CZ2000952A3

CZ2000952A3 - Farmaceutické formulace obsahující proteiny plasmy

Info

Publication number: CZ2000952A3
Application number: CZ2000952A
Authority: CZ
Inventors: Lajos Hegedüs; Krisztina Krempels; Krisztina Paál; Gábor Pethö
Original assignee: Human Rt.
Priority date: 1997-09-18
Filing date: 1998-09-17
Publication date: 2000-09-13
Also published as: NO325294B1; EP0981375A1; BG104245A; NO20001371L; LV12493B; DE69810612D1; CN1189216C; CN1270529A; PL193067B1; PT981375E; EP0981375B1; ATE230611T1; DE69810612T2; US20100076008A1; TR200001545T2; BG64749B1; US7501455B2; ZA988585B; ES2187062T3; BR9812469A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu, přípravků a formulací pro podání terapeuticky aktivních sloučenin špatně rozpustných ve vodě a majících dobrou vazebnou afinitu k proteinům plasmy a procesů pro přípravu takových přípravků a formulací.

Konkrétněji jsou hlavním předmětem vynálezu přípravky a farmaceutické formulace v pevné, nebo kapalné formě hlavně pro parenterální použití zahrnující, nebo obsahující

a) terapeuticky aktivní látku nerozpustnou ve vodě a s vysokou vazebnou afinitou k proteinům plasmy (dále „aktivní látka“) a

b) frakci plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu, kde uvedená aktivní látka a uvedená frakce proteinů jsou navzájem spojeny nekovalentní vazbou a

c) případně další farmaceuticky akceptovatelná a hlavně parenterálně akceptovatelná aditiva jako je voda, stabilizátory), regulátor(y) agregace proteinů.

Homogenní přípravky podle vynálezu v pevném stavu obsahující uvedený protein a uvedenou látku jsou ve vodě rozpustné a jejich vodné roztoky mohou být použity parenterálně, nebo mohou být použity k přípravě parenterálních farmaceutickách formulací.

Dosavadní stav techniky

Odborníkům je dobře známo, že některé biologicky aktivní sloučeniny mají potenciální terapeutickou aktivitu, ale nemohou být dostatečně účinné pro svou špatnou rozpustnost ve vodném médiu. Některé z nich nebyly nikdy navrženy zatímco jiné neprošly „fází I“ klinického vývoje. Některé z nich jsou součástí přípravků se „špatnou biokompaktibilitou“ a relativně vysokou toxicitou způsobenou látkami použitými v přípravku. Typický příklad je představován skupinou taxonů hlavně pacitaxelem, který je nadějným cytostatikem a jehož aplikace je omezena kvůli toxicitě jeho známých použitelných forem v Klucel: tween 80 nebo Klucel a rozpouštědlu 12, směsi 1:1 Cremaphor EL : ethanol. [Cancer Chemoterapy and Pharmacology (1994) 34:465471; Journal of the National Cancer Institute (1994) 1247-1259], Cremaphor EL (polyoxyethylovaný ricinový olej) je podstatně toxický, způsobující vazodilataci, letargii, hypotensi a tak dále. Ve snaze snížit toxické vedlejší účinky rozpouštědla a adjuvancií byla navržena celá řada metod: aplikace velmi malých dávek po dlouhou dobu, pre-medikace před léčbou a tak dále. (USP 5665761; USP 5621001; USP 5670537 a tak dále.) Dalším návrhem je • · • · • · • «I • · I • · uzavření aktivní látky s dispergačním činidlem do obálky vzniklé reakcí bílkoviny s olejem jako je například sójový olej. Takové přípravky byly navrženy pro paclitaxel a amphotericin. Poslední odkazy v literatuře však obsahují varování před tímto způsobem podávání paclitaxelu (viz. například „Guidance for Industry“ vydaný U.S. Departement of Health and Human Service CDER, září 1997, OGD-L-8) pro možnost reakce přecitlivělosti -všichni pacienti léčení paclitaxelem by měli být premedikováni kortikosteroidy, difenylhydraminem a H₂ antagonisty.

Dále bylo navrženo připravovat parenterální přípravky jistých ve vodě nerozpustných dihydropyridinů, jejich rozpuštěním v organickém rozpouštědle, nebo ve směsi organického rozpouštědla a vody a přídavkem roztoku HSP k tomuto roztoku za účelem minimalizace krystalizace nerozpustné aktivní látky (Hungarian Patent N° 198381; DE přihláška 37 02105). Výsledná kapalina však stále není čirým roztokem a obsahuje organické rozpouštědlo.

Podle JP zveřejněného dokumentu č. 58216126 (viz EPO Patent Abstracts of Japan) některé deriváty karboxylových kyselin nesoucí bráněné aromatické funkční skupiny a ve vodě rozpustné asi 0,1 mg/ml byly solubilizovány, po přídaku ke zředěnému vodnému roztoku lidského sérového albuminu.

Je také známo, že orální farmaceutické kompozice byly připraveny smícháním aktivní složky s vaječným albuminem při vysoké rychlosti 5 000 až 40 000 otáček za minutu ve vodném rozpouštědle a pak oddestilováním roupouštědla (EPA 326618). Jako výsledek byla získána vodná suspenze pro orální použití s účinkem zmírnění určitých vedlejších účinků aktivní složky.

Dále je známo, že některé ve vodě nerozpustné aktivní látky mají pozoruhodnou afinitu k proteinům séra. Můžeme zde uvést literaturu týkající se paclitaxelu [Cancer Chem. and Pharm. (1994)34: 465-471]; miconazolu, fluconazolu, amphotericinu B [Infection, 23(5): 292-297 (1995) září]; carbamazepinu [J. Chromatogr. B Biomed. Appl. 669(2): 281-288 (1995 červenec 21)]; azathioprinu [Ann. N.Y. Acad. Sci, 685 (1993): 175-192], propofolu [J. Chromatogr. Sci (1992): 164-166], Podle nové literatury [The Lancet vol. 352 (1998): 540-542] lék Taxol® způsobuje tvorbu rouleax červených krvinek vlivem přítomnosti polyoxyethylovaného ricinového oleje, který slouží jako rozpouštědlo tohoto léku. Některé ve vodě nerozpustné látky byly podávány pomocí toxického Cremaphoru (cyklosporin, teniposid, paclitaxel, amphotericin B). Podle našich nejlepších znalostí řada vysoce aktivních, ale ve vodě nerozpustných látek nebyla dosud dostupná na trhu ve formě aplikovatelné parenterálně, nebo intravenózně, například ritonavir, carbamazepin, camphotethin, azathiopin, miconazol, fluconazol a tak dále.

• · • · »» • · · • · « » ·· • · • ···

Je tedy tedy třeba řešit problém, kdy terapeuticky hodnotná ve vodě nerozpustná látka má být podávána v ve vodě rozpustné formě, zvláště parenterálně, pacientům, kteří potřebují léčbu těmito aktivními látkami.

Cílem vynálezu je splnit tento požadavek pro ve vodě prakticky nerozpustné aktivní látky mající dostatečnou vazebnou afinitu k proteinům plasmy.

Předmět vynálezu

Vynález je založen na poznatku, že vazba aktivní látky na odpovídající protein nekovalentní vazbou před podáním přípravku představuje nový a vysoce účinný systém pro podávání aktivní látky se špatnou rozpustností ve vodě. Podle vynálezu jsou připravovány homogenní pevné přípravky, které jsou poté rozpuštěny ve vodě a je získán biokompaktibilní, čirý, vodný roztok, který je vhodný pro parenterální podání. Vynález tedy představuje způsob pro podávání žádané ve vodě nerozpustné aktivní látky bez dalších toxických složek a jistých případech v podstatně účinější dávce než původně.

Vysvětlení symbolů a označení zde použitých:

R¹ označuje amid nebo benzoylamid terc.butyl-oxy*karboxylové kyseliny;

R² označuje vodík, nebo jakoukoli acylovou skupinu zvláště acetyl;

Nízká rozpustnost ve vodě znamená rozpustnost ve vodě při pokojové teplotě <l*10'⁴ M; Dostatečná vazebná afinita k proteinům plasmy znamená, že více jak 90% látky je vázáno k proteinům ve vodném médiu za rovnováhy při pokojové teplotě;

HSA lidský sérový albumin,

WFI voda pro injekce.

Jedním z předmětů vynálezu je ve vodě rozpustný farmaceutická formulace určený pro lidské pacienty hlavně pro parenterální užití obsahující aktivní látku mající nízkou rozpustnost ve vodě a dostatečnou afinitu k proteinům plasmy nebo frakci lidských plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu.

Lidské, nebo zvířecí plasmy, které mohou být přítomny v přípravcích a farmaceutickách formulacích podle vynálezu a náležitě použity podle daných metod k přípravě přípravků a směsí mohou být jakýmkoli přirozeně se vyskytujícím proteinem, proteiny, nebo plasmatickou frakcí jako je sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin stejně jako jejich rekombinantní analoga. Mohou být použity jak lidské tak zvířecí proteiny. Ve sloučeninách a směsích určených pro léčbu lidí je výhodné použití přirozeného lidského séra a rekombinantních lidských sérových proteinů.

