CN1547588A - 用于诊断和治疗用途的纯化的丙型肝炎病毒外被蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于纯化选自E1和/或E2和/或E1/E2的HCV单个的或特异性寡聚外被蛋白的方法，其特征在于，在为了分离所述重组表达的蛋白而裂解转化过的宿主细胞时，用一种二硫键裂解剂进行二硫键裂解或还原的步骤。本发明还涉及一种通过该方法所分离的组合物。本发明还涉及所述组合物的诊断和治疗用途。另外，本发明涉及将HCV E1蛋白和肽用于预测和监测HCV治疗的临床效果和/或临床结果的用途。

Description

用于诊断和治疗用途的纯化的丙型肝炎病毒外被蛋白
发明领域
本发明涉及重组蛋白表达、重组蛋白纯化、合成肽、HCV感染诊断、对HCV感染进行预性防治疗的一般领域，并且涉及患有慢性肝炎个体的治疗的临床效果的预测/监测治疗效果，或预测/监测天然疾病。
更具体地讲，本发明涉及纯化丙型肝炎病毒外被蛋白的纯化方法，按照本发明所披露的方法所纯化的HCV外被蛋白在诊断、预防或治疗中的用途，以及单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白在监测疾病、和/或诊断疾病、和/或治疗疾病的测定方法中的用途。本发明还涉及E1和/或E2外被蛋白表位，以及它的单克隆抗体及其在诊断、预防或治疗中的用途。
发明背景
按照本发明所披露的方法，从细胞裂解物中纯化的E2蛋白能够与大约95％的患者的血清起反应。这种反应性类似于由CHO细胞中分泌的E2所获得的反应性(Spaete等，1992)。不过，细胞内表达形式的E2可能更接近于天然病毒外被蛋白，因为它含有高含量的甘露糖碳水化合物基序，而由CHO细胞中分泌的E2蛋白，由半乳糖和唾液酸糖成分进行过进一步的修饰。当E2的氨基末端部分是在杆状病毒系统中表达时，只能在来自若干患者组的大约13-21％的血清中检测到(Inoue等。1992)。在用大肠杆菌表达E2之后，HCV血清的反应性甚至更低，在14(Yokosuka等，1992)-17％(Mita等，1992)范围内。使用本发明的纯化的、疫苗表达的重组E1蛋白，大约有75％的HCV血清(以及95％的慢性患者)是抗E1阳性的，与Kohara等(1992)和Hsu等(1993)的结果形成了鲜明的对比。Kohara等使用痘苗病毒表达的E1蛋白，并且在7-23％的患者体内检测到抗E1抗体，而Hsu等使用杆状病毒表达的E1检测了14/50(28％)的血清。
以上结果表明，为了获得所述外被蛋白与人类患者血清的高的反应性，不仅需要好的表达系统，而且还需要好的纯化方法。这一目的可以通过使用本发明的正确的表达系统和/或纯化方法而实现，该方法能确保保持所述蛋白的天然折叠，并且本发明的纯化方法可以确保消除污染性蛋白，它能保持HCV外被蛋白的构象，并因此保持其反应性。诊断性筛选测定所需要的纯化HCV外被蛋白的量为每年数克。对于疫苗用途来说，可能需要更大量的外被蛋白。因此，可以利用所述痘苗病毒系统筛选最佳的表达构建体，并且用于有限的扩大表达，并且，在用若干酵母菌株表达时，可以实现大规模表达和纯化含有高甘露糖碳水化合物的单个的或特异性的寡聚外被蛋白。例如，对于乙型肝炎来说，与酵母产生的乙型肝炎疫苗相比，用哺乳动物细胞生产H BsAg的成本更高。
本发明的目的
本发明的一个目的是提供一种纯化重组表达的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的新方法，以便能够以不含杂质的单个的或特异性寡聚重组蛋白形式而不是凝聚体的形式，将所述重组蛋白直接用于诊断和疫苗接种目的。
本发明的另一个目的是提供含有纯化的(单个的或特异性寡聚的)重组E1和/或E2和/或E1/E2糖蛋白的组合物，所述糖蛋白含有来自HCV的E1和/或E2和/或E1/E2结构域的构象表位。
本发明的另一个目的是提供用于重组表达E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的新的重组载体构建体，以及用所述载体构建体转化过的宿主细胞。
本发明的另一个目的是提供一种用于生产并纯化重组HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的方法。
本发明的另一个目的是提供本发明的重组HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的诊断和免疫原用途，以及提供将含有本发明的任意一种重组HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的用于诊断目的的试剂盒、疫苗或治疗剂。
本发明的另一个目的是提供将E1和/或E2和/或E1/E2蛋白或其适当的部分用于监测/预测对患有HCV感染的患者进行治疗(例如，用干扰素治疗)的反应的新的用途。
本发明的另一个目的是提供将本发明的重组E1和/或E2和/或E1/E2蛋白用于HCV筛选和证实抗体测定的用途。
本发明的另一个目的是提供可用于诊断HCV感染并用于制备抗体的E1和/或E2肽。所述肽还可用于分离人单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供单克隆抗体，尤其是人单克隆抗体或人源化的小鼠单克隆抗体，这种抗体能与肽或重组蛋白中的构象表位所包含的E1和/或E2表位特异性地起反应。
本发明的另一个目的是提供将抗E1或抗E2单克隆抗体用于HCV抗原检测或用于慢性HCV感染治疗的可能的用途。
本发明的再一个目的是提供用于监测/预测对患有HCV感染的患者进行治疗(例如，用干扰素治疗)的反应或监测/预测所述疾病的后果的试剂盒。
本发明的所有目的都可以通过下面所提供的实施方案而实现。
定义
下面的定义用于解释在本发明中所使用的不同的术语和表达形式。
术语‘丙型肝炎病毒单个外被蛋白’表示含有一种氨基酸序列(和/或氨基酸类似物)的多肽或其类似物(例如，模拟表位)，该序列确定了E1或E2区的至少一个HCV表位。所述单个外被蛋白在其广义的含义上可以是单体或同型寡聚物形式的、重组表达的外被蛋白。通常，限定所述表位的序列相当于HCV的E1或E2区的氨基酸序列(相同或者通过用天然氨基酸残基类似物取代而不会破坏该表位)。一般，表位限定序列的长度为3个或3个以上氨基酸，更优选5个或5个以上氨基酸，更优选8个或8个以上氨基酸，更优选10个或10个以上氨基酸。对于构象表位来说，所述表位限定序列的长度可以有较大的改变，因为确信这种表位是由抗原的三维形状形成的(例如，折叠)。因此，限定所述表位的氨基酸的数量可以比较少，而且广泛分布在该分子的长度上，通过折叠形成正确的表位构象。位于限定表位的残基之间的抗原部分，对于该表位的构象的结构来说可能并不重要。例如，只要保留了对表位构象重要的序列(例如，与二硫键结合有关的半胱氨酸，糖基化位点等)，缺失或取代这些间插序列可能不会影响该构象表位。构象表位还可以通过同型寡聚物或异源寡聚物的亚基的两个或两个以上关键区而形成。
本发明的HCV抗原包括来自HCV的E1和/或E2(外被蛋白)结构域的构象表位，被认为对应于病毒外被蛋白的E1结构域，目前估计跨越HCV多蛋白的192-383号氨基酸(Hijikada等，1991)。在哺乳动物系统中进行表达(糖基化的)时，通过SDS-PAGE测定相信具有大约35kDa的分子量。据信以前被称为NS1的E2蛋白跨越HCV多蛋白的384-809或384-746号氨基酸(Grakoui等，1993)，并且它也是一种外被蛋白，在疫苗系统中表达时(糖基化的)据信它具有大约72kDa的表观凝胶分子量。相信这些蛋白的终点是大致的(例如，E2的羧基末端可能位于730-820号氨基酸片段中的某一位置上，例如，以730、735、740、742、744、745号氨基酸为终点，优选以746、747、748、750、760、770、780、790、800、809、810、820号氨基酸为终点)。所述E2蛋白还可以与E1、P7(747-809号氨基酸)、NS2(810-1026号氨基酸)、NS4A(1658-1711号氨基酸)或NS4B(1712-1972号氨基酸)一起表达。与上述其他HCV蛋白一起表达，对于获得正确的蛋白折叠来说是重要的。
还应当理解的是，在本发明的实施例部分所使用的分离物不是要用来限定本发明范围的，并且来自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10型或任何其他新基因型的HCV的任何HCV分离物都是用于实施本发明的E1和/或E2序列的合适来源。
用于本发明的E1和E2抗原可以是完整长度的病毒蛋白，其基本为全长的形式，或其功能性片段(例如，没有缺少形成或保留表位所必须的序列的片段)。另外，本发明的HCV抗原还可以包括不会妨碍或抑制形成感兴趣的构象表位的其他序列。通过用一种抗体(所述构象表位的多克隆或单克隆血清)筛选所述感兴趣的抗原，并且将它的反应性与仅仅保留了线性表位(如果有的话)的所述抗原的变性形式的反应性进行比较，可以方便地确定构象表位的存在与否。在所述用多克隆抗体进行的筛选中，优选首先用变性的抗原吸附所述多克隆血清，并观察是否能保留感兴趣抗原的抗体。
本发明的HCV抗原可以通过能提供感兴趣的表位的任何重组方法制备。例如，对于天然HCV抗原来说，在哺乳动物或昆虫细胞中进行重组细胞内表达是提供具有“天然”构象的糖基化E1和/或E2抗原的优选方法。酵母细胞和突变型酵母菌株(例如，mnn9突变体(Kniskern等，1994)或通过矾酸盐抗性筛选所产生的糖基化变体(Ballou等，1991))很适合生产分泌的高甘露糖型糖类；而由哺乳动物细胞分泌的蛋白可能含有包括半乳糖或唾液酸在内的修饰，这种修饰对于某些诊断或疫苗用途来说可能是不需要的。不过，对于某些用途来说是可行的并且是足够的，因为对蛋白来说，已知可以在其他重组宿主(如大肠杆菌)中表达所述抗原，并且在回收之后对该蛋白进行复性。
术语‘融合多肽’是指这样一种多肽，其中，HCV抗原是单个的连续氨基酸链的一部分，该氨基酸链不是天然存在的。所述HCV抗原可以通过肽键直接彼此连接，或者通过间插氨基酸序列分开。所述融合多肽还可以含有对于HCV来说是外源的氨基酸序列。
术语‘固相’是指一种固体物质，单个的HCV抗原或由HCV抗原组成的融合多肽通过共价结合或诸如疏水性吸附的非共价性结合形式与它连接。
术语‘生物学样品’是指哺乳动物个体(例如，类人猿、人)的体液或组织，它通常含有由所述个体所产生的抗体，尤其是抗HCV的抗体。所述体液或组织还可以含有HCV抗原。所述成分为本领域所公知，并且包括，但不限于血液、血浆、血清、尿液、脑脊液、淋巴液、呼吸道、肠道或泌尿生殖道的分泌物、眼泪、唾液、乳汁、白细胞和骨髓。身体成分包括生物学液体。术语‘生物学液体’是指从一种生物体内获得的体液。某些生物学体液被用作其他制品的来源，如凝血因子(例如，因子VIII；C)、血清白蛋白、生长激素等。在这种情况下，重要的是生物学液体的来源没有受到诸如HCV的病毒的污染。
术语‘免疫学反应性’表示有关抗原能够与存在于来自HCV感染过的个体的身体成分中的抗HCV抗体特异性地反应。
术语‘免疫复合物’是指当抗体与抗原上的表位结合以后所形成的组合物。
本文所说的‘E1’是指在HCV多蛋白的前400个氨基酸内表达的蛋白或多肽，有时候是指E、ENV或S蛋白。其天然形式是一种35kDa的糖蛋白，发现它与膜紧密结合。在大多数天然HCV菌株中，E1蛋白是在病毒多蛋白中紧随C(核心)蛋白之后编码的。E1蛋白从所述完整长度多蛋白的大约192号氨基酸延伸至383号氨基酸。
本文所使用的术语‘E1’还包括能与天然E1发生免疫交叉反应的类似的或截短的形式，并且包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10基因型或任何其他新鉴定的HCV类型或亚型的E1蛋白。
本文所说的‘E2’是指在HCV多蛋白的前900个氨基酸内表达的蛋白或多肽，有时候是指NS1蛋白。其天然形式是一种72kDa的糖蛋白，发现它与膜紧密结合。在大多数天然HCV菌株中，E2蛋白是在所述病毒多蛋白中紧随E1蛋白之后编码的。E2蛋白分布在大约384氨基酸至746号氨基酸之间，另一种形式的E2延伸到809号氨基酸。本文所使用的术语‘E2’还表示能与天然E2发生免疫交叉反应的类似的或截短的形式。例如，Kato等(1992)业已报导了在383和384号密码子之间插入多个密码子，以及缺失384-387号氨基酸。
本文所使用的‘E1/E2’表示含有至少一个E1成分和至少一个E2成分的外被蛋白的寡聚物形式。
术语‘特异性寡聚’E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白表示重组表达的E1和/或E2外被蛋白的非凝聚的所有可能的寡聚形式。E1和/或E2特异性寡聚外被蛋白还称作同型寡聚E1或E2外被蛋白(参见下文)。
术语‘单个的或特异性寡聚’E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白表示单个的单体E1和/或E2蛋白(在该术语的严格含义上是单个的)以及特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2重组表达的蛋白。本发明的所述单个的或特异性寡聚外被蛋白还可以通过以下公式定义：(E1)x(E2)y，其中，x可以是0-100之间的数，而y可以是0-100之间的数，前提是x和y不能同时为0。当x＝1，而y＝0时，所述外被蛋白包括单体E1。
本文所使用的术语‘同型寡聚物’是指含有一个以上E1或E2单体的E1和/或E2的复合物，例如，E1/E1二聚体、E1/E1/E1三聚体、E1/E1/E1/E1四聚体和E2/E2二聚体、E2/E2/E2三聚体、E2/E2/E2/E2四聚体、E1五聚体和六聚体、E2五聚体和六聚体、或E1或E2的任何更高数目的同型寡聚物，都是该定义范围内的‘同型寡聚物，。所述寡聚物可以含有来自不同类型或亚型丙型肝炎病毒的E1或E2的一个、二个或数个不同的单体，例如，包括在本申请人的国际专利申请公开文件WO94/25601和欧洲专利申请号94870166.9中所披露的寡聚物，所述混合的寡聚物仍然属于本发明范围内的同型寡聚物，并且可以对HCV进行更通用的诊断、预防或治疗。
本文中用于蛋白上的术语‘纯化的’是指一种组合物，其中，所需要的蛋白至少占该组合物中总蛋白成分的35％。所述需要的蛋白优选占总蛋白成分的至少40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％，更优选至少约90％，最优选至少约95％。所述组合物还可以含有不会影响测定本文所使用的纯度百分比的其他化合物，如碳水化合物、盐类、脂类和溶剂等。‘分离的’HCV蛋白是指纯度至少为35％的HCV蛋白组合物。
术语‘基本上纯化的蛋白’是指纯化过的蛋白，以便可将其用于体外诊断方法并且用作治疗化合物。这种蛋白基本上不含细胞蛋白、载体衍生的蛋白或其他HCV病毒成分。通常，这些蛋白被纯化到均质，至少80％的纯度，优选90％，更优选95％，更优选97％，更优选98％，更优选99％，更优选99.5％，最优选纯化到通过诸如SDS-PAGE和银染色的常规方法检测不到污染蛋白的程度。
在本发明中所使用的术语‘重组表达’是指本发明的蛋白是通过重组表达方法在下面所披露的原核生物或低等或高等真核生物中生产的。
术语‘低等真核生物’是指诸如酵母和真菌之类的宿主细胞。低等真核生物通常是(但不一定是)单细胞。优选的低等真核生物有酵母，特别是糖酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母属、毕赤酵母属(例如，巴斯德毕赤酵母)、汉逊酵母属(例如，多型汉逊酵母)、Yarowia、许盛酵母属、裂殖酵母属和接合酵母属等属内的种。酿酒酵母、卡尔酵母和乳克鲁维酵母是最常用的酵母宿主，并且是常见的真菌宿主。
术语‘原核生物’是指诸如大肠杆菌、乳杆菌、乳球菌、沙门氏菌、链球菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌等宿主。这些宿主同样可用于本发明中。
术语‘高等真核生物’是指来自诸如哺乳动物、爬行动物和昆虫之类的高等动物的宿主细胞。本发明优选的高等真核生物宿主细胞来自中国仓鼠(例如，CHO)、猴(例如，COS和Vero细胞)、幼仓鼠肾(BHK)、猪肾(PK15)、兔肾13细胞(RK13)、人骨肉瘤细胞系143B、人细胞系HeLa，以及诸如Hep G2的人肝癌细胞系和昆虫细胞系(例如，草地贪夜蛾)。所述宿主细胞可以以悬浮液或烧瓶培养物、组织培养物和器官培养物之类的形式提供。另外，所宿主细胞还可以是转基因动物。
术语‘多肽’是指氨基酸聚合物，而且不表示特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白都包括在多肽的定义范围内。该术语也不表示或排除对所述多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化和磷酸化等。例如，该定义包括含有一个或多个氨基酸类似物的多肽(例如，包括非天然氨基酸，PNA等)、具有取代过的键的多肽，以及本领域已知的其他修饰，包括天然发生的和非天然发生的形式。
术语‘重组多核苷酸或核酸’表示来自基因组、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸或核酸，由于其来源或操作：(1)它不与在天然状态下与它结合的多肽的全部或一部分结合，(2)与天然状态下不与它连接的多核苷酸连接，或(3)在天然状态下不存在。
术语‘重组宿主细胞’、‘宿主细胞’、‘细胞’、‘细胞系’、‘细胞培养物’以及其他作为单细胞实体培养的表示微生物或高等真核细胞系的诸如此类的术语，是指可以是或者曾经被用作重组载体或其他转移多核苷酸的受体的细胞，并且包括转染过的原始细胞的后代。可以理解的是，由于天然、意外或人为突变，所述单个亲本细胞的后代不一定在形态上或者在基因组或总DNA互补上与原始亲本完全相同。
术语‘复制子’是任何遗传因子，例如，质粒、染色体、病毒、粘粒等，它在细胞内的表现就如同自主性核苷酸复制单元；即能够在它自己的控制之下复制。
术语‘载体’是一种另外包括提供所需要的开放读框复制和/或表达的序列的复制子。
术语‘控制序列’表示实现与它连接的编码序列表达所必需的多核苷酸序列。所述控制序列的性质根据宿主生物而有所不同；在原核生物中，所述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和终止子；在真核生物中，所述控制序列通常包括启动子、终止子以及在某些场合下包括增强子。术语‘控制序列’意在最低限度包括表达时所需要存在的所有成分，并且还可以包括其他成分，这些成分的存在是有利的，例如，能控制分泌的前导序列。
术语‘启动子’是由共有序列所组成的核苷酸序列，它使得RNA聚合酶能够以这样的方式与DNA模板结合：在相邻的结构基因的正常转录起始位点上开始产生mRNA。
短语‘可操作地连接’表示一种并列，其中，有关成分的相互关系使得它们能够以预期的方式起起用。控制序列‘可操作地连接’于编码序列是这样一种连接，该编码序列的表达是在与该控制序列相容的条件下实现的。
‘开放读框’(ORF)是一段多核苷酸序列，它编码一种多肽，并且不含终止密码子；该片段可以是编码序列的一部分或者是整个编码序列。
‘编码序列’是在适当的调控序列控制下能转录成mRNA和/或翻译成多肽的多核苷酸序列。所述编码序列的边界是由位于5’末端的翻译起始密码子和位于3’末端的翻译终止密码子确定的。编码序列可以包括，但不限于mRNA、DNA(包括cDNA)以及重组多核苷酸序列。
在本文中，‘表位’或‘抗原决定族’表示具有免疫活性的氨基酸序列。通常，一个表位由至少3-4个氨基酸，更常见的是至少5或6个氨基酸组成，有时候所述表位由约7-8个，或者甚至是大约10个氨基酸组成。在本文中，特定多肽的表位表示具有与所述特定多肽的表位相同的氨基酸序列的表位及其免疫学等同物。所述等同物还包括菌株、亚型(＝基因型)或类型(组)特异性变体，例如，属于1a、1b、1c、1d、1e、1f、2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g、2h、2i、3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g、4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g、4h、4i、4j、4k、4l、5a、5b、6a、6b、6c、7a、7b、7c、8a、8b、9a、9b、10a或任何其他新确定的HCV(亚)型的目前已知的序列或菌株。可以理解的是，构成所述表位的氨基酸不一定是线性序列的一部分，而且可以由任何数量的氨基酸间隔开，因此形成一种构象表位。
术语‘免疫原性’表示一种物质在有或没有佐剂的情况下，单独或者与一种载体结合时，能导致体液和/或细胞应答的能力。‘中和’表示能部分或完全抑制一种感染剂的感染性的免疫应答。‘疫苗’是能够部分或全面诱导针对HCV的保护作用的免疫原性组合物。疫苗还可用于治疗个体，在这种情况下，它又被称为治疗性疫苗。
术语‘治疗性’是指一种能治疗HCV感染的组合物。
术语‘有效量’表示足以在给予它的个体体内诱导免疫应答或者在其预期的系统(例如，免疫测定)中产生可检测的免疫反应的具有表位的多肽的量。所述有效量优选足以实现上文所定义的治疗。所需要的确切的用量会根据用途有所不同。例如，对于疫苗用途或对于制备多克隆抗血清/抗体的用途来说，所述有效量可能根据物种、年龄、个体的一般状况、要治疗的状况的严重程度、以及所选择的特定多肽及其给药方式等而有所不同。另外，相信所述有效量可以在相对较大的非关键范围内。仅仅通过常规实验，就可以方便地确定合适的有效量。用于预防HCV疾病的E1和/或E2和/或E1/E2单个的或特异性寡聚外被蛋白的优选范围是0.01-100微克/剂，优选0.1-50微克/剂。为了获得足够的免疫应答，以及随后预防HCV病，每个个体可能需要若干个剂量。
发明详述
更具体地讲，本发明涉及一种用于分离或纯化选自E1和/或E2和/或E1/E2的重组HCV单个的或特异性寡聚外被蛋白的方法，其特征在于在裂解转化过的宿主细胞以便分离重组表达的蛋白时，用一种二硫键裂解剂完成一个二硫键裂解或还原步骤。
本发明的所述‘单个的或特异性寡聚’外被蛋白的实质是，它们不含污染性蛋白，并且，它们不通过二硫键与污染物连接。
本发明的蛋白是在低等或高等真核细胞或原核细胞中重组表达的。本发明的重组蛋白优选是糖基化的，并且可以含有高甘露糖型、杂合型或复杂的糖基化。所述蛋白优选是由在实施例部分详细披露的哺乳动物细胞系表达的，或者是诸如同样在实施例部分详细披露的突变型酵母菌株等酵母中表达的。
本发明的蛋白可以是分泌的或者在细胞的成分，如ER或高尔基体内表达。不过，本发明的蛋白优选具有高甘露糖型糖基化，并且保留在哺乳动物细胞的ER或高尔基体中，或者保留在酵母细胞中或者从酵母细胞中分泌出来，优选是由诸如mnn9突变体的酵母突变菌株(Kniskern等，1994)，或通过矾酸盐抗性筛选过的突变体(Ballou等，1991)分泌。
在表达HCV外被蛋白时，本发明人证实半胱氨酸的某些游离的巯基没有参与细胞内或细胞间二硫桥，与宿主或表达系统产生的(例如，痘苗)蛋白或其他HCV外被蛋白(单个的或寡聚物的)的半胱氨酸起反应，并形成一种特殊的分子间桥。这会导致HCV外被蛋白与污染蛋白一起形成‘凝聚物’。在WO92/08734中还证实了‘凝聚物’是在纯化之后获得的，不过，该文献没有披露与哪一种蛋白相互作用有关。在专利申请WO92/08734中由痘苗病毒系统表达的重组E1/E2蛋白是部分纯化的凝聚物，并且发现它的纯度仅仅为70％，使得这种纯化的凝聚物不能用于诊断、预防或治疗目的。
因此，本发明的一个主要目的是从污染的蛋白中分离单个的或特异性寡聚HCV外被蛋白，并将纯化的蛋白(＞95％的纯度)用于诊断、预防和治疗目的。为达到以上目的，本发明人业已能够提供在二硫桥和非共价蛋白-蛋白相互作用基础上形成了凝聚的蛋白复合物(凝聚物)的证据。因此，本发明提供了一种用于在特定情况下选择性地裂解二硫键并且用于从能极大干扰诊断、预防和治疗用途的污染蛋白中分离蛋白的方法。为了防止再次形成二硫键，可以封闭(可逆的或不可逆的)游离的巯基基团，或者对它进行氧化并与其他外被蛋白寡聚化(参见同型寡聚物的定义)。可以理解的是，所述蛋白寡聚物基本上不同于在WO92/08734和WO94/01778中所披露的凝聚物，因为它的污染蛋白的含量是检测不到的。
所述二硫键的裂解可以通过以下方法实现：
(1)通过半胱磺酸进行的过甲酸氧化，在这种情况下，半胱氨酸残基被修饰成半胱磺酸(Moore等，1963)。
(2)例如，通过亚硫酸盐(SO2- 3)与诸如铜离子的适当的氧化剂一起进行亚硫酸分解(R-S-S-R-2R-SO3)，在这种情况下，半胱氨酸被修饰成S-磺基-半胱氨酸(Bailey和Cole，1959)。
(3)由诸如二硫苏糖醇(DDT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、谷胱甘肽红、ε-巯基乙胺或巯基乙酸的硫醇进行的还原，其中，DTT和β-巯基乙醇是常用的(Cleland，1964)，它是本发明的优选方法，因为该方法可以在水环境中进行，并且因为半胱氨酸保持未被修饰。
(4)通过膦(例如，Bu3P)进行还原(Ruegg和Rudinger，1977)。
因此，上述所有化合物都被认为是本发明用于裂解二硫键的制剂或手段。
本发明的所述二硫键裂解(或还原)步骤，优选是一个部分二硫键裂解(还原)步骤(在部分裂解或还原条件下进行)。
本发明的优选的二硫键裂解或还原制剂是二硫苏糖醇(DTT)，部分还原是通过使用低浓度的所述还原剂而实现的，即，对于DTT来说，例如，在大约0.1-大约50mM的浓度范围内，优选大约0.1大约20mM，优选大约0.5-大约10mM，优选高于1mM，高于2mM或高于5mM，更优选大约1.5mM，大约2.0mM，大约2.5mM，大约5mM或大约7.5mM。
所述二硫键裂解步骤还可以在存在诸如DecylPEG、EMPIGEN-BB、NP-40、草酸钠、Triton X-100的能裂解所表达的蛋白的合适的洗涤剂(作为裂解二硫键的例子或与裂解剂组合)的条件下进行。
所述还原或裂解步骤(优选部分还原或裂解步骤)优选在有(含)洗涤剂的条件下进行。本发明优选的洗涤剂是Empigen-BB。诸如Empigen-BB的洗涤剂的用量优选在1-10％的范围内，优选高于3％，更优选大约3.5％。
用于实现二硫键裂解的特别优选的方法采用了上述常规二硫键裂解制剂和洗涤剂(同样如上文所述)的组合。正如在实施例部分所提到的，低浓度DTT(1.5-7.5mM)和大约3.5％Empigen-BB的特定组合，被证明是用于纯化重组表达的E1和E2蛋白的还原剂和洗涤剂的特别优选的组合。在进行凝胶过滤层析时，发现所述部分还原会导致产生可能的二聚体E1蛋白，并且从导致免疫测定时产生假反应性的污染蛋白中分离这种E1蛋白。
不过，同样可以理解的是，使得半胱氨酸更容易接近的本领域已知的任何还原剂与本领域已知的任何洗涤剂或其他方式的任何其他组合，同样属于本发明的范围，只要所述组合能够达到与本发明所披露的优选组合相同的二硫键裂解目的就行。
除了还原二硫键之外，本发明的二硫键裂解方式还可以包括本领域已知的任何二硫键交换制剂(有机类或蛋白类竞争性制剂，例如，参见Creighton，1988)，这种制剂能够导致发生以下反应：
            
*R1、R2：蛋白凝聚物的化合物
R3SH：竞争性制剂(有机类、蛋白类)
术语‘二硫桥交换制剂’被理解为包括二硫键再生成剂以及二硫键抑制剂。
本发明还涉及用于纯化或分离上述HCV单个或特异性寡聚外被蛋白的方法，包括利用本领域已知的任何SH基团抑制剂或结合制剂，如选自下面所列举的制剂：
谷胱甘肽
5，5’-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)或双-(3-羧基-4-硝基苯基)-二硫化物(DTNB或Ellman’s制剂)(Elmann，1959)
N-乙基马来酰亚胺(NEM；Benesch等，1956)
N-(4-二甲基氨基-3，5-二硝基苯基)马来酰亚胺或Tuppy’s马来酰亚胺，它能为蛋白提供颜色
P-氯代苯甲酸汞(Grassetti等，1969)
4-乙烯吡啶(Friedman和Krull，1969)，可以在通过酸水解反应之后释放出来
乙腈，可以在通过酸水解之后释放出来(Weil和Seibles，1961)
NEM-生物素(例如，购自Sigma B1267)
2.2’-二硫代吡啶(Grassetti和Murray，1967)
4.4’-二硫代吡啶(Grassetti和Murray，1967)
6.6’-二硫代二烟酸(DTDAN；Brown和Cunigham，1970)
2.2’-二硫代双-(5’-硝基吡啶)(DTNP；US3597160)或其他二硫代双(杂环衍生物)化合物(Grassetti和Murray，1969)
综合所引用的文献可以发现，通常用于巯基基团的不同的制剂会与同一种蛋白或酶分子的不同数量的硫醇基团起反应。人们可能会认为所述硫醇基团在反应性方面的变化可能是由于该基团的空间环境所导致的，如所述分子的形状和原子周围的基团及其电荷，以及所述制剂分子或离子的大小、形状和电荷。通常，足够浓度的诸如十二烷基硫酸钠、尿素或盐酸胍的变性剂的存在，会导致蛋白分子具有足够的非折叠，使得所有的制剂都能同样接触硫醇基团。通过改变变性剂的浓度，可以控制非折叠的程度，并且通过这种方法可以发现具有不同程度反应性的硫醇基团。尽管到目前为止，所报导的大部分研究都是用p-氯代苯甲酸汞、N-乙基马来酰亚胺和DTNB进行的，其他最近开发出的制剂可能会被证明同样有用。由于它们具有不同的结构，事实上，很有可能它们会对硫醇基团的空间环境的改变产生不同的反应。
另外，用于抑制游离的SH基团氧化，并因此抑制在重组表达和纯化E1和E2(外被)蛋白时形成大的分子间凝聚物的诸如低的pH(优选低于pH6)的条件也属于本发明的范围。
本发明的优选的SH基团封闭制剂是N-乙基马来酰亚胺(NEM)。所述SH基团封闭制剂可以在重组宿主细胞裂解期间，并且在上述部分还原过程之后或者在用于裂解二硫桥的任何其他过程之后使用。所述SH基团封闭制剂还可以用能够提供可检测的标记的任何基团和/或有助于将所述重组蛋白固定在固体底物上的任何基团，例如，生物素化的NEM进行修饰。
Darbre(1987)，Means和Feeney(1971)以及Wong(1993)还披露了用于裂解半胱氨酸桥和封闭游离的半胱氨酸的方法。
如上文所述的本发明的纯化单个的或特异性寡聚重组蛋白E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的方法的特征还在于包括以下步骤：
-优选在有诸如N-乙基马来酰亚胺(NEM)的SH基团封闭制剂，以及可能存在的合适的洗涤剂，优选Empigen-BB的条件下，裂解重组E1和/或E2和/或E1/E2表达宿主细胞，
-通过亲和纯化回收所述HCV外被蛋白，例如，通过凝集素层析纯化，如lentil凝集素层析、或用抗E1和/或抗E2特异性单克隆抗体进行的免疫亲和层析，然后
-用诸如DTT的二硫键裂解制剂还原或裂解二硫键，同样优选在有诸如NEM或生物素-NEM的SH基团封闭制剂的情况下进行，以及
-通过诸如凝胶过滤(大小排阻层析或分子筛)的方法回收所述还原的HCV E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白。随后还可以进行额外的Ni2+-IMAC层析以及脱盐步骤。
应当理解的是，上述回收步骤还可以用本领域技术人员所公知的任何其他合适的技术完成。
优选的凝集素层析系统包括雪花莲凝集素(GAN)-层析，或兵豆凝集素(LCA)(lentil)凝集素层析，正如在实施例部分所披露的。其他有用的凝集素包括那些能识别高甘露糖型糖类的凝集素，如黄水仙凝集素(NPA)、豌豆凝集素(PSA)或熊葱凝集素(AUA)。
优选将上述方法用于纯化按上述方法在细胞内产生的单个的或特异性寡聚HCV外被蛋白。
对于分泌型E1或E2或E1/E2寡聚物来说，诸如蓖麻凝集素I(RCAI)的凝集素结合复合糖是优选的凝集素。
更具体地讲，本发明涉及选自E1和/或E2和/或E1/E2的基本上纯化的重组单个的或特异性寡聚HCV外被蛋白，其特征是通过上述方法分离或纯化的。
更具体地讲，本发明涉及纯化或分离由诸如痘苗的重组哺乳动物细胞表达的重组单个的或特异性寡聚HCV外被蛋白。
本发明还涉及纯化或分离由重组酵母细胞表达的重组外被蛋白。
本发明同样涉及纯化或分离由重组细菌(原核生物)细胞表达的重组外被蛋白。
本发明还涉及一种重组载体，该载体包括一个载体序列，一个合适的原核生物、真核生物或病毒或合成的启动子序列，随后是一个可以表达本发明的单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2的核苷酸序列。
具体地讲，本发明涉及一种重组载体，该载体包括一个载体序列，一个合适的原核生物、真核生物或病毒或合成的启动子序列，随后是一个可以表达本发明的单个的E1或E1的核苷酸序列。
具体地讲，本发明涉及一种重组载体，该载体包括一个载体序列，一个合适的原核生物、真核生物或病毒或合成的启动子序列，随后是一个可以表达本发明的单个的E1或E2的核苷酸序列。
插入所述载体序列中的编码需要的E1和/或E2序列的HCV cDNA片段，可以与一个信号序列连接。所述信号序列可以是来自非HCV来源的信号序列，例如，用于在哺乳动物细胞中表达的IgG或组织纤溶酶原激活物(tpa)前导序列，或用于在酵母细胞中表达的α交配因子序列，不过，本发明特别优选的构建体含有出现在HCV基因组上位于E1和E2蛋白的相应的起始位点前面的信号序列。插入所述载体序列中的编码需要的E1和/或E2序列的HCV cDNA片段还可以包括缺失，例如，在实施例部分所披露的疏水性结构域的缺失，或E2高可变区I的缺失。
