CS276467B6

CS276467B6 - Pharmaceutical antiviral preparation

Info

Publication number: CS276467B6
Application number: CS884413A
Authority: CS
Inventors: Anna Dr Szabolcs; Laszlo Dr Otvos; Janos Dr Sagi; Helga Dr Tudos; Attila Dr Szemzo; Zsuzsa Dr Veres; Istvan Dr Szinai; Miklos Dr Vajda; Istvan Csernus; Katalin Dr Marossy; Sandor Dr Jancso; Eva Dr Medgyesi; Gyorgy Dr Bacsa
Original assignee: Mta Koezponti Kemiai Kutato In; Biogal Gyogyszergyar
Priority date: 1987-08-07
Filing date: 1988-06-23
Publication date: 1992-06-17
Also published as: GR1000139B; DD270656A5; IT8820871A0; SE8802193D0; KR960015953B1; SG42292G; FR2619010B1; GB2207864A; DK299088D0; IT1217789B; NL8801411A; JPH0515694B2; CS441388A3; KR890003380A; AU1741388A; SE503261C2; HU196038B; NO882491D0; RU2035180C1; ES2010559A6

Description

Vynález sa týká farmaceutického protlvirového přípravku ve formě masti s obsahem 5-isopropyl-2-beta-deoxyuridlnu, hromadícího se v kůži.

Dosavadní stav techniky

Je dobře známé, že počet infekcí způsobených virem herpes se neustále zvyšuje přes rozsáhlou lékařskou vzdělávací kampaň a dosavadní výsledky chemoterapie. Proto stále vzrůstá potřeba protivirovýoh přípravků pro vnitřní použití, Jako jsou tablety, injekce, infusní roztoky atd. (Saral, R. a další: R. Eng. J, Med. 305, 63-67, 1981). Iři terapii infekcí způsobených virem herpes se také používá přípravků pro zevní použití.

5-substituované 2’-deoxyuridiny obsahující také atomy halogenu v substituentu jako /E/-5-chlorvinyl-2'-deoxyuridin, /E/-5-bromvinyl-2^z-deoxyuridin a /E/-5-Jodvinyl-2'-deoxyuridín jsou velmi účinnými sloučeninami proti infekcím způsobeným virem herpes (De Clercq, E. a Walker, R. T.: Pharm. Therapy 26, 1, 1984). Z 5-substituovaných 2'-deoxyuridinů obsahujících atomy halogenu byl také zaveden do lékařské praxe 5-jod-2^,-betadeoxyuridin, jako účinná složka četných protivirovýoh přípravků pro zevní použití přesto, že má nízkou chemickou stálost a toxické rozkladné produkty (Prusoff, W. H. a Goc, B.: v Sartorelll, A. C. a Jones, D. G.: Antineoplastic and Immunosuppressive Agents, část II, str. 272 až 347, Springer New York, 1975).

Z pyrimidlnových derivátů byly 5-alkylsubstituované 2’-beta-deoxyuridiny zkoušeny také na protivirovou účinnost. Za podmínek in vitro projevovaly tyto sloučeniny mnohem nižší účinnost než halogenované deriváty (De Clercq, E. a další: Curr. Chemother., 352 až 354, 1978).