• · • · © · • · ·· • · • · • · · • · · · « © © · · © • · · ♦ · · · • · · · · ·

Prakticky ve vodě nerozpustné aktivní látky podle vynálezu zahrnují široké spektrum sloučenin, kde jediným omezením je, že musí vykazovat dostatečnou afinitu k proteinu plasmy, který je pro použití zvolen. Příklady takových aktivních látek zahrnují následující skupiny terapeutických sloučenin: cytostatika, například taxonoid, antibiotika, vitaminy, protizánětlivé látky, analgetika, antikolvusanty, imunosupresiva, antiepileptika, anxiolytika, hypnotika, prostředky proti houbovým infekcím, antikoagulancia, inhibitory peroxidace lipidů, srdeční vasodilatátory, antiarytmika, kardiotonika, urikosurika, antithrombotika, steroidní hormony (progestrogen, androgen, testogen) a/nebo fotosensitisátory. Současné použití některých aktivních látek je možné po pečlivé úvaze a úpravě terapeutických dávek a posouzení vazných afinit zvolených proteinů, které jsou schopny zajistit tyto požadavky.

Podle vynálezu mohou být připraveny přípravky a farmaceutické formulace, jak je uvedeno výše, obsahující alespoň jednu z následujících aktivních látek: amphotericin B, analoga adriamicin, apazon, azathioprin, bromazepam, camptothecin, carbamazepin, clonazepam, cyclosporin A, diazepam, dicumarol, digitoxin, dipyridamol, disopyramid, flunitrazepam, gemfibrozil, ketochlorin, ketoconazol, miconazol, niflumová kyselina, oxazepam, fenobarbital, fenytoin, progesteron, propofol, ritonavir, sulfinpyrazon, suprofen, tacrolimus, tamoxifen, taxonoid, testosteron, tirilazad, trioxsalen, valproová kyselina a/nebo warfarin.

Výhodným provedením vynálezu je formulace, nebo přípravek popsaný výše a obsahující taxonoid obecného vzorce I.

Dalším výhodné provedením podle vynálezu obsahuje, nebo se skládá z paclitaxelu a lidského sérového albuminu, imunoglobulinu, glykoproteinu, interferonu a/nebo interleukinu, nebo některých jiných frakcí plasmatických proteinů.

Dalšími zvláště důležitými příklady provedení vynálezu jsou homogenní, pevné, ve vodě rozpustné přípravky obsahující alespoň jednu aktivní látku ze skupiny obsahující amphotericin B, analoga adriamicinu, apazon, azathioprine, bromazepam, camphothecin, carbamazepin, clonazepam, cyklosporin A, diazepam, dikumarol, digitoxin, dipyridamol, disopyramid, flunitrazepam, gemfibrozil, ketochlorin, ketoconazol, miconazol, niflumová kyselina, oxazepam, phenobarbital, fenytoin, progesteron, propofol, ritonavir, sulfipyrazon, suprofen, tacrolimus, tamoxifen, taxonoid, testosteron, tirilazad, trioxsalen, valproová kyselina a/nebo warfarin a také obsahuje alespoň jeden protein ze skupiny obsahující lidský sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jinou frakci přírodních nebo rekombinantních plasmatických proteinů, kde uvedené aktivní látky a uvedené proteinové frakce jsou navzájem ♦ ♦ 4

4 4

44· • 4 ♦· 44 ·· • · 4 4 • · 4 ·· · • · · · · · • · 4 · «

44 >«

vázány nekovalentní vazbou, a kde látkový poměr uvedené aktivní látky a uvedené proteinové frakce jsou v intervalu od 1:0,05 do 1:100 a výhodněji pak od 1:0,1 do 1:50.

Výhodnými představiteli výše popsaného jsou následující homogenní, pevné, ve vodě rozpustné přípravky obsahující následující páry aktivní látka - protein: taxonoid obecného vzorce I,

(I) kde R¹ představuje amid, nebo benzoyl amid t-butyl-oxy-karboxylové kyseliny,

R² představuje vodík, nebo jakoukoli acylovou skupinu zvláště acetyl a frakci plasmatických proteinů;

paclitaxel a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský plasmový albumin a/nebo γglobulin;

camptothecin B a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský plasmový albumin a/nebo γglobulin;

karbamazepin a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský plasmový albumin a/nebo γglobulin;

cyklosporin A a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský plasmový albumin a/nebo γglobulin;

propofol a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský plasmový albumin a/nebo γ-globulin; Z výše uvedeného vysvětlení je jasné, že vynález zahrnuje výše uvedené farmaceutické formulace jak v pevném stavu, tak ve formě vodného roztoku.

Jak vyplývá z jejich přirozené struktury, přesněji řečeno z jejich chemického složení proteinové molekuly mají tendenci agregovat prostřednictvím svých specifických vazných míst.

·· *· • · * • · ··· • · · · • · · ·

Stupeň agregace závisí na parametrech roztoku (teplota, složení, relativní a absolutní koncentrace složek, rovněž pH, iontová síla), ve kterém je protein přítomen.

Plasmatické proteiny použité podle vynálezu jsou s výhodou ve stabilizovaném, nebo kontrolovaném agregačním stavu. Cílem je zabránit takové agregaci proteinů, která by inhibovala optimální vazbu použité aktivní látky. Nechtěná agregace proteinů může být kontrolována přítomností jiných molekul schopných obsadit některé, nebo všechna vazná místa na makromolekulách účastnících se agregace a tak předejít vícenásobné asociaci proteinů. Některé proteiny jsou komerčně dostupné v kontrolovaném agregačním stavu: obsahují stabilizátory zabraňující agregaci. Tento stav však není vždy optimální pro vazbu aktivní látky tak, jak je ve vynálezu uvedeno.

Termín „kontrolovaný agregační stav“ podle vynálezu znamená stav, kdy je protein nejlépe schopen vázat aktivní látku přesně způsobem, který je žádoucí pro zvolený cíl. Nejedná se nutně o stav, kdy je na protein vázán maximální počet molekul aktivní látky, ale jsou případy, kdy je největší vazný poměr žádoucí.

To znamená, že v některých případech musíme z například komerčně dostupných frakcí sérových albuminů odstranit excipienty jako jsou stabilizátory, iontové složky a tak dále. Může to být nezbytným prvním krokem při provádění procesu nebo způsobu podle vynálezu. Požadované podmínky pro ustavení vhodného agregačního stavu striktně závisí na příslušné aktivní látce a dané proteinové frakci.

Příklady uvedené níže demonstrují (například paclitaxel a cyklosporin A), že aktivní látky vykazují vyšší vaznou afinitu k frakci plasmatických proteinů v nepřítomností jiných excipientů (jako jsou stabilizátory, iontové složky, soli a tak dále). Avšak existují i takové aktivní látky (například amphotericin B a propofol), které nevykazují žádné interference s například stabilizátory proteinů.

Vhodný agregační stav použitých proteinů tedy musí být určen pro každý pár aktivní látka / protein, který je použit ve způsobech podle vynálezu zvlášť.

Je-li použit pár paclitaxel a HSA: je důležité eliminovat všechny stabilizátory doprovázející komerčně dostupné HSA: jako je N-acetyl-D,L-tryptofan, alkalické kapryláty, které jsou používány pro stabilizaci proteinů během pasterizace při 60°C. Amphotericin B nebo propofol se mohou vázat na HSA i v přítomnosti těchto stabilizátorů. V některých případech, kdy žádaný agregační stav může být dosažen pomocí vody, musí být ostatní komponenty odstraněny pomocí například procedury detailně popsané níže v jednom z příkladů.

• · · • · · ·· « · · • · · · ♦ · ·· ·· ·· • · · • · ··· • 4 4 4 4

4 4 4

44

44 • · · · • · · 4 • 4 4 4 • · · ·

44

Následující aspekty musí být brány do úvahy pro optimální kombinaci určité látky a určitého plasmového proteinu podle vynálezu:

a) charakteristiky vazných míst obsazených na proteinu substancemi;

b) možné jiné komponenty přítomné v roztoku obsazují stejná vazná místa, nebo dokonce o ně soutěží;

c) fyzikálně - chemické podmínky určující konformaci určitého vazného místa a podmínky vazby;

d) známé terapeutické aspekty například

i) paclitaxel na HS A mající unikátní transportní vlastnosti;

ii) paclitaxel na interleukinech s prokázanou terapeutickou aktivitou nosiče;

iii) cyklosporin A na gama imunoglobulinu s prokázanou terapeutickou aktivitou nosiče;

iv) ritonavir na gama imunoglobulinu s prokázanou terapeutickou aktivitou nosiče; stabilita přípravku.

Jedním z nejjednodušších činidel ovlivňujících agregaci je voda. Pomocí vhodného množství vody omezíme nežádoucí agregaci a protein je připraven pro použití podle vynálezu a je ve stavu s kontrolovanou agregací.

V provedení podle vynálezu mohou sloučeniny a směsi obsahovat jako aditiva látky kontrolující a/nebo stabilizující agregaci proteinů a/nebo roztoky stabilizující aditiva. Příklady takových aditiv jsou tyto: voda, chlorid sodný, pufr, polyalkohol, například glycerol, ve vodě rozpustné deriváty cukrů především manitol, sorbitol a/nebo dulcitol a jiné.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy nových přípravků a farmaceutickách formulací podle vynálezu. Způsob zahrnuje následující kroky:

a) rozpuštění terapeuticky aktivní látky mající malou rozpustnost ve vodě a dostatečnou afinitu k proteinům plasmy („aktivní substance“) ve s vodou mísitelném farmaceuticky akceptovatelném organickém rozpouštědle.

b) smísení uvedeného roztoku s vodným roztokem frakce plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu a případně

c) dalšími farmaceuticky akceptovatelnými aditivy jako jsou látky kontrolující a/nebo stabilizující agregaci proteinů, přičemž je získán pravý roztok obsahující aktivní látku a proteinovou frakci, které jsou navzájem vázány nekovalentními vazbami;

d) odstranění organického rozpouštědla, s výhodou pomocí ultrafiltrace, dialysy, diafiltrace a/nebo lyofilysace roztoku, nebo jeho zakoncentrování, nebo pomocí kombinace těchto metod.