具体地讲，本发明的重组载体包括具有编码所述多蛋白的HCVcDNA片段的核酸，该片段始于HCV多蛋白的1号和192号氨基酸位点之间，并且止于250-400号位点之间的部分，更优选止于250-341号位点之间的部分，更优选止于290-341号位点之间的部分，以便表达HCV单个的E1蛋白。最优选的是，本发明的重组载体包括具有编码部分HCV多蛋白的HCV cDNA片段的重组核酸，该片段始于117-192位置之间的部分，并且止于263-326号位置之间的任意位点，以便表达HCV单个的E1蛋白。缺失了第一个疏水性结构域(264-293号位置加或减8个氨基酸)的形式，或添加了5’末端ATG密码子和3’末端终止密码子的形式，或添加了因子Xa裂解位点和/或3-10个，优选6个组氨酸密码子的形式同样属于本发明的范围。
更具体地，本发明的重组载体包括具有编码所述多蛋白的HCVcDNA片段的核酸，该片段始于290-409号氨基酸位点之间的部分，并且止于HCV多蛋白的600-820号位点之间的部分，更优选始于322-406号位点之间的部分，更优选始于347-406号位点之间的部分，更优选始于364-406号位点之间的部分，以便表达HCV单个的E2蛋白。最优选的是本发明的重组载体包括具有编码所述多蛋白的HCV cDNA片段的重组核酸，该片段始于290-406号位置之间的部分，并且止于623、650、673、710、715、720、746或809号位置中的任意一个位置，以便表达HCV单个的E2蛋白。添加了5’末端ATG和3’末端终止密码子的形式，或添加了因子Xa裂解位点和/或3-10个，优选6个组氨酸密码子的形式同样属于本发明的范围。
有多种载体可用于实现本发明的HCV单个的或特异性的寡聚外被蛋白的重组表达。诸如酵母或糖基化突变菌株的低等真核生物通常是用质粒转化的，或者是用重组病毒转化的。所述载体可以在所述宿主内独立复制，或者也可以整合到宿主细胞基因组中。
高等真核生物可以用载体转化，或者可以用重组病毒转染，例如用重组痘苗病毒转染。用于将外源DNA插入痘苗病毒中的方法和载体为本领域所熟知，并且使用诸如同源重组的方法。在本领域可以获得哺乳动物表达所需要的多种病毒启动子序列，可能需要的终止子序列和聚腺苷酸添加序列，可能的增强子序列以及可能的扩增序列。痘苗是特别优选的，因为痘苗能抑制宿主细胞蛋白的表达。痘苗同样是非常优选的，因为它能在用活的重组痘苗病毒免疫的细胞或个体中表达HCV的E1和E2蛋白。对于人类免疫接种来说，禽痘病毒和Ankara修饰病毒(AMV)是特别优选的载体。
另外，已知源于杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)的昆虫表达转移载体是辅助依赖型病毒表达载体。源于该系统的表达载体通常使用强的病毒多角体蛋白基因启动子驱动异源基因的表达。本领域技术人员可以获得用于将异源DNA导入杆状病毒的理想位点以便进行杆状病毒表达的不同的载体和方法。由昆虫细胞识别的用于翻译后修饰的不同的信号在本领域中同样是公知的。
本发明还包括用于生产纯化的重组单个的或特异性寡聚HCV E1或E2或E1/E2蛋白的方法，其中，参与凝聚物形成的半胱氨酸残基在核酸序列水平上被其他残基所取代，以便抑制凝聚物的形成。由携带所述突变的E1和/或E2蛋白编码核酸的重组载体所表达的所述重组蛋白同样属于本发明的范围。
本发明还涉及重组E1和/或E2和/或E1/E2蛋白，其特征在于业已去掉了它们的至少一个糖基化位点，并因此被称为糖基化变体。正如在实施例部分所述，为了诊断(筛选、证实、预测等)和抑制有关患者的HCV诊断和预防有关患者的HCV疾病，可能需要不同的糖基化变体。例如，业已发现缺乏GLY4的E2蛋白糖基化变体在诊断中能改善某些血清的反应性。所述糖基化变体优选是按照本发明所披露的方法纯化的。本发明还涉及具有编码诸如E1和/或E2和/或E1/E2糖基化变体的核酸插入片段的重组载体，以及用所述重组载体转化过的宿主细胞。
本发明还涉及包括同样构成本发明的一部分的多核苷酸的重组载体。本发明特别涉及如SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47和49所示出的重组核酸或其部分。
本发明还涉及用上述重组载体转化过的宿主细胞，其中，所述载体包括编码上述HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的核酸序列，另外还包括可操作地连接在所述HCV E1和/或E2和/或E1/E2序列上的，并且能够调控所述HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白表达的调控序列。
真核宿主包括在定义部分所披露的低等和高等真核宿主。低等真核宿主包括本领域所熟知的酵母细胞。高等真核宿主主要包括本领域所公知的哺乳动物细胞系，并且包括可以从ATCC获得的很多永生化细胞系，包括HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、PK15、PK13和多种其他细胞系。
本发明特别涉及由含有上述重组载体的上述宿主细胞所表达的重组E1和/或E2和/或E1/E2蛋白。所述重组蛋白特别是用本发明的方法纯化过的。
上述用于分离或纯化HCV外被蛋白的优选方法的特征还在于至少包括以下步骤：
-在合适的培养基中生长用本发明的重组载体或能表达E1和/或E2和/或E1/E2 HCV外被蛋白的重组载体转化过的上述宿主细胞，
-在合适的条件下使所述载体序列表达，以及
-优选在有诸如N-乙基马来酰亚胺(NEM)的SH基团封闭制剂，以及可能存在的合适的洗涤剂，优选Empigen-BB的条件下裂解所述转化过的宿主细胞，
-通过亲和层析回收所述HCV外被蛋白，例如，通过凝集素亲和层析或使用抗E1和/或抗E2特异性单克隆抗体的免疫亲和层析，所述凝集素优选是lentil-凝集素或GNA，然后
-用诸如DTT的二硫键裂解制剂温育以上步骤的洗脱物，优选随后用诸如NEM或生物素NEM的SH基团封闭制剂进行温育，
-通过诸如凝胶过滤的方法分离HCV单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白，随后还可以进行额外的Ni2+-IMAC层析以及脱盐步骤。
正如在实施例部分所披露的，上述过程的结果是，以从含有载体来源的成分和/或凝胶过滤柱或IMAC柱的空隙体积中的细胞成分的大的凝聚物中差异洗脱的形式生产出了E1和/或E2和/或E1/E2蛋白。由于存在宿主和/或表达系统产生的蛋白，所述二硫键裂解步骤，优选还消除了假的反应性。在裂解细胞期间NEM和合适的洗涤剂的存在已经部分或者甚至是完全抑制了HCV外被蛋白和污染物之间的凝聚。
正如Janknecht等1991和Hochuli等1998所披露的，优选将Ni2+-IMAC层析和随后的脱盐步骤用于具有(His)6的构建体。
本发明还涉及用于在诸如小鼠和大鼠的小动物中生产单克隆抗体的方法，以及利用本发明的HCV单个的或特异性寡聚外被蛋白筛选并分离能识别抗HCV抗体的人B-细胞的方法。
本发明还涉及一种含有在表3中所列举的至少一种下列E1肽的组合物：
跨越核心/E1 V1区的181-200号氨基酸的E1-31(SEQ ID NO：56)，
跨越E1区的193-212号氨基酸的E1-33(SEQ ID NO：57)，
跨越E1 V2区的205-224号氨基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO：58)，
跨越E1 V2区的208-227号氨基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO：59)，
跨越E1区的192-228号氨基酸(V1、C1、和V2区(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO：53)，
跨越E1区301-320号氨基酸的E1-51(SEQ ID NO：66)，
跨越E1C4区的313-332号氨基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO：67)，
跨越E1的325-344号氨基酸的E1-55(SEQ ID NO：68)，
本发明还涉及含有在表3中所列举的至少一种下列E2肽的组合物；
跨越E2区的397-418号氨基酸(表位A，由单克隆抗体2F10H10识别，参见图19)的Env67或E2-67(SEQ ID NO：72)，
跨越E2区的409-428号氨基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO：73)，
跨越E2区的583-602号位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO：86)，
跨越E2区的595-614号位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO：87)，
跨越E2区的607-626号位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO：88)，
跨越E2区的547-586号位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO：83)，
跨越E2区的523-542号位置(表位C；由单克隆抗体16A6E7识别，参见图19)的Env13B或E2-13B(SEQ ID NO：82)。
本发明还涉及含有至少一种下列E2构象表位的组合物。
由单克隆抗体15C8C1、12D11F1和8G10D1H9单克隆抗体识别的表位F，
由单克隆抗体9G3E6识别的表位G，
由单克隆抗体10D3C4和4H6B2识别的表位H(或C)，
由单克隆抗体17F2C2识别的表位I。
本发明还涉及通过用一种肽或蛋白组合物免疫所产生的E1或E2特异性抗体，所述抗体能够与上述任意一种多肽或肽特异性地反应，并且所述抗体优选是单克隆抗体。
本发明还涉及通过本领域公知的方法从质粒或噬菌体中可变链文库中或者从人B细胞群体中筛选的E1或E2特异性抗体，所述抗体能够与上述任意一种多肽或肽起反应，并且所述抗体优选是单克隆抗体。
在一方面，本发明的E1或E2特异性单克隆抗体可以通过用本发明的HCV多肽或肽免疫过的动物，特别是小鼠或大鼠脾细胞，通过常规方法形成的任意一种杂交瘤产生，另一方面，可以由骨髓瘤细胞系的细胞产生，可以根据杂交瘤产生能识别起初用于免疾所述动物的多肽的单克隆抗体的能力进行选择。
本发明所涉及到的抗体可以通过酶促、荧光、或放射性类型的合适的标记物进行标记。
本发明的该优选实施方案的单克隆抗体，可以是通过重组DNA技术制备的人源化形式的小鼠单克隆抗体，脱离了部分来自编码H和L链的cDNA或基因组克隆的编码H和L链的小鼠和/或人基因组DNA序列。
另外，本发明的该优选实施方案的单克隆抗体可以是人单克隆抗体。本发明的该实施方案的抗体还可以来自受HCV感染的或对HCV有免疫力的患者的人外周血淋巴细胞。
例如，所述人单克隆抗体是通过使人外周血淋巴细胞(PBL)重新集中于重度合并性免疫缺陷(SCID)小鼠而制备的(最新的综述参见Duchosal等，1992)。
本发明还涉及利用本发明的蛋白或肽通过所有成分克隆的方法筛选重组抗体(Persson等，1991)。
针对来自特定基因型的肽或单个的或特异性寡聚的外被蛋白的抗体可以被用作药物，更具体地讲，用于检测HCV基因型的免疫测定中(用于检测HCVE1或E2抗原的存在)，用于预测/监测HCV疾病，或者用作治疗剂。
另外，本发明还涉及利用上述任意一种E1或E2特异性单克隆抗体制备用于检测生物学样品中E1或E2抗原存在的免疫测定试剂盒，用于制备预测/监测HCV疾病的试剂盒或用于制备HCV药物。
本发明还涉及一种用于体外诊断或检测生物学样品中HCV抗原存在的方法，至少包括以下步骤：
(i)在能够形成免疫复合物的合适条件下，让所述生物学样品与上述任意一种E1和/或E2特异性单克隆抗体接触，优选固定化形式的单克隆抗体，
(ii)清除未结合的成分，
(iii)在合适的条件下，温育由异源抗体形成的免疫复合物，它能特异性地结合存在于要分析的样品中的抗体，在所述异源抗体上结合了一种可检测的标记，
(iv)通过肉眼或机械方法(例如，通过密度测定、荧光测定、比色测定)检测所述免疫复合物的存在。
本发明还涉及用于体外诊断存在于生物学样品中的HCV抗原的试剂盒，包括：
-至少一种上述单克隆抗体，所述单克隆抗体优选固定在一种固体基质上，
-生产使得所述抗体和存在于所述生物学样品中的HCV抗原之间的结合反应能够进行的缓冲液所需要的缓冲物或成分，
-一种用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置，
-还可能包括一个用于根据所观察到的结合形式推测存在于所述样品中的HCV抗原的自动化扫描和翻译装置。
本发明还涉及被用作药物的含有用本发明的方法纯化过的E1和/或E2和/或E1/E2重组HCV蛋白的组合物，或含有上述至少一种肽的组合物。
更具体地讲，本发明涉及含有上述至少一种外被肽的组合物或上述重组外被蛋白组合物，将该组合物用作疫苗对哺乳动物，优选人类进行HCV免疫，包括给予足够量的所述组合物，还可以同时给予可以药用的佐剂，以便产生免疫应答。
更具体地讲，本发明还涉及将上述任意一种组合物用于制备上述疫苗。
另外，本发明涉及一种用于对哺乳动物，优选人类进行HCV免疫的疫苗，它含有来自上述E1和/或E2区的HCV单个的或特异性寡聚蛋白或肽。
可以按照本领域公知的方法制备免疫原性组合物。本发明的组合物含有免疫原量的上述重组E1和/或E2和/或E1/E2单个的或特异性寡聚蛋白或上述E1或E2肽，通常与一种可以药用的载体组合，优选还含有一种佐剂。
预计本发明的E1和/或E2和/或E1/E2单个的或特异性寡聚外被蛋白能够提供特别有用的疫苗抗原，因为形成抗E1或E2的抗体比形成抗其他外被蛋白的抗体更理想，并且由于E2蛋白在HCV类型之间有交叉反应，而且E1蛋白是类型特异性的。含有来自若干种基因型的1型E2蛋白和E1蛋白的混合物可能是特别有利的。含有摩尔数过量的E1与E2或E2与E1的混合物可能同样是特别有用的。可以给动物给予免疫原性组合物，以便诱导抗体的产生，从而提供抗体的来源或在所述动物体内诱导保护性免疫性。
可以药用的载体包括任何载体，它本身不会诱导对接受该组合物的个体有害的抗体的产生。合适的载体通常是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物；以及无活性的病毒颗粒。所述载体为本领域普通技术人员所熟知。
能增强所述组合物效果的优选佐剂包括，但不限于：披露于US4606918中的氢氧化铝(明矾)、N-乙酰-肉桂酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正肉桂酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(nor-MDP)、N-乙酰肉桂酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷氧基)-乙胺(MTP-PE)和RIBI，在2％角鲨烯/Tween80乳液中含有三种从细菌中提取的成分-单磷脂A、海藻糖二霉菌酸酯、以及细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。MPL、TDM或CWS这三种成分中的任意一种都可以单独使用或者两两组合使用。另外，还可以使用诸如Stimulon(Cambridge Bioscience，Worcester，MA)或SAF-1(Syntex)的佐剂。另外，可将完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)用于非人用途和研究目的。
所述免疫原性组合物通常含有可以药用的载体，如水、盐水、甘油、乙醇等。另外，在所述载体中可以包括辅助性物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲物质和防腐剂等。
通常，所述免疫原性组合物是作为可以注射的液体溶液或悬浮液形式制备的；还可以制备适合在注射之前溶解在或悬浮在液体载体中的固体形式。所述制剂还可以乳化在或胶囊化在脂质体中，以便增强佐剂的效果。E1和E2蛋白还可以与诸如Quil A的皂苷一起结合在免疫刺激复合物中(ISCOMS)。
被用作疫苗的免疫原性组合物含有‘足够量的’或‘免疫有效量的’本发明的外被蛋白，以及根据需要含有上述任何其他成分。‘免疫有效量的’表示作为单个剂量或作为一系列剂量的一部分给予这一用量就能实现上述有效治疗。所述用量根据接受治疗的个体的健康和体能状况、接受治疗的个体的分类类型(例如，非人灵长类、灵长类等)、所述个体的免疫系统合成抗体的能力、需要保护的程度、疫苗的配方、治疗医师对医学状况的评估、感染HCV的菌株、以及其他相关因素而有所不同。预计，所述用量落在一个较宽的范围内，该范围可以通过常规实验确定。通常，所述用量在0.01-1000微克/剂之间，更优选0.1-100微克/剂。
所述单个的或特异性寡聚外被蛋白还可以用作疫苗载体，以与乙型肝炎表面抗原相同的方式呈递同源的(例如，来自核心、NS2、NS3、NS4或NS5区的T细胞表位或B细胞表位)或异源的(非HCV)半抗原(参见欧洲专利申请174444)。在这一用途中，外被蛋白提供了一种能够刺激对与所述凝聚物结合的半抗原或抗原的免疫应答的免疫原性载体。所述抗原可以通过常规化学方法连接，或者可以克隆到编码E1和/或E2的基因的相当于该蛋白的亲水性区的位点上。所述亲水区包括V1区(包括191-202号氨基酸)、V2区(包括213-223号氨基酸)、V3区(包括230-242号氨基酸)、V4区(包括230-242号氨基酸)、V5区(包括294-303号氨基酸)和V6区(包括329-336号氨基酸)。另一种可用于插入半抗原的位点是疏水区(包括264-293号氨基酸)。在本发明中证实，该区可以缺失，而不会影响缺失了的E1蛋白与血清的反应性。因此，可以将半抗原插在所述缺失位点上。
所述免疫原性组合物通常是通过注射方式经肠胃外途径给予的，例如，皮下或肌内注射。适合其他给予方法的其他制剂包括口服制剂和栓剂。剂量治疗可以是单个剂量方案或多剂量方案。所述疫苗可以与其他免疫调控剂组合使用。
本发明还涉及一种用于体外检测存在于生物学样品中的HCV抗体的含有上述肽或多肽的组合物。
本发明还涉及将上述组合物用于制备用来检测存在于生物学样品中的HCV抗体的免疫测定试剂盒的用途。
本发明还涉及一种用于体外诊断存在于生物学样品中的HCV抗体的方法，该方法至少包括以下步骤：
(i)在能够形成免疫复合物的合适条件下，让所述生物学样品与含有上述任意一种上述外被肽或蛋白的组合物接触，优选固定化形式的组合物，其中，所述肽或蛋白可以是通过链霉亲和素或亲和素复合物与一种固体基质共价结合的生物素化的肽或蛋白，
(ii)清除未结合的成分，
(iii)在合适的条件下，温育由异源抗体形成的免疫复合物，所述异源抗体上结合了可检测的标记，
(iv)通过肉眼或机械方法(例如，通过密度测定、荧光测定、比色测定)检测所述免疫复合物的存在。
另外，本发明还涉及竞争性免疫测定制剂，其中，将上文所披露的重组生产的单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白与E1和/或E2蛋白组合使用，以便竞争存在于生物学样品中的HCV抗体。
本发明还涉及一种用于确定HCV抗体在生物学样品中的存在的试剂盒，包括：
-上述至少一种肽或蛋白组合物，有可能与来自HCV或其他类型HCV的其他的多肽或肽组合，所述肽或蛋白优选固定在一种固体基质上，更优选固定在同一块ELISA平板上的不同的微孔上，更优选固定在同一个膜片上，
-生产使得所述多肽或肽与所述存在于所述生物学样品中的抗HCV的抗体之间的结合反应能够进行的缓冲液所需要的缓冲物或成分，
-用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置，
-还可能包括一个用于根据所观察到的结合形式推测存在于所述样品中的HCV基因型的自动化扫描和翻译装置。
本发明的免疫测定方法使用来自E1和/或E2结构域的单个的或特异性寡聚抗原，该抗原保留了由存在于来自受HCV感染的个体的血清中的抗体识别的线性(对于肽来说)和构象表位(单个的或特异性寡聚蛋白)。例如，使用单个的或特异性寡聚抗原、二聚体抗原、以及单个的或特异性寡聚抗原的组合也属于本发明的范围。本发明的HCVE1和E2抗原实际上可应用于采用已知的抗原检测抗体的任何测定方案中。当然，应当避免或改进使HCV构象表位变性的方案。上述所有测定的共同特征是，在所述抗原能够结合存在于所述成分中的任何所述抗体的条件下，让所述抗原与被怀疑含有HCV抗体的身体成分接触。所述条件通常是使用过量抗原时的生理学温度、pH和离子强度。在将所述抗原与所述样品一起温育之后，检测包括所述抗原的免疫复合物。
免疫测定的设计可以有很大的不同，并且许多方案为本领域所公知。例如可以使用固体支持物或免疫沉淀的方案。大多数测定包括使用标记过的抗体或多肽；所述标记可以是，例如，酶促、荧光、化学发光、放射性、或染料分子。用于放大来自所述免疫复合物的信号的测定同样是公知的；其例子有利用生物素和亲和素或链霉亲和素的测定，以及未标记的和介导的免疫测定，如ELISA测定。
所述免疫测定可以是，但不限于标准类型或竞争类型的异源或同源方案。在异源方案中，所述多肽通常与一种固体基质或支持物结合，以便有利于在温育之后将所述样品与所述多肽分离。可以使用的固体支持物的例子有硝酸纤维素(例如，薄膜形式或微量滴定孔形式)，聚氯乙烯(例如，片材或微量滴定孔)，聚丙乙烯乳胶(例如，小球或微量滴定板)，聚偏氟乙烯(被称为ImmunolonTM)，重氮化纸、尼龙膜、活性的小球、以及蛋白A小球。例如，在异源方案中可以使用Dynatech ImmunolonTM1或ImmunolonTM2微量滴定板或0.25英寸聚苯乙烯小球(精密塑料球)。在与测试样品分离之后，并且在检测结合的抗体之前，通常要洗涤含有所述抗原性多肽的固体支持物。标准方案和竞争性方案都是本领域所公知的。
在同源方案中，所述测试样品在溶液中与抗原的组合一起温育。例如，可以在能使所形式的任何抗原-抗体复合物沉淀的条件下温育。用于这种测定的标准方案和竞争方案为本领域所公知。
在标准方案中，直接监测抗体-抗原复合物中HCV抗体的量。这一目的可以通过测定能识别抗HCV抗体上的一个表位的标记过的抗异源(例如，抗人)抗体是否会因为复合物的形成而结合来实现。在竞争方案中，通过监测结合所述复合物中已知量的标记过的抗体(或其他竞争配体)的竞争效应推测样品中HCV抗体的量。
根据所述方案，通过多种已知方法中的任意一种检测所形成的含有抗HCV抗体的复合物(或者对于竞争测定来说，检测竞争抗体的量)。例如，所述复合物中的未标记过的HCV抗体可以利用与一种标记物(例如，酶标记物)复合的抗异源IgG的缀合物检测。
在免疫沉淀或凝聚测定方案中，HCV抗原和抗体之间的反应形成了一个从溶液或悬浮液中沉淀出来的网络，并形成一个肉眼可见沉淀层或膜。如果在测试样品中不存在抗HCV抗体，就不会形成可见的沉淀。
目前有三种特殊类型的颗粒凝聚(PA)测定。这些测定被用于检测涂在一种支持物上的各种抗原的抗体。上述一种类型的测定是利用红细胞(RBCs)进行的凝血测定，所述红细胞通过在RBC上被动吸附抗原(或抗体)而被敏化。通过添加特殊抗原，存在于身体成分中的抗体(如果有的话)会导致用纯化的抗原包衣的RBCs发生凝聚。
为了消除血凝聚测定中潜在的非特异性反应，可以用两种人工载体取代PA中的RBC。最常见的是乳胶颗粒。不过，也可以使用凝聚颗粒。使用上述任意一种载体的测定都是基于用纯化抗原包衣的颗粒的被动凝聚。
包括构象表位的本发明的HCV单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2抗原通常以试剂盒进行包装，用于上述免疫测定。该试剂盒通常包括独立的容器，分别装有天然HCV抗原、对照抗体制剂(阳性和阴性)标记过的抗体(如果该测定方案需要这种抗体)，以及信号发生试剂(例如，酶底物)(如果所述标记不能直接产生一种信号)。所述天然HCV抗原可能已经与一种固体基质，或者与用于将它结合在所述基质上的制剂分开。在该试剂盒中通常还包括实施该测定的说明书(例如，文字、磁带、CD-ROM等)。
采用天然HCV抗原的免疫测定可用于筛选血液，以便制备缺乏潜在的传染性HCV的血液供应物。用于制备血液供应物的方法包括以下步骤。让本发明的HCV E1和/或E2蛋白与来自供血个体的身体成分，优选血液或血液成分起反应，以便发生HCV抗体(如果有的话)和HCV抗原之间的免疫反应。检测是否因为上述反应形成了HCV抗体-HCV抗原复合物。作为血液供应物的血液来自不存在天然HCV抗原E1或E2抗体的供体。
如果出现了对HCV抗原的阳性反应，优选重复所述免疫测定，以便降低假阳性的可能性。例如，在大规模筛选血液以便生产血液制品(例如，输血用血、血浆、因子VIII、免疫球蛋白等)时，‘筛选’测试通常以牺牲特异性为代价来提高灵敏度(以便确保没有污染的传染物，即提高了假阳性的比例)。因此，通常仅仅是推迟进一步检测‘反复反应’的供体，即在对供体样品进行两轮或两轮以上的免疫测定时都是阳性。不过，为了证实HCV阳性，通常要进行‘验证’实验，以牺牲灵敏度为代价来提高特异性(以便确保不会确认假阳性样品)。因此，本发明所披露的用于纯化E1和E2的方法非常有利于将单个的或特异性寡聚外被蛋白包括在HCV诊断测定中。
所选择的固相可以包括聚合物小球或玻璃小球、硝酸纤维素、微颗粒、反应平板的微孔、试管和磁性小球。信号发生化合物可以包括酶、发光化合物、生色剂、放射性元素和化学发光化合物。酶的例子包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶和β-半乳糖苷酶。增强化合物的例子包括生物素、抗生物素和亲和素。增强化合物结合成分的例子包括生物素、抗生物素和亲和素。为了抑制类风湿因子样物质的作用，要用足以抑制类风湿因子样物质的作用的条件对测试样品进行处理。所述条件包括让所述测试样品与一定量的抗人IgG接触，以便形成一种混合物，并且在处理形成基础上不含类风湿因子样物质的反应混合物的条件下温育所述混合物一段时间。
本发明还涉及将E1蛋白或其部分，更具体说是上述HCV单个的或特异性寡聚E1蛋白用于体外监测HCV疾病或预测患有HCV感染的患者对治疗(例如用干扰素治疗)的反应的用途，包括：
-在能够形成免疫复合物的条件下将来自感染了丙型肝炎的患者的生物学样品与E1蛋白或其合适的部分一起温育。
-除去未结合的成分，
-计算存在于所述样品中的抗E1效价(例如，在(干扰素)治疗开始和/或期间测定)。
-监测HCV疾病的天然过程，或者根据在治疗开始和/或治疗期间出现在所述样品中的抗E1效价的量预测所述患者对治疗的反应。
与最初的抗E1效价相比，表现出效价降低了2、3、4、5、7、10、15或优选降低了20倍以上的患者被认为是HCV治疗，尤其是干扰素治疗的长期的、持续的反应者。在实施例部分说明了抗E1测定一般是非常有利于预测对IFN治疗的长期反应，或者对丙型肝炎病毒疾病治疗的长期反应。
更具体地讲，在表3中所列举的以下E1肽可用于体外监测HCV疾病或预测对患有HCV感染的患者进行干扰素治疗的反应。
跨越核心/E1 V1区的181-200号氨基酸的E1-31(SEQ ID NO：56)，
跨越E1区的193-212号氨基酸的E1-33(SEQ ID NO：57)，
跨越E1 V2区的205-224号氨基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO：58)，
跨越E1 V2区的208-227号氨基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO：59)，
跨越E1区的192-228号氨基酸(V1、C1和V2区(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO：53)，
跨越E1区的301-320号氨基酸的E1-51(SEQ ID NO：66)，
跨越E1 C4区的313-332号氨基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO：67)，
跨越E1区的325-344号氨基酸的E1-55(SEQ ID NO：68)。
可以理解的是，上述肽的更小的片段也属于本发明的范围。通过化学合成可以方便地制备所述较小的片段，并且可以检测其用于在上文和在实施例部分所述的测定中使用的能力。
本发明还涉及用于监测HCV疾病或预测患有HCV感染的患者对治疗(例如用干扰素治疗)的反应的试剂盒，包括：
-至少一种E1蛋白或E1肽，更具体地讲，上述E1蛋白或E1肽，
-用于生产所述蛋白或肽和存在于生物学样品中的抗E1抗体之间发生结合反应的缓冲液所需要的缓冲物或成分，
-用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置，
-可能还包括用于了解在治疗进行期间抗E1效价降低的自动化扫描和翻译装置。
可以理解的是，本发明的E2蛋白和肽也可用于在一定程度上监测/预测HCV治疗，正如上面针对E1蛋白或肽所说明，因为与其他HCV抗原的抗体相比，抗E2水平也会降低。不过，应当理解的是，还可以确定E2区中的某些表位，这些表位可能适用于监测/预测HCV疾病的实验。
本发明还涉及血清分类测定，用于检测存在于生物学样品中的HCV的一种或多种血清学类型，特别是用于检测要中和在一个测定方案中检测的不同类型的HCV抗体，至少包括以下步骤：
(i)在能够形成免疫复合物的合适条件下，让需要分析是否存在一种或多种血清学类型的HCV抗体的生物学样品与上述至少一种E1和/或E2和/或E1/E2蛋白组合物或至少一种E1和/或E2肽组合物接触，优选固定化形式的组合物，
(ii)清除未结合的成分，
(iii)在合适的条件下，将与异源抗体形成的免疫复合物与所述可检测标记结合的异源抗体一起温育，
(iv)通过肉眼或机械方法(例如，通过密度测定、荧光测定、比色测定)检测所述免疫复合物的存在，并且根据所观察到的结合形式了解一种或多种HCV血清学类型的存在。
应当理解的是，用于该方法中的蛋白或肽的组合物是重组表达的类型特异性外被蛋白或类型特异性肽。
本发明还涉及一种用于对存在于生物学样品中的一种或多种血清类型的HCV进行血清分类，尤其是用于检测所述血清类型的HCV的抗体的试剂盒，包括：
-至少一种上述E1和/或E2和/或E1/E2蛋白或E1或E2蛋白，
-用于生产使得所述蛋白或肽和存在于所述生物学样品中的抗E1抗体发生结合反应的缓冲液所需要的缓冲物或成分，
-用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置，
-还可能包括一个用于根据所观察到的结合形式检测一种或多种血清类型的存在的自动化扫描和翻译装置。
本发明还涉及将上述肽或蛋白组合物固定在一种固体基质上，并且用于反相杂交测定，优选用于作为对照系固定在膜片的固体支持物上，用于按照上述方法测定HCV的存在或基因型。与来自其他HCV多蛋白区的类型特异性抗原的组合也属于本发明的范围。
本发明提供了一种用于纯化选自通过重组方法生产的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的重组HCV单个的或特异性寡聚外被蛋白的方法，包括让所述蛋白与一种二硫键裂解或还原制剂接触，本发明的该方法的接触可以在部分裂解或还原的条件下进行。所述二硫链裂解制剂优选是二硫苏糖醇(DTT)，其浓度范围优选为0.1-50mM，优选0.1-20mM，更优选0.5-10mM。另外，所述二硫键裂解制剂还可以诸如Empigen-BB(它是含有N-十二烷基-N，N-二甲基甘油作为主要成分的混合物)的洗涤剂，其浓度优选为1-10％，更优选3.5％。还可以使用洗涤剂，二硫键裂解制剂和/或还原制剂的混合物。在一种实施方案中，利用诸如N-乙基马来酰亚胺(NEM)或其衍生物的SH基团封闭制剂抑制二硫键的形成。在一种优选实施方案中，所述二硫键再形成是通过使用低的pH条件抑制的。
本发明还提供了一种本文所披露的方法，该方法还包括以下步骤：在选择性地存在诸如N-乙基马来酰亚胺(NEM)的SH封闭基团的条件下，裂解重组E1和/或E2和/或E1/E2表达宿主细胞；通过亲和纯化回收所述HCV外被蛋白，如通过凝集素层析，如lentil凝集素层析，或通过使用抗E1和/或抗E2特异性单克隆抗体的免疫亲和；同样优选在存在于NEM或生物素-NEM的SH封闭制剂的条件下，用诸如DTT的二硫键裂解制剂还原或裂解二硫键；乙基，通过凝胶过滤回收还原的E1和/或E2和/或E1/E2外被蛋白，并且选择性地进行额外的Ni2+-IMAC层析和脱盐步骤。
本发明提供了一种含有选自E1和/或E2和/或E1/E2的基本上分离的和/或纯化的，和/或分离的和/或纯化的重组HCV单个的或特异性寡聚外被蛋白的组合物，所述蛋白是用本文所披露的方法分离的。在一种优选实施方案中，本发明的重组HCV外被蛋白是在哺乳动物细胞中表达的，如疫苗、重组酵母细胞。