E, De Clercq prováděl in vitro testy 5-substituovaných 2*-deoxyuridinů proti viru herpes simplex typu 1 /Proo. of the 4th Int. Round Table an Ruoleosides, Ruoleotides and Their Biological Applications, Antmerpen, 1981/. Pibroplastové buněčnaté kultury čerstvě izolované z lidského embrya se infikují virem herpes HSV - 1/HTL jak uvedeno v literatuře/. Změnou koncentrace infekčního viru se stanoví dávka viru způsobující oytopatogenní účinek u 50 % infikované buněčnaté kultury ^TCID^q f tkáňové kultury infekční dávka 50 %//. Buněčnaté kultury se infikují zkoušeným virem v koncentraci odpovídající TCID^q a k infikované buněčnaté kultuře se přidá roztok 5-substituovanóho 2*-deoxyuridlnového derivátu rozpuštěného v živném prostředí v různých koncentracích. Živné prostředí: Mlnimal Essential Medium Eagle /MEM, GEBCO/ with Earles Salta. Toto se doplní při pokusech 10% telecím sérem, 10 IU/ml penicilinu a 100 <ug /ml streptomycinu při pH 7,4. Touto metodou se může stanovit minimální koncentrace účinné složky požadované ke snížení TCID^q hodnoty viru jednou logaritmickou jednotkou. Výsledky získané tímto způsobem a dobře charakterizující účinnost sloučenin jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Zkoušená sloučenina	Minimální inhibiční koncentrace proti HSV-1 /jug/1/
5-Bromviny1-2'-de oxyurid in	0,008
5-Ethy1-2’-d e oxyurid in	0»5
5-j od-2*-d eoxyurid in	0,13
5-Is opropy1-2'-d eoxyurid in	4

Údaje v tabulce 1 ukazují, že 5-isopropyl-2'-beta-deoxyuridin vzorce I projevuje antiherpetickou účinnost o jeden řád nižáí než je účinnost jiných 5-substituovaných 2'-beta-deoxyuridinů a je prakticky neúčinný proti virům herpes simplex in vitro.

Toto zjištění je v dobré shodě s údaji K. K. Gauri a R. D. Walter (Chemotherapy 18, 269, 1973)» kteří usoudili, že 5-isopropyl-2'-beta-deoxyuridin se nemůže aplikovat při terapii viru herpes.

Úkolem vynálezu je vyvinout farmaceutický přípravek pro zevní použití, který se může aplikovat účinněji než dřívější přípravky pro dermatologické léčení poruch způsobených různými viry herpes.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je farmaceutický protivirový přípravek ve formě masti s obsahem 5-isopropyl-2'-beta-deoxyurÍdinu hromadícího se v kůži při aplikaci ve vhodném nosiči, ředidle a dalších přísadách běžně používaných při výrobě farmaceutických přípravků pro zevní použití, obsahující 0,02 až 5 g 5-isopropyl-2'-beta-deoxyuridinu a 95 až 99»2 % hmot. nosiče jako Polysorbátu 60, parafinového oleje, Cetylstearylalkoholu, bílé vaseliny a glycerinu.

Vynález je založen na poznatku, že 5-isopropyl-2'-betadeoxyuridin aplikovaný na kůži ve vhodném nosiči se hromadí v kůži a proto má vynikající protivirové vlastnosti.

Tabulka 2 shrnuje výsledky farmaceutických zkoušek. Studie byly prováděny β 5-isopropyl-2'-beta-deoxyuridinem značeným ^C. Výsledky ukazují, že mast obsahující 5-isopropyl-2'-betadeoxyuridin aplikovaná na kůži se během 15ti minut úplně resorbuje. Neočekávaně se zjistilo, že 20 až 29 % resorbované účinné složky se hromadí v kůži a její koncentrace zůetane po 8 hodin prakticky nezměněna.

Vynález je dále založen na poznatku, že hromadění účinné složky v kůži je velmi selektivní. To znamená, že 75 až 80 % resorbované dávky vstupuje do krevního oběhu a tělesných orgánů, ze kterých se rychle eliminuje. V orgánech uvedených v tabulce 3 poklesne koncentrace 5-isopropyl-2'-deoxyuridinu během 3 až 6 hodin pod detekovatelnou hladinu.

