alguna otra técnica conocida por el experto en el arte. Los sistemas preferidos de lectin-cromatografía incluyen la cromatografía de aglutinina Galanthus nivalis (GNA) o la lectin-cromatografía (lentil) de aglutinina Lens culinaris (LCA), como se ilustra en la sección de Ejemplos. Otras lectinas útiles ¡ncluyen las que reconocen azúcares del tipo de mañosa elevada, tales como la aglutinina Narcissus pseudonarcissus (NPA), aglutinina Pisum sativum (PSA) o la aglutinina Allium ursinum (AUA). Con preferencia, dicho método es utilizable para purificar proteína envolvente de HCV oligomérica sola o específica, producida intracelularmente como ya se detallara. Para los oligómeros E1 o E2 o E1/E2 secretados, las lectinas que enlazan azúcares complejos tales como la aglutinina I Ricinus communis (RCA I), son las lectinas preferidas. La presente invención contempla, más en particular, las proteínas de envoltura oligoméricas solas o específicas, de HCV recombinantes esencialmente purificadas, seleccionadas entre el grupo que consiste en E1 y/o E2 y/o E1/E2, caracterizadas porque son aisladas o purificadas a través de un método como ya fuera definido con anterioridad. La presente invención, más en particular, se relaciona con la purificación o el aislamiento de proteínas de envoltura recombinantes que son expresadas a partir de células de mamífero recombinantes tales como la vaccinia. La presente invención, también, se relaciona con la purificación o el aislamiento de proteínas de envoltura recombinantes que son expresadas a partir de células de levadura recombinantes. La presente invención, asimismo, se relaciona con la purificación o el aislamiento de proteínas de envoltura recombinantes que son expresadas a partir de células bacterianas (procarióticas) recombinantes. La presente invención, además, contempla un vector recombinante que comprende una secuencia de vector, una adecuada secuencia promotora sintética, viral, eucariótica o procariótica seguida por una secuencia nucleótida que permita la expresión de la E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligomérica sola o específica, de la invención. La presente invención, en particular, contempla un vector recombinante que comprende una secuencia de vector, una adecuada secuencia promotora sintética, viral, eucariótica o procariótica seguida por una secuencia nucleótida que permita la expresión de la E1 o E1 sola de la invención. La presente invención, en particular, contempla un vector recombinante que comprende una secuencia de vector, una adecuada secuencia promotora sintética, viral, eucariótica o procariótica seguida por una secuencia nucleótida que permita la expresión de la E2 o E1 sola, de la invención.

El segmento del HCV cADN codificante de la secuencia deseada de E1 y/o E2 insertado en la secuencia de vector puede anexarse a una secuencia señal. Dicha secuencia señal puede proceder de una fuente no HCV, por ejemplo la secuencia líder de IgG o activador plasminógeno de tejido (tpa) para expresión en células de mamífero, o la secuencia de factor a-acoplamiento para expresión en células de levadura, pero las construcciones particularmente preferidas de acuerdo con la presente invención contienen secuencias señal que aparecen en el genoma HCV antes de los respectivos puntos de inicio de las proteínas E1 y E2. El segmento del HCV cADN codificante de la secuencia deseada de E1 y/o E2 insertada en el vector puede comprender también eliminaciones, por ejemplo del o los dominio(s) hidrófobo(s) como se ilustra en la sección de Ejemplos, o de la E2 hipervariable región I. Más en particular, los vectores recombinantes de acuerdo con la presente invención comprenden un ácido nucleico que posee un segmento HCV cADN codificante de la poliproteína que se inicia en la región entre las posiciones aminoácidas 1 y 192, y finaliza en la región entre las posiciones 250 y 400 de la poliproteína HCV, más preferentemente que finaliza en la región entre las posiciones 250 y 341 , más preferentemente aún que finaliza en la región entre las posiciones 290 y 341 para la expresión de la proteína E1 sola de HCV. Más preferentemente, el vector recombinante de la presente comprende un ácido nucleico recombinante con un segmento HCV cADN que codifica parte de la poliproteína de HCV que se inicia en la región entre las posiciones 117 y 192 y finaliza en cualquier posición ubicada en la región entre las posiciones 263 y 326, para la expresión de la proteína E1 sola de HCV. También quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención aquellas formas que tienen el primer dominio hidrófobo eliminado (posiciones 264 a 293 más o menos 8 aminoácidos), o aquellas formas a las cuales se agregó un codón ATG 5' -terminal y un codón tope 3'-terminal, o aquellas formas que poseen un sitio de separación factor Xa y/o a las cuales se agregaron 3 a 10, con preferencia 6 Histidina codones. Más en particular, los vectores recombinantes de acuerdo con la presente invención comprenden un ácido nucleico que poseen un segmento HCV cADN codificante de la poliproteína que inicia en la región entre las posiciones aminoácidas 290 y 406 y finaliza en la región entre las posiciones 600 y 820 de la poliproteína de HCV, más con preferencia que inicia en la región entre las posiciones 322 y 406, más preferentemente que inicia en la región entre las posiciones 347 y 406, más preferentemente aún que inicia en la región entre las posiciones 364 y 406 para la expresión de la proteína E2 sola de HCV. Más preferentemente, el vector recombinante de la presente comprende un ácido nucleico recombinante que posee un segmento HCV cADN codificante de la poliproteína que inicia en la región entre las posiciones 290 y 406 y finaliza en cualquier posición entre las posiciones 623, 650, 661 , 673, 710, 715, 720, 746 o 809, para expresión de la proteína E2 sola de HCV. También dentro del alcance de la presente invención quedan comprendidas las formas a las cuales se agregó un codón ATG 5' -terminal y un codón tope 3'-terminal, o las formas que tienen un sitio de separación de factor Xa y/o a las que se agregaron 3 a 10, con preferencia 6 Histidina codones.

Puede utilizarse una variedad de vectores para obtener la expresión recombinante de las proteínas de envoltura oligoméricas solas o específicas de HCV de la presente invención. Los eucariotes inferiores tales como las levaduras, y las cepas mutantes de glicosilación, son transformadas típicamente con plásmidos, o con un virus recombinante. Los vectores pueden copiarse dentro de la huésped de forma independiente, o bien pueden integrarse dentro del genoma de célula huésped. Los eucariotes superiores pueden transformarse con vectores o bien pueden infectarse con un virus recombinante, por ejemplo un virus vaccinia recombinante. Las técnicas y los vectores para la inserción de ADN extraño en el virus vaccinia son bien conocidos en el arte y utilizan, por ejemplo, recombinación homologa. En la técnica está disponible una amplia variedad de secuencias de promoción viral, posiblemente secuencias de terminación y secuencias de poli(A)-agregado, posiblemente secuencias de mejorador y posiblemente secuencias de amplificación, todas ellas requeridas para la expresión mamífera. La vaccinia se prefiere en particular dado que la misma detiene la expresión de proteínas de célula huésped. La vaccinia se prefiere en gran medida, también porque permite la expresión de proteínas E1 y E2 de HCV en células o individuos que están inmunizados con el virus vivo de vaccinia recombinante. Para la vacunación de seres humanos, el avipox y Virus Ankara Modificado (AMV) son vectores particularmente útiles. También se conocen los vectores de transferencia de expresión de insectos, derivados del virus de polihedrosis nuclear del baculovirus Autographa californica (AcNPV), el cual constituye un vector de expresión viral independiente de colaboradores. Los vectores de expresión derivados de este sistema suelen emplear el fuerte promotor de gen de polihedrina viral para conducir la expresión de genes heterólogos. Los diferentes vectores, así como también los métodos para la introducción de ADN heterólogo en el sitio deseado de baculovirus están disponibles para el experto en la técnica de expresión de baculovirus. Asimismo, en la técnica se conocen diferentes señales para la modificación post-translacional reconocida por las células de insectos. Dentro del alcance de la presente invención también queda comprendido un método para producir proteínas E1 o E2 o E1/E2 de HCV oligoméricas, solas o específicas, recombinantes purificadas, donde los residuos de cisteína involucrados en la formación de agrupaciones son reemplazados a nivel de la secuencia de ácido nucleico por otros residuos, de tal manera de evitar la formación de agrupaciones. Las proteínas recombinantes expresadas por vectores recombinantes portadores de tal proteína E1 y/o E2 mutada, codificante de ácido nucleico, también quedan comprendidas dentro del alcance de la presente invención. La presente invención, asimismo, se relaciona con las proteínas recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/E2 caracterizadas porque al menos uno de sus sitios de glicosilación fue removido y, en consecuencia, se denominan mutantes de glicosilación. Tal como se explica en la sección de Ejemplos, pueden resultar deseables diferentes mutantes de glicosilación para diagnosticar (por barrido, confirmación, prognosis, etc.) y prevenir la enfermedad de HCV de acuerdo con el paciente en cuestión. Un mutante de glicosilación de proteína E2, carente de GLY4, por ejemplo, se descubrió que mejora la reactividad de ciertos sueros en el diagnóstico. Estos mutantes de glicosilación se purifican, con preferencia, de acuerdo con el método revelado en la presente invención. También se contemplan dentro de la presente los vectores recombipantes portadores de la inserción de ácido nucleico que codifica tal mutante de glicosilación E1 y/o E2 y/o E1/E2, así como también células huésped transformadas con un vector recombinante tal. La presente invención también se relaciona con vectores recombinantes que incluyen un polinucleótido, el cual también forma parte de la presente invención. La misma está relacionada, más en particular, con los ácidos nucleicos recombinantes tal como están representados en la SEC ID NO 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47 y 49, o sus partes. La presente invención contempla, asimismo, células huésped transformadas con un vector recombinante como ya fuera definido con anterioridad, donde dicho vector comprende una secuencia nucleótida codificante de proteína de HCV E1 y/o E2 y/o E1/E2 como se definiera precedentemente, además de una secuencia regulatoria ligada de manera operativa a dicha secuencia de HCV E1 y/o E2 y/o E1/E2, y capaz de regular la expresión de dicha proteína HCV E1 y/o E2 y/o E1/E2. Las huéspedes eucarióticas incluyen huéspedes eucarióticas superiores e inferiores como ya se explicara en la sección de Definiciones. Las huéspedes eucarióticas inferiores incluyen las células de levadura ya conocidas en la técnica. Las huéspedes eucarióticas superiores comprenden, principalmente, líneas de células mamíferas conocidas en la técnica e incluyen varias líneas celulares inmortalizadas de ATCC, incluso células HeLa, células de ovario de hámster Chino (CHO), células de riñon de hámster recién nacido (BHK), PK15, RK13 y una variedad de otras líneas celulares. La presente invención, en particular, se relaciona con una proteína recombinante E1 y/o E2 y/o E1/E2 expresada mediante una célula huésped, como ya se definiera, que contiene un vector recombinante según explicación precedente.

Estas proteínas recombinantes están particularmente purificadas de acuerdo con un método de la presente invención. Un método preferido para aislar o purificar proteínas de envoltura de HCV, como ya se definiera, está caracterizado también porque comprende al menos los siguientes pasos: cultivar una célula huésped, como se definió con anterioridad, transformada con un vector recombinante de acuerdo con la presente invención o con un vector recombinante que expresa proteínas de envoltura de HCV E1 y/o E2 y/o E1/E2 en un medio de cultivo apropiado, - causar la expresión de dicha secuencia de vector tal como ya fuera definido, en condiciones adecuadas y someter a lisis dichas células huésped transformadas, con preferencia en presencia de un agente bloqueador de grupo SH, tal como N-etilmaleimida (NEM), y posiblemente un detergente adecuado, con preferencia Empigen-BB, - recuperar dicha proteína envolvente de HCV mediante purificación por afinidad, como por medio de lectin-cromatografía o cromatografía de inmunoafinidad, empleando anticuerpos monoclonales específicos anti-E1 y/o anti-E2, siendo dicha lectina preferentemente lentil-lectina o GNA, seguido por incubación del eluato del paso precedente con un medio de separación del enlace de bisulfuro, como el DTT, con preferencia seguido por incubación con un agente bloqueador de grupo SH, tal como NEM o Biotin-NEM, y aislar las proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligoméricas, solas o específicas, de HCV, como por ejemplo a través de filtración de gel y posiblemente también mediante subsiguiente cromatografía Ni2+-IMAC seguida por un paso de desalinización. Como resultado del proceso citado, pueden producirse proteínas E1 y/o E2 y/o E1/E2 en una forma que eluyan de manera diferente de las grandes agrupaciones que contienen componentes vector-derivados y/o componentes celulares en el volumen nulo de la columna de filtración de gel o la columna IMAC, como se ilustra en la sección de Ejemplos. El paso de separación del puente de bisulfuro, de manera ventajosa, también elimina la falsa reactividad debida a la presencia de proteínas huésped y/o derivadas del sistema de expresión. La presencia de NEM y un detergente apropiado durante la lisis de las células puede ya evitar, en parte o en su totalidad, la agrupación entre las proteínas de envoltura de HCV y los contaminantes.

Con preferencia, se hace uso de cromatografía Ni2+-IMAC seguida por un paso de desalinización para aquellas construcciones que porten un (His)6 , como describen Janknecht y colaboradores, 1991 , y Hochuli y colaboradores, 1988. La presente invención también se relaciona con un método para generar anticuerpos monoclonales en animales pequeños tales como ratones o ratas, así como también un método para detectar por barrido y aislar células B humanas que reconocen anticuerpos anti-HCV, empleando las proteínas de envoltura oligoméricas, solas o específicas, de HCV, de la presente invención. La presente invención se relaciona asimismo con una composición que comprende al menos uno de los siguientes péptidos E1 que se listan en la Tabla 3: E1 -31 (SEC ID NO 56) que abarca los aminoácidos 181 a 200 de la región Central/E1 V1 , E1-33 (SEC ID NO 57) que abarca los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1 -35 (SEC ID NO 58) que abarca los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2 (epítope B), E1-35A (SEC ID NO 59) que abarca los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2 (epítope B), 1 bE1 (SEC ID NO 53) que abarca los aminoácidos 192 a 228 de las regiones E1 (regiones V1 , C1 y V2) (que contienen epítope B), E1-51 (SEC ID NO 66) que abarca los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1 -53 (SEC ID NO 67) que abarca los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4 (epítope A), E1-55 (SEC ID NO 68) que abarca los aminoácidos 325 a 344 de la región E1. La presente invención también se relaciona con una composición que comprende al menos uno de los siguientes péptidos E2 que se listan en la Tabla 3: Env 67 o E2-67 (SEC ID NO 72), que abarca las posiciones de aminoácido 397 a 416 de la región E2 (epítope A, reconocido por el anticuerpo monoclonal 2F10H10, ver figura 19), Env 69 o E2-69 (SEC ID NO 73), que abarca las posiciones de aminoácido 409 a 428 de la región E2 (epítope A), Env 23 o E2-23 (SECID NO 86), que abarca las posiciones 583 a 602 de la región E2 (epítope E), Env 25 o E2-25 (SEC ID NO 87), que abarca las posiciones 595 a 614 de la región E2 (epítope E) Env 27 o E2-27 (SEC ID NO 88) que abarca las posiciones 607 a 626 de la región E2 (epítope E) Env 17B o E2-17B (SEC ID NO 83) que abarca las posiciones 547 a 566 de la región E2 (epítope D) Env 13B o E2-13B (SEC ID NO 82) que abarca las posiciones 523 a 542 de la región E2 (epítope C, reconocido por el anticuerpo monoclonal 16A6E7, ver figura 19). La presente invención también se relaciona con una composición que comprende al menos uno de los siguientes epítopes conformacionales E2: Epítope F reconocido por los anticuerpos monoclonales 15C8C1 , 12D1 1 F1 y 8G10D1 H9, Epítope G reconocido por el anticuerpo monoclonal 9G3E6, Epítope H (o C) reconocido por el anticuerpo monoclonal 10D3C4 y H4H6B2, o Epítope I reconocido por el anticuerpo monoclonal 17F2C2. La presente invención también se relaciona con un anticuerpo específico E1 o E2 generado con la inmunización con una composición de péptido o proteína, siendo dicho anticuerpo específicamente reactivo con cualquiera de los polipéptidos o péptidos como se definieran con anterioridad, y siendo dicho anticuerpo, con preferencia, un anticuerpo monoclonal. Asimismo, la presente invención se relaciona con un anticuerpo específico E1 o E2 detectado por barrido en una biblioteca de cadena variable en plásmidos o fagos o en una población de células B humanas por medio de un proceso ya conocido en la técnica, siendo dicho anticuerpo reactivo con cualquiera de los polipéptidos o péptidos según definición anterior, y siendo dicho anticuerpo con preferencia un anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales específicos E1 o E2 de la invención pueden producirse mediante cualquier hibridoma capaz de formarse de acuerdo con los métodos clásicos, a partir de células esplénicas de un animal, en particular de un ratón o rata, inmunizadas contra los péptidos o polipéptidos de HCV de acuerdo con la invención como ya se definiera, por un lado, y de células de una línea celular de mieloma por otro lado, y de ser seleccionado por la capacidad del hibridoma de producir los anticuerpos monoclonales reconocedores de los polipéptidos, que se usaron inicialmente para la inmunización de los animales. Los anticuerpos implicados en la invención pueden rotularse mediante un rótulo apropiado, de tipo enzimático, fluorescente o radioactivo. Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con esta forma de realización preferida de la invención pueden ser versiones humanizadas de anticuerpos monoclonales de ratón generados mediante tecnología de ADN recombinante, iniciándose en partes de secuencias de ADN genómico humano y/o de ratón que codifiquen cadenas H y L de cADN, o clones genómicos que codifiquen cadenas H y L. En alternativa, los anticuerpos monoclonales acordes con esta forma de realización preferida de la invención pueden ser anticuerpos monoclonales humanos. Estos anticuerpos, según la presente forma de realización de la invención, también pueden derivarse de linfocitos sanguíneos periféricos humanos de pacientes infectados con HCV, o vacunados contra HCV. Tales anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo, por medio de una repoblación de linfocitos sanguíneos periféricos humanos (PBL) de ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) (ver revisión reciente en Duchosal y colaboradores, 1992). La invención también se relaciona con el uso de las proteínas o péptidos de la invención para la selección de anticuerpos recombinantes mediante el proceso de clonación de repertorio (Persson y colaboradores, 1991 ). Los anticuerpos dirigidos hacia los péptidos, o las proteínas de envoltura oligóméricas solas o específicas, derivadas de un cierto genotipo, pueden emplearse como medicamento, más en particular para su incorporación en un inmunoensayo para la detección de genotipos de HCV (para detectar la presencia de antígeno E1 o E2 de HCV), para la prognosis o el monitoreo de la enfermedad de HCV, o como agentes terapéuticos. En alternativa, la presente invención también se relaciona con el uso de cualquiera de los previamente especificados anticuerpos monoclonales específicos E1 o E2 para la preparación de un kit de inmunoensayo para detectar la presencia de antígeno de E1 o E2 en una muestra biológica, para la preparación de un kit para la prognosis o monitoreo de enfermedad de HCV o para la preparación de un medicamento para la HCV. La presente invención también se relaciona con el método para el diagnóstico o detección in vitro del antígeno de HCV presente en una muestra biológica, que comprende al menos lo siguientes pasos: (i) poner en contacto dicha muestra biológica con cualquiera de los anticuerpos monoclonales específicos E1 y/o E2 según definición anterior, con preferencia en forma inmovilizada, en las condiciones adecuadas que permitan la formación de un complejo inmune, (ii) retirar los componentes no ligados (¡ii) incubar los complejos inmunes formados con anticuerpos heterólogos, los cuales se ligan específicamente a los anticuerpos presentes en la muestra a ser analizada, habiendo dichos anticuerpos heterólogos conjugado a un rótulo detectable en las condiciones adecuadas, (iv) detectar la presencia de dichos complejos inmunes por medios visuales o mecánicos (por ejemplo mediante densitometría, fluorimetría, colorimetría). La presente invención también está relacionada con un kit para el diagnóstico in vitro de un antígeno de HCV presente en una muestra biológica, que comprende: al menos un anticuerpo monoclonal como ya se definiera, estando dicho anticuerpo con preferencia inmovilizado sobre un sustrato sólido, un buffer, o los componentes necesarios para producir el buffer, que permita la reacción enlazante entre estos anticuerpos y los antígenos de HCV presentes en la muestra biológica, un medio para detectar los complejos inmunes formados en la reacción de enlace precedente, posiblemente, también se incluye un barrido automático y un dispositivo de interpretación para inferir los antígenos de HCV presentes en la muestra, a partir del patrón de enlace observado. La presente invención también se relaciona con una composición que comprende proteínas de HCV recombinantes E1 y/o E2 y/o E1/E2 purificadas según el método de la presente invención, o una composición que comprenda al menos un péptido como ya se especificara, para su uso como medicamento. La presente invención, más en particular, se relaciona con una composición que comprende al menos uno de los péptidos envolventes especificados más arriba, o una composición de proteína envolvente recombinante según explicación anterior, para su uso como vacuna para inmunizar un mamífero, con preferencia seres humanos, contra HCV, que comprende administrar una cantidad suficiente de la composición, posiblemente acompañada de uno o más adyuvantes farmacéuticamente aceptables, para generar una respuesta ¡nmunológica. Más en particular, la presente invención se relaciona con el uso de cualquiera de las composiciones que se describieron más arriba, para la preparación de una vacuna según explicación precedente. También, la presente invención se relaciona con una composición de vacuna para inmunizar un mamífero, con preferencia seres humanos, contra HCV, que comprende proteínas o péptidos oligoméricos, solos o específicos, de HCV, derivados de la región E1 y/o E2 como se describiera con anterioridad.

Las composiciones inmunogénicas pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Las composiciones de la presente comprenden una cantidad inmunogénica de proteínas oligoméricas solas o específicas E1 y/o E2 y/o E1/E2 recombinantes, como ya se definieran, o péptidos E1o E2 según definición anterior, por lo general combinadas con un portador farmacéuticamente aceptable, con preferencia comprendiendo también un adyuvante. Las proteínas de envoltura oligoméricas solas o específicas de la presente invención, sean E1 y/o E2 y/o E1/E2, se espera que brinden un antígeno de vacuna particularmente útil, ya que la formación de anticuerpos hacia E1 o E2 puede ser más deseable que hacia otra proteína envolvente, y dado que la proteína E2 es reactiva de cruce entre los tipos HCV, y la proteína E1 es tipoespecífica. Los cócteles que incluyen la proteína E2 de tipo 1 y proteínas E1 derivadas de diferentes genotipos, pueden resultar particularmente ventajosas. Los cócteles que contienen un excedente molar de E1 contra E2 o E2 contra E1 también pueden ser particularmente útiles. Las composiciones inmunogénicas pueden administrarse a animales a fin de inducir la producción de anticuerpos, ya sea para ofrecer una fuente de anticuerpos o para inducir inmunidad protectora en el animal. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier portador que en sí mismo no induzca la generación de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes y metabolizadas lentamente, como las proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido y partículas de virus inactivas. Tales portadores son bien conocidos para los técnicos con conocimiento normal en el arte. Los adyuvantes preferidos para mejorar la efectividad de la composición incluyen, pero no se limitan a: hidróxido de aluminio (alum), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), como se halla en la Patente Estadounidense nro.4.606.918, N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanipa-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-gl¡cero-3- hidroxifosforiloxi)-etilamipa (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, trehalosa dimicolato y esqueleto de pared celular (MPL + TDM + CWS) en una emulsión de 2% escualeno/Tween. Cualquiera de los 3 componentes MPL, TDM o CWS también puede emplearse solo o combinado 2 por 2. Además, puede hacerse uso de adyuvantes tales como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o SAF-1 (Syntex). Además, pueden usarse Adyuvante Completo Freund's (CFA) y Adyuvante Incompleto Freund's (IFA) para aplicaciones no en humanos y con fines de investigación. Las composiciones inmunogénicas contienen típicamente vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. También pueden incluirse sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias para el buffer de pH, conservantes y similares, en dichos vehículos. Típicamente, las composiciones inmunogénicas se preparan en forma de inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; las formas sólidas adecuadas para su solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección, también pueden ser preparadas. Asimismo, la preparación también puede emulsionarse o encapsularse en liposomas para un mayor efecto adyuvante. Las proteínas E1 y E2 pueden incluso incorporarse en Complejos Inmuno Estimuladores junto con saponinas, por ejemplo Quil A (ISCOMS). Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una "cantidad suficiente" o una "cantidad inmunologicamente efectiva" de las proteínas de envoltura de la presente invención, así como también cualquier otro de los componentes citados más arriba, según necesidad. "Cantidad inmunológicamente efectiva" significa que la administración de dicha cantidad a un individuo, sea en una dosis única o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento, como ya se explicara. Esta cantidad varía según la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo primate, primate no humano, etc.), la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación clínica, la cepa del HCV infectante y otros factores de relevancia. Se espera que la cantidad quedará comprendida en un rango relativamente amplio que puede determinarse mediante pruebas de rutina. Por lo general, la cantidad oscilará entre 0,01 y 100 µg/dosis, más en particular entre 0,1 y 100 µg/dosis. Los compuestos inmunogénicos usualmente se administran en forma parenteral, típicamente por inyección, por ejemplo subcutánea o intramuscular. Las formulaciones adicionales apropiadas para otros métodos de administración incluyen formulaciones orales y supositorios. La posología del tratamiento puede implicar un plan de simple dosis o un plan de múltiples dosis. La vacuna puede administrarse conjuntamente con otros agentes inmunorregulatorios. La presente invención asimismo se refiere a una composición que comprende péptidos o polipéptidos como antes descriptos, para la detección in vitro de anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica. La presente invención también comprende el uso de una composición como arriba descriptos para la preparación de un kit de inmunoensayo o de detección de anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica. Además la presente invención también refiere a un método para el diagnóstico in vitro de anticuerpos del HCV presentes en una muestra biológica, que comprende al menos los siguientes pasos: poner en contacto la mencionada muestra biológica con una composición que comprende cualquiera de los péptidos o proteínas envolventes como antes definidos, preferentemente en una forma inmovilizada bajo condiciones apropiadas que permiten la formación de un complejo inmune, en el que dicho péptido o proteína puede ser un péptido o una proteína biotinilada que es ligada de modo covalente a un sustrato sólido por medio de complejos de estreptavidina o avidina, remover componentes no ligados, incubar los complejos inmunes formados con anticuerpos heterólogos, en los que dichos anticuerpos heterólogos fueron conjugados a una marcación detectable bajo condiciones apropiadas, detectar la presencia de dichos complejos inmunes en forma visual o mecánica (p.ej. por medio de densiometría, fluorimetría, colorimetría).

Alternativamente la presente invención también refiere a formatos de ¡nmunoensayo competentes, en los que la proteína oligomérica purificada simple o específica E1 y/o E2 y/o proteínas E1/E2 producidas de modo recombinante, como antes detalladas se usan en combinación con péptidos E1 y/o E1/E2 a fin de reaccionar con anticuerpos del HCV presentes en la muestra biológica. La presente invención asimismo refiere a un kit para determinar la presencia de anticuerpos del HCV en una muestra biológica, que comprende: al menos un compuesto peptídico o proteico como arriba definido, posiblemente en combinación con otros polipéptidos o péptidos de HCV u otros tipos de HCV, en los que dichos péptidos o proteínas fueron preferentemente inmovilizadas sobre un sustrato sólido, de mayor preferencia sobre diferentes microcavidades de la misma placa ELISA y de mayor preferencia sobre una sola tira membranal, un buffer o componentes necesarios para producir el buffer permitiendo la reacción de ligado entre esos polipéptidos o péptidos y los anticuerpos contra HCV presentes en la muestra biológica, medios para la detección de los complejos inmunes formados en la anterior reacción de ligado, posiblemente incluyendo también un dispositivo de interpretación y barrido automatizado para inferir los genotipos de HCV presentes en la muestra del patrón de ligado observado. Los métodos de inmunoensayo conformes a la presente invención utilizan antígenos oligoméricos específicos o simples de los dominios E1 y/o E1/E2 que mantienen epítopes lineales (en caso de péptidos) y conformacionales (proteínas oligoméricas simples o específicas) reconocidos por anticuerpos en el suero de individuos infectados con HCV. En el alcance de la invención se incluye, por ejemplo, el uso de antígenos oligoméricos simples o específicos, de antígenos diméricos, tanto como combinaciones de antígenos oligoméricos simples o específicos. Los antígenos E1 y E2 de HCV de la presente invención también pueden emplearse en prácticamente cualquier formato de ensayo que emplea un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Lógicamente debe evitarse o adaptarse un formato que desnaturaliza el epítope conformacional de HCV. Una característica común de todos estos ensayos es que el antígeno es contactado con el componente del cuerpo, en el que se sospecha la presencia de anticuerpos del HCV, en condiciones que permitan al antígeno ligarse a cualquiera de tales anticuerpos presentes en el componente. Tales condiciones típicamente serán la temperatura fisiológica, el pH y la intensidad iónica utilizando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con el espécimen se observan mediante la detección de complejos inmunes comprendidos por el antígeno. El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran cantidad de variaciones, conociéndose en el arte muchos formatos diferentes. Los protocolos pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos incluyen el uso de anticuerpos o polipéptidos marcados; las marcas pueden, por ejemplo, ser enzimáticas, fluorescentes, quimioiluminiscentes, radioactivas o moléculas muertas. Se conocen asimismo los ensayos que amplían las señales del complejo inmune; ejemplos de los cuales constituyen los ensayos que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, y ensayos mediados y con enzimas marcas, tales como los ensayos ELISA. El inmunoensayo puede presentarse, sin limitación alguna, en un formato heterogéneo u homogéneo, de tipo estándar o competente. En un formato heterogéneo, el polipétido usualmente es ligado a una matriz o soporte sólido a fin de facilitar la separación de la muestra del polipéptido luego de la incubación. Son ejemplos de soportes sólidos que pueden usarse la nitrocelulosa (p. ej. en forma membranal o cavidad de microtitulado), el cloruro de polivinilo (p.ej. en láminas o cavidades de microtitulado), látex de poliestireno (p. ej. en forma de perlas o de placas de microtitulación), fluoruro de polivinilidina (conocido como Immunolon™), papel diazotizado, membranas de nylon, perlas activadas y perlas de proteína A. Por ejemplo, pueden usarse placas de microtitulación Dynatech Immunolon™ 1 o lmmunolon™2 o perlas de poliestireno de 0,25 pulgadas (Precisión Plástic Ball) en el formato heterogéneo. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos usualmente se lava luego de separarlo de la muestra de testeo y previo a la detección de anticuerpos ligados. Ambos formatos estándar y competentes son conocidos en el arte. En un formato homogéneo, la muestra de testeo se incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, puede realizarse en condiciones que precipitarán cualquier complejo de anticuerpos antígenos que se hayan formado. Ambos formatos estándar y competentes para estos ensayos se conocen en el arte.

En un formato estándar, la cantidad de anticuerpos del HCV en los complejos de anticuerpos antígenos se monitorea directamente. Esto puede completarse determinando si los anticuerpos anti-xenogénicos marcados (p. ej. antihumanos) que reconocen un epítope o anticuerpos anti-HCV se ligarán debido a la formación compleja. En un formato competente, la cantidad de anticuerpos del HCV en la muestra puede deducirse al monitorear el efecto competitivo sobre la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando que compite) en el complejo. Los complejos formados que comprenden anticuerpos anti-HCV (o en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpo que compite) son detectados por cualquiera o una cantidad de técnicas conocidas, dependiendo del formato. Por ejemplo, pueden detectarse en el complejo, anticuerpos del HCV sin marcar utilizando un conjugado de Ig anti-xenogénico complejizado con una marca (p. ej. una marca enzimática). En un formato de ensayo de inmunoprecipitado o de aglutinado las reacciones entre los antígenos del HCV y el anticuerpo forman una red que precipitan de la solución o la suspensión y conforman una capa o lámina visible de precipitado. En caso que no haya ningún anticuerpo anti-HCV presente en el espécimen de testeo, no se formará precipitación visible. Así existen actualmente tres tipos específicos de ensayos de algutinado de partículas (PA). Estos ensayos se utilizan para la detección de anticuerpos de diferentes aptígenos, en caso que estén adheridos a un soporte. Un ensayo de este tipo es el ensayo de hemaglutinación usando células de glóbulos rojos (RBCs) que son sensibilizadas mediante antígenos de adsorción pasiva ( o anticuerpos) a los glóbulos rojos. El agregado de anticuerpos antígenos específicos presentes en el componente del cuerpo, si es que hubiera, produce el aglutinado de los RBCs cubiertos con el antígeno purificado. A fin de eliminar potenciales reacciones no específicas en el ensayo de hemaglutinación, pueden usarse dos vehículos artificiales en lugar de RBC en el aglutinado de partículas. Las más usuales son las partículas de látex. De cualquier modo, también pueden usarse partículas de gelatina. Los ensayos que utilizan cualquiera de estos vehículos se basan en la aglutinación pasiva de las partículas cubiertas con antígenos purificados. Los antígenos E1 y/o E2 y/o E1/E2 oligoméricos simples o específicos del HCV de la presente invención compuestos de epítopes conformacionales, típicamente se presentarán embalados en forma de kit para usarse en esos inmunoensayos. El kit normalmente contendrá en contenedores separados los antígenos del HCV originales, las formulaciones de control de anticuerpo (positivas y/o negativas), anticuerpo marcado si el formato de ensayo requiere los mismos reactivos generadores de señal (p. ej. sustrato enzimático) en caso que la marca no genere directamente una señal. El antígeno del HCV original puede estar en cualquier caso ligado a una matriz sólida o separado con reactivos para ligar el mismo a la matriz. Normalmente el kit incluirá instrucciones (p. ej. escritas, grabadas en cassette, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el ensayo. Los inmunoensayos que utilizan el antígeno del HCV original resultan útiles al explorar la sangre para la preparación de un suplemento carente del HCV potencialmente infectivo. El método para preparar el suplemento de sangre comprende los siguientes pasos. Se produce la reacción de un componente del cuerpo, preferentemente sangre o un componente de la sangre, del individuo donante de sangre con proteínas E1 y/o E2 del HCV de la presente invención que permita una reacción inmunológica entre anticuerpos del HCV, si existieran, y el antígeno del HCV. Al detectar si se forman complejos de anticuerpo anti-HCV -antígeno HCV como resultado de la reacción. La sangre contribuida al suplemento de sangre proviene de donantes que no presentan anticuerpos a los antígenos del HCV originales, E1 ó E2. En casos de una reacción positiva al antígeno del HCV, es preferible repetir el inmunoensayo a fin de disminuir la posibilidad de falsos positivos. Por ejemplo, en la amplia variedad de exploración selectiva de sangre para la producción de productos de la sangre (p. ej. transfusión de sangre, plasma, factor VIII, inmunoglobulina, etc.) los estudios de 'exploración' usualmente son formateados a fin de aumentar la sensibilidad (para asegurar pasajes de sangre no contaminados) a expensas de la especifidad; p. ej. aumenta el índice de falsos positivos. Así, es usual para solamente diferir a un examen posterior aquellos donantes que fueron 'repetidamente reactivos'; p. ej. resultan positivos en dos o más pasadas de inmunoensayos con la muestra donada. De todos modos, para confirmar la positividad del HCV, los estudios de 'confirmación' son usualmente formateados para aumentar la especifidad (a fin de asegurar que no se confirme ninguna muestra falso-positiva) a expensas de la sensibilidad. Por ello el método de purificación para E1 y E2 descripto en la presente invención será muy ventajoso, por incluir proteínas envolventes oligoméricas simples o específicas en ensayos de diagnóstico del HCV.

La fase sólida seleccionada puede incluir tapones poliméricos o de vidrio, nitrocelulosa, micropartículas, microcavidades de una bandeja de ensayo, tubos de ensayo y perlas magnéticas. El compuesto generador de señal puede incluir una enzima, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radioactivo y un compuesto quimioiluminiscente. Son ejemplos de enzimas que incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y beta-galactosidasa. Los ejemplos de compuestos facilitadores del ligado de miembros incluyen biotina, antibiotina y avidina. A fin de bloquear los efectos de sustancias con aspecto de factor reumatoide, la muestra de ensayo está sujeta a suficientes condiciones para bloquear los efectos de sustancias con aspecto de factor reumatoide. Estas condiciones comprenden el contacto de la muestra de ensayo con una cantidad de IgG antihumano para formar una mezcla, y la incubación de la mezcla por un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar un producto mezcla reactivo, substancialmente libre de sustancias con aspecto de factor reumatoide. La presente invención contempla además el uso de proteínas E1 o partes de la misma, más específicamente proteínas E1 oligoméricas de HCV simples o específicas como antes definidas, para monitorear in vitro la enfermedad del HCV o para pronosticar la respuesta al tratamiento (por ejemplo con Interferon) de pacientes infectados con HCV que comprende: incubar una muestra biológica de un paciente infectado con hepatitis C con una proteina E1 o una parte adecuada de la misma en condiciones que permitan la formación de un complejo ¡nmunológico, remover los componentes sin ligar, calcular los títulos anti-E1 presentes en dicha muestra (por ejemplo al comienzo y/o durante el transcurso del tratamiento (Interferon)), monitorear el curso natural de la patología del HCV, o pronosticar la respuesta al tratamiento de dicho paciente en base a la cantidad de títulos anti-E 1 encontrados en dicho ejemplo al comienzo del tratamiento y/o durante el transcurso del mismo. En pacientes que muestran una disminución de 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 o preferentemente más de 20 veces la cantidad inicial de títulos anti-E1 puede considerarse que responden en forma continua y sostenida a la terapia del HCV, más específicamente a la terapia con Interferon. En la sección de ejemplos se ilustra que un ensayo anti-E1 puede resultar de suma utilidad para pronosticar la respuesta a largo plazo al tratamiento con IFN, o a un tratamiento de una patología debida al virus de hepatitis C en general. Más especificamente, los siguientes péptidos E1 como enunciados en la Tabla 3, resultaron de utilidad para el monitoreo in vitro de la patología del HCV o para el pronóstico de la respuesta al tratamiento con Interferon de pacientes infectados con el HCV: E1-31 (SEC ID NO 56) que abarca los aminoácidos 181 a 200 de la región Core/E1 V1 , E1-33 (SEC ID NO 57) que abarca los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 E1-35 (SEC ID NO 58) que abarca los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2 (epítope B), E1 -35A (SEC ID NO 59) que abarca los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2 (epítope B), 1 bE1 (SEC ID NO 53) que abarca los aminoácidos 192 a 228 de regiones E1 (regiones V1 , C1 y V2) (que contiene epítope B), E1 -51 (SEC ID NO 66) que abarca los aminoácidos 310 a 320 de la región E1 E1 -53 (SEC ID NO 67) que abarca los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4 (epítope A), E1 -55 (SEC ID NO 68) que abarca los aminoácidos 325 a 344 de la región E1. Se sobreentiende que fragmentos menores de los péptidos antes mencionados también se incluyen en el alcance de la presente invención. Dichos fragmentos menores pueden prepararse fácilmente mediante síntesis química, pudiendo verificarse su aptitud para ser usados en un ensayo como detallado anteriormente y en la sección de ejemplos. La presente invención refiere asimismo a un kit para monitorear la patología del HCV o para pronosticar la respuesta al tratamiento (por ejemplo a Interferon) de pacientes infectados con el HCV, que comprende: al menos una proteína E 1 o péptido E1 , más específicamente una proteína E1 o péptido E1 como se describió anteriormente, un buffer o los componentes necesarios para producir el buffer que permite la reacción de ligado entre esas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E1 presentes en la muestra biológica, medios para detectar los complejos inmunes formados en la reacción de ligado precedente, posibilitar además un dispositivo automatizado de barrido e interpretación para inferir la disminución de títulos anti-E1 durante la progresión del tratamiento.