• · 9 • · · • 0 · ·· • · · • · · · ··

Μ ·· • ·

00· • 9

0 0

0·

Tak je získána homogenní ve vodě rozpustná kapalina nebo pevná látka, nebo farmaceutická formulace obsahující aktivní látku a frakci plasmatíckých proteinů;

e) případně je pevná látka, nebo kapalina zředěna vodou a je získána čirá, kapalná směs, která je vhodná pro terapeutické podání a

f) případně nakonec je tento přípravek převeden do formy vhodné pro parenterální podání (dávková forma) pro přímé použití.

Při přípravě nových homogenních pevných přípravků obsahujících aktivní látky a proteiny vázané nekovalentními vazbami podle vynálezu je výhodné použít způsoby zahrnující následující kroky podle vynálezu:

a) rozpuštění terapeuticky aktivní sloučeniny mající nízkou rozpustnost ve vodě a dostatečnou vazebnou afinitu k plasmatickým proteinům („aktivní látka“) ve s vodou mísitelném farmaceuticky akceptovatelném organickém rozpouštědle,

b) smísení uvedeného roztoku s vodným roztokem frakce plasmatíckých proteinů v kontrolovaném agregaěním stavu přičemž je získán pravý roztok obsahující uvedenou aktivní látku a uvedenou proteinovou frakci, které jsou navzájem vázány nekovalentními vazbami;

c) a případně odstranění organického rozpouštědla a lyofilysace roztoku, nebo jeho zakoncentrování.

Nej vhodnější cesta eliminace organického rozpouštědla závisí na aktivní látce a použitém proteinu. Jak vyplývá z povahy aktivního přípravku (páru zahrnujícího aktivní látku a protein) měly by tyto metody využívat mírných podmínek.

Lyofilizace vede k homogennímu, pevnému, ve vodě rozpustného přípravku, který po znovu rozpuštění ve vodě může být intraperitoneálně podáván. Může s výhodou kombinovat výše zmíněné kroky například, aby byl způsob ekonomičtější může být nejprve připraven koncentrát páru aktivní látka/protein a poté tento koncentrát lyofilizovat. Některé páry aktivní látka/protein (například pár amphotericin B/sérový albumin) mohou být úspěšně zakoncentrovány pomocí ultrafiltrace a dialysy. Některé jiné páiy (například paclitaxel/HSA) jsou s výhodou lyofilizovány. Některé páry by měly být nejprve ultrafiltrovány a vzniklý koncentrát je poté lyofilizován.

Odborníkům je jasné, že způsob přípravy a ředění přípravku pro parenterální farmaceutické užití musí využívat takové vodné roztoky, které obsahují další parenterálně akceptovatelná aditiva, například chlorid sodný.

* · fcfc • <1 fcfcfcfc • « · « • · · · ·· ·· • 0 « • 0 fcfcfc • ·· · • 0 · · ·· fcfc • · · fc • 0t fc • ·· · • ·· · ·· ··

Vhodnými rozpouštědly použitelnými podle vynálezu pro rozpuštění aktivní látky podle kroku a) uvedeného výše jsou ty, které splňují následující požadavky:

- měly by být schopné zcela rozpustit aktivní látku ve své směsi s vodou a

- jeho směsi s >50% vody by neměly denaturovat použité proteiny.

Před započetím provádění způsobu podle vynálezu za použití aktivní látky a proteinu je třeba zvolit vhodné rozpouštědlo na základě výše uvedených zásad. Je vhodné použít rozpouštědla ve směsi s vodou, kde je zastoupeno >50% vody a tato směs je stále schopna rozpouštět aktivní látku.

Výhodnými rozpouštědly, které mohou být použity pro krok a) výše uvedeného způsobu jsou například některé ze skupiny obsahující alifatické C2-C 4 monoalkoholy, nebo polyalkoholy, 70-100% ethanol, dimethyl formamid, methyl formamid.

Při přípravě roztoku obsahujícího protein může být použita látka kontrolující a/nebo stabilizující agregační stav. Tyto aditiva zahrnují nadbytek, nebo optimální množství vody. Také zahrnují činidla schopná částečně obsadit některá vazná místa na proteinu a zamezit agregaci a může to být některé z následujících činidel: chlorid sodný, pufr, polyalkoholy jako je glycerol a/nebo ve vodě rozpustné deriváty cukrů s výhodou manitolu, sorbitolu, dulcitolu.

Optimální podmínky pro každou aktivní látku musí být optimální vazebné afinity a odpovídající agregační podmínky musí být stanoveny předběžnými pokusy. V příkladech níže uvádíme úplné způsoby takových stanovení.

Podle výhodného provedení vynálezu jsou látky použité v kroku a) paclitaxel a přirozeně se vyskytující plasmatický protein, například sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin stejně jako jejich rekombinantní analoga. Další uspořádání podle vynálezu zahrnují jako aktivní látku ve vodě nerozpustné cytostatika, například taxonoid, antibiotika, vitaminy, protizánětlivé látky, analgetika, antikolvusanty, imunosupresiva, antiepileptika, anxiolytika, hypnotika, prostředky proti houbovým infekcím, antikoagulancia, inhibitory peroxidace lipidů, srdeční vasodilatátory, antiarytmika, kardiotonika, urikosurika, antithrombotika, steroidní hormony (progestrogen, androgen, testogen) a/nebo fotosensitisátory. Výhodnými aktivními látkami, které mohou být použity pro způsob podle vynálezu jsou amphotericin B, analoga adriamicin, apazon, azathioprin, bromazepam, camptothecin, carbamazepin, clonazepam, cyclosporin A, diazepam, dicumarol, digitoxin, dipyridamol, disopyramid, flunitrazepam, gemfibrozil, ketochlorin, ketoconazol, miconazol, niflumová kyselina, oxazepam, fenobarbital, fenytoin, progesteron, propofol, ritonavir, sulfinpyrazon, suprofen, • 9 99 • 9 9 · ··· • * * · « * 9 9 ·

99

99 «9 • i «·♦ • * · * • · · · * 9 » * »9 « 9 9 · • 9 9 9 • 9 9 9 • 9 9 9 »· tacrolimus, tamoxifen, taxonoid, testosteron, tirilazad, trioxsalen, valproová kyselina a/nebo warfarin.

Výhodné provedení podle vynálezu spočívá v přípravě homogenního, pevného, ve vodě rozpustného přípravku obsahujícího paclitaxel a lidský sérový albumin, kde aktivní látka a frakce plasmatického proteinu mohou být nekovalentně vázány. Další výhodné provedení podle vynálezu spočívá v přípravě homogenního, pevného, ve vodě rozpustného přípravku obsahujícího taxonoid obecného vzorce I a frakci plasmatických proteinů, kde aktivní látka frakce plasmatických proteinů jsou nekovalentně vázány.

Z výše uvedených vysvětlení je jasné, že vynález není omezen použitím některé aktivní látky, nebo některého ze zde uvedených proteinů.

Další předmětem vynálezu jsou způsoby použití přípravků a formulací podle vynálezu pro léčbu lidských, nebo veterinárních pacientů. Způsoby zahrnují podávání přípravků pacientům, kteří vyžadují léčbu pomocí aktivní látky a účinné dávkování směsí podle vynálezu, nebo připravených podle způsobů podle vynálezu. Dávky, které mají být podávány závisí na aktivní látce stejně jako na použitém proteinu. Dávky, které jsou použity mohou být alespoň takové, aby zajistily alespoň stejné hladiny v krvi, které jsou známy jako účinné, pokud je určitá specifická aktivní látka použita a podávána jinou cestou.

Vynález poskytuje výhodný způsob pro parenterální léčbu lidských, nebo veterinárních pacientů pomocí ve vodě nerozpustných terapeuticky aktivních látek majících dostatečnou vaznou afinitu pro vazbu k plasmatickým proteinům cestou parenterálního podání uvedené aktivní látky v účinné dávce ve formě uvedeného přípravku pacientovi, který vyžaduje léčbu touto aktivní látkou v rozmezí dávek (počítáno podle množství aktivní látky):

paclitaxel/albunim 70-280 mg/léčbá; propofol/albumín 6-10 mg/kg/hodinu; camptothecin/albumin, gemfibrozil/albumin, cyclosporin A/ albumin 3-5 mg/kg/den; amphothericin B/albumin do 1,5 mg/kg/den, kde stejný rozsah dávek je použit pro přípravky obsahující rekombinantní proteiny.