Tabulka 2

Doba	Celková radioaktivita	Radioaktivita měřená
/min/	reBorbováná	v kůži
	vyjádřeno jako procento radioaktivity

aplikované

15	27,9	9,25
30	30,5	6,60
60	32,9	7,70
120	30,8	6,00
180	26,0	7,25
240	20,7	5,90
480	26,7	5,40

Tabulka	3
Doba /h/	Relativní radioaktivita	dpm/mg orgán dpm/mg kůže
	kůže	mozek	ledvina	játra	slezina	plíce
0,25	1,00	0,0006	0,01	0,008	0,005	0,008
0,50	1,00	0,0004	0,005	0,010	0,005	0,008
3,00	1,00	0,0001	0,003	0,002	0,002	0,002
6,00	1,00	0,0001	0,001	0,002	0,002	0,002

Údaje v tabulce 3 jasně indikují, že se radioaktivní složka hromadí z uvedených orgánů hlavně v kůži, to je, že resorpce 5-isopropyl-2'-deoxyuridinu do tkáně kůže je selektivní.

Konečně je vynález založen na poznatku, že 5-isopropyl-2'-/^-deoxyuridin, jako opak dalších pyrimidinových nukleosidů známých pro lékařskou aplikaci, je značně stálý oproti degradujícím enzymům, které štěpí nukleosidy na bázi a 2-deoxyribóza-l-fosfát. Toto bylo zkoušeno enzymatickými reakcemi a metabolickými pokusy in vivo provedenými s 5-isopropyl-2*-deoxyuridinem značeným ^C, Na obrázku 1 je ukázána rychlost štěpení thymidinu, 5-ethyl-2'-/ -deoxyuridinu /EDU/ a 5-isopropyl-2'-/J-deoxyuridinu /IPDU/ enzymem fosforylázou.

Obrázek 2 ukazuje metabolické produkty identifikované v moči myší léčených 5-isopropyl-2'-/j-deoxyuridinem /1/ /i.p. 200 mg/kg/. Tento obrázek ukazuje, že 80 až 85 % 5-isopropyl-2-'-deoxyuridinu /1/ je eliminováno z těla v nezměněné formě, zatímco pouze 2 až 5 % je eliminováno ve formě 5-isopropyluracilu a 10 až 15 % ve formě 5-/1-methy1-2-hydroxyethyl/-2'-deoxyuridinu.

V pokusech bylo také zjištěno, že 5-isopropyl-2'-/J-deoxyuridin t je prakticky netoxický, neprojevuje mutagenní nebo teratogenní účinek a nevyvolává poškození kůže nebo alergii, i když ee aplikuje v několikanásobku terapeuticky účinné dávky. Na základě těchto příznivých vlastností může být 5-isopropyl-2^,-z^ -deoxyuridin výhodně použit jako účinná látka protivirově směsi pro dermatologické použití, především proti viru herpes.

Na základě výše uvedených poznatků se vynález týká farmaceutické protivirové směsi pro zevní použití, hromadící se v kůži. Tato směs obsahuje 0,02 až 5 % hmot. 5-isopropyl-2^,-/í-daoxyuridÍnu společně s nosičem, ředidlem a/nebo dalšími přísadami běžně používanými při výrobě farmaceutických směsí pro zevní použiti.

Protivirová směs podle vynálezu se může připravit smícháním 0,02 až 5 % hmot. 5-isopropyl-2^>-/J-deoxyuridinu s nosičem, ředidlem a/nebo dalšími přísadami běžně používanými při výrobě farmaceutických směsí pro zevní použití.

Farmaceutická protivirová směs podle vynálezu obsahuje pro oftalmologickó účely 0,1 až 1 % hmot. 5-isopropyl-2^z-/5 -deoxyuridinu s nosičem, ředidlem a/nebo dalšími přísadami běžně používanými při výrobě farmaceutických směsí.

Farmaceutické směsi podle vynálezu projevují pozoruhodnou protivirovou účinnost. Mohou se připravit ve formě masti, gelu, emulze, suspenze, roztoku, spreye, adhezní látky, atd. Obsah účinné složky v protivirových směsích se mění podle způsobu aplikace a léčení. Uspokojivé výsledky se mohou obecně získat aplikací 0,3 až 2 % hmot. 5-isopropyl-2*-/3-deoxyuridinu na kůži.