本发明提供了一种重组载体，它含有可操作地结合在一起的载体序列，原核、真核或病毒启动子序列，以及可以表达单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的核苷酸序列。在一种实施方案中，所述载体的核苷酸序列编码单个的HCV E1蛋白，该蛋白始于1-192号氨基酸之间的部分，并且止于250-400号氨基酸之间的部分，特别是止于250-341号位置之间的部分，更优选止于290-341号位置之间的部分。在另一种实施方案中，所述载体的核苷酸序列编码单个的HCV E1蛋白，该蛋白始于117-192号氨基酸之间的部分，并且止于263-400号氨基酸之间的部分，特别是止于250-326号位置之间的部分。在另一种实施方案中，所述载体的核苷酸序列编码单个的HCV E1蛋白，该蛋白缺失了293号位置之间的第一个疏水性结构域，加或减8个氨基酸。在另一种实施方案中，所述载体的核苷酸序列编码单个的HCV E2蛋白，该蛋白始于290-406号氨基酸之间的部分，并且止于600-820号氨基酸之间的部分，特别是始于322-406号位置之间的部分，更优选始于347-406号位置之间的部分，最优选始于346-406号位置之间的部分；并且优选止于623、650、661、673、710、715、720、746或809中任意一个氨基酸位置。在一种实施方案中，本发明的载体含有可操作地连接于所述核苷酸序列上的5’末端ATG密码子和3’末端终止密码子。在一种实施方案中，所述载体还包括一个因子Xa裂解位点和/或添加在所述编码区3’末端的3-10，优选6个组氨酸密码子。本发明的载体选择性地包括一个核苷酸序列，其中，业已在核酸水平上去掉了存在于E1或E2蛋白上的至少一个糖基化位点。
本发明提供了含有SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47和49中的任意一种或其部分的核酸。本发明的载体优选含有一种核苷酸序列，该序列含有包括SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13、21、23、25、27、29、31、35、37、39、41、43、45、47和49中的任意一种或其部分的核酸。
本发明的组合物还含有重组HCV外被蛋白，该蛋白是由上述载体表达或者是该载体的表达产物。
本发明提供了一种上述至少一种重组载体转化过的宿主细胞，其中，所述载体含有本文所披露的编码HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白的核苷酸序列，此外还包括能够在该宿主细胞中起作用并且能够调控HCV E1和/或E2和/或E1/E2蛋白表达的调控序列。另外，本发明提供了一种由本发明的宿主细胞表达的重组E1和/或E2和/或E1/E2蛋白。
本发明还提供了一种本文所披露的方法，该方法包括以下步骤：在合适的培养基中生长用本文所披露的重组载体转化过的本文所披露的宿主细胞；在合适的条件下使本文所披露的载体核苷酸序列表达；优选在存在诸如N-乙基马来酰亚胺(NEM)的SH基团封闭制剂的条件下裂解转化过的宿主细胞；通过亲和层析回收所述HCV外被蛋白，如通过凝集素层析或使用抗E1和/或抗E2特异性单克隆抗体进行免疫亲和层析，所述凝聚素优选是lentil凝聚素，然后将上一步骤所获得的洗脱物与DTT的二硫键裂解剂一起温育，同样优选在存在诸如NEM或生物素NEM的SH基团封闭制剂的条件下进行；以及，通过凝胶过滤分离HCV单个的或特异性寡聚E1和/或E2和/或E1/E2蛋白，还可以通过额外的Ni2+-IMAC层析和脱盐步骤分离。
本发明提供了一种含有至少一种下列E1和/或E2肽的组合物：
跨越核心/E1 V1区的181-200号氨基酸的E1-31(SEQ ID NO：56)，
跨越E1区的193-212号氨基酸的E1-33(SEQ ID NO：57)，
跨越E1 V2区的205-224号氨基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO：58)，
跨越E1 V2区的208-227号氨基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO：59)，
跨越E1区的192-228号氨基酸(V1、C1和V2区(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO：53)，
跨越E1区的301-320号氨基酸的E1-51(SEQ ID NO：66)，
跨越E1 C4区的313-332号氨基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO：67)，
跨越E1区的325-344号氨基酸的E1-55(SEQ ID NO：68)。
跨越E2区的397-418号氨基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO：72)，
跨越E2区的409-428号氨基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO：73)，
跨越E2区的583-602号位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO：86)，
跨越E2区的595-614号位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO：87)，
跨越E2区的607-626号位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO：88)，
跨越E2区的547-586号位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO：83)，
跨越E2区的523-542号位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO：82)，
本发明提供了一种含有至少一种下列E2构象表位的组合物：
由单克隆抗体15C8C1、12D11F1和8G10D1H9识别的表位F
由单克隆抗体9G3E6识别的表位G，
由单克隆抗体10D3C4和4H6B2识别的表位H(或C)，
由单克隆抗体17F2C2识别的表位I。
本发明提供了用上述组合物免疫接种所产生的E1和/或E2特异性单克隆抗体，例如，本发明的抗体可以被用作药物，使用在免疫测定试剂盒中，用于检测HCV E1或E2抗原的存在，用于预测/监测HCV疾病或用于HCV治疗。本发明提供了将本文所披露的E1和/或E2特异性单克隆抗体用于制备用来检测HCV E1或E2抗原的免疫测定试剂盒，用于制备用来预测/监测HCV疾病的试剂盒或用于制备HCV药物。
本发明提供了一种用于体外诊断存在于生物学样品中的HCV抗原的方法，至少包括以下步骤：
(i)在能够形成免疫复合物的合适条件下，让所述生物学样品与本文所披露的E1和/或E2特异性单克隆抗体接触，优选固定化形式的单克隆抗体，
(ii)清除未结合的成分，
(iii)在合适的条件下，温育与异源抗体形成的免疫复合物，所述异源抗体与一种可检测的标记结合，
(iv)通过肉眼或机械方法检测所述免疫复合物的存在。
本发明提供了一种用于确定存在于生物学样品中的HCV抗原的存在的试剂盒，该试剂盒至少包括以下部分：至少一种本文所披露的E1和/或E2特异性单克隆抗体，优选是固定在固体基质上的形式，生产使得所述抗体和存在于生物学样品中的HCV抗原之间能发生结合反应的缓冲液所需要的缓冲物或成分，以及选择性地包括用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置。
本发明的化合物能够以药物形式提供。
本发明提供了一种组合物，如本文所述，该组合物被用作疫苗，对哺乳动物，优选人类进行HCV免疫，所述免疫包括给予有效量的所述组合物，并选择性地同时给予可以药用的佐剂，以便产生免疫反应。
本发明提供了一种利用本文所披露的组合物制备用于对哺乳动物，优选人类进行HCV免疫的疫苗的方法，包括给予有效量的所述组合物，并选择性地给予可以药用的佐剂，以便产生免疫反应。
本发明提供了一种对哺乳动物，优选人类进行HCV免疫的疫苗组合物，该组合物包含有效量的含有本文所披露的E1和/或E2的组合物，并选择性地含有可以药用的佐剂。
本发明的组合物可以体外检测存在于生物学样品中的HCV抗体的形式提供。本发明还提供了一种制备用于检测存在于生物学样品中的HCV抗体的免疫测定试剂盒的方法，以及利用本发明的试剂盒检测存在于生物学样品中的HCV抗体的方法，以便诊断存在于生物学样品中的HCV抗体。本发明的上述方法至少包括以下步骤：
(i)在能够与所述生物学样品中的HCV抗体形成免疫复合物的合适条件下，让所述生物学样品与本文所披露的组合物接触，优选固定化形式的组合物，
(ii)清除未结合的成分，
(iii)在合适的条件下，温育与异源抗体形成的免疫复合物，所述异源抗体与一种可检测的标记结合，
(iv)通过肉眼或机械方法检测所述免疫复合物的存在。
本发明提供了一种用于确定存在于生物学样品中的HCV抗体的存在的试剂盒，包括：至少一种本文所披露的肽或蛋白组合物，优选是固定在固体基质上的固定化形式的；生产使得所述蛋白或肽和抗存在于生物学样品中的HCV的抗体之间能发生结合反应的缓冲液所需要的缓冲物或成分；以及选择性地包括用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置。
本发明提供了一种体外监测HCV疾病或诊断患有HCV感染的患者对治疗、优选用干扰素治疗的反应的方法，该方法包括：在能形成免疫复合物的条件下将来自受到HCV感染的患者的生物学样品与E1蛋白或其合适的部分一起温育；除去未结合的成分。计算在治疗开始时和治疗期间存在于所述样品中的抗E1效价；监测HCV疾病的自然进程，或根据在治疗开始时和/或在治疗期间存在于所述样品中的抗E1效价的量诊断患者对治疗的反应。
本发明提供了一种用于监测HCV疾病或预测患有HCV感染的患者对治疗，特别是用干扰素治疗的反应的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：
-至少一种E1蛋白或E1肽，特别是本文所披露的E1蛋白或E1肽；
-用于生产使得所述蛋白或肽与所述存在于所述生物学样品中的抗E1抗体之间的能发生结合反应的缓冲液所需要的缓冲物或成分；
-并且选择性地包括用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置；
-还选择性地包括用于了解在治疗过程中抗E1效价降低的自动化扫描和翻译装置。
本发明还提供了一种血清分类测定，用于检测存在于生物学样品中的一种或多种血清类型的HCV，特别是用于检测需要组合在一个测定方案中检测的不同类型的HCV抗体，至少包括以下步骤：
(i)在能够形成免疫复合物的合适条件下，让需要分析一种或多种血清类型的HCV抗体的存在的所述生物学样品与至少一种本文所披露的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白组合物或至少一种本文所排版的E1和/或E2肽组合物接触，优选固定化形式的组合物；(ii)清除未结合的成分，(iii)在合适的条件下，温育与异源抗体形成的免疫复合物，所述异源抗体与一种可检测的标记结合；以及选择性地(iv)通过肉眼或机械方法(例如，通过密度测定、荧光测定、比色测定)检测所述免疫复合物的存在，并且根据所观察到的结合形式了解一种或多种HCV血清类型的存在。
本发明提供了一种用于对存在于生物学样品中的一种或多种血清类型的HCV进行血清分类的试剂盒，尤其是用于检测所述血清类型的HCV的抗体的试剂盒，包括：至少一种本文所披露的E1和/或E2和/或E1/E2蛋白或本文所披露的E1或E2肽；用于生产使得所述蛋白或肽与所述存在于所述生物学样品中的抗E1抗体之间能够发生结合反应的缓冲液所需要的缓冲物或成分；选择性地包括用于检测在上述结合反应中所形成的免疫复合物的装置，另外还选择性地包括用于根据所观察到的结合形式检测一种或多种血清类型的存在的自动化扫描和翻译装置。
本发明还提供了本文所披露的肽或蛋白组合物，用于固定在固体基质上，并且用于反相杂交测定中，优选用于固定在诸如膜片的固体支持物上作为对照系，用于按照本文所披露的方法确定HCV的存在或基因型。
本发明还提供了一种治疗用疫苗组合物，该组合物含有治疗有效量的以下成分：
含有选自E1蛋白和E2蛋白的至少一种纯化的重组HCV单个的或特异性寡聚重组外被蛋白的组合物；以及选择性地含有可以药用的佐剂。本发明疫苗的HCV外被蛋白可以选择性地由重组哺乳动物细胞或重组酵母细胞生产。本发明提供了一种含有治疗有效量的含有至少一种下列E1和E2肽的组合物的治疗用疫苗组合物：
跨越核心/E1 V1区的181-200号氨基酸的E1-31(SEQ ID NO：56)，
跨越E1区的193-212号氨基酸的E1-33(SEQ ID NO：57)，
跨越E1 V2区的205-224号氨基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO：58)，
跨越E1 V2区的208-227号氨基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO：59)，
跨越E1区的192-228号氨基酸(V1、C1和V2区(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO：53)，
跨越E1区的301-320号氨基酸的E1-51(SEQ ID NO：66)，
跨越E1 C4区的313-332号氨基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO：67)，
跨越E1区的325-344号氨基酸的E1-55(SEQ ID NO：68)。
跨越E2区的397-418号氨基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO：72)，
跨越E2区的409-428号氨基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO：73)，
跨越E2区的583-602号位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO：86)，
跨越E2区的595-614号位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO：87)，
跨越E2区的607-626号位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO：88)，
跨越E2区的547-586号位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO：83)，和
跨越E2区的523-542号位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO：82)。
本发明提供了一种治疗诸如人类受HCV感染的哺乳动物的方法，包括给予有效量的本文所披露的组合物，如上述疫苗，并选择性地给予可以药用的佐剂。在一种实施方案中，本发明的组合物与抗病毒治疗组合给予或在抗病毒治疗时给予，所述抗病毒治疗是在给予本发明的组合物之前或之后或同时进行。
本发明提供了一种含有选自E1蛋白和E2蛋白至少一种纯化的重组HCV重组外被蛋白的组合物，并且选择性地含有一种佐剂。在一种优选实施方案中，所述组合物至少含有一种下面的E1和E2肽：
跨越核心/E1 V1区的181-200号氨基酸的E1-31(SEQ ID NO：56)，
跨越E1区的193-212号氨基酸的E1-33(SEQ ID NO：57)，
跨越E1 V2区的205-224号氨基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO：58)，
跨越E1 V2区的208-227号氨基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO：59)，
跨越E1区的192-228号氨基酸(V1、C1和V2区(含有表位B))的1bE1(SEQ ID NO：53)，
跨越E1区的301-320号氨基酸的E1-51(SEQ ID NO：66)，
跨越E1 C4区的313-332号氨基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO：67)，
跨越E1区的325-344号氨基酸的E1-55(SEQ ID NO：68)。
跨越E2区的397-418号氨基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO：72)，
跨越E2区的409-428号氨基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO：73)，
跨越E2区的583-602号位置(表位E)的Env23或E2-23(SEQ IDNO：86)，
跨越E2区的595-614号位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO：87)，
跨越E2区的607-626号位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO：88)，
跨越E2区的547-586号位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO：83)，和
跨越E2区的523-542号位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO：82)。
本发明提供了一种诱导HCV特异性抗体的治疗组合物，该组合物含有治疗有效量的含有由纯化的重组HCV单个的或特异性寡聚重组E1或E2蛋白形成的E1/E2复合物的组合物；并且选择性地含有可以药用的佐剂。本发明的重组HCV外被蛋白可以用重组哺乳动物细胞生产，或者重组HCV外被蛋白是用重组酵母细胞生产的。本发明提供了一种治疗诸如人类的受HCV感染的哺乳动物的方法，包括给予有效量的本文所披露的组合物，并选择性地给予可以药用的佐剂。本发明提供了一种用于诱导HCV特异性抗体的组合物，该组合物含有治疗有效量的含有选自E1和E2蛋白的至少一种纯化的重组HCV单个的或特异性寡聚重组外被蛋白的组合物；并选择性地含有可以药用的佐剂。
附图和表格的说明
图1：质粒pgptATA18的限制图
图2：质粒pgsATA18的限制图
图3：质粒pMS66的限制图
图4：质粒pvHCV-11A的限制图
图5：对IFN治疗无反应者体内的抗E1水平
图6：对IFN台疗有反应者体内的抗E1水平
图7：对IFN治疗有完全反应的患者体内的抗E1水平
图8：对IFN治疗有不完全反应的患者体内的抗E1水平
图9：对IFN治疗无反应者体内的抗E2水平
图10：对IFN治疗有反应者体内的抗E2水平
图11：对IFN治疗有完全反应的患者体内的抗E2水平
图12：对IFN治疗有不完全反应的患者体内的抗E2水平
图13：与肽竞争的人抗E1反应性
图14：抗E1单克隆抗体与肽反应性的竞争
图15：对IFN治疗无反应者体内的抗E1(表位1)水平
图16：对IFN治疗有反应者体内的抗E1(表位1)水平
图17：对IFN治疗无反应者体内的抗E1(表位2)水平
图18：对IFN治疗有反应者体内的抗E1(表位2)水平
图19：抗E2单克隆抗体与肽反应性的竞争
图20：与肽竞争的人抗E2反应性
图21：本发明的核酸序列。本发明的编码E1或E2蛋白的核酸序列可以翻译(SEQ ID NO：3-13，21-31，35和41-49是在从1号残基开始的读框中翻译的，SEQ ID NO：37-39是在从2号残基开始的读框中翻译的)成序列表中所示出的相应E1或E2蛋白的氨基酸序列。
图22：由受到vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染的细胞裂解物的四种不同的E1纯化物的lentil凝集素层析洗脱物级份所获得的ELISA的结果。
图23：根据图22所示出的值由四种不同的E1结构所获得的lentil凝集素层析的洗脱曲线。
图24：由受到vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染的细胞裂解物的四种不同的E1纯化物的凝胶过滤层析级份所获得的ELISA的结果。
图25：由纯化的1b型(1)、3a型(2)和5a型(3)E1蛋白(来自分别用vvHCV39、vvHCV62和vvHCV63感染过的RK13细胞；按照例5.2-5.3所述用lentil凝集素纯化并还原)和标准物(4)获得的曲线。峰值用‘1’、‘2’和‘3’表示，它表示纯的E1蛋白峰(参见图24，E1反应性主要存在于26-30号级份中)。
图26：按例4所述方法对SDS-PAGE进行银染色，E1 HWCV40(1b型)的粗制裂解物(泳道1)vvHCV40的凝胶过滤收集物1相当于图25中所示的级份10-17(泳道2)，vvHCV40的凝胶过滤收集物2相当于图25中所示的级份18-25(泳道3)，和E1收集物(级份26-30)(泳道4)。
图27：E1构建体39(1b型)和62(3a型)的凝胶过滤级份的链霉亲和素-碱性磷酸酶的印迹。用NEM-生物素标记蛋白。泳道1：开始的凝胶过滤构建体39，泳道2：级份26构建体39，泳道3，级份27构建体39，泳道4，级份28构建体39，泳道5，级份29构建体39，泳道6，级份30构建体39，泳道7，级份31构建体39，泳道8，分子量标记，泳道9，开始的凝胶过滤构建体62，泳道10：级份26构建体62，泳道11：级份27构建体62，泳道12：级份28构建体62，泳道13：级份29构建体62，泳道14：级份30构建体62，泳道15：级份31构建体62。
在与图26相同条件下进行的vvHCV-39(E1s，1b型)和vvHCV-62(E1s，3a型)的凝胶过滤级份的SDS-PAGE凝胶的银染色。泳道1：开始的凝胶过滤构建体39，泳道2：级份26构建体39，泳道3，级份27构建体39，泳道4，级份28构建体39，泳道5，级份29构建体39，泳道6，级份30构建体39，泳道7，级份31构建体39，泳道8，分子量标记，泳道9，开始的凝胶过滤构建体62，泳道10：级份26构建体62，泳道11：级份27构建体62，泳道12：级份28构建体62，泳道13：级份29构建体62，泳道14：级份30构建体62，泳道15：级份31构建体62。
用抗E1小鼠单克隆抗体5E1A10进行的Western印迹分析，提供了该纯化方法的完整的概述。泳道1：粗制裂解物，泳道2：lentil层析的流通物，泳道3：在lentil层析之后用Empigen-BB洗涤，泳道4：lentil层析的洗脱物，泳道5：在浓缩lentil洗脱物期间流通物，泳道6：在大小排阻层析(凝胶过滤)之后的E1合并物。
图30：在来自受vvHCV44感染的RK13细胞的E2蛋白的lentil凝集素层析的OD280曲线(连续的曲线)。点划线表示通过ELISA检测的E2反应性(如实施例6所述)。
图31A：在来自受vvHCV44感染的RK13细胞的lentil-凝集素凝胶过滤层析E2蛋白收集物的OD280曲线(连续的曲线)，其中，所述E2收集物被马上加样到凝胶过滤柱上(非还原条件)。点划线表示通过ELISA检测的E2反应性(如实施例6所述)。
图31B：在来自受vvHCV44感染的RK13细胞的lentil-凝集素凝胶过滤层析E2蛋白收集物的OD280曲线(连续的曲线)，其中，按照实施例5.3的方法还原或封闭E2收集物(还原条件)。点划线表示通过ELISA检测的E2反应性(如实施例6所述)。
图32：在凝胶过滤之后，在图31B的还原条件下，由vvHCV44表达的E2蛋白的Ni2+-IMAC层析和ELISA反应性。
图33：通过图32中所示的Ni2+-IMAC层析的200mM咪唑洗脱步骤(泳道2)和30mM咪唑洗涤(泳道1)步骤所回收的0.5微克纯化的E2蛋白的SDS-PAGE的银染色。
图34：通过图33所示的200mM咪唑洗脱所回收的纯化的E2蛋白的脱盐步骤的OD曲线，意在去除咪唑。
图35A：在治疗期间以及在治疗之后6-12个月的时间内通过LIAscan方法测定的NR和LTR的针对不同的HCV抗原(核心1、核心2、E2HCVR、NS3)的抗体含量。平均值用带有空心方框的曲线表示。
图35B：在治疗期间以及在治疗之后6-12个月的时间内通过LIAscan方法测定的NR和LTR的针对不同的HCV抗原(NS3、NS5、E1和E2)的抗体含量。平均值用带有空心方框的曲线表示。
图36：LTR和NR组中的平均E1抗体(E1Ab)和E2抗体(E2Ab)含量。
图37：1b型和3a型非反应者(NR)和长期反应者(LTR)的平均E1抗体(E1Ab)水平。
图38：抗E2单克隆抗体的相对作图位置。
图39：HCV E1外被蛋白的部分脱糖基化。按照生产商的说明，将vvHCV10A-感染过的RK13细胞的裂解物与不同浓度的糖苷酶一起温育。右侧图片：糖肽酶F(PNGase F)。左侧图片：内切糖苷酶H(EndoH)。
图40：HCV E2外被蛋白的部分脱糖基化。按照生产商的说明，将vvHCV64-感染过的(E2)和vvHCV41-感染过的(E2s)RK13细胞的裂解物与不同浓度的糖肽酶F(PNGase F)按照生产商的说明一起温育。
图41：HCV E1糖蛋白的体外诱变。诱变序列的作图和新的限制位点的产生。
图42A：HCV E1糖蛋白的体外诱变(第一部分)。PCR的扩增的第一个步骤。
图42B：HCV E1糖蛋白的体外诱变(第二部分)。重叠延伸和嵌套PCR。
图43：HCV E1糖蛋白的体外诱变。在第一个扩增步骤中合成的PCR诱变片段(GLY#和OVR#)的作图。
图44A：通过Western印迹分析在HeLa(左侧)和RK13(右侧)细胞中表达的E1糖蛋白变体。泳道1：野生型VV(痘苗病毒)，泳道2：原始E1蛋白(vvHCV-10A)，泳道3：E1变体Gly-1(vvHCV-81)，泳道4：E1变体Gly-2(vvHCV-82)，泳道5：E1变体Gly-3(vvHCV-83)，泳道6：E1变体Gly-4(vvHCV-84)，泳道7：E1变体Gly-5(vvHCV-85)，泳道8：E1变体Gly-6(vvHCV-86)。
图44B：通过PCR扩增/限制分析E1糖基化变体痘苗病毒。泳道1：E1(vvHCV-10A)BspEI，泳道2：E1.GLY-1(vvHCV-81)，BspEI，泳道4：E1(vvHCV-10A)，SacI，泳道5：E1.GLY-2(vvHCV-82)，SacI，泳道7：E1(vvHCV-10A)，SacI，泳道8：E1.GLY-3(vvHCV-83)SacI，泳道10：E1(vvHCV-10A)，StuI，泳道11：E1.GLY-4(vvHCV-84)，StuI，泳道13：E1(vvHCV-10A)，SmaI，泳道14：E1.GLY-5(vvHCV-85)，SmaI，泳道15：E1(vvHCV-10A)，StuI，泳道17：E1.GLY-6(vvHCV-86)，StuI，泳道3-6-9-12-15：低分子量标记，pBluescript II SK+，MspI。
图45：在酿酒酵母中表达的重组E2的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。使接种物在亮氨酸选择培养基中生长72小时，并且用完全培养基以1/15的比例稀释。在28℃下培养10天之后，取培养基样品。将通过speedvac浓缩的相当于200微升培养上清液加样到所述凝胶上。分析两个独立的转化体。
图46：在糖基化缺陷型酿酒酵母变体中表达的重组E2的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。将接种物在亮氨酸选择培养基中生长72小时，并且用完全培养基以1/15的比例稀释。在28℃下培养10天之后，取培养基样品。将通过离子交换层析浓缩的相当于350微升培养上清液加样到所述凝胶上。
图47：黑猩猩的特征和免疫方案。
图48：在经过3次免疫接种后的细胞应答。
图49：在充分进行E1免疫接种时细胞应答的演化。
图50：在经过NS3免疫接种时的细胞应答。
表1：用于扩增构建实施例1中所示的不同形式的E1蛋白的相应的克隆和引物的特征
表2：抗E1测定的总结
表3：用于竞争研究的合成肽
表4：外被抗体水平随时间的变化
表5：LTR和NR之间的差别
表6：鼠E2单克隆抗体之间的竞争实验
表7：用于构建E1糖基化变体的引物
表8：通过ELISA分析E1糖基化变体
表9：使用过佐剂的E1 Balb/c小鼠的特征
表10：体液应答：不同的E1抗体水平所需要的免疫接种次数。
例1：丙型肝炎病毒E1蛋白的克隆和表达
1.构建痘苗病毒重组载体
pgptATA18痘苗重组质粒是pATA18的修饰形式(Stunnenberg等，1988)，其中额外插入了含有受痘苗病毒13中间启动子控制的大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的片段(图1)。质粒pgsATA18是通过将在3个开放读框内含有终止密码子的具有SEQ IDNO：1/94的寡核苷酸接头插入PstI和HindIII切断的pATA18载体上而构建的。由此产生了一个额外的PacI限制位点(图2)。没有恢复原有的HindIII位点。具有SEQ ID NO：1/94的寡核苷酸接头：
5′     G   GCATGC   AAGCTT   AATTAATT            3′
3′ ACGTC   CGTACG   TTCGAA   TTAATTAA  TCGA    5′
     PstI    SphI    HindIII    Pac I     (HindIII)
为了有利于通过融合在重组蛋白上的工程产生的组氨酸片段的Ni2+螯合方法快速而有效地进行纯化，可以将疫苗重组载体pMS66设计成能表达具有一个额外的羧基末端组氨酸标记的分泌型蛋白。用以下方式合成含有通过三种限制酶产生平端(SmaI、StuI和PmlI/BbrPI)的独特位点的具有SEQ ID NO：2/95的寡核苷酸接头，任何cDNA的羧基末端都可以插入具有一个编码蛋白酶因子Xa裂解位点的序列的框内，随后是一个编码6个组氨酸和2个终止密码子的核苷酸序列(在3’末端下游还形成了一个PacI位点)。将具有SEQ ID NO：2/95的寡核苷酸插入pgptATA18的XmaI和PstI位点之间(图3)。
具有SEQ ID NO：2/95：的寡核苷酸接头
5′CCGGG GAGGCCTGCACGTGATCGAGGGCAGACACCATCACCACCATCACTAATAGTTAATTAA CTGCA
3′
3′   C CTCCGGACGTGCACTAGCTCCCGTCTGTGGTAGTGGTGGTAGTGATTATCAATTAATT G
    XmaI                                                              PstI
业已按照布达佩斯条约将包含在大肠杆菌MC1061(λ)中的质粒pgptATA18保存在BCCM/LMBP(比利时微生物协调保藏中心/Laboratorium voor Moleculaire Biologie Plasmidencollectie，Universiteit Gent，K.L.Ledeganckstraat35B-9000 Ghent，Belgium)，保藏号为LMBP4486。所述保藏是在2002年1月9日进行的。
实施例2.构建HCV重组质粒
2.1编码不同形式的E1蛋白的构建体
通过以前所披露的RNA制备，随后进行逆转录和PCR(Stuyver等，1993b)从血清样品中获得聚合酶链式反应(PCR)产物。表1表示用于扩增相应的克隆和引物的特征。将所述PCR片段克隆到SmaI裂解过的pSP72(Promega)质粒上。选择以下克隆插入痘苗重组载体上：HCCI9A(SEQ ID NO：3)、HCCI10A(SEQ ID NO：5)、HCCI11A(SEQID NO：7)、HCCI12A(SEQ ID NO：9)、HCCI13A(SEQ ID NO：1)和HCCI17A(SEQ ID NO：13)，如图21所示。通过用EcoRI和HindIII限制裂解将含有编码E1区的cDNA片段从相应的pSP72质粒上裂解下来，并插入EcoRI/HindIII裂解过的pgptATA18疫苗重组载体上(如例1所述)，位于11K痘苗病毒晚期启动子的下游。相应的质粒被命名为pvSCV-9A，pvSCV-10A，pvSCV-11A，pvSCV-12A，pvSCV-13A和pvSCV-17A，在图7中示出了其中了pvSCV-11A。
2.2疏水区E1缺失变体
按以下方法制备含有密码子Asp264-Va1287缺失的克隆HCCI37(790-861号氨基酸，编码疏水性结构域I的片段)：用引物对HCPr52(SEQ ID NO：16)/HCPr107(SEQ ID NO：19)和HCPr108(SEQ IDNO：20)和HCPr54(SEQ ID NO：18)由克隆HCCI10A制备两种PCR片段。所述引物如图21所示。在电泳之后从琼脂糖凝胶中纯化以上两种PCR片段，并将1纳克每一种片段同时用作模板，通过引物HCPr52(SEQ ID NO：16)和HCPr54(SEQ ID NO：18)进行PCR。将所得到的片段克隆到SmaI裂解过的pSP72载体上，并且能很方便地鉴定含有所述缺失的克隆，因为缺失了24个密码子(72个碱基对)。筛选含有克隆HCCI37(SEQ ID NO：15)的质粒pSP72-HCCI37。通过将所述缺失周围的HCV序列(通过XmaI和BamHI从载体pSP72-HCCI37裂解的片段)插入疫苗质粒pvHCV-10A上的XmaI和BamHI位点上构建含有缺乏疏水性结构域I的完整长度E1 cDNA的重组疫苗质粒。所得到的质粒被命名为pvHCV-37。在验证性测序之后，将含有所述内部缺失的氨基末端片段从载体pvHCV-37上分离下来(用EcoRI和BstEII裂解)，并重新插入EcoRI和BstEII裂解过的pvHCV-11A质粒上。预计该构建体能表达缺失了两个疏水性结构域E1蛋白，并命名为pvHCV-38。克隆HCCI38的E1编码区如SEQ ID NO：23所示。