Se sobreentiende que las proteínas y los péptidos E2 conforme la presente invención pueden usarse hasta un determinado grado para determinar/pronosticar el tratamiento del HCV como arriba indicado para las proteínas o péptidos E1 , porque también los niveles anti-E2 disminuyen en relación a anticuerpos de los demás antígenos del HCV. Asimismo se sobreentiende que puede ser factible determinar ciertos epítopes en la región E2, que también resultan apropiados para usarse en un estudio de monitoreo/pronóstico de la patología del HCV. La presente invención asimismo comprende un ensayo de serotipificación para detectar uno o más tipos serológicos de presencia del HCV en una muestra biológica, más específicamente para detectar anticuerpos de los diferentes tipos de HCV a ser detectados combinados en un formato de ensayo, que comprende al menos los siguientes pasos: poner en contacto la mencionada muestra biológica a ser analizada respecto de la presencia de anticuerpos del HCV de uno o más tipos serológicos, con al menos una composición proteica E1 y/o E2 y/o E1/E2 de al menos una de las composiciones peptídicas E1 o E2 antes definidas, preferentemente en una forma inmovilizada bajo condiciones apropiadas que permiten la formación de un complejo inmune, remover componentes no ligados, incubar los complejos inmunes formados con anticuerpos heterólogos, en los que dichos anticuerpos heterólogos fueron conjugados a una marcación detectable bajo condiciones apropiadas, detectar la presencia de dichos complejos inmunes en forma visual o mecánica (p.ej. por medio de densiometría, fluorimetría, colorimetría) e inferir la presencia de uno o más tipo serológicos del HCV a partir del patrón de ligado observado. Se sobreentiende que las composiciones de proteínas o de péptidos usadas en este método son proteínas envolventes tipo específicas de expresión recombinante o péptidos tipo específicos. La presente invención refiere además a un kit de tipificación sérica de uno o más tipos serológicos del HCV presente en una muestra biológica, más específicamente para detectar los anticuerpos para estos tipos serológicos de HCV, que comprende: al menos una proteína E 1 y/o E2 o un péptido E1 o E2, como antes descripto, un buffer o componentes necesarios para producir el buffer que permite la reacción de ligado entre esas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E 1 presentes en la muestra biológica, medios para detectar los complejos inmunes formados en la reacción de ligado precedente, posibilitar además un dispositivo automatizado de barrido e interpretación para inferir la disminución de títulos anti-E1 durante la progresión del tratamiento. La presente invención también refiere al empleo de una composición peptídica o proteica como antes definido, para la inmovilización sobre un sustrato sólido y la incorporación en un ensayo de hibridización de fase invertida, preferentemente para la inmovilización como líneas paralelas sobre un soporte sólido tal como una tira membranal, a fin de determinar la presencia o el genotipo del HCV conforme a un método como antes definido. Las combinaciones con otros antígenos tipo específicos de otras regiones de poliproteína HCV también se incluyen en el alcance de la presente invención. La presente invención proporciona un método para purificar proteínas simples u oligoméricas específicas recombinantes de la envoltura de HCV seleccionadas de las proteínas E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 producidas por un proceso de recombinación que consiste en contactar a tales proteínas con un agente reductor o de clivaje de las ligaduras bisulfuro. El contacto del método de la invención puede ser realizado en condiciones de clivaje o reducción parciales. Preferiblemente, el agente de clivaje de las ligaduras bisulfuro es ditiotreitol (DTT), preferiblemente en un rango de concentración de 0,1 a 50 mM, preferiblemente de 0,1 a 20 mM, más preferiblemente de 0,5 a 10 mM. Alternativamente, el agente de clivaje de las ligaduras bisulfuro puede ser un detergente, como Empigen-BB (que es una mezcla que contiene N-docecil-N,N-dimetilglicina como componente principal), preferiblemente a una concentración de 1 a 10%, más preferiblemente a una concentración de 3,5%. También pueden utilizarse mezclas de detergentes, agentes de clivaje de ligaduras bisulfuro y/ o agentes reductores. En una incorporación, se previene la reformación de las ligaduras bisulfuro con un agente bloqueante de los grupos SH, como N-etilmaleimida (NEM) o un derivado. En una incorporación preferida, la reformación de la ligadura bisulfuro es bloqueada mediante el empleo de condiciones de bajo pH. La presente invención presenta además un método como el que se describe aquí, que incluye los siguientes pasos: Lisado de las células huésped que expresan E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 recombinante, opcionalmente en presencia de un agente bloqueante de SH como N-etilmaleimida; recuperaciuón de dichas proteínas de la envoltura de HCV por purificación de afinidad como por medio de cromatografía de lectina, como cromatografía de lentil-lectina o por medio de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales específicos anti-E1 y/o anti-E2; reducción o clivaje de las ligaduras bisulfuro con un agente que diva las ligaduras bisulfuro, como DTT, preferiblemente también en presencia de un agente bloqueante SH, como NEM o Biotina-NEM y recuperación de las proteínas de la envoltura E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 por filtración en gel y opcionalmente, además, mediante un paso ulterior de cromatografía Ni-IMAC y de extracción de sal. La presente invención proporciona una composición que contiene proteínas de la envoltura de HCV, simples u oligoméricas específicas recombinantes sustancialmente aisladas y/ o purificadas y/ o aisladas y/ o purificadas seleccionadas de E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2, que preferiblemente han sido aisladas con los métodos descriptos aquí. En una incorporación preferida, las proteínas recombinantes de la envoltura de HCV de la invención han sido expresadas en células recombinantes de mamíferos, como vaccinia, células recombinantes de levaduras. La presente invención proporciona un vector recombinante que contiene una secuencia de vector, una secuencia promotora procariótica, eucariótica o viral y una secuencia de nucleótido que permite la expresión de una proteína simple u oligomérica específica E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2, en combinación operable. En una incorporación, la secuencia de nucleótido del vector codifica una única proteína E1 de HCV comenzando en la región entre las posiciones de aminoácidos 1 y 192 y finalizando en la región comprendida entre los aminoácidos 250 y 400, más particularmente finalizando en la región entre las posiciones 250 y 341 , aún más preferiblemente finalizando en la región entre la posición 290 y 341. En otra incorporación, la secuencia de nucleótido del vector codifica una única proteína E1 de HCV en la región comprendida entre las posiciones de aminoácidos 117 y 192 y finalizando en la región entre las posiciones de aminoácidos 263 y 400, más particularmente finalizando en la región comprendida entre las posiciones 250 y 326. En otra incorporación, la secuencia de nucleótido del vector codifica una única proteína E1 de HCV que posee una deleción del primer dominio hidrofóbico entre las posiciones 264 a 293, más o menos 8 aminoácidos. En otra incorporación, la secuencia de nucleótido del vector codifica una única proteína E2 de HCV comenzando en la región comprendida entre las posiciones de aminoácidos 290 y 406 y finalizando en la región comprendida entre las posiciones de aminoácidos 600 y 820, más particularmente comenzando en la región comprendida entre las posiciones 322 y 406, aún más preferiblemente comenzando en la región comprendida entre la posición 347 y 406 y más preferiblemente comenzando en la región comprendida entre las posiciones 384 y 406 y preferiblemente finalizando en cualquiera de las posiciones de aminoácidos 623, 650, 661 , 673, 710, 715, 720, 746 u 809. El vector de la presente invención, en una incorporación, contiene un codón ATG 5'-terminal y un codón de detención 3'-terminal ligado operativamente a la secuencia de nucleótido. El vector contiene, además, en una incorporación, una secuencia de nucleótido que contiene además en un sitio de clivaje del factor Xa y/ o 3 a 10, preferiblemente 6, codones de histidina agregados en forma 3'-terminal a la región codificante. El vector de la presente invención opcionalmente contiene una secuencia de nucleótido en la cual al menos uno de los sitios de glucosilación presentes en las proteínas E1 o E2 ha sido removido a nivel del ácido nucleico. La presente invención proporciona un ácido nucleico que contiene cualquiera de los SEC ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47 y 49 o sus partes. El vector de la invención puede contener preferiblemente una secuencia de nucleótido que contiene un ácido nucleico que contiene cualquiera de los SEC ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 21 , 23, 25, 27, 29, 31 , 35, 37, 39, 41 , 43, 45, 47 y 49 o sus partes. La composición de la presente invención contiene, además, proteínas recombinantes de la envoltura de HCV que han sido expresadas o son el producto de expresión de un vector descripto aquí. La presente invención proporciona una célula huésped transformada con al menos un vector recombinante como se describe aquí, en la cual el vector contiene una secuencia de nucleótido que codifica las proteínas E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 como se describe aquí además de una secuencia regulatoria operable en la célula huésped y capaz de regular la expresión de la proteína de HCV E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2. Además, la presente invención proporciona una proteína E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 expresada por una célula huésped de la invención. La presente invención proporciona además un método como el descripto aquí y que contiene los siguientes pasos: desarrollo de la célula huésped como se describe aquí, que ha sido transformada con un vector recombinante como se describe aquí, en un medio de cultivo adecuado; inducción de la expresión de la secuencia de nucléotido del vector, como se describe aquí, en condiciones adecuadas; lisado de las células huésped transformadas, preferiblemente en presencia de un agente bloqueante de grupos SH, como N-etilmaleimida (NEM); recuperación de la proteína de la envoltura del HCV por purificación de afinidad por medio de, por ejemplo, cromatografía de lectina o cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos monoclonales anti-E1 y/ o anti-E2 específicos, preferiblemente con dicha lectina como lentil-lectina seguida por incubación del material extraído del paso previo con un agente de clivaje de las ligaduras bisulfuro, como DTT, preferiblemente también en presencia de un agente bloqueante de los grupos SH, como NEM o Biotina-NEM, y aislamiento de las proteínas simples u oligoméricas específicas E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 de HCV por medio de filtración en gel y posiblemente también por medio de un paso adicional de cromatografía NI2+-IMAC y de extracción de sal. La presente invención proporciona una composición que contiene al menos uno de los siguientes péptidos de E1 y/ o E2: E1-31 (SEC ID NO 56) abarcando los aminoácidos 181 a 200 de la región Centro/ E1 V1 , E1-33 (SEC ID NO 57) abarcando los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1-35 (SEC ID NO 58) abarcando los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2 (epitope B), E1-35A (SEC ID NO 59) abarcando los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2 (epitope B), 1 bE1 (SEC ID NO 53) abarcando los aminoácidos 192 a 228 de las regiones V1 , C1 y V2 (que contienen el epitope B). E1-51 (SEC ID NO 66) abarcando los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1 -53 (SEC ID NO 67) abarcando los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4 (epitope A), E1 -55 (SEC ID NO 68) abarcando los aminoácidos 325 a 344 de la región E1.

Env 67 o E2-67 (SEC ID NO 72) abarcando las posiciones de los aminoácidos 397 a 416 de la región E2 (epitope a), Env 69 o E2-69 (SEC ID NO 73) abarcando las posiciones de los aminoácidos 409 a 428 de la región E2 (epitope A), Env 23 o E2-23 (SEC ID NO 86) abarcando las posiciones 583 a 602 de la región E2 (epitope E), Env 25 o E2-25 (SEC ID NO 87) abarcando las posiciones 595 a 614 de la región E2 (epitope E), Env 27 o E2-27 (SEC ID NO 88) abarcando las posiciones 607 a 626 de la región E2 (epitope E), Env 178 o E2-178 (SEC ID NO 83) abarcando las posiciones 547 a 566 de la región E2 (epitope D), Env 138 o E2-138 (SEC ID NO 82) abarcando las posiciones 523 a 542 de la región E2 (epitope C). La presente invención proporciona una composición que contiene al menos uno de los siguientes epitopes E2 de conformación: Epitope F reconocido por los anticuerpos monoclonales 15C8C1 , 12D11 F1 y 8G10D1 H9, Epitope G reconocido por el anticuerpo monoclonal 9G3E6, Epitope H (o C) reconocido por los anticuerpos monoclonales 10D3C4 y 4H6B2, Epitope I reconocido por el anticuerpo monoclonal 17F2C2. La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal específico para E1 y/ o E2 creado ante la inmunización con una composición como se describe aquí. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados, por ejemplo, como medicamentos, para la incorporación a un equipo de inmunoensayo para detectar la presencia de antígeno E1 o E2 de HCV, para pronóstico/ monitoreo de la enfermedad o para el tratamiento del HCV. La presente invención proporciona para el uso de un anticuerpo monoclonal específico E1 y/ o E2 como se describe aquí para la preparación de un equipo de inmunoensayo para detectar antígenos E1 o E2 de HCV, para la preparación de un equipo para pronóstico/ monitoreo de la enfermedad por HCV o para la preparación de un medicamento contra el HCV. La presente invención proporciona un método para el diagnóstico in vitro del antígeno de HCv presente en una muestra biológica, conteniendo al menos los siguiente pasos: contacto de ciha muestra biológica con un anticuerpo monoclonal específico para E1 y/ o E2 como se describe aquí, probablemente en una forma inmovilizada bajo condiciones apropiadas que permiten la formación de un complejo inmune, remoción de los componentes no unidos, incubación de los complejos inmunes formados con anticuerpos heterólogos, siendo éstos conjugados a un rótulo detectable bajo las condiciones apropiadas. Detección de la presencia de los complejos inmunes visualmente o mecánicamente.

La presente invención proporciona un equipo para determinar la presencia de antígenos de HVC presentes en una muestra biológica, que incluyen al menos lo siguiente: al menos un anticuerpo monoclonal específico para E1 y/ o E2 como se describe aquí, preferiblemente en una forma inmovilizada o en un sustrato sólido, un buffer (amortiguador) o componentes necesarios para producir la reacción que permite la unión entre estos anticuerpos y los antígenos de HCV presentes en la muestra biológica y, opcionalmente, un medio para detectar los complejos inmunes formados en la reacción de unión precedente. La composición de la presente invención puede ser presentada en la forma de un medicamento. La presente invención proporciona una composición, como se describe aquí, para ser utilizada como vacuna para inmunizar a un mamífero, preferiblemente seres humanos, contra el HCV, comprendiendo la administración de una cantidad efectiva de dicha composición, siendo acompañada, opcionalmente, por adyuvantes farmacéuticamente aceptables, para producir una respuesta inmunológica. La presente invención proporciona un método para utilizar la composición, como se describe aquí, para la preparación de una vacuna para inmunizar a un mamífero, preferiblemente seres humanos, contra el HCV, comprendiendo la administración de una cantidad efectiva de dicha composición, siendo acompañada, opcionalmente, por adyuvantes farmacéuticamente aceptables, para producir una respuesta inmunológica. La presente invención proporciona una composición de una vacuna para inmunizar a un mamífero, preferiblemente seres humanos, contra HCV, que contiene una cantidad efectiva de una composición que contiene la composición con E1 y/ o E2, como se describe aquí, opcionalmente acompañada también por adyuvantes farmacéuticamente aceptables. La composición de la presente invención puede ser proporcionada en una forma para la detección in vitro de anticuerpos contra HCV presentes en una muestra biológica. La presente invención también proporciona un método de preparación de un equipo de inmunoensayo para detectar anticuerpos HCV presentes en una muestra biológica y un método para detectar anticuerpos contra HCV presentes en una muestra biológica utilizando el equipo de la invención para diagnosticar anticuerpos contra HCV presentes en una muestra biológica. Tal método de la presente invención incluye al menos uno de los pasos siguientes: contacto de dicha muestra biológica con una composición como se describe aquí, preferiblemente en una forma inmovilizada bajo condiciones apropiadas que permite la formación de un complejo inmune con los anticuerpos contra HCV presentes en la muestra biológica. Remoción de los componentes no unidos, Incubación de los complejos inmunes formados con anticuerpos heterólogos, conjugando los mismos a un rótulo detectable bajo las condiciones apropiadas, Detección de la presencia de los complejos inmunes visualmente o mecánicamente. La presente invención proporciona un equipo para determinar la presencia de anticuerpos HCV presentes en una muestra biológica, conteniendo: al menos una composición de péptido o proteína como se describe aquí, preferiblemente en una forma inmovilizada sobre un sustrato sólido; un buffer (amortiguador) o componentes necesarios para producir la reacción que permite la unión entre estos péptidos o proteínas y los anticuerpos contra HCV presentes en la muestra biológica y, opcionalmente, un medio para detectar los complejos inmunes formados en la reacción de unión precedente. La presente invención proporciona un método para el monitoreo in vitro de la enfermedad por HCV o para diagnosticar la respuesta al tratamiento de un paciente que padece la infección por HCV, preferiblemente con interferón; tal método incluye: incubación de una muestra biológica del paciente infectado con HCV con una proteína E1 o una parte adecuada de ella en condiciones que permitan la formación de un complejo inmunológico; remoción de los componentes no unidos; cálculo de los títulos de anti-E1 presentes en la muestra al comienzo del tratamiento y durante su transcurso; monitoreo de la evolución natural de la enfermedad por HCV o diagnóstico de la respuesta del paciente al tratamiento sobre la base de los títulos de anti-E1 hallados en la muestra al comienzo del tratamiento y/ o durante su transcurso. La presente invención proporciona un equipo para el monitoreo de la enfermedad por HCV o pronosticar la respuesta al tratamiento, particularmente con interferón, de pacientes que padecen una infección por HCV; tal equipo incluye: al menos una proteína E1 o un péptido E1 , más particularmente una proteína o un péptido E1 como se describe aquí; un buffer (amortiguador) o componentes necesarios para producir la reacción que permite la unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E1 presentes en una muestra biológica y, opcionalmente, un medio para detectar los complejos inmunes formados en la reacción de unión precedente; opcionalmente también, un dispositivo automatizado de rastreo e interpretación para deducir un descenso de los títulos de anti-E1 durante la progresión del tratamiento. La presente invención proporciona un ensayo de serotipificación para detectar uno o más tipos serológicos de HCV presente en una muestra biológica, más particularmente, para detectar anticuerpos contra los diferentes tipos de HCV para ser detectados en combinación en un formato de un solo ensayo, incluyendo al menos los siguientes pasos: (i) contacto de la muestra biológica a analizar para la presencia de anticuerpos contra HCV de uno o más tipos serológicos, con al menos una de las composiciones de proteína E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 como se describe aquí o al menos una de las composiciones de péptidos E1 o E2 descriptas aquí, preferiblemente en una forma inmovilizada bajo condiciones apropiadas que permitan la formación de un complejo inmune; (ii) remoción de los componentes no unidos, (iii) incubación de los complejos inmunes formados con anticuerpos heterólogos, conjugando los mismos a un rótulo detectable bajo las condiciones apropiadas y, opcionalmente, (iv) detección de la presencia de los complejos inmunes visualmente o mecánicamente (por ejemplo, por medio de densitometría, fluorimetría, colorimetría) y deducir la presencia de uno o más tipos serológicos de HCV presentes a partir del patrón de unión observado. La presente invención proporciona un equipo para la serotipificación de uno o más tipos serológicos de HCV presentes en una muestra biológica, más particularmente para detectar los anticuerpos contra estos tipos serológicos de HCV conteniendo: al menos una proteína E1 y/ o E2 y/ o E1/ E2 como se describe aquí o un péptido E1/ E2 como se describe aquí; un buffer (amortiguador) o componentes necesarios para producir la reacción que permite la unión entre estas proteínas o péptidos y los anticuerpos anti-E1 presentes en una muestra biológica; opcionalmente, un medio para detectar los complejos inmunes formados en la reacción de unión precedente; opcionalmente también, un dispositivo automatizado de rastreo e interpretación para detectar la presencia de uno o más tipos serológicos presentes en el patrón de unión observado. La presente invención proporciona una composición de péptido o proteína como se describe aquí, para la inmovilización sobre un sustrato sólido e incorporación en un ensayo de hibridación de fase inversa, preferiblemente para la inmovilización como líneas paralelas en un soporte sólido como la tira de membrana, para determinar la presencia o el genotipo de HCV de acuerdo a un método descripto aquí. La presente invención proporciona una composición de vacuna terapéutica que contiene una cantidad efectiva de: Una composición que contenía al menos una proteína recombinante simple u oligomérica específica de la envoltura de HCV purificada seleccionada del grupo de una proteína E1 y una proteína E2 y, opcionalmente un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Las proteínas de la envoltura de HCV de la vacuna de la presente invención opcionalmente son producidas por células recombinantes de mamíferos o células recombinantes de levaduras. La invención proporciona una composición de vacuna terapéutica que contiene una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que contiene al menos uno de los siguientes péptidos de E1 y E2: E1-31 (SEC ID NO 56) abarcando los aminoácidos 181 a 200 de la región Centro/ E1 V1 , E1 -33 (SEC ID NO 57) abarcando los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1 -35 (SEC ID NO 58) abarcando los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2 (epitope B), E1-35A (SEC ID NO 59) abarcando los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2 (epitope B), 1 bE1 (SEC ID NO 53) abarcando los aminoácidos 192 a 228 de las regiones V1 , C1 y V2 (que contienen el epitope B). E1-51 (SEC ID NO 66) abarcando los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1-53 (SEC ID NO 67) abarcando los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4 (epitope A), E1-55 (SEC ID NO 68) abarcando los aminoácidos 325 a 344 de la región El Env 67 o E2-67 (SEC ID NO 72) abarcando las posiciones de los aminoácidos 397 a 416 de la región E2 (epitope A), Env 69 o E2-69 (SEC ID NO 73) abarcando las posiciones de los aminoácidos 409 a 428 de la región E2 (epitope A), Env 23 o E2-23 (SEC ID NO 86) abarcando las posiciones 583 a 602 de la región E2 (epitope E), Env 25 o E2-25 (SEC ID NO 87) abarcando las posiciones 595 a 614 de la región E2 (epitope E), Env 27 o E2-27 (SEC ID NO 88) abarcando las posiciones 607 a 626 de la región E2 (epitope E), Env 178 o E2-178 (SEC ID NO 83) abarcando las posiciones 547 a 566 de la región E2 (epitope D), Env 138 o E2-138 (SEC ID NO 82) abarcando las posiciones 523 a 542 de la región E2 (epitope C). La presente invención proporciona un método para tratar a un mamífero, como un ser humano, infectado con el HCV que comprende la administración de una cantidad efectiva de una composición como se describe aquí, como las vacunas descriptas anteriormente y, opcionalmente, un adyuvante farmacéuticamente aceptable. En una incorporación, la composición de la invención se administra en combinación o simultáneamente con el tratamiento antiviral, ya sea poco tiempo antes o después o con la administración de la composición de la invención. La presente invención proporciona una composición que contiene al menos una proteína recombinante purificada de la envoltura de HCV seleccionada del grupo de proteína E1 y E2 y, opcionalmepte, un adyuvante. En una incorporación preferida, la composición contiene al menos uno de los siguientes péptidos E1 y E2: E1 -31 (SEC ID NO 56) abarcando los aminoácidos 181 a 200 de la región Centro/ E1 V1 , E1-33 (SEC ID NO 57) abarcando los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1 -35 (SEC ID NO 58) abarcando los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2 (epitope B), E1 -35A (SEC ID NO 59) abarcando los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2 (epitope B), 1 bE1 (SEC ID NO 53) abarcando los aminoácidos 192 a 228 de las regiones V1 , C1 y V2 (que contienen el epitope B). E1 -51 (SEC ID NO 66) abarcando los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1-53 (SEC ID NO 67) abarcando los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4 (epitope A), E1-55 (SEC ID NO 68) abarcando los aminoácidos 325 a 344 de la región E1. Env 67 o E2-67 (SEC ID NO 72) abarcando las posiciones de los aminoácidos 397 a 416 de la región E2 (epitope A), Env 69 o E2-69 (SEC ID NO 73) abarcando las posiciones de los aminoácidos 409 a 428 de la región E2 (epitope A), Env 23 o E2-23 (SEC ID NO 86) abarcando las posiciones 583 a 602 de la región E2 (epitope E), Env 25 o E2-25 (SEC ID NO 87) abarcando las posiciones 595 a 614 de la región E2 (epitope E), Env 27 o E2-27 (SEC ID NO 88) abarcando las posiciones 607 a 626 de la región E2 (epitope E), Env 178 o E2-178 (SEC ID NO 83) abarcando las posiciones 547 a 566 de la región E2 (epitope D), Env 138 o E2-138 (SEC ID NO 82) abarcando las posiciones 523 a 542 de la región E2 (epitope C). La presente invención proporciona una composición terapéutica para inducir anticuerpos específicos contra HCV que contiene una cantidad terapéutica efectiva de una composición que contiene un complejo de E1/ E2 formado con proteínas recombinantes E1 o E2 simples u oligoméricas específicas de HCV recombinante purificado. Las proteínas de la envoltura del HCV recombinapte son producidas por células de levaduras recombinantes. La presente invención proporciona un método para tratar a un mamífero, como un ser humano, infectado con HCV, incluyendo la administración de una cantidad efectiva de una composición como se describe aquí y, opcionalmente, un adyuvante farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona una composición terapéutica para inducir anticuerpos específicos contra HCV conteniendo una cantidad terapéutica efectiva de una composición que contiene al menos una proteína recombinante purificada de la envoltura, simple u oligomérica específica de HCV recombinante seleccionada de una proteína E1 y una proteína E2 y, opcionalmente, un adyuvante farmacéuticamente aceptable. Referencias de figuras y tablas Figura 1 : mapa de restricción del plásmido pgpt ATA 18 Figura 2: mapa de restricción del plásmido pgs ATA 18 Figura 3: mapa de restricción del plásmido pMS 66 Figura 4: mapa de restricción del plásmido pv HCV-11a Figura 5: niveles de anti-E1 en pacientes que no responden al tratamiento con IFN Figura 6: niveles de anti-E 1 en pacientes que responden al tratamiento con IFN Figura 7: niveles de anti-E1 en pacientes con respuesta completa al tratamiento con IFN Figura 8: niveles de anti-E 1 en pacientes con respuesta incompleta al tratamiento con IFN Figura 9: niveles de anti-E2 en pacientes que no responden al tratamiento con IFN Figura 10: niveles de anti-E2 en pacientes que responden al tratamiento con IFN Figura 11 : niveles de anti-E2 en pacientes con respuesta incompleta al tratamiento con IFN Figura 12: niveles de anti-E2 en pacientes con respuesta completa al tratamiento con IFN Figura 13: reactividad de anti-E1 humano compitiendo con péptidos Figura 14: competencia de reactividad de anticuerpos anti-E1 monoclonales con péptidos Figura 15: niveles de anti-E1 (epítope 1 ) en pacientes que no responden al tratamiento con IFN Figura 16: niveles de anti-E1 (epítope 1 ) en pacientes que responden al tratamiento con IFN Figura 17: niveles de anti-E1 (epítope 2) en pacientes que no responden al tratamiento con IFN Figura 18: niveles de anti-E1 (epítope 2) en pacientes que responden al tratamiento con IFN Figura 19: competencia de reactividad de anticuerpos ant?-E2 monoclonales con péptidos Figura 20: reactividad de anti-E2 humano compitiendo con péptidos Figura 21 : secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención. Las secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína E1 ó E2 conforme la presente invención pueden traducirse (las SEC ID NO 3 a 13, 21 -31 , 35 y 41-49 se traducen en un marco de lectura que comienza del número residual 2), en secuencias de aminoácidos de las respectivas proteínas E1 y E2 como enunciadas en el listado de secuencias. Figura 22: resultados de ELISA obtenido de fracciones de eluato de cromatografía de lentil lectina de 4 diferentes purificaciones de E1 de lisatos de células infectadas con vvHCV39 (tipo 1 b), vvHCV40 (tipolb), vvHCV62 (tipo 3a) y vvHCV63 (tipo 5a). Figura 23: perfiles de elución obtenidos de una cromatografía de lentil lectina de las 4 construcciones de E1 diferentes en base a los valores como mostrados en la figura 22. Figura 24: resultados de ELISA obtenidos de fracciones obtenidas de una cromatografía de filtrado de gel de 4 diferentes purificaciones de E1 de lisatos de células infectadas con vvHCV39 (tipo 1 b), vvHCV40 (tipol b), vvHCV62 (tipo 3a) y vvHCV63 (tipo 5a). Figura 25: perfiles obtenidas de purificaciones de proteínas E1 del tipo 1b (1), tipo 3a (2), y tipo 5a (3) (de células RK13 infectadas con vvHCV39, vvHCV62 y vvHCV63, respectivamente; purificadas sobre lentil lectina y reducida como en el ejemplo 5.2 - 5.3) y un estándar (4). Los picos indicados con '1', '2' y '3' representan icos de proteína E1 pura (ver Figura 24, la reactividad de E1 principalmente en fracciones 26 a 30).

Figura 26: teñido plateado de un SDS-PAGE como descripto en el ejempio 4 de un lisato en bruto de E1 vvHCV40 (tipo 1b) (línea 1), conjunto 1 del filtrado con gel de vvHCV40 representando fracciones 10 a 17 como mostrado en la figura 25 (línea 2), conjunto 2 del filtrado con gel de vvHCV40 representando fracciones 18 a 25 como se muestra en la figura 25 (línea 3), y conjunto de E1 (fracciones 26 a 30) (línea 4). Figura 27: blot de fosfatasa alcalina de estreptavidina de las fracciones del filtrado con gel de las construcciones de E1 39 (tipo 1 b) y 62 (tipo 3 a). Las proteínas son marcadas con NEM biotina. Línea 1 : comienza filtrado con gel de construcción 39, línea 2: fracción 26 construcción 39, línea 3: fracción 27 construcción 39, línea 4: fracción 28, construcción 39, línea 5: fracción 29 construcción 39, línea 6: fracción 30 construcción 39, línea 7: fracción 31 construcción 39, línea 8: marcador de peso molecular, línea 9: comienza filtrado con gel construcción 62, línea 10: fracción 26 construcción 62, línea 11 : fracción 27 construcción 62, línea 12: fracción 28 construcción 62, línea 13: fracción 29 construcción 62, línea 14: fracción 30 construcción 62, línea 15: fracción 31 , construcción 62. Figura 28: teñido plateado de un gel SDS-PAGE de las fracciones del filtrado con gel de vvHCV-39 (E1 s, tipo 1b) y vvHCV-62 (E1 s, tipo 3 a) realizado bajo condiciones a las de la figura 26. . Línea 1 : comienza filtrado con gel de construcción 39, línea 2: fracción 26 construcción 39, línea 3: fracción 27 construcción 39, línea 4: fracción 28, construcción 39, línea 5: fracción 29 construcción 39, línea 6: fracción 30 construcción 39, línea 7: fracción 31 construcción 39, línea 8: marcador de peso molecular, línea 9: comienza filtrado con gel construcción 62, línea 10: fracción 26 construcción 62, línea 11 : fracción 27 construcción 62, línea 12: fracción 28 construcción 62, línea 13: fracción 29 construcción 62, línea 14: fracción 30 construcción 62, línea 15: fracción 31 , construcción 62. Figura 29: análisis de western blot con anticuerpo anti-E1 monoclonal de ratón 5E1A10 brindando una visión completa del procedimiento de purificación. Línea 1 : lisato en bruto, línea 2: pasaje a través de cromatografía de lentil lectina, línea 3: lavado con Empigen BB luego de la cromatografía con lentil, línea 5: pasaje a través durante la concentración del eluato de lentil, línea 6: conjunto de E1 luego de la cromatografía de exclusión de tamaño (filtrado con gel). Figura 30: perfil OD28o (línea continua) de la cromatografía con lentil lectina de la proteína E2 de células RK13 infectadas con vvHVC44. La línea punteada representa la reactividad de E2 como detectada por ELISA (como en ejemplo 6). Figura 31 A: perfil OD2ßo (línea continua) de la cromatografía con lentil lectina del conjunto de proteína E2 de RK13 infectadas con vvHVC44, en el que el conjunto E2 es inmediatamente aplicado a la columna de filtradon con gel (condiciones no reducidas). La línea punteada representa la reactividad de E2 como detectada por ELISA (como en ejemplo 6). Figura 31 B: perfil OD2so (línea continua) de la cromatografía con lentil lectina del conjunto de proteína E2 de células RK13 infectadas con vvHVC44, en el que el conjunto E2 fue reducido y bloqueado conforme al ejemplo 5.3 (condiciones reducidas). La línea punteada representa la reactividad de E2 como detectada por ELISA (como en ejemplo 6).

Figura 32: cromatografía NI2+-IMAC y reactividad de ELISA de la proteína E2 como expresada de vvHCV44 luego del filtrado con gel bajo condiciones reductoras como se muestra en la figura 31 B. Figura 33: teñido plateado de un SDS-PAGE de 0,5 µg de proteína E2 purificada recubierta con un paso de elución de imidazol de 200 mM (línea 2) y un lavado con 30 mM de imidazol (línea 1 ) de la cromatografía NI2+-IMAC como se muestra en la figura 32. Figura 34: perfiles OD de un paso de eliminación de sales de la proteína E 2 purificada recubierta con 200 mM de imidazol como se muestra en la figura 33, con la intención de eliminar la imidazol. Figura 35 A: niveles de anticuerpo de los diferentes antígenos del HCV (Core 1 , Core 2, E2HCVR, NS3) para Nr y NTR seguido durante el tratamiento y durante un período de 6 a 12 meses posterior al tratamiento determinado con el método LIAscan. Los valores promedio son indicados mediante las curvas con los cuadros abiertos. Figura 36: promedio de niveles del anticuerpo de E1 (E1Ab) y del anticuerpo de E2 (E2Ab) en los grupos LTR y NR. Figura 37: promedio de niveles del anticuerpo E1 (E1Ab) para pacientes que no responden al tratamiento (NR) y para pacientes con respuesta a largo plazo (LTR) para el tipo 1 b y el tipo 3 a. Figura 38: posiciones de mapeo relativas de los anticuerpos monoclonales anti-E2. Figura 39: deglucosilación parcial de la proteína envolvente HCV E1. El lisato de células RK13 infectadas con vvHCVlOA es incubado con diferentes concentraciones de glucosidasas conforme a las instrucciones del fabricante. Panel de la derecha: glucopeptidasa F (PNGase F). Panel de la izquierda: endoglucosidasa H (Endo H). Figura 40: deglucosilación parcial de la proteína envolvente HCV E2. El lisato de células (E2s)RK13 infectadas con vvHCVlOA es incubado con diferentes concentraciones de glucopeptidasa F (PNGase F) conforme a las instrucciones del fabricante. Figura 41 : mutagénesis in vitro de glucoproteínas HCV E1. Mapa de las secuencias mutadas y la creación de nuevos sitios de restricción. Figura 42 A: mutagénesis in vitro de glucoproteínas HCV E1 (parte 1 ). Primer paso de la amplificación PCR. Figura 42 B: mutagénesis in vitro de glucoproteínas HCV E1 (parte 2). Extensión superpuesta y PCR anidado. Figura 43: mutagénesis in vitro de glucoproteínas HCV E1. Mapa de los fragmentos mutados PCR (GLY-# y OVR-#) sintetizados durante el primer paso de la amplificación. Figura 44 A: análisis de mutantes de glucoproteína E1 mediante Western blot expresado en células HeLa (izquierda) y RK13 (derecha). Línea 1 : W natural (vaccinia virus). Línea 2: proteína E1 original (vvHCV-10 A), Línea 3: mutante de E1 Gly-1 (vvHCV-81 ), Línea 4: mutante de E1 Gly-2 (vvHCV-82), Línea 5: mutante de E1 gly-3 (vvHCV-83), Línea 6: mutante de E1 Gly-4 (vvHCV-84), Línea 7: mutante de E1 Gly-5 (vvHCV-85), Línea 8: mutante de E1 Gly-6 (vvHCV-86). Figura 44 B: análisis de los mutantes por glucosilacion de E1 de los virus vaccinia a través de amplificación/restricción PCR. Línea 1 : E1 (vvHCV-10 A), BspE I, Línea 2: E1.GLY-1 (vvHCV-81 ), BspE I, Línea 4: E1 (vvHCV-10 A), Sac l, Línea 5: E1.GLY-2 (vvHCV-82), Sac I, Línea 7: E1 (vvHCV-10 A), Sac I, Línea 8: E1.GLY-3 (vvHCV-83), Sac /, Línea 10: E1 (vvHCV-10 A), Stu I, Línea 11 : E1.GLY-4 (vvHCV-84), Stu I, Línea 13: E1 (vvHCV-10 A), Sma I, Línea 14: E1.GLY-5 (vvHCV-85), Sma I, Línea 16: E1 (vvHCV-10 A), Stu I, Línea 17: E1.GLY-6 (vvHCV-86), Stu /, Línea 17: E1.GLY-6 (vvHCV-86), Stu I, Linea 3 - 6 - 9 - 12 - 15: marcador de bajo peso molecular, pBluescript SK+, Msp I. Figura 45: electroforesis de gel de poliacrilamida SDS de E2 recombinante expresado en S cerevisiae. Los inoculados son cultivados en un medio selectivo de leucina durante 72 horas y diluidos 1/15 en un medio completo. Luego de 10 días de cultivo a 28EC, se tomaron muestras del medio. El equivalente de 200 µl de sobrenadante de cultivo concentrado mediante speedvac fue cargado al gel. Se analizaron dos transformadores independientes. Figura 46: electroforesis de gel de poliacrilamida SDS de E2 recombinante expresado en un mutante por glucosilación carente de S cerevisiae. Los inoculados son cultivados en un medio selectivo de leucina durante 72 horas y diluidos 1/15 en un medio completo. Luego de 10 días de cultivo a 28EC, se tomaron muestras del medio. El equivalente a 350 µl de sobrenadante de cultivo concentrado mediante cromatografía de intercambio iónico fue cargado al gel. Figura 47: Perfil de chimpancés y esquema de inmunicación. Figura 48: Respuesta celular luego de 3 inmunizaciones. Figura 49: Evolución de la respuesta celular luego de repetidas inmunizaciones on E1 Figura 50: Respuesta celular luego de inmunizaciones con NS3 Figura 51 : índice de estimulación hasta la semana 28. Figura 52: Producción de citoquinas de PBMCs. Figura 53: Resultados de la incorporación de timidina. Tabla 1 : Características de los respectivos clones y cebadores usados para amplificar para construir las diferentes formas de la proteína E1 como explicado en el ejemplo 1. Tabla 2: resumen de las pruebas anti-E1 Tabla 3: péptidos sintéticos para estudios competitivos Tabla 4: cambios de niveles de anticuerpos envolventes a lo largo del tiempo Tabla 5: diferencia entre LTR y NR Tabla 6: experimentos competitivos entre anticuerpos monoclonales de E2 murinos Tabla 7: cebadores para la construcción de mutantes por glucosilación de E1 Tabla 8: análisis de mutantes por glucosilación de E1 mediante ELISA Tabla 9: Cebadores para la construcción de mutantes de glicosilación E1 Tabla 10: Respuestas humorales: No. de inmunizaciones requeridas para los diferentes niveles de anticuerpos E1. Tabla 11 : Títulos de anticuerpos de chimpancés. Tabla 12: Títulos de anticuerpos humanos Tabla 13: Títulos de anticuerpos humanos (8-28 semanas). Ejemplo 1 : Clonación y expresión de la proteína E1del virus de la hepatitis 1. Construcción de vectores de recombinación del virus vaccinia El plásmido de recombinación de vaccinia pgptATA es una versión modificada del la pATA18 (Stunnenberg et al, 1988) con una inserción adicional que contiene el gen de xantin guanina fosforibosil transferasa de E coli bajo el control del promotor intermediario 13 del virus vaccinia (Figura 1 ). El plásmido pgsATA18 se construyó por medio de la inserción de un enlace oligonucleótido con la SEC ID NO 1/94, que contiene codones de detención en los tres marcos de lectura, en el vector Pst y Hindi-cut pATA18. Esto creó un sitio de restricción Pac I extra (Figura 2). El sitio Hindi original no se restauró. Enlace Oligonucleótido con SEC. ID NO 1/94 5' G GCATGC AAGCTT AATTAATT 3' 3' ACGTC CGTACG TTCGAA TTAATTAA TCGA 5' Pstl Sphl Hindlll Pac í (Hindlll) Con el fin de facilitar la purificación rápida y eficiente por medio de la quelación de Ni2+ de los tramos de histidina diseñada fusionados a las proteínas recombinantes, el vector de recombinación de vaccinia pMS66 se diseñó para expresar las proteínas secretadas con una marca de histidina carboxi-terminal adicional. Un enlace oligonucleótido con la SEC ID NO 2/95, que contiene sitios únicos para enzimas de restricción 3 que generan extremos truncados (Sma I, Stu I y PMI/Bbr Pl) se sintetizó de tal forma que el extremo carboxi-terminal de cualquier cADN se podría insertar en el cuadro con una secuencia que codifica el sitio de disociación del factor de proteasa Xa seguido por una secuencia de nucleótido que codifica 6 histidinas y 2 codones de detención (se creó un nuevo sitio de restricción Pac I en sentido descendente de la extremidad 3'). Este oligonucleótido con la SEC ID NO 2/95 se introdujo entre los sitios Xma I y Pst I de pgptATA18 (Figura 3) Enlace Oligonucleótido con SEC. ID NO 2/95: 5' CCGGG GAGGCCTGCACGTGATCGAGGGCAGACACCATCACCACCATCACTAATAGTTAA TTAA CTGCA 3' 3' C CTCCGGACGTGCACTAGCTCCCGTCCTGTGGTAGTGGTGGTAGTGATTATCAAT TAATT G Xmal — Pstl 207649 US/cnm El plásmido pgpt ATA-18 contenido dentro de Escherichia coli MC1061 (lambda) ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en BCC M/LMBP (Belgian Coordinated Collections of microorganisms/Laboratorium voor Moleculaire Biologie- Plasmidoncolledier, Universiteit Gent, K.L. Ledeganckstaat 35, B-9000 Ghent, Belgium), y lleva el número de acceso LMBP 4486. Dicho depósito fue realizado el 9 de enero, 2002.