Pro přípravu farmaceutických směsí podle vynálezu se může především použít lanolin, vazelína, polyethylenglykol, vosky, dále voda a organická rozpouštědla jako ethanol. V závislosti na typu směsi se mohou také použít stabilizátory, emulgační činidla, povrchově aktivní látky a barviva a další přísady.

Farmaceutická směs podle vynálezu může také obsahovat kromě 5-lsopropyl-2*-/^-deoxyuridinu dalši biologicky účinné látky, například antiflogistické přípravky jako chloramfenikol, kožní trankvilizery jako azulen, kožní vysoušedlo jako oxid zinečnatý, atd.

Farmaceutické směsi podle vynálezu se mohou připravit obecně známými farmakotechnologickými postupy.

5-isopropyl-2*~/?-deoxyuridin je známá sloučenina a může se připravit postupem popsaným v literatuře, například: Szabolcs, A., Sági, J. a <5tvó's, I.: Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides 2, 197-211 /1975/j Nucleic Acids Res. 1, 49 až 52 /1975/. Fyzikální charakteristika sloučeniny je následující: bílý, krystalický, nevonící prášek se slabě hořkou příchutí. Teplota tání: 181 až 183 °C. Sloučenina je rozpustná ve vodě, methanolu a ethanolu, rozpustnost při teplotě místnosti je 7,9 mg/cm^,

25,4 mg/cm^ a 11 mg/cm^. Je prakticky nerozpustná v benzenu, chloroformu a diethyletheru. Může se skladovat léta při teplotě místnosti bez rozkladu.

Při Chromátografii na tenké vrstvě na silikagelu /Merck/ za použití směsi ethylacetát-methanol /95 : 5/ je hodnota R_f 0,43. Maximum ultrafialové absorpce bylo zjištěno při 267,4 0,4 nm s koeficientem molární extinkoe 9 500 í 400; n = 50/.

Toxikologické zkoušky a zkoušky neškodnosti na kůži

Akutní toxicita

Hodnoty akutní toxicity se stanovily na myších, krysách a králících. Sloučenina se podávala zvířatům intraperitoneálně během 14 dní a byly získány následující hodnoty LD₅₀ :

Myši;

Krysy;

Králíci

920 mg/kg 820 mg/kg

000 mg/kg

30ti denní toxicita u krys

Zvířatům se podá intraperitoneálně denní dávka 5 až 50 mg/kg účinné složky během 30 dnů. Během zkušební periody nebyl pozorován žádný rozdíl mezi léčenými a neléčenými /kontrolními/ zvířaty. Nebyly pozorovány žádné rozdíly ve zvýšení hmotnosti, přijímání potravy, ani poruchy nervového systému a uhynutí. Výsledky obdukce se netýkaly žádného účinku spojeného se změnami toxicity.

6týdenní akutní a subakutní toxikologické testy na králících

Zvířatům se podá intraperitoneálně denní dávka 3sž3O mg .účinné složky. Ani během 6 týdenního léčení ani během dalšího 2týdenního pozorovacího období se nepozorovaly toxické symptomy, změny tělesné hmotnosti a žádné uhynutí. Pitvou se nezjistily žádné histologické lese.

Mutagenní a karcinogenní účinek účinné složky jak stanoveno Ames testem

Pokusy ss provádějí za použití mutant bakterie Salmonella typhimurium. Při pokusech se aplikuje vodná suspenze nebo roztok 0,125 až 8,0 % hmot. 5-isopropyl-2^,-^-deoxyuridinu, dále pevná práškovitá forma účinné složky. Při studiu bylo použito difusního - reverzního testu, kapalného - reverzního testu /Ames, B.N. et al.; Proč. Natl.Aoad.Sci. USA 71. 2281/1973/, a dalších testů s S9 frakcemi /Ames, B.N. et al.: Mutat.Res. 311, 347 /1975/. Nebyly pozorovány ani mutagenní ani karcinogenní účinky.