由于在构建体pvHCV-38上不包括完整的位于E1羧基末端的亲水区(理论上讲延伸到337-340号氨基酸周围)，通过EcoRI/BamHI裂解从pvHCV-37质粒上分离了较大的缺乏疏水结构域I的E1片段，并将其克隆到EcoRI/BamHI裂解过的pgsATA-18载体上。所得到的质粒被命名为pvHCV-39，并且含有克隆HCCI39(SEQ ID NO：25)。通过BamHI(其中的粘性末端用KlenowDNA聚合酶I(Boehringer)补平)随后用EcoRI(5’末端)消化将相同的片段从pvHCV-37载体上裂解下来。将该序列插入EcoRI和BbrPI裂解过的载体pMS-66上。由此得到了包含在质粒pvHCV-40上的克隆HCCI40(SEQ ID NO：27)，它在其羧基末端含有6个组氨酸尾巴。
2.3其他基因型的E1
克隆HCCI62(SEQ ID NO：29)来自3a型感染的慢性丙型肝炎患者(在WO94/25601中披露为血清BR36，克隆BR36-9-13，SEQ ID NO：18，并且还可以参见Stuyver等，1993a)，而HCCI63(SEQ ID NO：31)来自5a型感染的输血后感染肝炎的儿童(在WO94/25601中披露为血清BE95，克隆PC-4-1，SEQ ID NO：45)。
2.4E2构建体
利用Stuyver等，1993b所披露的RNA制备、逆转录和PCR技术通过引物HCPr109(SEQ ID NO：33)和HCPr72(SEQ ID NO：34)由血清BE11(基因型b)获得HCV E2 PCR片段22，并将该片段克隆到SamI裂解过的pSP72载体上。用NcoI/AlwNI或通过BamHI/AlwNI裂解克隆HCCI22A(SEQ ID NO：35)，并将该片段的粘性末端补平(用KlenowDNA聚合酶I(Boehringer)补平NcoI和BamHI位点，用T4DNA聚合酶(Boehringer)补平AlwNI位点)。将所述BamHI/AlwNI cDNA片段插入疫苗pgsATA18载体上，该载体业已通过EcoRI和HindIII裂解线性化，并且用KlenowDNA聚合酶(Boehringer)将其粘性末端补平。所得到的质粒被命名为pvSCV-41，并且编码从氨基酸Met347到Gln673的E2区，包括E1蛋白的37个氨基酸(从Met347到Gly383)，该片段可能起着信号序列的作用。将相同的HCV cDNA插入EcoRI/BbrPI裂解过的载体pMS-66上，随后用KlenowDNA聚合酶将末端补平，所述的质粒被命名为pvSCV-42，并且同样编码347-683号氨基酸。用类似方法将NcoI/AlwNI片段插入pgsATA18(pvSCV-43)或pMS-66疫苗载体(pvSCV-44)的相同位点上。pvSCV-4和pvSCV-444编码多蛋白的346-673号氨基酸，其中来自E1蛋白的天然羧基末端区的364-383号氨基酸编码E2信号序列，以及成熟E2蛋白的384-673号氨基酸。
2.5制备重组HCV-痘苗病毒
兔肾RK13细胞(ATCC CCL37)、人骨肉瘤143B胸苷激酶缺陷型(TK-)(ATCC CRL8303)HeLa(ATCC CCL2)和Heb G2(ATCC HB8065)细胞系是从美国模式培养物保藏所(ATCC，Rockville，Md，美国)获得的。在Dulbecco’s改进的Eagle培养基(DMEM)上生长所述细胞，用于生长RK13和143B(TK-)的培养基补充了10％的胎牛血清和Earle’s盐(EMEM)，而用于Hep G2细胞生长的培养基补充了葡萄糖(4克/升)。按以前披露的方法(Panicali&Paoletti，1982；Piccini等，1987；Mackett等，1982，1984和1986)在143B或RK13细胞中常规增殖所述痘苗病毒WR菌株(Western Reserve，ATCC VR119)。用野生型痘苗病毒0.1的感染复数(m.o.i.)(0.1噬斑形成单位(PFU)/细胞)感染153B细胞的铺满的单层。2小时之后，以含有500纳克质粒DNA的磷酸钙共沉淀形式将所述疫苗重组质粒转染到受感染的细胞中，以便进行同源重组(Graham&van de Eb，1973；Makett等，1985)。在用选择培养基(含有25微克/毫升霉酚酸(MPA)、250微克/毫升黄嘌呤和15微克/毫升次黄嘌呤的EMEM；Falkern和Moss，1988；Janknecht，1991)培养的兔肾RK13细胞上选择表达大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶(gpt)蛋白的重组病毒。在选择培养基的0.9％琼脂糖叠层下面的新的RK13细胞新的单层上纯化单个的重组病毒。筛选胸苷激酶缺陷型(TK-)重组病毒，然后在有25微克/毫升5-溴-2’-脱氧尿苷的条件下在新的人143B细胞(TK-)单层上纯化噬斑。通过以0.05的m.o.i.感染人143B或兔RK13细胞制备纯化的重组HCV-痘苗病毒原种(Mackett等，1988)。在经过MPA选择之后，通过利用用于克隆相应的HCV片段的引物(参见表1)进行PCR，用一份细胞裂解物样品(50微升)证实所述HCV cDNA片段插入了重组痘苗病毒上。所述重组疫苗HCV病毒按照疫苗重组质粒编码进行命名，例如，重组痘苗病毒vvHCV-10A来自野生型WR菌株与pvHCV-10A的质粒的重组。
实施例3：用重组痘苗病毒感染细胞
用实施例2中所披露的重组HCV痘苗病毒以3的感染复数感染RK13细胞的铺满的单层。为了进行感染，用磷酸缓冲的盐溶液pH7.4(PBS)洗涤所述细胞单层2次，并用MEM培养基稀释所述重组痘苗病毒原种。向每106细胞中添加200微升病毒溶液，使得感染复数为3，并在24℃下培养45分钟。吸出所述病毒溶液，并向每106细胞中添加2毫升完整的生长培养基(参见例2)。在37℃下培养所述细胞24小时，在此期间进行了HCV蛋白的表达。
实施例4：通过Western印迹分析重组蛋白
用PBS洗涤感染过的细胞2次，直接用裂解缓冲液(50mMTris-HCl，pH7.5，100mM氯化钠，1％Triton X-100，5mM氯化镁，1微克/毫升抑蛋白酶肽(Sigma，Bornem，比利时))直接裂解或通过在50mMTris-HCl pH7.5/10mMEDTA/150mM氯化钠培养5分钟与烧瓶分离，并通过离心收集(1000g，5分钟)。然后将细胞沉淀物每106细胞重新悬浮在200微升裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH8.0，2mM EDTA，150mM氯化钠，5mM氯化镁，抑蛋白酶肽，1％Triton X-100)以14000rpm的速度在Eppendorf离心机中离心5分钟使细胞裂解物澄清，以便除去不溶性的碎片。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离20微升裂解物的蛋白。然后用冷却到4℃的Hoefer HIS转移装置将所述蛋白从所述凝胶上转移到硝酸纤维素膜(Amersham)上，在转移缓冲液中(25mM Tris-HCl，pH8.0，192mM甘氨酸，20％(v/v)甲醇)以100V的稳定电压转移2小时。用Blotto(用PPS制备的5％(w/v)脱脂速溶奶粉；Johnson等，1981)封闭硝酸纤维素膜，并且与用Blotto/0.1％Tween-20稀释的一级抗体一起培养。通常将人类阴性对照血清或感染了HCV的患者的血清稀释200倍，并且在室温下与稀释200倍的野生型痘苗病毒感染的细胞裂解物一起预培养1小时，以便减弱非特异性结合。在用Blotto/0.1％Tween-20洗涤之后，将所述硝酸纤维素膜与用Blotto/0.1％Tween-20稀释的碱性磷酸酶底物溶液一起培养。用由PBS配置的0.1％Tween-20洗涤，然后将所述滤膜与碱性磷酸底物溶液(100mM Tris-HCl，pH9.5，100mM氯化钠，5mM氯化镁，0.38微克/毫升淡兰四唑，0.165微克/毫升5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸)一起培养。除了电转移步骤之后，所有步骤都是在室温下进行的。
实施例5：纯化重组E1或E2蛋白
5.1裂解
用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)洗涤感染过的RK13细胞(具有E1或E2构建体)2次，并通过在含有10mM EDTA的PBS中培养将其从培养受体上分离下来。分离的细胞用PBS洗涤2次，并为每105细胞添加4℃的1毫升裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM氯化钠，1％Triton X-100，5mM氯化镁，1微克/毫升抑蛋白酶肽(Sigma，Bornem，比利时)，含有2mM生物素化的N-乙基马来酰亚胺(生物素-NEM)(Sigma))。用B型douncer对该裂解物进行匀浆，并在室温下放置0.5小时。将另外5倍体积的含有10mM N-乙基马来酰亚胺(NEM，Aldrich，Bornem，比利时)的裂解缓冲液添加到所述原始裂解物中，并将该混合物在室温下放置15分钟。在4℃下通过在Beckman JA14转子中以14000rpm的速度(最大速度为30100g)离心1小时将不溶性细胞碎片从该溶液中清除。
5.2凝集素层析
以1毫升/分钟将澄清的细胞裂解物加样到0.8×10厘米的lentil-凝集素Sepharose 4B柱(Pharmacia)上，该柱用5倍柱体积的裂解缓冲液以1毫升/分钟的流速平衡过。用5-10倍柱体积的缓冲液1(0.5M磷酸钾，pH7.3，500mM氯化钾，5％甘油，1mM6-NH2-己烷酸，1mM氯化镁，和1％圭基PEG(KWANT，Bedum，荷兰))洗涤所述lentil-凝集素柱。在某些实验中，随后用10倍柱体积的含有0.5％Empigen-BB(Calbiochem，San Diego，CA，USA)而不是1％圭基PEG的缓冲液1洗涤该柱。通过使用洗脱缓冲液(10mM磷酸钾，pH7.3，5％甘油，1mM己烷酸，1mM氯化镁，0.5％Empigen-BB，和0.5Mα-甲基-甘露糖吡喃糖苷)洗脱结合的材料。分离洗脱的材料，并通过例6所述的ELISA筛选级份中E1或E2蛋白的存在。图22表示由用vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染过的细胞裂解物的四种不同的E1纯化物的lentil凝集素洗脱物级份所获得的ELISA的结果。图23表示由图22所示出的值所获得的曲线。以上结果表明凝集素亲和层析可用于不同类型HCV的外被蛋白。
5.3浓缩和部分还原
通过在4℃下，在Beckman JA20转子中以5000rpm的速度离心3小时收集E1或E2阳性级份，在Centricon30kDa(Amicon)上浓缩。在某些实验中，E1或E2阳性级份是通过氮气蒸发收集并浓缩的。将相当于3×108细胞的量浓缩到大约200微升。为了进行部分还原，将30％的Empigen-BB(Calbiochem，San Diego，CA，USA)添加到这200微升样品中，使最终浓度为3.5％，随后添加用水配制的1M DTT，使最终浓度为1.5-7.5mM，并在37℃下培养30分钟。随后添加NEM(用二甲基亚砜配制成1M浓度)至50mM的最终浓度，并在37℃下让它们再反应30分钟，以便封闭游离的巯基基团。
5.4凝胶过滤层析
用3倍柱体积的PBS/3％Empigen-BB平衡Superdex-200HR10/20柱(Pharmacia)。将还原的混合物注入Smart系统(Pharmacia)的500微升样品回路中，并添加PBS/3％Empigen-BB缓冲液，进行凝胶过滤。收集从V0至Vt的250微升的级份。按例6所述方法筛选所述级份中E1或E2蛋白的存在。图24表示由受到vvHCV39(1b型)、vvHCV40(1b型)、vvHCV62(3a型)和vvHCV63(5a型)感染的细胞裂解物的四种不同的E1纯化物的凝胶过滤层析级份所获得的ELISA的结果。图25表示由纯化的1b型(1)、3a型(2)和5a型(3)E1蛋白(来自分别用vvHCV39、vvHCV62和vvHCV63感染过的RK13细胞；按照例5.2-5.3所述用lentil凝集素纯化并还原)和标准物(4)获得的曲线。峰值用‘1’、‘2’和‘3’表示，它表示纯的E1蛋白峰(参见图24，E1反应性主要存在于26-30号级份中)。这些峰表示大约为70kDa的非常接近的分子量，相当于二聚体蛋白。在这三条曲线上的其他峰表示痘苗病毒和/或细胞蛋白，这些蛋白只所有能与E1分离，仅仅是因为在例5.3中所述的还原步骤，并且因为随后在有适当的洗涤剂的条件下进行的凝胶过滤步骤。如图26所示，收集物1(表示10-17号级份)和收集2(表示18-25号级份)含有不存在于E1收集物(26-30号级份)中的污染性蛋白。将E1峰级份在SDS-PAGE上分离，并按例4所述方法吸印。按图27所示通过图27所示的链霉亲和素-碱性磷酸酶检测用NEM-生物素标记过的蛋白。不难看出，在凝胶过滤层析之前所存在的29kDa和45kDa的污染蛋白(泳道1)仅以非常低的含量出现在26-30号级份中。大约65kDa的带表示E1二聚体形式，这种二聚体形式不能完全裂解成单体E1形式。3aE1蛋白获得了类似结果(泳道10-15)，它在SDS-PAGE上表现出更快的迁移速度，因为仅存在5个碳水化合物而不是6个。图28表示以与图26相同的条件进行的SDS-PAGE凝胶电泳的银染色。在图29中提供了该纯化方法的完整的综述。
通过在例4所披露的Western印迹进一步证实了纯化E1蛋白的存在。二聚体E1蛋白似乎是非凝聚的，并且不含杂质。用477Perkins-Elmer测序仪对按照上述方法从用vvHCV-40感染过的细胞中纯化的亚型1b E1蛋白的氨基末端进行测序，并证实它的第一个残基是酪氨酸。由此证实了所述E1蛋白业已在正确的位置上(A191和Y192之间)通过信号肽酶裂解与它的信号序列分离。这一结果证实了Hijikata等(1991)的发现，即成熟的E1蛋白的氨基末端始于192号氨基酸位置。
5.5纯化E2蛋白
按照例5.1-5.4所述方法从用vvHCV-44感染过的RK13细胞中纯化E2蛋白(384-673号氨基酸)。图30表示lentil凝集素层析的OD280曲线(连续的曲线)。点划线表示通过ELISA检测的E2反应性(如例6所述)。图31表示通过lentil凝集素E2蛋白收集物的凝胶过滤层析所获得的相同的曲线(参见图30)，其中的一部分是按照例5.3所述方法还原并封闭的，而另一部分被马上加样到所述柱上。这两部分E2收集物在独立的凝胶过滤柱上过滤。可以证实，如果没有进行还原的话，E2能与污染性蛋白形成共价连接的凝集物。在还原和封闭之后，污染性蛋白的主要部分分离成V0级份。与E2蛋白一起纯化的其他污染性蛋白不再与E2蛋白共价连接，因为这些污染物可以在随后的步骤除去。图32表示为了E2蛋白纯化而进行的额外的Ni2+-IMAC纯化步骤。该亲和素纯化步骤采用了由vvHCV44所表达的添加在E2蛋白上的6个组氨酸残基。污染性蛋白要么可以从所述柱中流过，或者通过30mM咪唑洗涤清除。图33表示0.5微克纯化的E2蛋白的银染色的SDS-PAGE和30mM的咪唑洗涤。通过200Mm的咪唑洗脱步骤可以轻易地回收纯的E2蛋白。图34表示用于除去咪唑的额外的脱盐步骤，并可以转移到需要的缓冲液中，例如，PBS、碳酸盐缓冲液、盐水。
在例5.1-5.5中所述的方法以大约50000平方厘米的RK13细胞为原材料(用于生产E1的细胞用vvHCV11A(或vvHCV40)感染过，或为了生产E2蛋白所述细胞用vvHCV41、vvHCV42、vvHCV43或vvHCV44感染过)，可以纯化大约1.3毫克E1蛋白和0.6毫克E2蛋白。
还应当指出的是，分泌型E2蛋白(占细胞内形式的大约30-40％，60-70％)的特征是形成凝聚物(与预期结果相反)。因此纯化分泌型E2存相同的问题。可以按上述方法纯化分泌型E2。
实施例6：用于检测抗E1或抗E2抗体或用于检测E1或E2蛋白的ELISA
以每孔1倍体积(例如50微升或100微升或200微升)的用PBS配制的5微克/毫升链霉亲和素溶液(Boehringer Mannheim)对Maxisorb微孔平板(Nunc，Roskilde，丹麦)进行包衣，在4℃下进行16小时或者在37℃下进行1小时。或者，用1倍体积的用50mM碳酸钠缓冲液pH9.6配制的5微克/毫升雪花莲凝集素(GAN)所述孔进行包衣，4℃下进行16小时或者在37℃下进行1小时。在用GAN进行包衣时，用400微升Innotes HCV Ab III试剂盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)的洗涤溶液将所述平板洗涤2次。用1.5-2倍体积的封闭溶液(用PBS配制的0.1％酪蛋白和0.1％氮化钠)封闭未结合的包衣表面，在37℃下进行1小时或者在4℃下进行16小时。吸出封闭溶液。将纯化的E1或E2稀释到100-1000纳克/毫升(浓度是在A＝280nm的波长下测定的)或者筛选柱级份中的E1或E2(参见例5)，或将未纯化过的细胞裂解物中的E1或E2(例5.1)用封闭溶液稀释20倍，并将1倍体积的E1或E2溶液添加到每一个孔中，并在37℃下在链霉亲和素或GAN包衣的平板上培养1小时。用1倍体积的Innotes HCV Ab III试剂盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)洗涤溶液将所述微孔洗涤3次。用Innotes HCV Ab III试剂盒的样品稀释剂将血清样品稀释20倍，或者将单克隆抗E1或抗E2抗体稀释到20纳克/毫升的浓度，并让1体积的溶液与E1或E2蛋白在37℃下反应1小时。用100微升Innotes HCV Ab III试剂盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)的洗涤溶液洗涤所述微孔5次。按上述方法检测结合的抗体：在37℃下用由1体积的Innotes HCV Ab III试剂盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)的缀合稀释剂稀释1/80000倍的山羊抗人或抗小鼠IgG、过氧化物酶结合的二级抗体(DAKO，Glostrup，丹麦)培养每一个孔1小时，用400微升Innotes HCV AbIII试剂盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)的洗涤溶液洗涤所述平板3次之后，通过添加用1体积的Innotes HCV Ab III试剂盒(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)底物溶液稀释100倍的Innotes HCV Ab III试剂盒的底物(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)在24℃下反应30分钟实现显色。
实施例7：用不同的临床特征随访患者组
7.1监测抗E1和E2抗体
业已开发出了用于筛选并证实HCV抗体存在的现有的丙型肝炎病毒(HCV)诊断测定方法。所述测定方法似乎不能提供用于监测疾病治疗或预测治疗结果的信息。不过，对于乙型肝炎来说，检测并定量抗外被蛋白抗体在临床实践上可能更为有用。为了研究利用抗E1抗体效价和抗E2抗体效价作为预测丙型肝炎疾病的后果的标记，将一系列用IFN-α治疗的具有长期持续的反应(被定义为在治疗之后至少1年时间内，在血液中具有正常的转氨酶水平和阴性HCV-RNA测试(在5’非编码区上进行的PCR)的患者)与表现出物反应或表现出在治疗结束时具有延迟的生物化学反应的患者进行比较。
将一组8个具有长期持续反应的IFN-α治疗过的患者(LTR，随访1-3.5年，3个3a型和5个1b型)与9个对治疗表现出不完全反应的患者(NR，随访1-4年，6个1b型和3个3a型)进行比较。1b型(vvHCV-39，参见例2.5)和3a E1(vvHCV-62，参见例2.5)蛋白是由痘苗病毒系统表达的(参见例3和4)，并纯化至均匀(例5)。检验来自受1b型丙型肝炎病毒感染的患者的样品与纯化的1b型1E蛋白的反应性。同时通过例6所示的ELISA检验受3a型感染的样品与抗3aE1型抗体的反应性。通过Inno-LiPA基因型分类测定(Innogenetics，Zwi jndrecht，比利时)确定感染不同患者的丙型肝炎病毒的基因型。图5表示在干扰素治疗期间观测到的以及在治疗之后的时间内观测到的所述患者的抗E1信噪比。LTR例子中，一致性地表现出抗E1水平的迅速下降(在所有三个例子中都是阴性的)，而NR例子的抗E1水平大体上保持稳定。所获得的某些抗E1数据在表2中是以平均S/N比例±SD的形式表示的(平均抗E1效价)。可以根据表5、6、7和8中所示的信噪比推测出抗E1效价。
在治疗结束时，就已经能够观察到两组之间的显著差别。在LTR组中，抗E1抗体效价下降了6.9倍，而在NR组中仅下降了1.5倍。在随访观察结束时，在具有持续反应的患者体内的抗E1效价下降到原来效价的1/22.5，在NR组中甚至还略有增加。因此，基于以上数据，在监测IFN-α治疗期间抗E1抗体含量的降低与对治疗的长期持续性反应相关。所述抗抗E1测定对于预测IFN治疗的长期反应或者对于总体上治疗丙型肝炎疾病非常有用。
这一发现是出乎预料的，相反，本发明人曾经预计在具有长期反应的患者中，在IFN治疗期间抗E1抗体含量会提高。对于乙型肝炎来说，由于抗H BsAg抗体的血清转变而清除了这种病毒。另外，在许多其他病毒感染中，在抗外被蛋白抗体产生以后，消除了有关病毒。不过，在本发明的实验中，在对治疗具有长期反应的患者体内抗E1抗体明显降低，而在非反应患者体内该抗体的含量大体上保持在同一水平上。尽管以上实验的结果是出乎预料的，不过这种非显而易见的发现可能对于HCV感染的临床诊断非常重要并且有用。如图9、10、11和12所示，在所研究的相同的患者体内抗E2含量表现出很大差别，而对于抗E1抗体来说没有发现其效价有明显的下降。图35提供了该实验研究的完整的概况。
从表2可以看出，在治疗开始时，长期反应者体内的抗E1效价比对治疗的不完全反应者的抗E1效价平均高至少2倍。因此，测定治疗开始时抗E1抗体的效价，或者将监测在感染过程中对患者进行监测并测定抗E1效价。可以作为临床诊断丙型肝炎的有用的标志。
正如在例7.3中所述，可能需要使用E1或E2蛋白的更明确的部分。
7.2在较大的患者群中分析E1和E2抗体
以上实验研究使得本发明人得出了这样的结论：在感染被彻底消除以后，抗HCV外被蛋白的抗体的变化比抗更常见的研究过的HCV抗原的抗体的变化更快，以E1抗体的改变最明显。因此，我们在研究中包括了更多的1b型和3a感染的LTR患者，并且在患者群中补充了匹配的一系列NR，这样两个组就各包括14位患者。还分析了某些部分反应者(PR)以及反应延迟的反应者(RR)。
图36表示LTR和NR组中平均E1抗体(E1Ab)和E2抗体(E2Ab)含量，而表4和5表示统计学分析。在这一较大的群体中，在IFN-α治疗之前较高的E1抗体与LTR相关(p＜0.03)。由于在3a型感染的患者中观察到了比1b型感染的患者体内的更高的E1抗体含量(图37)，也要将基因型考虑在内(表4)。在1b感染型组内，在开始治疗时LTR的E1抗体含量同样高于NR的E1抗体含量(p＜0.05)；有限数量的3a型感染的NR无法进行统计学分析。
在对LTR进行1.5年的抗体含量监测时，只有E1抗体与在治疗开始时测定的含量相比被快速清除[治疗结束时P＝0.0058；在治疗之后6个月和12个月分别为P＝0.0047和P＝0.0051]。在1型或3型感染的LTR中这种消除依然保持明显(平均P值＜0.05)。以上数据证实了最初的发现，即在发展的早期阶段E1Ab含量迅速降低。这一特征似乎与病毒基因型无关。在NR、PR或RR中，在整个随访观察期间没有发现测定的任何抗体有所改变。在对治疗有积极反应的患者中，在治疗期间表现出ALT水平的正常化和HCV-RNA阴性，而在持续的反应者(LTR)和反应延迟的反应者(RR)之间存在显著差别。与LTR相反，RR没有表现出E1抗体含量的任何降低，这表明隐藏的HCV感染的存在既不能通过PCR或用于检测HCV-RNA的传统方法证实，又不能通过提高了的ALT含量证实。在治疗期间在RR组中仍然存在的少量病毒RNA似乎能进行抗E1 B细胞刺激。因此，抗E1监测不仅能够区分LTR和NR，而且还能区分LTR和RR。
7.3监测E1蛋白的特定区域的抗体
尽管鉴定HCV抗原的分子生物学方法导致了在病毒诊断发展中的前所未有的突破，对λgt11文库进行免疫筛选的方法主要得到了分布在核心和非结构区上的线性表位，而有关外被蛋白区的分析还有待于在哺乳动物细胞中进行E1/E2区的克隆和表达。这一方法与很多其他病毒感染明显不同，其中所述外被蛋白区的表位在解释基因组结构很久以前就已经进行了作图。所述表位和相应的抗体通常具有中和活性，这种活性可用于疫苗开发和/或用于开发具有临床或预测价值的诊断测定方法(例如，乙型肝炎表面抗原的抗体)。由于目前还没有可以对丙型肝炎疾病进行临床诊断和预测的HCV疫苗或检测方法，用于免疫监督的病毒外被区的鉴定可能会明显导致对HCV诊断和预防的新的指导作用。
按照以前披露的方法(EP-A-0489968)，根据HC-J1序列(Okamoto等，1990)合成了若干二十聚体肽(表3)，这些肽各自有8个氨基酸相互重叠。除了肽env35(又被称为E1 35)之外，这些肽无一能够检测大约200个HCV患者血清中的抗体。只有两种血清与env35肽有微弱的反应。不过，通过例6所披露的抗E1 ELISA，可以发现以下额外的表位：对例6所述的抗E1 ELISA进行以下改进：在样品稀释剂中将50微克/毫升E1肽与1/20稀释过的人血清混合。图13表示在有单个的或E1肽混合物的情况下，人血清对重组E1(由vvHCV-40表达)蛋白的反应性结果。尽管在线性免疫测定方案中，通过涂在小片上的E1肽只能检测2％的血清，不过超过半数的抗E1抗体的血清可以在用重组E1蛋白测定时通过相同的肽竞争。在注射纯化的E1蛋白之后从Balb/C小鼠中获得的某些鼠单克隆抗体随后与E1竞争对所述单个肽的反应性(图14)。很明显，含有所述优势表位的env53的部分在添加env53时能够明显竞争如果种血清与E1的反应性，并且还检测到了env31区抗体。这一发现是惊人的，因为在将env53和env31肽直接涂在固相上时没有发现任何反应性。
因此，用申请人以前所披露的技术合成了有关肽(参见WO93/18054)。合成了以下肽：
肽env35A-生物素
NH2-SNSSEAADMIMHTPGCV-GK生物素(SEQ ID NO：51)
跨越HCV多蛋白的E1区的208-227号氨基酸
肽生物素-env53(“表位A”)
生物素-GG-ITGHRMAWDMMMNWSPTTAL-COOH(SEQ ID NO：52)
跨越HCV多蛋白的E1区的313-332号氨基酸
肽1bE1(“表位B”)
H2N-YEVRNVSGIYHVTNDCSNSSIVYEAADMIMHTPGCGK-生物素(SEQ IDNO：53)
跨越HCV多蛋白的E1区的192-228号氨基酸
并且与肽E1a-BB(生物素-GG-TPTVATRDGKLPATQLRRHIDLL，SEQ IDNO：54)和E1b-BB(生物素-GG-TPTLAARDASVPTTTIRRHVDLL，SEQ IDNO：55)的反应性进行比较，后者分别来自1a和1b基因型序列的相同部分，并且于1993年在Glasgow召开的第9届国际病毒学会议上公开(表位C)。并且将用表位A、B和C测试了一组HCV血清的反应性，并且将表位B与env35A进行比较(在47个HCV阳性血清中，有8个在表位B上是阳性的，而没有一个能与env35A起反应)。按照例6所披露的方法直接测定了结合在用链霉亲和素包衣的平板上的生物素化的肽(50微克/毫升)对表位A、B和C的反应性。很明显，表位A和B反应性最强，而表位C和env35A-生物素反应性要低得多。检测了监测过对完整E1蛋白的反应性的相同系列的患者(例7.1)对表位A、B和C的反应性。观察到了对表位C的很弱的反应性，而如图15、16、17和18所示，表位A和B能与大部分血清起反应。不过，针对反应性最强的表位(表位A)的抗体似乎不能预测疾病的缓解，而抗1bE1抗体(表位B)几乎只是在IFN治疗开始时存在于长期反应者体内。因此，抗1bE1(表位B)抗体和抗env35(表位A)抗体可以提供用于预测丙型肝炎疾病的有用的标志。Env53表位可用于检测交叉反应抗体(能在主要基因型之间交叉反应的抗体)，而Env53区的抗体对于在血清或肝脏组织中检测通用E1抗原来说是非常有用的。能识别Env53区的单克隆抗体能够与随机表位文库起反应。在用单克隆抗体5E1A10进行免疫筛选时能起反应的4个克隆中存在序列-GWD-。由于它与存在于所有HCV变体的env53区中的通用HCV序列类似，因此认为序列AWD含有env53交叉反应鼠表位的必需序列。Env31明显还含有一个可变区，该可变区可能含有一个存在于氨基末端序列-YQVRNSTGL-(SEQ ID NO：93)上的表位，并且可用于诊断。在表3中所示的Env31和E1-31是肽1bE1的一部分。肽E1-33和E1-51还能在某种程度上与鼠抗体起反应，而肽E1-55(含有可变区6(V6)；跨越329-336号氨基酸)也能与某些患者血清起反应。
抗E2抗体明显具有不同于抗E1抗体的模式，尤其是在对治疗具有长期反应的患者中。因此，很明显的是，抗外被抗体的减少不能向使用单个的抗E1或抗E2蛋白那样使用重组E1/E2蛋白进行有效测定。在同时测定两种类型抗体的测定中，抗E2反应能明显干扰抗E1反应。因此，证实了检测抗外被蛋白抗体对单个的E1和E2蛋白的能力。
7.4在24个抗E2MAB中只有三个能够竞争肽对重组E2的反应性。其中的两个与HVRI区反应(肽E2-67和E2-69，被称为表位A)，而一个能识别由肽E2-13B识别的表位(表位C)。大部分鼠抗体能识别构象抗E2表位(图19)。通常还能观察到人类对HVRI(表位A)的反应，以及较低程度的对HVRII(表位B)和第三种线性表位区(由肽E2-23、E2-25或E2-27竞争，并称为表位E)和第四种线性表位区(由肽E2-17B竞争，表位D)的反应，不过大部分血清与构象表位起反应(图20)。可以按照以下方法根据其相对位置对所述构象表位进行分类：通过蛋白A亲和层析纯化能识别构象表位的杂交瘤的15C8C1、12D11F1、9G3E6、8G10D1H9、10D3C4、4H6B2、17F2C2、5H6A7、15B7A2的上清液中的IgG抗体，在硼酸缓冲液中在有生物素的条件下将所得到的1毫克/毫升IgG生物素化。通过凝胶过滤层析将生物素化的抗体与游离的生物素分离。将合并的生物素化抗体级份稀释100-10000倍。在有100倍含量的非生物素化竞争抗体存在的条件下通过生物素化的IgG检测与固相结合的E2蛋白，然后再通过碱性磷酸酶标记的链霉亲和素检测。
在表6中给出了的竞争的百分比。根据以上结果，可以描绘出四种构象抗E2表位区(表位F、G、H和I)(图38)。另外，上述Mabs可以识别在本研究中所没有出现过的肽的突变型线性表位。Mabs4H6B2和10D3C4能竞争16A6E7的反应性，但是，与16A6E7不同，它们不能识别肽E2-13B。这种Mabs能够识别相同的线性表位(表位C)的变体，或者识别受到了空间位阻或在将16A6E7结合到E2-13B区上之后的构象表位(表位H)。
实施例8：E1糖基化变体
8.1前言
由哺乳动物细胞表达的，由vvHCV10A编码的E1蛋白，和由vvHCV41-44编码的E2蛋白分别含有6个和11个碳水化合物部分。这一结果可以通过将vvHCV10A感染过的或vvHCV44感染过的RK13细胞的裂解物与浓度出现降低的糖苷酶(PNGase F或内切糖苷酶H(Boehringer Mannheim Piochemica)，按照生产商的说明操作)一起培养，以便使裂解物中的蛋白(包括E1)被部分脱糖基化(分别如图39和40所示)。
缺乏某些糖基化位点的变体可以选择具有改善了的免疫学反应性的外被蛋白。以HIV为例，业已发现缺乏某些特定的糖添加基序的gp120蛋白特别适用于诊断或疫苗目的。通过在A/香港/3/68(H3N2)流感病毒的逃脱变体的血凝集素蛋白上添加新的寡聚糖侧链，可以抑制与中和单克隆抗体的反应性(Skehel等，1984)。当通过位点特异性诱变将新的糖基化位点导入所述流感血凝集素蛋白中时，会出现明显的抗原性改变，这表明所述糖类起着抗原性调节物的作用(Gallagher等，1988)。在另一个分析中，来自Friend鼠白血病病毒的表面蛋白gp70的8个碳水化合物添加基序缺失了。尽管7种这样的突变都不影响病毒的感染性，但是针对氨基末端的糖基化信号的第四个突变导致出现了非感染性表型(Kayman等，1991)。另外，本领域众所周知的是添加N-连接的糖链对于折叠中间物的稳定来说是重要的，并因此对于有效折叠、抑制错折叠和内质网降解、寡聚化、生物学活性、以及糖蛋白的转运来说也是重要的(有关综述参见Rose等，1988；Doms等，1993；Helenius，1994)。
