CS208157B2 - Způsob výroby nových aminových derivátů glycerolů - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu výroby nových aminových derivátů glycerolů s protivircivým účinkem.

Virové infekce, které napadají savce včetně člověka, jsou nakažlivé a mohou způsobit velké zdravotní obtíže a hospodářské ztráty. Na neštěstí jsou objevy proitívirových sloučenin daleko složitější a obtížnější, než je tomu v případě antibakterlálních látek a sloučenin účinných proti houbám. Jde patrně o to, že tna překážku výzkumů je blízká strukturní příbuznost virů a některých podstatných složeik buněk, například kyseliny ribonukleové a dezoxyribonukleové. Přesto byla objevena řada protiviirových látek nevirového původu, to jest sloučenin, jimiž je možno předcházet nebo léčit virové infekce, nebo jde o· materiály, které podstatně zvyšují tvorbu protilátek, zlepšují jejich účinnost, zvyšují .nespecifickou odolnost, Urychlují uzdravení nebo snižují příznaky. [Herriman a další, Proč. Soc. Exptl. Biol. Med., 103, 625 (1960)]. Mezi protivirevá činidla patří například interferon a syntetické materiály, jako- amantadinhydrochloirid, pyrimidiny, trguanidy, guanidin, pteiridiny a meťhisazon. Protože každou z těchto· látek je možno léčit jetn několik máto virových infekcí, je nuitno nacházet nové syntetické protivirové látky, aby bylo možno lépe předcházet virovým infekcím a léčit je.

Buňky savců produkují při virové infekci látku, která umožňuje buňce inhibovat rozmnožování viru. Tyto· sloučeniny se nazývají inteirferony. Inteirferony jsou glyiko,proteiny, které se mohou lišit svými fyizikálněichemickými vlastnostmi, mají však stejné trolog'cké vlastnosti, a to inhiibici široké škály vzájemně nepřihnaných virů. Přitom tyto sloučeniny nemají toxické ani jiné nepříznivé účinky-na buňky a jsou specifické v rámci jednoho druhu. (Lockart, Fronťers of Biology, sv. 2, „interferons“, vydavatelství Fiinter, W. B. Saunders Co., Philadelphia, 1966, str. 19 až 20 j.

Až dosud nebyla navržena žádná hospodárná a prakticky použitelná metoda k výrobě exogenního interferonu pro- běžné chemické použiti. Byly proto· vyvíjeny snahy v jiném směru, aby bylo možno podat zvířatům nebo člověku, který má být chráněn proti infekci, látku nevirové povahy, která podporuje nebo vyvolá tvorbu iinterfercnu v buňkách. Interferon získaný tímto, způsobem se nazývá endogenní interferon.

V US patentu č. 2 738 351 se uvádí,, že sloučeniny obecného vzorce

Ri—X—CH₂ 1 I

CH—Z—ALK—B ,

I

Rz—Y—CHz kde znamenají

Ri a Rz alkyl, arylalkyl, aryl, cykloalkyl, aryl substituovaný nitroskupinou nebo- atomem halogenu, popřípadě alkylovou nelbo alkoxylovou skupinou,

X, Y a Z atom kyslíku, atom síry nebo sulfonylqvou skupinu,

ALK alkylen o 1 až 6 atomech ulhlíiku s přímým nebo- rozvětveným řetězcem a

B bijnižšíjalkylaminoskupinu, piperidinovou skupinu, morfolinoivou skupinu, pyrrolidinoivou skupinu, (nižší) alkylpyrrolidinovou skupinu, N‘-aikylpipeirazinoivou skupinu nebo pipekolinovou skupinu, jsou místní anestetika. Při vysvětlení různých cest k výrobě těchto sloučenin, například ive sloupci 1 na straně 11, v řádku 57 až 70 uvedeného· patentu, jsou uváděny meziprodukty svrchu uvedeného vzorce, v nichž B znamená aminoskupinu nebo- nižší alkylaminoskupinu. Žádná z uvedených sloučenin však neobsahuje ve významu Ri nebo Rz vyšší alkylovou skupinu než n-pentyl. Mimoto v žádné z uvedených sloučenin neznamenají oba substituenty Ri a Rz alkyl a X i Y atom kyslíku.

V japonském patentu č. J7-6O42-177 se uvádějí Injsekiticidlní a miticidní sloučeniny obecného· vzorce

Ri—CHz

CH-(CHz)_q-A ,

Rz—CHz kde znamenají

Ri a Rz mimo· jiné nižší alfcylthioskupinu, q 0 až 5, a

A mimo· jiné l-piperidinovou skupinu nebo di (inižšíalkyl) aminoskupinu.

•Nyní bylo zjištěno, že některé nové aminové deriváty di-O-(n-vyšší alkyl a alkenyl)glyceirolů jsou látkami, které moihou sloužit k potírání virových infekcí u savců.