Přípravky, směsi a způsoby podle vynálezu mají následující výhody:

- dávají možnost vyloučit biologicky inkompaktibilní vehicula, zmírnit, nebo zcela vyloučit vedlejší účinky omezující použitelnou dávku, které byly důsledkem použití těchto vehicul, jako jsou toxická rozpouštědla, povrchově aktivní látky, emulgátory a podobně

- použití frakcí plasmatických proteinů jako vehicul nepředstavuje žádné vedlejší toxické účinky naopak může zlepšit toleranci pacienta například v případě chemoterapie • ·

- ve vhodných případech může být aplikovaná dávka vyšší ve srovnání s léky nyní používanými, což představuje možnost zlepšení celkového dopadu terapie.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je popsán do větších detailů pomocí následujících příkladů bez úmyslu omezit rozsah vynálezu:

I. Preparativní metody, stanovení

Následující metody byly aplikovány pro určení vazby určité aktivní látky k proteinu:

a) Ultrafiltrace

Vzorek 1 ml čirého roztoku tvořeného smícháním vodného roztoku obsahujícího protein v kontrolovaném agregačním stavu a roztoku aktivní látky ve vhodném rozpouštědle je přefiltrován přes ultrafitrační membránu (cut off limit > 30 000 Da) a aktivní látka je stanovena ve frakci ultrafiltrátu. Je-li měřena koncentrace aktivní látky v nezfiltrovaném roztoku je získáno celé množství (>90%) v nezměněné formě.

b) Lyofilizace

Výše uvedený roztok 1 ml je lyofilizován. Po lyofilizací je pevný zbytek rozpuštěn v asi 1,00 ml destilované vody za získání čirého roztoku. Měřením koncetrace aktivní látky v tomto roztoku není žádná aktivní látka nalezena ve vodné fázi, ale 100% je získáno z proteinové frakce.

c) Analysa aktivní látky

Stanovení aktivní látky je prováděno pomocí HPLC s UV detekcí. HPLC analysa byla prováděna na přístroji Waters Millennium (Waters, MA, USA). Jeho součástmi byly: pumpa Waters 616; řídící jednotka Waters 600S; automatický dávkovač vzorků Waters 717 plus, s termostatem nastaveným na +5°C; UV/VIS detektor s diodovým polem Waters 996. Systém byl řízen a zpracování dat bylo provedeno pomocí software Waters Millennium v.2.02.0 na osobním počítači Digital P486/166 (Digital Equipments, Irvin, UK). Podmínky stanovení byly optimalizovány individuálně pro každou sloučeninu, jak je na příkladech několika přípravků dokumentováno níže:

d) Potvrzení chemické struktury

Pro potvrzení, že chemická struktura látky získaná z vázané frakce je nezměněna je použita metoda LC/MS. LC/MS stanovení bylo provedeno na Finnigan Navigátor (Finnigan, Manchester, UK) kvadrupólovém LC/MS hmotovém spektrometru s využitím ES, nebo APCI+ ionizačního modu, data byla zpracována pomocí MassLab v.2.0 systému na osobním počítači Digital

Venturis FX/166 (Digital Equipments, Irvin, UK). Použité podmínky musí být individuálně optimalisovány pro každou specifickou substanci a na základě literatury jejíž příklady jsou uvedeny v následujících příkladech.

e) Příprava vzorků

Následuje způsob přípravy typického vzorku použitý pro stanovení poměru koncentrace/množství látky ze vzorku pomocí HPLC a /nebo LC/MS analysy.

Pevný obsah lyofylizační vialky je znovurozpuštěn ve vodě, roztok je smíchán s absolutním ethanolem v poměru objemů 1:1, což způsobí precipitaci plasmatických proteinů zatímco aktivní látka zůstane rozpuštěna. Po rychlé cetrifugaci je roztok vhodný pro HPLC, nebo LC/MS analysu. V případě LC/MS je vzorek analysován přímo, nebo po HPLC, která oddělí jednotlivé komponenty jednu od druhé. Obě metody poskytly hodnotné informace o chemické struktuře určité sloučeniny a/nebo možných degradačních přípravků, jak je na příkladech detailněji uvedeno pro několik přípravků.

Chromatografická a hmotově spektroskopická data z HPLC a LC/MS studií mohou potvrdit chemickou ekvivalenci mezi známou biologicky aktivní látkou použitou jako výchozí materiál a sloučeninou získanou po vazbě na frakci proteinů podle vynálezu.

f) Použitý materiál

Všechny použité aktivní látky byly USP XXIII kvality.

V popusech byly použity následující frakce plasmatických proteinů: (* = Farma. Eur. kvalita)

HUMAN Rt., Gódólló, Maďardsko DELTA Biot.Ltd, Nottingham, UK Biotest Ph., Dreieich, Germany Centeon Bio-Services, Little Rock, AR, USA Centeon Ph. GmbH, Vídeň, Rakousko HUMAN Rt., Gódólló, Maďardsko

Human Albumin 20% roztok* Recombulin™ 25% Humanalbumin 20% * Albumeon USP

Human Albumin 20% Behring* Human Gamma Globulin 16%*

II. Preparace a chemická, nebo fyzikální stanovení

V následujících příkladech jsou vazné poměry plasmatický protein : substrát v rozmezí od

1:0,1-100. Látka : HSA vazný poměr byl vypočítán na základě předpokladu, že molekulová hmotnost (mw) = 66500, a lidský gama globulin má mw = 150 000 [viz Science, vol. 244. P.l 195-1198, 1989; Vox Sang, 70: 203-209, 1996] • · • * • · • · » · · 4 ·· ·· • · • · • · • ·

Příklad II. 1

20% roztok (3,08 * 10'³ M) roztok lidského sérového albuminu v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem lmg/ml (1,17 * 10'³ M) paclitaxelu v absolutním ethanolu v poměru 4:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího lidský sérový albumin v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 99% paclitaxelu bylo vázáno k lidskému sérovému albuminu. To odpovídá poměru lidský sérový albumin : paclitaxel 1:0,1.

Příklad II.2

4,44% roztok (6,67 * 10'⁴ M) roztok lidského sérového albuminu v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 2,0 mg/ml (2,34 * 10'³ M) paclitaxelu (mw 853,92) v absolutním ethanolu v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok. Roztok byl dále zpracován tak jak je popsáno v příkladu II. 1.

Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 99% paclitaxelu bylo vázáno k lidskému sérovému albuminu. To odpovídá poměru lidský sérový albumin: paclitaxel 1:0,39.

Příklad 11,3

4,44% roztok (6,67 * 10'⁴ M) roztok rekombinantního lidského sérového albuminu v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 2,0 mg/ml (1,40 * 10'³ M) paclitaxelu v absolutním ethanolu v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího rekombinantní lidský sérový albumin v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 99% paclitaxelu bylo vázáno k rekombinantnímu lidskému sérovému albuminu. To odpovídá poměru rekobinantní lidský sérový albumin : paclitaxel 1:0,24.

Příklad II.4

2,25% roztok (1,5 * ΙΟ'⁴ M) roztok lidského gama globulinu v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 0,1 mg/ml (1,171 * 10'⁴ M) paclitaxelu v absolutním ethanolu v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího lidský gama globulin v koncentraci 16%. Vazba byla • · · · · · ···· 9 9 ··· · 9 999 9 9 9 · • · · ··· · · 9 9 9 9 9 9

9 9 ® 9 9 9 9 9 9 9 9 stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 98% paclitaxelu bylo vázáno k lidskému gama globulinu. To odpovídá poměru lidský gama globulin : paclitaxel 1:0,71.

Ve výše uvedených příkladech II. 1 až II.3 je množství paclitaxelu stanovováno pomocí následující HPLC metody:

MN Nucleosil Cis 5 pm 250x2 mm acetonitril: voda = 73 : 27 0,30 ml/min pokojová při 273 nm

5,9 min; k - 2,93 kolona mobilní fáze průtok teplota detekce typický retenční čas

Látka byla stanovena pomocí LC/MS a bylo zjištěno, že zůstala nezměněna [viz Rapid Communications in Mass Spectrometry VOL. 11: p 1025-1032, 1997, a Rapid Communications in Mass Spectrometry VOL. 9: p 495-502, 1995.]. Porovnání výsledků je ukázáno na Obr, 6: Obrázek 6A ukazuje hmotové spektrum standardu, obrázek 6B ukazuje spektrum znovurozpuštěného vzorku. Obrázek 6C ukazuje fragmentaci paclitaxelu.

Parametry LC/MS: ionizace: APCI+ interface; průtok dusíku: 300 1/h; rozpouštědlo acetonitril : pufr = 60 : 40, kde pufr je 10 mM mravenčan amonný pH 5,0 adjustovaný 10% kyselinou mravenčí; průtok: 0,300 ml/min.

Stanovení paclitaxelu:

Byla použita HPLC metoda využívající C-18 reversní fázi a paclitaxel tak byl stanoven v různých roztocích pocházejících z příkladů II. 1 až 11.27. Vzorky byly nastříknuty do HPLC systému v roztoku > 50% ethanolu, který zamezuje precipitaci některé ze sloučenin v roztoku.

Vazba

Vazba látky k plasmatickému proteinu byla stanovena po 15 minutách ekvilibrace při 8±2 °C.

Distribuce látky byla stanovena pomocí ultrafiltrace přes vhodnou membránu (cut-off musí být > než MW proteinu) stanovením koncentrace látky ve frakci ultrafiltrátu (čímž stanovíme nenavázanou frakci) a zadrženém roztoku, po rozrušení vazby denaturací proteinu (což • · tf · » · · • · · · ·· ·· ·· ·· • · · · · · ♦ • · · · · · · · • ·· ♦ · · · · · tf ·· * · · · · • tf ·· · · · · představuje celek). Pro denaturaci proteinu a uvolnění vázaného podílu je použit vychlazený (8±2 °C) absolutní ethanol v poměru 1:1. Přesná koncentrace a množství je vypočítáno s ohledem na zřeďovací poměr.

Příklady II.5 až 11.21

Roztok lidského sérového albuminu v koncentraci od 20% (3,08 x 10'³M) do 0,02% (3,08 χ 10'⁶ M) je smíchán s roztokem paclitaxelu v absolutním ethanolu v koncetraci od 20 mg/ml (2,34 χ 10'² M) do 0,01 mg/ml (1,17 χ 10'⁵ M) vždy za získání čirého roztoku. Detaily jsou uvedeny v tabulce I. Všechna měření byla provedena třikrát a výsledky byly zprůměrovány.