在对HCV基因型的不同的外被蛋白基因序列进行的排比之后，可以了解到并不是HCV亚型1bE1蛋白上的所有6个糖基化位点都是正确折叠和反应性所必需的，因为在某些类型或亚型中缺少了某些糖基化位点。在1b、6a、7、8和9型中所存在的第4个糖基序(在Asn251上)在目前已知的所有其他类型中都缺乏。可以对这种糖添加基序进行诱变，以便产生具有改善了的反应性的1bE1蛋白类型。另外，2b型序列在V5区出现了一个额外的糖基化位点(在Asn299上)上。属于基因型2c的分离物I83甚至缺少V1区的第一个糖基序(在Asn上)，而该基序存在于所有其他的分离物上(Stuyver等，1994)。不过，即使是在完全保守的糖添加基序中，所述糖的存在可能并非是折叠所必需的，不过，它可能是避免免疫监督方面发生作用。因此，对正确折叠(以及反应性)来说并非必需的糖添加基序的确定不是明确的，并且必须分析每一种变体，并检测其反应性。糖基化基序的诱变(NXS或NXT序列)可以通过以下方式实现：诱变编码N、S或T的密码子，使这些密码子编码的氨基酸不同于它原来所编码的N，和/或使它所编码的氨基酸不同于它原来所编码的S或T。另外，可以将X位点诱变成P，因为已知NPS或NPT通常不会受到糖类的修饰。在确定哪一个糖添加基序是折叠和/或反应性所需要的，哪一个是不需要的之后，可以实施所述诱变的组合。
8.2E1蛋白的诱变
所有突变都是用克隆HCCI10A的E1序列(SEQ ID NO：5)进行的。第一轮PCR反应是用针对位于疫苗11K晚期启动子上游的GPT序列的有义引物‘GPT’(参见表7)，和含有需要的碱基变化的反义引物(被命名为GLY#，其中的#表示糖基化位点的编码，参见图41)进行的，以便获得所述诱变。设计了6种GLY#引物(各自对特定的糖基化位点有特异性)，以便：
将编码N-糖基化Asn的密码子(AAC或AAT)修饰成Gln密码子(CAA或CAG)。之所以选择谷氨酰胺，是因为它非常类似于天冬酰胺(这两种氨基酸都是中性的，并且含有非极性残基，谷氨酰胺具有较长的侧链(一个以上的-CH2-基团))。
在糖基化位点下游的若干密码子的一个上导入沉默突变，以便产生新的特殊的或罕见的(例如，E1Gly5的第二个SmaI位点)限制酶位点。在不改变氨基酸序列的前提下，这种突变可用于区分突变型序列和原始E1序列(pvHCV-10A)或与其他序列区分(图41)。这种额外的限制位点还可用于构建新的杂合(2倍、3倍等)糖基化变体。
在第一个错配的核苷酸的5’末端延长18个核苷酸，并向3’末端延长12-16个核苷酸。表7示出了与N-连接的糖基化位点的序列的重叠的六种GLY#引物的序列。
为了进行定向诱变，使用了‘错误启动’或‘重叠延伸’(Horton，1993)。这一概念如图42和43所示。首先，由靶基因扩增两种独立的片段，以便得到每一种突变位点。由5’末端获得的PCR产物(产物GLY#)是用5’有义GPT引物(参见表7)和相应的3’反义GLY#引物扩增的。第二个片段(产物OVR#)是用3’反义TKR引物和相应的5’有义引物(OVR#引物，参见表7，图43)扩增的。
所述OVR#引物针对部分GLY#引物序列。因此，这两组PCR产物拥有一个具有相同序列的重叠区。当混合上述中间产物(GLY-1和OVR-1，GLY-2和OVR-2等)，以较高的温度熔化并退火时，产物GLY#的上部有义链可以与产物OVR#的反义链退火(反之亦然)，使得这两股彼此起着对方的引物的作用(参见图42B)。在两轮PCR中通过Taq聚合酶延伸退火的重叠部分，产生了完整长度的突变型分子E1Gly#，该分子具有能破坏#号糖基化位点的突变。通过常见的两种内部嵌套引物在第三轮PCR中制备了用于克隆的足够量的E1GLY#产物。这两种新的引物分别与疫苗11K启动子的3’末端(有义GPT-2引物)和疫苗胸苷激酶基因座的5’末端(反义TKR-2引物，参见表7)重叠。所有PCR条件是按照在Stuyver等(1993)所披露的条件下进行的。
通过EcoRI/BamHI裂解将上述每一种PCR产物克隆到EcoRI/BamHI裂解过的含有原始E1序列的疫苗载体上(pvHCV10-A)。通过EcoRI/BamHI裂解分析特所选择克隆的插入片段的长度，以及每一种新的限制位点的存在。通过双链测序证实重叠的突变位点的序列。
8.3分析E1糖基化变体
以例8.2中所披露的含有突变型E1序列的6种质粒为起点，通过与例2.5中所披露的野生型痘苗病毒重组制备了重组型痘苗病毒。简单地讲，用6种具有突变型E1序列的重组痘苗病毒、vvHCV-10A(具有非突变型E1序列)和野生型痘苗病毒感染175平方厘米的亚铺满的RK13细胞的烧瓶。在感染之后24小时裂解细胞，并按照例4所述方法在Western印迹上进行分析(参见图44A)。所有突变体在SDS-PAGE上都表现出比原始E1蛋白更快的迁移率(相当于大约为2-3kDa的较小的分子量)；证实增加了一个糖基部分。还通过PCR和限制酶分析分析了重组病毒，以便证实不同突变体的身份。图44B表示所有突变体(如图41所示)都含有预期的额外限制位点。将另一部分细胞裂解物通过ELISA检测不同突变体的反应性。将所述裂解物稀释20倍，并添加到按照例6所述方法用凝集素GNA包衣的微孔平板上。让被捕获(突变型)糖蛋白与稀释20倍的在例6中所披露的24个HCV感染患者的血清起反应。在表8中示出了6个突变体和E1的信噪比(S/N)值(GLY#的OD/野生型的OD)。该表还示出了GLY#的S/N值与E1蛋白的比例。应当理解的是，将不同突变体的细胞裂解物用于比较同患者血清的反应性的方法，可能会导致出现的结果是由于不同的表达水平所致，而不是由于反应水平所致。所述困难可以通过按例5所述方法纯化不同的突变体而得到克隆，并通过检测所有不同E1蛋白的相同的量而克服。不过，表5所示的结果已经表明，去掉第一个(GLY1)、第三个(GLY3)和第六个(GLY6)糖基化基序，能减弱某些血清的反应性，而去掉第二个和第五个位点则不能。去掉GLY4似乎能提高某些血清的反应性。以上结果表明，不同的患者对本发明糖基化突变体的反应不同。因此，所述突变型E1蛋白可用于HCV疾病的诊断(筛选、证实、预测等)和预防。
实施例9：在糖基化缺陷型酵母中表达HCV E2蛋白
为相当于克隆HCCL41的E2序列提供α交配因子前/原信号序列，将其插入酵母表达载体上，并且用该构建体转化酿酒酵母细胞，将E2蛋白分泌到生长培养基中。业已发现，在酿酒酵母菌株中表达所述构建体时，大多数糖基化位点被高甘露糖型糖基化所修饰(图45)。这会导致过高的不均匀性，并且抑制其反应性，这是疫苗或诊断用途所不需要的。为了克服这一问题，通过筛选钒酸盐抗性克隆的方法制备了具有修饰过的糖基化途径的酿酒酵母突变体。通过分析糖蛋白转化酶的分子量和不均匀性，分析了所述克隆的修饰过的糖基化途径。这使得我们能够鉴定不同的糖基化缺陷型酿酒酵母突变体。然后在某些特定的突变体中表达E2蛋白，并在例4所述的Western印迹上让这种蛋白与例7所述的单克隆抗体起反应(图46)。
实施例10：一般用途
本发明的结果表明，为了获得HCV外被蛋白与人类患者血清的高的反应性，不仅需要好的表达系统，而且还需要好的纯化方法。这一目的可以通过使用本发明的合适的HCV外被蛋白表达系统和/或纯化方法而实现，所述表达系统能确保保持所述蛋白的天然折叠，而本发明的纯化方法能确保消除污染性蛋白，并保留其构象，并因此保留了HCV外被蛋白的反应性。用于诊断性筛选测定的纯化HCV外被蛋白的量为每年数克。对于疫苗用途来说，可能需要更大量的外被蛋白。因此，所述痘苗病毒系统可用于筛选最佳的表达构建体，并用于有限的扩大和大规模表达并纯化含有高甘露糖糖类的单个的或特异性寡聚外被蛋白。在用若干酵母菌株表达时可以实现这一目的。例如，对于乙型肝炎来说，用哺乳动物细胞生产H BsAg的成本比用酵母产生的乙型肝炎疫苗生产成本高。
本发明所披露的纯化方法总体上还可用于‘病毒外被蛋白’。这些病毒的例子来自黄病毒、新发现的GB-A、GB-B和GB-C肝炎病毒、瘟病病毒(如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪霍乱病毒(HCV)、边界病病毒(BDV))，不过，还在较低的程度上涉及到诸如乙型肝炎病毒的病毒(主要是用于纯化H BsAg)。
本发明的外被蛋白纯化方法，可用于在详细说明部分所列举的低等或高等真核细胞或原核细胞中细胞内和细胞外表达的蛋白。
实施例11：证实预防和治疗作用
通过接种E1可以减轻慢性感染HCV的黑猩猩的肝脏疾病。不过，为了获得明显的免疫反应，需要多次接种。普通技术人员可以理解的是，通过免疫调节可以产生病毒的抗性，这种抗性是由病毒本身产生或者是由宿主产生的。为了分析在HCV上是否存在这种免疫调节，比较了在初次感染的黑猩猩和慢性感染的黑猩猩中对E1和NS3的免疫反应。由于预计在慢性感染的动物体内会出现较弱的反应，选择这一组动物进行更严格的免疫接种方案，包括以下步骤：采用在小鼠上证实更有效的佐剂诱导细胞反应(表9)，与明矾进行比较。这种佐剂是用于初次感染的动物的佐剂；而用于慢性感染动物的免疫接种方案包括12次免疫接种，与之对应的是初次感染的动物有6次免疫接种(图47)。
尽管由于免疫接种的动物数量无法进行统计学分析，不过在人体液反应中可以检测到以下明显的倾向(表10)：在初次感染的动物的血清转化的接种次数较少；而在初次感染的动物中的免疫反应的幅度明显较大，有2/3的感染过的动物没有达到10个内部单位的水平，即使是在免疫接种12次之后也是如此。
在3次免疫接种之后进行的细胞反应分析发现了更大的差别(图48a-d)，包括以下差别：在慢性感染的动物体内几乎缺乏E1-特异性T细胞增殖，而在初次感染的动物组中可以观察到明显的刺激作用；IL-2测定证实了在慢性携带者的T细胞区室中的较低的刺激作用；并且在初次感染的动物中诱导了明显的Th2(IL-4)反应，与含有明矾佐剂的疫苗预期的结果一样。
这证实了，至少E1免疫接种能在初次感染的动物中提供预防性作用，并且表明E2和/或E1和E1和E2蛋白和肽的组合可以在初次感染的动物中提供有用的治疗和/预防效果。
正如以下结果所证实的，通过多次免疫接种只能部分克服对诱导针对HCV E1抗原的细胞和体液应答的‘损害’：在每一次注射之后观察到了抗体效价的提高，但是在2/3的动物中没有达到初次感染的动物的水平；并且T细胞增殖反应依然非常(图49)。不过ELISPOT结果证实了IL-2略有增加(未发表)，IFN-g没有变化(未发表)，并且IL-4增加(图49)，这表明，Th2型应答更容易诱导。与在初次感染的动物中经过3次免疫之后所达到的水平相比，发现IL-4仍然处于低水平上。
对NS3免疫接种进行了十分相似的观察，其中，在慢性黑猩猩上使用了更强的佐剂(RIBI)。与明矾制剂相比，在初次感染的动物上发现了以下现象：在两组中诱导的抗体效价相当(未发表)；与在初次感染的动物中的应答相比，在慢性动物中细胞分泌和T细胞增殖几乎缺乏(图49a-b)。
目前已经有某些证据表明，在慢性携带者中对HCV的免疫应答较低，或者至少不足于消除感染。上述结果支持了这样的假说，即HCV慢性携带者的免疫系统可能受到了损害，并且它对HCV抗原的应答不如在初次感染的动物中有效。
在Wiedmann等所做的研究中(Hepatology2000；31：230-234)的研究中，在HCV慢性携带者上，对HBV的免疫效果较差，这表明这种免疫损伤不局限于HCV抗原。DeMaria等(Hepatology2000；32：444-445)证实了以上结果，并且提供了适合HCV患者的改进的疫苗用药方案。本文所提供的数据表明，增加免疫接种的次数，确实可以增强体液的应答，但是，细胞(特别是Th1细胞)应答是难以诱导的，即使在使用有效的佐剂时也是如此。在抗病毒治疗的时候开始免疫接种是有利的，此时免疫系统更容易作出应答。
表1：重组痘苗质粒和病毒
  质粒名称     名称     cDNA亚克隆构建     长度(nt/aa)   用于插入的载体
  pvHCV-13A     E1s     EcoRI-HindIII     472/157   pgptATA-18
  pvHCV-12A     E1s     EcoRI-HindIII     472/158   pgptATA-18
  pvHCV-9A     E1     EcoRI-HindIII     631/211   pgptATA-18
  pvHCV-11A     E1s     EcoRI-HindIII     625/207   pgptATA-18
  pvHCV-17A     E1s     EcoRI-HindIII     625/208   pgptATA-18
  pvHCV-10A     E1     EcoRI-HindIII     783/262   pgptATA-18
  pvHCV-18A     COREs     AccI(KI)-EcoRI(KI)     403/130   pgptATA-18
  pvHCV-34     CORE     AccI(KI)-FspI     595/197   pgptATA-18
  pvHCV-33     CORE-E1     AccI(KI)     1150/380   pgptATA-18
  pvHCV-35     CORE-E1b.his     EcoRI-BamHI(KI)     1032/352   pMS-66
  pvHCV-36     CORE-E1n.his     EcoRI-NcoI(KI)     1106/376   pMS-66
  pvHCV-37     E1Δ     XmaI-BamHI     711/239   pvHCV-10A
  pvHCV-38     E1Δs     EcoRI-BstEII     553/183   pvHCV-11A
  pvHCV-39     E1Δb     EcoRI-BamHI     960/313   pgsATA-18
  pvHCV-40     E1Δb.his     EcoRI-BamHI(KI)     960/323   pMS-66
  pvHCV-41     E2bs     BamHI(KI)-AlwNI(T4)     1005/331   pgsATA-18
  pvHCV-42     E2bs.his     BamHI(KI)-AlwNI(T4)     1005/341   pMS-66
  pvHCV-43     E2ns     NcoI(KI)-AlwNI(T4)     932/314   pgsATA-18
  pvHCV-44     E2ns.his     NcoI(KI)-AlwNI(T4)     932/321   pMS-66
  pvHCV-62     E1s(type 3a)     EcoRI-HindIII     625/207   pgsATA-18
  pvHCV-63     E1s(type 5)     EcoRI-HindIII     625/207   pgsATA-18
  pvHCV-64     E2     BamHI-HindIII     1410/463   pgsATA-18
  pvHCV-65     E1-E2     BamHI-HindIII     2072/691   pvHCV-10A
  pvHCV-66     CORE-E1-E2     BamHI-HindIII     2427/809   pvHCV-33
nt：核苷酸aa：氨基酸K1：Klenow DNA Pol填充T4：T4 DNA Pol填充位置：HCV多蛋白序列上的氨基酸位置
表1(续)：重组痘苗质粒和病毒
  质粒名称                    HCV cDNA亚克隆  用于插入的载体
    名称     构建   长度(nt/aa)
  pvHCV-81     E1*-GLY1     EcoRI-BamHI   783/262  pvHCV-10A
  pvHCV-82     E1*-GLY2     EcoRI-BamHI   783/262  pvHCV-10A
  pvHCV-83     E1*-GLY3     EcoRI-BamHI   783/262  pvHCV-10A
  pvHCV-84     E1*-GLY4     EcoRI-BamHI   783/262  pvHCV-10A
  pvHCV-85     E1*-GLY5     EcoRI-BamHI   783/262  pvHCV-10A
  pvHCV-86     E1*-GLY6     EcoRI-BamHI   783/262  pvHCV-10A
nt：核苷酸aa：氨基酸K1：Klenow DNA Pol填充T4：T4 DNA Pol填充位置：HCV多蛋白序列上的氨基酸位置
                            表2：抗E1测定总结
                           S/N±SD(平均抗E1效价)
治疗开始 治疗结束 随访
LTR 6.94±2.29(1:3946) 4.48±2.69(1:568) 2.99±2.69(1:175)
NR 5.77±3.77(1:1607) 5.29±3.99(1:1060) 6.08±3.73(1:1978)
LTR：1年以上的长期、持续的反应
NR：无反应、反应延迟或部分反应
表3
用于竞争研究的合成肽
蛋白     肽        氨基酸序列                  位置       SEQ ID NO
E1       E1-31     LLSGLTVPASAYQVRNSTGL        181-200    56
         E1-33     QVRNSTGLYHVTNDCPNSSI        193-212    57
         E1-35     NDCPNSSIVYEAHDAILHTP        205-224    58
         E1-35A    SNSSIVYEAADMIMHTPGCV        208-227    59
         E1-37     HDAILHTPGCVPCVREGNVS        217-236    60
         E1-39     CVREGNVSRCWVAMTPTVAT        229-248    61
         E1-41     AMTPTVATRDGKLPATQLRR        241-260    62
         E1-43     LPATQLRRHIDLLVGSATLC        253-272    63
         E1-45     LVGSATLCSALYVGDLCGSV        265-284    64
         E1-49     QLFTFSPRRHWTTQGCNCSI        289-308    65
         E1-51     TQGCNCSIYPGHITGHRMAW        301-320    66
         E1-53     ITGHRMAWDMMMNWSPTAAL        313-332    67
         E1-55     NWSPTAALVMAQLLRIPQAI        325-344    68
         E1-57     LLRIPQAILDMIAGAHWGVL        337-356    69
         E1-59     AGAHWGVLAGIAYFSMVGNM        349-368    70
         E1-63     VVLLLFAGVDAETIVSGGQA        373-392    71
E2       E2-67     SGLVSLFTPGAKQNIQLINT        397-416    72
         E2-69     QNIQLINTNGSWHINSTALN        409-428    73
         E2-$3B    LNGNESLNTGWWLAGLIYQHK       427-446    74
         E2-$1B    AGLIYQHKFNSSGCPERLAS        439-458    75
         E2-1B     GCPERLASCRPLTDFDQGWG        451-470    76
         E2-3B     TDFDQGWGPISYANGSGPDQ        463-482    77
         E2-5B     ANGSGPDQRPYCWHYPPKPC        475-494    78
         E2-7B     WHYPPKPCGIVPAKSVCGPV        487-506    79
         E2-9B     AKSVCGPVYCFTPSPVVVGT        499-518    80
         E2-11B    PSPVVVGTTDRSGAPTYSWG        511-530    81
         E2-13B    GAPTYSWGENDTDVFVLNNT        523-542    82
         E2-17B    GNWFGCTWMNSTGFTKVCGA        547-566    83
         E2-19B    GFTKVCGAPPVCIGGAGNNT        559-578    84
         E2-21     IGGAGNNTLHCPTDCFRKHP        571-590    85
         E2-23     TDCFRKHPDATYSRCGSGPW        583-602    86
         E2-25     SRCGSGPWITPRCLVDYPYR        595-614    87
         E2-27     CLVDYPYRLWHYPCTINYTI        607-626    88
         E2-29     PCTINYTIFKIRMYVGGVEH        619-638    89
         E2-31     MYVGGVEHRLEAACNWTPGE        631-650    90
         E2-33     ACNWTPGERGDLEDRDRSEL        643-662    91
         E2-35     EDRDRSELSPLLLTTTQWQV        655-674    92
表4：外被抗体含量随时间的变化(完整的研究，28位患者)
Figure A0280060900731
                                   全部         Ib型  3a型    全部        Ib型 3a型  全部    全部
Figure A0280060900733
′数值是与治疗开始时获得的值相比较
″P值＜0.05
表5.LTR和NR的差异(完整的研究)
Mann-Wilhnay            E1Ab S/N    E1Ab效价    E1Ab S/N    E1Ab S/N    E2Ab S/N
U检验(P值)              全部        全部        1b型  3a型  全部
治疗开始                0.0257*    0.05*      0.68        0.1078
治疗结束                0.1742                              0.1295
6个月随访               1           0.8099      0.425       0.3081
12个月随访              0.67        0.23        0.4386      0.6629
*P值＜0.05
表6.鼠E2单克隆抗体之间的竞争实验
        生物素化的抗E2 mabs的抗E2反应性的降低(％)
竞争剂      17H10F4D10    2F10H10 16A6E7  10D3C4  4H6B2  17C2F2  9G3E8  12D11F1 15C8C1  8G10D1H9
17H10F4D10  -             62      10      ND      11     ND      5      6       30      ND
2F10H10     90            -       1       ND      30     ND      0      4       12      ND
16A6E7      ND            ND      -       ND      ND     ND      ND     ND      ND      ND
10D3C4      11            60      92      -       94     26      28     43      53      30
4H6B2       ND            ND      82      ND      -      ND      ND     ND      ND      ND
17C2F2      2             ND      75      ND      56     -       11     10      0       0
9G3E6       ND            ND      68      ND      11     ND      -      60      76      ND
12D11F1     ND            ND      26      ND      13     ND      ND     -       88      ND
15C8C1      ND            ND      18      ND      10     ND      ND     ND      -       ND
8G10D1H9    2             2       11      ND      15     ND      67     082     81      -
竞争剂对照
15B7A2      0             0       9       15      10     9       0      0       0       5
5H6A7       0             2       0       12      8      0       0      4       0       0
23C12H9     ND            ND      2       12      ND     4       ND     ND      ND      2
ND＝未测定
表7.引物
SEQ ID NO.96  GPT      5′-GTTTAACCACTGCATGATG-3′
SEQ ID NO.97  TKR     5′-GTCCCATCGAGTGCGGCTAC-3′
SEQ ID NO.98  GLY1     5′-CGTGACATGGTACAT TCCGGACACTTGGCGCACTTCATAAGCGGA-3′
SEQ ID NO.99  GLY2     5′-TGCCTCATACACAATG GAGCTCTGGGACGAGTCGTTCGTGAC-3′
SEQ ID NO.100 GLY3     5′-TACCCAGCAGCGG GAGCTCTGTTGCTCCCGAACGCAGGGCAC-3′
SEQ ID NO.101 GLY4     5′-TGTCGTGGTGGGGACGG AGGCCTGCCTAGCTGCGAGCGTGGG-3′
SEQ ID NO.102 GLY5     5′-CGTTATGTGG CCCGGGTAGATTGAGCACTGGCAGTCCTGCACCGTCTC-3′
SEQ ID NO.103 GLY6     5′-CAGGGCCGTTGT AGGCCTCCACTGCATCATCATATCCCAAGC-3′
SEQ ID NO.104 OVR1     5′- CCGGAATGTACCATGTCACGAACGAC-3′
SEQ ID NO.105 OVR2     5′- GCTCCATTGTGTATGAGGCAGCGG-3′
SEQ ID NO.106 OVR3     5′- GAGCTCCCGCTGCTGGGTAGCGC-3′
SEQ ID NO.107 OVR4     5′- CCTCCGTCCCCACCACGACAATACG-3′
SEQ ID NO.108 OVR5     5′-CTACCCGGGCCACATAACGGGTCACCG-3′
SEQ ID NO.109 OVR6     5′-GG AGGCCTACAACGGCCCTGGTGG-3′
SEQ ID NO.110 GPT-2    5′-TTCTATCGATTAAATAGAATTC-3′
SEQ ID NO.111 TKn-2    5′-GCCATACGCTCACAGCCGATCCC-3′
加下划线的核苷酸表示额外的限制位点
用粗体字表示的核苷酸表示相对于原始HCCI10A序列的突变
表8.通过ELISA分析E1糖基化变体
         血清
                1        2        3           4         5        6          7        8          9        10        11        12
SN GLY1  1.802482  2.120971  1.403871  1.205697  2.120191  2.866913  1.950345  1.866183  1.730193  2.466162  1.220654  1.629403
SN GLY2  2.400795   1.76818  2.326495  2.639308  2.459019  6.043993  2.146302  1.595477  1.688973  2.482212  1.467582  2.070524
SN GLY3  1.642718  1.715477  2.281848  2.364748  1.691818  4.833742   1.98892  1.482099  1.602222  2.191658  1.464210  1.721164
SN GLY4  2.570154  3.824038  3.874605  1.499387      3.15  4.71302   4.198751  3.959542  3.710507  5.170841  4.250784  3.955153
SN GLY5  2.462051  1.793761  2.409344  2.627368  1.716311  4.964785   2.13912  1.578330  1.708937  3.021807  1.562002   2.07278
SN GLY6  2.031487  1.495737  2.131613  2.627925  2.494833  4.704027   2.02069  1.496480  1.704978  2.677757  1.529808  1.744221
SN E1    2.828205  2.227036  2.512792  2.790861  3.131679  4.869128  2.287753  1.954198  1.805558  2.616822   1.55719  2.593886
                                                                                                                                总计      平均
               13        14        15        16        17        18       19         20        21        22        23        24  S/N       S/N
SN GLY1  6.886581  3.233804  3.783496  1.985105  2.317721  6.675179   1.93470   2.47171  4.378633  1.188748  2.168800  1.706992  69.88534  2.495223
SN GLY2  7.556882  2.587613  3.621928  3.055849  2.933792   7.65433  2.127712  2.921288  4.680101  1.150781  1.661914  1.632785  69.65243  2.902185