Ejemplo 2. Construcción de plásmidos recombinantes de HCV 2.1. Construcciones que codifican formas diferentes de la proteína E1 Los productos de Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) se derivaron de las muestras de suero por medio de la preparación del ARN y la posterior trascripción inversa y la PCR tal como se describió anteriormente (Stuyver et al., 1993b) . La tabla 1 muestra los rasgos de los clones respectivos y los cebadores que se utilizan para la amplificación. Los fragmentos de PCR se clonaron en los plásmidos Sma I-cut pSP72 (Promega). Los siguientes clones se seleccionaron para la inserción en los vectores de recombipación de vaccinia: HCCI9A (SEC ID NO 3), HCCI10A (SEC ID NO 5), HCCI11A (SEC ID NO 7), HCCI12A (SEC ID NO 9), HCCI13A (SEC ID NO 11 ), y HCCI17A (SEC ID NO 13) tal como se muestra en la Figura 21. Los fragmentos de cADN que contienen las regiones de codificación de E1 se disociaron por medio de la restricción de EcoRI y Hindi a partir de los plásmidos pSP72 respectivos y se insertaron en el vector de recombinación de vaccinia EcoRI/Hindi-cut pgptATA-18 (descripta en el ejemplo 1 ), en sentido descendente del promotor final del virus vaccinia. Los plásmidos respectivos se designaron como pvHCV-9A, pvHCV-10A, pvHCV-11A, pvHCV-12A, pvHCV-11A, pvHCV-13A, pvHCV-17A, de los cuales pvHCV-11 A se muestra en la Figura 4. 2.2 Mutantes deliminación de E1 de la región hidrofóbica El clon HCCI37, que contiene una eliminación de los codones Asp264 hasta Val287 (nucleótidos 790 hasta 861 , región que codifica el dominio I hidrofóbico) se generó de la siguiente manera: se generaron 2 fragmentos de PCR a partir del clon HCCMOAa con los grupos de cebadores HCPr52 (SEC ID NO 16)/HCPr107 (SEC ID NO 19) y HCPM08 (SEC ID NO 20)/HCPR54 (SEC ID NO 18). Estos cebadores se muestran en la Figura 21. Los dos fragmentos de PCR se purificaron a partir del gel de agarosa luego de la electroforesis y se utilizó 1 ng de cada fragmento juntos como patrón para la PCR por medio de los cebadores HCPr52 (SEC ID NO 16) y HCPr54 (SEC ID NO 18). El fragmento resultante se clonó en el vector Sma l-cut pSP72 y los clones que contienen la eliminación se identificaron en forma rápida por la eliminación de 24 codones (72 pares de base). Se seleccionó el plásmido pSP72HCCI37 que contiene el clon HCCI37 (SEC ID NO 15). Se construyó un plásmido de vaccinia recombinante que contiene el dominio hidrofóbico I que carece del cADN de E1 de longitud completa por medio de la inserción de la secuencia del HCV que rodea a la eliminación (fragmento disociado por medio de Xma I y BamH I a partir del vector pSP72-HCCI37) en los sitios Xma I y BamH I del plásmido de vaccinia pvHCV-10A. La eliminación resultante denominó pvHCV-37. Luego de una secuenciación confirmatoria, la región amino-terminal que contiene la eliminación interna se aisló de este vector pvHCV-37 (disociación por medio de EcoR I y BstE II) y se reinsertó en el plásmido Eco Rl y Bst Ell-cut pvHCV-11A. Se esperaba que esta construcción exprese una proteína E1 con eliminación de ambos dominios hidrofóbicos y se la denomió pvHCV-38. La región de codificación de E1 del clon HCCI38 se representa por medio de la SEC ID NO 23. Como la región hidrofílica en la extremidad carboxi de E1 (que se extiende en forma teórica hasta alrededor de los aminoácidos 337-340) no se incluyó en forma completa en la construcción pvHCV-38, un dominio I hidrofóbico más grande que carece de la región E1 se aisló del plásmido pvHCV-37 por medio de la disociación de EcoR l/Bam Hl y se clonó en un vector EcoRI/BamHI-cut pgsATA-18. El plásmido resultante se nombró como pvHCV-39 y contenía el clon HCCI39 (SEC ID NO 25). El mismo fragmento se disoció a partir del vector pvHCV-37 por medio del BamH I (del cual los extremos pegajosos se llenaron con Polimerasa de ADN Klenow (Boehringer) y en forma subsiguiente por medio del EcoR I (5' en el extremo cohesivo). Esta secuencia se insertó en el vector EcoRI y Bbr P l-cut pMS-66. Esto resultó en un clon HCCI40 (SEC ID NO 27) en el plásmido pvHCV-40, que contiene una cola de 6 histidinas en su extremo carboxi-terminal. 2.3 E1 de otros genotipos El clon HCCI62 (SEC ID NO 29) derivó de un paciente infectado de tipo 3a con hepatitis C crónica (suero BR36, clon BR36-9-13, SEVC ID NO 19 en WO 94/25601 , y remitirse además a Stuyver et al. 1993a) y HCCI63 (SEC ID NO 31) derivó de un niño infectado con el tipo 5A con una hepatitis posterior a una transfusión (suero BE95, clon PC-4-1 , SEC ID NO 45 en WO 94/25601 ) 2.4 Construcciones de E2 El fragmento 22 de PCR de HCV E2 se obtuvo a partir del BE11 en suero (genotipo 1 b) por medio de los cebadores HCP 09 (SEC ID NO 33) y HCPr72 (SEC ID NO 34) por medio del uso de técnicas de preparación del ARN, trascripción inversa y PCR, como se describió en Stuyber et al., 1993b, y el fragmento se clonó en un vector Sma l-cut pSP72. El clon HCCI22A (SEC ID NO 35) se cortó con Ncol/AlwNI o por medio de un BamHI/AlwNI y los extremos pegajosos del fragmento se truncaron (sitios Ncol y BamHl con Polimerasa I de ADN de Klenow (Boerhinger), y AlwNI con polimerasa de ADN T4 (Boerhinger). Luego el fragmento de cADN BamHI/AlwNI se insertó en el vector de vaccinia pgsATA-18 que se había linearizado por medio de la disociación de EcoR I y Hind lll y de los cuales los extremos cohesivos se habían llenado con Polimerasa de ADN de Klenow (Boerhinger). El plásmido resultante se denominó pvHCV-41 y codificó la región E2 de los aminoácidos Met347 hasta el Gln673, que incluye 37 aminoácidos (del Met347 al Gly383) de la proteína E1 que puede servir como secuencia de señalización. El mismo cADN HCV se insertó en el vector pmMS66 EcoR I y Bbr Pl-cut, que posteriormente se había terminado en forma truncada con Polimerasa de ADN de Klenow. El plásmido resultante se denominó pvHCV-42 y también codificó los aminoácidos 347 hasta 683. El fragmento Ncol/AlwNI se insertó de una forma similar en los mismos sitios de los vectores de vaccinia pgsATA-18 (pvHCV) o pMS-66 (pvHCV-44). Los aminoácidos codificados pvHCV-43 y pvHCV-44 364 al 673 de la poliproteína del HCV, de la cual los aminoácidos 364 al 383 derivaron de la región natural carboxi-terminal de la proteína E1 que codifica la secuencia de señal para E2, y los aminoácidos 384 al 673 de la proteína madura E2. 2.5 Generación de los virus vaccinia recombinantes HCV Las células de riñon de conejo RK13 (ATCC CCL 37), líneas celulares del osteosarcoma humano 143B con deficiencia de timidina quinasa (TK") (ATCC CRL 8303), HeLa (ATCC CCL 2), y Hep G2 (ATCC HB 8065) se obtuvieron del American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Md, USA). Se cultivaron las células en un medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con un 10% de suero de feto de ternero, y con sales de Earle (EMEM) para RK13 y 143 B (TK-), y con glucosa (4 g/l) para Hep G2. La cepa WR del virus vaccinia (Western Reserve, ATTC VR119) se propagó como rutina tanto en células 143B como RK13, tal como se describió anteriormente (Panicali & Paoletti, 1982; Piccini et al., 1987; Macket et al., 1982, 1984, y 1986). Un capa única confluente de las células 143B se infectaron con el virus vaccinia de tipo salvaje en una multiplicidad de infección (m.o.i.) de 0,1 (= 0,1 placa que forma una unidad (PFU) por célula). Dos horas más tarde, el plásmido de recombinación de vaccinia se transfectó a las células infectadas en la forma de coprecipitado de fosfato de calcio que contiene 500 ng del plásmido ADN para permitir la recombinación homologa (Graham & van der Eb, 1973; Macket et al., 1985). Los virus recombinantes que expresan la fosforibosil transferasa de xantina-guanina de Escherichia coli (gpt) se seleccionaron sobre células RK13 de riñon de conejo que se incubaron en un medio de selección (EMEM que contiene 25 µg/ml de ácido micofenólico (MPA), 250 µg/ml de xantina, y 15 µg/ml de hipoxantipa, Falkner y Moss, 1988; Janknecht et al, 1991 ). Los virus recombinantes simples se purificaron sobre capas únicas frescas de células RK13 bajo una cubierta de agarosa de 0,9% de un medio de selección. Los virus recombianantes con deficiencia de timidina quinasa (TK") se seleccionaron y luego se purificaron de placa sobre mono capas frescas de células 143B humanas (TK-) en la presencia de 25 µg/ml de 5-bromo-2'-desoxiuridina. Los stocks de virus vaccinia de HCV recombinantes purificados se prepararon por medio de la infección de, ya sea células 143 B humanas o RK13 de conejo en un m.o.i. de 0,05 (Mackett et al, 1998). La inserción del fragmento de cADN HCV en los virus vaccinia recombinantes se confirmaron sobre una alícuota (50 µg) del lisato celular luego de la selección del MPA por medio del PCR con los cebadores que se utilizaron para clonar los fragmentos respectivos de HCV (ver la Tabla 1 ). Los virus vaccinia recombinantes de HCV se denominaron de acuerdo al número de plásmido en la recombinación de vaccinia, por ejemplo, el virus vaccinia recombinante vvHCV-10A derivó de la recombinación de la cepa WR de tipo salvaje con el plásmido pvHCV-10A.

Ejemplo 3: Infección de las células con los virus vaccinia recombinantes Se infectó una mono capa confluente de células RK13 en un m.o.i. de 3 con los virus vaccinia recombinante de HCV tal como se describe en el ejemplo 2. Para la infección, se lavó la mono capa celular dos veces con solución salina con pH regulado con fosfato con un pH de 7,4 (PBS) y se diluyó el stock del virus recombinante de vaccinia en un medio MEM. Se agregaron 200 µl de la solución del virus por cada 106 de células de tal forma que el m.o.i. fuera 3, y se incubó durante 45 min. a 24°C. Se aspiró la solución del virus y se agregaron 2 ml del medio de cultivo completo (ver el ejemplo 2) por cada 106 de células. Las células se incubaron durante 24 hs. a 37°C mientras tenía lugar la expresión de las proteínas del HCV. Ejemplo 4: Análisis de las proteínas recombinantes por medio de western blottinq Se lavaron las células infectadas dos veces con PBS, se usaron en forma directa con un buffer de lisis (50 mM Tris.HCI pH de 7,5, 150 mM NaCI, 1 % Tritón X-100, 5 mM MgCI2, 1 µg/ml aprotinina (Sigma, Bornem, Bélgica)) o se desprendieron de los frascos por medio de la incubación en 50 mM Tris. HCL pH de 7,5/ 10 mM EDTA/ 150 mM NaCI durante 5 min, y se recolectó por medio del centrifugado (5 min. a 1000g). Luego se suspendió nuevamente el pellet celular en 200 µl de buffer de lisis (50 mM Tris.HCL pH de 8,0, 2mM EDTA, 150 mM NaCI, 5 mM MgCI2, aprotinipa, 1 % Tritón X-100) por cada 106 de células. Se limpiaron los lisatos de las células durante 5 minutos a 14.000 rpm en una centrífuga Eppendorf hasta quitar los restos insolubles. Se separaron las proteínas de 20 µl de lisato por medio de la electroforesis con gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE). Luego las proteínas se transfirieron en forma electrónica a partir del gel hasta una lámina de nitrocelulosa (Amersham) por medio del uso de una unidad de transferencia Hoefer HSI enfriada a 4°C durante 2 horas a un voltaje constante de 100 V, en un buffer de transferencia (25 mM Tris.HCI pH de 8,0, 192 mM de glicina, 20% (v/v) metanol). Los filtros de nitrocelulosa se bloquearon con Blotto (5% (p/v) leche en polvo instantánea sin grasas en PBS; Jonson et al., 1981) y se incubaron con anticuerpos primarios diluidos en Blotto/0,1 % Tween 20. Generalmente, un suero humano de control negativo o un suero de un paciente infectado con HCV se diluyeron 200 veces y se preincubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con lisato celular infectado con el virus vaccinia del tipo salvaje diluido 200 veces con el fin de reducir la unión no específica. Luego de lavar con Blotto/0,1 % Tween 20, los filtros de nitrocelulosa se incubaron con una solución de substrato de fosfatasa alcalina diluida en Blotto/0,1 % Tween 20. Luego de lavar con 0,1 % Tween 20 en PBS, los filtros se incubaron con una solución de substrato de fosfatasa alcalina (100 mM Tris.HCI pH de 9,5, 100 mM NaCI, 5mM MgCI2, 0,38 µg/ml de tetrazolio nitroblue, 0,165 µg/ml 5-bromo-4-cloro-3-indolifosfato). Todos los pasos, excepto la electrotransferencia, se realizaron a temperatura ambiente. Ejemplo 5: Purificación de la proteína recombinante E1 o E2 5.1 Lisis Las células infectadas RK13 (que transportan construcciones E1 o E2) se lavaron dos veces con solución salina con pH de fosfato (PBS) y se desprendieron de los recipientes de cultivo por medio de la incubación en PBS que contiene 10 mM EDTA. Las células desprendidas se lavaron dos veces con PBS y se agregó 1 ml de buffer de lisis (50 mM Tris.HCI pH de 7,5, 150 mM NaCI, 1 % Tritón X-100, 5 mM MgCI2, 1 µg/ml de aprotinina (Sigma, Bornem, Bélgica) que contiene 2 mM de N-etilmaleimida biotinilada (biotin-NEM) (Sigma) por cada 105 de células a 4°C. Este lisato se homogeneizó con un "douncer" de tipo B y se dejó a temperatura ambiente durante 0,5 horas. Se agregaron otros 5 volúmenes de buffer de lisis que contiene 10 mM de N-etilmaleimida (NEM, Aldrich, Bornem, Bélgica) al lisato primario y la mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 15 min. Se limpiaron los residuos celulares insolubles de la solución por medio del centrifugado en un rotor Beckman JA-14 a 14.000 rpm (301000 g a rmax) durante 1 hora a 4°C. 5.2 Cromatografía de Lectina Se cargó el lisato celular limpio a una tasa de 1 ml/min en un 0,8 por medio de una columna de 10 cm de Lentil-lectina Sefarosa 4B (Farmacia) que se había equilibrado con 5 volúmenes de columnas de un buffer lisis a una tasa de 1 ml/min. La columna lentil-lectina se lavó con 5 a 10 volúmenes de columnas de buffer 1 (0,1 M de fosfato de potasio con un pH de 7,3, 500 mM KCl, 5% de glicerol, 1 mM 6-NH2-ácido hexanoico, 1 mM MgCI2, y 1 % DecilPEG (KWANT, Bedum, Países Bajos). En algunos experimentos, la columna se lavó posteriormente con 10 volúmenes de columnas del buffer 1 que contiene 0,5% de Empigen-BB, y 0,5 M a-metilo-manopiranosida). El material eluído se fraccionó y las fracciones se seleccionaron en busca de la presencia de la proteína E1 o E2 por medio dellSA tal como se describió en el ejemplo 6. La Figura 22 muestra los resultados obtenidos de las fracciones de eluato de lentil lectina de 4 purificaciones diferentes de lisatos celulares infectados con vvHCV39 (tipo 1 b), vvHCV40 (Tipo 1 b), vvHCV62 (tipo 3a), y vvHCV63 (tipo 5a). La Figura 23 muestra los perfiles que se obtuvieron a partir de los valores que se muestran en la Figura 22. Estos resultados muestran que la columna de afinidad de lectina se puede emplear para proteínas envolventes de los tipos diferentes de HCV. .3 Reducción parcial y de la concentración Las fracciones positivas E1 o E2 se reunieron y se concentraron en un Centricon 30 kDa (Amicon) por medio del centrifugado durante 3 horas a 5.000 rpm en un rotor Beckman JA-20 a 4°C. En algunos experimentos las fracciones positivas E1 o E2 se reunieron y se concentraron por medio de la evaporación del nitrógeno. Un equivalente de células de 3,108 se concentró hasta 200 µl aproximadamente. Para la reducción parcial, se agregó 30% de Empigen-BB (Calbiochem, San Diego, CA, USA) a este 200 µl hasta una concentración final de 3,5 %, y se agregó 1 M DTT en H20 a una concentración final de 1 ,5 a 7,5 mM y se incubó durante 30 min. a 37°C. Se agregó en forma subsiguiente NEM (1 M en dimetilsulfoxida) a la concentración final de 50 mM y se dejó que reacciones durante otros 30 min. a 37°C hasta bloquear los grupos libres de sulfidrilo. 5.4 Cromatografía de filtración de gel Se equilibró una columna Superdex-200 HR 10/20 (Farmacia) con volúmenes de 3 columnas de PBS/3% Empingen-BB. La mezcla reducida se inyectó en una muestra tipo loop de 500 µl del Sistema Smart (Farmacia) y se agregó PBS/3% Empingen-BB buffer por filtración de gel. Las fracciones de 250 µl se recolectaron de Vo hasta Vt. Las fracciones se evaluaron en busca de la presencia de la proteína E1 o E2 tal como se describe en el ejemplo 6.

La Figura 24 muestra los resultados de ELISA que se obtuvieron a partir de las fracciones que se obtuvieron luego de la cromatografía de filtración de gel de 4 purificaciones diferentes de E1 de lisatos celulares infectados con vvHCV39 (tipo 1 b), vvHCV40 (tipo 1 b), vvHCV62 (tipo 3A), y vvHCV63 (tipo 5A). La Figura 25 muestra los perfiles que se obtuvieron a partir de las purificaciones de las proteínas E1 de los tipos 1 b, 3A, y 5A (a partir de las células RK13 infectadas con vvHCV39, vvHCV62, y vvHCV63, en forma respectiva; purificadas sobre lentil lectina y reducidas como en los ejemplos anteriores). Los picos indicados con 'Y, '2', y '3', representan los picos de proteína pura E1 (La reactividad E1 principalmente en fracciones de 26 hasta 30). Estos picos muestran pesos moleculares muy similares de aproximadamente 70 kDa, que corresponde a la proteína dimérica E1. Otros picos en los tres perfiles representan el virus vaccinia y/o las proteínas celulares que se pudieron separar de E1 solamente por el paso de reducción como se mostró en el ejemplo 5.3. y por el paso subsiguiente de filtración de gel en la presencia del detergente apropiado. Tal como se muestra en la Figura 26 reunión 1 (que representa fracciones de 10 a 17) y la reunión 2 (que representa fracciones 18 a 25) contiene proteínas contaminantes no presentes en la reunión E1 (fracciones 26 a 30). Las fracciones pico E1 se corrieron en SDS/PAGE y se realizó un blot tal como se describe en el ejemplo 4. Las proteínas que se etiquetaron con NEM-biotina se detectaron por medio de streptavidina-fosfatasa alcalina tal como se muestra en la Figura 27. Se puede observar en forma rápida que, entre otras, las proteínas contaminantes 29 kDa y 45 kDa presentes antes de la cromatografía con filtración de gel (línea 1 ) están presentes solamente en niveles bajos en las fracciones 26-30. La banda de 65kDa aproximadamente representa la forma dimérica E1 que no se pudo descomponerse en forma completa en la forma monomérica de E1. Se obtuvieron resultados similares para el tipo 3A de la proteína E1 (líneas 10 a 15), los cuales muestran una movilidad más rápida sobre el SDS/PAGE por la presencia de 5 carbohidratos solamente en lugar de 6. La Figura 28 muestra una mancha de plata de un ciclo de gel de SDS/PAGE en condiciones idénticas tal como se muestra en la Figura 26. Una vista completa del proceso de purificación se da en la Figura 29. La presencia de la proteína E1 purificada se confirmó en forma posterior por medio del western blotting tal como se describe en el ejemplo 4. La proteína E1 dimérica apareció ser no-agregada y libre de contaminantes. El subtipo 1 b de la proteína E1 que se purificó a partir de las células infectadas con vvHCV40 de acuerdo al esquema anterior, se secuenció en forma aminotérmica en un secuenciador 477 Perkins-Elmer y resultó que contiene una tirosina como primer residuo. Esto confirmó que la proteína E1 se había disociado por medio de señal de peptidasa en la posición correcta (entre A191 y Y192) a parir de su secuencia de señal. Esto confirma el hallazgo de Hijikata et al. (1991 ) que el amino-término de la proteína madura E1 comienza en la posición 192 del aminoácido. 5.5 Purificación de la proteína E2 La proteína E2 (aminoácidos 384 a 673) se purificó a partir de células RK13 infectadas con vvHCV44 tal como se indica en los ejemplos 5.1 a 5.4. La Figura 30 muestra el perfil OD2so (línea continua) de la cromatografía de lentil lectina. La línea de puntos representa la reactividad de la E1 tal como se detecta por medio del ELISA (remitirse al ejemplo 6). La Figura 31 muestra los mismos perfiles que se obtuvieron a partir de la cromatografía de filtración de gel del grupo E2 de lentil-lectina (remitirse a la Figura 30), parte de la cual se redujo y se bloqueó de acuerdo a los métodos que se establecen en el ejemplo 5.3, y parte de la cual se aplicó en forma inmediata a la columna. Ambas partes del grupo E2 se corrió en columnas separadas de filtración de gel. Se pudo demostrar que E2 forma agregados unidos en forma covalente con proteínas contaminantes si no se ha realizado ninguna reducción. Luego de la reducción y del bloqueo, la mayoría de las proteínas contaminantes se segregaron en la fracción Vo. Otras proteínas contaminantes co-purificadas con la proteína E2, ya no se unieron en forma covalente a la proteína E2 ya que estos contaminantes se pudieron quitar en un paso posterior. La Figura 32 muestra un paso de purificación adicional Ni2+IMAC que se llevó a cabo para la purificación de la proteína E2 tal como se expresa a partir del vvHCV44. Las proteínas contaminantes se corrieron tanto a través de la columna o se pueden quitar por medio de un lavado de 30mM de imidazol. La proteína pura E2 se pudo recubrir fácilmente por medio de un paso delusión de 200 mM de imidazol. La Figura 34 muestra una paso de eliminación de sales adicional pensado para quitar el imidazol y ser capaz de alcanzar el buffer deseado, por ejemplo, PBS, buffer de carbonato, solución salina. Ejemplo 6: ELISA para la detección de anticuerpos anti-E1 o anti-E2 o para la detección de proteínas E1 o E2. Se recubrieron placas de microreceptáculos Maxisorb (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con 1 volumen (por ejemplo, 50 µl o 100 µl o 200 µl) por receptáculo de una solución de 5 µg/ml de Streptavidin (Boehringer Mannheim) en PBS durante 16 horas a 4°C o durante 1 hora a 37°C. En forma alternativa, los receptáculos se recubrieron con 1 volumen de 5 µg/ml de aglutinina Galanthus nivalis (GNA) en 50 mM de buffer de carbonato de sodio pH 9,6 durante 16 horas a 4°C o durante 1 hora a 37°C. En el caso de recubrimiento con GNA, las placas se lavaron 2 veces con 400 µl de Solución de Lavado del kit Innotest HCV Ab lll (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica). Las superficies de recubrimiento no adheridas se bloquearon con 1 ,5 a 2 volúmenes de solución de bloqueo (0,1 % de caseína y 0,1 % de NaN3 en PBS) durante 1 hora a 37°C o durante 16 horas a 4°C. Se aspiró la solución de bloqueo. Las E1 ó E2 purificadas se diluyeron hasta 100-1000 ng/ml (concentración medida a A= 280 nm) o fracciones de columna que deben seleccionarse para E1 o E2 (ver ejemplo 5), o E1 o E2 en lisatos celulares no purificados (ejemplo 5.1 ) se diluyeron 20 veces en solución de bloqueo, y 1 volumen de la solución de E1 o E2 se agregó a cada receptáculo y se incubó durante 1 hora a 30°C en las placas recubiertas con Streptavidin o GNA. Los micro-receptáculos se lavaron 3 veces con 1 volumen de Solución de Lavado del kit Innotest HCV Ab lll (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica). Se diluyeron las muestras de suero 20 veces o se diluyeron los anticuerpos monoclonales anti-E1 o anti- E2 hasta una concentración de 20 ng/ml en Diluyente para la Muestra del kit Innotest HCV Ab lll y 1 volumen de la solución se dejó para que reaccione con la proteína E1 o E2 durante 1 hora a 37°C. Se lavaron los micro-receptáculos 5 veces con 400 µl de Solución de Lavado del kit Innotest HCV Ab lll (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica). Los anticuerpos adheridos se detectaron por incubación de cada receptáculo durante 1 hora a 37°C con una IgG anti-humana o anti-ratón de cabra, anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (DAKO; Glostrup, Dinamarca) diluido en 1/80.000 en 1 volumen de Diluyente Conjugado del kit Innotest HCV Ab lll (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica), y se obtuvo desarrollo de color por medio del agregado de substrato del kit Innotest HCV Ab lll (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica) diluido 100 veces en 1 volumen de Solución de Substrato del kit Innotest HCV Ab lll (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica) durante 30 min. a 24°C luego de lavar las placas 3 veces con 400 µl de Solución de Lavado del kit Innotest HCV Ab lll (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica). Ejemplo 7: Seguimiento de grupos de pacientes con diferentes perfiles clínicos 7.1 Monitoreo de anticuerpos anti-E 1 y anti-E2 Los ensayos de diagnóstico actuales para el virus de la hepatitis C (HCV) se han desarrollado para selección y confirmación de la presencia de anticuerpos del HCV. Dichos ensayos no suministran información útil para monitoreo del tratamiento o para pronóstico del resultado de la enfermedad. Sin embargo, como en el caso de la hepatitis B, la detección y cuantificación de los anticuerpos anti-envoltorio pueden probar ser más útiles en un marco clínico. Para investigar la posibilidad del uso del título del anticuerpo anti-E1 y el título del anticuerpo anti-E2 como marcadores de pronóstico para el resultado de la enfermedad de la hepatitis C, una serie de pacientes tratados con IFN-a con respuesta prolongada a largo plazo (definidos como pacientes con niveles normales de transaminasa y test HCV-ARN negativo (PCR en la región no codificadora 5') en la sangre durante un período de por lo menos 1 año posterior al tratamiento) se comparó con pacientes que no muestran respuesta o que muestran respuesta bioquímica con recaída al final del tratamiento.

Un grupo de 8 pacientes tratados con IFN-a con respuesta prolongada a largo plazo (LTR; seguimiento de 1 a 3,5 años, 3 del tipo 3a y 5 del tipo 1b) se comparó con 9 pacientes que mostraban respuesta no completa al tratamiento (NR, seguimiento 1 a 4 años, 6 del tipo 1b y 3 del tipo 3a). Las proteínas del tipo 1b (vvHCV-39, ver ejemplo 2,5) y 3a E1 (vvHCV.62, ver ejemplo 2,5) se expresaron por medio del sistema del virus vaccinia (ver ejemplos 3 y 4) y se purificaron para lograr la homogeneidad (ejemplo 5). Las muestras derivadas de los pacientes infectados con un virus de la hepatitis C tipo 1b se sometieron a prueba para evaluar la reactividad con proteína E1 tipo 1 b purificada, mientras que la infección tipo 3a se sometió a prueba para evaluar la reactividad de los anticuerpos E1 anti-tipo 3a en un ensayo de ELISA como se describió en el ejemplo 6. Los genotipos de los virus de la hepatitis C que infectan a los diferentes pacientes se determinó por medio del ensayo de genotificación Inno-LiPA (Innogenetics, Zqijndrecht, Bélgica). La Figura 5 muestra las relaciones de señalización a ruido anti-E1 de estos pacientes a los que se realizó un seguimiento durante el curso del tratamiento con interferon y durante el período de seguimiento posterior al tratamiento. Los casos de LTR mostraron en forma consistente una declinación rápida de los niveles anti-E 1 (con negativación completa en 3 casos), mientras que los niveles anti-E1 de los casos NR permanecieron aproximadamente constantes. Algunos de los datos de anti-E 1 obtenidos se muestran en la Tabla 2 como relaciones de SN promedio ± SD (título anti-E1 promedio). El título anti-E1 podría deducirse de la relación de señalización a ruido como se muestra en las Figuras 5, 6, 7 y 8.

Ya al final del tratamiento, se pudieron observar marcadas diferencias entre los 2 grupos. Los títulos de anticuerpo anti-E1 habían disminuido 6,0 veces en LTR pero sólo 1 ,5 veces en NR. AL final del seguimiento, los títulos anti-E1 habían declinado por un factor de 22,5 en los pacientes con respuesta prolongada y aún aumentaron levemente en NR. Por lo tanto, sobre la base de estos datos, la disminución de los niveles de anticuerpo anti-E1 durante el monitoreo del tratamiento con IFN-a se correlaciona con la respuesta prolongada, a largo plazo, al tratamiento. El ensayo anti-E 1 puede ser muy útil para pronóstico de una respuesta a largo plazo del tratamiento con IFN, o al tratamiento de la enfermedad de la hepatitis C en general. Este hallazgo no fue esperado. Por el contrario, todos los inventores habían esperado que los niveles de anticuerpo anti-E1 aumenten durante el curso del tratamiento con IFN en pacientes con respuesta a largo plazo. Como en el caso de la hepatitis B, el virus se depura como consecuencia de la seroconversión de los anticuerpos anti-HBsAG. Además, en muchas otras infecciones virales, el virus se elimina cuando se aumetan los anticuerpos anti-envoltorio. Sin embargo, en los experimentos de la presente invención, los anticuerpos anti-E 1 claramente disminuyeron en pacientes con una respuesta a largo plazo al tratamiento, mientras que el nivel de anticuerpos permaneció aproximadamente igual en pacientes que no respondieron al tratamiento. Aunque el resultado de estos experimentos no fue el esperado, este hallazgo no obvio puede ser muy importante y útil para diagnóstico clínico de infecciones con HCV. Como se muestra en las Figuras 9, 10, 11 y 12, los niveles anti-E2 mostraron un comportamiento muy diferente en los mismos pacientes sometidos a estudio y no se observaron títulos obvios como para los anticuerpos anti-E1. La Figura 35 da una visión general completa del estudio piloto. Como puede deducirse a partir de la Tabla 2, los títulos anti-E1 fueron en promedio por lo menos 2 veces superiores al inicio del tratamiento en pacientes con respuesta a largo plazo, comparado con los pacientes con respuesta incompleta al tratamiento. Por lo tanto, la medición del título de los anticuerpos anti-E1 al inicio del tratamiento, o el monitoreo del paciente durante el curso de la infección y la medición del título anti-E1 , puede convertirse en un marcador útil para diagnóstico clínico de la hepatitis C. Además, el uso de regiones más definidas de las proteínas E1 o E2 puede tornarse deseable, como se muestra en los ejemplos 7.3. 7.2 Análisis de los anticuerpos E1 y E2 en un grupo de pacientes más grande. El estudio piloto condujo a los inventores a concluir que, en el caso en que la infección estuviera totalmente curada, los anticuerpos para las proteínas de envoltura del HCV cambian más rápidamente que los anticuerpos para los antígenos de HCV estudiados en forma más convencional, donde los anticuerpos E1 cambian más vigorosamente. Por lo tanto, incluimos más LTR tipo 1 b e infectados con 3a, y además suplementamos al grupo con series equivalentes de NR, de modo tal que ambos grupos incluyeron 14 pacientes cada uno. Algunos pacientes con respuestas parciales (PR) y pacientes que respondieron con recaída (RR) también se analizaron. La Figura 36 muestra niveles promedio de un anticuerpo E1 (E1Ab) y un anticuerpo E2 (E2Ab) en los grupos de LTR y NR y las Tablas 4 y 5 muestran los análisis estadísticos. En este grupo más grande, los niveles más elevados de anticuerpo E1 antes del tratamiento con IFN-a se asociaron con LTR (P < 0,03). Dado que se observaron niveles mucho más elevados de anticuerpo E1 en los pacientes infectados con el tipo 3a, comparado con los pacientes infectados con el tipo 1b (Figura 37), el genotipo se tomó en cuenta (Tabla 4). Dentro del grpo infectado con el tipo 1 b, LTR también presentó niveles de anticuerpo E1 más elevados que NR en el inicio del tratamiento [P > 0,05]; el número limitado de NR infectados con el tipo 3a no permitió realizar análisis estadístico. De los niveles de anticuerpos monitoreados en LTR durante el período de seguimiento de 1 ,5 años, sólo los anticuerpos E1 se depuraron rápidamente si se compara con los niveles medidos al inicio del tratamiento [P = 0,0058 al final del tratamiento; P = 0,0047 y P = 0,0051 a los 6 y 12 meses posteriores al tratamiento, respectivamente]. Esta depuración permaneció significativa dentro del LTR infectado con el tipo 1 o infectado con el tipo 3 (valores P promedio > 0,05). Estos datos confirmaron el hallazgo inicial de que los niveles de E1Ab disminuyen rápidamente en la fase temprana de resolución. Este rasgo parece ser independiente del genotipo viral. En NR, PR o RR, no se observaron cambios en ninguno de los anticuerpos medidos en la totalidad del período de seguimiento. En los pacientes que respondieron en forma favorable al tratamiento con normalización de los niveles de ALT y fueron negativos a HCV-ARN durante el tratamiento, se observó una marcada diferencia entre las personas que presentaban respuestas prolongadas (LTR) y los que respondieron con una recaída (RR). En contraste a los LTR, los RR no mostraron niveles decrecientes de anticuerpo E1 , lo que indica la presencia de infección de HCV oculta que no podría demostrarse ni por PCR ni por otras técnicas clásicas para la detección de HCV-ARN, ni podrían elevar los niveles de ALT. Las cantidades insignificantes de ARN viral, aún presentes en el grupo de RR durante el tratamiento, parecieron estimular las células B anti-E1. El monitoreo de anti-E1 puede, por lo tanto, ser no solo capaz de discriminar los LTR de los NR, sino también de los RR. 7.3 Monitoreo de los anticuerpos de regiones definidas de la proteína E1 Aunque el método de biología molecular para identificar los aptígenos del HCV produjo un avance sin precedentes en el desarrollo de los diagnósticos virales, el método de selección inmune de las bibliotecas de ?gt11 produjeron en forma predominante epítopes lineales dispersos en el centro y en las retiones no estructurales, y el análisis de las regiones de envoltura tuvo que esperar la clonación y la expresión de la región de E1/E2 en las células de mamíferos. Este método contrasta en forma aguda con muchas otras infecciones virales de las cuales se ha trazado el mapa de los epítopes de las regiones de envoltura mucho antes de descifrar la estructura genómica. Dichos epítopes y los anticuerpos correspondientes con frecuencia poseían actividad neutralizante útil para el desarrollo de vacunas y/o permitían el desarrollo de ensayos de diagnóstico con significado clínico o de pronóstico (por ejemplo, anticuerpos para el antígeno de la superficie de la hepatitis B). Dado que no se encuentran actualmente disponibles vacunas contra el HCV o pruebas que permitan el diagnóstico o pronóstico clínico de la enfermeda de hepatitis C, la caracterización de regiones de envoltura viral expuestas a la supervisión inmune puede contribuir en forma significativa a nuevas direcciones en el diagnóstico y la profilaxis del HCV.

Varios péptidos 20-meros (Tabla 3) que se superponen unos a otros por 8 aminoácidos, fueron sintetizados conforme al método previamente descripto (EP-A-0 489 968) basado en la secuencia HC-J1 (Okamoto et al., 1990). Ninguno de ellos, excepto el péptido env35 (también denominado E1 -35), fue capaz de detectar anticuerpos en suero en aproximadamente 200 casos de HCV. Únicamente 2 sueros presentaron una leve reacción con el péptido env35. De cualquier modo, mediante el anti-E1 ELISA como descripto en el ejemplo 6, fue posible descubrir epítopes adicionales, como sigue: el anti-E1 ELISA como descripto en el ejemplo 6 fue modificado mediante la mezcla de 50 µg/ml de péptido E1 con el suero humano diluido 1/20 en diluyente de muestra. La figura 13 muestra los resultados de la reactividad del suero humano frente a la proteína E1 recombinante (expresada a partir de vvHCV-40), en presencia de péptidos simples o de una mezcla de péptidos E1. Mientras que solamente 2% del suero pudo ser detectado mediante péptidos E1 aplicados sobre tiras en un formato de inmunoensayo de línea, más de la mitad de los anticuerpos anti-E1 contenidos en suero resultaron ser competentes a través de los mismos péptidos, al probarlos sobre la proteína E1 recombinante. Algunos de los anticuerpos monoclonales murinos obtenidos a partir de ratones Balb/C luego de inyectar proteína E1 purificada, fueron luego expuestos a competir por la reactividad frente a E1 con los péptidos imples (figura 14). Claramente, la región de env53 que contenía el epítope predominante, como la suma de epv53 demostró substancial competencia de reacción de varios sueros con E1 , detectándose asimismo anticuerpos de la región env31. Este resultado fue sorpresivo, dado los péptidos env53 y env31 no habían mostrado reactividad alguna al ser aplicados directamente a la fase sólida. Por ello los péptidos fueron sintetizados usando la tecnología descripta en la solicitud previa (en WO 93/18054). Se sintetizaron los siguientes péptidos: Péptido env35 A-biotina NH2-SNSSEAADMIMHTPGCV-Gkbiotina (SEC ID NO 51) Que abarca los aminoácidos 208 a 227 de la poliproteína HCV en región E1 Péptido env53-biotina ('epítope A') Biotin-GG-ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL-COOH (SEC ID NO 52) Que abarca los aminoácidos 313 a 332 de la poliproteína HCV en región E1 Péptido 1 bE1 ('epítope B') H2N-YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK-biotina (SEC ID NO 53) Que abarca los aminoácidos 192 a 228 de la poliproteína HCV en región E1 y se compararon con la reactividad de los péptidos E1a-BB (biotin-GG-TPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL, SEC ID NO 54) y E1 b-BB (biotin-GG-TPTLAA RDASVPPTTTIRRHVDLL, SEC ID NO 55) que fueron derivados de la misma región de secuencias de genotipo 1 a y 1 b respectivamente y que fueron descriptos en el IX Encuentro Internacional de Virología en Glasgow, 1993 (epítope C). Se estudió la reactividad de un panel de sueros del HCV sobre epítopes A, B y C, comparando también el epítope B con env35A (de 47 sueros HCV positivos, 8 fueron positivos en el epítope B y ninguno mostró reacción con env35 A). La reactividad contra epítopes A, B y C se verificó directamente con los péptidos biotinilados (50 µg/ml) ligados a placas cubiertas con estreptavidina como descripto en el ejemplo 6. Claramente los epítopes A y B fueron más reactivos, mientras que los epítopes C y env35 A-biotina demostraron una reacción mucho menor. Las mismas series de pacientes que fueron monitoreados respecto de su reactividad contra la proteína E1 completa (ejemplo 7.1.) fue estudiada respecto de la reactividad contra epítopes A, B y C. Se observó poca reacción frente al epítope C, mientras que como se muestra en las figuras 15, 16, 17, y 18, los epítopes A y B reaccionaron con la mayoría de los sueros. De todos modos, los anticuerpos del epítope más reactivo (epítope A) no parecieron producir una remisión de la enfermedad, mientras que los anticuerpos anti-1 bE1 (epitope B) estaban presentes prácticamente en forma exclusiva en pacientes con respuesta a largo plazo al comienzo del tratamiento con IFN. Por ello, los anticuerpos anti-1 bE1 (epítope B) y anti-env53 (epítope A) demostraron ser marcadores útiles para pronosticar la enfermedad de la hepatitis C. El epítope env53 puede usarse ventajosamente para la detección de anticuerpos de reacción cruzada (anticuerpos que reaccionan de modo cruzado entre genotipos importantes) y los anticuerpos de la región env53 pueden ser de mucha utilidad para la detección del antígeno de E1 universal en suero o en tejido de hígado. Los anticuerpos monoclonales que reconocieron la región env53 fueron llevados a reaccionar con una librería al azar de epítopes. En 4 clones que reaccionaron en la inmunodetección con el anticuerpo monoclonal 5E1 A10, estuvo presente la secuencia -GWD-. Debido a su analogía con la secuencia universal de HCV presente en todas las variantes de HCV en la región env53, se supone que la secuencia AWD contiene la secuencia esencial del epítope murino env53 de rección cruzada. Claramente el env31 también contiene una región variable que puede contener un epítope en la secuencia terminal amino - YQVRNSTGL- (SEC ID NO 93) y puede resultar útil para el diagnóstico. Env31 o E1-31 como se muestra en la tabla 3, es parte del péptido 1 bE1. Los péptidos E1-33 y E1-51 también reaccionan en alguna extensión con los anticuerpos murinos, y el péptido E1-55 (que contiene la región variable 6 (V6); las posiciones de aminoácido que abarcan de la 329-336) reaccionan asimismo con algunos de los sueros del paciente. Los anticuerpos anti-E2 claramente obedecen un patrón diferente a los anticuerpos anti.EI , especialmente en pacientes que presentan una respuesta a largo plazo frente al tratamiento. Por ello, es claro que la disminución en anticuerpos antienvolventes no puede ser medida de modo tan eficiente con un ensayo que emplea una proteína E1/E2 recombinante como con una proteina anti-E 1 o anti-E2 simple. La respuesta anti-E2 obviamente afectaría la respuesta anti-E1 en un ensayo para la medición simultánea de ambos tipos de anticuerpos. Por ello, resultó ser de utilidad el poder verificar anticuerpos anti-envolventes en las proteínas E1 y E2 simples. 7.4 Mapeo de anticuerpos anti-E2 De los 24 Acm anti-E2 sólo tres fueron competentes para la reactividad con E2 recombinante mediante péptidos, dos de los cuales reaccionaron con la región HVRI (péptidos E2-67 y E2-69, denominados como epítope A) y uno que reconoció un epítope, fue competente con el péptido E2-13B (epítope C). La mayoría de los anticuerpos murinos reconocieron epítopes anti-E2 conformacionales (Figura 19). También pudo observarse con frecuencia una respuesta humana al HVRI (epítope A), y a un menos extendido HVRII (epítope B) y una tercera región epitópica lineal (competentes para péptidos E2-23, E2-25 o E2-27, designado epítope E) y a una cuarta región epitópica linear (competente para el péptido E2-17B, epítope D), pero en la mayoría de los sueros se produjo la reacción con epítopes conformacionales (figura 20). Estos epítopes conformacionales pueden agruparse conforme a sus posiciones relativas, como sigue: los anticuerpos IgG en el sobrenadante de los hibridomas 15C8C1 , 12D11 F1 , 9G3E6, 8G10D1 H9, 10D3C4, 4H6B2, 17F2C2, 5H6A7, 15B7A2 reconociendo epítopes conformacionales fueron purificado por medio de cromatografía de afinidad con proteína A y 1 mg/ml de los IgG's resultantes fueron biotinilados en buffer de borato en presencia de biotina. Se separaron los anticuerpos biotinilados de la biotina libre por medio de cromatografía de filtrado con gel. Se diluyó el conjunto de fracciones de anticuerpo biotinilados de 100 a 10.000 veces. Se detectó la proteína E2 ligada a la fase sólida mediante el IgG biotinilado en la presencia de 100 veces la cantidad de anticuerpo competente no biotinilado y subsecuentemente detectado por medio de estreptavidina marcada con fosfatasa alcalina. Los porcentajes de competencia se enuncian en la tabla 6. Basándose en esos resultados, pudieron delinearse 4 regiones de epítope anti-E2 conformacionales (epítopes F, G, H e I) (Figura 38). Alternativamente esos Acm pueden reconocer epítopes lineales mutantes no representados por los péptidos utilizados en este estudio. La reactividad de los Acm 4H6B2 y 10D3C4 competente de 16 A6E7, pero distinto a 16 A6E7, no reconoció el péptido E2-13B. Estos Acm pueden reconocer variantes del mismo epítope linear (epítope C) o reconoce un epítope conformacional que es postergado en forma estérica o cambia la conformación luego del ligado de 16 A6E7 a la región E2-13B (epítope H). Ejemplo 8: mutantes de glucosilación de E1 8.1. Introducción La proteína E1 codificada por vvHCVI O A y la proteína E2 codificada por vvHCV41 a 44 expresada de células de mamífero que contienen 6 a 11 mitades de carbohidratos respectivamente. Esto pudo mostrarse a través de la incubación de los lisatos de células RK13 infectadas con vvHCVIO A o vvHCV44 con concentraciones decrecientes de glucosidasas (PNGase F o endoglucosidasas H, (Boehringer Mannheim Biochemica) conforme a las instrucciones del fabricante), de modo tal que las proteínas en el lisato (incluyendo E1 ) son parcialmente deglucosiladas (Fig. 39 y 40, respectivamente). Los mutantes desprovistos de varios de sus sitios de glucosilación pueden permitir la selección de proteínas envolventes con mayor reactividad inmunológica. Para VIH, por ejemplo, las proteínas gp120 carentes de determinados motivos seleccionados de adición de azúcar, fueron encontrados particularmente útiles a los fines de diagnóstico o vacuna. El agregado de una nueva cadena lateral de oligosacáridos a la proteína hemaglutinina de un mutante de escape del A/Hong Kong/3/68 (H3N2) virus de influenza previene la reactividad con un anticuerpo monoclonal neutralizante (Skehel et al., 1984). Al introducir novedosos sitios de glucosilación en la proteína hemaglutinina de influenza mediante la mutagénesis específica de sitio, se observaron dramáticos cambios antigénicos, sugiriendo que los carbohidratos sirven como un modulador de la antigenicidad (Gallagher et al., 1988). En otro análisis, se eliminaron los 8 motivos de adición de carbohidratos de la proteína de superficie gp70 del Friend Murine Leukemia Virus. Aunque siete de la mutaciones no afectaron la infectividad del virus, la mutación de la cuarta señal de glucosilación con respecto al teminal amino resultaron en un fenotipo no infeccioso (Kayman et al., 1991 ). Además, se conoce en el arte que el agregado de cadenas de carbohidratos N-ligadas es importante para la estabilización del plegado intermedio y así para el plegado eficiente, previniendo el malplegado y la degradación en el retículo endoplasmático, la oligomerización, la actividad biológica y el transporte de glucoproteínas (ver informes de Rose et al, 1988; Dorns et al, 1993; Helenius, 1994). Luego del alineado de las diferentes secuencias de proteínas envolventes de genotipos HCV, puede inferirse que no se requieren todos los 6 sitios de glucosilación en el subtipo 1 b E1 de HCV para un adecuado plegado y reactividad, ya que algunos no existen en determinados (sub)tipos. Los cuatro motivos de carbohidratos (en Asn251 ), presentes en los tipos 1 b, 6 a, 7, 8 y 9 no se encuentra en todos los demás tipo conocidos actualmente. Este motivo de adición de azúcar puede ser mutado para producir una proteína tipo 1 b E1 que aumenta la reactividad. Asimismo las secuencias del tipo 2b muestran un sitio de glusilación extra en la región V5 (en Asn299). El S83 aislado perteneciente al genotipo 2c, hasta carece del primer motivo de carbohidrato en la región V 1 (en Asn), mientras que se entran en todos los demás aislados (Stuyver et al, 1994). De todos modos, hasta entre los motivos de adición de azúcar complemente conservados, puede no requeririse la presencia del carbohidrato para el plegado, pero puede desempeñar un rol en la evasión de la supervisión inmune. Por ello, no resulta obvio la identificación de los motivos de adición de carbohidratos que no son requeridos para el plegado (y la reactividad) adecuado, y cada mutante debe ser analizado y estudiado respecto de su reactividad. La mutagénesis de un motivo de glucosilación (secuencias NXS o NXT) pueden ser llevadas a cabo por mutación de los codones para N, S ó T, de modo tal que esos codones codifican aminoácidos diferentes de N en el caso de N y/o aminoácidos diferentes de S ó T en el caso de T. alternativamente la posición X puede mutarse en P, ya que se conoce que NPS o NPT no son frecuentemente modificados con carbohidratos. Luego de establecer cuáles motivos de adición de carbohidratos son necesarios para el plegado y/o la reactividad y cuáles no, pueden realizarse las combinaciones de tales mutaciones. 8.2. Mutagénesis de la proteína E1 Todas las mutaciones fueron realizadas en la secuencia E1 del clon HCCI 10 A (SEC ID NO.5). La primera ronda de PCR se llevó a cabo usando un cebador con sentido 'GPT' (ver Tabla 7) tomando como blanco la secuencia GPT ubicado corriente arriba del promotor tardío 11 K de la vacuna, y un cebador antisentido (denominado GLY#, representando # la cantidad de sitios de glucosilación, ver Fig 41 ) que contiene el deseado cambio básico para obtener la mutagénesis. Los seis cebadores GLY# (cada uno específico para un sitio de glucosilación dado) se denominan tal como: modificación del codón que codifica por el Asn N-glusilado (AAC o AAT) a un codón Gln (CAA o CAG). Se optó por la glutamina dada su similitud con la asparagina (ambos aminoácidos son neutrales y contienen residuos no polares, la glutamina presenta una cadena lateral de mayor longitud (un grupo -CH2- adicional)).