Tabulka I

Příklad	[T]_T (mM)	[HSA] (mM)	n(T_B)/n (HSA)	η(Τ_Β)/η/Τ_τ/χ100 %
II. 5	0,2342	2,410	0,093	97,4
II.6	0,2342	1,205	0,177	93,2
II.7	0,2342	0,602	0,346	91,0
II. 8	0,2342	0,301	0,648	85,2
II.9	0,2342	0,121	1,545	81,2
II. 10	0,2342	0,0602	3,125	82,1
II. 11	0,2342	0,0241	5,662	59,5
11.12	0,2342	0,0121	4,948	26,0
11.13	0,2342	0,00602	5,823	15,3
11.14	0,2342	0,00241	10,419	11,0
11.15	0,2342	0,00121	14,367	7,6
11.16	0,2342	0,000602	12,370	3,3
11.17	4,6843	0,121	4,135	10,9
11.18	2,3421	0,121	8,401	44,2
11.19	1,1711	0,121	4,585	48,2
11.20	0,4648	0,121	2,864	75,3
11.21	0,1171	0,121	0,765	80,4

Legenda:

• · · • « celková koncentrace paclitaxelu po přídavku lidského sérového albuminu koncentrace lidského sérového albuminu počet molů paclitaxelu vázaného najeden mol lidského sérového albuminu [Τ]τ [HSA] η(Τ_Β)/η (HSA) η(Τβ)/η/Ττ/χ100% procento vázaného paclitaxelu

Variabilita koncetrace paclitaxelu (při 0,08% HSA, 10% ethanolu, 0,002 mg/ml paclitaxelu) je ukázána na obrázku 7; variabilita koncentrací albuminu (při 0,004-16,0% HSA, 20% ethanolu, 0,2 mg/ml paclitaxelu) je ukázána na obrázku 8. Variabilita vazby paclitaxelu na HSA (při 0,8% HSA, 10% ethanolu, 0,1-2,0 mg/ml paclitaxelu) jako funkce pH při hodnotách pH od 4,0 do 8,5 je zobrazena na obrázku 9. Symboly v grafech odpovídají následujícím příkladům.

Příklad 11.18
Příklad 11.19	-O-O-
Příklad 11.20
Příklad 11.21	-Λ-Α-
Příklad 11.22

Podobné metody jako jsou uvedeny výše v příkladech II.2 až 11.21 jsou použity pro zvířecí sérové albuminy, imunoglobulin, glykoproteiny, interferony a interleukiny.

Příklad 11.23

Ovlivnění komerčně dostupného lidského sérového albuminu, nebo rekombinantního lidského sérového albuminu (dále jen albuminu), tak aby bylo dosaženo kontrolovaného agregačního stavu s nej výhodnějšími vaznými podmínkami molekuly zahrnují odstranění stabilizátorů, jako je kaprylát sodný, N-acetyl-D,L-tryptofan a další iontové látky a soli.

a.) Ultrafiltrační metody pH roztoku obsahujícího 10% albumin bylo upraveno na 3,0 pomocí chlorovodíkové kyseliny roztok byl zředěn na koncentraci proteinu 5% pomocí redestilované vody. Roztok byl zakoncetrován na 10% obsahu proteinu pomocí ultrafiltrace (cut-oťf limit membrány 30 000 Da).

Roztok byl znovu zředěn na koncentraci proteinu 5% pomocí redestilované vody. Roztok byl zakoncetrován na 10% obsahu proteinu pomocí ultrafiltrace (cut-off limit membrány 30 000 Da).

Postup byl opakován 12x, poté bylo pH nastaveno na 6,9 pomocí 2,0 M vodného roztoku hydroxidu sodného a roztok byl zředěn na koncentraci proteinu 5% pomocí redestilované vody.

• · * • · · · • · ·

9 9 99 • 9 9 » · · Β

99 · · « • · • · · · 9 9 9 9

9 9

Roztok byl opět zakoncetrován na 10% obsahu proteinu pomocí ultrafiltrace (cut-off limit membrány 30 000 Da).

Roztok byl znovu zředěn na koncentraci proteinu 5% pomocí redestilované vody. Roztok byl zakoncetrován na 10% obsahu proteinu pomocí ultrafiltrace (cut-off limit membrány 30 000 Da). Procedura byla opakována lOx za získání čistého proteinu, dostatečně vyčištěného od excipientů. Nyní je vodivost ultrafiltrátu blízká vodivosti destilované vody používané k ředění. Tento protein je vhodný k užití pro vazbu například paclitaxelu, nebo cyklosporinu.

b) Kromě ultrafiltrace poskytuje podobné výsledky také dialysa. Procedura vyžaduje asi 48 hodin.

Příklad 11,24

0,8% roztok (1,203 * 10’⁴ M) roztok HSA byl smíchán s roztokem 4,0 mg/ml (4,33 * 10'³M) amphotericinu B (mw = 924,09) v DMF v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 99,7% amphotericinu B bylo vázáno k HSA. To odpovídá poměru HSA: amphotericin Β 1:4.

Příklad 11.25

0,8% roztok (1,203 * 10'⁴ M) roztok rekombinantního lidského sérového albuminu byl smíchán s roztokem 40,0 mg/ml (4,33 * 10'² M) amphotericinu B v DMF + HC1 v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího rekombinantní HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 99,5% amphotericinu B bylo vázáno k rekombinantnímu HSA. To odpovídá poměru rekombinantní HSA: amphotericin B 1:40.

Amphotericin B byl stanoven pomocí následující HPLC metody: kolona MN Nucleosil Ci₈ 5 pm 250x2 mm mobilní fáze acetonitril : pufr =1:1 (pufr : 0,2% kyselina mravenčí, pH upraveno pomocí triethylaminu na 4,0)

0,30 ml/min průtok k - 1,41 ·· ·· » · · • · ··* ι · « « » · · « • » · * ·· ·· ·· • * · * · 4 • ·♦· « ί · 1 • · ♦ · · « « ι • ♦ · * · · « ¹ · ’ ·» · ♦ teplota pokojová detekce při 365 nm typický retenční čas 5,3 min;

Látka byla stanovena pomocí LC/MS a bylo zjištěno, že zůstala nezměněna. Porovnání výsledků je ukázáno na obr. 2: Obr. 2A ukazuje hmotové spektrum standardu, obrázek 2B ukazuje spektrum znovurozpuštěného vzorku. Obr. 2C ukazuje fragmentaci Amphotericinu B.

Parametry LC/MS: ionizace: ESI+ interface; průtok dusíku: 300 1/h; rozpouštědlo 20 mM mraveněan amonný pH 4,0 adjustovaný 10% kyselinou mravenčí; průtok: 0,300 ml/min.

Příklad 11.26

0,4% roztok (6,015 * 10'⁵ M) roztok HSA v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 0,14 mg/ml (4,02 * 10‘⁴ M) camptothericinu (mw = 348,36) v absolutním ethanolu v poměru 4:1a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 98% camptothericinu bylo vázáno k HSA. To odpovídá poměru HSA: camptothericin 1:5,34.

Příklad 11.27

0,4% roztok (6,015 * 10'⁵ M) roztok rekombinantního HSA v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 0,14 mg/ml (4,02 * 10’⁴ M) camptothericinu v absolutním ethanolu v poměru 4:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího rekombinantní HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 98% camptothericinu bylo vázáno k rekombinantnímu HSA. To odpovídá poměru rekombianntní HSA: camptothericin 1:5,34.

Camptothecin byl stanoven pomocí následující HPLC metody:

kolona mobilní fáze průtok teplota

MN Nucleosil Cig 5 pm 250x2 mm acetonitrikpufr = 33 : 67 0,33 ml/min pokojová • 4 • · 44 • 4 4 • 9 999 • 9 9 9 • 9 9 * • · ♦ *4

9 99 9

9 9

• 9 • · *· • 4 • * • 4 • 4 4 4 detekce při 356 nm typický retenční čas 6,9 min; k - 2,45

Látka byla stanovena pomocí LC/MS a bylo zjištěno, že zůstala nezměněna. [Cancer Research, ročník 56: strany 3689-3694, 1996]

Příklad 11.29

4,0% roztok (6,015 * 10'⁴ M) roztok HSA v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 8.0 mg/ml (3.39 * 10‘² M) carbamazepinu (mw 236,27) v absolutním ethanolu v poměru 19:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 98% carbamazepinu bylo vázáno k HSA. To odpovídá poměru HSA: carbamazepin 1:2,8.

Carbamazepin byl stanoven pomocí následující HPLC metody:

kolona mobilní fáze průtok teplota detekce typický retenční čas

MN Nucleosil Cis 5 pm 250x2 mm acetonitrikpufr =1:1 (pufr : 0,2% kyselina mravenčí, pH upraveno pomocí triethylaminu na 7,0)

0,25 ml/min pokojová při 285 nm

5,3 min; k - 1,12

Látka byla stanovena pomocí LC/MS a bylo zjištěno, že zůstala nezměněna. [Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., ročník 35(10): strany 755-759, 1997]. Porovnání výsledků je ukázáno na obr. 3: Obr. 3 A ukazuje hmotové spektrum standardu, obrázek 3B ukazuje spektrum znovurozpuštěného vzorku. Obr. 3C ukazuje fragmentaci carbamazepinu.

Parametry LC/MS: ionizace: ESI+ interface; průtok dusíku: 300 1/h; rozpouštědlo 2 mM mravenčan amonný; průtok: 0,250 ml/min.