SN GLY3  7.930538  2.783055  3.016099  2.045828  2.515305  5.778357  1.980185  2.657384  4.268833   0.97707  1.336776   1.20378  82.09872  2.507447
SN GLY4  8.176818  8.581122  6.707668  5.684498  5.004813    8.4125  3.813321  3.002535  4.293038  2.393011   3.68713  2.481585  102.6978  4.279076
SN GLY5  8.883408  2.940334  3.125501  3.330912  2.654224  5.424107  2.442804  3.126761   4.64657  1.153658  1.817901  1.638211  69.26511  2.886046
SN GLY6  8.005581  2.499952  2.621704  2.672385  2.363301  8.194107  1.600716  2.885433  2.781003  1.200743  1.475062  1.715423  61.32181  2.555076
SN E1    8.825112  3.183771  3.067265  3.280335  2.980354  7.191964  2.771218  3.878066   6.35443  1.167286  2.083333   1.70252  76.64068  3.189195
         血清
                1         2         3        4          5         6        7          8         9       10         11        12
GLY1/E1  0.637316  0.952374   0.65869  0.431977  0.677036  0.688794  0.852516  0.954901  0.958261   0.94319  0.783882  0.628171
GLY2/E1  0.848878  0.793901  0.925463   0.94569  0.785233  1.035913   0.93617  0.816436  0.935431   0.94656  0.942455  0.798232
GLY3/E1  0.680834  0.770296  0.900053   0.84373  0.508312  0.992733  0.859761  0.758418  0.887385  0.837488  0.940294  0.683547
GLY4/E1  0.941587  1.717097  1.641952  0.537245  1.005882  0.967939  1.835317  2.028172   2.06505     1.976   2.72978  1.524798
GLY6/E1  0.877607  0.805447  0.958831  0.941408  0.647748  1.019642  0.935031  0.806641  0.948488  1.154762  1.003148  0.799102
GLY6/E1  0.718296  0.671825  0.848305   0.90578  0.798669  0.982522  0.883284  0.785781  0.944294  1.023288  0.982288  0.672435
                                                                         总计  平均
             13         14        15        16        17       18         19        20        21        22        23        24  E1/GLY#   E1/GLY#
GLY1/E1  0.644248  1.015852  1.226988  0.605153  0.777666  0.928144  0.898182  0.672013  0.817759  1.018386  1.036267  0.957628  19.36524  0.806885
GLY2/E1   0.86827  0.808489  1.180833  0.931505  0.984377  1.064289   0.78779  0.794245  0.874061   0.98586  0.797719  0.916998  21.67384  0.903077
GLY3/E1  0.898633  0.867856  0.903319  0.897968  0.843962  0.803029  0.714554  0.695308  0.797215  0.837558  0.841052  0.675314  19.19921  0.799967
GLY4/E1   0.92654  2.080802  1.860833  1.732902  1.880587   0.09102  1.376045  0.810335  0.801773  2.050064  1.787422  1.392178  36.38692  1.51608
GLY5/E1  1.006606  0.923538  1.019006  1.017857  0.690574   0.75419  0.861491  0.850109  0.067512  0.988323  0.872593  0.919042  21.70879  0.907783
GLY6/E1  0.907134  0.786217  0.654737  0.784184   0.79296   0.72221  0.543702  0.724683  0.519396  1.097197   0.70803  0.962919  19.59691  0.616538
表9.Balb/c小鼠体内有佐剂的E1的特征
    明矾   T细胞佐剂   RBI
抗体效价(平均值±SD，n＝6)     96000±101000   62000±60000   176000±149000
抗体同种型     IgG1   IgG1/2b   IgG1/2a
脾脏中的T细胞殖1(n＝3)     11750(2/3)   48300(3/3)   26000(3/3)
淋巴节中的T细胞增殖2     无特异性刺激   4000   8000
细胞因子特征(脾)     II-4   IFN-g/II-4   IFN-g/II-4
1在经过3次皮下/肌肉免疫接种之后，分别对3只随机挑选的小鼠进行分析，结果以用E1刺激(1μg/ml)4天之后获得的平均比cpm形式表示，括号中的数字表示具有上述特殊刺激背景的小鼠数量
2在经过1次足底免疫接种之后(n＝2)，结果以用E1刺激(1μg/ml)5天之后获得的平均比cpm形式表示。
表10.体液应答：不同E1抗体水平需要的免疫接种次数
    动物     状态     血清转变1     ＞1U/ml2     ＞10U/ml
    Marcel     慢性     3     4     5
    Peggy     慢性     3     5     ＞12
    Femma     慢性     4     5     ＞12
    Yoran     初次感染     3     4     5
    Marti     初次感染     2     3     5
1如果在免疫接种之前不存在E1抗体，将ELISA信号确定为高于截止水平，在其它病例中，高于免疫接种之前效价的3个独立的时间点的结果被视为血清转变点。
2单位确定如下：在干扰素治疗之前和用1b基因型感染后，在人慢性载体中的E1抗体含量对50％的患者来说为＜0.1U/ml，对25％的患者来说为0.1-1U/ml，其余25％的患者＞1U/ml，n＝58。
实施例12：对受到HCV1b亚型慢性感染的黑猩猩进行免疫接种
用E1(192-326号氨基酸)接种在13年以前(在免疫接种之前5015天)就已经感染了HCV1b亚型菌株的黑猩猩(Phil)，所述E1来自不同的1b基因型菌株，在氨基酸水平上具有95.1％的相同性(还可参见WO99/67285的表2，该文献被全文收作本文的参考)，并且是按照WO99/97285中的例1-3所披露的方法制备的)。按照生产商的方法(Ribi公司，Hamilton，MT)对黑猩猩一共进行了6次肌内免疫接种，每次50微克E1，所述E1溶解在PBS/0.05％CHAPS，与RIBI R-730(MPLA+TDM+CWS)混合。以上6次免疫接种是用两个系列每个系列3次接种的方式进行的，每个系列中的每次接种之间间隔3周时间，而2个系列之间间隔6周时间。从免疫接种之前150天开始，在免疫接种期间一直到免疫接种后1年(参见下文和WO99/67285)对所述黑猩猩进行连续监测，监测表示HCV诱导的疾病的活性的各种参数。所述参数包括血液化学、ALT、AST、γGT、血液化学、血清中的病毒负荷，肝脏和肝组织中的病毒负荷。另外，在体液和细胞水平监测对所述接种的免疫应答。在此期间，还要监测所述接种的任何负面影响，如行为的变化、临床症状、体重、体温和局部反应(发红、肿胀、硬结)，不对这些效果进行检测。
很明显，一旦抗E1的抗体水平达到最大值ALT(特别是γGT，数据未发表)含量就会降低(参见WO99/67285的图8)。一旦所述抗体含量开始下降，ALT就能相当快地反弹，但是，只要仍然可以检测到抗E1，γGT就保持在较低的水平上。
在可检测到抗E1的时间内，肝脏内的E2抗原降低到几乎检测不到的水平，而E2抗原在所述抗体消失之后很快就反弹。随着肝脏中所述核心和E2抗原变得无法检测，肝脏的炎症也明显减弱(还可参见WO99/67285的表3)。这是疫苗诱导肝脏损伤减轻的一个主要证据，有可能是通过清除，至少是部分清除其主要靶器官肝脏中的病毒抗原所致。
在整个研究期间，通过Amplico HCV监测仪(Roche，Basel，瑞士)测定在血清中的病毒血症水平大体上保持不变。
对体液应答所作的更详细的分析发现，最大终点效价达到了14.5×103(在第6次免疫接种之后)，并且该效价在免疫接种之后1年内降低到无法检测的水平(WO99/67285的图8)。WO99/67285的图9表明，由B细胞识别的可以由肽模拟的主要表位位于E2 N-末端区(肽V1V2和V2V3，有关所使用的肽的细节参见WO99/67285的表4)。由于针对重组E1的反应性强而且持续时间长，由该附图可以推测由该表位所识别的抗体仅仅代表抗E1的所有抗体群体的一部分。其余部分是针对不能由肽模拟的表位的，即不连续的表位。所述表位仅仅出现在完整的E1分子上或者甚至只能出现在颗粒样结构上。所述对E1的免疫应答是独特的，至少与在人类慢性HCV携带者(授予Maertens的WO96/13590)和黑猩猩(van Doorn等，1996)上正常出现的情况相比是独特的，它能在它的初次感染过程中产生抗E1抗体。在上述患者中，抗E1也是部分针对不连续表位的，不过，大部分是针对C4表位的(占患者血清的±50％)，小部分是针对V1V2(根据基因型在2％-70％之间波动)，而针对V2V3的反应性只能偶然记录到(Maertens等，1997)。
分析T细胞反应性发现，免疫系统的该区室还是由所述疫苗以特殊方式刺激的，由于所述T细胞的刺激指数从1提高到2.5，并且在随后的时间内依然会有某些提高(WO99/67285的图10)。这种T细胞反应性只能出现在对干扰素治疗的长期反应者体内(参见授予Leroux-Roels等的PCT/EP94/03555；Leroux-Roels等，1996)。
实施例13：用不同的亚型免疫接种慢性HCV携带者
用HCV1b基因型的E1接种来自1a基因型的HCV在10年以前就已经感染了来自1a基因型的HCV(在免疫接种之前3809天)亚型菌株的黑猩猩(Ton)，在氨基酸水平上具有79.3％的相同性(还可参见WO99/67285的表2，该文献被全文收作本文的参考)，并且是按照前面实施例中的方法制备的)。按照生产商的方法(Ribi公司，Hamilton，MT)对黑猩猩一共进行了6次肌内免疫接种，每次50微克E1，所述E1溶解在PBS/0.05％CHAPS，与RIBI R-730(MPLA+TDM+CWS)混合。以上6次免疫接种是用两个系列每个系列3次接种的方式进行的，每个系列中的每次接种之间间隔3周时间，而2个系列之间间隔4周时间。从免疫接种之前250天开始，在免疫接种期间一直到免疫接种后9个月(参见下文和WO99/67285)对所述黑猩猩进行连续监测，监测表示HCV诱导的疾病的活性的各种参数。所述参数包括血液化学、ALT、AST、γGT、血清中的病毒负荷，肝脏和肝组织中的病毒负荷。另外，在体液和细胞水平监测对所述接种的免疫应答。在此期间，还要监测所述免疫接种对动物产生的任何负面影响，如行为的变化、临床症状、体重、体温和局部反应(发红、肿胀、硬结)，不对这些效果进行检测。
很明显，一旦抗E1的抗体含量达到最大值ALT(特别是γGT含量，数据未发表)含量就会降低(参见WO99/67285的图11)。一旦所述抗体含量开始下降，ALT和γGT就会反弹，不过在整个随访观察期间ALT和γGT都保持在较低的水平上。与免疫之前的含量时间相比(85±11U/L)，在免疫接种之后ALT的含量甚至会显著降低(62±6U/L)。由于在血清中回收到的组织损伤的标记物较少，以上发现是免疫诱导的肝脏疾病改善的第一证据。
在抗E1保持在高于1.0×103的效价期间，E2抗原水平变得无法检测，不过，在较低的E1抗体水平又再次变得可以检测。随着HCV抗原的消失，肝脏的炎症也会从中度慢性活性肝炎向较弱形式的慢性持续性肝炎显著降低(WO99/67285的表3)。这是所述疫苗能诱导肝脏损伤减轻的另一个主要证据，有可能是通过清除，至少是部分清除其主要靶器官肝脏中的病毒所致。
在整个研究期间，通过Amplico HCV监测仪(Roche，Basel，瑞士)测定在血清中的病毒血症水平大体上保持不变。对体液应答所作的更详细的分析发现，所达到的最大终点效价为30×103(第六次免疫接种之后)。并且该效价在免疫接种之后9个月降低到0.5×103(WO99/67285的图11)。WO99/67285的图12表明由B细胞识别的可以由肽模拟的主要表位，该表位位于N-末端区(肽V1V2和V2V3，有关所使用的肽的细节参见WO99/67285的表4)。由于针对重组E1的反应性强而且持续时间长，根据该附图可以推测由该表位所识别的抗体仅仅代表抗E1的所有抗体群体的一部分。其余部分很有可能是针对不能由肽模拟的表位的，即不连续的表位。所述表位有可能仅仅出现在完整的E1分子上或者甚至只能出现在颗粒样结构上。所述对E1的免疫应答是独特的，至少与具有可检测的E1的人类慢性HCV携带者上正常出现的免疫应答相比比是独特的。在上述患者中，抗E1还是部分不连续的，大部分是针对C4表位的(占患者血清的50％)，小部分是针对V1V2(根据基因型在2％-70％之间波动)，而只能偶然记录到针对V2V3的反应性(Maertens等，1997)。由于该黑猩猩是用1a分离物感染的，还要评估所述抗体反应对E1-1a抗原的交叉反应性。从WO99/67285的图13中可以看出，确实产生了所述交叉反应抗体，不过，这种抗体只占整个抗体群体的一部分。引人注目的是，在肝脏中病毒抗原的重新出现和血清中可检测的抗1aE1抗体的消失之间的相关性。
分析T细胞反应性还发现，免疫系统的该区室也是由所述疫苗以特殊方式刺激的，由于所述T细胞的刺激指数从1提高到2.5，并且在随后的随访观察时间内保持在较高的水平上(WO99/67285的图14)。
实施例14：用E1再加强HCV慢性携带者
由于在例12和13中观察到的E1抗体效价是不稳定的，并且随着时间推移而降低，对于1b感染的黑猩猩来说甚至会降低到无法检测的水平，对有关这种抗体应答是否能通过额外的加强免疫再次增强的问题进行了研究。以3周的间隔时间对这两种黑猩猩再进行3次连续的免疫接种(与RIBI佐剂混合的50微克E1)。从WO99/67285的图8和11中可以看出，一旦肝脏中的病毒抗原再次降低到低于检测极限的水平，就可以群鼠加强抗E1应答。不过，在Ton的黑猩猩的血清中病毒负荷保持稳定(WO99/67285的图11)。在随访观察期间，第一次测出了低于每毫升105基因组当量的病毒血症水平。
值得注意的是以下发现，正如与第一个系列的免疫接种情形相同，与用1a亚型HCV菌株感染的黑猩猩(Phil)相比用1b亚型HCV菌株感染的黑猩猩(Phil)以较低的抗E1效价作出应答。第一轮最大效价为14.5×103对Ton黑猩猩的30×103，在额外加强免疫之后，Phil的效价仅为1.2×103，而Ton黑猩猩的效价为40×103)。尽管对这两种动物的有利影响似乎是相似的，不过，根据该实验可以得出这样的结论：为了获得更高的效价，用来自另一种亚型或基因型的E1蛋白对慢性携带者进行免疫接种可能是特别有利的，并且通过用所述感染性亚型或基因型诱导可以避免在所述宿主中预先存在的和特异性的免疫抑制作用。另外，在同源组(1b疫苗+1b感染)中所观察到的较低的效价可能表明了有大量抗体与病毒结合。因此，所诱导的抗体可能具有中和能力。
实施例15：验证E1免疫接种在黑猩猩中的预防作用
HCV E1s蛋白(192-326号氨基酸)是用重组痘苗病毒HCV11B在Vero细胞中表达的。该痘苗病毒基本上与vvHCV11A相同(披露于US6150134中，该专利的所有内容被收作本文参考)。不过，已经从RK13传入了Vero细胞。大体上按照PCT/E99/04342(WO99/67285)的例9中所披露的方法纯化所述蛋白(通过lentil层析，还原烷基化和大小排阻层析)，利用碘代乙酰胺作为半胱氨酸的烷基化试剂。在纯化之后，通过PCT/E99/04342中所披露的大小排阻层析方法将3％的Empigen-BB换成3％的甜菜碱，这一方法可以回收到颗粒形式的E1。最后将该材料脱盐成含有0.5％的甜菜碱的PBS，E1的浓度为500微克/毫升。将这种E1与等体积的Alhydrogel 1.3％(Superfos，丹麦)混合，并最后用8倍体积的0.9％的氯化钠进一步稀释，以便获得浓度为50微克E1/毫升和0.13％Alhydrogel的明矾辅佐的E1。
按照所披露的有关表达和纯化E1的方法用重组痘苗病毒HCV101在Vero中表达并从中纯化HCV E2ΔHVRI(412-715号氨基酸)，该重组痘苗病毒是按照PCT/E99/04342的例8中所披露的方法由pvHCV-101和野生型痘苗病毒重组而产生的。同样，在将Empigen-BB换成甜菜碱之后，E2ΔHVRI的表现就如同一种颗粒(通过动态光反射测定)。
选择在HCV-RNA和HCV-抗体检测中呈阴性的5只黑猩猩。其中的1只动物(Huub)不进行免疫接种，2只动物接受以明矾为佐剂的50微克的E1的6次免疫接种(Marti和Yoran)，而其余的2只动物接受以明矾为佐剂的50微克E2ΔHVRI的免疫接种(Boost和Karlien)。所有免疫接种都是通过肌内方式进行的，间隔时间为3周。在每一只动物中评估针对用来免疫接种的抗原的体液和细胞免疫应答，并且在每一只动物中检测两种类型的应答，如表11所示。
表11：在第6次免疫接种2周之后，通过ELISA测定抗体效价。将该样品的一系列稀释液与一种室内标准物进行比较(这种室内标准物被定义为具有1000mU/ml的E1或抗E2ΔHVRI抗体，它是来自根据高抗外被效价筛选的HCV慢性携带者的三种血清的混合物)。体现细胞免疫应答的刺激指数是通过在有或没有外被抗原的条件下培养PBMC获得的，所述PBMC来自第3次免疫之后2周的动物，并测定在培养5天之后为期18小时的时间内结合到所述细胞中的含氚胸苷的含量。刺激指数是掺入用外被抗原培养的细胞中的胸苷与掺入不用抗原培养的细胞中的胸苷的比例。大于3的刺激指数被认为是阳性信号。
抗E1反应 抗E2ΔHVRI反应
抗体效价  刺激指数  抗体效价  刺激指数
Yoran 14110  10.9
Marti 5630  14.2
Joost  3210  8.5
Karlien  1770  11.2
在6次免疫接种的最后一次接种之后3周，用100VID(黑猩猩感染剂量)的1b基因型接种物(J4.91，由J.Bukh博士馈赠，NIH，Bethesda，马里兰州)对包括对照在内的所有动物进行刺激。对于E1来说，疫苗蛋白和J4.91分离物(其序列信息可以从保藏号BAA01583获得)为7％(135个氨基酸中的9个)。而对于E2ΔHVRI来说为11％(304个氨基酸中的32个)；因此，该刺激被认为是异源的，并且体现了真实的活的刺激。
在刺激之后第7天所有黑猩猩都变成HCV-RNA阳性(用HCV监测仪测定，Roche，Basel，瑞士)，并且在第35和63天之间检测到了第一个ALT和γGT峰。这证明了所有黑猩猩都出现了急性肝炎。很明显，2只E1免疫接种的动物都解决了它们的感染，而于E2ΔHVRI和对照动物没有。这一结论得到了以下事实的验证：E1免疫接种过的动物在第98天(Yoran)和133天(Marti)丧失了HCV-RNA(用HCV监测仪测定，Roche，Basel，瑞士)，并且在每个月进行的检测中直到第273天都保持阴性。所有其他的动物在整个273天的随访观察期间都保持RNA阳性，其ALT和γGT值与E1免疫接种的黑猩猩不同没有恢复正常，而是逐渐提高。
总之，我们业已证实了E1免疫接种通过抑制慢性感染的发展改变了HCV感染的天然历史，这种感染是与HCV相关的主要健康问题。
实施例16：在人体内可以诱导的能够清除黑猩猩体内感染的类似的E1应答
为了在人体内获得E1免疫接种的预防作用，需要在人体内诱导与黑猩猩相应的类似免疫应答。因此，我们对20位男性人类志愿者进行了免疫接种，没有检测到抗E1应答(体液或细胞中)，使用三剂20微克E1免疫接种，该剂量是以0.5毫升的体积在0.13％的Alhydrogl上配制的。所有免疫接种都是以3周的间隔通过肌内注射进行的。正如在表12、17中所证实的，在20位志愿者中确实产生了针对E1的显著的体液和细胞免疫应答，这种应答不会没有严重的负面影响。仅有1位志愿者(对象021)被认为是非应答者，因为在3次E1免疫接种之后，体液或细胞应答都没有超过截段水平。体液应答低于黑猩猩的结果与这一事实相关：仅以20微克的用量进行了3次免疫接种，而不是使用50微克的用量进行6次免疫接种。
表12：在第3次免疫接种2周之后，通过ELISA测定抗体效价。将该样品的一系列稀释液与一种室内标准物进行比较(这种室内标准物被定义为具有1000mU/ml的E1或抗E2ΔHVRI抗体，它是来自根据高抗外被效价筛选的HCV慢性携带者的三种血清的混合物)。体现细胞免疫应答的刺激指数是通过在有或没有外被抗原的条件下培养PBMC获得的，所述PBMC来自第3次免疫之后2周的动物，并测定在培养5天之后为期18小时的时间内结合到所述细胞中的含氚胸苷的含量。刺激指数是掺入用外被抗原培养的细胞中的胸苷与掺入不用抗原培养的细胞中的胸苷的比例。大于3的刺激指数被认为是阳性信号。
 受试者编号  抗体效价   刺激指数
 002  1370   30.9
 003  717   13.2
 004  800   9.1
 007  680   3.8
 008  1026   3.9
 009  325   4.6
 010  898   7.7
 011  284   4.1
 012  181   3.6
 013  ＜20   3.5
 014  49   4.6
 015  228   3.8
 016  324   4.1
 017  ＜20*   6.2
 018  ＜20   6.7
 019  624   3.1
 020  84   5.5
 021  ＜20   2.1
 022  226   2.7
 023  163   7.6
*该个体在免疫接种后被认为是抗E1阳性，因为在免疫之前的样品和3次免疫接种之后的样品之间出现了ELISA信号的显著增强，不过，效价非常低，无法进行精确测定。
实施例17：在免疫过的健康志愿者体内加强E1应答
在第26周(即在第3次免疫接种之后20周)，用在0.13％Alhydrogl上配制的体积为0.5毫升的20微克E1对例16中的20位人类志愿者中的19位再进行1次加强接种。在该额外的免疫接种之后2周，再次测定抗体效价和细胞免疫应答。在20周的时间内，所有个体的抗体效价都降低了，不过，通过所述额外的免疫接种可以增强到等于或高于在第8周所出现的水平。与第8周的效价相比，在该加强免疫接种之后抗体的效价平均增加了1倍，而与第26周的效价相比增加了7倍(表13)。
表13：在第3次免疫接种之后2周(＝8周)和20周(26周)以及在加强免疫接种之后2周(＝28周)通过ELISA测定抗体效价。将该样品的一系列稀释液与一种室内标准物进行比较(这种室内标准物被定义为具有1000mU/ml的E1或抗E2ΔHVRI抗体，它是来自根据高抗外被效价筛选的HCV慢性携带者的三种血清的混合物)。为了精确比较用第26周和28周的样品重复进行在第8周进行的效价测定，它解释了在例16的表12中的差别。
 受试者编号  抗体效价
 第8周  第26周  第28周
 002  1471  443  3119
 003  963  95  2355
 004  1006  409  2043
 007  630  65  541
 008  926  81  819
 009  704  77  269
 010  1296  657  3773
 011  253  65  368
 012  254  148  760
 013  36  ＜20  166
 014  53  40  123
 016  159  45  231
 017  109  39  568
 018  43  23  50
 019  425  157  1894
 020  73  33  113
 021  25  ＜20  26
 022  280  150  357
 024  177  81  184
 平均值  467  138  936
很明显，对于大部分个体的T细胞应答在经过20周的时间之后仍然很高。考虑到对破伤风反应的正常化(它作为以前免疫的接种出现在大多数个体提内)，所述刺激指数的几何平均值没有变化。在经过所述额外的加强免疫之后，考虑到所述破伤风反应的正常化，没有发现变化(图51)。这证实了在3次E1免疫接种之后诱导了T辅助应答，并且表明这3次免疫接种已经诱导了非常好的T辅助记忆，它在至少6个月的时间内不需要进一步的加强免疫。
图51的说明：刺激指数(细胞免疫应答)是通过以下方法获得的：在有或没有3微克重组E1或2微克破伤风类毒素的条件下培养来自免疫接种之前(0周)，第3次免疫接种之后2周(8周)，加强免疫接种之前(26周)以及加强免疫接种之后2周(28周)的个体的PBMC(105细胞)，并且在培养5天之后，测定在为期18小时的时间内结合到所述细胞中的含氚的胸苷的量。刺激指数是结合到用外被抗原培养的细胞中的胸苷与结合到不用抗原培养的细胞中的胸苷的比例。在第1个测定(A)中，测定0周和8周的样品，而在第2个测定(B)中，测定26周和28周的样品，其中，对0周的样品进行再次分析。结果以所有20位(A，实验)或19位(B，实验)志愿者的刺激指数的几何平均值形式表示。
除了Th1细胞因子干扰素γ之外，还在第26周和28周采集的并用E1再次刺激过的样品的PBMC培养物的上清液中测定Th2细胞因子白介素-5。从图52中可以看出，由E1刺激的PBMC分泌的主要细胞因子是干扰素γ。另人吃惊的是，用明矾辅佐的E1观察到了偏向Th1的强的应答，因为已知明矾是Th2诱导物。这一结果再次证实了诱导了良好的T细胞记忆应答，因为在最后的加强免疫之前(26周)就观察到了非常强的应答。在另一个实验中我们发现所述干扰素γ分泌是特异性的，使用在第0周采集的样品我们没有发现在这些志愿者的E1刺激的细胞培养物和未刺激过的细胞培养物之间在干扰素γ的分泌方面有差别。
图52的说明：有3微克重组E1(E1)或2微克破伤风类毒素(TT)或无抗原(BI)的条件下培养来自加强免疫接种之前(26周)和加强免疫接种之后2周(28周)的个体的PBMC(105细胞)。通过ELISA测定取自24小时之后(白介素-5)或120小时之后(干扰素γ)采集的上清液中的细胞因子。刺激指数是在用外被抗原培养的细胞上清液中测定的细胞因子与在不用抗原培养的细胞中测定的细胞因子的比例。结果以所有19位志愿者分泌的pg细胞因子/毫升的几何平均值形式表示。细胞因子量低于检测极限的样品被确定为检测极限值。类似的，具有超出该测定的线性范围的极高浓度的细胞因子的样品被确定为该测定的线性范围的上限。
实施例18：免疫接种过的健康志愿者对E1的细胞应答的精细作图
为了对E1特异性反应进行作图，用标准Fmoc化合方法合成了一系列二十聚体肽，具有8个氨基酸的重叠，并且覆盖整个E1序列。对所有的肽进行C-末端氨基化和N-末端乙酰化，除IGP1626以外，它具有游离的氨基末端。
IGP1626  YEVRNVSGIYHVTNDCSNSS(192-211号氨基酸)
IGP1627  TNDCSNSSIVYEAADMIMHT(204-223号氨基酸)
IGP1628  AADMIMHTPGCVPCVRENNS(216-235号氨基酸)
IGP1629  PCVRENNSSRCWVALTPTLA(228-247号氨基酸)
IGP1630  VALTPTLAARNASVPTTTIR(240-259号氨基酸)
IGP1631  SVPTTTIRRHVDLLVGAAAF(252-271号氨基酸)
IGP1632  LLVGAAAFCSAMYVGDLCGS(264-283号氨基酸)
IGP1633  YVGDLCGSVFLVSQLFTISP(276-295号氨基酸)
IGP1634  SQLFTISPRRHETVQDCNCS(288-307号氨基酸)
IGP1635  TVQDCNCSIYPGHITGHRMA(300-319号氨基酸)
IGP1636  HITGHRMAWDMMMNWSPTTA(312-331号氨基酸)
在分别有25微克/毫升(未免疫接种的人体)或10微克/毫升(免疫接种过的人体)，在第3次或加强注射之后采集的样品)肽的情况下培养来自14个没有用E1免疫接种的不同的健康供体或10个用E1免疫接种的10个供体的PBMC。从图53中可以看出，与未免疫接种过的人体相比，在免疫接种过的人体内肽IGP1627、1629、1630、1631、1633、1635和1635都能诱导明显较强的反应。使用3的刺激指数作为肽IGP1627、1629、1631和1635的截断值，1635是最经常被识别的(至少能被测试的半数免疫接种过的人体所识别)。该实验证实，由来自哺乳动物细胞培养物的E1诱导的T细胞应答是对E1特异性的，因为这种应答不能被来自哺乳动物细胞培养物的相同的E1再次诱导，不过还可以通过合成肽诱导。另外，该实验证实了E1中的大部分免疫原性T细胞结构域位于204-223、228-271、276-295、300-311号氨基酸之间，尤其是位于204-223、228-247、252-271和300-319号氨基酸之间。
图53的说明：刺激指数(细胞免疫应答)是通过以下方法获得的：在有或没有肽的条件下培养PBMC(3×105细胞)，并测定在培养5-6天之后在一段时间内结合到所述细胞中的含氚的胸苷的量。刺激指数是结合到用肽培养的细胞中的胸苷与结合到不用肽培养的细胞中的含氚胸苷的比例。结果以接种过的人体(上图)或未接种过的或对照(下图)的单个值的形式表示。
因此，本发明还提供了以下E1肽、蛋白、含有它们的组合物和试剂盒、编码所述肽和蛋白的核酸序列及其生产方法和用途。正如在本文中针对本发明的其他E1和相关肽所作的一般性说明。
跨越E1区的192-211号位置的IGP1626(SEQ ID NO：112)，
跨越E1区的204-223号位置的IGP1627(SEQ ID NO：113)，
跨越E1区的192-211号位置的IGP1626(SEQ ID NO：112)，
跨越E1区的204-223号位置的IGP1627(SEQ ID NO：113)，
跨越E1区的216-235号位置的IGP1628(SEQ ID NO：114)，
跨越E1区的228-247号位置的IGP1629(SEQ ID NO：115)，
跨越E1区的240-259号位置的IGP1630(SEQ ID NO：116)，
跨越E1区的252-271号位置的IGP1631(SEQ ID NO：117)，
跨越E1区的264-283号位置的IGP1632(SEQ ID NO：118)，
跨越E1区的276-295号位置的IGP1633(SEQ ID NO：119)，
跨越E1区的288-307号位置的IGP1634(SEQ ID NO：120)，
跨越E1区的300-319号位置的IGP1635(SEQ ID NO：121)，
跨越E1区的312-331号位置的IGP1636(SEQ ID NO：122)。
                                           参考文献：
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All references clted herein are Incorporated in their entirety by reference.