La introducción de mutaciones silenciosas en uno o varios de los codones corriente abajo del sitio de glucosilación, a fin de crear un nuevo único o raro (p. ej. un segundo sitio Smal para E1 Gly5) sitio enzimático de restricción. Sin modificar la secuencia de aminoácido, esta mutación proveerá un modo de distinguir las secuencias mutadas de las secuencias E1 originales (pvHCV-10 A) o de cualquier otra (Figura 41 ). Este sitio de restricción adicional también puede ser útil para la construcción de nuevos mutantes híbridos (dobles, triples, etc.) de glucosilación. 18 nucleótidos se extienden 5' del primer nucleótido no coincidente y 12 a 16 nucleótidos se extienden hasta el extremo 3'. La tabla 7 describe las secuencias de los seis cebadores GLY# que se superponen a la secuencia de sitios de glucosilación N-ligados. Para la mutagénesis dirigida a un sitio, se utilizó el 'mispriming' o 'extensión superpuesta' (Horton, 1993). El concepto se ilustra en las figuras 42 y 43. En primer lugar se amplifican dos fragmentos separados del gen objetivo para cada sitio mutado. El producto PCR obtenido del extremo 5' (producto GLY#) se amplifica con el cebador GPT con sentido 5' (ver Tabla 7) y con los respectivos cebadores GLY# antisentido 3'. El segundo fragmento (producto OVR#) se amplifica con el cebador TKR antisentido 3' y los respectivos cebadores con sentido 5' (cebadores OVR#, ver tabla 7, figura 43). Los cebadores OVR# toman como objetivo parte del secuencia del cebador GLY#. Por ello, los dos grupos de productos PCR comparten una región de superposición de secuencia idéntica. Cuando estos productos intermedios son mezclados (GLY-1 con OVR-1. GLY-2 con OVR-2, etc.) se fusionan a alta temperatura y se retemplan, la primer hebra con sentido del producto GLY# puede templarse a la hebra antisentido del producto OVR# ( y viceversa) de modo tal que las dos hebras actúan como cebadores una de otra (ver Fig. 42. B). La extensión de la superposición templada crea mediante la polimerasa Taq durante los dos ciclos de PCR la molécula mutante E1 Gly# de longitud total, que vehiculiza la mutación destruyendo el sitio de glucosilación número #. Se genera suficientes cantidades de productos E1 GLY# para el clonado en un tercer PCR por medio de un juego usual de dos cebadores ubicados internamente. Estos dos nuevos cebadores superponen respectivamente el extremo 3' del promotor 11 K de la vacuna (cebador GPT-2 con sentido) y el extremo 5' de la locación de cinasa de timidina de la vacuna (cebador TKR-2 antisentido, ver tabla 7). Todas las condiciones PCR son cumplidas como descripto en Suyver et al. (1993). Cada uno de estos productos PCR fue clonado mediante la ruptura de EcoRI/BamHI en el vector de vacuna de corte EcoRI/BamHI que contiene la secuencia E1 original (pvHCV-10 A). Los clones seleccionados fueron analizados respecto de su longitud de inserción por medio de la ruptura de EcoRI/BamH I y respecto de la presencia de cada nuevo sitio de restricción. Las secuencias que superponen a los sitios mutados fueron confirmadas mediante el secuenciado de doble hebra. 8.3 Análisis de los mutantes de glicosilación de E1 Iniciando a partir de los 6 plásmidos que contienen las secuencias E1 mutantes, como se describió en el ejemplo 8.2, se generaron virus vaccinia recombinantes por recombinación con el virus vaccinia wt como se describió en el ejemplo 2.5. En síntesis, se infectaron frascos de 175 cm2 de células RK13 sub-confluentes con 6 virus vaccinia recombinantes que transportan las secuencias E1 mutantes, como también con el wHCV-10A (que transporta la secuencia E1 no mutada) y virus vaccinia wt. Se usaron las células luego de 24 horas de infección y se las analizó en Western blot como se describió en el ejemplo 4 (ver Figura 44A). Todos los mutantes mostraron una movilidad más rápida (correspondiente a un peso molecular más pequeño de aproximadamente 2 a 3 kDa) en SDS-PAGE que la proteína E1 original; lo que confirma que no se agregó un grupo funcional de carbohidrato. También se analizaron los virus recombinantes por PCR y análisis de la enzima de restricción para confirmar la identidad de los diferentes mutantes. La Figura 44B muestra que todos los mutantes (como se observa en la Figura 41 ) contenían los sitios de restricción adicionales esperados. Otra parte del lisato celular se utilizó para evaluar la reactividad del mutante diferente por medio del análisis de ELISA. Los lisatos se diluyeron 20 veces y se agregaron a placas con micro-receptáculos recubiertas con la GNA lectina como se describe en el ejemplo 6. Las glicoproteínas E1 capturadas (mutantes) se dejaron reaccionar con suero diluido 20 veces de pacientes infectados con HCV como se describió en el ejemplo 6. La señal de los valores de ruido (S/N) (OD de GLY#/OD de wt) para los seis mutantes y E1 se muestran en la Tabla 8. La tabla muestra, además, las relaciones entre los valores S/N de las proteínas GLY# y E1. Se debe comprender que el método de usar los lisatos celulares de los diferentes mutantes para comparación de la reactividad con suero de un paciente puede producir observaciones que son la consecuencia de los diferentes niveles de expresión en lugar de los niveles de reactividad. Dichas dificultades pueden superarse por medio de la purificación de los diferentes mutantes como se describe en el ejemplo 5, y al someter a prueba cantidades idénticas de las diferentes proteínas E1. Sin embargo, los resultados que se muestran en la Tabla 5 ya indican que la eliminación del 1o (GLY1 ), 3o (GLY3) y 6o (GLY6) motivos de glicosilación reducen la reactividad de ciertos sueros, mientras que la eliminación del 2° y el 5o sitio no lo hacen. La eliminación de GLY4 parece mejorar la reactividad de ciertos sueros. Estos datos indican que los diferentes pacientes reaccionan en forma distinta a los mutantes de glicosilación de la presente invención. Así, dichas proteínas E1 mutantes pueden resultar útiles para el diagnóstico (selección, confirmación, pronóstico, etc.) y prevención de la enfermedad del HCV. Ejemplo 9: Expresión de la proteína E2 del HCV en las levaduras con deficiencia de glicosilación A la secuencia de E2 correspondiente al clon HCCL41 se le suministró la secuencia de señalización pre/pro con factor de equivalencia a, insertada en un vector de expresión de la levadura y células de S. cerevisiae transformadas con la proteína E2 secretada en esta construcción en medio de cultivo. Se observó que la mayoría de los sitios de glicosilación se modificaron con glicosilaciones del tipo de alto contenido de mañosa luego de la expresión de dicha construcción en las cepas de S. cerevisiae (Figura 45). Esto produjo un nivel demasiado elevado de heterogeneidad y la formación de un escudo de reactividad, que no es deseable ya para fines de diagnóstico o de vacunas. Para superar este problema, se generaron mutantes de S. cerevisiae con vías de glicosilación modificada por medio de la selección de clones resistente al vanadato. Dichos clones se analizaron para evaluar las vías de glicosilación modificada por medio del análisis del peso molecular y la heterogeneidad de la glicoproteína ¡nvertasa. Esto nos permitió identificar los diferentes mutantes de S. cerevisiae con deficiencia de glicosilación. Posteriormente se expresó la proteína E2 en algunos de los mutantes seleccionados y se dejó que reaccionen con un anticuerpo monoclonal como se describió en el ejemplo 7, en un Western blot como se describió en el ejemplo 4 (Figura 46). Ejemplo 10. Utilidad General Los resultados de la invención muestran que se requiere no solo un buen sistema de expresión sino también un buen protocolo de purificación para alcanzar una elevada reactividad de las proteínas de envoltura del HCV con suero de un paciente humano. Esto puede obtenerse con el uso del sistema apropiado de expresión de la proteína de envoltura del HCV y/o los protocolos de purificación de la presente invención, que garantizan la eliminación de proteínas contaminantes y que preservan la conformación, y así la reactividad de las proteínas de envoltura del HCV. Las cantidades de proteína de envoltura del HCV necesarias para los ensayos de selección de diagnóstico se encuentran en el rango de gramos por año. Para fines de vacunas, aún se necesitarían cantidades más elevadas de proteína de envoltura. Por lo tanto, el sistema del virus vaccinia puede utilizarse para seleccionar las mejores construcciones de expresión y para elevación limitada, y la expresión a gran escala y purificación de las proteínas de envoltura oligoméricas simples o específicas que contienen carbohidratos con alto contenido de mañosa pueden lograrse cuando se expresan a partir de varias cepas de levadura. En el caso de la hepatitis B, por ejemplo, la fabricación de HBsAg de células de mamíferos fue mucho más costosa, comparada con las vacunas contra la hepatitis B derivadas de la levadura. El método de purificación descrito en la presente invención puede utilizarse, además, para las "proteínas de envoltura virales" en general. Algunos ejemplos son aquellas derivadas de los Flavivirus, los virus de la Hepatitis GB-A, GB-B Y GB-C descubiertos recientemente, Pestivirus (como Virus de Diarrea viral Bovina (BVDV), Virus del Cólera del Cerdo (HCV), Virus de la Enfermedad de Border (BDV)), aunque también virus menos relacionados como el Virus de la Hepatitis B (principalmente para la purificación de HBsAg). El método de purificación de la proteína de envoltura de la presente invención puede utilizarse para las proteínas expresadas en forma intracelular como extracelular en células eucarióticas inferiores o superiores, o en los procariotos como se establece en la sección de descripción detallada. Ejemplo 11. Demostración de la Utilidad Profiláctica y Terapéutica La enfermedad hepática en chimpancés crónicamente infectados con HCV puede ser reducida con la inmunización con E1. No obstante, se requirieron múltiples inmunizaciones para producir una respuesta inmunológica significativa. Una persona con las aptitudes ordinarias podrá apreciar que la persistencia viral es producida con la modulación ¡nmunológica, que es orquestada por el virus mismo o por el huésped. Con el fin de analizar si existe tal modulación inmune en el HCV, se compararon las respuestas inmunológicas contra E1 y NS3 en chimpancés vírgenes de infección o crónicamente infectados. Debido a que se anticipaba una respuesta menor en los animales infectados crónicamente, este grupo fue seleccionado para un esquema de inmunización más riguroso, incluyendo lo siguiente: uso de un adyuvante de mayor potencia para inducir respuestas celulares demostrada en ratones (Tabla 9) en comparación con alumbre, que fue el adyuvante utilizado para los animales vírgenes de infección; el esquema de inmunización para los animales con infección crónica consistió en 12 inmunizaciones en comparación con 6 para los restantes (Fig. 47). Aunque el número de animales inmunizados no permite el análisis estadístico, es posible detectar la siguiente tendencia clara en las respuestas humorales (Tabla 10); el número de inmunizaciones para la seroconversión es menor en los animales vírgenes de infección y la magnitud de la respuesta inmunológica es sustancialmente mayor en los animales vírgenes de tratamiento, 2/3 de los animales infectados no alcanzaron el nivel de 10 unidades internas, aun después de 12 inmunizaciones. El análisis de las respuestas celulares, después de tres inmunizaciones, revela una diferencia aún mayor (Fig. 48a-d), incluyendo lo siguiente: la proliferación de células T específicas para E1 está casi ausente en los animales crónicamente infectados, mientras que en los animales vírgenes de infección puede observarse una estimulación clara; las mediciones de IL-2 confirmaron la baja estimulación del compartimiento de células T en portadores crónicos y se induce una clara respuesta Th2 (IL-4) en animales vírgenes de infección, como se esperaba para una vacuna que contiene un adyuvante de alumbre. Esto confirma que al menos la inmunización con E1 produce un efecto profiláctico en los animales vírgenes de infección y sugiere que las proteínas y/ o péptidos de E2 y/ o combinaciones de E1/ E2 pueden proporcionar beneficios terapéuticos o profilácticos útiles en animales vírgenes de infección.

La "alteración" para inducir respuestas celulares y humorales contra un antígeno de E1 de HCV sólo puede ser contrarrestada parcialmente por múltiples inmunizaciones, como se demuestra por los siguientes resultados: se observó aumento del título de anticuerpos después de cada inyección pero no se alcanzaron niveles similares a los de los animales vírgenes de tratamiento en 2/3 de los animales y las respuestas proliferativas de células T se mantienen en niveles muy bajos (Fig. 49). No obstante, los resultados de ELISPOT demuestran un incremento menor en IL-2 (no presentado), ausencia de cambios en IFN-g (no presentado) y aumento de IL-4 (Fig. 49), lo que indica que las respuestas tipo Th2 son inducidas más fácilmente. Se observó que IL-4 se mantenía en un nivel bajo en comparación con el nivel alcanzado después de tres inmunizaciones en animales vírgenes de infección. Se realizó una observación similar para las inmunizaciones con NS3, en las que se utilizó un adyuvante aún más potente (RIBI) en los chimpancés infectados crónicamente. En comparación con una formulación de alumbre en animales vírgenes se observó lo siguiente: los títulos de anticuerpos inducidos son comparables en ambos grupos (no presentado); la secreción de citoquina y la proliferación de células T están prácticamente ausentes en los animales infectados crónicamente en comparación con las respuestas de los animales vírgenes de infección (Fig. 49a-b). Actualmente se obtuvieron algunos indicios que respuestas ¡nmunológicas contra HCV bajas o al menos insuficientes para permitir la eliminación de la infección en los portadores crónicos. Los resultados anteriores apoyan la hipótesis que postula que el sistema inmunológico de los portadores crónicos de HCV puede estar alterado y que no responden a los antígenos de HCV tan eficientemente como en la situación observada en los animales vírgenes de infección. En un estudio de Wiedmann et al. (Hepatology 2000; 31 :230-234), la vacunación contra HBV fue menos efectiva en portadores crónicos de HCV, lo que indica que tal alteración inmune no se limita a los antígenos de HCV. De María et al. (Hepatology 2000; 32:444-445) confirmaron estos datos y propusieron regímenes de administración de la vacuna adaptados para pacientes infectados con HCV. Los datos presentados aquí indican que el aumento del número de inmunizaciones puede, ciertamente, aumentan las respuestas humorales pero que las respuestas celulares (en especial Th1 ) son difíciles de inducir, aun cuando se utilicen adyuvantes potentes. Puede ser ventajoso iniciar la inmunización simultáneamente con el tratamiento antiviral, cuando el sistema inmunológico tiene más propensión a responder.

Tabla 1 : Plásmidos de vacuna recombinantes y virus nt: nucleótido aa: aminoácido Kl: T4 de relleno Pol del ADN Klenow: relleno Pol del ADN T4 Posición: posición del aminoácido en la secuencia de poliproteína de HCV Tabla 1 - continuación: Plásmidos de vacuna recombinantes y virus nt: nucleótido aa: aminoácido Kl: T4 de relleno Pol del ADN Klenow: relleno Pol del ADN T4 Posición: posición del aminoácido en la secuencia de poliproteína de HCV Tabla 2: Resumen de las pruebas anti-E1 S/N ± SD (título anti-E1 promedio) LTR: A largo plazo, respuesta prolongada durante más de 1 año. NR: Sin respuesta, respuesta con recaída, o respuesta parcial Tabla 3 Péptidos sintéticos para estudios de competencia PROTEÍNA PÉPTIDO SEC. DE AMINOÁCIDO POSICIÓN SEC ID NO E1 E1-31 LLSCLTVPASAYQVRNSTGL 181 -200 56 E1-33 QVRNSTGLYHVTNDCPNSSI 193-212 57 E1-35 NDCPNSSIVYEAHDAILHTP 205-224 58 E1-35A SNSSIVYEAADMIMHTPGCV 208-227 59 E1-37 HDAILHTPGCVPCVREGNVS 217-236 60 E1-39 CVREGNVSRCWVAMTPTVAT 229-248 61 E1 -41 AMTPTVATRDGKLPATQLRR 241 -260 62 E1-43 LPATQLRRHIDLLVGSATLC 253-272 63 E1-45 LVGSATLCSALYVGDLCGSV 265-284 64 E1-49 QLFTFSPRRHWTTQGCNCSI 289-308 65 E1-51 TQGCNCSIYPGHITGHRMAW 301 -320 66 E1-53 ITGHRMAWDMMMNWSPTAAL 313-332 67 E1-55 NWSPTAALVMAQLLRIPQAI 325-344 68 E1 -57 LLRIPQAILDMIAGAHWGVL 337-356 69 E1 -59 AGAHWGVLAGIAYFSMVGNM 349-368 70 E1-63 WLLLFAGVDAETIVSGGQA 373-392 71 E2-67 SGLVSLFTPGAKQNIQLINT 397-416 72 E2-69 QNIQLINTNGSWHINSTALN 409-428 73 E2-$3B LNCNESLNTGWWLAGLIYQHK 427-446 74 E2-$1 B AGLIYQHKFNSSGCPERLAS 439-458 75 E2-1 B GCPERLASCRPLTDFDQGWG 451 -470 76 E2-3B TDFDQGWGPISYANGSGPDQ 463-482 77 E2-5B ANGSGPDQRPYCWHYPPKPC 475-494 78 E2-7B WHYPPKPCGIVPAKSVCGPV 487-506 79 E2-9B AKSVCGPVYCFTPSPWVGT 499-518 80 E2-11 B PSPVWGTTDRSGAPTYSWG 511-530 81 E2-13B GAPTYSWGENDTDVFVLNNT 523-542 82 E2-17B GNWFGCTWMNSTGFTKVCGA 547-566 83 E2-19B GFTKVCGAPPVCIGGAGNNT 559-578 84 E2-21 IGGAGNNTLHCPTDCFRKHP 571-590 85 E2-23 TDCFRKHPDATYSRCGSGPW 583-602 86 E2-25 SRCGSGPWITPRCLVDYPYR 595-614 87 E2-27 CLVDYPYRLWHYPCTINYTI 607-626 88 E2-29 PCTINYTIFKIRMYVGGVEH 619-638 89 E2-31 MYVGGVEHRLEAACNWTPGE 631-650 90 E2-33 ACNWTPGERCDLEDRDRSEL 643-662 91 E2-35 EDRDRSELSPLLLTTTQWQV 655-674 92 Tabla 4. Cambio de los niveles de anticuerpos de envoltura (estudio completo, 28 pacientes) Prueba de ElAb NR ElAb NR ElAb NR ElAb LTR E1Ab LTR E1Ab LTR E2Ab NR ElAb LTR Tipo 3a All Wilcoxon All Tipo 1 b Tipo 3a Tipo 1 b Signed Rank Fin de la 0,1167 0,2604 0,285 0,0058 0,043 0,0499 0,0186 0,0640 terapia * Seguimiento 0,86 0,7213 0,5930 0.0047 0,043 0.063 0,04326 0,0464 de 6 meses* Seguimiento 0,7989 0,3105 0,0051 0,0679 0,0277 0,0869 0,0058 de 12 meses* * Los datos se compararon con los valores que se obtuvieron al inicio de la terapia * Valores P <0,5.

Tabla 5. Diferencia entre LTR y NR (estudio completo) * Valores P <0,05 Tabla 6. Experimentos de competición entre anticuerpos monoclonales E2 de murino Reducción (%) de reactividad anti-E2 de mabs anti-E2 biotinilados ND, no realizado Tabla 7. Cebadores SEC ID NO. 110 GPT-2 5'-TTCTATCGATTAAATAGAATTC -3' SEC ID NO. 111 TKR-2 5'-GCCATACGCTCACAGCCGATCCC-3' Los nucleotidos subrayados representan el sitio de restricción adicional Los nucleotidos ennegrita representan las mutaciones en relación con la secuencia HCCI10A original Tabla 8 Análisis de mutantes de glicosilación E1 mediante ELISA suero 1 2 3 4 5 ß 7 0 9 10 t t 12 SM OLY 1 1 802402 2.120971 1 03871 1 205597 2.120191 2 BG6913 1.950345 1 80018.1 1 730101 2 488162 1 220654 1 629403 SN Ot V2 2 400795 1.76818 2 326485 2.839308 2 450019 5 043983 2 148302 1 S90477 1 008973 2 482212 1 467562 2 070524 SN OLY3 1 042718 1.715477 2 261040 2.354748 I 501B1T 4 833742 1 90092 1.482099 1 002222 2 101558 1 404210 1 72110 SN GLY 4 2 570154 3 824038 3 874805 1 499387 3 15 4 71302 4 19B751 3 959542 3.7 10507 5 170841 4 2GO704 3 955153 SN Gl.YS 2 482051 1.793781 2.409344 2.627358 1.71531 1 4 984785 2 13912 1 070336 1 708937 3 021807 1 582002 2 07278 SN OLYß 2 031407 1 495737 2 131613 2 5Z7925 2.494833 4 704027 2 02069 1 496400 1 704970 2 677757 1 529008 744221 SN E1 2 828205 2 227030 2 512792 2.790881 3.131679 4 869128 2.287753 1.95 198 1 805556 2 616822 1 55719 2 593886 suma | promedio 13 14 15 16 17 10 19 20 21 22 23 24 S/N 5/N SN GIY1 5 686561 3 233604 3 7T3498 1 985105 2.317721 6 875179 1 93470 2 47171 4 378033 1 188748 2 168 BBO 1 70T992 59 88534 2 490223 SN GLY2 7.556682 2 587613 3021928 3.055649 2.933792 7.05433 2.127712 2.921208 4 860101 1 150781 1 661914 t 032705 6965243 2 902105 ¡SN GtY3 7 930536 2.783055 3 010099 2 045028 2 615305 5 775357 1 980185 2 557384 4.20B033 0 97707 1 3367 6 1 20.170 62 09872 2 507-147 SN GIY< ß. 176916 ß 5B1 122 5 7076T8 5.884498 5 6D4B13 8 4125 3 013321 3 002535 4 29303T 2 393011 3 087 13- 2 481585 102 6978 4 27907G ¡SN GLY5 ß B8340T 2.940334 12S50I 3.338912 2.654224 5.424107 2 442004 3 126761 4 64557 1 1536ST 1 61 /901 1.038211 69 2651 1 2 806040 ,SN G YG 8 005501 2.499952 Z GZ 1704 2 672389 2 363301 6.104107 1 500716 2.665433 2 701003 1 280743 1 475062 1 1G423 61 32181 2 555075 'S E1 8 825112 3.183771 3 067286 3.2T0335 2.900354 7.191804 2.771210 3 678088 5 35443 1 167286 2.083333 1 78252 76 54008 3 109195 suero 1 2 3 A 5 6 7 8 9 10 1 1 12 GLYI/E1 0 037316 0 952374 0.55869 0.431977 0 877036 0.688794 0.852516 0 954001 0 958261 0 94319 0.783882 O T2B I71 GLY2/E1 0.648070 0.793901 0 925463 0 94569 0.765233 1.035913 0 93817 0.816436 0 935431 0 94850 0 942455 0 796232 GLY3/E1 0.S80T34 0 770298 0 900053 0 84373 0 508312 0 992733 0659781 0.768418 0 887365 0037488 0.94D294 O GG35 GLY4fEt 0.911587 1 717097 1 541952 0 537245 1.005882 0.967939 1 635317 2 026172 2 05505 1.976 2 72978 i 524798 GLY5/E1 0.877007 0 805447 0.958831 0.941408 0.647740 1.019642 0 935031 0 806641 0 048488 1 154762 1 0031-18 0 799102 GIY6/HI 0.71 B296 0.6 1628 0 848305 0 90578 0.796669 0 9B2622 0883264 0.765781 0 9442B4 1 023200 0 082280 0 672435 suma promedio 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 E1/GLY* E 1/GLY* GLY17E1 0 644248 015652 1.226988 0 605153 0 777606 0 020144 0.T98102 0.072013 O.B 17759 1 018360 1 03G2G7 0.957626 19.36524 0 8OS0B5 GLY2/E1 0 85T2 0.800469 1 180833 0931505 0 904377 1.064289 076779 0 794245 0 874061 0 985B6 0 797719 0 915998 21 67384 0 903077 ULY?E1 0 098033 0.807056 0 983319 D 097966 0 843962 0 803029 0 714554 0 695300 0 797215 0 037556 0 641052 0675314 19 19921 0 7999R GLY4/E1 » 97654 2 0CO8O2 1 860833 1.732902 1.880587 0 89102 1 376045 0 B1G335 0 801773 2 050U04 1 767422 1 3921 8 36 38592 1 51G00 GLY5/E1 1 006606 0 92353S 1 019O0T 1 017857 0.890574 0 75419 0 881491 0.850109 0 867612 0 908323 0 872593 0 919042 21 7DG79 0 907703 GLY6? 1 0 907134 0 785217 0 854737 0.784184 0 79296 0 72221 0.643702 0 724683 0 519396 1 097197 0 U0U3 0 962919 19 59691 0 8 1653 1 Tabla 9: Perfil de E1 adyuvado en ratones Balb/c = luego de tres inmunizaciones s.c. / i.m., se analizaron individualmente 3 ratones seleccionados al azar, y el resultado se expresa como el cpm específico promedio obtenido luego de 4 días de estimulación de E1 (1 µg/ml); el número entre paréntesis se refiere a la cantidad de ratones con estimulación específica por sobre el fondo. 2 = luego de una única inmunización intra sendero (n=2), el resultado se expresa como el cpm específico promedio obtenido luego de 5 días de estimulación de E1 (1 µg/ml). Tabla 10: Respuestas humorales: Cantidad de inmunizaciones requeridas para diferentes niveles de anticuerpos E-1 antes de la inmunización; en los otros casos la observación de un título superior a los 3 puntos temporales individuales de los títulos pre-inmunización, fue considerada como el punto de seroconversión. 2 = la unidad se define de la siguiente manera: el nivel de anticuerpos E1 en portadores humanos crónicos antes de la terapia con interferones e infectados con genotipo 1b es < 0,1 U/ml para 50% de los pacientes, entre 0,1 y 1 U/ml para 25% de los pacientes y > 1 U/ml en el restante 25% de pacientes, n=58. Ejemplo 12: Inmunización de un chimpancé infectado crónicamente con HCV subtipo 1 b Un chimpancé (Phil) ya infectado por un lapso de más de 13 años (5015 días antes de la inmunización) con un subtipo de HCV cepa 1 b, se vacunó con E1 (aa 192-326), el cual se derivó de una cepa diferente de genotipo 1b, con una identidad del 95,1 % en el nivel de aminoácido (ver también Tabla 2 de la WO 99 / 67285, la totalidad de la cual se incorpora a la presente para referencia), y que se preparó como se descpbe en los ejemplos 1-3 de la WO 99 / 97285. El chimpancé recibió en total 6 inmunizaciones intramusculares de 50 µg cada una de E1 en PBS / 0,05% CHAPS mezclado con RIBI R-730 (MPLA + TDM + CWS) de acuerdo con el protocolo del fabricante (Ribi Inc., Hamilton, MT). Las 6 inmunizaciones se aplicaron en dos series de tres inyecciones con un intervalo de tres semanas y un período de descanso de 6 semanas entre las dos series. Comenzando 150 días antes de la inmunización, durante el período de inmunización y hasta 1 año luego de la misma (sin embargo, ver a continuación y la WO 99 / 67285) el chimpancé se monitoreó continuamente para detectar varios parámetros indicadores de la actividad de la enfermedad inducida por HCV. Estos parámetros incluían química sanguínea, ALT, AST, gamma GT, química sanguínea, carga viral en el suero, carga viral en el hígado e histología del hígado. Además, se controló la respuesta inmunológica a la inmunización tanto a nivel humoral como celular. Durante este período el animal también se controló para detectar cualquier efecto adverso de la inmunización, tal como un cambio en la conducta, síntomas clínicos, peso corporal, temperatura y reacciones locales (enrojecimiento, hinchazón, endurecimiento). Tales efectos no se detectaron. Claramente, los niveles de ALT (y en especial gamma GT, cuya información no se muestra) disminuyeron tan pronto como el nivel del anticuerpo contra E1 llegó a su máximo (ver figura 8 de la WO 99 / 67285). ALT rebotó con bastante rapidez tan pronto como los niveles de anticuerpo comenzaron a bajar, pero Gamma GT permaneció en un nivel infepor mientras el anti E1 fue detectable. El antígeno de E2 en el hígado disminuyó hasta niveles casi indetectables durante el período en el cual el anti E1 fue detectable, y el antígeno de E2 rebotó poco después de la desaparición de estos anticuerpos. Al mismo tiempo que el Centro y el antígeno de E2 se tornaron indetectables en el hígado, la inflamación del mismo bajó notablemente (ver también la Tabla 3 de la WO 99 / 67285). Esto constituye una gran prueba de que la vacuna induce una reducción del daño al hígado, probablemente al retirar, al menos en parte, los antígenos virales de su principal órgano objetivo, el hígado. El nivel de viremia, según medición con Monitor de HCV Amplicor (Roche, Basilea, Suiza) permaneció aproximadamente inalterado en el suero durante todo el período de estudio. Análisis más detallados de la respuesta humoral revelaron que el máximo título de punto terminal alcanzó 14,5 x 103 (luego de la sexta inmunización) y que este título cayó hasta ser indetectable 1 año luego de la inmunización (figura 8 de la WO 99 / 67285). La figura 9 de la WO 99 / 67285 muestra que los principales epítopos, que pueden ser imitados por los péptidos, reconocidos por las células B, se encuentran localizados en la región N-terminal de E2 (péptidos V1V2 y V2V3; para detalles sobre los péptidos utilizados véase la Tabla 4 de la WO 99 / 67285). Como la reactividad contra el E1 recombinante es mayor y más duradera, también puede deducirse a partir de esta figura que los anticuerpos que reconocen estos péptidos representan sólo una parte de la población total de anticuerpos contra E1. La parte restante está dirigida contra los epítopos los cuales no pueden ser imitados por los péptidos, es decir epítopos discontinuos. Tales epítopos sólo están presentes en la molécula E1 completa o incluso sólo en la estructura similar a la partícula. Tal respuesta inmunológica contra E1 es singular, al menos en comparación con lo que normalmente se observa en los portadores de HCV humanos crónicos (WO 96 / 13590 otorgada a Maertens y colaboradores) y en chimpancés (Van Doorn y colaboradores, 1996), quienes elevan los anticuerpos anti E1 en su curso de infección natural. En dichos pacientes, el anti E1 en parte también está dirigido a los epítopos discontinuos, pero una gran proporción está dirigida contra el epítopo C4 (± 50% del suero del paciente), una proporción menor contra V1V2 (que oscila entre 2 y 70% dependiendo del genotipo), y la reactividad contra V2V3 se registró sólo excepcionalmente (Maertens y colaboradores, 1997). El análisis de la reactividad de célula T indicó que también este compartimiento del sistema inmunológico es estimulado por la vacuna en una manera específica, ya que el índice de estimulación de estas células T se elevó de 1 a 2,5, y permanece algo elevado durante el período de seguimiento (figura 10 de la WO 99 / 67285). Es esta reactividad de la célula T la que se ve únicamente en quienes responden a largo plazo a la terapia con interferones (véase PCT / EP 94 / 03555 otorgada a Leroux -Roéis y colaboradores; Leroux - Roéis y colaboradores, 1996). Ejemplo 13: Inmunización de un portador de HCV crónico con diferente subtipo Un chimpancé (Ton) ya infectado por un período de más de 10 años (3809 días antes de la inmunización) con HCV de genotipo 1a se vacunó con E1 de genotipo 1 b, con únicamente un 79,3% de identidad en el nivel de aminoácido (ver también Tabla 2 de la WO 99 / 67285), y se preparó como se describiera en los ejemplos precedentes. El chimpancé recibió un total de 6 inmunizaciones intramusculares de 50 µg cada una de E1 en PBS / 0,05% CHAPS, cada una mezclada con RIBI R-730 de acuerdo con el protocolo del fabricante (Ribi Inc., Hamilton, MT). Las 6 inmunizaciones se aplicaron en dos series de tres inyecciones con un intervalo de tres semanas y un período de descanso de 4 semanas entre las dos series. Comenzando 250 días antes de la inmunización, durante el período de inmunización y hasta 9 meses luego de la misma (sin embargo, ver a continuación y la WO 99 / 67285), el chimpancé se monitoreó continuamente para detectar varios parámetros indicadores de la actividad de la enfermedad inducida por HCV. Estos parámetros incluían química sanguínea, ALT, AST, gamma GT, carga viral en el suero, carga viral en el hígado e histología del hígado. Además, se controló la respuesta ¡nmunológica a la inmunización tanto a nivel humoral como celular. Durante este período el animal también se controló para detectar cualquier efecto adverso de la inmunización, tal como un cambio en la conducta, síntomas clínicos, peso corporal, temperatura y reacciones locales (enrojecimiento, hinchazón, endurecimiento). Tales efectos no se detectaron. Claramente, los niveles de ALT (y en especial gamma GT, cuya información no se muestra) disminuyeron tan pronto como el nivel de anticuerpo contra E1 llegó a su máximo (ver figura 11 de la WO 99 / 67285). ALT y Gamma GT rebotaron tan pronto como los niveles de anticuerpo comenzaron a bajar, pero ALT y Gamma GT permanecieron en un nivel infepor durante todo el período de seguimiento. Los niveles de ALT fueron incluso reducidos significativamente luego de la vacunación (62 ± 6 U/l) en comparación con el período previo a la vacunación (85 ± 11 U/l). Dado que se recuperaron menos marcadores del daño al tejido en el suero, estos descubrimientos constituyeron una ppmera indicación de que la vacunación indujo una mejora en la enfermedad del hígado. Los niveles de antígeno de E2 se tornaron ¡ndetectables en el período en el cual el anti E1 permaneció por encima de un título de 1 ,0 x 103, pero se tornaron detectables nuevamente en el momento de niveles inferiores de anticuerpo E1. Al mismo tiempo de la desaparición de los antígenos de HCV, la inflamación del hígado disminuyó marcadamente, desde una hepatitis activa crónica y moderada a formas mínimas de hepatitis crónica persistente (Tabla 3 de la WO 99 / 67285). Esto constituye otra gran prueba de que la vacuna induce una reducción en el daño al hígado, probablemente al quitar, al menos en parte, el virus de su principal órgano objetivo, el hígado. El nivel de viremia en el suero, según medición con Monitor de HCV Amplicor (Roche, Basilea, Suiza) permaneció en niveles aproximadamente similares durante todo el período de estudio. Análisis más detallados de la respuesta humoral revelaron que el máximo título de punto terminal alcanzado fue 30 x 103 (luego de la sexta inmunización) y que este título cayó a 0,5 x 103 nueve meses luego de la inmunización (figura 11 de la WO 99 / 67285). La figura 12 de la WO 99 / 67285 muestra que los principales epítopos, que pueden ser imitados por los péptidos y son reconocidos por las células B, se encuentran localizados en la región N-terminal (péptidos V1V2 y V2V3; para detalles sobre los péptidos utilizados véase la Tabla 4 de la WO 99 / 67285). Como la reactividad contra el E1 recombinante es mayor y más duradera, también puede deducirse a partir de esta figura que los anticuerpos que reconocen estos péptidos representan sólo una parte de la población total de anticuerpos contra E1. La parte restante está más probablemente dirigida contra los epítopos que no pueden ser imitados por los péptidos, es decir epítopos discontinuos. Tales epítopos probablemente sólo estén presentes en la molécula E1 completa o incluso sólo en la estructura similar a la partícula. Tal respuesta ¡nmunológica contra E1 es singular, al menos en comparación con lo que normalmente se observa en los portadores de HCV humanos crónicos, que poseen un anti E1 detectable. En dichos pacientes, el anti E1 en parte también es discontinuo, pero una gran proporción está dirigida contra el epítopo C4 (50% del suero del paciente), una proporción menor contra V1V2 (que oscila entre 2 y 70% dependiendo del genotipo), y excepcionalmente se registró reactividad contra V2V3 (Maertens y colaboradores, 1997). Dado que este chimpancé estaba infectado con un aislado de 1a, en la respuesta del anticuerpo también se evaluó la reactividad cruzada hacia un antígeno E1 - 1 a. Como se podrá apreciar en la figura 13 de la WO 99 / 67285, tales anticuerpos de reactividad cruzada son generados, en efecto, pero sólo forman una parte de la población total de anticuerpos. Es notable la correlación entre la reaparición de antígeno viral en el hígado y la desaparición de anticuerpos anti 1a E1 detectables, en el suero. El análisis de la reactividad de la célula T indicó que también este compartimiento del sistema inmunológico es estimulado por la vacuna de una manera específica, dado que el índice de estimulación de estas células T se eleva de 0,5 a 5 y permanece elevado durante el período de seguimiento (figura 14 de la WO 99 / 67285). Ejemplo 14: Refuerzo de los portadores crónicos de HCV con E1 Dado que los títulos de anticuerpo de E1 observados en los ejemplos 12 y 13 no fueron estables y decayeron con el tiempo, incluso hasta niveles indetectables para el chimpancé infectado con 1 b, se investigó si esta respuesta del anticuerpo podía volver a aumentarse mediante un refuerzo adicional. Ambos chimpancés se volvieron a inmunizar con tres inmunizaciones intramusculares consecutivas, con un intervalo de tres semanas (50 µg de E1 mezclados con adyuvante RIBI). Como puede observarse a partir de las figuras 8 y 11 de la WO 99 / 67285, la respuesta anti E1 pudo efectivamente reforzarse, y nuevamente el antígeno viral en el hígado decayó por debajo del límite de detección. La carga viral en el suero permaneció constante aún en Ton (figura 11 de la WO 99 / 67285). Se midió por primera vez un nivel de viremia de <105 equivalentes de genoma, durante el período de seguimiento. Es notable el descubrimiento que, como ya ocurrió en la primera serie de inmunizaciones, el chimpancé infectado con la cepa HCV de subtipo 1b (Phil) responde con títulos anti E1 menores al chimpancé infectado con la cepa HCV subtipo 1a (máximo título en la primera ronda: 14,5 x 103 contra 30 x 103 para Ton, y luego de refuerzo adicional sólo 1 ,2 x 103 para Phil contra 40 x 103 para Ton). Si bien para ambos animales el efecto beneficioso parece ser similar, podría llegarse a la conclusión, a partir de este experimento, de que la inmunización de un portador crónico con una proteína E1 derivada de otro subtipo o genotipo puede resultar especialmente beneficiosa para alcanzar títulos superiores, quizás evitando una supresión inmunológica preexistente y específica que existe en el huésped, e inducida por el subtipo o genotipo infectante. En alternativa, los títulos inferiores observados en la disposición homologa (vacuna 1 b + infección 1b) puede indicar un enlace del grupo de los anticuerpos con el virus. En consecuencia, los anticuerpos inducidos puede poseer una capacidad neutralizante. Ejemplo 15: Demostración de utilidad profiláctica de la vacunación E1 en chimpancés La proteína E1 s de HCV (aminoácidos 192-326) se expresó en células Vero empleando virus de vaccinia recombinante HCV11 B. Este virus de vaccinia fue esencialmente idéntico a vvHCV11 A (como se describe en la Patente Estadounidense nro 6.150.134, la totalidad de contenidos de la cual se incorpora en la presente para referencia), pero se pasó de RK13 a células Vero. La proteína se purificó (por medio de lentil cromatografía, reducción - alquilación y cromatografía de exclusión por tamaño), esencialmente como se describe en el ejemplo 9 de la PCT / E99 / 04342 (WO 99 / 67285), empleando ¡odoacetamida como agente alquilante para las cisteínas. Luego de la purificación, el empigen-BB 3% se intercambió a betaína 3% mediante cromatografía de exclusión por tamaño, como se descpbe en el ejemplo 1 de la PCT / E99 / 04342; este proceso permite recuperar E1 s como una partícula. Finalmente, el material se desalinizó a PBS con un contenido de 0,5% de betaína y una concentración de E1s de 500 µg/ml. Esta E1 se mezcló con igual volumen de Alhydrogel 1 ,3% (Superfos, Dinamarca) y luego se diluyó con 8 volúmenes de NaCI 0,9% para obtener E1 alum - adyuvantada a una concentración de 50 µg E1/ml y 0,13% de Alhydrogel.