4 9

9 494 * · · 9 • · · • 9 9 · ♦ • · · · • 9 9 9 • 9 49

Μ 99 ·· 99 • 9 9 9

9 4 4

9 4 9 • · « 9

9 4 4

Příklad 1130

4,0% roztok (6,015 * 10'⁴ M) roztok HSA v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 1,0 mg/ml (8.33 * 10'⁴ M) cyklosporinu A (mw 1202,63) v absolutním ethanolu v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafíltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 97% cyklosporinu A bylo vázáno k HSA. To odpovídá poměru HSA: cyklosporin A 1:0,14.

Příklad 11.31

2,0% roztok (3,008 * 10'⁴ M) roztok rekombinantního HSA v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 1.0 mg/ml (8.33 * 10'⁴ M) cyklosporinu A v absolutním ethanolu v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího rekombinantní HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafíltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 98% cyklosporinu A bylo vázáno k rekombinantnímu HSA. To odpovídá poměru rekombinantní HSA: cyklosporin A 1:0,29.

Příklad 11.32

2,25% roztok (1,50 * 10'⁴ M) roztok lidského gama globulinu v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 1.0 mg/ml (8.33 * ΙΟ'⁴ M) cyklosporinu A (mw 236,27) v absolutním ethanolu v poměru 9:1a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofilizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího lidského gama globulin v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafíltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 97% cyklosporinu A bylo vázáno k lidského gama globulinu. To odpovídá poměru lidského gama globulin: cyklosporin A 1:0,56.

Cyklosporin A byl stanoven pomocí následující HPLC metody: kolona MN Nucleosil Cis 5 pm 250x2 mm mobilní fáze acetonitril: voda : methanol: fosforečná kyselina = 700 : 260 : 40 :

0,05

0,350 ml/min průtok ·»

teplota detekce

80°C termostat při 205 nm typický retenční čas 7,5 min; k'= 2,95

Látka byla stanovena pomocí LC/MS a bylo zjištěno, že zůstala nezměněna. [1]. Porovnání výsledků je ukázáno na obr. 4: Obr. 4A ukazuje hmotové spektrum standardu, obr. 4B ukazuje spektrum znovurozpuštěného vzorku. Obr. 4C ukazuje fragmentaci cyklosporinu A.

Parametry LC/MS: ionizace: ESI+ interface; průtok dusíku: 300 1/h, rozpouštědlo acetonitril: voda, 60 : 40; průtok: 0,350 ml/min.

Příklad 11.33

0,4% roztok (6,015 * 10'⁵ M) roztok HSA v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 2,0 mg/ml (1,12 * ΙΟ’² M) propofolu (mw = 178,27) v absolutním ethanolu v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofílizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího HSA v koncentraci 20%, Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 99% propofolu bylo vázáno k HSA. To odpovídá poměru HSA: propofol 1:18,3.

Příklad 11.34

0,4% roztok (6,015 * 10'⁵ M) roztok rekombinantního HSA v kontrolovaném agregačním stavu byl smíchán s roztokem 2,0 mg/ml (1,12 * 10'² M) propofolu (mw = 178,27) v absolutním ethanolu v poměru 9:1 a míchán tak dlouho až byl získán čirý roztok.

Roztok byl lyofílizován; pevný zbytek byl rozpuštěn v dostatečném množství vody za získání čirého roztoku obsahujícího rekombinantní HSA v koncentraci 20%. Vazba byla stanovena pomocí ultrafiltrace a frakcí retentátu a ukázalo se, že 99% propofolu bylo vázáno k rekombinantnímu HSA. To odpovídá poměru rekombinantní HSA: propofol 1:18,3.

Propofol byl stanoven pomocí následující HPLC metody: kolona MN Nucleosil Cis 5 pm 250x2 mm mobilní fáze acetonitril: voda = 73 : 27 průtok 0,30 ml/min teplota pokojová detekce při 273 nm

typický retenční čas 6,1 min; k - 1,77

Látka byla stanovena pomocí LC/MS a bylo zjištěno, že zůstala nezměněna. [J. of Chromatography B, 669: strany 358-365, 1995]. Porovnání výsledků je ukázáno na obr. 5: Obrázek 5A ukazuje hmotové spektrum standardu, obrázek 5B ukazuje spektrum znovurozpuštěného vzorku. Obrázek 5C ukazuje fragmentaci propofolu.

Parametry LC/MS: ionizace: APCI+ interface; průtok dusíku: 300 1/h; rozpouštědlo acetonitril: voda, 73 : 23; průtok; 0,300 ml/min.

Příklad 11,35

9,0 ml 0,8% roztoku (1,213 * 10⁴ M) roztok HSA byl smíchán s 1,0 ml roztoku 4,0 mg/ml (4,33 * 10'³ M) amphotericinu B (mw = 178,27) v dimethylformamidu a byl získán čirý roztok. Tento roztok byl dialysován proti 2,0 litru vody (WFI) při 4°C po 20 hodin ve tmě.

Pomocí stanovení popsaném v příkladu 11.24 bylo zjištěno, že je navázáno 99,6% amphotericinu což odpovídá poměru HSA : amphotericin Β 1 : 3,5.

Opakováním dialysační procedury třikrát byla koncentrace DMF v roztoku snížena pod detekční limit (2 * ΙΟ⁹ M).

III. Dávkovači formy Příklady III. 1 ažIII.6

Podle postupů přípravy zahrnujících lyofilizaci popsaných výše jsou získány vhodné farmaceutické formy. Znovu rozpuštěním pevné látky v odpovídajícím objemu WFI (voda pro injekční podávání) ta, že je dosažena koncentrace v roztoku HSA 20 % vede ke koncentracím vhodným pro terapeutickou aplikaci, jak je shrnuto níže pro některé aktivní látky.

Příklad	název	koncentrace mg/ml
III. 1	amphotericin	11,09
III.2	camptothecin	6,8
III.3	carbamazepin	1,98
III.4	cyklosporin A	0,50
III. 5	paclitaxel	1,0
III.6	propofol	10,0

#**··** *** ·· : ·· · ·..··..·

Výše uvedené dávkové formy mohou být plněny do vialek pro injekční, nebo infiizní podávání.

IV. Biologické příklady

Studie biologické ekvivalence.

Biologická ekvivalence byla stanovena srovnáním nových forem podle vynálezu se známými formami používanými v terapii obsahujícími stejné aktivní látky se špatnou rozpustností ve vodě. Takové známé formy byly připraveny s použitím polyoxyethylovaného ricinového oleje (Cremophor EL) a absolutního ethanolu.

Použité materiály:

Paclitaxel rozpuštěný ve směsi polyoxyethylovaného ricinového oleje (Cremophor EL) : absolutní ethanol = 1 : 1, byl srovnán s vodným roztokem paclitaxel/HSA podle vynálezu, připraveným podle příkladu II.2.

Příklad IV. 1 in vitro studie

Byly provedeny srovnávací studie in vitro, aby byla stanovena antiproliferační a cytotoxická aktivita pomocí lidských nádorových buněčných linií. Cremophor EL/absolutní ethanol a HSA forma paclitaxelu byly srovnány pomocí K562 lidských myeloidních leukemických buněk, MCF-7 a MDA-231 rakovinných buněk prsu a OVCAR-5 rakovinných buněk vaječníku [Anticancer Research, vol. 16: p. 2469-2478, 1996]

Metoda:

Stanovení inhibice růstu kolonií: Monovrstevné kultury buněčných linií byly vystaveny devíti různými koncentracemi látky ve dvou uvedených formách a navíc v DMSO/fyziologický roztok jako reference. Kultury byly inkubovány 24, 48, 72, 96 a 120 hodin. Kolonie byly barveny krystalovou violetí a přežití zasažených buněk bylo vypočítáno jako procento kolonií vytvořených buňkami nezasaženými. Tabulky II A až IV B ukazují výsledky získané na různých buněčných liniích. V každé studii je ukázáno přežití zasažených buněk jako procento kolonií vytvořených buňkami nezasaženými. Všechny hodnoty jsou průměrem ze tří pokusů.

Tabulka IIA buněčná linie: MCF7 karcinom prsu forma: paclitaxel/Cremophor EL & absolutní ethanol

Pt x cc[pM]/t[h]

24h

48h

72h

96h

120h •0 00 ♦ 0 0

0 ·

0 0 • 0 0 0 ·· 00

0«

0

C 0 ··

0

0 0

0 • 000 • · 0

0· 00

0,005	92*	86	76	42	30
0,01	90	81	72	33	26
0,02	86	71	67	29	23
0,025	84	64	60	24	18
0,05	82	60	52	23	16
OJ	80	57	38	18	15
1,0	68	46	28	15	6,5
10,0	62	33	21	10	4,6

Tabulka IIΒ buněčná linie: MCF7 karcinom prsu forma: paclitaxel/HSA

Pt x cc[pM]/t[h]	24h	48h	72h	96h	120h
0,005	91	84	75	41	27
0,01	88	81	69	35	23
0,02	84	76	64	31	20
0,025	80	70	59	28	16
0,05	77	66	53	25	12
0,1	75	59	46	20	9,5
1,0	67	42	30	17	6,2
10,0	58	31	21	9,0	3,0

Tabulka IIIA buněčná linie: MDA-231 karcinom prsu forma: paclitaxel/Cremophor EL & absolutní ethanol

Pt x cc[pM]/t[h]	24h	48h	72h	96h	120h
0,005	97	89	80	47	34
0,01	94	87	75	41	30
0,02	89	82	69	37	28
0,025	86	76	65	34	23
0,05	84	72	59	29	21