Zkouška mutagenicity, teratogenicity a embryotoxioity za podmínek in vivo

Tyto pokusy se provádějí za použití Rousselova Mouše Spot Test /Roussel, L.B. s Majos, M.H.: Genetice 42, 161-175 /157/Roussel, L.B. et al.: Mutation Res. 86,

355 až 359 /1981/ na myších C57/BL. Aplikuje se fyziologický roztok 5-isopropyl-2'-á-deoxyuridinu při koncentraci 460 a 230 mg/kg. V případě dávky 230 mg/kg, která je 45 x vyšší než terapeutická dávka, se nepozoroval ani mutagenní a embryotoxický ani teratogenní účinek.

Resorpční test

Pokusy se provádějí na šátečcích'. bílých myší CPLP o tělesné hmotnosti 23 až 25 g za použití masti připravené podle příkladu 1 obsahující 0,8 % hmot. 5-isopropyl-2 - ó-deoxyuridinu značeného ^C. Mast se použije v dávce 50 mg/živočioh, Pro každý pokus se použije 5-5 zvířat. Břišní kůže zvířat se zbaví chlupů Depilanem /registro· váná ochranná značka, Hamol International, Krk, Jugoslávie/. 24 hodin po zbavení chlu p

pů se zvířata hřbetně upevní a mast se aplikuje na plochu 2 om kůže zbavené chlupů. Upevněná zvířata se udržují v metabolické komoře po dobu 8 hodin, potom se povrch ošetřené kůže očistí a zvířata se nechají volně pohybovat až do konce pozorovacího období. Doba pozorování byla 15, 30, 60, 120, 180, 360 a 480 minut. Stanovila se radioaktivita setřeného materiálu a nahromaděná v různých orgánech léčeného zvířete /kůže, krev, játra, slezina, ledviny, plíce a mozek/ společně s radioaktivitou v moči zvířat shromážděné během 24 hodiny. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Doba /min/	Radioaktivita šetřená /%/	Radioaktivita resorbováná /%/
0	100	0
15	72,1	27,9
60	67,1	32,9
120	68,2	30,8
180	74,0	26,0
240	79,3	20,7
480	73,3	26,7

Podle údajů v tabulce 4 se radioaktivita resorbovaného materiálu prakticky nezměnila po prvních 15 minutách, tzn., že radioaktivní materiál se resorbuje do kůže z masti během 15ti minut a zůstane v kůži velice dlouhou dobu. Množství radioaktivity naměřené v kůži, krvi a dalších orgánech indikuje, že 20 až 35 % účinné složky se resorbuje z masti a 65 až 80 % tohoto množství se rychle eliminuje z různých orgánů. Údaje ukazují, ža radioaktivní materiál se může detekovat pouze ve stopovém množství 3 hodiny po ošetření /tabulka 3/.

Na druhé straně se radioaktivní materiál dobře hromadí v kůži a jeho koncentrace zůstane přibližně nezměněna po 8 hodin, jak je jasně indikováno údaji v tabulce 2.

Test snášenlivosti

Výzkum se provádí s bílými myšmi o tělesné hmotnosti 25 až a 30 g. Kůže zkoušep ných myší je zdravá nebo zjizvená. 2 až 3 cm plochy myší se denně ošetřují mastí obsahujíoí 2,5 % hmot. 5-isopropyl-2'’-/J-deoxyuridinu po 6 týdnů. Kontrolní skupina myší se ošetří mastí neobsahující žádnou účinnou složku.

Po ošetření se zvířata 2 týdny pozorují. Nebyly detekovány u ošetřených myší Žádné zmšny /podráždění kůže, alergické projevy nebo zapálení/ ani během léčení ani po dobu pozorování. Nebyly také detekovány žádné histopatologioké změny.