La HCV E2 delta HVRI (aminoácidos 412 - 715) se expresó en, y purificó desde, Vero esencialmente como se describió para E1 , empleando virus de vaccinia recombinante HCV 101 el cual se recombinó a partir de pv HCV-101 descripto en el ejemplo 8 de la PCT / E99 / 04342 y virus de vaccinnia de tipo silvestre. También E2 delta HVRI se comporta como una partícula (medido mediante dispersión de luz dinámica) luego del intercambio de empígeno a betaína. Se seleccionaron cinco chimpancés que dieron negativo en un test de anticuerpos de HCV y HCV-RNA. Uno de los animales (Huub) no fue inmunizado, 2 animales recibieron 6 inmunizaciones con 50 µg de E1 adyuvantada con alum (Marti y Yoran) mientras que los 2 animales restantes recibieron 6 inmunizaciones con 50 µg de E2 delta HVRI adyuvantada con alum (Joost y Karlien). Todas las inmunizaciones se administraron via intramuscular con un intervalo de 3 semanas. Se evaluaron las respuestas inmunológicas humorales y celulares en cada animal contra el antígeno con el cual fueron inmunizados, y en cada animal se detectaron ambos tipos de respuestas, como se muestran en la Tabla 11. Tabla 11 : Se determinaron los títulos de anticuerpo mediante ELISA dos semanas después de la sexta inmunización. Se comparó una dilución seriada de la muestra con un parámetro interno (este parámetro interno se define como poseedor de 1000 mU/ml de E1 o anticuerpo anti - E2 delta HVR I es una mezcla de tres sueros de portadores crónicos de HCV seleccionados en base a un elevado título antienvolvente). El índice de estimulación, el cual refleja la respuesta ¡nmunológica celular, se obtuvo cultivando PBMC, extraído de los animales dos semanas después de la tercera inmunización, en presencia o ausencia de antígeno envolvente, y determinando la cantidad de timidina titulada que se incorporó en estas células durante un pulso de 18 horas luego de 5 días de cultivo. El índice de estimulación es la relación entre la timidina incorporada en las células cultivadas con antígeno envolvente, y aquellas cultivadas sin antígeno. Un índice de estimulación >3 se considera una señal positiva.

Tres semanas después de la última de las 6 inmunizaciones, todos los animales incluyendo el animal de control se probaron con 100 CID (dosis infecciosas para chimpancés) de un inoculum de genotipo 1 b (J4.91 , cortesía del Dr. J. Bukh, NIH, Bethesda, Maryland). La divergencia de la secuencia de aminoácido entre las proteínas de la vacuna y el aislado J4.91 (del cual está disponible la información de secuencia con el número de acceso BAA 01583) es de 7% (9 de 135 aminoácidos) para E1 s y 11 % (32 de 304 aminoácidos) para E2 delta HVRI. En consecuencia, esta prueba se considera heteróloga y refleja un desafío de la vida real.

Todos los chimpancés se tornaron HCV-RNA positivos (determinado por medio de Monitor HCV, Roche, Basilea, Suiza) en el día 7 luego de la prueba, y se midió un primer pico ALT y Gamma GT entre los días 35 y 63. Esto demuestra que todos los chimpancés desarrollaron hepatitis aguda. Notoriamente, ambos animales inmunizados con E1 resolvieron su infección, mientras que el de E2 delta HVRI y el animal de control no lo hicieron. Esto lo demuestra el hecho que los animales inmunizados con E1 perdieron HCV-RNA (determinado con Monitor HCV, Roche, Basilea, Suiza) en el día 98 (Yoran) y 133 (Marti) y permanecieron negativos hasta el día 273, con un testeo mensual. Todos los otros animales siguieron siendo RNA-positivos durante todo el período de seguimiento de 273 días, y los valores de ALT y gamma GT no retornaron al normal como para el caso de los chimpancés inmunizados con E1 , sino que aumentaron gradualmente. En conclusión, hemos demostrado que la inmunización con E1 cambia la historia natural de la infección con HCV al prevenir la evolución a una infección crónica, el cual es el principal problema de salud relacionado con el HCV. Ejemplo 16: Similares respuestas a la E1 , que permitieron la remisión de la infección en chimpancés, pueden inducirse en seres humanos A fin de obtener un efecto profiláctico de la inmunización con E1 en el hombre, se requiere que se puedan inducir similares respuestas inmunológicas en el mismo en comparación con el chimpancé. Por lo tanto, hemos vacunado a 20 voluntarios humanos varones en los cuales no se pudieron detectar respuestas anti E1 (humorales o celulares), con 3 dosis de 20 µg de E1s formuladas en 0,13% de Alhydrogel en 0,5 ml. Todas las inmunizaciones se aplicaron por vía intramuscular con un intervalo de 3 semanas. Como se puede apreciar en la Tabla 12, 17 de los 20 voluntarios efectivamente generaron una significativa respuesta inmunológica humoral y celular contra E1 y sin serios efectos adversos. Sólo un voluntario (sujeto 021 ) debe considerarse no respondedor ya que ninguna respuesta humoral o celular estuvo por encima del nivel de corte luego de 3 inmunizaciones con E1. La observación que la respuesta humoral es inferior en comparación con el chimpancé se relaciona con el hecho que se aplicaron sólo 3 inmunizaciones de 20 µg y no 6 de 50 µg. Tabla 12: Se determinaron los títulos de anticuerpo mediante ELISA dos semanas después de la tercera inmunización. Se comparó una dilución seriada de la muestra con un parámetro interno (este parámetro interno se define como poseedor de 1000 mU/ml de E1 o anticuerpo anti - E2 delta HVR I es una mezcla de tres sueros de portadores crónicos de HCV seleccionados en base a un elevado título antienvolvente). El índice de estimulación (respuesta ¡nmunológica celular) se obtuvo cultivando PBMC, extraído de los individuos dos semanas después de la tercera inmunización, en presencia o ausencia de 1 µg de E1 s, y determinando la cantidad de timidina titulada que se incorporó en estas células durante un pulso de 18 horas luego de 5 días de cultivo. El índice de estimulación es la relación entre la timidina incorporada en las células cultivadas con antígeno envolvente, y aquellas cultivadas sin antígeno. Un índice de estimulación >3 se considera una señal positiva.

Sujeto número Título de anticuerpo índice de estimulación 20 * Este individuo se considera anti E1 - positivo luego de la inmunización dado que se observó un aumento significativo en la señal ELISA entre la muestra preinmunológica y la muestra después de la tercera inmunización; el título sin embargo es muy bajo y no permite una determinación precisa. Ejemplo 17: Intensificado de respuesta de E1 de voluntarios sanos vacunados A19 de los 20 voluntarios humanos del ejemplo 16 se les aplicó otro refuerzo de 20 µg de E1 de formulación en 0,13% de Alhidrogel en 0,5 ml en la semana 26 ( p.ej. 20 semanas luego de la tercera inmunización). Se determinaron nuevamente los títulos del anticuerpo y la respuesta de inmunización celular 2 semanas después de esta inmunización adicional. En todos los individuos disminuyó el título del anticuerpo durante el intervalo de 20 semanas, pero pudo aumentarse fácilmente con esta inmunización adicional, hasta un nivel similar o mayor que el observado en la 8a semana. En promedio, el título del anticuerpo aumentó al doble al cabo de este refuerzo en relación con el título de la 8a semana, y 7 veces con respecto al título de la semana 26 (Tabla 13). Tabla 13: los títulos de anticuerpo se determinaron por medio de ELISA dos semanas (= semana N°8) y 20 semanas (= semana N°26) al cabo de la tercera inmunización y finalmente también 2 semanas después del refuerzo (= semana N°28). Se comparó una dilución serial de la muestra con un estándar casero (este estándar casero es de 1000 mU/ml de anticuerpo E1 , es una mezcla de tres sueros de portadores crónicos del HCV seleccionados basándose en un título de elevada acción anti-envolvente). A efectos de una comparación exacta se repitió la determinación del título de la 8a semana dentro del mismo ensayo, para la 26a semana y 28 muestras, lo que explica la diferencia entre la tabla 12 del ejemplo 16. 024 177 81 184 Promedio 467 138 936 Remarcablemente la respuesta de las células-T permanecía elevada luego del intervalo de 20 semanas. Teniendo en cuenta una normalización a la respuesta del tétano, que se da en la mayoría de los individuos como una consecuencia de la vacunación previa, no existen cambios en el sentido geométrico del índice de estimulación. Luego del refuerzo adicional, teniendo en cuenta una normalización a la respuesta del tétanos, no se nota cambio alguno (figura 51 ). Esto confirma que se indujo una fuerte respuesta de ayuda-T luego de las inmunizaciones con 3 E1 e indica que esas inmunizaciones indujeron siempre una muy buena memoria de ayuda-T que no requiere, al menos por un período de 6 meses, un refuerzo adicional. Referencia de la figura 51 : el índice de estimulación (respuesta de inmunidad celular) se obtuvo mediante el cultivo de PMBC (células 105), tomadas de los individuos previo a la inmunización (semana 0), dos semanas después de la tercera inmunización (semana 8), previo a la inmunización de refuerzo (semana 26) y dos semanas posteriores a la inmunización de refuerzo (semana 28), en la presencia o ausencia de 3 µg de E1 recombinante o 2 µg de toxoide de tétanos y determinándose la cantidad de timidina titulada incorporada en esas células durante un pulso de 18 horas luego de 5 días de cultivo. El índice de estimulación equivale a la medida de timidina incorporada a las células cultivadas con antígeno envolvente versus aquellas cultivadas sin antígeno. Se determinaron muestras de la semana 0 y 8 en un primer ensayo (A), mientras que las muestras de la semana 26 y 28 fueron determinadas en un segundo ensayo (B), en el que se analizó nuevamente las muestras de la semana 0. Los resultados se expresaron como el índice de estimulación en sentido geométrico de todos los 20 (experimento A) o 19 (experimento B) voluntarios. Adicionalmente se midió la Th1 citocina interferón-gamma y la Th2 citocina interleucina-5 en el sobrenadante de los cultivos de PBMC de muestras tomadas en la semana 26 y 28 y reestimuladas con E1. Como puede juzgarse de la figura 52, la citocina predominante secretada por el PBMC estimulado con E1 , es interferón-gamma. Es altamente sorpresivo ver que una fuerte respuesta basada en Th1 es observada con un E1 adyuvado con aluminio, ya que el aluminio es conocido como inductor de Th2. Una vez más los resultados confirmaron que se indujo una buena respuesta de memoria de célula-T previamente al refuerzo final (semana 26), aún observándose una muy fuerte respuesta. La secreción de interferón-gamma se consideró específica, de modo que en un experimento adicional no notamos diferencia en la secreción de interferón gamma entre cultivos de células estimuladas con E1 y cultivos de células no estimuladas de esos voluntarios, utilizando muestras tomadas en la semana 0. Referencia de la figura 52: se cultivaron PBMC (células 105) tomadas de los individuos antes de la inmunización de refuerzo (semana 26) y dos semanas luego de la inmunización de refuerzo (semana 28) en la presencia de 3 µg de E1s recombinante (E1 ) o 2 µg de toxoide de tétanos (TT) o no antígeno (Bl). Se midieron las citocinas en el sobrenadante tomado luego de 24 horas (interleucina-5) o luego de 120 horas (interferón-gamma) por medio de ELISA. El índice de estimulación constituye la proporción de citocina medida en el sobrenadante de células cultivadas con antígeno envolvente versus aquellas cultivadas sin antigeno. Los resultados se expresaron en el sentido geométrico de pg citocina/ml secretado de los 19 voluntarios. A las muestras con una cantidad de citocina por debajo del límite de detección se les asignó el valor del límite de detección. A muestra similares con concentraciones extremadamente altas de citocina que quedaban fuera del rango del ensayo se les asignó el valor del límite superior dentro del rango del ensayo. Ejemplo 18: Mapeo fino de la respuesta celular frente a E1 en voluntarios sanos Vacunados A fin de mapear las respuestas específicas de E1 , se sintetizó una serie de péptidos -meros, usando química estándar Fmoc, con una superposición de 8 aminoácidos y cubriendo la secuencia completa de E1. Todos los péptidos fueron amidados en el extremo C y acetilados en el extremo N, con la excepción de IGP 1626 que presenta un terminal amino libre. IGP 1626 YEVRNVSGIYHVTNDCSNSS (aminoácido 192-211 ) IGP 1627 TNDCSNSSIVYEAADMIMHT (aminoácido 204-223) IGP 1628 AADMIMHTPGCVPCVRENNS (aminoácido 216-235) IGP 1629 PCVRENNSSRCWVALTPTLA (aminoácido 228-247) IGP 1630 VALTPTLAARNASVPTTTIR (aminoácido 240-259) IGP 1631 SVPTTTIRRHVDLLVGAAAF (aminoácido 264-283) IGP 1632 LLVGAAAFCSAMYVGDLCGS (aminoácido 264-283) IGP 1633 YVGDLCGSVFLVSQLFTISP (aminoácido 276-295) IGP 1634 SQLFTISPRRHETVQDCNCS (aminoácido 288-307) IGP 1635 TVQDCNCSIYPGHITGHRMA (aminoácido 300-319) GP 1636 HITGHRMAWDMMMNWSPTTA (aminoácido 312-331) Se cultivó PBMC de 14 donantes sanos no vacunados con E1 s o 10 donantes vacunados con E1 s en presencia de 25 µg/ml (personas no vacunadas) o 10 µg/ml (personas vacunadas, muestras tomadas luego de la tercera aplicación o inyección de refuerzo) de cada péptido separadamente. Como puede juzgarse de la figura 53, los péptidos IGP 1627, 1629, 1630, 1631 , 1633, 1635 y 1636 indujeron todos respuestas significativamente más altas en personas vacunadas en comparación a personas no vacunadas. Aplicando un índice de estimulación de 3 como corte, los péptidos IGP 1627, 1629, 1631 y 1635 fueron los más frecuentemente reconocidos (p. ej. reconocidos por al menos la mitad de la personas vacunas estudiadas). Este experimento prueba que las respuestas de las células-T inducidas mediante E1s derivadas de cultivos de células de mamíferos son específicas contra E1 , aunque estas respuestas no pueden ser solamente revocadas por el mismo E1 s derivado de cultivos de células de mamífero, pero también mediante péptidos sintéticos. Adicionalmente este experimento determina que los dominios de células-T de mayor inmunogenicidad en E1 se ubican entre los aminoácidos 204-223, 228-271 , 276-295, 300-331 y más particularmente aún entre los aminoácidos 204-223, 228-247, 252-271 y 300-319. Referencia de la figura 53: el índice de estimulación (respuesta inmunológica celular) se obtuvo mediante el cultivo de PBMC (3 x células 105 ), en la presencia o ausencia de péptidos y determinando la cantidad de timidina tritilada incorporada en esas células durante un pulso luego de 5-6 días de cultivo. El índice de estimulación representa la proporción de timidina incorporada en las células cultivadas con péptidos versus aquellas cultivadas sin péptidos, Los resultados se expresaron como valores individuales para personas vacunadas (panel superior) o para no vacunadas o controles (panel inferior). La presente invención asimismo provee para ello los siguientes péptidos E1 , las proteínas, las composiciones y los kits conteniendo las mismas secuencias de ácido nucleico que codifican para esos péptidos y proteínas que contienen el mismo, y métodos para su manufactura y uso, como descripto aquí en general para otros E1 y péptidos relacionados de la presente invención. IGP 1626 que abarca las posiciones 192-211 de la región E1 (SEC ID NO: 112) IGP 1627 que abarca las posiciones 204-223 de la región E1 (SEC ID NO:113) IGP 1628 que abarca las posiciones 216-235 de la región E1 (SEC ID NO:114) IGP 1629 que abarca las posiciones 228-247 de la región E1 (SEC ID NO:115) IGP 1630 que abarca las posiciones 240 259 de la región E1 (SEC ID NO:116) IGP 1631 que abarca las posiciones 252-271 de la región E1 (SEC ID NO: 117) IGP 1632 que abarca las posiciones 264-283 de la región E1 (SEC ID NO:118) IGP 1633 que abarca las posiciones 276-295 de la región E1 (SEC ID NO: 119) IGP 1634 que abarca las posiciones 288-307 de la región E1 (SEC ID NO: 120) IGP 1635 que abarca las posiciones 300-319 de la región E1 (SEC ID NO: 121 ) IGP 1636 que abarca las posiciones 312-331 de la región E1 (SEC ID NO: 122) REFERENCIAS Bailey, J. and Colé, R. (1959) J. Biol. Chem. 234, 1733-1739. Ballou, L, Hitzeman, R., Lewis, M. & Ballou, C. (1991 ) PNAS 88, 3209-3212. Benesch, R., Benesch, R.E., Gutcho, M. & Lanfer, L. (1956) Science 123, 981. Cavins, J. & Friedman. (1970) Anal. Biochem. 35, 489. Cleland, W. (1964) Biochemistry 3, 480 Creighton , E. (1988) BioEssays 8, 57 Darbre, A., John Wiley & Sons Ltd. (1987) Practical Protein Chemistry - A Handbook.

Darbre, A., John Wiley & Sons Ltd. (1987) Practical Proteinchemistry p.69-79. Doms et al, (1993), Virology 193, 545-562. Ellman, G. (1959) Arch. Biochem. Biohys. 82, 70. Falkner, F. & Moss, B. (1988) J. Virol. 62, 1849-1854. Friedman, M. & Krull. (1969) Biochem. Biophys. Res. Commun. 37, 630. Gallagher J. (1988) J. Cell Biol.107, 2059-2073. Glazer, A., Delange, R., Sigman, D. (1975) North Holland publishing company, Elsevier, Biomedical. Part Modification of protein (p. 116). Graham, F. & van der Eb, A. (1973) Virology 52, 456-467. Grakoui et al. (1993) Journal of Virology 67:1385-1395. Grassetti, D. & Murray, J. (1969) Analyt. Chim. Acta. 46, 139. Grassetti, D. & Murray, J. (1967) Arch. Biochem Biophys. 119, 41. Helenius, Mol. Biol. Cell (1994), 5: 253-265. Hijikata, M., Kato, N., Ootsuyama, Y., Nakagawa, M. & Shimotohno, K. (1991 ) Proc.

Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88(13):5547-51.

Hochuli, E., Bannwarth, W., Dóbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. (1988) Biochemistry 88, 8976. Hsu, H., Donets, M., Greenberg, H. & Feinstone, S. (1993) Hepatology 17:763-771.

Inoue, Y., Suzuki, R., Matsuura, Y., Harada, S., Chiba, J., Watanabe, Y., Saito, I. & Miyamura, T. (1992) J. Gen. Virol. 73:2151 -2154. Janknecht, R., de Martynoff, G. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 8972- 8976. Kayman (1991 ) J. Virology 65, 5323-5332. Kato, N., Oostuyama, Y., Tanaka, T., Nakagawa, M., Muraiso, K., Ohkoshi, S., Hijikata, M., Shimitohno, K. (1992) Virus Res. 22: 107-123. Kniskern, P., Hagopian, A., Burke, P., Schuitz, L., Montgomery, D., Hurni, W., Yu Ip, C, Schulman, C, Maigetter, R., Wampler, D., Kubek, D., Sitrin, R., West, D., Ellis, R., Miller, W. (1994) Vaccine 12:1021 -1025. Kohara, M., Tsukiyama-Kohara, K., Maki, N., Asano, K., Yoshizawa, K., Miki, K., Tanaka, S., Hattori, N., Matsuura, Y., Saito, I., Miyamura, T. & Nomoto, A. (1992) J.

Gen. Virol. 73:2313-2318. Mackett, M., Smith, G. & Moss, B. (1985) In: 'DNA cloning: a practical approach' (Ed.

Glover, D.) IRL Press, Oxford. Mackett, M., & Smith, G. (1986) J. Gen. Virol. 67, 2067-2082. Mackett, M., Smith, G. & Moss, B. (1984) J. Virol. 49, 857-864. Mackett, M., Smith, G. & Moss, B. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419.

Means, G. (1971 ) Holden Day, Inc. Means, G. & Feeney, R. (1971 ) Holden Day p.105 & p. 217.

Mita, E., Hayashi, N., Ueda, K., Kasahara, A., Fusamoto, H., Takamizawa, A., Matsubara, K., Okayama, H. & Kamada T. (1992) Biochem. Biophys. Res.

Comm.183:925-930. Moore, S. (1963) J. Biol. Chem. 238, 235-237. Okamoto, H., Okada, S., Sugiyama, Y., Yotsumoto, S., Tanaka, T., Yoshizawa, H., Tsuda, F., Miyakawa, Y. & Mayumi, M. (1990) Jpn. J. Exp. Med. 60:167-177. Panicali & Paoletti (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931. Piccini, A., Perkus, M. & Paoletti, E. (1987) Meth. Enzymol. 153, 545-563. Rose (1988) Annu. Rev. Cell Biol. 1988, 4: 257-288; Ruegg, V. and Rudinger, J. (1977) Methods Enzymol. 47,111 -116. Shan, S. & Wong (1993) CRC-press p. 30-33. Spaete, R., Alexander, D., Rugroden, M., Choo, Q., Berger, K., Crawford, K., Kuo, C, Leng, S., Lee, C, Ralston, R., et al. (1992) Virology 188(2): 819-30. Skehel, J., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 , 1179-1783. Stunnenberg, H., Lange, H., Philipson, L, Miltenburg, R. & van der Vliet, R. (1988) Nucí. Acids Res.16, 2431-2444. Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A., DeLeys, R. & Maertens, G. (1993a) Biochem. Biophys. Res. Commun. 192, 635-641. Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A., Duhamel, M., Vanderborght, B., Van Heuverswyn, H., & Maertens, G. (1993b) J. Gen. Virol. 74, 1093-1102. Stuyver, L., Van Arnhem, W., Wyseur, A., Hernández, F., Delaporte, E., Maertens, G. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :10134-10138. Weil, L. & Seibler, S. (1961 ) Arch. Biochem. Biophys. 95, 470.

Yokosuka, 0., Ito, Y., Imazeki, F., Ohto, M. & Omata, M. (1992) Biochem. Biophys.

Res. Commun. 189: 565571. Miller P, Yano J, Yano E, Carroll C, Jayaram K, Ts'o P (1979) Biochemistry 18: 5134- 43. Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt 0 (1991 ) Science 254: 1497-500. Nielsen P, Egholm M, Berg R, Buchardt O (1993) Nucleic-Acids-Res. 21 :197-200.

Asseline U, Delarue M, Lancelot G, Toulme F, Thuong N (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 81 :3297-301. Matsukura M, Shinozuka K, Zon G, Mitsuya H, Reitz M, Cohén J, Broder S (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7706-10. WO 96/04385 (PCT/EP95/03031 ) - Purified Hepatitis C Virus Envelope Proteins for Diagnostic and Therapeutic Use. Todas las referencias citadas aquí se incorporan en su totalidad a modo de referencia. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

LISTADO DS SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Maertens, Geert Bos an, Fons De Martynoff, Guy Buyse, Marie-Ange (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: Proteinas purificadas de envoltura, del virus de la hepatitis C para uso diagnóstico y terapéutico. (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 122 (iv) DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA (A) DIRECCIÓN: NIXON & VANDERHYE (B) CALLE: 1100 North Glebe Road, 8 th Floor (C) CIUDAD: Arlington, VA 22201 (E) PAÍS: USA (F) ZIP: 22201 (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA (A) TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA. OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: Patentln Reléase # 1.0, Versión # 1.25 (vi) DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE SOLICITUD: sin asignar (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 01-DIC-2000 (C) CLASIFICACIÓN: (viii) INFORMACIÓN DE FUNCIONARIO/APODERADO (A) NOMBRE: Sadoff, B. J. (B) NUMERO DE REGISTRO: 36663 (C) NUMERO DE ACTA/REFERENCIA: 2551-53 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN (A) TELEFONO: (703)816-4000 (B) TELEFAX: (703)816-4100 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1: GG ATOCAAG CTTAAT AAT T 21 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 68 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2: CCGGGGAßGC CT8CACGTCA TCGACGaC?S ACACOTCAC CACCMJC?CT ARTABrTAAT SO TAACTGCA 58 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 642 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/C AVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...639 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACION: 1...636 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3 : ATG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TT5 GCT TTA CTG TCC TGT 46 Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Xle Pbe Leu Leu la Leu Leu Sex Cys i s ?e ' 15 CTG ACC ATT CCA GCT TCC GCT TAT GAG G?G CGC AAC GTG TCC GGG ATG- 95 Leu £r lie Pro Ala Ser A * Tyr Glu Val Arg Asa Val Ser Gly Met 20 25 30 TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGC ATT GTG TAT GAG GCA 144 Tyr His Val Thr Aan Asp ys Ser ASE Ser Ser lie Val Tyr Glu Ala "33 "40 "45 GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC CTG CCC TGC GTT CGG GAG 152 Ala Asp Mee Xle Mee His ftr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val ?rg Giu 50 55 60 AAC AAC TCT TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACC CCC ACG CTC OCA GCT "240 Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu ?hr Pro Thr Leu Ala Ala ß5 70 75 80 AGG AAC GCC AGC GTC CCC ACC ACG ACÁ ATA CGA CGC CAC GTC GAT TTG 288 Arg Aap Ala ser Val Pro Tbr Thr Thr ?le Arg Arg His Val Asp Leu 85 90 S5 CTC GTT GGG GCG GCT GCT CTC TGT TCC GCT ATG TAC OTG GGß GftT CTC "336 Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Cya Ser Ala ütet Tyr Val Gly Aso Leu 100 105 110 TQC GGA TCT GTC TTC CTC GTC TCC CAG CTß TTC ACC ATC TCG CCT CGC 384 Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gla Leu Phe Thr lie Ser Pro Ar? 115 120 125 CQG CAT GAS ACG GTG CAG GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC "432 Arg His Glu Thr Val Gla Asp Cys Asr Cys Ser lie Tyr Pro Giy Kiß 130 135 140 ATA ACÁ GGT CAC CGT ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCT 480 Xle Thr Gly Hiß Arg Met Ala Trp Asp Mee Ket Met Ase Trp Ser Pro 145 150 1SS 150 ACÁ ACG GCC CTG GTG GTA TCG CAG CTG CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC 528 Tfcr Thr Ala Leu Val Val Ser Glc. Lett Leu Arg lie Pro Gln Ala Val 165 170 1"5 GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAT TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTC GCC 576 Val ?ßp Het Val Ala Gly Ala Eis Trp Gly Val Leu ?la Gly Leu Ala IßC 185 190 TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG ßTT TTG ATT GTG ATG CTA "624 Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asa Trp Ala Lys Val Leu lie Val Kec Leu 195 200 205 CTC TTT GCT CTC TAATA6 642 Leu' Phe Ala Leu 210 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 212 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 4.

Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser ¿le Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cyß 1 5 10 - 13 Lßu Thr lie Pro Ala Ser Ala Tyr ßlu Val Arg Asa Val Ser Gly Kec 20 25 30 Tyr His Val Thr Asa Aßp Cys Ser Asa Sar Ser lie Val Tyr Glu Ala 35 «0 45 Ala Asp Met He Het Hiß Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 50 55 60 Asa ?sn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Tbr Leu Ala ?la 65 70 75 80 Arg Asn Ala Ser Val Pro Ttsr Tbr Thr He Arg Arg His Val Asp Leu 85 90 95 Leu Val Gly Ala Ala ?la Leu Cyß Ser ?la Mee Tyr Vai Gly Asp Leu 100 105 110 Pys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gla Leu Phe Thr He Ser Pro Ar? 115 120 ' .125 Arg Hiß Glu Thr Val Gl» Asp Cys Asa Cys Ser lie Tyr Pro ßly His 130 135 140 He Tfcr Gly Hxs Arg Mee Ala Trp Asp Het Mee Met Asa Trp Ser Pro 145 150 155 160 Itr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg ' lle Pro Gla Ala al 165 170 175 Val Asp Met Val Ala Gly Ala Ris Trp Gly Val Leu Ala Giy Leu Ala 180 185 190 Tyr Tyr Ser Ket Val Gly Asn Trp Ala ys Val Leu He Val Met Leu 195 200 205 Leu Phe Ala Leu 210 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 795 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1. . . 792 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: ?aat_peptide (B) LOCAL I ZAC ION: 1. . .789 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5: 8 ATG TTG GGT AAG OIC ATC GAT ACC CTT ACÁ TGC GGC TTC GCC GAC CTC 43 Het Leu Sly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe ?la Asp Leu 1 5 10 15 GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG "96 Val Gly Tyr He Pro Leu Vil Gly Ala Pro Leu Gly Gly ?la Ala Arg 20 25 30 CCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG G?G GftC GGC GTG AAC TAT GCA "144 Ale Leu Ala His Gly Val ?rg Val Leu Glu Asp Gly Val Asa Tyr ?la 3S *0 . 45 ACÁ GOG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TIC TCT ATC TIC CTC TTG GCT TTG 192 Thr Giy Asa Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser He Phe Leu Leu ?la Leu 50 55 60 CTG TCC TGT CTG ACC GTT CCA GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG 240 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val 65 70 75 B0 TCC GGG ATG TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGC ATT GTG Ser Gly Mee Tyr His Val Thr Asa ?sp Cys Se Asn Ser Ser He Val 85 90 95 TAT G?G GCA GCG GAC ATG ATC ?TG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC 336 Tyr Clu Ala Ala Asp Mee He Mee His T=r Pro Gly Cye Val Pro Cys 100 105 110 GTT CGG GAG AAC AAC TCT TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTQ ACC CCC ACG Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cyß Trp Val Ala Leu Tbr Pro Thr 115 120 125 CTC GCA GCTAGGAAC GCC AGC GTCCCCACCACGAC? ATA CGA CGC CAC "432 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Tsr Thr Thr He Arg Arg His 130 135 .140 src GAT TTG er GTT GGG GCG GCT G G TTC TGT TCC GCT ATG TAC GTG "480 Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Pe Cys Ser Ala Met Tyr Val 145 150 155 160 "ßGG GAC CTC TGC GGA TCT CTC TTCCTC GXTCCCAGCTGTTC ACC ATC "528 Gly ?sp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr He 155 170 175 TCG CCT CGC CGG CAT GAG ACG GTG CAG G?C TGC AAT TGC TCA ?TC T?T 576 Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asa Cys Ser He Tyr 180 185 190 CCC GGC CAC ATA ACG GGT CAC CGT ATG GCT TGG GAT ATG A2G ATG AAC 624 Pro Gly Eis He Thr Giy His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Aso 195 200 205 TGG TCG CCT ACÁ ACG GCC CTG GTG GTA TCG CAG CTß CTC CGG ATC CCA "672 Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Lßu Leu Arg He Pro 210 215 220 CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAT TGG GGA GTC CTG GCG 720 Gla Ala val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala 225 230 235 240 GGT CTC GCC T?C TAT TCC ATG GTG GGG ?AC TGG GCT ?AG GTT TTG ATT "768 Gly Leu Ala lyr Tyr Ser Met vai Gly Asa Trp Ala Lys Val Leu He 245 250 255 GTG ATG CTA CTC TW GCT CCC TAAT?G 795 Val Mee Leu Leu Phe Ala Pro 260 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 263 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6: Mee Leu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Giy Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 Val Gly Tyr He Pro Leu Val Gly Ala Pro Lßu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Leu ?la His Gly Val Arg Vai Leu Glu Asp Giy Vai Asa Tyr Ala 35 40 45 Thr Giy Asa Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Xle Phe e Leu Ala Leu 50 55 50 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Giu al Arg Asa Vai 65 70 75 BO Ser ßly Met Tyr Ris Val Thr Asn Asp Cya Ser Asa Ser Ser He Val 85 90 95 Tyr Glu Ala Ala Asp Met He Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 U0 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg ?rg His 130 135 140 Val ?sp Leu Leu Val Gly Ala Ala ?la Phe Cys Ser Aia Met Tyr Val 145 150 153 160 Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gis Leu Phe Thr He 165 170 175 Ser Pro Arg Arg Hiß Glu Thr al ßla Asp Cys Asa Cys Ser He Tyr 180 185 190 Pro Gly His He Thr Gly Ris Arg Met ?la Trp Asp Met Met Met Asn 195 200 205 Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gla Leu Leu Arg He Pro 210 215 220 Gln ?la Val Val ?s? Met Val Ala Giy Ala His Txp Gly Val Leu Ala 225 230 235 240 Gly Lßu Ala Tyr Tyr Ser Het Val Giy Asa T?p Ala Lys ai Leu He 245 250 255 Val Met Leu Leu Phe ?la Pro 260 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 633 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...630 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACION: 1...627 11 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7: ATß TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACG TGC GGC TTC GCC GAC CTC "48 Mee Leu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 ATG GGß TAC ATT CCG C?CGTCGGCGCCCCC CTAGGG GGTGCT GCC AGA 96 Met ßly Tyr He Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG G?A GAC GGC GTG AAC TAT GCA "144 Ala Leu Ala His ßly Val Arg Val Leu Glu Asp ßly Val Asn Tyr Ala 35 40 45 ACÁ GGß AAT TTG CCT GßT TCC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTA ' 192 Thr Gly Asa Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser He Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 CTß TCC TGT CTG ACC ATT CCA GCT TCC QCT TAT GAG ßTG CGC AAC GTG 240 Leu Ser Cys Lßu Thr He Pro Ala Ser ?la Tyr Giu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 TCC GGG ATG TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA ACC ATT GTG "2BB Ser ßiy Met Tyr His Val «ur Asn Asp Cya Ser Asn Ser Ser He Val 85 , 90 95 10 T?T G?G GCA GCG GAC ATG ATC ATG C?C ACC CCC GGG TGC ßTß CCC TGC 336 Tyr Giu Ala ?la Aso Mee He Met His Thr Pro Giy Cys Val Pro Cys 100 IOS 110 GTT CGG G?G AAC AAC TCT TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACC CCC ACG 384 Vil Arg Glu Asn Asa Ser Sar Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 CTC GC? GCT AGG A?C GCC AGC GTC CCC ACT ACß ACÁ ATA CGA CGC CAC " 432 Leu Ala Ala Arg Asa Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Axg His 130 135 140 GTC G3J TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGT TCC GCT ATG TAC GTG 480 i < Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cyß Ser Ala Mee Tyr Val J 145 150 155 160 GGG G?T CTC TGC GGA TCT GTC TTC CTC GTC TCC CAG CTG TTC ACC ATC "528 Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr He 165 170 175 TCG CCT CGC CGG CAX GAG ACß GTG CAG G?C TGC ?AT TGC TCA ATC TAT Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser He Tyr 180 185 190 CCC GGC C?C ATA ACÁ QGT CAC CGT ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC "624 Pro Giy Hia He Thr Giy His Arg Mee Ala Txp Asp Mee Met Mee Asa 195 200 205 0 TGG TAATAG "210 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) EXTENSIÓN: 209 aminoácidos 12 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8: Met Leu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 1 S 10 15 Mee Gly Tyr He Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Lßu Glu ?so Gly Val Asa Tyr Ala 35 40 45 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser ? e Ser He Phe Leu Leu Ala Leu 50 • 55 60 Leu Ser Cys Leu Thr He Pro Ala Ser Ale Tyr Glu Val Arg Asa Val 65 70 75 80 Ser Gly Met Tyr Kis Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser He Val 85 90 95 Tyr ßlu Ala Ale ASp Met He Mee Kis Thr Pro ßly Cys Val Pro Cyß 100 105 110 Val Arg Glu Asa Asa Ser Ser ?rg Cys Trp Val Ala Leu Thr ro «ur US 120 125 Leu Ala. Ala Arg Asa ?la Ser Val Pro Thr ?fcr Thr lie Arg Arg His 130 135 140 Val Asp Leu Lßu Val Gly Ala ?la ?la Phe Cys Ser Ala Het Tyr Vai 145 150 155 160 Gly Asp Lßu Cyß Gly Ser Val Phe Leu Vai Ser Gln Leu Phe thr He 165 170 175 Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asa Cyß Ser He Ty 180 185 190 Pro Gly His He Thr Gly His ?rg Met Ala Trp ?sp Met Met Met Asn 195 200 205 Trp (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 483 pares de bases 13 (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...480 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...477 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9: ATG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCC CTG CTG TCC TGT 48 Met Pro Gly Cys Ser he Ser Xle he Leu Leu Ala Leu Lau Ser Cys 1 5 10 15 CTG ACC ATA CCA GCT TCC GCT TAT GAA CTß CGC AAC GTß TCC GGG GTG 96 Leu Thr He Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Vei Arg Asa Val Ser Gly Val 20 2S 30 TAC CAT GTC ACG fAC GAC TOC TCC A?C TCA AGC ATA GTG TAT GAG GCA 144 ?yx Kiß Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser He Val lyr Giu Ala 35 40 43 GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC ßTT CßG GAG 192 ?la Asp Met Xle Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 50 55 60 14 GGC AAC TCC TCC CGT TGC TOG GTG GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 240 Gly Asa Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu ?la ?la 65 ' 70 75 80 AGG AAC GCC ?GC GTC CCC ACÁ ?CG ACÁ ATA GC? CGC CAC GTC G?T TTG '288 Arg ?sn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His Vai Asp Leu 85 90 95 CTC GTT GGG GCT GCT GCT TTC TGT TCC GC? ATG TAC GTG GGG GAT CTC "336 Leu Val Gly ?la Ala ?la Pbe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 100 105 110 TGC OGA TCT GTT TTC CTT GTT TCC CAG CTG TTC ACC TTC TCA CCT CGC "384 Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gla Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg 115 • 120 125 CGG CAT CAA ACÁ GTA CAG G?C TGC AAC TGC TCA ATC TAI CCC GßC CAT "432 Arg His Sin 3hr Val Gla Asp Cys Asa Cys Ser He Tyr Pro Gly His 130 135 140 GTA TCA GGT CAC CGC ATß GCT TSS ß?T ATG ATG ATG AAC TGG TCC TAATAG "483 Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Het Ket Asa Trp Ser 145 150 155 160 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 159 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10: Het Pro Gly Cys Ser Phe Ser He Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys 1 5 10 15 Leu Ba He Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val Ser Gly Val 20 25 30 Tyr Bis Val Thr Asa Asp cys Ser ?sa Ser Ser He Vai Tyr ßlu ?la 35 40 45 ?la Asp Met He Met Kis Thr Pro Gly Cys Val Pro Cyß Val Arg Glu 50 55 60 Giy Asa Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro TSa: Leu Ala ?la 65 70 75 80 ?rg ?ßn ?la Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His Val Asp Leu 85 SO 55 Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu 100 105 - lio Cya Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gin Leu Phe Thr Phe Ser Pro ¿rg 115 120 125 Arg Mis Gln Thr Val Gln ?sp Cys ?sn Cy* Ser He Tyr Pro Gly His 130 135 «o Val Ser Gly Hts AJGS7 Mee Ala Trp Asp Mee Mee Mee Asn. Trp Ser 145 • 150 155 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 480 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO 16 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...477 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...474 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11: ATG TCC GGT TGC TCT TTC TCT A?C TTC CTC TTG GCC CTG CTß TCC TGT 48 Met Ser Gly Cys Ser P é Ser lie Phe Leu Leu ¿la Leu Leu Ser Cys 1 5 10 15 "CTß ?CC ATA CCA GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG TCC GGG GTG »* Leu Tbr He Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val Ser Giy Val 20 25 30 TAC CAZ GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGC ATA GTG TAT GAG GCA 144 Tyr Eis Val Thx Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser He Val Tyr Glu Ala 35 40 45 GCG GAC ATß ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG 192 Ala Asp Met lie Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu 50 SS 60 GGC AAC TCC TCC CGT TGC TGG GTG GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC 240 Gly Asn. Ser Ser Arg Cvs Trp Val Ala Lew Thr Pro Thr Leu Ala Ala SS 70 75 B0 AGG AAC GCC AGC GTC CCC ACÁ ACG ACÁ ATA CGA CSC CAC GTC GAT TTG "288 Arg ?sn. Ala Se Val Pro Thr Thr Thr lie Arg Arg His Val Asp Leu 85 90 . 95. CTC GTT GGG GCT GCT GCT TTC- TGT TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC 336 u Vai Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser ?la Mee Tyr Val Gly ?sp Lßu 2.00 105 no TGC GGA TCT GTT TTC CTT GTT TCC CAG CTG TTC ACC TTC TCA CCT CGC ~M* Cys Gly Ser Val Phe Leu Vai Ser Gla Leu Phe Str Phe Ser Pro Arg 17 "115 120 125 CGG CAT CAA ACÁ GTA CAG GAC TOC AAC TGC TC? AT TAX CCC GGC CAT 432 Arg Eis Sin Thr Val Gla Asp Cys Asn Cys Ser He Tyr Pro Gly His 130 135 140 OTA TCA GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TAATAG Val ser Giy Eis Arg Bet Ala Trp Asp Met Mee Mßt Asa Trp 480 145 3 0 155 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 12 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN : 158 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12 : Met Ser Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe Lßu Leu Ala ^eu Leu Ser Cys 1 5 10 ÍS I»eu Thr lie Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val Ser Gly Val 20 25 30 Tyr Kis Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser lie Val Tvr ßlu Ala 35 40 45 Ala Asp Jiez lie Ket Kis Tbx Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu - 50 55 60 Bly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Lßu Thr Pro Thr Leu Ala ?la 65 70 75 80 Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His Val Asp Leu 85 90 95 Leu Val Giy Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Het Tyr Val Gly Asp Z>eu 100 105 110 Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg 115 120 125 Arg Eis Gln Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser He Tyr Pro Gly His 130 135 140 Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Ket Met Asn Trp 145 150 155 18 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 636 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACION: 1...633 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACION: 1...630 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13: 19 ATG CTG GGT AAG GCC ATC GAT ACC CTT ACG TGC GGC TTC GCC GAC CTC "48 Mßt Leu Gly Lys Ala lie Asp Thr Lßu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Lßu 1 5 10 15 GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG "96 Val Gly Tyr lie Pro Lßu Val Gly Ala Pro Lßu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAA GAC GGC GTG AAC TAT GCA 144 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Lßu Glu Asp Gly Val Asa Tyr Ala 35 40 45 ACÁ CGG AAT TTG CCT GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTA 192 Thr Glv Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 CTG TCC TGT CTA ACC ATT CC? GCT TCC GCT TAC GAG GTG CGC AAC GTG 240 Lßu Ser Cys Leu Thr lie Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val 65 70 75 80 TCC GGG ATG TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGC ATT GTG 288 Ser Gly Mee Tyr His Val Thr Asa Asp Cys Ser Asn Ser Ser lie Val 85 90 95 TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC 336 Tyr Glu Ala Ala Asp Met He Mee His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110. GTT CGG GAG AAC AAC TCT TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACC CCC ACG 384 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys TT? Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 CTC GCG GCT AGG AAC GCC AGC ATC CCC ACT ACÁ ACÁ ATA CGA CGC CAC 432 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser He Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His 130 135 140 GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGT TCC GCT ATG TAC GTG 480 Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val 145 150 155 160 GGG GAT CTC TGC GGA TCT GTC- TC CTC GTC TCC CAG CTG TTC ACC ATC 528 Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr He 165 170 175 TCG CCT CGC CGG CAT GAG ACß GTG CAG GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT 576 Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser lie Tyr 180 185 190 CCC GGC CAC ATA ACG GGT CAC CGT ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC 624 Pro Gly Ris lie Thr Gly Eis Arg Met Ala Trp Asp Mßt Met Mat Asn 195 200 205 TGG TAC T?ATAG 640 Trp yr 210 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 14 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN : 210 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1 Met Leu Gly Lys Ala lie Asp T=r Lßu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Lßu 1 5 10 15 Val Gly Tyr lie Pro Leu Vai Gly Ala Pro Leu Giy Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Lßu Ala Ki* Gly Val Arg Val Leu Glu Aso Gly Val ASE Ty Ala 35 40 45 Thr Gly Asn Lßu Pro Gly Cys Ser Pae Ser lie Phß Leu Leu Ala Lßu 50 33 eo Leu Ser Cys Leu Thr lie Pro Ale Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val 65 70 75 80 Ser Gly Kec Tyr Hls Val Thr ?sn Asp Cys Ser Asn Ser Ser lie Val SS 90 95 T r Glu Ala Ala Asp Met lie Hec His Tur Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 Val ?rg ßlu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr US 120 125 Lßu Ala Ala Arg Asn Ala Ser lie Pro Thr Tfcr Thr lie Arg Arg His 130 135 140 Val Aßp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Pha cys Ser Ala Mßt Tyr Val 145 150 1S5 160 Gly ?sp Leu Cys Gly Ser Vai Phß Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr He 165 170 175 Ser Pro Arg ?rg His Giu Thr Val Gin Asp Cys ?sn Cys Ser He Tyr 180 185 190 Pro Gly His lie «ir Gly Ele Arg Met Ala Txp ?sp Met Mat Het Asp 155 200 205 T?p Tyr 210 21 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (lil) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15: ATGCCCGGTT GCTCTTTCTC TATCTT 26 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 22 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA?* NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16: &TGTTGGGTA AGGTCATCGA TACCCT "26 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: SI (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17 : CTAXTAGGAC CAGTTCATCA TCAIATCC A 30 23 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: SI (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18: CTATTACCAG TTCATCATCA TATCCCA 27 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 24 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19: ATACGACGCC ACGTCGATTC CCAGCTGTTC ACCATC 36 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADOR^: YES (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20 : GATGGTGAAC AGCTGGGAAT CGACGT3GCG TCGTAT 36 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 723 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal ¡ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...720 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...717 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21; 26 ATG TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACÁ TGC GGC TTC GCC GAC CTC 48 Met Lßu Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Lßu 1 - 5 10 15 GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG 96 Val Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC 'GTG AAC TAT GC? 144 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Giu Asp Gly Val Asa Tyr Ala 35 40 45 ACÁ GGG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG "192 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Zle Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 CTG TCC TGT CTG ACC GTT CCA GCT TCC GCT T?T GAA GTG CGC AAC GTG 240 Leu Ser Cvs Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 TCC GGG ATG TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGC ATT GTG 288 Ser Gly Mee Tyr His Val Thr Asa Asp Cys Ser Asn Ser Ser lie Val 85 90 95 TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC 336 Tyr Glu Ala Ala Asp Met He Mer His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 GTT CGG GAG AAC AAC TCT TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACC CCC ACG 384 Val Arg Glu Asa Asn Ser Ser Arg Cys Trp" Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 CTC GCA GCT AGG AAC GCC AGC GTC CCC ACC ACG ACÁ ATA CGA CGC CAC 432 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr lie Arg Arg His 130 135 140 GTC GAT TCC CAG CTG TTC ACC ATC TCG CCT CGC CGG CAT GAG ACG GTG 480 Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr lie Sex Pro Arg Arg His Glu Thr Val "1*5 "150 155 160 CAG GAC TGC AAT TGC TC? ATC Tft? CCC GGC CAC ATA ACG GGT CAC CGT 528 Gln Asp Cys Asn Cys Ser lie Tyr Pro Gly His He Thr Gly His Arg 165 170 175 ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCT ACÁ ACG GCC CTG GTG 576 Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 180 185 190 GTA TCG CAß CTG CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG 624 Val Ser Gln Leu Leu Arg He Pro Gln Ala Val val Asp Met Val Ala 195 200 ' 205 GGG GCC CAT TGG GGA GTC CTG GCG GGT CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG 672 Gly Ala His Txp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val 210 215 220 GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTT GCT CCC TAATAG Gly Asa Trp Ala Lys Val Leu He Val Met Leu Leu Phe Ala Pro 7„ 225 230 235 240 27 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 22 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN : 239 aminoácidos (B) TIPO: aminoácidos (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22 : Ket Leu Gly Lys Val lie Asp Thr Leu Thr Cys ßly Phe Ala Asp Lßu 1 5 10 15 Val Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Leu ?la Bis Gly Val ?rg Val Lßu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala 35 40 45 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Pha Ser Xle Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 ' 60 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro ?la Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val 65 70 7S 80 Ser Gly Met Tyr Hie Val Thr Asa ?sp Cys Ser ?sn Ser Ser He Val 85 90 95 Tyr Glu Ala Ala Asp Met lie Mee HÍS Thr Pro Giy Cys Val Pro Cys 100 105 110 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Tbr Pro Thr 115 120 125 Leu ?la ?la ?rg Asa Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His 130 13S 140 Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr He Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val US 150 15 160 Gla Asp Cys Asn Cys Ser tie Tyr Pro Gly His lie Thr Giy His Arg 165 170 173 Met Ala Trp Aßp Mee Kec Het Asn Tr? Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 180 BS 190 Val Ser Gla Leu Leu Arg He Pro Gla Ala Val Vai Asp Met val Ala 155 200 205 Gly ?la His Txp ßly Val Leu ?la Gly Leu ?la Tyr Tyr Ser Bet Val 210 215 220 Gly ?sa Trp ?la Lyß Val Leu He Val Mee Leu Leu Hie Ala Pro 225 230 235 28 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 561 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...558 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...555 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23: 29 ATG TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACÁ TGC GGC TTC GCC GAC CTC 48 Het Leu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe ?la ?ep Leu 1 5 10 15 GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG 96 Vel Gly Tyr He Pro Leu Val Gly Ala Pro Lßu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 c GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG G?G GAC GGC GTG AAC TAT GCA 144 Ala Leu Ala Eis Gly Vai Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala 35 «0 45 ACÁ GGG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG 192 *hr Gly ?sn Leu Pro Gly Cyß Ser Phe Ser He Phß Leu Leu Ala Lßu 50 55 SO CTG TCC TGT CTß ACC GTT CCA GCT TCC GCT TAT G \ GTG CGC AAC GTG 2*0 Leu Ser Cys Leu Tnr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val 65 70 7S 80 TCC GGG ?TG TAC CAT GTC ACG A?C GAC TGC TCC AAC TCA AGC ATT GTG 2S8 Ser Sly Het Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asa Ser Ser He Vai 10 85 90 95 TAT GAG OCA GCG GAC ATG ATC A2G CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC 336 Tyr Glu Ala Ala Asp «et He Bfet Sis Tte Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 GTT CGG G?G AAC AAC TCT TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ACC CCC ACG 384 Val Arg Glu Aßn Asa Ser Ser Aig y* Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 CTC GCA GCT AGG AAC GCC AGC GTC CCC ACC ACG ACÁ ATA CGA CGC CAC 432 Lßu Ala Ala Arg Aßn Ala Ser Val Pro Thr Oí Thr He Arg Arg His 130 135 140 i c GTC G?.T TCC CAG CTG TTC ACC ATC TCG CCT CGC CGG CAT GAG ACG GTG 480 Vil Asp Ser Gln Leu Phß Thr He Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val 145 150 155 160 CAG eac TGC AAT TGC TCA ATC «ur CCC GGC CAC ATA ACG GGT CAC CGT 528 Gln Asp Cys Asa Cys Ser He Tyr Pro Gly His He Thr Gly ais Arg 165 170 175 ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TAATAG 551 Met Ala t=p Asp Mee aet Mee Asa Trp 180 185 0 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 185 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 5 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24; Met Leu Gly Lys Val He Asp Thr Lßu Tiir Cys Gly he Ala Asp Leu 1 5 .10 15 Val Cly Tyr He Pro Leu Vai Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Lßu Ala His Gly Val Arg Val Lßu Glu Asp ßly Val Asn Tyr ?la 25 40 45 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cvs Ser Pbe Ser Xle Phe Leu Leu ?la Lßu 50 55 60 Leu Ser Cyß Lßu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asa Val 85 70 75 80 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asa Ser Ser He Val 8S 90 95 *yr Glu Ala Ala Asp Met He Met His Ttar Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 Val Arg Glu Asn Asa Ser Ser Arg Cys Trp al Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 Leu Ala Ale Arg Asa Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His 130 . 135 140 Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr He Ser Pro ?xg Arg Hia Glu Thr Val 145 150 155 160 Gln Asp Cys Asa Cys Ser He Tyr Pro Gly Kis He Thr Gly Bis Arg 165 170 175 Ket ?la Trp ?sp Met Met Mee Asa Trp 180 185 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 606 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 31 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...603 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_pe tide (B) LOCALIZACIÓN: 1...600 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25: ATG TTG GOT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACÁ TGC GGC TTC GCC GAC CTC 48 Ket Leu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe ?la Asp Leu 1 5 10 15 GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGC GGC GCT GCC AGG 96 Val Gly Tyr He Pro Lßu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala ?la Arg 20 25 30 GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC CTG AAC TAT GC? 144 ?la Leu ?la Hia Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asa r Ala 35 __ 40 45 ACÁ GGG AAT TTG CCC GGT TOC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG 192 Thx Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser He Phe Leu Leu ?la Leu 50 55 60 CTG TCC TGT CTG ACC ßTT CCA GCT TCC GCT TAT GAA GTS CGC AAC GTG 240 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 32 TCC GGG ATC TAC CAT GTC A8 J?C GaC TOC Ttt AAC TCAAOC ATT CTC 2S8 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asa ?sp Cys Ser Asa Ser Ser He Vai 85 90 95 TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TK "336 Tyr Giu Ala Ala Asp Ser He Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 GTT TOG GAG AAC AAC TCT TCC CGC TGC TGG GTA GCG CTC ?CC CCC ACG 384 Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr US 120 125 CTC GCA GCT AGG A?C GCC ?SC GTC CCC ACC ACG AC? ATA CG? CGC CAC 432 Leu Ala Ala Arg ?sn Ala Ser Val Pro Thr Thr ?hr He Arg Arg His U0 135 140 GTC GftT TCC CAG CTG TTC ACC ATC TCG CCT CGC CGG C?T GAG ACG GTG 480 Val Asp Ser Gln Lßu Phß Thr He Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val 145 150 1S5 160 CAG GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC C1C AT? ACG GGT CAC CGT "5?ß Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ha Tyr Pro Gly His He Thr Gly His Arg 165 170 175 ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCT ACÁ ACG GCC CTG GTG Mßt Ala Trp Asp Mee Mee Mee Asa Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 180 185 130 GTA TCG CAG CTG CTC CGG ATC CTC TAG 606 val Ser Gla Leu Leu Arg lie Leu 195 200 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 200 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26: 33 Het Leu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Ttr Cys Gly hß Ala Asp Leu • .A- 5 10 15 Val Gly Tyr He Pro Leu Val Gly Ala Pro Lßu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 Ala Leu Ala His Giy Val Arg val Leu Glu Asp Gly Val Asa Tyr Ala 35 40 45 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Xle Phe Leu Leu Ala Leu 50 55 60 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala ?yr Glu Val ?rg Asn Val 65 70 75 80 Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser He Val 85 SO 95 Tyr Glu Ala Ala Asp Bet He Kßt His Thr Pro Gly Cyß Val Pro Cys 100 105 110 Val Arg Glu Asa ?sa Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115 120 125 Lßu Ala ?la Arg Asa Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His 130 135 140 Val Asp Ser Gia Leu Pbß Thr He Ser Pro Arg Axg His Glu Thr Val 145 150 155 160 Gla Asp Cyß Asn Cys Ser He Tyr Pro Gly His He Thr Gly His Arg 165 170 175 Het Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 180 185 190 Vsl Ser Gln Lßu Leu Arg He Leu 195 200 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 636 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA 34 (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...633 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...630 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27: ATG TTG GGT AAG GTC ATC GAT ?CC CTT ACÁ TGC GGC TTC GCC GAC CTC 48 Met Leu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala ?sp Leu 1 5 10 15 GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG "96 Val Gly Tyr He Pro Leu Val Gly Ala Pro Lßu Gly ßly Ala Ala Arg 20 25 30 GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ~144 Ala Leu Ala His Gly Val Arg Vel Leu Glu Asp Gly Vai Asn Tyr Ala 35 40 45 AC? GGG ??T TTG CCC GCT TGC TCT ?TC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG 192 Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser lie Phe Leu Lßu ?la Leu 50 55 60 CTG TCC TGT CTG ACC GTT CC? GCT TCC GCT TAT GAA GTG CGC AAC GTG 240 Leu Ser Cys Leu Thr Val ro Ala Ser Ala Tyr Glu Val ?rg ?sn Val 65 70 75 80 TCC GGG ATG TAC CAT GTC ACG ?AC GAC TGC TCC AAC TC? AQC ATT GTG 288 Ser Gly Het Tyr Kis Val Thr ?sn Asp Cys Ser ?sn Ser Ser Zle Val 85 90 95 TAT GAG GC? GCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC 336 Tyr Glu ?la Ala ?sp Mat He Met Eiß Tfcr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 GTT CGG GAG AAC AAC .TCT TCC CGC TGC TSG GEA GCG CTC ACC CCC ACG 384 Val Arg Giu Asa ?sa Ser Ser ?rg Cys Tr? Val Ala Leu Thr Pro Thr H5 120 125 CTC GC? GCT AGG AAC QCC AOC GTC CCC ACC ACG AC? ?TA CGA CGC CAC 432 Leu Ala Ala Arg Asn ?la Ser Val Pro Tfcr Thr Thr lie ArgArg His . 130 135 140 GTC GAT TCC CAB CTG TTC ACC ?TC TC3 CCT CGC CGG CAT GAG ACG GTG 480 Vai Asp Sex Gln Leu Phe Thr He Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val 145 150 155 160 CAG GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC ATA ACG GGT CAC CGT 528 Gla Asp Cys Asn Cys Ser He Tyr Pro Gly «íis He Thr Gly His Arg 165 170 175 ATG GCT TGG GAT ATS ATG ATG SAC rßS TCS CCT ACÁ ACS GCC CTG GTG 576 Met Ala Trp Asp Met Mee Met Asn r=p- Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 180 185 190 GT? TCG CAG CTG CTC CGG ATC G?G ?CC GAG GGC AGA CAC CAT CAC CAC 624 Val Sar Gln Leu Lßu Arg Ha Val ríe Glu Gly Arg His His His His • 195 . 200 205 CAT CAC TAATAG 636 His His 210 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 210 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina 36 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28 : Met Leu Gly Lys val lie Asp Thr Leu Thr Cys Gly ph* ?la ?sp Leu 1 5 10 15 Val Gly Tyr He Pro Lea Val Giy Ala Pro Leu Gly Gly Ala ?la Arg 20 25 30 Ala Leu Ala His Gly Val ?rg Val Lßu Glu Asp Gly Val Asa Tyr Ala 40 45 Thr Gly ?sn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser He Phe Leu Leu Ala Leu 50 * 55 60 Leu Ser Cys Leu Tur Val Pro Ala Ser Ala Tyr ßlu Val Arg Asn Val 65 70 75 80 Ser Gly Met lyr His Val Thr Asn Asp Cyß Ser Asa Ser Ser He Vai 85 90 95 Tyr Glu ?la Ala Asp Mee lie Hßt His Tfar Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 Val ?rg Glu Ase Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 115. 120 125 Leu Ala Ala Arg ?sn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg ais 130 135 140 Val Asp Ser Gln Leu Phe thr He Ser Pro Arg Arg Kis Glu Thr Val 145 150 155 160 Gln Asp Cys Asn Cys Ser lie Tyr Pro ßly His He Thx Gly His Arg 165 170 175 Mee Ala Tsp Asp Met Met «ec Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val 180 IBS 190 Val Ser Gla Leu Lßu Arg He Vai He Glu Gly Arg Kis His His ?ia 195 200 205 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 630 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 37 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA^ NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...627 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...624 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29: 38 ATS GGT A?G GTC ATC GAT ACC CTT ACG TGC GGA TTC GCC GAT CTC ATG 48 Hec Cly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cya Gly Phe Ala Asp Leu Ket 1 5 10 15 GGG TA ATC(XGCTC(3TC 8CGCTCCCsTAGGAGGC Í? GCA AG? GCC 96 Gly Tyr He Pro Leu Val Gly ?la Pro Val Gly Gly Val Ala Arg Ala 20 25 30 CTT GCG CAT GGC GTG AGG GCC CTT GAA GAC GGG AT? AAT TTC GCA AC? 144 Lau ?la His Gly Val Arg Ala Leu Glu Asp Gly He Asa Phe ?la Thr 35 40 43 GGG AAT TTG CCC GGT TGC TOC TTT TCT ATT TTC CTT CTC GCT CTG TTC 192 Gly Aßn Leu Pro Gly Cys Ser Pbe Ser Zle Phe Leu Leu ?la Leu Phe 50 55 60 TCT TGC TTA ATT C?T CC? GCA TCT AGT CTA- G?G TGG CGG ?AT ACG TCT "240 Ser Cys Leu He His Pro Ala Ala Ser Leu-Glu Trp ?rg Asa Thr ser 65 70 75 80 GGC CTC TAT GTC CTT ACC AAC GAC TGT TCC AAT AGC AGT ATT GTG TAC 288 Gly Leu Tyr Val Leu Thr Asn As? Cys Ser Aso Ser Ser He val Tyr 85 90 95 GAG GCC GAT GAC GTT ATT CTG CAC ACÁ CCC GGC TGC ATA CCT TGT GTC 336 Glu Ala Asp Asp Val He Leu His Thr Pro Gly Cys He Pro Cys Val 100 105 110 CAG G?C GGC A?T ACÁ TCC ACG TGC TGG ACC CCA GTG AC? CCT ACÁ GTG 381 Gln Asp Giy Asn Thr Ser Thr Cys Trp ftr Pro vai Tiir Pro Thr Val 115 120 ir3 GCA GTC AAG TAC GTC GGA GCA ACC ACC GCT TCG ?TA CSC AGT C?T GTG «32 ?la Val Lys Tyr Val Gly ?la Thr Tir Ala Ser He ?rg Ser Kis Val 130 135 140 G?C CT? TT? GTG GGC GCG GCC ACG ATG TGC TCT GCG CTC TAC GTG GGT 480 Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Thr Mee Cys Ser Ala Leu Tvr Val Gly 145 150 155 160 GAC AXG TGT GGG GCT GTC TTC CTC GTG GS? C?A GCC TTC ACG TTC AGA 52B ?sp Het Cys Gly Ala Val Phe Leu Val Giy Gln Aia Pie Thr Phe Arg 165 170 175 CCT CGT CßC C?T CAA ACG GTC CAß ACC TGT AAC TGC TCS CTG TAC CCA '576 Pro Arg Arg His-Gln Thr Val Gln Thr Cys Asn Cys Ser Leu Tyr Pro 180 185 190 GGC car CTT TCA GSA CAG CGA ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC GG "624 Gly His Leu Ser Gly His Arg Set ?ia Trp Asp Hez aer Jíet ?sn Trp 195 200 103 TAATAG "634 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 30 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 39 (A) EXTENSIÓN: 208 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30: Ket Gly Lys Val He ?sp Kir Leu Tfcr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Het 1 5 10 15 Gly Tyr He Pro Leu al Gly Ala Pro val Gly Gly Val Ala Arg Ala 20 25 30 Leu Ala Bis Cly Val Arg ?la Leu Glu Asp Giy He ?sn Phe Ala Thr 35 40 45 Gly Asn Leu Pro Giy Cys Ser Phe Ser He Phe Leu Leu Ala Leu Phe 50 55 60 Ser Cys Leu Zle His Pro Ala Ala Ser Lßu Glu Trp ?rg Asa Thr Ser 65 70 75 B0 Gly Leu Tyr Val Leu Thr Asn Asp C s Ser Asa Ser Ser He Val Tyr 85 90 95 Glu Ala Asp Asp Val He Lßu His Thr Pro Gly Cyß He Pro Cys Val 100 105 110 Gln Asp Gly Asa Thr Ser Thr Cys Trp Thr Pro Val Thr Pro Thr Val 115 120 125 Ala Val Lys Tyr Val Gly ?la Thr Thr Ala Ser He Arg Ser His Val 130 135 :40 Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Str Het Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly 145 150 155 160' ?sp Met Cys Gly Ala Val ?hß Leu Val Gly Gla ?la Phe Thr Phe Arg 165 170 175 Pro Arg Arg His Gla Thr Val Gln Thr Cys ?sz Cys Ser Leu Tyr Pro 180 185 190 Gly Bis Leu Ser Gly His ?rg Met Ala Trp ?sp Hez Het Het ?sn Trp 195 200 205 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 40 (A) EXTENSIÓN: 630 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 627 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_pepti e (B) LOCALIZACION: 1...624 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31: 41 ?TG GGT AAG GTC ?TC G?T ?CC CTA ACG TGC GGA TTC GCC GAT CTC ?TG 48 Het Gly Lys Val Zle Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe ?la ?sp Leu Met 1 5 10 15 OSG T?T ATC CCG CTC GTA GGC GGC CCC ATT GGG GCC GTC CCA AGG GCT 96 ßly Tyr He Pro Leu Val Gly Gly Pro He ßly Cly Val Ala Arg Ala 20 25 30 CTC GC? CAC GGT GTG AGG GTC CTT G?G GAC GGG GTA AAC TAT GCA ACÁ 144 Lßu ?la His Gly Val ?rg Val Leu Giu ?sp Gly Vai Asn Tyr Ala rhr 35 40 45 GGG AAT TTA CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTT ATT CTT GCT CTT CTC 192 Gly ?sn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Sex Ha Phß He Leu Ala Leu Leu 50 55 60 TCG TGT CTS ACC GTT CCG GCC TCT SC? GTT CCC T?C CGA ?AT GCC TCT 240 Ser Cys Leu Thr Val Pro ?la Ser Ala Val Pro Tyr Arg Asa ?la Ser 65 70 75 80 GGG ATT T?T CAT GTT ACC AAT G&T TGC CC? A?C TCT TCC ATA GTC TAT 288 Gly He Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser He Val Tyr 85 90 95 GAG OCA G?T A?C CTG ATC CTA CAC GCA CCT GGT TGC GTG CCT TGT GTC 336 Glu Ala ?sp ?sn Leu He Leu Kis Ala Pro Gly Cys Val Pro Cys Val 100 105 110 ATG ACÁ GGT AAT GTG AGT AGA TGC TGG GTC CAA ATT ACC CCT ACÁ CTG 384 Met Thr Gly Asn Val Ser Arg Cys Trp Val Gla He Thr Pro Thr Leu 115 120 125 TCA GCC CCG AGC CTC GGA GCA GTC ACS GCT CCT CTT CGG AGA GCC GTT 432 Ser Ala Pro Ser Leu Gly Ala Val Thr Ala Pro Leu Arg Arg Ala Val 130 135 140 • GAC TAC CT? GCG GG? GGG GCT GCC CTC TQC TCC GCG TT? TAC GTA GG? 480 Asp Tyr Lßu Ala sly Gly Ala Ala Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly 145 150 155 160 GAC GCG TGT GGG GCA CTA TTC TTG GTA GGC CAA ATG TTC ACC TAT AGß 52B ?sp Ala Cys Gly Ala Leu Phe Leu Val Gly Gin Het Phe Thr Tyr Arg 165 170 175 CCT CX CAG CAC GCT ACG GTG CAS AAC TGC A?C TGT TCC ATT TAC AGT 576 Pro Arg Gin His Ala Thr Val Gln ?sn Cys Asa Cys Ser He Tyr Ser 180 185 190 GGC CAT GTT ACC GGC CAC CGS ATG GCA TGG SAT ATG ATG ATG AAC TGG 624 Gly Hiß Val Thr Gly His Arg Met ?la Trp Asp Met Het Met Asn Trp 195 200 205 TAATAG 630 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 208 aminoácidos 42 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32 : Met Gly Lys Val Zle ?sp Thr Leu Bu- Cys Gly Phe Ala ?sp Leu Mee 1 5 10 15 Gly Tyr He Pro Leu Val Gly Gly Pro Xle Gly Gly Val Ala Arg Ala 20 25 30 Leu Ala His ßly Val Arg Val Leu Glu ?sp Gly Val Asa tyr Ala Thr 35 40 45 Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser He Phe He Leu ?la Leu Leu 50 55 60 Ser Cys Leu Thr Ved Pro ?la Ser Ala Val Pro Tyr Arg Aßn ?la Ser 65 70 75 80 Gly He Tyr His Val Thx Asn Asp Cvs Pro Asa Ser Ser He al Tyr 85 90 9S Glu Ala Asp ?sn Leu He Leu HAS Ala Pro Gly Cys Vai Pro Cys Vai 100 105 U0 Het «ir Gly Ase Val Ser Arg Cys Trp Val Gla He Thr Pro Thr Lßu 115 120 125 Ser Ala Pro Ser Leu Glv ?la Val Thr Ala Pro Leu Arg ?rg Ala Val 130 135 140 Asp Tyr Leu Ala Gly Gly ?la Ala Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly 145 150 155 160 Asp Ala Cyß Gly Ala Leu Phß Leu Val Gly Gln Mßt Phe Thr Tyr Arg 165 170 175 Pro Arg Gln His Ala Thr al Gla Asa Cys Asn Cys Ser He Tyr Ser 180 185 190 Gly Kis Val Thr Gly Kis Arg Met ?la Trp Asp Het Met Met Asn Trp 195 200 205 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única 43 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33: TGGG?lATGA TG?TGAACTG GTC 23 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO 44 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 34 CTATEATGGT GGTAAGCCAC AG?GC?GG?G 30 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 1476 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO ( iii) CODIFICADOR? : NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...1473 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...1470 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 35: 45 TGG GAT ATG ATG ?TG A?C TGG TOG CCT ACÁ ACG GCC CTG GTG CT? TCG 8 Tro Asp Met Met Met ?sn Trp Ser Pro Thr Tfcr Ala Leu Vai Val Ser 1 5 10 15 CAG CTS.CTC CGG ?TC CCA CA? GCT GTC GTG GAC ATG GTG GCG SGG GCC 96 Gis Leu Leu ?rg Zle Pro Gln ?la Val Val ?sp Het Val Ala Giy ?la 20 25 30 CAT TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTC GCC TAC TST TCC ATG GTG GGG ?AC 144 Eis Trp Gly Vai Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser «et Val Gly Asn 35 40 45 TCG GCT AAG GTT TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTC GCC GGC GTC G?C GGG 192 Trp ?la Lys Val Leu Val Val Het Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly 50 55 60 CAT ?CC CGC GTG TCA GGA GGG GCA OCA GCC TCC GAT ACC AGG GGC CTT 240 His Tbr ?rg Val Ser Gly Gly Ala ?la ?la Ser *s? "Sir Arg Gly Leu 65 70 75 80 CTS TCC CTC TTT AGC CCC GGG TCG GCT CAG A&? ?TC C?G CTC GTA AAC 288 Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser ?la Gin Lys ríe -31a Leu Val Asn 85 90 95 ACC AAC GGC AGT TOS CAC AGC ?AC AGG ACT GCC G AAC TGC AAC GAC 336 b ?sn Gly Ser Trp Sis Zlß Ass Arg Thr Ala le Asa Cys ?sn Asp • 100 105 110 TCC CTC CAA AC? GGG TTC TTT GCC SC? CTA TTC TAC AAA CAC AAA TTC 384 Ser Leu Gla Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe ryr Lys Eis Lys Phe 115 120 125 AAC TCS TCT GGA TGC CCA GAG CGC TTG GCC AGC TGT CSC TOC ATC G?C 432 Asn Ser Ser ßly Cyß Pro Giu Arg Leu Ala Ser Cvs ?rg Ser He Asp 130 135 140 ¡ja rrc ser CAG GGG TGG GGT CCC ere AC TAC ACT G?G CCT AAC AGC 4ßo Lys Phe Ala Gla Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Chr Glu Pro Asn Ser 145 150 155 160 TCG GAC CAG AGG CCC TAC TGC TGG CAC TAC GCG CCT CG? CCG TGT GGT 528 Ser Asp Gin.Arg Pro Tyr Cyß Trp Hie Tyr Ala Pro Arg Pro Cvs Gly 165 170 175 AST GT? CCC GCG TCT CAG GTG TGC GGT CC? GIG T?T TGC TTC ?CC CCG 576 He Val Pro ?la Ser Gla Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro 180 185 190 AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGG TTT GGT GTC CCC ACG TAT 624 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Pha Gly Val Pro Thr Tyr ¿95 ' 200 205 AAC TGG GGG GCG A?C GAC TCG GAT GTG CTG ATT CTC ?AC AAC ?CG CGG 672 Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser ?sp Val Lßu He Leu Asa Asn Thr Arg 210 215 220 CCG CCG CG? GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACÁ TGG ?TG A?T GGC ACT GGG 720 Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cy» Tk= T*P 2tßt ?sn Gly Thr Gly 225 230 235 240 TTC ACC AAG ACG TGT GGG GGC CCC CCG TOC AAC ATC GGG GGG GCC GGC 768 Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asa He Giy Gly Ala Gly 245 250 255 46 AAC AAC ACC TTG ACC TGC CCC ACT GAC TGT TTT CGG AAG CAC CCC GAG 815 ?sn Asa. Thr Leu Thr Cys Pro Ttr ?sp Cys Phe Arg Lys HÍS Pro Clu 260 265 270 SCC ACC TAC GCC AGA TGC GCT TCT GGG CCC.TGG CTG ACÁ CCT AGG TGT 864 Ala ?tor Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys 5 . 275 280 285 ?TG GTT CAT TAC CCA TAT AGG CTC TGG CftC TAC CCC TGC ACT GTC A?C 912 Mefc Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val ?sn 290 295 300 TTC ACC ?TC TTC ??G GTT AGG ?TG TAC GTG GGG GGC GTG G?G C?C AGG 960 Phe Tbr He Phe Lys Val ?rg Het Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 305 310 ^ 315 320 TTC G?? GCC GCA TGC A?T TGG ACT CGA GGA SAG CCT TGT GAC TTG GAS 1008 Phe Glu Ala Ala Cys Asa Trp Thr Argr Gly Glu ?rg Cys ?sp Leu Glu 325 330 335 10 G?C ASG GAT ASA TCA GAG CTT AGC CCG CTG CTG CTG TCT ACÁ ACÁ GAG 1055 ?sp ?rg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Giu 340 34S 350 TGG C?G ATA CTG CCC TGT TCC TIC ACC ACC CTG CCS GCC CTA TCC ACC 1104 Trp Gln He Lßu Pro Cys Ser Phß Thr Tbr Leu Pro Ala Leu Ser Tbr 355 360 365 GGC CTS ?TC CAC CTC C?T CAG A?C ?TC GTG GAC CTG CA? TAC CTG TM 1152 Gly Leu Zie HÍS Leu His Gin Asn lie Val Asp Val Gln Tyx Leu Tvr 370 375 380 GGT GT? GGG TCG GCG GTT GTC TCC CTT GTC ATC AAA TGG GAG TAT GTC 1200 i c Gly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val lie Lya Trp Glu Tyr Val 385 390 395 400 CTG TTG CTC TTC CTT CTC CTG GC? GAC GCG CGC ?TC TGC GCC TGC TTA 1248 Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu ?la ?sp ?la ?rg He Cys Ala Cys Leu 405 410 415 TGG ATG ATG CTG CTG ATA GCT CAA GCT GAG GCC GCC TTA GAG AAC CTG 1296 Trp Het Het Leu Leu Xle ?la Gla ?la Glu ?la ?la Leu Glu ?sn Leu 420 425 430 GTG GTC CTC ??T GCO GCG GCC GTG GCC GGG GCG C?T GGC ACT CTT TCC 1344 Val Val Leu ?sn ?la ?la Ala Val ?la Gly ?la His Gly Thr Leu Ser 435 440 445 0 TTC CTT GTG TTC TTC TGT GCT GCC TGG TAC ?TC AAG GGC ?GG CTG GTC 1332 Phe Lßu Val Pxie Phe Cys Ala Ala Trp Tyr lie Lys Gly Arg Leu Val 450 455 460 CCT GGT GCG GC? T?C GCC TTC T?T GGC GTG TGG CCG CTG CTC CTG CTT 1440 Pro Gly ?la ?la Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu 465 470 475 480 CTG CTG GCC TT? CCA CCA CGA GCT TAT GCC TAGTAA 14T6 Leu Leu ?la Leu Pro Pro rg Ala yr Ala 48S 490 5 47 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 36 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 490 aminoácido 5 (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 36 : Trp ?sp Het Met Met Asa Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser 1 5 10 15 i ? Ola Lßu Leu Arg lie Pro Gis ?la val Val Asp Mee Val ?la Gly Ala 1 W - 20 25 30 His Trp Gly Val Lßu ?la Gly Leu Ala ?yr lyr Ser Mac Val Gly Asa 35 40 45 Tx? ?la Lys Val Leu Val Val Het Leu Leu She ?la Gly Val As? Gly 50 55 60 His Thr ?rg Val Ser Gly Sly ?la Ala ?la Ser ?sp Thr ?rg Gly Leu 65 70 75 80 Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser ?la Gln Lys He Gis Leu Val ?sn 85 90 95 Thr Asa Gly Ser Trp His lie ?sp Arg Thr Ala Lew Asn Cys ?sn ?sp 15 100 105 110 Ser Leu 31n Thr Gly' Phe Phe ?la Ala "Leu Phs Tyr Lys His Lys Pha 115 120 125 ?sn Ser Ser Gly Cys Pro Clu ?rg Leu ?la Ser Cys Arg Ses lie ?sp 130 1135 140 Lys Plat ?la Gln ßly Trp ßly Pro Leu Thr Tyr Tbr Glu- Pro ?sn Ser 145 150 155 160 Ser ?sp Gln ?rg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro ?rg Pro Cys Gly 165 170 175 lie Val Pro ?la Ser Gln Val Cy» Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro 180 185 190 0 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr ?sp ?rg Phe Giy Val Pro «ir Tyr 195 200 205 ?sa Txp ßly Ala ?sn Asp Ser ?sp Val Lau lie Leu Ase ?sn Thr Arg 210 315 220 Pro Pro ?rg Gly ?sn Trp Phß Gly Cyß Tbr Trp Met ?sn Gly "Ore sly 225 230 235 240 Phß Tfcr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn lie Sly Gly ?la Gly 245 250 255 ?sn Aso Thr Leu Thr Cy» Pro Tbr ?sp Cys Phe Arg Lya His Pro Glu 260 265 270 ?la Ite Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys 5 48 275 280 2S5 Met Val His Tyr Pro T^r Arg Les Trp Eis r Pro cys Thr Val Asn 290 . 295 300 Phe TBr lie Phe Lys Val ?rg Hec Tyr Val Gly Gly Val Glu Eia ?rg 305 310 315 320 Phe Glu ?la ?ia Cys ?as Trp Thr Arg Gly Glu ?rg Cys Asp Leu Glu 325 330 335 Asp Arg Asp ?rg Sor Glu Leu Ser Pro Lea. Leu Leu Sar Tbr Thr Glu 340 345 350 Txp Gis Zle Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro ?la Leu Ser Tbr 355 360 365 Gly Leu Zle His Leu His Gla ?sn Xle Val Asp Val Gin Tyr Leu Tyr 370 375 380 Gly Vai Glv Ser Ala Val Val Ser Leu Val lie Lys Trp Glu Tyr Val 385 390 395 400 Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ale ?sp ?la Arg Zlß Cys Ala Cys Leu 405 410 415 Trp Het Het Leu Leu Zle Ala Glr. ?la Glu Ala Ala Leu Glti Asn Leu 420 425 430 Val Val Leu Asn Ala ?la Ala Val Ala Gly ?la His Gly Thr Leu Ser 435 ' 440 445 Phe Leu Val Phß Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Zlß Lys Giy Arg Leu Val 450 455 460 Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu 465 470 47S 4S0 Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg ?la Tvr Ala 485 490 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 1021 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA 49 (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 2...1018 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 2...1015 (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 37: 50 G ATC CC?"CA? GCT GTC GTG G?C ATS GTG GCG GGG GCC CAT TGG GSA 46 lia Pro Gln ?la Val Val ?sp Het: Val ?la Gly Ala His Trp Gly 1 5 10 15 GTC CTG GCG GGC CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG A?C TGG GCT ??G 94 Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr lyr Ser Hßt val Gly Asn Trp Ala Lys 20 25 30 GTT TTG GTT GTG ATG CT? CTC TTT GCC GGC GTC GAC GGG C?T ACC CGC 142 Val Leu Val Val Met Leu Leu Ehe Ala Gly Val ?sp Gly Kis Thr Arg 35 40 45 GTG TC? GGA GGG GC? GC? GCC TCC GAT ?CC AGG GGC CTT GTG TCC CTC 190 Val Ser Gly Gly Ala ?la ?la Ser ?sp Thr Axg Gly Leu Val Ser Leu 50 55 60 TTT AGC CCC GGG TCG GCT CAE AAA ATC C?G CTC GTA AAC ACC AAC 3GC 238 Phe Ser Pro Gly Ser Ala Glp Lys ríe lz Leu Val ?sn Thr ?sn Giy 65 70 75 AGT TGG CAC ?TC ?AC AGG ACT GCC S AAC TOC AAC GAC TCC CTC CAA 286 Ser Trp His lie ?sn Arg Thr Ais Leu Asn Cys Asa ?ßp Ser Leu Gia 80 85 90 95 ACÁ GGG TTC TTT GCC GCA. CTA TTC TAC SAA CAC SAA. TTC AAC TCG TCT 334 Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser 100 105 110 GGA TGC CCA G?G CSC TTG GCC AGC TGT CGC TCC ATC GAC AAG TTC GCT 382 Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser lie Aso Lys Phe Ala 115 120 125 CAG GGG TGG GGT CCC CTC ACT TAC ACT G?G CCT ?AC AGC TCG GAC CAG 430 Gin Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu ?ro ?sn Ser Ser ?ep Gis. 130 135 140 AGG CCC TAC TGC TGß CAC TAC GCG CCT CGA CCG TGT SGT ATT GTA CCC 478 Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr ?la Pro ?rg Pro Cys Gly lie Val Pro 145 150 1S5 GCG TCT CAG GTG TGC GGT CC? GTG T?T TGC TTC ACC CCG AGC CCT ßTT 526 ?la Ser Gla Vai Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 160 165 170 175 GTG GTG GGG ACG ?CC GAT CGG TTT GGT GTC CCC ACG TAT ?AC TGG GGG 574 Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Giy Val Pro Thr Tvr ?sn Tro Glv 180 193 190 GCG AAC GAC TCG GAT GTG CTG ATT CTC AAC A?C ACG CGG CCG CCG CGA 622 Ais Asn ?sp Ser ?sp Val Leu lie Leu A&z. Asn Thr Arg Pro Pro Are 195 200 205 GGC AAC TGG TTC GGC TGT AC? TGG ?TG AAT GGC ACT GGG TTC ACC AAG 670 Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Het Asa Gly Thr Gly Phe Thr Lys 210 215 220 ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC ATC GGG GGG GCC GGC A?C AAC ACC 718 Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn lie Gly Gly Ala Giy Asn Asn Thr 51 225 230 235 TTG ACC TGC CCC ACT G?C TG» TTT CGG AAG CAC CCC GAG GCC ACC TAC 766 Leu Tbr Cys Pro Thr ?sp Cys Phe Arg Lys His ro Glu Ala Thr Tyr 240 245 250 2S5 QCC AGA TOC GGT TCT GGG CCCTGCCTGAC?CCTAßG TGT ATG GTT CAT 814 ?la ?rg Cys Gly Sar Giy Pro Trp Leu Thr Pro ?rg Cys Mee Val Eis 260 265 270 TAC CC? TAT AGG CTC TGG C?C T?C CCC TBC CT GTC ?AC TTC ACC ?TC 862 Tyr Pro Tyr ?rg Leu Trp Bie Tyr Pro Cyß Thr Val ?sn Phß Thr ?iß 275 280 265 TTC ??G ßTT ?GG ?TG TAC GTG GSG GGC GTG GAG CAC AOG TTC G?A GCC 910 Phe Lys al Arg Mee Tyr Val Gly Gly Val .Glu His Arg Phß ßlu Ala 290 295 ' 300 GCA TGC AAT TSG ACT CGA GGA GAG CGT TOT G?C TTG GAG G?C AGG GAT 958 Ala Cys Asn Trp Ttr ?rg Gly Glu ?rg Cys Asp Lßu Glu Asp Arg Asp 305 310 315 AGA TCA GAGCTTAGC CCGCTGCTGCTGTCTACAAC?GAGTGGC?G?GT 1006 Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ser 320 325 330 335 GGC ASA GCT TAATTA 1021 Gly ?rg Ala (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 38 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 338 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 38: 52 lie Pro Gln Ala Val Val Asp Mee Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 1 5 10 is Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Kat Val Gly ?sn Trp Ala Lvs Val 20 25 30 " Lßu Val Val Het Lßu Leu Phe Ala Gly Val Aso Gly His Thr Ars Val 35 40 " 45 Ser Gly sly Ala Ala Ala Ser ?sp «u- ?rg Gly Leu Val Ser Lau Phe 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys lie Gln Leu Val Asn Thr Aßn Gly Sar 6S 70 75 80 Trp Ris lie Asn Axg ?r Ala Lßu Asn Cys Asn Asp ser Lßu Gla -"hr 85 go 95 Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phß Tyr Lys Kis Lvs Phß Asn Ser Ser Gly 100 105 no Cys Pro Glu ?rg I*u ?ia Ser Cyß ?rg Ser lia ?sp Lys Phe Ala Gla J.1S 120 125 Gly Txp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser ?sp Gln ?rg 130 - 135 140 Pro TJ Cys Trp His Tyr Ala Pro ?rg Pro Cys Gly lie Val Pro Ala 145 150 155 160 Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cyß Phß Thr Pro Ser Pro Val Val 165 170 175 Val ßly Thr Thr Asp Arg Phß Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Cly Ala 180 185 190 Asa Asp Ser Asp Val Leu lie Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly 195 200 205 Aan Trp Phe Gly Cys Thr Trp Set Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn lie Gly Gly Ala Gly ?sn ?sn Thr Leu 225 230 235 240 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala 245 230 253 Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Het Val His Tyx 260 265 270 Pro y Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr lie Phe 275 280 285 Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val ßlu His ?rg Phß Glu Ala Ala 230 295 300 Cys Asa Trp Thr ?rg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg 305 310 315 320 Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gla Ser Gly 325 330 335 Arg ?la (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 39: 53 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 1034 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 2...1032 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 2...1029 <xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 39: 54 G ATC CC? C?A GCT GTC GTG GAC TG GTG GCG GGG GCC CAT TGG GS& 46 lie Pro Gln Ala Val Val Asp Mee Val ?ia Gly Ala Kis Trp Gly 1 5 10 15 GTC CTG GCG GGC CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG "94 Vel Leu Ala Gly Leu ?la Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys- 20 25 30 GTT TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTC G?C GGG CAT ACC CGC 142 Val Leu Val Val Mee Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg 3S 40 45 " GTG TCA GGA GGG GCA GCA GCC TCC G?? ACC AGG GGC CTT GTG TCC CTC "190 Val Ser Gly Gly Ala Ala ?la Ser Asp Thr Arg Giy Leu Val Ser Lau 50 55 60 TTT A?C CCC GGG TCG GCT CAG AAA ATC CAG CTC GTA AAC ACC AAC GGC 238 Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gin Lys lie Gin Leu Val Asa Thr Asn Gly 65 70 75 AGT TGG CAC ATC AAC AGG AC? GCC CTG AAC TGC AAC GAC TCC CTC CAA 286 Ser Trp His lie Asn Ar Thr Ala Leu Asa Cys Asn Asp Ser Leu Gin 80 85 90 95 ACÁ GGG TTC TTT GCC GCA CTA TTC TAC A?? CAC AAA TTC AAC TCG TCT 334 Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asa Ser Ser 100 105 110 GGA TGC CCA GAG CGC TTG GCC AGC TGT CGC TCC ATC GAC AAG TTC GCT 382 Gly Cys Pro Glu Arg Lau Ala Ser Cvs Arg S^r lie Asp Lys Phe Ala 115 120 125 CAß GGG TGG GGT CCC CTC ACT TAC ACT GAG CCT AAC AGC TCG GAC CAG 430 Gla Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln 130 . 135 140 AGG CCC TAC TGC TGG CAC TAC GCG CCT CGA CCG TGT GGT ATT GTA CCC "478 Arg Pro Tyr Cys Trp HÍS TV Ala Pro Arg Pro Cys Gly lie Val Pro 145 150 155 GCG TCT CAG GTG TGC GGT CCA GTG TAT TGC TTC ACC CCG AGC CCT GTT "526 Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val 160 165 170 173 GTG CTG GGG ACG ACC GAT CGG TTT GGT GTC CCC ACG TAT AAC TGG GGG 574 Vel Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tvr Asa Trp Gly 1S0 185 190 GCG ?AC GAC TCß GAT GTG CTG ATT CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCG CGA 622 Ala Asa Asp Ser Asp Val Lau lie Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg 195 200 205 55 GGC ?AC TGG TTC GGC TGT ACÁ TGG ATG AAT GSC ACT GGG TTC ?CC AAG 670 Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp He: Asa Gly Thr Cly Phß Thr Lys 210 215 220 ACG TGT GGG GGC CCC CCG TGC AAC ?Z GGG GGG GCC 63C AAC ?AC ACC 718 Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asa Z e Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr 225 230 235 •TTG ACC TGC CCC ACT GAC TC? TTT CGG AAG CAC CCC G?G GCC ACC TAC 766 Lßu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg lys Eis Pro Glu Ala Thr Tyr 240 245 250 255 GCC AGA TGC GST TCT GGG CCC TGG C?G ACÁ CCT AGG IGT ATG GTT CAT 814 Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Het Val Hiß 260 265 270 TAC CC? T?T ?GG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GTC A?C TTC ACC ATC 862 Tyr Pro Tyr ?rg Leu Trp His' Tyr Pro Cys Thr Val ?sa Phe Thr lie 275 280 285 TTC AAG ßTT AGG ATG TAC GTß GGG GGC GTS ®G CAC AGG TTC G?? GCC 910 Phe Lys Val Arg Het Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Pbe Glu ?la 290 295 300 GC? TGC AAT TGG ?CT CGA GG? GAG CST TGT GAC TTG G?G G?C AGG GAT 958 Ala Cys ?sn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp 305 310 315 AGA TCA GAG CTT ?GC CCG CTG CTG CTG TCT AC? ACÁ GGT GAT CGA GGG 1006 Arg Ser Glu Leu Ser Pro Lßu Lßu le Ser Thr Thr Glv Aep Arg Gly 320 325 330 335 C?G ACÁ CCA TCA CCA CCA TC? CTA AT AG 1034 Gln Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu 340 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 343 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 40: 56 lie Pro Sin Ala Val al Asp Mßt Vai Ala Gly ?la Hiß Trp ßly Vai 1 5 10 15 Leu Ala ßly Lßu ?la Tyr Tyr Ser Xsz Val Gly ?sn Trp Ala Lys Val 20 25 30 Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr ?rg Val 35 40 45 Ser Gly Giy Ala ?la Ala Ser Aso Ti Arg Gly Leu Vel Ser Leu Phe 50 55 SO _- Ser Pro Gly Ser ?la Gin Lys lie Gin Leu Val ?sn Thr ?sn Gly Ser -> 65 70 75 80 Trp His He ?sn Arg Thr Ala Lßu Asa Cys Asa Asp Ser Lau Gla Thr 85 90 95 Gly Phfc Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Giy 100 105 110 Cys Pro Glu Arg Leu ?la Ser Cys Arg Ser Zle Asp Lys Phe Ala Gin 115 120 125 Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Sex Ser Asp Gln Arg 130 135 140 10 Pro Tyr Cys Trp Biß Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly lie Val Pro Ala 145 150 155 160 Ser Gln Val Cys ßly Pro Val Tyr Cyß Phe Thr Pro Ser Pro Val Vel 165 170 175 Val Gly Thr Thr Aep ?rg Phe Gly Vel Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala 180 185 190 Asa Asp Ser Asp Val Lßu He Leu Asn Asi Thr Arg Pro Pro ?rg Gly 195 200 205 Asn Trp Phe Gly Cys Thr T?p Mßt Asa Gly Tbr Gly Phe Thr Lys Thr 210 215 220 i « Cys Sly Gly Pro Pro Cys ?sn lie ßly Gly Ala Gly Asn ?sa Thr Leu 225 230 235 240 Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys Eis Pro Glu Ala Thr Tyr Ala 245 250 255 Arg Cys Gly Sar Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Mßt Vai Hiß Tyr 260 265 270 Pro Tyr ?rg Leu Trp Bis Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr He Phe 275 280 2B5 Lys Val Arg Met Tyr Val Cly Giy Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala 290 295 300 20 Cys ?sn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Lßu Glu Asp Arg Asp ?rg 305 310 315 320 Ser ßlu Leu Ser Pro Leu Leu Lßu Ser Thr Thr Gly Asp Arg Giy Gln 325 330 335 Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu 340 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 41: 25 57 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 945 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...942 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...939 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 41: 58 ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTG GTX GTG ATG CTA CTC TTT GCC 48 Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Me= Leu Leu Phe Ala 1 5 10 15 GGC GTC GAC GGG CAT ACC CGC GTG TCA GGA GGG GCA GCA GCC TCC GAT 96 Gly V&l Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp 20 25 30 ACC AGG GßC CTT GTG TCC CTC TTT AGC CCC GGG TCG GCT CAG AAA ATC 144 Tbr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser ?ro Gly Ser ?le Sin Lys He 35 40 45 CAG CTC GTA AAC ACC AAC GGC AGT TGG CAC ?TC AAC AGG ACT GCC CTG 192 Gla Leu Val Asa Thr Asa Gly Ser xp -lis lie Asa ?rg Thr Ala Leu 50 53 60 AAC TGC AAC GAC TCC CTC CAA ACÁ GGG TTC TTT GCC GCA CTA TTC TAC 240 Asn Cyß Asn Asp Ser Leu Gla Thr Giy Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr 65 70 75 80 AAA CAC AAA TTC AAC TCG TCT GGA TGC CCA GAG CGC TTG QCC AGC TGT 288 Lys His Lys Phe Asa Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys 85 80 95 CGC TCC ATC GAC AAG TTC GCT CAG GGG TGG GGT CCC CTC ACT TAC ACT 336 Arg Ser He Asp Lys Phe Ala Gla Gly Trp Gly Pro Leu thr Tyr Thr ?oo ios no GAG CCT AAC AGC TCG GAC C?G ?GG CCC TAC TGC TGG CAC TAC GCG CCT 384 Glu Pro Asa Ser Ser Asp Gla Arg Pro Tyr Cys Trp Bis Tyr ?la Pro 115 120 125 CGA CCG TGT GGT ATT GTA CCC GCG TCT CAG GTG TGC GGT CCA GTG TAT 432 Arg Pro Cys Gly He Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr 130 135 140 TGC TTC ACC CCG AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGG TTT GGT 480 Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly 145 . 