·· • · • · 99 • · • 999 9 9 ·

9 9

9 ·· * * • * • 9

9 • *

0,1	83	66	53	26	18
1,0	73	49	34	21	9,5
10,0	65	37	24	14	8,2

Tabulka IIΒ buněčná linie: MDA-231 karcinom prsu forma: paclitaxel/HSA

Pt x cc[pM]/t[h]	24h	48h	72h	96h	120h
0,005	92	78	51	30	10
0,01	86	65	38	24	8,3
0,02	75	51	33	22	7,0
0,025	64	47	28	19	6,4
0,05	60	42	26	18	5,3
0,1	55	36	24	16	4,0
1,0	49	33	22	15	3,2
10,0	45	26	20	10	2,6

Tabulka IV A buněčná linie: K562 lidská myeloidní leukemie forma: paclitaxel/Cremophor EL & absolutní ethanol

Pt x cc[pM]/t[h]	24h	48h	72h	96h	120h
0,005	88	59	30	21	10
0,01	79	40	21	15	8,7
0,02	66	31	19	12	7,2
0,025	62	29	17	10	6,0
0,05	56	25	14	9,4	5,4
0,1	51	23	12	7,7	4,6
1,0	47	20	10,5	6,0	3,0
10,0	39	16	9,5	4,2	2,0

Tabulka IV B buněčná linie: K562 lidská myeloidní leukemie

9

999

9

9 • · > · · ·« » · · 4 * · · 4

99 •9 99

9 9 9 • 9 9 9 • 9 9 9 • · · 9

99 forma: paclitaxel/HSA

Pt x cc[pM]/t[h]	24h	48h	72h	96h	120h
0,005	89	53	31	18	5,4
0,01	75	40	22	11	4,7
0,02	69	32	18	9,0	4,0
0,025	65	30	14	7,6	3,5
0,05	58	25	11	7,0	3,0
0,1	53	21	9,5	5,6	2,4
1,0	47	18	8,0	5,0	1,7
10,0	41	16	7,1	4,7	1,0

Příklad IV.2: In vivo farmakokinetícké testy

Z terapeutického úhlu pohledu může být biologická ekvivalence posouzena demonstrováním identických farmakokinetických charakteristik jako je AUC (area under curve plocha pod křivkou), eliminační konstanty, poločas látky v plasmě po podání stejných dávek stejnému druhu. Takové experimenty jsou prováděny na krysách pro dvě formy stejně jako v příkladu IV.l. [Semin Oncol, vol. 21 ( 5 dodatek 8): p.53-62,1994.].

AUC znamená plochu pod křivkou na diagramu koncentrace látky v plasmě v závislosti na čase. Může být zjištěna měřením koncentrací látky v plasmě po jejím podání v určených časových bodech.

Farmakokinetická studie na krysách:

Metoda: Dávka paclitaxelu 2,5 mg/kg byla podána v objemu 1,0 ml intravenózně bolus do CR. (Wi) BR krysy (váha těla mezi 380 a 420 g), 1,0 ml vzorek krve byl odebrán do heparinisované zkumavky od třech zvířat v každém zvoleném čase jak je naznačeno níže:

C.

10'

20'

30'

45'

60'

90'

2h 3h

4h

5h

6h + + + + + + + +

+

+	+
+	+	+

• φ φφ φ φ • φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ φ

φ φ • · φ φ φ φ φ

φ φ

• · φφ • ··· • · φ • φ φ

8	+	+	+
9		+		+
10			+	+ +
11	+			+ +
12	+ +			+
	Frakce plasmy byla oddělena rychlou centrifugací při 5°C	a uchována	při -70°C až do

okamžiku analytického měření.

Příprava vzorku: Zmrzlé vzorky plasmy byly zahřátý na +8°C, zcentrifiigovány 5 min při 5000 RPM. 0,300-0,500 ml čirého roztoku plasmy bylo naneseno na Oasis HLB 1 cm³ SPE (Pevná fáze) Extrakční kolonku. Před nanesením vzorku plasmy na kolonku byla tato promyta 1 ml vody a 1 ml 30% roztoku acetonitril/voda. Kolonka byla ponechána na vzduchu dokud nevyschla. Paclitaxel byl z SPE kolonky eluován 1 ml absolutního ethanolu. Vzorek byl odpařen do sucha dusíkem a uchován při -20°C do doby analysy. Zbytek byl rozpuštěn v 0,200 ml absolutního ethanolu a nastříknut pro HPLC analysu.

Podmínky HPLC byly stejné jako byly použity při identifikaci látky.

Výsledky:

Získané body byly průměrem třech měření vzorků získaných od třech zvířat. Jako výsledek bylo zjištěno, že rozdíl mezi dvěma křivkami získanými z farmakokinetické studie pro stejné dávky ve dvou rozdílných formách se nachází uvnitř chyb jednotlivých stanovení. Byla získána křivka stejného tvaru pro všechna získaná data, což ukazuje na malé, nebo žádné rozdíly ve farmakokinetických parametrech dvou použitých forem.

Příklad IV. 3

In vitro ověření antiproliferační a zjištění cytotoxické aktivity ukazují, že nové formy vykazují pozitivní efekty proti lidským tumorovým štěpům CH1 a CHl_tax v nahých myších.

Příklad IV.4

Test hypersenzitivity

Asi 45% pacientů léčených paclitaxelem vykazovalo hypersenzitivitu. Bylo dokázáno, že tyto vedlejší efekty jsou důsledkem přítomnosti jednoho z excipientů v lékové formě a to Cremophoru EL, což bylo pozorováno také u jiných farmaceutickách přípravků obsahujících stejnou složku. Tato reakce hypersenzitivity může být popsána jako anafylaktická toxicita způsobená indukcí uvolnění histaminu Cremophorem EL.

·· ·· • * · · » 9 9 9 • 9 9 9 • 9 9 9 •9 99

Naše studie byla provedena na CRL (WI) BR samcích krys vážících 130-150 g [14], Podávaná dávka byla vypočítána asi na 7,0 mg paclitaxelu na kg, podána intravenózně v celkovém objemu 1 ml. Skupina pro každý časový bod a dávku obsahovala pět zvířat. Vzorky krve byly odebrány do heparinizováných zkumavek po 2, 5 a 10 minutách po podání. Plasma byla oddělena rychlou centrifugací. Vzorky byly uchovávány při -70°C.

Histaminu ve vzorku byl C¹⁴-methylován specifickým enzymem histamin-N-methyltrasferasou. Hladina histaminu byla stanovena ve vzorcích plasmy měřením radioaktivity C¹⁴ ve vzorcích.

Získaná data indikují, že Cremophor EL a formy které ho obsahují vykazují významnou indukci uvolnění histaminu, zatímco HSA a formy obsahující HSA a paclitaxel sám nevykazovaly žádný takový účinek.

Příklad IV. 5

Stejný fenomén jako v příkladu IV.4 byl nalezen pomocí in vitro experimentu na vzorcích lidské krve založeném na kvantitativním stanovení aktivace chromatinu krevních lymfocytů [Metoda: Analytical and Quantitative Cytology and Histology, vol. 8: ρ. 1, 1986], (původně podané nároky, které nejsou určeny k úplnému průzkumu)

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Ve vodě rozpustný přípravek, nebo farmaceutická formulace v pevném, nebo kapalném skupenství určená především pro parenterální použití obsahující:

a) terapeuticky aktivní látku vykazující nízkou rozpustnost ve vodě a dostatečnou vaznou afinitu k proteinům plasmy a

b) frakci plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu, kde aktivní látka a frakce plasmatických proteinů jsou navzájem vázány nekovalentní vazbou a

c) případně obsahují další farmaceuticky přijatelné a především parenterálně přijatelné aditivum , například voda, stabilizátor(y), látku(y) kontrolující agregaci proteinů.
2. Ve vodě rozpustný přípravek, nebo farmaceutická formulace podle nároku 1 především pro parenterální použití obsahující terapeuticky aktivní látku vykazující nízkou rozpustnost ve vodě a frakci lidských plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu.
3. Ve vodě rozpustný přípravek, nebo farmaceutická formulace podle nároku 1 především pro parenterální použití obsahující terapeuticky aktivní látku vykazující nízkou rozpustnost ve vodě a frakci zvířecích plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu.
4. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle nároků 1 až 3 obsahující složku přírodní lidské, nebo zvířecí plasmy vybraný ze skupiny sestávající z sérového albuminu, imunoglobulinu, glykoproteinu, interferonů a/nebo interleukínu, nebo rekombinantního analogu složek plasmy.
5. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle nároků 1 až 4 určená pro podání lidem, především parenterální cestou, obsahující složku přírodní lidské, nebo zvířecí plasmy vybraný ze skupiny sestávající z sérového albuminu, imunoglobulinu, glykoproteinu, interferonů a/nebo interleukínu, nebo rekombinantního analogu složek plasmy.