Klinické testy

Klinické pokusy se provádějí u pacientů s diagnózou infekčního viru herpes simplex, herpes genitálie a herpes zoster. V závislosti na onemocnění se pacienti léčí 3 až 5x denně po dobu 5 až 10 dní farmaceutickou směsí podle vynálezu. Klinické testy se provádějí se zdvojeným slepým pokusem. Účinnost směsi podle příkladu 1 /A/ se zkouší ve srovnání s obchodně dostupnou mastí· 5-jod-2'-/4-deoxyuridinew /0/ a mastí, která neobsahuje žádnou účinnou složku /B/. Výsledky klinických testů jsou uvedeny v tabulce 5,

Tabulka 5

Účinek	Herpes simplex	Herpes genitalis	Herpes zoster
A	B	C	A ”B”	C	A	l»B« ItQlt
Vynikající	31	6	14	11	0	10	16	0	3
Přiměřený	9	10	13	7	2	6	7	2	1
Mírný	9	10	9	3	5	5	3	5	3
Neúčinný	1	24	14	0	13	1	0	1	3
Poškození	1	1	1	1	1	0	0	0	0
Počet pacientů	51	5.1	51	22	21	22	26	8	10

A Mast 5-isopropyl-2'-A-deoxyuridin

B” Mast bez účinné složky

C Mast obsahující 5-jod-2*-/3-deoxyuridin /kontrola/

Hlavní výhody směsi a způsobu podle vynálezu jsou následující:

a/ Účinná složka směsi se rychle a selektivně resorbuje do kůže, kde se hromadí a tímto způsobem se může dosáhnout žádaného účinku použitím směsi s nízkým obsahem účinné složky.

b/ Jako důsledek místní aplikace směsi je množství účinné složky menší, než v případě použití směsi pro vnitřní aplikaci.

c/ Účinná složka směsi je neobyčejně stálá. Teto stálost také přispívá k příznivým výsledkům získaným se směBÍ s nízkým obsahem účinné složky.

Směs a způsob podle vynálezu jsou detailně objasněny v následujících příkladech, aniž by byl omezen rozsah vynálezu.

Příklad 1

Mast pro dermatologické použití

5-Isopropyl-2'-^-deoxyuridin 8 g Polysorbát 60 /Ph, Hg. Vil. 731/ 36 g Kapalný parafin 50 g Cetyl-stearylalkohol /Ph.Hg.VII,731/ 80 g Bílá vazelína 100 g Glycerin 200 g Bílý vosk 4 g Methylester p-Hydroxybenzoové kyseliny 2 g Destilovaná voda 500 g

Mast se může skladovat bez rozkladu alespoň 2 roky při teplotě místnosti

Příklad 2

Gel pro dermatologickou aplikaci

5-Isopropyl-2'-/$-deoxyuridin 1,0 g Methylcelulóza 4,0 g Glycerin 20,0 g Destilovaná voda 73,9 g Benzoát sodný 0,1 g Ethanol /96%/ 0,9 g Ethylester p-Hydroxy-betizoové kyseliny /nipagin/ 0,1 g

Iříklad 3

Mast pro oftalmologickou aplikaci

5-Isopropyl-2-,3 -daoxyurldin 0,8 g

Oční základ 999,2 g

Složení očního základu je následující?

Cara lanae /lanolínový alkohol/ 50 g /Ph Hg VII: 1088/

Paraffinura liquidum /kapalný parafin/ 250 g /Ph Hg VII: 1283/

Vaselinum album ophtalmioum /bílá vazelína/ 700 g

Claims

Farmaceutický protivirový přípravek ve formě masti s obsahem 5-isopropyl-2'-/í-deoxyuridiau hromadícího se v kůži při aplikaci ve vhodném nosiči, ředidle a dalších přísadách běžně používaných při výrobě farmaceutických přípravků pro zevní použití, vyznačující se tím, že obsahuje 0,02 až 5 g 5-isopropyl-2'-/í-ideoxyuridinu a 95 až 99,2% hmot, nosiče jako Polysorbátu 60, parafinového oleje, cetylstaarylakoholu, a bílé vasaliny a glycerinu.