150 155 160 GTC CCC ACG TAT AAC TGG GGG GCG AAC GSC TCG GAT GTG CTG ATT CTC 528 Val Pro Thr Tyr Asn Trp Cly Ala Asa Asp Ser Asp Val Leu He Leu 16S 170 175 AAC AAC ACG CGG CCG CCG CGA GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACÁ TGG ATG 576 Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asa Trp Phe ßly Cys Thr Trp Met 180 185 190 59 AAT GGC ACT GGG TTC ACC ??G ACG TGT GGG SSC CCC CCG TGC AAC ATC 624 Asa Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cyß Gly Gly Pro Pro Cys Asa He 195 200 205 GGG GGG-GCC GGC AAC A?C ACC TTß ACC TGC CCC ACT GAC TGT TTT CGG 672 Gly Gly Ala Gly Asa Asn Thr Leu Thr Cys Pro Tbr Asp Cyß Phe Arg 210 215 220 AAG CAC CCC GAG GCC ACC T?C GCC AQ? TGC GST TCT GGG CCC TGG CTG 720 Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 225 230 235 240 ACÁ CCT AGG TGT ATG GTT CAT TAC CCA T?T AGG CTC TGG CAC TAC CCC 768 Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro 245 250 255 TGC ?CT GTC AAC TTC ?CC ATC TTC AAG GTT ?Gß ?TG T?C GTG GGG GGC 816 Cys Tbx Val ?sn Phe Thr He Phß Lys Val ?rg Bet Tyr Val ßly Gly 260 265 270 GTS G?G CAC AG5 TTC GA? GCC GCA TGC AAT ?SG ACT CG? GGA GAß CGT 864 Val Glu Kis Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Tfar Arg Sly ßlu Arg 275 280 285 TGT GAC TTG G?G GAC AGG GAT AGA TO. GAG CCT AGC CCG CTG CTß CTG 912 Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Lea Ser Pro Leu Leu Lßu 290 295 300 TCT ACÁ ACÁ GAG TOO C?G AGC TT? At?T AAT =?G S45 Ser Thr Thr Giu Trp Gia Ser Leu He Asn 305 310 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 42 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 314 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina {xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 42: 60 Met Val Gly Asn Trp ?la Lys Vai Leu Vai Val Mßt Leu Lßu Phe Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp 20 25 30 Thr Arg Gly Leu Val Sar Leu Phß Sex Pro Gly Ser Ala Gla Lys He 35 40 45 Gin Lßu Val Asn Thr Ass Gly Ser Trp Hiß lie Asa Arg Thr Ala Leu 50 55 ' 60 c Asn Cys Asn ?sp Ser Leu Gla Thr Gly Phe Phe ?la ?le Leu Phe Tyr •> 65 70 75 80 Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu ?rg Leu ?la Ser Cys 85 90 SS Arg Ser Xle Asp Lys Pha Ala Gla dy Trp Gly Pro Leu Ttr Tyr Thr 100 105 HO Glu Pro ?sn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp Eis Tyr Ala Pro 115 120 125 Arg Pro Cys Gly lie Val Pro Ala Ser Gla Val Cys Gly Pro Val Tyr 130 135 140 0 Cys Phß Thr Pro Ser Pro Val Val Val ßly Thr Thr Aso Arg Phe Gly 145 150 155 160 Val .Pro Thr Tyr Asa Trp Gly Ala Asa Asp Ser Asp Val Leu He Leu 165 170 175 Asa Asa Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met 180 185 190 Asn Gly Thr Gly Phß Thr Lys Thr Cys ßly Gly Pro Pro Cys Asa He 195 200 205 Gly Gly Ala Gly ?sn Asn Thr Leu ?hr Cys Pro Thr Asp Cys Phß Arg 210 215 220 5 Lys His Pro Glu ?la Thr Tyr ?la Arg Cys Gly Ser Glv Pro Trp Leu 225 230 235 " 240 Thr Pro Arg Cys Met Val Hiß Tyr Pro Tyr ?rg Leu Trp His Tyr Pro 245 250 255 Cys Thr Val Asn Phe Thr lie Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly 260 255 270 val Glu Ris Arg Phe Glu Ala ?la Cys ?sn Trp Thr Arg Gly Glu ?rg 275 2S0 285 Cys Aso Leu Glu Asp Arg Asp ?rg Ser Glu Leu Ser Pro Lßu Leu Leu 2S0 295 300 0 S r Thr Thr ßlu Trp Gla Ser Lßu He Asn 305 310 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 43 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 5 (A) EXTENSIÓN: 961 pares de bases 61 (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (Üi) CODIFICADORA^ NO (ÍX) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...958 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat__peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...955 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 43: 62 ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GT7 rTG GTT GTG ?TG CTA CTC TTT GCC 48 Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val lau Val Val Het Leu Leu Phe Ala . 1 5 10 15 GGC GTC G?C GGG C?T ?CC CßC GTG rC? GGA G3G GC? GCA GCC TCC G?T 96 ßly Val Asp Gly Eis Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala ?ex Asp 20 25 30 ACC AGG GGC CTT GTG TCC CTC TT7 ACC CCC GGG TCC GCT C?G ??? ATC 144 Thr Arg ßly Leu Vai Ser Leu Phe Ser Pro ßiy Ser ?la Glp Lys Xle 35 40 • 45 C?G CTC GT? AAC ?CC ?AC GGC ACT 7SG C?C ATC AAC ?GG ?CT GCC CTG 192 Gla Leu Val Asn Thr Asa Gly Ser r? Kis He Asa Arg Thr Ala Leu 50 55 60 AAC TGC AAC G?C TCC CTC CAA AC? 3G3 TTC TTT GCC GCA CTA TTC TAC • 240 Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gla T r 3.-/ Phe Phe ?la ?ia Leu Jhe Tyr 10 65 70 75 80 A?A CAC A?? TTC AAC TCG TCT SG? T CCA G3W» CGC TTG GCC ?GC TGT 288 Lys His Lys Phe Asa Ser Ser Siv Cvs Pro Glu Arg Lßu Ala Ser Cys 85 90 95 CGC TCC ATC GAC A?G TTC GCT AG 35S TGG GGT CCC CTC ?CT T?C ACT 336 Arg Ser He ?sp Lys '?he Aia Glz Sly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr 100 125 XlO G?G CCT AAC AGC TCG GAC CAG AGG CCC TAC TGC TGG CAC TAC GCG CCT 384 Glu Pro Asa Ser Ser Asp Glr. Arg ?rs Tyr Cys Trp His Tyr ?la Pro 115 122 125 CG? CCG TGT GßT ?TT GTA CCC GCG 7CT CAG GTG TGC GGT CCA GTG TAT 432 i <; Arg Pro Cys Gly He Val Pro Ala Ser Gin Val Cys Gly Pro Val Ty 130 133 140 TGC TTC ACC CCG ?GC CCT GTT GTG GTG GGG ?Cß ?CC GAT CGG TTT GGT 480 Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val 7ai Gly ?xr Thr ?sp Are Phe Giy 145 150 1S5 150 GTC CCC ACG TAT A?C TGß GGG SC3 £ GAC TCG G?T GTG CTG ATT CTC 528 Val Pro Thr Tyr Asa Trp Giy Ala Así Asp Ser Asp Val Leu He Leu 165 170 175 AAC AAC ACG CSG CCG CCG CGA GGC A?C TGG TTC GGC TGT ACÁ TGG ATG 576 Asa ?sn Thr ?rg Pro Pro Arg Glv AS- Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met 180 135 190 20 AAT GGC ACT GGß TTC ACC AAG ACS tGC GSE GGC CCC CCG TGC AAC ATC S24 Asa Gly Thr Gly Phe Thr Lvs Tar Cvs Gly Gly Pro Pro Cys Asa He 195 200 " 205 GGG GGG GCC GGC AAC AAC ACC TX ACC TGC CCC ACT G?C TGT TTT CGG 672 Gly Gly Ala Gly Aen Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg 210 215 220 A?G CAC CCC GAG GCC ACC TAC GCC AGA TGC GGT TCT GGG CCC TGG CTß 720 63 Lyß His Pro ßlu Ala Thr Tyr Ala ?rg Cys Gly Ser Cly Pro Trp Leu 225 230 235 240 ACÁ CCT AGG TGT ATG GTT CAS TAC CCA T?T AGG CTC TGG C?C TAC CCC 768 Thr Pro Arg Cys Met Val Kis Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp Eis Tyr Pro 245 250 255 TGC ACT GTC AAC TTC iCC ATC TTC AAG CTT AGG ATG T?C GTG Gßß GGC 616 Cys Thr val Asn Phe Thr He Pae Lvs Val Arg Met Tyr Val Gly Gly 260 265 270 GTG GAG C?C ?GG TTC G?A GCC GC? TGC ??T TGG ACT CG? GGA G?G CGT 864 Val Glu His Arg Phe Giu Ala Ala Cys Asa Trp Thr Arg Gly Glu Arg 275 280 285 TGT G?C TTG GAG ß?C ?GG GAT ?GA TC? G?G CTT ?GC CCC CTG CTG CTG 912 Cys ?sp Leu Glu ?sp ?rg ?sp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu 290 255 300 TCT ACÁ AC? GGT GAT CGA GGG CAG ?C? CCA TCA CCA CCA TC? CTA A 958 Ser Thr Thr Gly Asp Arg Gly Gin Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu 305 310 315 T?ß 961 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 44 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 319 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 44: 64 Met Val Gly Asa Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala 1 5 10 15 Gly Val Asp Gly His Thr Arg vai Ser Giy Gly Ala Ala Ala Ser Asp 20 25 30 Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gla Lys He 35 ' 40 45 Gln Leu Val Asa Thr Asn Gly Ser Tzp Eis He Asn Arg Thr Ala Leu 50 55 60 Asa Cys Asn. Asp Ser Leu Gla Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr 65 70 75 80 Lys Eis Lys Phe Asa Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys 85 90 95 Arg Ser He Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr 100 105 110 Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gla Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro H5 • 120 125 Arg Pro Cys Gly He Val Pro Ala Ser ßln Val Cys Gly Pro Val Tyr 130 135 140 Cys Pha Thr Pro Ser Pro Vai Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly 145 . 150 155 160 Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asa Asp Ser Aso Vai Leu He Leu 165 170 175 Asa Asa Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asa Tro Phe Gly Cvs Thr Trp Met 180 185 190 Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thx Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asa He 195 200 205 Gly Gly Ala ßly Asa Asn Oi Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg 210 215 .220 Lys His Pro Slu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu 225 230 235 240 Tütr pro Arg Cys Mat val His tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro 245 250 255 Cys Tbr Val Asn Phe Thr He Phe Lys Val Arg >íer Tyx Val Gly Gly 260 265 270 Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg 275 280 285 Cys Asp Leu Giu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu 290 295 300 Ser Thr Tfer Gly Asp Arg Gly Gla ?ir Pro Ser Pro ?ro Ser Leu 305 310 315 65 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 1395 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...1392 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...1389 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 45: ATG GTG GCß GGß GCC CAT TGß Gß? GTC CTG GCG GGC CTC GCC T?C T?T 48 66 Mßt Val Ala Gly Ala His Trp Sly Val Leu Ala Gly Leu ?la Tyr Tyr 1 5 10 15 TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTß GTT GTG ATG CTA CTC TT? 96 Ser Met Val Gly ?sa Tro Ala Lvs Val Lau Val Val Mee Leu Leu Phe 20 25 30 GCC GGC GTC GAC GGG CAT ACC CGC GTG TCA GGA GGG OCA KA ßCC TCC 144 Ale Gly Val ?sp Gly ?xs Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser 35 40 45 GAT ACC AGG GGC CTT GTG TCC CTC TTT AGC CCC GGG TCG GCT CAG AAA 192 Asp Thr Arg Gly Leu Vai Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gla Lys 50 55 60 ATC CAG CTC GTA AAC ACC AAC GGC AST TGß CAC ATC AAC AGG ACT GCC 240 He Gla Leu Val Asa Thr Asa Gly Ser Trp His He Asa Arg Thx Ala 65 70 75 80 CTG AAC TGC AAC GAC TCC CTC CAA. ACÁ GGG TTC TTT GCC GCA CSA TTC 288 Lßu Asa Cys Asa Asp Ser Lßu Gla Thr ßly Phe Phe Ala Ala Leu Pha 85 90 95 T?C AAA CAC AAA TTC A?C TCG TCT GGA TGC CCA GAG CGC TTG GCC AGC 336 Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Giu Arg Leu Ala Ser 100 105 110 TGT CGC TCC ATC GAC AAG TTC ßCT CAG GGG TGG GGT CCC CTC ACT TAC 384 Cys Arg Ser He Asp Lys Pha Ala Gla Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr 115 120 125 ACT GAG CCT AAC AGC TCG GAC CAG AGG CCC T?C TGC TGG CAC TAC GCG 432 Ifcr Glu Pro Asa Ser Ser Asp Gla Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala 130 135 140 CCT CGA CCG TGT GGT ATT 'GT? CCC GCG TCT CAG GTG TGC GGT CCA GTG 480 Pro Arg Pro Cys Gly He Val Pro Ala Ser Gia Val Cys Glv Pro Val 145 150 155 160 TAT TGC TTC ACC CCG AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGS TTT 52B Tyr Cys Phß Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Aso Arg Pha 165 170 175 GGT GTC CCC ACG TAT AAC TGG GGG GCG AAC G?C TCG GAT GTG CTG ATT 576 Gly Val Pro Thr'Tyr ?sa Tip Gly Ala Asa Asp Ser Asp Val Leu He 180 185 190 CTC AAC AAC ACG CGG CCG CCG CGA GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACÁ TG3 624 Leu Asa Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asa Trp Phe Gly Cys Thr Trp 195 200 205 ATG AAT GßC ACT GGG TTC ACC AAG ACG TGT GGS GGC CCC CCG TGC AAC 672 Met ?sa Gly Thr Gly Phe Thr Lvs Thr Cys Gly Giy Pro Pro Cvs Asn 210 215 220 ATC GGG GGG GCC GGC AAC AAC ACC TTG ACC TGC CCC ACT GAC TGT TTT 720 He Gly Gly Ala Gly Asn Asn Tar Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phß 225 230 235 240 CGG AAG CAC OCC GAG GCC ACC TAC GCC ?G? TGC GGT TCT GGG CCC TGG 768 Arg Lys Kis Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Ars Cys Gly Ser Gly Pro Trp 245 250 2SS 67 CTG ACÁ CCT ?GG TGT ATG GTT CXt TAC CC? TAT AGG CTC TGG CAC T?C 816 Leu Thr Pro Arg Cys Mee Vai Kis Tyr Pro T r Arg Leu Trp Hts Tyr 260 265 270 CCC TGC ACT GTC AAC TTCACCATCCTC AAGGTT AGG ATG T?C CTG GGG 864 Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr He Phß Lys Val Arg Mee Tyr Vel Gly 275 280 285 GGC GTG GAG C?C AGG TTC G?? GCC GCA TGC AAT TGG ACT CGA GßA ß?ß 912 Gly Val Glu His ?rg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Tar Arg Giy Glu 290 295 300 CGT TGT GAC TTG GAG GAC AGG GAT AG? TCA GAG CTT AGC CCC CTG CTG 950 ?xg Cya Asp Lßu Glu ?sp ?rg Asa ?rg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu 305 310 " 315 320 CTG TCT ?C? ACÁ G?S TG3 CdG ATA CTG CCC TGT TCC TTC ACC ACC CTG 1008 Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gla lie Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu 325 330 33S CCG GCC CTA TCC ACC ßGC CTG ATC CAC CTC CAT CAG AAC ATC GTG G?C 1055 Pro Ala Leu Ser Thr ßly Leu lie ?is Leu His Gln Asn He Val Asp 340 345 350 GTG CAA TAC CTG TAC GGT ßTA GGG TCS GCG GTT ßTC TCC CTT GTC ATC 1104 Val Gin Tyr Leu Tyr Qly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Vai lie 355 360 3S5 A?? TGG GAG T?T GTC CTG TTO CTC TTC CTT CTC CTG GCA G?C GCG CGC 1152 Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp ?la Axg 370 375 380 ATC TGC ßCC TßC TTA Tßß ATG ATO CTG CTG ATA GCT CAA GCT GAG GCC 1200 He Cys Ala Cys Lßu Trp Mer Ser Leu Leu He Ala Gin Ala Glu Ala 385 390 395 400 KC TTA GAG AAC CTß GTG GTC CTC AAT GCß GCG GCC GTG GCC GGG GCG 1248 Ala Leu Glu Asn Lßu Val Val Leu Asa Ala Ala Ala Vai Ala Gly Ala 405 410 415 CAT GGC ACT CTT TCC TTC CTT GTG TTC TTC TGT GCT GCC TGG TAC ATC 1296 Kis Gly Tur Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr He 420 425 430 A?G GGC ?GG CTG GTC CCT GGT GCG GC? T?C GCC TTC T?T GGC 3TG TGG 1344 Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly ?la Ala Tyr ?la Phe Tyr Gly Val Trp 435 440 445 CCG CTG CTC CTG CTT CTG CTG GCC TT? CCA CCA CGA GCT TAT SCC TAGTAA 1395 Pro Leu Leu Leu Leu Leu Lßu Ala Lea Pro Pro Arg Ala Tyr Ala 450 455 460 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 463 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 68 (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteina (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 46 ; Het Val ?la Gly Ala Kis Tzp Glv al Leu Ala Giy Leu Ala r Tyr 1 5 10 15 Ser Met Val Gly ?sn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Het Leu Leu Phe 20 25 30 Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala ?la Ser 35 40 45 ?sp ?hr Arg Gly Lßu Val Ser Leu Phe Ser Pro ßly Ser Ala ßln Lys 50 55 60 11» ßln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His He Asa Arg Thr Ala 65 70 75 80 ? n Leu ?sn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe ?la Ala Leu Pbe 1 U 85 90 95 Tyr Lys His Lys Phe Asa Ser Ser ßly Cvs pro ßlu ?rg Leu Ala Ser 100 105 110 Cys Arg Ser He Asp Lys Phß Ala Gla Giy Trp Gly Pro Leu Thr Tyr 115 120 125 Thr ßlu Pro Asn Ser Ser Asp Gla Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala 130 135 140 Pro Arg Pro Cys Gly He Val Pro Ala Ser Gla Val Cvs Glv Pro Val 145 150 155 160 Tyr Cys Pae Thr Pre Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe 165 170 175 Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asa Asp Ser ?sp Val Leu He 180 185 190 Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asa Trp Phe Gly Cys Thr Trp 195 200 205 Mee ?sa Gly Thr ßiy Phß Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys ?sn 210 215 220 He ßly Gly ?la Gly ?sa ?sa Thr Leu Thr Cvs Pro Thr Aso Cys Phe 225 230 23S " 240 ?rg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr ?la Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp 245 250 255 Leu Thr Pro Arg Cys Mee Val Eis Tvr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr 260 265 270 Pro Cys xhr Val Asn Phe Thr He Phe Lys Val Arg Mer Tyr Val Gly 275 280 285 Gly Val Glu His Arg Phß Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly ßlu 290 295 300 Arg Cys Asp Leu Clu ?ep Arg Asp ?rg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu 305 310 315 320 5 69 Lau Ser Thr Thr Glu Trp Gln He Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Lßu 325 330 335 Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu He ?is Leu His Gln Asa He Val ?sp 340 345 350 Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val He 355 360 365 Lys Trp ßlu Tyr Val Leu Lßu Leu Phe Lßu Leu Lea Ala ?sp ?la ?rg 370 375 380 He Cys Ala Cys Leu Trp Mee Mßt Leu Leu He ?la Gla ?la ßlu ?la 385 390 395 400 Ala Leu Glu ?sn Leu Val Val Leu Asa ?la Ala Ala Val ?la Gly ?la 405 410 415 His Gly Thr Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys ?la ?la Trp Tyr He 420 425 430 Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phß Tyr Gly Val Trp 435 440 445 Pro Leu Leu Leu Lßu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg ?la Tvr Ala 450 455 460 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 2082 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: 70 (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...2079 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACIÓN: 1...2076 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 47: ??T TTG GGT A?ß STC ?TC G?T ACC CTT ACÁ TGC GGC TTC GCC G?C CTC 48 Asn Lßu Gly Lys Val He Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu 1 5 10 15 GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGß GGC GCT GCC AGG 96 Val Gly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Lßu Gly Gly Ala Ala Arg 20 25 30 71 GCC CTG GCß CAT ßßC GTC CGG ßTT CTG SAG GAC G3C ßTß AAC T?T 6C? 144 Ala Leu ?la His Gly Vel Arg Val Leu Glu ?sp ßly Val Asa Tyr Ala * 35 40 45 ACÁ GGG A?T TTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG 192 Thr Gly Asa Leu Pro Giy Cys Ser Phe Ser He Phe Leu Leu Ala Lßu 50 55 60 5 CTG TCC TGT CTG ACC STT CCA GCT TCC GCT TAI GAA GTG CGC A?C GTG 240 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro ?la Ser Ala Tyr Glu Vel Arg Asn al 65 70 75 80 TCC GGG ATG TAC CAT GTC ACG AAC G?C TGC TCC AAC TCA ?GC ?TT GTG 288 Ser Gly Met Tyr Eis Val Thr ?sa Asp Cvs Ser Asn Ser Ser He Val 85 90 95 T?T G?G GCA GCG GAC ?Tß ?TC ATG CAC ACC CCC GGS TGC GTG CCC TGC 336 Tyr ßlu Ala Ala Asp Mßt He Mee Eis Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 GTT CGß G?G AAC ??C TCT TCC CGC TGC TGG GT? ßCG CTC ?CC CCC ?CG 384 Val ?rg ßlu Asn ?sn Ser Ser Arg Cvs Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr 10 5 120 125 CTC GCA CCT Aßß A?C ßCC ?GC GTC CCC ACC ACG AC? AT? CGA CßC CAC 432 Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr lie ?rg Arg His 130 135 140 GTC GAT TTG CTC CTT CGG GCC GCT GCT TTC TGT TCC GCT ATG T?C GTG 480 Vai Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala ?ia Phe Cys Sar Ala Mee Tyr Val 14S 150 155 160 GGG GAC CTC TGC GGA TCT GTC TEC CTC GTC TCC C?G CTG TTC ?CC ATC 528 Gly Asp Lßu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr He 165 170 175 i c TCG CCT CGC CGG CAT GAS ACG GTG CAß G?C TGC ?AT TGC TC? ATC TAT S76 Ser Pro Arg Arg His ßlu Thr Vtl Gin Asp Cys Asa Cys Ser lie Tyr 180 185 190 CCC GGC CAC ATA ACß GGT CAC CGT ATG GCT TGG GAT ATG ATG ?TG AAC 624 Pro Gly HÍS He Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Mee Mee Met Asn 195 200 205 TGG TCG CCT ACÁ ACG GCC CTG GTß ßTA TCß C?ß CTG CTC CGß ATC CC? • 672 Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser ßla Leu Lßu Arg He Pro 210 215 220 C?? GCT GTC ßTG G?C ATG GTß GOG GGG GCC CAT TGG GG? GTC CTG GCG 720 Gla ?ia ai Val Asp Mee Val Ala Giy Ala Bis Trp Glv Val Lßu Ala 225 230 235 240 0 GGC CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AftC TGG GCT ??G GTT TTG GTT ?68 Gly Leu ?la Tyr Tyr Ser Mee Val Gly ?sn Trp Ala Lys Val Leu Val 245 250 255 GTG ATG CTA CTC TTT GCC GGC GTC G?C ßßß C?T ACC CGC GTß TC? Gß? 816 Val Mßc Leu Lßu Phß Ala Glv Vai Asp Gly His Thr ?rg Val Ser Giy 260 " 265 270 GGG GC? GCA GCC TCC GAT ACC AGG GGC CTT GTß TCC CTC TTT AGC CCC Sé4 ßly ?ia Ala ?ia Ser ?ep Thr ?rg Gly Lßu Val Ser Leu Phe Ser Pro 72 275 280 2S5 GßG TCG GCT CAG AAA ATC C&G CTC GTA AAC ?CC AAC ßßC AGT TGG CAC 912 Gly Ser ?ia Gla Lys He Gla Leu Val ?sa Thr ?sa Gly Ser Trp His 290 29S 300 ATC AAC ?GG ACT GCC CTß A?C TGC A?C GftC TCC CTC C?A ?CA GGG TTC 960 Ha Asn ?rg Thr Ala Leu Asa Cys Asn Asp Ser Leu Gla Thr Gly Phß 30S 310 315 320 TTT GCC GC? CT? TTC TAC AAA C?C AAA TTC ?AC TCG TCT GßA TGC CCA 1008 Phe Ala ?la Leu Phß Tyr Lys His Lys Phß Asa Ser Ser ßly Cys Pro 325 330 335 GAG CGCTTGGCCAGC GTCGCTCC?TCG?CAAGTTCGCTCAG GGGTGG 1056 Giu Arg Lßu ?la Ser Cys ?rg Ser He Asp Lys Phe ?la Gla Gly Trp 340 ' 345 350 GGT CCC CTC ?CT T?C CT GAG CCT A?C AGC TCG GAC OU? AGG CCC T?C 1104 Gly Pro Leu Thr Tyr Thr ßlu Pro Asn Ser Ser Asp ßln ?rg Pro Tyr 355 360 365 TGC TGG CAC TAC GCG CCT CGA CCG TGT GGT ATT GTA CCC GCG TCT C?G H52 Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly He Val Pro ?la Ser Gln 370 375 380 GTG TGC GßT CCA GTG TAT TGC TTC ACC CCG AGC CCT GTT ßTß GTG GGß 1200 val Cys ßly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly 385 390 395 400 ACG ACC GAT CGG TTT GGT GTC CCC ACG T?T A?C TGG GGG GCß AAC G?C 1248 Thr Thx Asp Arg he Gly Val Pro Thr Tyr Asa Trp Gly ?la Asn Asp 405 410 415 TCß GAT GTG CTß ATT CTC ?AC AAC ACß CGG CCG CCG CG? GGC A?C TGG 1296 Ser ?sp Val Leu He Lßu Asn Asa Ttr Axg Pro Pro Arg Gly Asa Trp 420 425 430 TTC GGC TGT ACÁ TGG ATG AAT GGC ACT GGG TTC ?CC A?G ACG TGT GGG 1344 Phe Gly Cys Thr Trp Met Asa Gly Thr Gly Phe Thr Lvs Thr Cys Gly 435 440 445 GGC CCC CCG TGC AAC ATC GSG GGG GCC GGC A?C ?AC ACC TTß ACC TGC 1392 Gly Pro Pro Cys Asn He Gly Gly Ala Glv Asn ?sn Thr Leu Thr Cys 450 455 460 CCC ACT GAC TßT TTT CGG AAG C?C CCC G?G GCC ACC T?C GCC AGA TGC 1440 Pro Thr ?sp Cys Phe ?rg Lyß His Pro Glu ?la Thr Tyr Ala Arg Cys 465 470 475 480 GGT TCT ßGG CCC TGG CTG ACÁ CCT AGG TGT ATO GTT CAT TAC CCA T?T 1488 Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val Eis Tyr Pro Tyr 485 490 495 AGG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GTC A?C TTC ACC ATC TTC AAG GTT 1536 Arg Leu Trp E?s Tyr Pro Cys Thr Val Asa Phe Thr"He Phe Lys Val 500 505 510 AGG ATG TAC GTG GßG GGC GTG GAG C?C AGß TTC GAA GCC GCA TGC AAT 1584 Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn 51£ 520 525 TGG ACT CG? GGA GAS CGT TßT GAC TTG G?G G?C ?GS GAT ASA TCA GAC 1632 73 Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Lßu Glu Asp Arg Asp ?rg Ser ßlu 530 53S 540 CTTAGC CCGCTGCTGCTG CrACAACAG?GTGGCAGAT CTGCCC TGT 1680 Leu Ser Pro Leu Leu Lßu Ser Thr Thr ßlu Trp ßln He Leu Pro Cys 545 550 553 560 TCC TTC ACC ACC CTG CCG ßCC CTA TCC ACC GGC CTG ATC C?C CTC CAT 1728 Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser T r Gly Leu He Kis Leu Eis 565 570 575 C?G AAC ATC GTC GAC GTG CAA TAC CTG TAC ßCT GTA GGG TCG GCG GIT 1776 Gla Asa He val Asp Val ßia Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val 580 5B5 590 GTC TCC CTT ßTC ?TC UU TßG G?G TAT GTC CTG TTG CTC TTC CTT CTC 1824 Val Ser Leu Val He Lyß Trp Glu Tyr Val Leu Lßu Leu Phe Leu Leu 595 600 605 CTG GCA GAC GCG CGC ?TC TGC GCC TGC TTA TGß ATG ATG CTG CTG ATA 1872 Leu Ala As? Ala ?rg ¿le Cys Ala Cys Leu Trp Mßt Mßt Lßu Leu He 610 615 620 GCT CAA GCT G?G GCC GCC TTA GAG AAC CTG GTG GTC CTC ?AT GCG GCG 1920 Ala Gin Ale Glu ?la ?ia Leu Glu Asa Leu Val Val Leu ?sa ?la Ala 625 630 635 640 ßCC GTG GCC ßßG ßCG C?T GßC ACT CTT TCC TTC CTT GTG TTC TTC TGT 1968 Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser Phe Leu Val Phe Pie Cys 645 650 £55 GCT GCC TGG TAC ATC A?C GGC ?GG CTG GTC CCT GGT GCG GC? T?C GCC 2016 Ala Ala Trp Tyr He Lys Giy Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr ?la 660 665 670 TTC TAT GßC GTG TGG CCG CTG CTC CTG CTT CTG CTG GCC TTA CCA CCA 2064 Phe Tyr Gly al Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro 675 680 685 CGA ßCT TAT GCC TAGTAA 2082 Arg Ala Tyr ?la 690 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 692 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 74 (Xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 48 : Ase Leu Gly Lys Val He Aep Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala ?sp Leu 1 5 10 15 Val Gly Tyr He Pro Leu Val ßly Ala Pro Leu Gly Gly ?la ?la ?rg 20 25 30 ?la eu ?la K¿s Gly Val Arg Val Leu Glu Asp ßly val Asa Tyr ?la 35 40 45 Thr Gly Asa Leu Pro Gly Cys Ser Fhe Ser lie Phe Leu Leu ?la Leu 50 55 60 Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro ?la Ser ?la Tyr ßlu Val ?rg ?sa Val 65 70 75 80 Ser ßly Met Tyr His Val Thr ?sn ?sp Cys Ser ?sn Ser Ser He Val 85 90 95 Tyr Glu Ala ?la ?sp Mett lie Det ais Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys 100 105 110 Val Arg Glu ?sa ?sn Ser Ser ?rg Cys Trp al ?la Leu Thr Pro Thr 115 120 125 Leu Ala ?la ?rg ?sa ?la Ser Val Pro Thr Thr Thr He ?rg ?rg His 130 135 140 Val ?sp Leu Lßu Val Gly Ala ?la Ala Phe Cys Ser ?la Met Tyr Val 145 150 155 160 Gly ?sp Lßu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr He 165 170 175 Ser Pro Arg Arg Kis Glu Thr Val Glc ?sp Cys ?sa Cys Ser Xle Tyr 180 ißS 190 Pro ßly His He Thr Gly His ?rg Mee ?la Trp Asp Met Me: Xßc ?sa 195 200 205 Trp Ser Pro Thr Thr ?la Leu Val Vai Ser Gla Leu Leu Arg He Pro 210 215 223 Gin Ala Val Val ?ep Het Val Ala Gly ?la Bis Trp ßly Val Leu ?la 225 230 235 240 Gly Leu ?la Tyr Tvr Ser Met Val Gly ?sn Trp ?la Lys Val Leu Val 245 250 255 Val Hat Leu Leu Phe ?la Giy Val ?sp Gly His Thr ?rg Val Ser Gly 260 265 270 Gly ?la ?la ?la Ser ?sp Thr ?rg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro 275 280' 285 Gly Ser Ala Gln ?ya He Gln Leu Val Ase Thr ?sa Gly Ser Trp His 290 295 300 He Asn Arg Thr ?la Leu ?sn Cys ?sa Asp Ser Leu Gln Thr Cly Phe 305 310 315 320 Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys Els Lys Phe ?sn Ser Ser Gly Cys Pro 325 330 335 Glu ?rg Leu ?la Ser Cys ?rg Ser He s Lys Phe ?ia Gn Gly Trp 340 345 350 Gly Pro Leu Thr Tyr Thr ßlu Pro Asa Ser Ser ?ep Gln ?rg Pro Tyr 355 360 6S Cys Trp His Tyr ?la Pro Axg Pro Cys ßly XI* Val Pro ?la Ser Gin 75 370 375 380 Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phß Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly 385 390 395 400 Thr Thr Asp Arg Phß ßly Val Pro Tar Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp 405 410 415 Ser Asp Val Leu He Leu Asa ?sn Thr ?rg Pro Pro Arg Gly Asa Trp <- 420 425 430 Phß ßly Cys Thr Trp Mee Asa ßly Thr Gly Phß Thr Lys Thr Cys Gly 435 440 445 ßly Pro Pro Cys Asa He ßly Giy Ala ßly Asa ?sa Thr Leu Thr Cys 450 455 460 Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala ?rg Cys 465 470 475 480 Gly Ser Gly Pro Trp Leí: Thr Pro ?rg Cys Met Val Eis Tyr Pro Tyr 485 490 495 Arg Leu Trp Mis Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr lie Phe Lys Val ¡0 500 505 510 Arg Mßt Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phß Glu Ala Ala Cys Asn 515 520 525 Trp Thr Arg Gly ßlu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg ?sp Arg Ser Giu 530 535 540 Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gla He Leu Pro Cys 545 550 555 560 Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Cly Leu lie Mis Leu His 565 570 575 Gin Asa He Val Asp Vai Gla Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val 15 580 585 590 Val Ser Leu Val He Lys Trp Giu Tyr Val Leu Lßu Leu Phe Leu Leu 595 600 605 Leu ?la ?sp Ala ?rg Xle Cys ?la Cys Leu Trp Met Met Leu Leu He £10 613 620 Ala Gln Ala Glu ?ia ?le Leu Glu ?sn Leu Val Val Leu Asn Ala Ala 625 630 635 Ó4C Ala Val Ala Gly ?la Sis Gly Thr Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys 645 650 655 0 Ala Ala Trp Tyr He Lyß Giv Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala 660 " 665 670 Phe y Gly Val Trp Pro Leu Leu Lßu Leu Leu Leu ?la. Lau Pro Pro 675 680 6ß5 Arg Ala Tyr Ala 690 76 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 2433 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1...2430 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mat_peptide (B) LOCALIZACION: 1...2427 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 49: 77 ATG AGC ACG A?T CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC AAC 48 Met Ser Thr Asa Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asa Thr Asa 1 5 10 15 CGC CGC CCA CAG GAC GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT 96 Arg Arg Pro Gla Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gla He Val Gly 20 25 30 GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Giy Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ?CT AGG AAG ?CT TCC GAG CGG TCG CAA CCT CGT GGG ?GG CGA CAA CCT 192 Thr Arg Lys Thx Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Giy Arg Arg Gla Pro 50 55 60 ATC CCC AAG GCT CGC CGA CCC GAG GGT AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG 240 lie Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Axg Ala Trp Ala Gla Pro Gly 65 70 75 80 TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA TGG '288 Tyr Pro Trp Pro Lßu Tyr Gly Aso. Glu Gly Het Gly Trp Ala Gly Trp 85 30 95 CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCT CGG CCT AGT TGG GGC CCT ACÁ GAC CCC "336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 CGG CGT AGG TCG CGT ÁAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTT ACÁ TGC 384 Axg Arg Arg Ser Arg Asa Leu Gly Lys Val He ?sp Thr Leu Thr Cys 115 120 125 GGC TTC GCC GAC CTC GTG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA 432 Giy Phe Ala Asp Leu Val Gly Tyr He Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 GGG GGC GCT GCC AGG GCC CTG GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC "480 78 Gly Gly Ala Ala ?rg Ala Lßu Ala Kis ßly Val ?rg Vai Lßu Giu Asp 145 150 155 160 GQC GTG AAC TAT GCA ACÁ GGG AAT TTG CCC GST TßC TCT TTC TCT ATC 528 Gly Val ?sn Tyr Ala Thr Gly Asa Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser He 165 170 175 TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT CTG ACC GTT CCA GCT TCC GCT TAT 576 Phe Leu Lßu ?la Leu Leu Sex Cys Lßu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr 1B0 185 190 G?? GTG CGC ??C GTG TCC GGG ATG TAC CAT GTC ACG A?C ß?C TßC TCC 624 Glu Val Arg Asa Val Ser Gly Mßt Tyr His Val Thr Asa Asp Cys Ser 195 200 205 AAC TCA AGC ATT GTG TAT GG GCA ßCG GAC ATG ATC ATG CAC ACC CCC 672 Asn ser Ser He Val Tyr Glu Ala Ala Asp Mee He Mßc His Thr Pro 210 215 220 Gßß TGC GTG CCC TGC ßTT CßG GAG ASC AAC TCT TCC CCC TßC TGG GTA 720 ßly Cys Val Pro Cys Val Arg Clu Asa Asn Ser Ser ?rg Cys Tro Val 225 230 235 240 GCG CTC ?CC CCC ACß CTC GCA GCT AGG AAC GCC AGC GTC CCC ACC ?CG 768 Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg ?sa Ala Ser Val Pro Thr Thr 245 250 255 ACÁ AT? CSA CGC CAC ßTC ßAT TTG CTC CTT GGß GCG GCT GCT TTC TGT 816 Thr He ?rg ?rg Hiß Val Asp Leu Lßu Val Giy Ala Ala Ala Phe Cys 260 265 270 TCC GCT ATG T?C GTß GGG GAC CTC TGC GG? 3CT STC TTC CTC ßTC TCC 864 Ser Ala Met Tyr Val ßly Asp Lßu Cys Gly Ser Val Phe Lßu Val Ser 275 280 285 CAG CTß TTC ACC ATC TCG CCT CSC CCG CAT GAG ACG GTG CAG GAC TGC 912 Gla Leu Phe Thr He Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val ßln ?sp Cys 290 295 300 AAT TGC TCA ATC TAT CCC ßGC CAC ATA ACG GGT C?C CGT ?TG ßCT TGß 960 Asa Cys Ser He Tyr Pro Gly Kis He Thr Gly His Arg Met Ala Trp 305 310 315 320 GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCT ACÁ ACG GCC CTG GTß GT? TCG CAG 1008 Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gla 325 330 335 CTG CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC GTß GAC ATG GTG GCß GGG GCC C?T 1056 Leu Leu ?rg He Pro Gla Ala Val Val Asp Met Val Ala ßly Ala His 340 345 350 TGG GßA ßTC CTß GCG GGC CTC GCC TAC T?T TCC ATG GTG GGG AAC TGG 1104 Trp Gly Val Lßu Ala Gly Leu Aia Tyr Tvr Ser Met Val Gly ?sn Trp 355 360 ' 365 GCT ??G GTT TTG GTT GTG ATG CTA CTC TTT ßCC GßC GTC GAC GßG CAT 1152 Ala Lys Val Leu Vai Val Mßt Leu Leu Phe Ala ßly Val Asp Gly His 370 375 380 ACC CßC GTG TCA GG? GGG GC? GC? GCC TCC GST ACC AGG OGC CTT GTG 1200 Thr Arg Val Ser Gly Gly Aia Aia Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val 385 390 395 400 79 TCC CTC TTT AGC CCC GßG TCG CCT CAG AAA ?TC CAG CTC GTA AAC ACC 1248 Ser Leu Phe Ser Pro Giy Ser Aia Gin Lys He ßla Lßu Val Asa Thr 405 410 415 AAC 6GC AGT TGG CAC ?TC AAC AGG ACT GCCCTG?AC TGC?AC GAC TCC 1296 Asa ßly Ser Trp His He Asa ?rg Thr Ala Leu ?sa Cys Asa Asp Ser 420 425 430 CTC CAA ACÁ ßGG TTC TTT GCC GC? CTA TTC TAC A?? C?C AAA TTC AAC 1344 Leu ßln Thr ßly Phe Phe Ala ?la Lea Phe Tyr Lys His Lys Phe Asa 435 440 445 TCG TCT GGA TGC CCA GAG CGC TTG GCC AGC TCT CGC TCC ATC ß?C ??G 1392 Ser Ser Gly Cys Pro Glu Ag Leu Aia Ser Cys Arg Ser He Asp Lys 450 455 460 TTC GCT CAS GGß TGß GGT CCC CTC ACT TAC ACT GAG CCT AAC AGC TCG 1440 Phe Ala Gla ßly Trp Gly Pro Lßu Thr Tyz Thr Glu Pro Asa Ser Ser 465 470 475 480 GAC CAG ASG CCC T?C .TGC TGG C?C TAC GCG CCT CGA CCG TGT GGT ATT 1*88 Asp Gia Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro ?rg Pro Cys Gly lie 485 490 495 GTA CCC GCG TCT CAG GTG TGC GGT CCA GTG TAT TGC TTC ACC CCG AGC 1536 val Pro Ala Ser Gla Val Cys Gly Pro Val Tyr Cyß Phß Thr Pro Ser 50Q 505 510 CCT GTT GTG GTG Gßß ACß ACC GAT CßG TTT ßGT ßTC CCC ACß TAT A?C 15B4 Pro Vai Vai Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Tar Tyr Asn 515 520 525 TGG GGG GCG AAC G?C TCß G?T GTG CTß ATT CTC A?C AAC ?CG CGß CCG 1632 Trp ßly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu He Leu ?sa ?sa Thr Arg Pro 530 535 540 CCG CGA GGC A?C TGG TTC GßC TGT ACÁ TGG ATG AAT GßC ACT ßGG TTC 1680 Pro Arg Gly Asn Trp Phe ßly Cys Ttr Trp Met ?sn Gly Thr ßly Phe 545 550 555 560 ACC ?AG ACG TGT Gßß GGC CCC CCß TGC AAC ATC GGG GGG GCC GßC A?C 1728 Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cvs ?sn He Gly Giy ?ia ßly Asn 565 570 575 AAC ACC TTG ACC TßC CCC ACT ß?C TGT TTT CGG ??G C?C CCC G?G GCC 1776 Asa Thr Leu Thr Cyß Pro Thr Asp Cys Phe ?rg Lys Hxs Pro Glu ?la 5B0 585 590 ?CC T?C GCC Aß? TGC GGT TCT GGG CCC TGG CTG ?C? CCT ?GG TGT ?TG 1824 ' Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser ßly Pro Trp Leu Thr Pro ?rg Cys Met 595 600 60S GTT C?T TAC CCA TAT ?GG CTC TGG CAC TAC CCC TßC ACT ßTC AAC TTC 1872 Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asa Phß 610 615 620 ACC ATC TTC AAG GTT ?GG ATß TAC GTG ßGG GSC CTG GAG C?C Aßß TTC 1920 Thr He Phe Lys Val Arg Met Tyr Val ßly ßly Val Glu His Arg Phß 625 630 635 640 G?A 6CC GCA TGC A?T TGß ACT CGA GGA G?G CßT TGT GAC TTG GAG GAC 1968 80 Glu Ala ?ia Cys ?sa Trp Thr Arg Gly ßl? Arg Cys Asp Leu Glu Asp 645 650 655 ?GGG?TAGATCAGAGCITAGC tXGCTGCTGCTGTCT?CA?CAG?GTGG 2016 Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp 660 665 670 CAG ATA CTG CCC TCT TCC TTC SCC ACC CTG CCG GCC CTA TCC ACC GGC 2064 ßla He Leu Pro Cys Ser Phe Thx Thx Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly 675 680 685 CTß ATC CAC CTC CAT C?G AAC ATC GTG GAC GTG C?? T?C- CTG TAC GGT 2112 Leu He His Leu His Gla Asn Ha Vai Asp Val Gla Tyr Leu t ßly 690 695 700 GT? GGG TCG ßCG GTT GTC TCC CTT ßTC ATC AAA TßS GAG TAT GTC CTG 2160 Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val He Lyß Tip Glu Tyr Val Leu 705 710 715 720 TTG CTC TTC CTT CTC CTG GCA GAC GCG CßC ATC TGC ßCC TGC TTA TGG 2208 Lßu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Aia ?rg He Cys Ala Cys Leu Trp .725 730 735 ATß ?TG CTG CTG ATA GCT CAA GCT GAG GCC GCC TT? G?G ??C CTG GTG 2256 Met üet Leu Leu Xle Aia Gla Aia ßlu Ala ?la Leu Glu ?sn Leu Val 740 7*3 750 GTC CTC ?AT GCG GCG GCC GTG GCC GGG GCG C?T ßGC ACT CTT TCC TTC 2304 Val Leu ?sn Ala Ala Ala Vai Ale ßiv Ala His Gly Thr Leu Ser Phe 755 760 765 CT? GTG TTC TTC TGT GCT GCC TSG TAC ATC AAß ßQC AGG CTG GTC CCT 2352 Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tvr He Lys Gly Arg Leu Val Pro 770 775 780 GGT GCG GC? T?C GCC TTC TAT GGC GTG TOG CCG CTG CTC CTG CTT CTG 2400 G y ?^e Aia Tyr Ala Pbe Tyr Gly Vai Trp Pro Lßu Leu Leu Leu Leu 785 790 795 800 CTG GCC TTA CCA CCA CGA GCT TAT GCC T?GT?? 2433 Leu Ala Lau Pro Pro ?rg Ala Tyr Aia 805 810 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 809 aminoáccidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteina 81 <?i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 50: Met Ser Thr Asn Pro Lyß Pro ßia Arg Lys Thr Lys Arg ?an Thr Aen i 5 10 15 ' Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln He Val Gly 20 25 30 Gly Val Tyr Leu Leu. Pro Arg Arg Giy Pro ?rg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 "45 5 Tbr ?rg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gip Pro Arg ßly ?rg ?rg Gin Pro 50 55 60 He Pro Lys Aia Axg Axg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gla Pro Gly 65 70 75 80 Tyr ro Trp Pro Leu Tyr Gly ?sa Glu Gly Het Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 Arg ?rg ?rg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val He ?sp Thr Leu Thr Cyß 115 120 125 i fi Gly Phe ?la ?sp Leu Val ßly Tyr lie Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu 130 135 140 Gly ßly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His ßly Val Arg Val Leu Glu Asp 145 150 155 160 "Gly Val Asa Tyr Ala Thr ßly Asa Leu Pro ßly Cys Ser Phe Ser He 165 170 175 Phe Leu Lßu Aia Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser ?la Tyr 180 185 190 Glu Val ?rg ?sa Val Ser Gly Met Tyr Kis Val Thr ?sn ?sp Cys Ser 195 200 • 203 15 Asn Ser Ser He Val Tyr ßlu Ala Ala Asp Met He Met His Thr Pro 210 215 220 ~ ßly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asa ?sa Ser ser Arg Cys Trp Val 225 230 235 240 ?la Leu Thr Pro Thr Leu Ala ?la Arg Asa Ala Ser Val Pro Thr Thr 245 250 255 Thr He Arg Arg His Val Asp Leu Lßu Val ßly Ala Ala Ala Phe Cys 260 265 270 Ser Ala Met T Val Cly Aso Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu al Ser 275 ' 280 285 20 Gln Leu Phe Thr He Ser Pro Arg ?rg His ßlu Thr Vai ßla Asp Cys 290 295 300 Asn Cys Ser He Tyr Pro Gly His He Thr Gly Hie Arg Met Ala Trp 305 310 315 320 Asp Met Met Met Asa Trp Ser Pro Thr Thr Ala Lßu Val Val Ser Gla 325 330 335 Leu Leu Arg He Pro ßla Ala Val Val Aep Met Val Ala Gly Ala Kis 340 345 350 Trp Gly Val Leu Ala Gly Lßu ?la Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asa Tr 355 360 365 25 Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala ßly Val Asp Gly Kia 82 370 375 380 Thr Arg val Ser Gly Gly Ala ?la Ala Ser Asp Thr Arg Gly Lßu Val 3S5 . * 390 395 400 Ser Leu Pbe Ser Pro Gly Ser ?la Gla Lys He Gla Leu Val ?an Thr 405 410 415 ?sa Gly er Trp His He Asa Arg Thr Ala Lßu Asa Cys Asa Asp Ser 420 425 430 Leu Gla Thr Gly Phe Phe ?la ?la Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asa 435 440 445 Ser Ser Gly Cys Pro ßlu ?rg Leu Ala Ser Cys ?rg Ser He Asp Lys 450 455 460 Phe Ala Gla Gly Trp Gly Pro Lßu Thr Tyr Thr Giu Pro Asn Ser Ser 465 470 475 480 ?sp ßin Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro ?rg Pro Cys ßly He 485 490 495 Val Pro Ala Ser ßla Val Cyß Gly Pro Val Tyr Cvß Phe Thr Pro Ser 500 5D5 510 Pro Val Vai Val ßly Tbr Thr Asp Arg Phß Gly Vai Pro Thr Tyr Asp 515 520 525 Trp Giy ?la Asa ?sp Ser ?sp Val Lßu He Leu ?sa ?sa Thr Arg Pro 530 535 SiO Pro Arg Gly ?sa Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asa Gly Thr ßly Phe 545 550 555 560 O¡x Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys *sa He ßiy Gly Ala Gly Asn 565 570 575 Asa Thr Lßu Thr Cys Pro Thr ?sp Cys Phe Arg Lvs His Pro Glu Ala 580 585 590 Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly pro Trp Leu Thr Pro ?rg Cys Mßt 595 600 605 Val His T Pro Tyr ?ng Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe 610 615 620 Thr He Phe Lys Val ?rg Ket Tyr Val Gly Gly Val Glu His ?rg Phß 625 630 635 640 Glu ?la Aia Cys Asn Trp Thr Arg ßly Glu ?rg Cys ?sp Leu Glu ?sp 645 6S0 655 Arg ?sp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Lßu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp ' 660 665 670 Gla He Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu pro Ala Leu Ser Thr Gly 675 680 685 Leu He His Lßu His Gla. Asa He Val Asp Val Gla Tyr Leu Tyr Gly 690 695 700 83 Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val He Lys T?p Glu Tyr Val Leu 705 710 715 720 Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala ?sp Ala ?rg He Cys Aia Cys Leu Trp 725 730 735 Met Mßt Leu Leu He Aia Gla Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asa Leu Val ' 740 745 750 Val Lßu Asn Ala Aia Ala Vai Aia Gly Ala Hiß Gly Thr Lßu Ser Phe 755 760 765 Leu Val he Phß Cys Ala Ala Trp Tyr He Lys Gly Arg Leu Val Pro 770 775 780 Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Lßu Leu Leu 785 790 795 800 Leu Ala Lßu Pro Pro ?rg Ala Tyr Ala 805 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado (B) LOCALIZACIÓN: 1...17 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 51 : Ser Asn Ser Ser Giu Aia Ala ?sp Met He Met His Thr Pro Gly Cys 1 5 10 ?s Val 84 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 52: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 22 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado (B) LOCALIZACIÓN: 1...22 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 52 ; ßly Gly He Thr Gly His Arg Met ?la Tzp ?sp Met Mee Met Asa Trp 1 5 l0 , 1,5 Ser Pro Tb Thr Ala Leu 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 37 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 85 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado (B) LOCALIZACIÓN: 1...37 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 53: Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly lie Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 1 5 10 15 Ser Asn Ser Ser He Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met He Met His Thr 25 30 Pro Gly Cys Gly Lys 35 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado 86 (B) LOCALIZACIÓN: 1...25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 54: Gly Gly Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg ?sp Gly Lys Lßu Pro Ala Thr 1 5 10 15 ßla Leu Axg ?rg His He Asp Leu Lßu 20 25 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: sitio modificado (B) LOCALIZACIÓN: 1...25 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 55: Gly ßly Thr Pro Thr Leu Aia Ala Arg Asp Ala Ser Val Pro Thr Thr 1 5 10 15 Thr He Arg ?rg Hiß Val ?sp Leu Leu 20 25 87 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 56 : Leu Leu Ser Cys Lßu Thr Vai Pro Aia Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn i 5 10 ' 15 Ser Thr ßly Leu 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 57 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 57: 88 Gln Val Arg ?sn Ser Thr ßly L Tyr His Val Thr Asa Asp Cys Pro 1 5 10 15 Asa Ser Ser He 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 58 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 58: Asa ?sp Cys Pro Asa Ser Ser He Val Tyr Glu Ala His Asp Ala He i . 5 10 15 Leu His Thr Pro 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 59 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 89 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 59: Ser Asa Ser Ser Xle Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met He Met His Thr 1 5 10 15 Pro Gly Cys Val 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 60 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C ) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 60: His ?sp ?la He Lßu His Thr Pro Gly Val Pro Cyß Val Arg Glu Gly 1 5 10 15 Asn Val Ser (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 61: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 90 (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 61: Cys Val ?rg Glu Gly Asp Val Ser Arg cys Trp Val Ala Met Thr Pro 1 S 10 15 Tbr Val Ala Thr 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 62: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 62: ?la Het Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Giy Lvs Lßu Pro ?la Thr 1 5 10 " 15 ßla Leu ?rg ?rg 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 63: 91 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 63: Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His lie Asp Leu Leu Val Gly Ser 1 5 10 15 Ala Thr Leu Cys 20 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 64 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 64: 92 Leu Val ßly Ser ?la Thr Leu Cys Ser ?la Leu Tyr Val Gly Asp Lßu 1 5 10 15 Cys Gly Ser Val 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 65 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 65 : Gla Leu Phß Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr ßla Gly Cyß 1 5 10 15 Asn Cys Ser He 20 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 66 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 93 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (Xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 66: Thr Gla Gly Cys Asn Cys Ser He Tyr Pro ßly His He Thr Gly His 1 5 10 15 Arg Met ?la Trp 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 67 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 67 : He Ihr Gly His Arg Met Ala Trp ?sp Met Met Met Asn Trp ser Pro 1 5 1 i n0 1 - 5. Thr ?la ?la Leu 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 68 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 94 (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 68 : Aßn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Mßt Ala ßla Leu Leu ?rg He 10 15 Pro Gla Ala He 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 69 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 69 : Leu Lßu Arg He Pro ßln Ala He Leu ?sp Met He Ala Gly Ala His 10 15 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 70 : 95 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 70 : Ala ßly ?la Kis Trp Gly Val Lßu Ala Gly He Ala Tyr Phe Ser Met 1 • 5 10 15 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 71: Val Val Leu Leu Leu Phß Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr He Val Ser 1 5 10 1S Gly Cly ßln Ala 20 96 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 72: Ser Gly Leu Val Ser Leu Phß Thr Pro ßly ?la Lys ßln Asn He ßla 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 73: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 97 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 73: Gla Asa He Gla Leu Ue Asa Thr Asa Gly Ola Trp His He Asa Ser 1 5 10 15 Thr ?la Leu Asn 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 74 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 21 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 74 : Leu Asa Cys ?sn Glu Ser Leu Asn Thr Gly Trp Trp Leu ?la ßly Leu 1 S 10 15 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 75: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 98 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 75: Ala Gly Leu He Tyr ßln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu 1 5 10 15 ?rg Leu ?ia Ser 20 ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 76 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 76 : ßly Cys Pro ßlu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Pro Leu Thr Asp Pbe Asp 1 5 10 15 ßln ßly Trp Gly 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 77: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 99 (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 77: Thx Asp Phß ?sp ßln Gly Trp ßly Pro He Ser Tyr Ala Asa ßly Ser 1 5 10 15 ßly Pro Asp ßln 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 78: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 78 : Ala Asa Gly Ser Gly Pro ?sp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro 1 5 10 15 Pro Lys Pro Cys 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 79 : 100 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 79 : Trp- His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly He Val Pro Ala Lys Ser Val 1 S 10 15 Cys Gly Pro Val (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 80: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 80: 101 Ala Lyß Ser Val Cyß Gly Pro Val ayr Cyß phe Thr Pro S x Pro Val 1 5 10 15 Val Val Gly Thr 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 81 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 81 : Pro S T Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr 1 . 5 10 15 Tyr Ser Trp Gly 20 . ( 2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 82 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 102 ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 82 : Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu ?sn Asp Thr Asp Val Phß Val 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 83: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 83 : ßly Asa Trp Phß Gly Cys Thr Trp Met ?sn Ser «ir ßly Phß Thr Lyß 10 15 Val Cys ßly Ala 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 84: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos 103 (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 84 ; Gly Phe Thr Lys Val ' Cys Gly Ala Pro Pro Val Cys He Gly Gly Ala 1 5 m 1 ,5___ Gly Asa Asa Thr- 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 85 : He Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu His cys Pro Thr Asp Cys Ara 1 5 1 -u0. 15 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 86: 104 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (Ü) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 86 : Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly 10 15 Ser Gly Pro Trp 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 87: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 87: 105 Ser ?rg Cys ßly Ser Gly Pro Trp He Thr Pro ?rg Cys Leu Val Asp 5 10 is Tyr Pro Tyr Arg 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 88 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 88: Cyß Leu Val ?sp Tyr Pro Tyr ?rg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr He 1 5 10 15 Asn Tyr Thr He 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 89: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 106 ( i) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 89: Pro Cys Thr He Asn Tyr Thr He Phe Lys He Arg Met Tyr Val Giy 1 5 10 15 Gly Val ßlu His 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 90: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 90 : Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Lßu Glu Ala Ala Cys Asa Trp 1 5 10 15 Thr Pro Gly Glu 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 91: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única 107 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 91: Ala Cys Asn Trp Thr Pro ßly Glu Arg Cys ?sp Leu Glu ?sp Arg ?sp 1 . 5 . 10 15 ?rg Ser Glu Leu 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 92: Glu ?sp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr 1 - 5 10 15 Gln Trp Gla Val 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 93: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: 108 (A) EXTENSIÓN: 9 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 93: Tyr ßla Val Arg Asa Ser Thr Gly Leu 1 5 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 94: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: SI (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 94: 109 ACGTCCGTAC GTTCG?ATTA ATT??TCG? 29 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 95: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 60 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: CDNA (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: SI (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 95 : CCTCCGGACG TGC?CTAGCT CCCGTCTGTG GTAGTGßTGG TAGTGATTAT CA?TTAATTG ßO (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 96: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 110 (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 96: GTTTAACCAC TGC?TGATG ?$ (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 97: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID NO: 97 : GTCCC?TCßA GTßCGGCT?C 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 98: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 45 pares de bases 111 (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 98: CGTG?CATGG TACATTCCGß ACACTTGGCß CACTTC?l?? GCGG? 45 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 99 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 99: 112 TGCCTC?TAC ACAATGGAGC TCTßGGACGA GTCGTTCßTG AC 42 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉ ICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 100: TACCCAGC?G CGGG?GCTCT GTOGCTCCCG AACGC?GGGC AC 42 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 101: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 113 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 101 : TGTCGTGSGG GGGACGGAGG CCTGCCTAGC TGCG?GCGTG GG 42 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 48 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 102: CGTTATOTGG CCCGGGTAG? TTG?CC?CTG ßC?GTCCTßC ACCGTCTC 48 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 103 : 114 (i) CARACTERISTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* SI (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 103: CAGGGCCGTT CTAGGCCTCC ACTGCATCAT CATATCCCft? GC 2 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO 115 ( ÍÜ) CODIFICADORA NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 104: CCGG??TGTA CCATGTCACG AACGSC 26 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA1: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 105: ßCTCCATTßT GTATG?GGCA GCGG 24 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única 116 (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 106: GAGCTCCCGC TGCTGGGTAG CGC 23 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 107: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 107: CCTCCGTCCC CACC?CGAC? ATACG 25 117 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 108: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 108: Ct?CCCGGGC CACATA?CGG GTCACCG 27 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) 118 (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA*: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 109: GGAGGCCT?C AACGGCCCTG GTGG 24 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 110: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA* NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 110: TTCTATCGAT TAAAT?ß??T TC 22 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 111: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 119 (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (iii) HIPOTÉTICA: NO (iii) CODIFICADORA: NO (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 111: GCCATACGCT CACAGCCG?T CCC 23 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 112: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 112 ; Tyr Glu Val ?rg Asa Val Ser Gly He Tyr His Val Thr Asa ?sp cys 1 . 5 10 15 Ser Asa Ser Ser 20 120 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 113: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 113 : Thr Asa Asp Cys Ser Asa Ser Ser He Val Tyr Glu Aia ?la Asp 1 S 10 15 Met. He Met His Thr 20 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 114: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 114: 121 Ala Ala Asp Met He er His Tbr Pro Gly Cy» Val Pro Cye Val i 5 10 . 15 Arg Glu Asa Asa Ser 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 115 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 115 : Pro Cys Val Arg Glu Aßn Asn Ser Ser Arg Cyß Trp Val Ala Leu - 1 5 10 15 Tar Pro Thr Leu ?la 20 " ~ (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 116: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal 122 ( ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 116 : val Ala Leu Tbr Pro «i Leu Alo Ala Arg Aßn Ala Ser Val Pro 1 5 10 15 ?ir Thr Tbr He Arg 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 117 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 117: Ser Val Pro Thr Thr Thr He Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val 1 5 10 15 Gly Ala Ala Ala Phe 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 118 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido 123 (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 118 : Leu Leu Val ßly Ala ?la ?la Phß Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly 1 • 5 10 15 Asp Leu Cys Gly Ser 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 119 ; (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 119 : Tyr Val Gly Asp Leu Cyß Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gla Leu 1 5 10 15 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO : 120 : 124 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO : 120 : Ser Gla Lea Phe Thr He Ser Pro Arg ?rg Eis Glu Thr Val Gla 1 5 10 15 Asp Cys Asn Cys Ser 20 (2 ) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 121 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 121: Thr Val ßln ?sp Cys Asn Cys Ser He Tyr Pro Gly His He Thr 1 5 10 15 . Gly His Arg Met Ala 20 125 (2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID NO: 122: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) EXTENSIÓN: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) HEBRA: única (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido ¡xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12; His He Thr ßly Kis Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asa Trp 1 5 10 15 Ser Pro Thr Thr Aia 20 * O ANTI-SENTIDO