» · • · · · « · ♦ · • · • · · ·

9 · · · · · 9 9 9 9 9 9 9

9 4 9 9 4 9 9 9 9 9 9

4 4 49 44 94 9 9 44
6. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle nároků l až 3 obsahující ve vodě nerozpustnou aktivní látku jako jsou cytostatika vybrané ze skupiny sestávající z taxonoidu, antibiotik, vitaminů, protizánětlivých látek, analgetik, antivirálních látek, antikolvusantů, imunosupresiv, antiepileptik, anxiolytik, hypnotik, prostředků proti houbovým infekcím, antikoagulancia, inhibitorů peroxidace lipidů, srdečních vasodilatátorů, antiarytmik, kardiotonik, urikosurik, antithrombotik, steroidních hormonů, progestrogenu, androgenu, testogenu a/nebo fotosensitisátory.
7. Přípravek, nebo farmaceutická formulace podle nároků l až 6 obsahující alespoň jednu aktivní látku vybranou ze skupiny sestávající se z amphotericinu B, analogu adriamicin, apazonu, azathioprinu, bromazepamu, camptothecinu, carbamazepinu, clonazepamu, cyclosporinu A, diazepamu, dicumarolu, digitoxinu, dipyridamolu, disopyramidu, flunitrazepamu, gemfibrozilu, ketochlorinu, ketoconazolu, miconazolu, niflumové kyseliny, oxazepamu, fenobarbitalu, fenytoinu, progesteronu, propofolu, ritonaviru, sulfinpyrazonu, suprofenu, tacrolimusu, tamoxifenu, taxonoidu, testosteronu, tirilazadu, trioxsalenu, valproové kyseliny a/nebo warfarinu.
8. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle nároků l až 7 obsahující taxonoid obecného vzorce I, kde

R¹ představuje amid terč. butyl-oxy-karboxylové kyseliny, nebo benzoyl amid této kyseliny

R² představuje vodík, nebo acylovou skupinu s výhodou acetyl.
9. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle nároků 1 až 7 obsahující paclitaxel a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
10. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle nároků 1 až 9 obsahující azathioprine a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
11. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující camptothecin a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo • · · ··· ···« • ···· · · ··· · · · ·

J/ · · · · ···· ··««

44 ............

jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
12. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující gemfibrozil a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 ; 0,1 do 1 : 50.
13. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující miconazol a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
14. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující propofol a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
15. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující tamoxifen a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
16. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující ritonavir a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
17. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující tacrolimus a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.

• « • · · fc
18. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující tirilazad a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
19. Přípravek nebo farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 obsahující trioxsalen a sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo jiný přírodní, nebo rekombinantní protein lidské plasmy v molárním poměru od 1 : 0,05 do 1 : 100, s výhodou v molárním poměru od 1 : 0,1 do 1 : 50.
20. Farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 19 v pevné formě, nebo mající formu vodného roztoku.
21. Farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 20 obsahující jako aditiva látky stabilizující roztok a/nebo protein.
22. Farmaceutická formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 20 obsahující jako aditiva látky stabilizující roztok a/nebo protein přičemž se jedná o některé z následujících aditiv: chlorid sodný, pufr, alkohol jako je glycerol a/nebo ve vodě rozpustné deriváty cukrů především manitol, sorbitol a/nebo dulcitol.
23. Způsob přípravy přípravku nebo farmaceutické formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 22, nebo přípravků podle nároků 30 až 37, vyznačující se tím, že

a) rozpuštění terapeuticky aktivní látky mající malou rozpustnost ve vodě a dostatečnou afinitu k proteinům plasmy ve s vodou mísitelném farmaceuticky přijatelném organickém rozpouštědle,

b) smísení roztoku s vodným roztokem frakce plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu a případně

c) dalšími farmaceuticky akceptovatelnými aditivy jako jsou látky kontrolující a/nebo stabilizující agregaci proteinů, přičemž je získán pravý roztok obsahující uvedenou aktivní látku a uvedenou proteinovou frakci, které jsou navzájem vázány nekovalentními vazbami;

9 9 9 9 • · · 9 9 · · 9 * »« 9

99 «9 · · 9 9 · · 9 9

d) odstranění organického rozpouštědla s výhodou pomocí ultrafiltrace, dialysy, diafiltrace a/nebo lyofilisace roztoku, nebo jeho zakoncentrování, nebo pomocí kombinace těchto kroků, přičemž se získá homogenní ve vodě rozpustná kapalina nebo pevná látka, nebo farmaceutická formulace obsahující aktivní látku a frakci plasmatických proteinů;

e) případně je pevná látka, nebo kapalina zředěna vodou a je získána čirá, kapalná směs, která je vhodná pro terapeutické podání a

f) případně nakonec je tento přípravek převeden do formy vhodné pro parenterální podání v dávkové formě pro přímé použití.
25. Způsob pro přípravu přípravku nebo farmaceutické formulace podle kteréhokoli z nároků 1 až 24, nebo podle nároků 30 až 37, vyznačující se tím, že

a) rozpuštění terapeuticky aktivní látky ve s vodou mísitelném farmaceuticky akceptovatelném organickém rozpouštědle,

b) smísení roztoku s vodným roztokem frakce plasmatických proteinů v kontrolovaném agregačním stavu, kde tento roztok obsahuje případně

c) další farmaceuticky akceptovatelná aditiva jako jsou látky kontrolující a/nebo stabilizující agregaci proteinů, přičemž je získán pravý roztok obsahující uvedenou aktivní látku a uvedenou proteinovou frakci, které jsou navzájem vázány nekovalentními vazbami;

d) odstranění organického rozpouštědla a lyofilizaci roztoku, nebo jeho zakoncentrování.
26. Způsob podle kroku a) kteréhokoli z nároků 23 až 25, vyznačující se tím, že pro rozpuštění aktivní látky je použito rozpouštědlo mající následující vlastnosti:

a) je schopno úplně rozpustit aktivní látku v své směsi s vodou a

b) směs s méně než 50% nedenaturuje použitý protein.
27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se použije rozpouštědlo ze skupiny alifatických C2-C4 monoalkoholů, nebo polyalkoholů, 70-100% ethanol, dimethylformamid, methylformamid.
28. Způsob podle kroku a) kteréhokoli z nároků 23 až 27, vyznačující se tím, že jako látka kontrolující a/nebo stabilizující agregaci proteinů je použita některá z následujících látek: voda, • 9 • ·

9 ·

9 9 9 9 ýý žrh chlorid sodný, pufr, polyalkohol jako je glycerol a/nebo ve vodě rozpustné deriváty cukrů s výhodou manitol, sorbitol a/nebo dulcitol.
29. Způsob podle kroku a) kteréhokoli z nároků 23 až 25, vyznačující se tím, že se použije paclitaxel a složky přírodní plasmy jako je sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo rekombinantní analoga uvedených složek plasmy.
30. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek obsahující alespoň jednu aktivní látku ze skupiny obsahující amphotericin B, analoga adriamicin, apazon, azathioprin, bromazepam, camptothecin, carbamazepin, clonazepam, cyclosporin A, diazepam, dicumarol, digitoxin, dipyridamol, disopyramid, flunitrazepam, gemfibrozil, ketochlorin, ketoconazol, miconazol, niflumová kyselina, oxazepam, fenobarbital, fenytoin, progesteron, propofol, ritonavir, sulfinpyrazon, suprofen, tacrolimus, tamoxifen, taxonoid, testosteron, tirilazad, trioxsalen, valproová kyselina a/nebo warfarin.

a také obsahující alespoň jeden protein ze skupiny obsahující lidský sérový albumin, imunoglobulin, glykoprotein, interferon a/nebo interleukin, nebo rekombinantní analoga uvedených složek lidské plasmy.
31. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek podle nároku 30, obsahující taxonoid obecného vzorce I, kde

R¹ představuje amid tert. butyl-oxy-karboxylové kyseliny, nebo benzoyl amid této kyseliny

R² představuje vodík, nebo acylovou skupinu s výhodou acetyl. a frakci plasmatických proteinů.
32. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek podle nároku 30, obsahující paclitaxel a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský sérový albumin a/nebo γ-globulin.
33. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek podle nároku 30, obsahující amphotericin B a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský sérový albumin a/nebo γ-globulin.
34. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek podle nároku 30, obsahující camptothecin a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský sérový albumin a/nebo γ-globulin.

• · φ φφφ · · φφφ · · · φ φφ φ φ φφ φ φ φφ · • Φ φφ φφ ·φ φ» φφ

58· • φφφ
35. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek podle nároku 28, obsahující carbamazepin a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský sérový albumin a/nebo γ-globulin.
36. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek podle nároku 28, obsahující cyklosporin A a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský sérový albumin a/nebo γ-globulin.
37. Homogenní, pevný, ve vodě rozpustný přípravek podle nároku 30, obsahující propofol a lidský sérový albumin, rekombinantní lidský sérový albumin a/nebo γ-globulin.
38. Způsob léčby lidských, nebo veterinárních pacientů pomocí ve vodě nerozpustných terapeuticky aktivních látek majících dostatečnou afinitu k plasmatickým proteinům charakterisovaný tím, že pacientům, kteří potřebují léčbu uvedenými aktivními látkami, je podávána efektivní dávka následujících přípravků s výhodou využívajících následující rozsahy dávek, vypočítáno vzhledem k obsahu aktivní látky: paclitaxel/albunim 70-280 mg/kg/hodina; propofol/albumin 6-10 mg/kg/hodinu; camptothecin/albumin, gemfibrozil/albumin, cyclosporin A/ albumin 3-5 mg/kg/den; amphothericin B/albumin do 1,5 mg/kg/den, kde stejný rozsah dávek je použit pro přípravky obsahující rekombinantní proteiny.
40. Způsob parenterálního podání při terapeutickém použití farmaceuticky aktivních látek se špatnou rozpustností ve vodě a dostatečnou vazebnou afinitou pro vazbu k plasmatickým proteinům charakterisovaný tím, že pacientům, kteří potřebují léčbu uvedenými aktivními látkami, je podávána efektivní dávka přípravku podle, nebo připravené podle, kteréhokoli z nároků 1 až 19.
41. Přípravek, nebo způsob v podstatě stejný jako ten v kterémkoli z příkladů.