序列表
<110>基因创新有限公司
<120>用于诊断和治疗用途的纯化的丙型肝炎病毒外被蛋白
<140>PCT/EP02/00219
<160>122
<170>PatentIn 3.1
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>1
ggcatgcaag cttaattaat t                                              21
<210>2
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>2
ccggggaggc ctgcacgtga tcgagggcag acaccatcac caccatcact aatagttaat    60
taactgca                                                             68
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..639
<220>
<221>mat_肽
<222>1..636
<400>3
atg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gct tta ctg tcc tgt     48
Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
  1               5                  10                  15
ctg acc att cca gct tcc gct tat gag gtg cgc aac gtg tcc ggg atg     96
Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met
             20                  25                  30
tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg tat gag gca    144
Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala
         35                  40                  45
gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc gtt cgg gag    192
Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu
     50                  55                  60
aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta gcg ctc acc ccc acg ctc gca gct    240
Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala
 65                  70                  75                  80
agg aac gcc agc gtc ccc acc acg aca ata cga cgc cac gtc gat ttg    288
Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu
                 85                  90                  95
ctc gtt ggg gcg gct gct ctc tgt tcc gct atg tac gtg ggg gat ctc    336
Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu
            100                 105                 110
tgc gga tct gtc ttc ctc gtc tcc cag ctg ttc acc atc tcg cct cgc    384
Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg
        115                 120                 125
cgg cat gag acg gtg cag gac tgc aat tgc tca atc tat ccc ggc cac    432
Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His
    130                 135                 140
ata aca ggt cac cgt atg gct tgg gat atg atg atg aac tgg tcg cct    480
Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro
145                 150                 155                 160
aca acg gcc ctg gtg gta tcg cag ctg ctc cgg atc cca caa gct gtc    528
Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val
                165                 170                 175
gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga gtc ctg gcg ggc ctc gcc    576
Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala
            180                 185                 190
tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg att gtg atg cta    624
Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu
        195                 200                 205
ctc ttt gct ctc taatag                                             642
Leu Phe Ala Leu
    210
<210>4
<211>212
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>4
Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
  1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met
             20                  25                  30
Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala
         35                  40                  45
Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu
     50                  55                  60
Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala
 65                  70                  75                  80
Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu
                 85                  90                  95
Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu
            100                 105                 110
Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg
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Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His
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Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro
145                 150                 155                 160
Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val
                165                 170                 175
Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala
            180                 185                 190
Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu
        195                 200                 205
Leu Phe Ala Leu
    210
<210>5
<211>795
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..792
<220>
<221>mat_肽
<222>1..789
<400>5
atg ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc gac ctc     48
Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
gtg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggc gct gcc agg     96
Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
             20                  25                  30
gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac tat gca    144
Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
         35                  40                  45
aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gct ttg    192
Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
     50                  55                  60
ctg tcc tgt ctg acc gtt cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc aac gtg    240
Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
 65                  70                  75                  80
tcc ggg atg tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg    288
Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
                 85                  90                  95
tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc    336
Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
            100                 105                 110
gtt cgg gag aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta gcg ctc acc ccc acg    384
Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
        115                 120                 125
ctc gca gct agg aac gcc agc gtc ccc acc acg aca ata cga cgc cac    432
Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His
    130                 135                 140
gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct gct ttc tgt tcc gct atg tac gtg    480
Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val
145                 150                 155                 160
ggg gac ctc tgc gga tct gtc ttc ctc gtc tcc cag ctg ttc acc atc    528
Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile
                165                 170                 175
tcg cct cgc cgg cat gag acg gtg cag gac tgc aat tgc tca atc tat    576
Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr
            180                 185                 190
ccc ggc cac ata acg ggt cac cgt atg gct tgg gat atg atg atg aac    624
Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn
        195                 200                 205
tgg tcg cct aca acg gcc ctg gtg gta tcg cag ctg ctc cgg atc cca    672
Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro
    210                 215                 220
caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga gtc ctg gcg    720
Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala
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ggt ctc gcc tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg att    768
Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile
                245                 250                 255
gtg atg cta ctc ttt gct ccc taatag                                 795
Val Met Leu Leu Phe Ala Pro
            260
<210>6
<211>263
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>6
Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
             20                  25                  30
Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
         35                  40                  45
Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
     50                  55                  60
Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
                 85                  90                  95
Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
            100                 105                 110
Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
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Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val
145                 150                 155                 160
Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile
                165                 170                 175
Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr
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            260
<210>7
<211>633
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..630
<220>
<221>mat_肽
<222>1..627
<400>7
atg ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt acg tgc ggc ttc gcc gac ctc     48
Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
atg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggt gct gcc aga     96
Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
             20                  25                  30
gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gaa gac ggc gtg aac tat gca    144
Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
         35                  40                  45
aca ggg aat ttg cct ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gct tta    192
Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
     50                  55                  60
ctg tcc tgt ctg acc att cca gct tcc gct tat gag gtg cgc aac gtg    240
Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
 65                  70                  75                  80
tcc ggg atg tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg    288
Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
                 85                  90                  95
tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc    336
Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
            100                 105                 110
gtt cgg gag aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta gcg ctc acc ccc acg    384
Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
        115                 120                 125
ctc gca gct agg aac gcc agc gtc ccc act acg aca ata cga cgc cac    432
Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His
    130                 135                 140
gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct gct ttc tgt tcc gct atg tac gtg    480
Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val
145                 150                 155                 160
ggg gat ctc tgc gga tct gtc ttc ctc gtc tcc cag ctg ttc acc atc    528
Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile
                165                 170                 175
tcg cct cgc cgg cat gag acg gtg cag gac tgc aat tgc tca atc tat    576
Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr
            180                 185                 190
ccc ggc cac ata aca ggt cac cgt atg gct tgg gat atg atg atg aac    624
Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn
        195                 200                 205
tgg taatag                                                         633
Trp
    210
<210>8
<211>209
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>8
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  1               5                  10                  15
Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
             20                  25                  30
Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
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Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
     50                  55                  60
Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
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Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
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Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His
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Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val
145                 150                 155                 160
Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile
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Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr
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Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn
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<220>
<221>CDS
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<220>
<221>mat_肽
<222>1..477
<400>9
atg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gcc ctg ctg tcc tgt        48
Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
  1               5                  10                  15
ctg acc ata cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc aac gtg tcc ggg gtg        96
Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val
             20                  25                  30
tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc ata gtg tat gag gca       144
Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala
         35                  40                  45
gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc gtt cgg gag       192
Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu
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ggc aac tcc tcc cgt tgc tgg gtg gcg ctc act ccc acg ctc gcg gcc       240
Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala
 65                  70                  75                  80
agg aac gcc agc gtc ccc aca acg aca ata cga cgc cac gtc gat ttg       288
Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu
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ctc gtt ggg gct gct gct ttc tgt tcc gct atg tac gtg ggg gat ctc       336
Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu
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tgc gga tct gtt ttc ctt gtt tcc cag ctg ttc acc ttc tca cct cgc       384
Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg
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cgg cat caa aca gta cag gac tgc aac tgc tca atc tat ccc ggc cat       432
Arg His Gln Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His
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Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser
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<210>10
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<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>10
Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
  1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val
             20                  25                  30
Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala
         35                  40                  45
Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu
     50                  55                  60
Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala
 65                  70                  75                  80
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Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu
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Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg
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Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser
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<210>11
<211>480
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
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<220>
<221>mat_肽
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<400>11
atg tcc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gcc ctg ctg tcc tgt     48
Met Ser Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
  1               5                  10                  15
ctg acc ata cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc aac gtg tcc ggg gtg     96
Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val
             20                  25                  30
tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc ata gtg tat gag gca    144
Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala
         35                  40                  45
gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc gtt cgg gag    192
Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu
     50                  55                  60
ggc aac tcc tcc cgt tgc tgg gtg gcg ctc act ccc acg ctc gcg gcc    240
Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala
 65                  70                  75                  80
agg aac gcc agc gtc ccc aca acg aca ata cga cgc cac gtc gat ttg    288
Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu
                 85                  90                  95
ctc gtt ggg gct gct gct ttc tgt tcc gct atg tac gtg ggg gat ctc    336
Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu
            100                 105                 110
tgc gga tct gtt ttc ctt gtt tcc cag ctg ttc acc ttc tca cct cgc    384
Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg
        115                 120                 125
cgg cat caa aca gta cag gac tgc aac tgc tca atc tat ccc ggc cat    432
Arg His Gln Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His
    130                 135                 140
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Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp
145                 150                 155
<210>12
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<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>12
Met Ser Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys
  1               5                  10                  15
Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Val
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Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala
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Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu
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Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala
 65                  70                  75                  80
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<210>13
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..633
<220>
<221>mat_肽
<222>1..630
<400>13
atg ctg ggt aag gcc atc gat acc ctt acg tgc ggc ttc gcc gac ctc     48
Met Leu Gly Lys Ala Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
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Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
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Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
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Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
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Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr
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ccc ggc cac ata acg ggt cac cgt atg gct tgg gat atg atg atg aac    624
Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn
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Trp Tyr
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<213>丙型肝炎病毒
<400>14
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Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val
145                 150                 155                 160
Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile
                165                 170                 175
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<400>15
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atgttgggta aggtcatcga taccct                                        26
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>misc_特征
<223>/注释＝″反义″
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<210>18
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
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<210>20
<211>36
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>misc_特征
<223>/注释＝″反义″
<400>20
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<211>723
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
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<221>CDS
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atg ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc gac ctc     48
Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
gtg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggc gct gcc agg     96
Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
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gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac tat gca    144
Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
         35                  40                  45
aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gct ttg    192
Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
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ctg tcc tgt ctg acc gtt cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc aac gtg    240
Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
 65                  70                  75                  80
tcc ggg atg tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg       288
Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
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tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc       336
Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
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gtt cgg gag aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta gcg ctc acc ccc acg       384
Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
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ctc gca gct agg aac gcc agc gtc ccc acc acg aca ata cga cgc cac       432
Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His
    130                 135                 140
gtc gat tcc cag ctg ttc acc atc tcg cct cgc cgg cat gag acg gtg       480
Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val
145                 150                 155                 160
cag gac tgc aat tgc tca atc tat ccc ggc cac ata acg ggt cac cgt       528
Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg
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atg gct tgg gat atg atg atg aac tgg tcg cct aca acg gcc ctg gtg       576
Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val
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gta tcg cag ctg ctc cgg atc cca caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg       624
Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala
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Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val
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ggg aac tgg gct aag gtt ttg att gtg atg cta ctc ttt gct ccc taatag    723
Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Pro
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<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>22
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Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
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Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
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Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
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Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
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Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg
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Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val
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Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala
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Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val
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Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Pro
225                 230                 235
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
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<221>CDS
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<220>
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Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
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Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
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Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val
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<213>丙型肝炎病毒
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Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
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Met Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
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Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
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Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
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Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
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Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val
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<213>丙型肝炎病毒
<220>
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<222>1..630
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atg ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc gac ctc     48
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Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val
145                 150                 155                 160
cag gac tgc aat tgc tca atc tat ccc ggc cac ata acg ggt cac cgt    528
Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg
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atg gct tgg gat atg atg atg aac tgg tcg cct aca acg gcc ctg gtg    576
Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val
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gta tcg cag ctg ctc cgg atc gtg atc gag ggc aga cac cat cac cac    624
Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Val Ile Glu Gly Arg His His His His
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Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
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Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
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Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
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Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
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Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
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Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
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Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
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Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His
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Val Asp Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val
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Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Val Ile Glu Gly Arg His His His His
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Met Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met
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ggg tac atc ccg ctc gtc ggc gct ccc gta gga ggc gtc gca aga gcc     96
Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Val Gly Gly Val Ala Arg Ala
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ctt gcg cat ggc gtg agg gcc ctt gaa gac ggg ata aat ttc gca aca    144
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ggg aat ttg ccc ggt tgc tcc ttt tct att ttc ctt ctc gct ctg ttc    192
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tct tgc tta att cat cca gca gct agt cta gag tgg cgg aat acg tct    240
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ggc ctc tat gtc ctt acc aac gac tgt tcc aat agc agt att gtg tac    288
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<213>丙型肝炎病毒
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ttc gaa gcc gca tgc aat tgg act cga gga gag cgt tgt gac ttg gag    1008
Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu
                325                 330                 335
gac agg gat aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg ctg tct aca aca gag    1056
Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu
            340                 345                 350
tgg cag ata ctg ccc tgt tcc ttc acc acc ctg ccg gcc cta tcc acc    1104
Trp Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr
        355                 360                 365
ggc ctg atc cac ctc cat cag aac atc gtg gac gtg caa tac ctg tac    1152
Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr
    370                 375                 380
ggt gta ggg tcg gcg gtt gtc tcc ctt gtc atc aaa tgg gag tat gtc    1200
Gly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val
385                 390                 395                 400
ctg ttg ctc ttc ctt ctc ctg gca gac gcg cgc atc tgc gcc tgc tta    1248
Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu
                405                 410                 415
tgg atg atg ctg ctg ata gct caa gct gag gcc gcc tta gag aac ctg    1296
Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu
            420                 425                 430
gtg gtc ctc aat gcg gcg gcc gtg gcc ggg gcg cat ggc act ctt tcc    1344
Val Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser
        435                 440                 445
ttc ctt gtg ttc ttc tgt gct gcc tgg tac atc aag ggc agg ctg gtc    1392
Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val
    450                 455                 460
cct ggt gcg gca tac gcc ttc tat ggc gtg tgg ccg ctg ctc ctg ctt    1440
Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu
465                 470                 475                 480
ctg ctg gcc tta cca cca cga gct tat gcc tagtaa                     1476
Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala
                485                 490
<210>36
<211>490
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>36
Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser
  1               5                  10                  15
Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala
             20                  25                  30
His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn
         35                  40                  45
Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly
     50                  55                  60
His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu
 65                  70                  75                  80
Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn
                 85                  90                  95
Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp
            100                 105                 110
Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe
        115                 120                 125
Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp
    130                 135                 140
Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser
145                 150                 155                 160
Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly
                165                 170                 175
Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro
            180                 185                 190
Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr
        195                 200                 205
Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg
    210                 215                 220
Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly
225                 230                 235                 240
Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly
                245                 250                 255
Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu
            260                 265                 270
Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys
        275                 280                 285
Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn
    290                 295                 300
Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg
305                 310                 315                 320
Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu
                325                 330                 335
Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu
            340                 345                 350
Trp Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr
        355                 360                 365
Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr
    370                 375                 380
Gly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val
385                 390                 395                 400
Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu
                405                 410                 415
Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu
            420                 425                 430
Val Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser
        435                 440                 445
Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val
    450                 455                 460
Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu
465                 470                 475                 480
Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala
                485                 490
<210>37
<211>1021
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>2..1018
<220>
<221>mat_肽
<222>2..1015
<400>37
g atc cca caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga       46
  Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly
    1               5                  10                  15
gtc ctg gcg ggc ctc gcc tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag     94
Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys
                 20                  25                  30
gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtc gac ggg cat acc cgc    142
Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg
             35                  40                  45
gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc gat acc agg ggc ctt gtg tcc ctc    190
Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu
         50                  55                  60
ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc cag ctc gta asc acc aac ggc    238
Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly
     65                  70                  75
agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg aac tgc aac gac tcc ctc caa    286
Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln
 80                  85                  90                  95
aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc tac aaa cac aaa ttc aac tcg tct    334
Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser
                100                 105                 110
gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt cgc tcc atc gac aag ttc gct    382
Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala
            115                 120                 125
cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act gag cct aac agc tcg gac cag    430
Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln
        130                 135                 140
agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg cct cga ccg tgt ggt att gta ccc    478
Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro
    145                 150                 155
gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg tat tgc ttc acc ccg agc cct gtt    526
Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val
160                 165                 170                 175
gtg gtg ggg acg acc gat cgg ttt ggt gtc ccc acg tat aac tgg ggg    574
Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly
                180                 185                 190
gcg aac gac tcg gat gtg ctg att ctc aac aac acg cgg ccg ccg cga    622
Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg
            195                 200                 205
ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg atg aat ggc act ggg ttc acc aag    670
Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys
        210                 215                 220
acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac atc ggg ggg gcc ggc aac aac acc    718
Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr
    225                 230                 235
ttg acc tgc ccc act gac tgt ttt cgg aag cac ccc gag gcc acc tac    766
Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr
240                 245                 250                 255
gcc aga tgc ggt tct ggg ccc tgg ctg aca cct agg tgt atg gtt cat    814
Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His
                260                 265                 270
tac cca tat agg ctc tgg cac tac ccc tgc act gtc aac ttc acc atc    862
Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile
            275                 280                 285
ttc aag gtt agg atg tac gtg ggg ggc gtg gag cac agg ttc gaa gcc    910
Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala
        290                 295                 300
gca tgc aat tgg act cga gga gag cgt tgt gac ttg gag gac agg gat    958
Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp
    305                 310                 315
aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg ctg tct aca aca gag tgg cag agt    1006
Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ser
320                 325                 330                 335
ggc aga gct taatta                                                 1021
Gly Arg Ala
<210>38
<211>338
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>38
Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val
  1               5                  10                  15
Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val
             20                  25                  30
Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val
         35                  40                  45
Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe
     50                  55                  60
Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser
 65                  70                  75                  80
Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr
                 85                  90                  95
Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln
        115                 120                 125
Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg
    130                 135                 140
Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val
                165                 170                 175
Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala
            180                 185                 190
Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly
        195                 200                 205
Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr
    210                 215                 220
Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu
225                 230                 235                 240
Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala
                245                 250                 255
Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr
            260                 265                 270
Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe
        275                 280                 285
Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala
    290                 295                 300
Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg
305                 310                 315                 320
Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ser Gly
                325                 330                 335
Arg Ala
<210>39
<211>1034
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>2..1032
<220>
<221>mat_肽
<222>2..1029
<400>39
g atc cca caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga       46
  Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly
    1               5                  10                  15
gtc ctg gcg ggc ctc gcc tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag     94
Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys
                 20                  25                  30
gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtc gac ggg cat acc cgc    142
Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg
             35                  40                  45
gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc gat acc agg ggc ctt gtg tcc ctc    190
Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu
         50                  55                  60
ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc cag ctc gta aac acc aac ggc    238
Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly
     65                  70                  75
agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg aac tgc aac gac tcc ctc caa    286
Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln
 80                  85                  90                  95
aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc tac aaa cac aaa ttc aac tcg tct    334
Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser
                100                 105                 110
gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt cgc tcc atc gac aag ttc gct    382
Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala
            115                 120                 125
cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act gag cct aac agc tcg gac cag    430
Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln
        130                 135                 140
agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg cct cga ccg tgt ggt att gta ccc    478
Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro
    145                 150                 155
gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg tat tgc ttc acc ccg agc cct gtt    526
Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val
160                 165                 170                 175
gtg gtg ggg acg acc gat cgg ttt ggt gtc ccc acg tat aac tgg ggg    574
Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly
                180                 185                 190
gcg aac gac tcg gat gtg ctg att ctc aac aac acg cgg ccg ccg cga    622
Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg
            195                 200                 205
ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg atg aat ggc act ggg ttc acc aag    670
Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys
        210                 215                 220
acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac atc ggg ggg gcc ggc aac aac acc    718
Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr
    225                 230                 235
ttg acc tgc ccc act gac tgt ttt cgg aag cac ccc gag gcc acc tac    766
Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr
240                 245                 250                 255
gcc aga tgc ggt tct ggg ccc tgg ctg aca cct agg tgt atg gtt cat    814
Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His
                260                 265                 270
tac cca tat agg ctc tgg cac tac ccc tgc act gtc aac ttc acc atc    862
Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile
            275                 280                 285
ttc aag gtt agg atg tac gtg ggg ggc gtg gag cac agg ttc gaa gcc    910
Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala
        290                 295                 300
gca tgc aat tgg act cga gga gag cgt tgt gac ttg gag gac agg gat    958
Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp
    305                 310                 315
aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg ctg tct aca aca ggt gat cga ggg    1006
Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gly Asp Arg Gly
320                 325                 330                 335
cag aca cca tca cca cca tca cta at ag                              1034
Gln Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu
                340
<210>40
<211>343
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>40
Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val
  1               5                  10                  15
Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val
             20                  25                  30
Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val
         35                  40                  45
Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe
     50                  55                  60
Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser
 65                  70                  75                  80
Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr
                 85                  90                  95
Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly
            100                 105                 110
Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln
        115                 120                 125
Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg
    130                 135                 140
Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala
145                 150                 155                 160
Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val
                165                 170                 175
Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala
            180                 185                 190
Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly
        195                 200                 205
Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr
    210                 215                 220
Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu
225                 230                 235                 240
Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala
                245                 250                 255
Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr
            260                 265                 270
Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe
        275                 280                 285
Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala
    290                 295                 300
Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg
305                 310                 315                 320
Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Gly Asp Arg Gly Gln
                325                 330                 335
Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu
            340
<210>41
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<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..942
<220>
<221>mat肽
<222>1..939
<400>41
atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt gcc     48
Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala
  1               5                  10                  15
ggc gtc gac ggg cat acc cgc gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc gat     96
Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp
             20                  25                  30
acc agg ggc ctt gtg tcc ctc ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc    144
Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile
         35                  40                  45
cag ctc gta aac acc aac ggc agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg    192
Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu
     50                  55                  60
aac tgc aac gac tcc ctc caa aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc tac    240
Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr
 65                  70                  75                  80
aaa cac aaa ttc aac tcg tct gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt    288
Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys
                 85                  90                  95
cgc tcc atc gac aag ttc gct cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act    336
Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr
            100                 105                 110
gag cct aac agc tcg gac cag agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg cct    384
Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro
        115                 120                 125
cga ccg tgt ggt att gta ccc gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg tat    432
Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr
    130                 135                 140
tgc ttc acc ccg agc cct gtt gtg gtg ggg acg acc gat cgg ttt ggt    480
Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly
145                 150                 155                 160
gtc ccc acg tat aac tgg ggg gcg aac gac tcg gat gtg ctg att ctc    528
Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu
                165                 170                 175
aac aac acg cgg ccg ccg cga ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg atg    576
Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met
            180                 185                 190
aat ggc act ggg ttc acc aag acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac atc    624
Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile
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ggg ggg gcc ggc aac aac acc ttg acc tgc ccc act gac tgt ttt cgg    672
Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg
    210                 215                 220
aag cac ccc gag gcc acc tac gcc aga tgc ggt tct ggg ccc tgg ctg    720
Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu
225                 230                 235                 240
aca cct agg tgt atg gtt cat tac cca tat agg ctc tgg cac tac ccc    768
Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro
                245                 250                 255
tgc act gtc aac ttc acc atc ttc aag gtt agg atg tac gtg ggg ggc    816
Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly
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gtg gag cac agg ttc gaa gcc gca tgc aat tgg act cga gga gag cgt    864
Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg
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tgt gac ttg gag gac agg gat aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg ctg    912
Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu
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tct aca aca gag tgg cag agc tta att aat tag                        945
Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ser Leu Ile Asn
305                 310
<210>42
<211>314
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>42
Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala
  l               5                  10                  15
Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp
             20                  25                  30
Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile
         35                  40                  45
Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu
     50                  55                  60
Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr
 65                  70                  75                  80
Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys
                 85                  90                  95
Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr
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Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro
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Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr
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Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly
145                 150                 155                 160
Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu
                165                 170                 175
Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met
            180                 185                 190
Ash Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile
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Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg
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Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu
225                 230                 235                 240
Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro
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Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly
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Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg
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Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu
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305                 310
<210>43
<211>961
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..958
<220>
<221>mat_肽
<222>1..955
<400>43
atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt gcc     48
Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala
  1               5                  10                  15
ggc gtc gac ggg cat acc cgc gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc gat     96
Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp
             20                  25                  30
acc agg ggc ctt gtg tcc ctc ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc    144
Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile
         35                  40                  45
cag ctc gta aac acc aac ggc agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg    192
Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu
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Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr
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aaa cac aaa ttc aac tcg tct gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt    288
Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys
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cgc tcc atc gac aag ttc gct cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act    336
Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr
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Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly
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Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu
                165                 170                 175
aac aac acg cgg ccg ccg cga ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg atg    576
Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met
            180                 185                 190
aat ggc act ggg ttc acc aag acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac atc    624
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    210                 215                 220
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Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu
225                 230                 235                 240
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Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu
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Ser Thr Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu
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tag                                                                961
<210>44
<211>319
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>44
Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala
  1               5                  10                  15
Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp
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Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu
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    130                 135                 140
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145                 150                 155                 160
Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu
                165                 170                 175
Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met
            180                 185                 190
Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile
        195                 200                 205
Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg
    210                 215                 220
Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu
225                 230                 235                 240
Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro
                245                 250                 255
Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly
            260                 265                 270
Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg
        275                 280                 285
Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu
    290                 295                 300
Ser Thr Thr Gly Asp Arg Gly Gln Thr Pro Ser Pro Pro Ser Leu
305                 310                 315
<210>45
<211>1395
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..1392
<220>
<221>mat_肽
<222>1..1389
<400>45
atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga gtc ctg gcg ggc ctc gcc tac tat     48
Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr
  1               5                  10                  15
tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt     96
Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe
             20                  25                  30
gcc ggc gtc gac ggg cat acc cgc gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc    144
Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser
         35                  40                  45
gat acc agg ggc ctt gtg tcc ctc ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa    192
Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys
     50                  55                  60
atc cag ctc gta aac acc aac ggc agt tgg cac atc aac agg act gcc    240
Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala
 65                  70                  75                  80
ctg aac tgc aac gac tcc ctc caa aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc    288
Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe
                 85                  90                  95
tac aaa cac aaa ttc aac tcg tct gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc    336
Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser
            100                 105                 110
tgt cgc tcc atc gac aag ttc gct cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac    384
Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr
        115                 120                 125
act gag cct aac agc tcg gac cag agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg    432
Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala
    130                 135                 140
cct cga ccg tgt ggt att gta ccc gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg    480
Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val
145                 150                 155                 160
tat tgc ttc acc ccg agc cct gtt gtg gtg ggg acg acc gat cgg ttt    528
Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe
                165                 170                 175
ggt gtc ccc acg tat aac tgg ggg gcg aac gac tcg gat gtg ctg att    576
Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile
            180                 185                 190
ctc aac aac acg cgg ccg ccg cga ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg    624
Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp
        195                 200                 205
atg aat ggc act ggg ttc acc aag acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac    672
Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn
    210                 215                 220
atc ggg ggg gcc ggc aac aac acc ttg acc tgc ccc act gac tgt ttt    720
Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe
225                 230                 235                 240
cgg aag cac ccc gag gcc acc tac gcc aga tgc ggt tct ggg ccc tgg     768
Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp
                245                 250                 255
ctg aca cct agg tgt atg gtt cat tac cca tat agg ctc tgg cac tac     816
Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr
            260                 265                 270
ccc tgc act gtc aac ttc acc atc ttc aag gtt agg atg tac gtg ggg     864
Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly
        275                 280                 285
ggc gtg gag cac agg ttc gaa gcc gca tgc aat tgg act cga gga gag     912
Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu
    290                 295                 300
cgt tgt gac ttg gag gac agg gat aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg     960
Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu
305                 310                 315                 320
ctg tct aca aca gag tgg cag ata ctg ccc tgt tcc ttc acc acc ctg    1008
Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu
                325                 330                 335
ccg gcc cta tcc acc ggc ctg atc cac ctc cat cag aac atc gtg gac    1056
Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp
            340                 345                 350
gtg caa tac ctg tac ggt gta ggg tcg gcg gtt gtc tcc ctt gtc atc    1104
Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile
        355                 360                 365
aaa tgg gag tat gtc ctg ttg ctc ttc ctt ctc ctg gca gac gcg cgc    1152
Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg
    370                 375                 380
atc tgc gcc tgc tta tgg atg atg ctg ctg ata gct caa gct gag gcc    1200
Ile Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala
385                 390                 395                 400
gcc tta gag aac ctg gtg gtc ctc aat gcg gcg gcc gtg gcc ggg gcg    1248
Ala Leu Glu Asn Leu Val Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala
                405                 410                 415
cat ggc act ctt tcc ttc ctt gtg ttc ttc tgt gct gcc tgg tac atc       1296
His Gly Thr Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile
            420                 425                 430
aag ggc agg ctg gtc cct ggt gcg gca tac gcc ttc tat ggc gtg tgg       1344
Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp
        435                 440                 445
ccg ctg ctc ctg ctt ctg ctg gcc tta cca cca cga gct tat gcc tagtaa    1395
Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala
    450                 455                 460
<210>46
<211>463
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>46
Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr
  1               5                  10                  15
Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe
             20                  25                  30
Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser
         35                  40                  45
Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys
     50                  55                  60
Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala
 65                  70                  75                  80
Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe
                 85                  90                  95
Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser
            100                 105                 110
Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr
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Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala
    130                 135                 140
Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val
145                 150                 155                 160
Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe
                165                 170                 175
Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile
            180                 185                 190
Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp
        195                 200                 205
Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn
    210                 215                 220
Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe
225                 230                 235                 240
Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp
                245                 250                 255
Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr
            260                 265                 270
Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly
        275                 280                 285
Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu
    290                 295                 300
Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu
305                 310                 315                 320
Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu
                325                 330                 335
Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp
            340                 345                 350
Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile
        355                 360                 365
Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg
    370                 375                 380
Ile Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala
385                 390                 395                 400
Ala Leu Glu Asn Leu Val Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala
                405                 410                 415
His Gly Thr Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile
            420                 425                 430
Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp
        435                 440                 445
Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala
    450                 455                 460
<210>47
<211>2082
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<22l>CDS
<222>1..2079
<220>
<221>mat_肽
<222>1..2076
<400>47
aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc ggc ttc gcc gac ctc     48
Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
gtg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta ggg ggc gct gcc agg     96
Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
             20                  25                  30
gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac ggc gtg aac tat gca    144
Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
         35                  40                  45
aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc ttc ctc ttg gct ttg    192
Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
     50                  55                  60
ctg tcc tgt ctg acc gtt cca gct tcc gct tat gaa gtg cgc aac gtg    240
Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
 65                  70                  75                  80
tcc ggg atg tac cat gtc acg aac gac tgc tcc aac tca agc att gtg    288
Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
                 85                  90                  95
tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc ggg tgc gtg ccc tgc    336
Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
            100                 105                 110
gtt cgg gag aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta gcg ctc acc ccc acg    384
Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
        115                 120                 125
ctc gca gct agg aac gcc agc gtc ccc acc acg aca ata cga cgc cac    432
Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His
    130                 135                 140
gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct gct ttc tgt tcc gct atg tac gtg    480
Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val
145                 150                 155                 160
ggg gac ctc tgc gga tct gtc ttc ctc gtc tcc cag ctg ttc acc atc    528
Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile
                165                 170                 175
tcg cct cgc cgg cat gag acg gtg cag gac tgc aat tgc tca atc tat    576
Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr
            180                 185                 190
ccc ggc cac ata acg ggt cac cgt atg gct tgg gat atg atg atg aac    624
Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn
        195                 200                 205
tgg tcg cct aca acg gcc ctg gtg gta tcg cag ctg ctc cgg atc cca    672
Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro
    210                 215                 220
caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat tgg gga gtc ctg gcg    720
Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala
225                 230                 235                 240
ggc ctc gcc tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg gct aag gtt ttg gtt    768
Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val
                245                 250                 255
gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtc gac ggg cat acc cgc gtg tca gga    816
Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly
            260                 265                 270
ggg gca gca gcc tcc gat acc agg ggc ctt gtg tcc ctc ttt agc ccc    864
Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro
        275                 280                 285
ggg tcg gct cag aaa atc cag ctc gta aac acc aac ggc agt tgg cac    912
Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His
    290                 295                 300
atc aac agg act gcc ctg aac tgc aac gac tcc ctc caa aca ggg ttc    960
Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe
305                 310                 315                 320
ttt gcc gca cta ttc tac aaa cac aaa ttc aac tcg tct gga tgc cca    1008
Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro
                325                 330                 335
gag cgc ttg gcc agc tgt cgc tcc atc gac aag ttc gct cag ggg tgg    1056
Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp
            340                 345                 350
ggt ccc ctc act tac act gag cct aac agc tcg gac cag agg ccc tac    1104
Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr
        355                 360                 365
tgc tgg cac tac gcg cct cga ccg tgt ggt att gta ccc gcg tct cag    1152
Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln
    370                 375                 380
gtg tgc ggt cca gtg tat tgc ttc acc ccg agc cct gtt gtg gtg ggg    1200
Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly
385                 390                 395                 400
acg acc gat cgg ttt ggt gtc ccc acg tat aac tgg ggg gcg aac gac    1248
Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp
                405                 410                 415
tcg gat gtg ctg att ctc aac aac acg cgg ccg ccg cga ggc aac tgg    1296
Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp
            420                 425                 430
ttc ggc tgt aca tgg atg aat ggc act ggg ttc acc aag acg tgt ggg    1344
Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly
        435                 440                 445
ggc ccc ccg tgc aac atc ggg ggg gcc ggc aac aac acc ttg acc tgc    1392
Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys
    450                 455                 460
ccc act gac tgt ttt cgg aag cac ccc gag gcc acc tac gcc aga tgc    1440
Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys
465                 470                 475                 480
ggt tct ggg ccc tgg ctg aca cct agg tgt atg gtt cat tac cca tat    1488
Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr
                485                 490                 495
agg ctc tgg cac tac ccc tgc act gtc aac ttc acc atc ttc aag gtt    1536
Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val
            500                 505                 510
agg atg tac gtg ggg ggc gtg gag cac agg ttc gaa gcc gca tgc aat    1584
Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn
        515                 520                 525
tgg act cga gga gag cgt tgt gac ttg gag gac agg gat aga tca gag    1632
Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu
    530                 535                 540
ctt agc ccg ctg ctg ctg tct aca aca gag tgg cag ata ctg ccc tgt    1680
Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu Pro Cys
545                 550                 555                 560
tcc ttc acc acc ctg ccg gcc cta tcc acc ggc ctg atc cac ctc cat    1728
Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His
                565                 570                 575
cag aac atc gtg gac gtg caa tac ctg tac ggt gta ggg tcg gcg gtt    1776
Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val
            580                 585                 590
gtc tcc ctt gtc atc aaa tgg gag tat gtc ctg ttg ctc ttc ctt ctc    1824
Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu
        595                 600                 605
ctg gca gac gcg cgc atc tgc gcc tgc tta tgg atg atg ctg ctg ata    1872
Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile
    610                 615                 620
gct caa gct gag gcc gcc tta gag aac ctg gtg gtc ctc aat gcg gcg    1920
Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val Val Leu Asn Ala Ala
625                 630                 635                 640
gcc gtg gcc ggg gcg cat ggc act ctt tcc ttc ctt gtg ttc ttc tgt    1968
Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys
                645                 650                 655
gct gcc tgg tac atc aag ggc agg ctg gtc cct ggt gcg gca tac gcc    2016
Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala
            660                 665                 670
ttc tat ggc gtg tgg ccg ctg ctc ctg ctt ctg ctg gcc tta cca cca    2064
Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro
        675                 680                 685
cga gct tat gcc tagtaa    2082
Arg Ala Tyr Ala
    690
<210>48
<211>692
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>48
Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu
  1               5                  10                  15
Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg
             20                  25                  30
Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala
         35                  40                  45
Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu
     50                  55                 60
Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val
                 85                  90                  95
Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys
            100                 105                 110
Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr
        115                 120                 125
Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His
    130                 135                 140
Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val
145                 150                 155                 160
Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Ile
                165                 170                 175
Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr
            180                 185                 190
Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn
        195                 200                 205
Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro
    210                 215                 220
Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala
225                 230                 235                 240
Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Val
            245                     250                 255
Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His Thr Arg Val Ser Gly
        260                     265                 270
Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val Ser Leu Phe Ser Pro
    275                     280                 285
Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr Asn Gly Ser Trp His
290                     295                 300
Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe
305                 310                 315                 320
Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro
                325                 330                 335
Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp
            340                 345                 350
Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser Asp Gln Arg Pro Tyr
        355                 360                 365
Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln
    370                 375                 380
Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val Val Val Gly
385                 390                 395                 400
Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn Trp Gly Ala Asn Asp
                405                 410                 415
Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro Pro Arg Gly Asn Trp
            420                 425                 430
Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe Thr Lys Thr Cys Gly
        435                 440                 445
Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu Thr Cys
    450                 455                 460
Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala Thr Tyr Ala Arg Cys
465                 470                 475                 480
Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met Val His Tyr Pro Tyr
                485                 490                 495
Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe Thr Ile Phe Lys Val
            500                 505                 510
Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe Glu Ala Ala Cys Asn
        515                 520                 525
Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu
    530                 535                 540
Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp Gln Ile Leu Pro Cys
545                 550                 555                 560
Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly Leu Ile His Leu His
                565                 570                 575
Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly Val Gly Ser Ala Val
            580                 585                 590
Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu Leu Leu Phe Leu Leu
        595                 600                 605
Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu Trp Met Met Leu Leu Ile
    610                 615                 620
Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val Val Leu Asn Ala Ala
625                 630                 635                 640
Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser Phe Leu Val Phe Phe Cys
                645                 650                 655
Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro Gly Ala Ala Tyr Ala
            660                 665                 670
Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Pro Pro
        675                 680                 685
Arg Ala Tyr Ala
    690
<210>49
<211>2433
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>CDS
<222>1..2430
<220>
<221>mat_肽
<222>1..2427
<400>49
atg agc acg aat cct aaa cct caa aga aaa acc aaa cgt aac acc aac     48
Met Set Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn
  1               5                  10                  15
cgc cgc cca cag gac gtc aag ttc ccg ggc ggt ggt cag atc gtt ggt     96
Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
             20                  25                  30
gga gtt tac ctg ttg ccg cgc agg ggc ccc agg ttg ggt gtg cgc gcg    144
Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
         35                  40                  45
act agg aag act tcc gag cgg tcg caa cct cgt ggg agg cga caa cct    192
Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro
     50                  55                  60
atc ccc aag gct cgc cga ccc gag ggt agg gcc tgg gct cag ccc ggg    240
Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly
 65                  70                  75                  80
tac cct tgg ccc ctc tat ggc aat gag ggc atg ggg tgg gca gga tgg    288
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp
                 85                  90                  95
ctc ctg tca ccc cgc ggc tct cgg cct agt tgg ggc cct aca gac ccc    336
Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
            100                 105                 110
cgg cgt agg tcg cgt aat ttg ggt aag gtc atc gat acc ctt aca tgc    384
Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
        115                 120                 125
ggc ttc gcc gac ctc gtg ggg tac att ccg ctc gtc ggc gcc ccc cta    432
Gly Phe Ala Asp Leu Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu
    130                 135                 140
ggg ggc gct gcc agg gcc ctg gcg cat ggc gtc cgg gtt ctg gag gac    480
Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp
145                 150                 155                 160
ggc gtg aac tat gca aca ggg aat ttg ccc ggt tgc tct ttc tct atc    528
Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile
                165                 170                 175
ttc ctc ttg gct ttg ctg tcc tgt ctg acc gtt cca gct tcc gct tat    576
Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr
            180                 185                 190
gaa gtg cgc aac gtg tcc ggg atg tac cat gtc acg aac gac tgc tcc    624
Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser
        195                 200                 205
aac tca agc att gtg tat gag gca gcg gac atg atc atg cac acc ccc    672
Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro
    210                 215                 220
ggg tgc gtg ccc tgc gtt cgg gag aac aac tct tcc cgc tgc tgg gta    720
Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val
225                 230                 235                 240
gcg ctc acc ccc acg ctc gca gct agg aac gcc agc gtc ccc acc acg    768
Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr
                245                 250                 255
aca ata cga cgc cac gtc gat ttg ctc gtt ggg gcg gct gct ttc tgt    816
Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys
            260                 265                 270
tcc gct atg tac gtg ggg gac ctc tgc gga tct gtc ttc ctc gtc tcc    864
Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser
        275                 280                 285
cag ctg ttc acc atc tcg cct cgc cgg cat gag acg gtg cag gac tgc    912
Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys
    290                 295                 300
aat tgc tca atc tat ccc ggc cac ata acg ggt cac cgt atg gct tgg     960
Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp
305                 310                 315                 320
gat atg atg atg aac tgg tcg cct aca acg gcc ctg gtg gta tcg cag    1008
Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln
                325                 330                 335
ctg ctc cgg atc cca caa gct gtc gtg gac atg gtg gcg ggg gcc cat    1056
Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His
            340                 345                 350
tgg gga gtc ctg gcg ggc ctc gcc tac tat tcc atg gtg ggg aac tgg    1104
Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp
        355                 360                 365
gct aag gtt ttg gtt gtg atg cta ctc ttt gcc ggc gtc gac ggg cat    1152
Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His
    370                 375                 380
acc cgc gtg tca gga ggg gca gca gcc tcc gat acc agg ggc ctt gtg    1200
Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val
385                 390                 395                 400
tcc ctc ttt agc ccc ggg tcg gct cag aaa atc cag ctc gta aac acc    1248
Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr
                405                 410                 415
aac ggc agt tgg cac atc aac agg act gcc ctg aac tgc aac gac tcc    1296
Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser
            420                 425                 430
ctc caa aca ggg ttc ttt gcc gca cta ttc tac aaa cac aaa ttc aac    1344
Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn
        435                 440                 445
tcg tct gga tgc cca gag cgc ttg gcc agc tgt cgc tcc atc gac aag    1392
Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys
    450                 455                 460
ttc gct cag ggg tgg ggt ccc ctc act tac act gag cct aac agc tcg    1440
Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser
465                 470                 475                 480
gac cag agg ccc tac tgc tgg cac tac gcg cct cga ccg tgt ggt att    1488
Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile
                485                 490                 495
gta ccc gcg tct cag gtg tgc ggt cca gtg tat tgc ttc acc ccg agc    1536
Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser
            500                 505                 510
cct gtt gtg gtg ggg acg acc gat cgg ttt ggt gtc ccc acg tat aac    1584
Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn
        515                 520                 525
tgg ggg gcg aac gac tcg gat gtg ctg att ctc aac aac acg cgg ccg    1632
Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro
    530                 535                 540
ccg cga ggc aac tgg ttc ggc tgt aca tgg atg aat ggc act ggg ttc    1680
Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe
545                 550                 555                 560
acc aag acg tgt ggg ggc ccc ccg tgc aac atc ggg ggg gcc ggc aac    1728
Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn
                565                 570                 575
aac acc ttg acc tgc ccc act gac tgt ttt cgg aag cac ccc gag gcc    1776
Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala
            580                 585                 590
acc tac gcc aga tgc ggt tct ggg ccc tgg ctg aca cct agg tgt atg    1824
Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met
        595                 600                 605
gtt cat tac cca tat agg ctc tgg cac tac ccc tgc act gtc aac ttc    1872
Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe
    610                 615                 620
acc atc ttc aag gtt agg atg tac gtg ggg ggc gtg gag cac agg ttc    1920
Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe
625                 630                 635                 640
gaa gcc gca tgc aat tgg act cga gga gag cgt tgt gac ttg gag gac    1968
Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp
                645                 650                 655
agg gat aga tca gag ctt agc ccg ctg ctg ctg tct aca aca gag tgg    2016
Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp
            660                 665                 670
cag ata ctg ccc tgt tcc ttc acc acc ctg ccg gcc cta tcc acc ggc    2064
Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly
        675                 680                 685
ctg atc cac ctc cat cag aac atc gtg gac gtg caa tac ctg tac ggt    2112
Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly
    690                 695                 700
gta ggg tcg gcg gtt gtc tcc ctt gtc atc aaa tgg gag tat gtc ctg    2160
Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu
705                 710                 715                 720
ttg ctc ttc ctt ctc ctg gca gac gcg cgc atc tgc gcc tgc tta tgg    2208
Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu Trp
                725                 730                 735
atg atg ctg ctg ata gct caa gct gag gcc gcc tta gag aac ctg gtg    2256
Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val
            740                 745                 750
gtc ctc aat gcg gcg gcc gtg gcc ggg gcg cat ggc act ctt tcc ttc    2304
Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser Phe
        755                 760                 765
ctt gtg ttc ttc tgt gct gcc tgg tac atc aag ggc agg ctg gtc cct    2352
Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro
    770                 775                 780
ggt gcg gca tac gcc ttc tat ggc gtg tgg ccg ctg ctc ctg ctt ctg    2400
Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu
785                 790                 795                 800
ctg gcc tta cca cca cga gct tat gcc tagtaa                         2433
Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala
                805                 810
<210>50
<211>809
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>50
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn
  1               5                  10                  15
Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
             20                  25                  30
Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
         35                  40                  45
Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro
     50                  55                  60
Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly
 65                  70                  75                  80
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly Trp
                 85                  90                  95
Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
            100                 105                 110
Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
        115                 120                 125
Gly Phe Ala Asp Leu Val Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu
    130                 135                 140
Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile
                165                 170                 175
Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr
            180                 185                 190
Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Met Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser
        195                 200                 205
Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro
    210                 215                 220
Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val
225                 230                 235                 240
Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro Thr Thr
                245                 250                 255
Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys
            260                 265                 270
Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser
        275                 280                 285
Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys
    290                 295                 300
Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp
305                 310                 315                 320
Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln
                325                 330                 335
Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His
            340                 345                 350
Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp
        355                 360                 365
Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly His
    370                 375                 380
Thr Arg Val Ser Gly Gly Ala Ala Ala Ser Asp Thr Arg Gly Leu Val
385                 390                 395                 400
Ser Leu Phe Ser Pro Gly Ser Ala Gln Lys Ile Gln Leu Val Asn Thr
                405                 410                 415
Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser
            420                 425                 430
Leu Gln Thr Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Tyr Lys His Lys Phe Asn
        435                 440                 445
Ser Ser Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp Lys
    450                 455                 460
Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Leu Thr Tyr Thr Glu Pro Asn Ser Ser
465                 470                 475                 480
Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys Gly Ile
                485                 490                 495
Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser
            500                 505                 510
Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Val Pro Thr Tyr Asn
        515                 520                 525
Trp Gly Ala Asn Asp Ser Asp Val Leu Ile Leu Asn Asn Thr Arg Pro
    530                 535                 540
Pro Arg Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Gly Thr Gly Phe
545                 550                 555                 560
Thr Lys Thr Cys Gly Gly Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Ala Gly Asn
                565                 570                 575
Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu Ala
            580                 585                 590
Thr Tyr Ala Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys Met
        595                 600                 605
Val His Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn Phe
    610                 615                 620
Thr Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Phe
625                 630                 635                 640
Glu Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp
                645                 650                 655
Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu Trp
            660                 665                 670
Gln Ile Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr Gly
        675                 680                 685
Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr Gly
    690                 695                 700
Val Gly Ser Ala Val Val Ser Leu Val Ile Lys Trp Glu Tyr Val Leu
705                 710                 715                 720
Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Ile Cys Ala Cys Leu Trp
                725                 730                 735
Met Met Leu Leu Ile Ala Gln Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu Val
            740                 745                 750
Val Leu Asn Ala Ala Ala Val Ala Gly Ala His Gly Thr Leu Ser Phe
        755                 760                 765
Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val Pro
    770                 775                 780
Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Val Trp Pro Leu Leu Leu Leu Leu
785                 790                 795                 800
Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala
                805
<210>51
<211>17
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>修饰位点
<222>1..17
<400>51
Ser Asn Ser Ser Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys
1               5                   10                  15
Val
<210>52
<211>22
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>修饰位点
<222>1..22
<400>52
Gly Gly Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp
1               5                   10                  15
Ser Pro Thr Thr Ala Leu
            20
<210>53
<211>37
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>修饰位点
<222>1..37
<400>53
Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys
1               5                   10                  15
Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr
            20                  25                  30
Pro Gly Cys Gly Lys
        35
<210>54
<211>25
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>修饰位点
<222>1..25
<400>54
Gly Gly Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ala Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu
            20                  25
<210>55
<211>25
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<220>
<221>修饰位点
<222>1..25
<400>55
Gly Gly Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asp Ala Ser Val Pro Thr Thr
1               5                   10                  15
Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu
            20                  25
<210>56
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>56
Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Val Arg Asn
1               5                   10                  15
Ser Thr Gly Leu
            20
<210>57
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>57
Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Pro
1               5                   10                  15
Asn Ser Ser Ile
            20
<210>58
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>58
Asn Asp Cys Pro Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala His Asp Ala Ile
1               5                   10                  15
Leu His Thr Pro
            20
<210>59
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>59
Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr
1               5                   10                  15
Pro Gly Cys Val
            20
<210>60
<211>19
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>60
His Asp Ala Ile Leu His Thr Pro Gly Val Pro Cys Val Arg Glu Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Ser
<210>61
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>61
Cys Val Arg Glu Gly Asn Val Ser Arg Cys Trp Val Ala Met Thr Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Ala Thr
            20
<210>62
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>62
Ala Met Thr Pro Thr Val Ala Thr Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ala Thr
1               5                   10                  15
Gln Leu Arg Arg
            20
<210>63
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>63
Leu Pro Ala Thr Gln Leu Arg Arg His Ile Asp Leu Leu Val Gly Ser
1               5                   10                  15
Ala Thr Leu Cys
            20
<210>64
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>64
Leu Val Gly Ser Ala Thr Leu Cys Ser Ala Leu Tyr Val Gly Asp Leu
1               5                   10                  15
Cys Gly Ser Val
            20
<210>65
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>65
Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Trp Thr Thr Gln Gly Cys
1               5                   10                  15
Asn Cys Ser Ile
            20
<210>66
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>66
Thr Gln Gly Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr Gly His
1               5                   10                  15
Arg Met Ala Trp
            20
<210>67
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>67
Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro
1               5                   10                  15
Thr Ala Ala Leu
            20
<210>68
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>68
Asn Trp Ser Pro Thr Ala Ala Leu Val Met Ala Gln Leu Leu Arg Ile
1               5                   10                  15
Pro Gln Ala Ile
            20
<210>69
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>69
Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Ile Leu Asp Met Ile Ala Gly Ala His
1               5                   10                  15
Trp Gly Val Leu
            20
<210>70
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>70
Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Ile Ala Tyr Phe Ser Met
1               5                   10                  15
Val Gly Asn Met
            20
<210>71
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>71
Val Val Leu Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Ala Glu Thr Ile Val Ser
1               5                   10                  15
Gly Gly Gln Ala
            20
<210>72
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>72
Ser Gly Leu Val Ser Leu Phe Thr Pro Gly Ala Lys Gln Asn Ile Gln
1               5                   10                  15
Leu Ile Asn Thr
            20
<210>73
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>73
Gln Asn Ile Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Gln Trp His Ile Asn Ser
1               5                   10                  15
Thr Ala Leu Asn
            20
<210>74
<211>21
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>74
Leu Asn Cys Asn Glu Ser Leu Asn Thr Gly Trp Trp Leu Ala Gly Leu
1               5                   10                  15
Ile Tyr Gln His Lys
            20
<210>75
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>75
Ala Gly Leu Ile Tyr Gln His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Pro Glu
1               5                   10                  15
Arg Leu Ala Ser
            20
<210>76
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>76
Gly Cys Pro Glu Arg Leu Ala Ser Cys Arg Pro Leu Thr Asp Phe Asp
1               5                   10                  15
Gln Gly Trp Gly
            20
<210>77
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>77
Thr Asp Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Ser Tyr Ala Asn Gly Ser
1               5                   10                  15
Gly Pro Asp Gln
            20
<210>78
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>78
Ala Asn Gly Ser Gly Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Pro
1               5                   10                  15
Pro Lys Pro Cys
            20
<210>79
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>79
Trp His Tyr Pro Pro Lys Pro Cys Gly Ile ValPro Ala Lys Ser Val
1               5                   10                 15
Cys Gly Pro Val
            20
<210>80
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>80
Ala Lys Ser Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr Pro Ser Pro Val
1               5                   10                  15
Val Val Gly Thr
            20
<210>81
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>81
Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Ser Gly Ala Pro Thr
1               5                   10                  15
Tyr Ser Trp Gly
            20
<210>82
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>82
Gly Ala Pro Thr Tyr Ser Trp Gly Glu Asn Asp Thr Asp Val Phe Val
1               5                   10                  15
Leu Asn Asn Thr
            20
<210>83
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>83
Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly Phe Thr Lys
1               5                   10                  15
Val Cys Gly Ala
            20
<210>84
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>84
Gly Phe Thr Lys Val Cys Gly Ala Pro Pro Val Cys Ile Gly Gly Ala
1               5                   10                  15
Gly Asn Asn Thr
            20
<210>85
<211>19
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>85
Ile Gly Gly Ala Gly Asn Asn Thr Leu His Cys Pro Thr Asp Cys Arg
1               5                   10                  15
Lys His Pro
<210>86
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>86
Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Asp Ala Thr Tyr Ser Arg Cys Gly
1               5                   10                  15
Ser Gly Pro Trp
            20
<210>87
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>87
Ser Arg Cys Gly Ser Gly Pro Trp Ile Thr Pro Arg Cys Leu Val Asp
1               5                   10                  15
Tyr Pro Tyr Arg
            20
<210>88
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>88
Cys Leu Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Ile
1               5                   10                  15
Asn Tyr Thr Ile
            20
<210>89
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>89
Pro Cys Thr Ile Asn Tyr Thr Ile Phe Lys Ile Arg Met Tyr Val Gly
1               5                   10                  15
Gly Val Glu His
            20
<210>90
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>90
Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg Leu Glu Ala Ala Cys Asn Trp
1               5                   10                  15
Thr Pro Gly Glu
            20
<210>91
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>91
Ala Cys Asn Trp Thr Pro Gly Glu Arg Cys Asp Leu Glu Asp Arg Asp
1               5                   10                  15
Arg Ser Glu Leu
            20
<210>92
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>92
Glu Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Thr Thr Thr
1               5                   10                  15
Gln Trp Gln Val
            20
<210>93
<211>9
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>93
Tyr Gln Val Arg Asn Ser Thr Gly Leu
1               5
<210>94
<211>29
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>94
agctaattaa ttaagcttgc atgcctgca                                      29
<210>95
<211>60
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>95
gttaattaac tattagtgat ggtggtgatg gtgtctgccc tcgatcacgt gcaggcctcc    60
<210>96
<211>19
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>96
gtttaaccac tgcatgatg                                                 19
<210>97
<211>20
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>97
gtcccatcga gtgcggctac                                                20
<210>98
<211>45
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>98
cgtgacatgg tacattccgg acacttggcg cacttcataa gcgga                      45
<210>99
<211>42
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>99
tgcctcatac acaatggagc tctgggacga gtcgttcgtg ac                         42
<210>100
<211>42
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>100
tacccagcag cgggagctct gttgctcccg aacgcagggc ac                         42
<210>101
<211>42
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>101
tgtcgtggtg gggacggagg cctgcctagc tgcgagcgtg gg                         42
<210>102
<211>48
<212>
<400>102
cgttatgtgg cccgggtaga ttgagcactg gcagtcctgc accgtctc                   48
<210>103
<211>42
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>103
cagggccgtt ctaggcctcc actgcatcat catatcccaa gc                         42
<210>104
<211>26
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>104
ccggaatgta ccatgtcacg aacgac                                           26
<210>105
<211>24
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>105
gctccattgt gtatgaggca gcgg                                             24
<210>106
<211>23
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>106
gagctcccgc tgctgggtag cgc                                              23
<210>107
<211>25
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>107
cctccgtccc caccacgaca atacg                                            25
<210>108
<211>27
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>108
ctacccgggc cacataacgg gtcaccg                                          27
<210>109
<211>24
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>109
ggaggcctac aacggccctg gtgg                                             24
<210>110
<211>22
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>110
ttctatcgat taaatagaat tc                                               22
<210>111
<211>23
<212>DNA
<213>丙型肝炎病毒
<400>111
gccatacgct cacagccgat ccc                                              23
<210>112
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>112
Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys
  1               5                  10                  15
Ser Asn Ser Ser
             20
<210>113
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>113
Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp
  1               5                  10                  15
Met Ile Met His Thr
                 20
<210>114
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>114
Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val
  1               5                  10                  15
Arg Glu Asn Asn Ser
                 20
<210>115
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>115
Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Val Ala Leu
  1               5                  10                  15
Thr Pro Thr Leu Ala
                 20
<210>116
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>116
Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Ser Val Pro
  1               5                  10                  15
Thr Thr Thr Ile Arg
                 20
<210>117
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>117
Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val
  1               5                  10                  15
Gly Ala Ala Ala Phe
                 20
<210>118
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>118
Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly
  1               5                  10                  15
Asp Leu Cys Gly Ser
                 20
<210>119
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>119
Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu
  1               5                  10                  15
Phe Thr Ile Ser Pro
                 20
<210>120
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>120
Ser Gln Leu Phe Thr Ile Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln
  1               5                  10                  15
Asp Cys Asn Cys Ser
                 20
<210>121
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>121
Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ile Thr
  1               5                  10                  15
Gly His Arg Met Ala
                 20
<210>122
<211>20
<212>PRT
<213>丙型肝炎病毒
<400>122
His Ile Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp
  1               5                  10                  15
Ser Pro Thr Thr Ala
                 20

Claims (14)

1.一种治疗用疫苗组合物，含有治疗有效量的：
含有选自E1蛋白和E2蛋白的至少一种纯化的重组HCV单个的或特异性寡聚的重组外被蛋白；并选择性地含有可以药用的佐剂的组合物。
2.如权利要求1的组合物，其中，所述重组HCV外被蛋白是由重组哺乳动物细胞产生的。
3.如权利要求1的组合物，其中，所述重组HCV外被蛋白是由重组酵母细胞生产的。
4.一种治疗用疫苗组合物，含有治疗有效量的含有至少一种下列E1和E2肽的组合物：
跨越核心/E1 V1区的181-200号氨基酸的E1-31(SEQ ID NO：56)，
跨越E1区的193-212号氨基酸的E1-33(SEQ ID NO：57)，
跨越E1 V2区的205-224号氨基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO：58)，
跨越E1 V2区的208-227号氨基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO：59)，
跨越E1区V1、C1、和V2区的192-228号氨基酸(含有表位B)的1bE1(SEQ ID NO：53)，
跨越E1区301-320号氨基酸的E1-51(SEQ ID NO：66)，
跨越E1 C4区的313-332号氨基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO：67)，
跨越E1区的325-344号氨基酸的E1-55(SEQ ID NO：68)，
跨越E2区的397-418号氨基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO：72)，
跨越E2区的409-428号氨基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO：73)，
跨越E2区的583-602号位置(表位A)的Env23或E2-23(SEQ IDNO：86)，
跨越E2区的595-614号位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO：87)，
跨越E2区的607-626号位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO：88)，
跨越E2区的547-586号位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO：83)，
跨越E2区的523-542号位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO：82)，
跨越E1区的192-211号位置的IGP1626(SEQ ID NO：112)，
跨越E1区的204-223号位置的IGP1627(SEQ ID NO：113)，
跨越E1区的192-211号位置的IGP1626(SEQ ID NO：112)，
跨越E1区的204-223号位置的IGP1627(SEQ ID NO：113)，
跨越E1区的216-235号位置的IGP1628(SEQ ID NO：114)，
跨越E1区的228-247号位置的IGP1629(SEQ ID NO：115)，
跨越E1区的240-259号位置的IGP1630(SEQ ID NO：116)，
跨越E1区的252-271号位置的IGP1631(SEQ ID NO：117)，
跨越E1区的264-283号位置的IGP1632(SEQ ID NO：118)，
跨越E1区的276-295号位置的IGP1633(SEQ ID NO：119)，
跨越E1区的288-307号位置的IGP1634(SEQ ID NO：120)，
跨越E1区的300-319号位置的IGP1635(SEQ ID NO：121)，和
跨越E1区的312-331号位置的IGP1636(SEQ ID NO：122)。
5.一种治疗感染了HCV的哺乳动物的方法，包括给予有效量的如权利要求1-4中任意一项的组合物，并选择性地给予可以药用的佐剂。
6.如权利要求5的方法，其中，所述哺乳动物是人。
7.一种含有选自E1蛋白和E2蛋白的至少一种纯化的重组HCV重组外被蛋白，并选择性地含有一种佐剂的组合物。
8.一种含有至少一种下列E1和E2肽的组合物：
跨越核心/E1 V1区的181-200号氨基酸的E1-31(SEQ ID NO：56)，
跨越E1区的193-212号氨基酸的E1-33(SEQ ID NO：57)，
跨越E1 V2区的205-224号氨基酸(表位B)的E1-35(SEQ ID NO：58)，
跨越E1 V2区的208-227号氨基酸(表位B)的E1-35A(SEQ IDNO：59)，
跨越E1区V1、C1、和V2区的192-228号氨基酸(含有表位B)的1bE1(SEQ ID NO：53)，
跨越E1区301-320号氨基酸的E1-51(SEQ ID NO：66)，
跨越E1C4区的313-332号氨基酸(表位A)的E1-53(SEQ ID NO：67)，
跨越E1区的325-344号氨基酸的E1-55(SEQ ID NO：68)，
跨越E2区的397-418号氨基酸(表位A)的Env67或E2-67(SEQID NO：72)，
跨越E2区的409-428号氨基酸(表位A)的Env69或E2-69(SEQID NO：73)，
跨越E2区的583-602号位置(表位A)的Env23或E2-23(SEQ IDNO：86)，
跨越E2区的595-614号位置(表位E)的Env25或E2-25(SEQ IDNO：87)，
跨越E2区的607-626号位置(表位E)的Env27或E2-27(SEQ IDNO：88)，
跨越E2区的547-586号位置(表位D)的Env17B或E2-17B(SEQID NO：83)，
跨越E2区的523-542号位置(表位C)的Env13B或E2-13B(SEQID NO：82)，
跨越E1区的192-211号位置的IGP1626(SEQ ID NO：112)，
跨越E1区的204-223号位置的IGP1627(SEQ ID NO：113)，
跨越E1区的192-211号位置的IGP1626(SEQ ID NO：112)，
跨越E1区的204-223号位置的IGP1627(SEQ ID NO：113)，
跨越E1区的216-235号位置的IGP1628(SEQ ID NO：114)，
跨越E1区的228-247号位置的IGP1629(SEQ ID NO：115)，
跨越E1区的240-259号位置的IGP1630(SEQ ID NO：116)，
跨越E1区的252-271号位置的IGP1631(SEQ ID NO：117)，
跨越E1区的264-283号位置的IGP1632(SEQ ID NO：118)，
跨越E1区的276-295号位置的IGP1633(SEQ ID NO：119)，
跨越E1区的288-307号位置的IGP1634(SEQ ID NO：120)，
跨越E1区的300-319号位置的IGP1635(SEQ ID NO：121)，和
跨越E1区的312-331号位置的IGP1636(SEQ ID NO：122)。
9.一种用于诱导HCV特异性抗体的治疗用组合物，含有治疗有效量的含有由纯化的重组HCV单个的或特异性寡聚的重组E1或E2蛋白形成的E1/E2复合物；并选择性地含有可以药用的佐剂的组合物。
10.如权利要求9的组合物，其中，所述重组HCV外被蛋白是由重组哺乳动物细胞生产的。
11.如权利要求9的组合物，其中，所述重组HCV外被蛋白是由重组酵母细胞生产的。
12.一种治疗感染了HCV的哺乳动物的方法，包括给予有效量的如权利要求9-11中任意一项的组合物，并选择性地给予可以药用的佐剂。
13.如权利要求12的方法，其中，所述哺乳动物是人。
14.一种用于诱导HCV特异性抗体的药用组合物，含有治疗有效量的含有选自E1蛋白和E2蛋白的至少一种纯化的重组HCV单个的或特异性寡聚的重组外被蛋白；并选择性地含有可以药用的佐剂的组合物。
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