Claims (26)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una composición de vacuna profiláctica, caracterizada porque comprende una cantidad profilácticamente efectiva de al menos una proteína de envoltura purificada recombinante oligomérica específica o simple del HCV seleccionada de una proteína E1 , una proteína E2 y partes de tales proteínas E1 y E2; y de manera opcional un adyuvante aceptable para uso farmacéutico.
2. 2. Una composición de vacuna profiláctica, caracterizada porque comprende una cantidad profilácticamente efectiva de una combinación de al menos dos proteínas de envoltura purificada recombinantes oligoméricas específicas o simples del HCV seleccionadas de las proteínas E1 derivadas de diferentes genotipos o subtipos del HCV, proteínas E2 derivadas de diferentes genotipos o subtipos del HCV y partes de tales proteínas de E1 y E2, y de manera opcional un adyuvante aceptable para uso farmacéutico.
3. 3. Una composición de vacuna profiláctica, caracterizada porque comprende una cantidad profilácticamente efectiva de al menos una de los siguientes péptidos E1 y E2: E1-31 (SEC ID NO: 56) que abarca los aminoácidos 181 a 200 de la región Central/E1 V1 , E1-33 (SEC ID NO: 57) que abarca los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1-35 (SEC ID NO: 58) que abarca los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2 , E1-35A (SEC ID NO: 59) que abarca los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2, 1 bE1 (SEC ID NO: 53) que abarca los aminoácidos 192 a 228 de las regiones E1 (regiones V1 , C1 y V2) , E1-51 (SEC ID NO: 66) que abarca los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1-53 (SEC ID NO: 67) que abarca los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4, E1-55 (SEC ID NO: 68) que abarca los aminoácidos 325 a 344 de la región E1. Env 67 o E2-67 (SEC ID NO:72), que abarca las posiciones de aminoácido 397 a 418 de la región E2 , Env 69 o E2-69 (SEC ID NO: 73), que abarca las posiciones de aminoácido 409 a 428 de la región E2, Env 23 o E2-23 (SEC ID NO: 86), que abarca las posiciones 583 a 602 de la región E2, Env 25 o E2-25 (SEC ID NO: 87), que abarca las posiciones 595 a 614 de la región E2, Env 27 o E2-27 (SEC ID NO: 88) que abarca las posiciones 607 a 626 de la región E2, Env 17B o E2-17B (SEC ID NO: 83) que abarca las posiciones 547 a 586 de la región E2, Env 13B o E2-13B (SEC ID NO: 82) que abarca las posiciones 523 a 542 de la región E2, IGP 1626 que abarca las posiciones 192-211 de la región E1 (SEC ID No: 112), IGP 1627 que abarca las posiciones 204-223 de la región E1 (SEC ID No: 113), IGP 1628 que abarca las posiciones 216-235 de la región E1 (SEC ID No:114), IGP 1629 que abarca las posiciones 228-247 de la región E1 (SEC ID No: 115), IGP 1630 que abarca las posiciones 240-259 de la región E1 (SEC ID No:116), IGP 1631 que abarca las posiciones 252-271 de la región E1 (SEC ID No: 117), IGP 1632 que abarca las posiciones 264-283 de la región E1 (SEC ID No: 118), IGP 1633 que abarca las posiciones 276-295 de la región E1 (SEC ID No: 119), IGP 1634 que abarca las posiciones 288-307 de la región E1 (SEC ID No: 120), IGP 1635 que abarca las posiciones 300-319 de la región E1 (SEC ID No: 121 ) y, IGP 1636 que abarca las posiciones 312-331 de la región E1 (SEC ID No:122); y de manera opcional, un adyuvante aceptable para uso farmacéutico.
4. 4. Una composición profiláctica, caracterizada porque comprende una cantidad profilácticamente efectiva de al menos una proteína de envoltura purificada recombinante oligomérica específica o simple del HCV seleccionada de una proteína E1 , una proteína E2 y partes de tales proteínas E1 y E2; y de manera opcional un adyuvante aceptable para uso farmacéutico.
5. 5. Una composición profiláctica, caracterizada porque comprende una cantidad profilácticamente efectiva de una combinación de al menos dos proteínas de envoltura purificada de HCV recombinantes oligoméricas específicas o simples del HCV seleccionadas de las proteínas E1 derivadas de diferentes genotipos o subtipos del HCV, proteínas E2 derivadas de diferentes genotipos o subtipos del HCV y partes de tales proteínas de E1 y E2, y de manera opcional un adyuvante aceptable para uso farmacéutico.
6. 6. Una composición profiláctica, caracterizada porque comprende una cantidad profilácticamente efectiva de al menos uno de los siguientes péptidos E1 y E2: E1-31 (SEC ID NO: 56) que abarca los aminoácidos 181 a 200 de la región Central/E 1 V1 , E1-33 (SEC ID NO: 57) que abarca los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1 -35 (SEC ID NO: 58) que abarca los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2, E1 -35A (SEC ID NO: 59) que abarca los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2, 1 bE1 (SEC ID NO: 53) que abarca los aminoácidos 192 a 228 de las regiones E1 , regiones V1 , C1 y V2, E1-51 (SEC ID NO: 66) que abarca los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1-53 (SEC ID NO: 67) que abarca los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4, E1-55 (SEC ID NO: 68) que abarca los aminoácidos 325 a 344 de la región E1 , Env 67 o E2-67 (SEC ID NO: 72), que abarca las posiciones de aminoácido 397 a 418 de la región E2, Env 69 o E2-69 (SEC ID NO: 73), que abarca las posiciones de aminoácido 409 a 428 de la región E2, Env 23 o E2-23 (SEC ID NO: 86), que abarca las posiciones 583 a 602 de la región E2, Env 25 o E2-25 (SEC ID NO. 87), que abarca las posiciones 595 a 614 de la región E2, Env 27 o E2-27 (SEC ID NO: 88) que abarca las posiciones 607 a 626 de la región E2, Env 17B o E2-17B (SEC ID NO: 83) que abarca las posiciones 547 a 586 de la región E2, Env 13B o E2-13B (SEC ID NO: 82) que abarca las posiciones 523 a 542 de la región E2, IGP 1626 que abarca las posiciones 192-211 de la región E1 (SEC ID No: 112), IGP 1627 que abarca las posiciones 204-223 de la región E1 (SEC ID No: 113), IGP 1628 que abarca las posiciones 216-235 de la región E1 (SEC ID No:114), IGP 1629 que abarca las posiciones 228-247 de la región E1 (SEC ID No:115), IGP 1630 que abarca las posiciones 240-259 de la región E1 (SEC ID No:116), IGP 1631 que abarca las posiciones 252-271 de la región E1 (SEC ID No:117), IGP 1632 que abarca las posiciones 264-283 de la región E1 (SEC ID No: 118), IGP 1633 que abarca las posiciones 276-295 de la región E1 (SEC ID No:119), IGP 1634 que abarca las posiciones 288-307 de la región E1 (SEC ID No: 120), IGP 1635 que abarca las posiciones 300-319 de la región E1 (SEC ID No: 121 ) y IGP 1636 que abarca las posiciones 312-331 de la región E1 (SEC ID No: 122) y , de manera opcional, un adyuvante aceptable para uso farmacéutico.
7. 7.- La composición profiláctica de conformidad con las reivindicaciones 1 a 6, caractepzada porque es para inducir anticuerpos específicos de HCV.
8. 8.- La composición profiláctica de conformidad con cualesquiera de una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque estimula la actividad de la célula T.
9. 9.- La composición profiláctica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque es capaz de aumentar protección contra infección con genotipo o subtipo de HCV diferente del genotipo o subtipo de HCV, o genotipos o subtipos de HCV, del cual los complejos de proteína E1 , E2 o E1/E2 se derivan.
10. 10.- Una composición de vacuna terapéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los siguientes péptidos E1 y E2: E1-31 (SEC ID NO: 56) que abarca los aminoácidos 181 a 200 de la región Central/E1 V1 , E1-33 (SEC ID NO: 57) que abarca los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1-35 (SEC ID NO: 58) que abarca los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2, E1-35A (SEC ID NO: 59) que abarca los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2, 1 bE1 (SEC ID NO: 53) que abarca los aminoácidos 192 a 228 de las regiones E1 , regiones V1 , C1 y V2, E1-51 (SEC ID NO: 66) que abarca los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1-53 (SEC ID NO: 67) que abarca los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4, E1-55 (SEC ID NO: 68) que abarca los aminoácidos 325 a 344 de la región E1 , Env 67 o E2-67 (SEC ID NO: 72), que abarca las posiciones de aminoácido 397 a 418 de la región E2, Env 69 o E2-69 (SEC ID NO: 73), que abarca las posiciones de aminoácido 409 a 428 de la región E2, Env 23 o E2-23 (SEC ID NO: 86), que abarca las posiciones 583 a 602 de la región
11. E2, Env 25 o E2-25 (SEC ID NO. 87), que abarca las posiciones 595 a 614 de la región E2, Env 27 o E2-27 (SEC ID NO: 88) que abarca las posiciones 607 a 626 de la región E2,
12. Env 17B o E2-17B (SEC ID NO: 83) que abarca las posiciones 547 a 586 de la región E2, Env 13B o E2-13B (SEC ID NO: 82) que abarca las posiciones 523 a 542 de la región E2, IGP 1626 que abarca las posiciones 192-211 de la región E1 (SEC ID No: 112), IGP 1627 que abarca las posiciones 204-223 de la región E1 (SEC ID No: 113), IGP 1628 que abarca las posiciones 216-235 de la región E1 (SEC ID No:114), IGP 1629 que abarca las posiciones 228-247 de la región E1 (SEC ID No: 115), IGP 1630 que abarca las posiciones 240-259 de la región E1 (SEC ID No: 116), IGP 1631 que abarca las posiciones 252-271 de la región E1 (SEC ID No: 117), IGP 1632 que abarca las posiciones 264-283 de la región E1 (SEC ID No: 118), IGP 1633 que abarca las posiciones 276-295 de la región E1 (SEC ID No: 119), IGP 1634 que abarca las posiciones 288-307 de la región E1 (SEC ID No: 120), IGP 1635 que abarca las posiciones 300-319 de la región E1 (SEC ID No: 121 ) y IGP 1636 que abarca las posiciones 312-331 de la región E1 (SEC ID No: 122) y , de manera opcional, un adyuvante aceptable para uso farmacéutico. 11.- Una composición terapéutica, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos uno de los siguientes péptidos E1 y E2: E1 -31 (SEC ID NO: 56) que abarca los aminoácidos 181 a 200 de la región Central/E1 V1 , E1-33 (SEC ID NO: 57) que abarca los aminoácidos 193 a 212 de la región E1 , E1-35 (SEC ID NO: 58) que abarca los aminoácidos 205 a 224 de la región E1 V2,
13. E1 -35A (SEC ID NO: 59) que abarca los aminoácidos 208 a 227 de la región E1 V2, 1 bE1 (SEC ID NO: 53) que abarca los aminoácidos 192 a 228 de las regiones E1 , regiones V1 , C1 y V2, E1-51 (SEC ID NO: 66) que abarca los aminoácidos 301 a 320 de la región E1 , E1 -53 (SEC ID NO: 67) que abarca los aminoácidos 313 a 332 de la región E1 C4,
14. E1-55 (SEC ID NO: 68) que abarca los aminoácidos 325 a 344 de la región E1 ,
15. Env 67 o E2-67 (SEC ID NO: 72), que abarca las posiciones de aminoácido 397 a 418 de la región E2, Env 69 o E2-69 (SEC ID NO: 73), que abarca las posiciones de aminoácido 409 a 428 de la región E2, Env 23 o E2-23 (SEC ID NO: 86), que abarca las posiciones 583 a 602 de la región
16. E2, Env 25 o E2-25 (SEC ID NO. 87), que abarca las posiciones 595 a 614 de la región
17. E2, Env 27 o E2-27 (SEC ID NO: 88) que abarca las posiciones 607 a 626 de la región
18. E2, Env 17B o E2-17B (SEC ID NO: 83) que abarca las posiciones 547 a 586 de la región E2, Env 13B o E2-13B (SEC ID NO: 82) que abarca las posiciones 523 a 542 de la región E2, IGP 1626 que abarca las posiciones 192-211 de la región E1 (SEC ID No:112),
19. IGP 1627 que abarca las posiciones 204-223 de la región E1 (SEC ID No:113),
20. IGP 1628 que abarca las posiciones 216-235 de la región E1 (SEC ID No: 114),
21. IGP 1629 que abarca las posiciones 228-247 de la región E1 (SEC ID No: 115), IGP 1630 que abarca las posiciones 240-259 de la región E1 (SEC ID No:116), IGP 1631 que abarca las posiciones 252-271 de la región E1 (SEC ID No:117), IGP 1632 que abarca las posiciones 264-283 de la región E1 (SEC ID No:118), IGP 1633 que abarca las posiciones 276-295 de la región E1 (SEC ID No:119), IGP 1634 que abarca las posiciones 288-307 de la región E1 (SEC ID No: 120), IGP 1635 que abarca las posiciones 300-319 de la región E1 (SEC ID No: 121 ) y IGP 1636 que abarca las posiciones 312-331 de la región E1 (SEC ID No:122) y , de manera opcional, un adyuvante aceptable para uso farmacéutico. 12.- Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 10 u 11 , caracterizada porque induce anticuerpos específicos de HCV . 13.- Una composición terapéutica de conformidad con la reivindicación 10 u 11 , caracterizada porque estimula la actividad de células T. 14.- Una composición terapéutica de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizada porque es terapéuticamente efectiva en el portador infectado de HCV con un genotipo o subtipo de HCV diferente del genotipo o subtipo de HCV, o genotipo o subtipo de HCV del cual los complejos de proteínas E1 , E2 o E1/E2 se derivan. 15.- .- Una composición, caracterizada porque comprende al menos uno de los siguientes péptidos E1 y E2: IGP 1626 que abarca las posiciones 192-211 de la región E1 (SEC ID No:112), IGP 1627 que abarca las posiciones 204-223 de la región E1 (SEC ID No: 113), IGP 1628 que abarca las posiciones 216-235 de la región E1 (SEC ID No:114),
22. IGP 1629 que abarca las posiciones 228-247 de la región E1 (SEC ID No: 115), IGP 1630 que abarca las posiciones 240-259 de la región E1 (SEC ID No:116), IGP 1631 que abarca las posiciones 252-271 de la región E1 (SEC ID No:117), IGP 1632 que abarca las posiciones 264-283 de la región E1 (SEC ID No:118), IGP 1633 que abarca las posiciones 276-295 de la región E1 (SEC ID No: 119), IGP 1634 que abarca las posiciones 288-307 de la región E1 (SEC ID No: 120), IGP 1635 que abarca las posiciones 300-319 de la región E1 (SEC ID No: 121 ) y IGP 1636 que abarca las posiciones 312-331 de la región E1 (SEC ID No:122) y , de manera opcional, un adyuvante aceptable para uso farmacéutico. 16.- Una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4, 5, 7-9 y 12 a 14, caracterizada porque las cisteinas de proteínas de envoltura recombinantes de HCV son bloqueadas, o de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3, 6, 10, 11 y 15, en donde las cisteinas de los péptidos E1 y E2 son bloqueadas. 17.- Una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4, 5, 7 a 9 y 12 a 14, caracterizada porque las proteínas de envoltura recombinantes de HCV son adicionadas como partículas similares a las virales. 18.- Una composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4, 5, 7 a 9 y 12 a 14, caracterizada porque la proteína de envoltura recombinante de HCV E1 es una proteína E1 s. 19.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1 , 2, 4, 5, 7 a 9 y 12 a 14, caracterizada porque las proteínas de envoltura recombinantes de HCV son producidas por células recombinantes de mamífero, por células de levadura recombinante o por virus recombinante. 20.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 3, 6, 10, 11 y 15, caractepzada porque los péptidos son péptidos recombinantes o péptidos sintéticos. 21.- Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende un virus recombinante que permite la expresión de al menos una proteína de envoltura recombinante de HCV seleccionada de la proteína E1 y/o proteína E2, y partes de las proteínas E1 y E2; y de manera opcional, un adyuvante aceptable para uso farmacéutico. 22.- Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende un virus recombinante que permite la expresión de al menos una proteína de envoltura recombinante de HCV seleccionada de la proteína E1 y/o proteína E2, y partes de las proteínas E1 y E2; y, de manera opcional, un adyuvante aceptable para uso farmacéutico.
23. 23.- La composición de conformidad con la reivindicación 21 o 22, caracterizada porque es efectiva en contra de un genotipo o subtipo de HCV diferente del genotipo o subtipo de HCV, del cual la proteína E1 y/o proteípa E2 o las partes de las mismas se derivan.
24. 24.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque induce anticuerpos específicos de HCV.
25. 25.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 23, caracterizada porque estimula la ctividad de células T.
26. 26.- La composición de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizada porque el virus recombinante es un virus de vaccinia recombinante, virus avipox recombinante o virus recombipante de Ankara modificado.