Nové aminové deriváty glycerolů s pirotiviirovým účinkem obecného vzorce I,

CHz—Qi •CH—Q2 •CHz—OR2 , (I) jakož í z farmaceutického hlediska přijatelné adiční soli těchto sloučenin s kyselinami, kde jeden ze symbolů

Qi a Qz znamená skupinu —O—Y—NHR3 a druhý skupinu —ORi,

Ri a Rz znamenají alkyl s přímým řetězcem o 12 až 20 atomech uhlíku,

Y znamená alkylen o 2 až 4 atomech uhlíku, jehož valence se nacházejí na odlišných atomech uhlíku a

R3 znamená atom vodíku nebo alkyl o 2 až 4 atomech uhlíku, se vyrábějí .způsobem podle vynálezu, jehož podstatou je, že se

a) uvede v reakci sloučenina obecného vzorce II,

CHz—Qs •CH—Qe

CHz—OR2 , (Π) kde jeden ze symbolů

Qs a Qe znamená skupinu RiO— a druhý skupinu —O—Y‘—CHO,

Y‘ znamená alkylen o 1 až 3 atomech

jejichž levé vazby jsou spojeny s atomy kyslíku, se sloučeninou obecného vzorce NH21R3 za redukčních podmínek, a

b) popřípadě se takto získaná sloučenina vzorce I převede na svou z farmaceutického hlediska přijatelnou sůl s kyselinou.

Sloučeniny vyráběné způsobem podle vynálezu mají přímý protivirový účinek na celou řadu virů in vivo u savců a in vitro ve tkáňových kulturách buněk savců. Podstatná část tohoto účinku spočívá patrně v tom, že sloučeniny podle vynálezu vyvolávají v buňkách tvorbu iinterfercnu, jde tedy o endogenní interferon.

Pod pojmem ,,z farmaceutického hlediska přijatelné“ adiční soli s kyselinami se rozumějí soli, které jsou netoxické v užívaných dávkách. Jde o soli ve vodě rozpustné i nerozpustné, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, fosforečnany, dusičnany, sírany, octainy, hexafluorofosforečnany, citrónainy, glukonáty, beinzoáty, propionáty, máselnany, sulfosalieyláty, maleáty, lauráty, jablečnany, fumáráty, jantarany, šťavelany, vínany, amsonáty (4,4“-diaminosilben-2,2‘-disulf’Onáty), pamoáty (l,l‘-methylen-bis-2-hydroxy-3-naftoáty), stearáty, 3-hydroxy-2-naftoáty, p-toluensulfonáty, methansulfoináty, laktáty a soli se suramineim.

Výhodnými skupinami sloučenin obecného vzorce I jsou:

hydrochloridy těchto sloučenin:

látky, v nichž Ri a Rz znamená alkyl s přímým řetězcem o 14 až 18 atomech uhlíku;

sloučeniny, v nichž Ri a Rz znamenají alkyl s přímým řetězcem o 14 až 18 atomech uhlíku, přičemž obě skupiny jsou totožné; látky, v nichž Ri a R2 znamenají n-hexadecyl;

látíky, v nichž R3 znamená atom vodíku a Y znamená alikylen s přímým řetězcem o· 2 až 4 atomech uhlíku.

Zvláště cenné jsou následující sloučeniny a jejich z farmaceutického· hlediska přijatelné adiční soli s kyselinami:

1,3-di-O- (n-hexadecyl j -2-0- (3-aminopropyljglycerol,

1.2- di-O- (n-ihexadecyl j -3-0- (3-aimlnopr opyl) giycerol,

1.3- di-O- (n-hexadeicyl) -2-0- (meta-aimimomethy 1 b e nzy 1 j g lyc e r ol,

1,2-di-O- (n-hexadecyl)-3-0- (meta-aminomethylbeinzyl) giycerol,

1.2- di-O- (n-fetradecyl j -3-0- (imeta-aminomethylbenzyl ] giycerol,

1.3- di-O-(in-hexadecyl)-2-0-(meta-alminomethylfenyl jglyceirol,

1.3- di-O- (n-lhexadecyl) -2-0- (para-aminomethylf enyl j giycerol,

1,2-di-O- (n-hexadecyl j -3-0- (para-aminomethylfeinyl jglyceirol.

Adiční 'soli sloučenin obecného· vzorce I s kyselinami je možno· připravit běžnými způsoby, například tak, že se smísí aminový derivát ve vhodném rozpouštědle s požadovanou kyselinou a sůl ^lse izoluje odpařením nebo· vyisrážením po přidání ro>zpouštědla, v němž ise sůl neirozpouští. H^drochloridy lze snadno připravit tak, že Se neichá procházet chlorovodík roztokem aminového derivátu v organickém· rozpouštědle. Je zřejmé, že řada hydrochloridů nebo dihydrochloridů sloučenin obecných vzorců I obsahuje po· Izolaci určité množství vody. Není známo, jde-li o krystalovou vodu nebo o tvorbu skutečných hydrátů, avšak i tyto soli je možno zpracovat na farmaceutické přípravky a podávat bez předchozí dehydratace.

Výchozí 1,2-di-O-(n-vyšší alkyl jglyceroly je možno zíiskat způsobem podle publikace Kaíteís M. a další, Biochemistry, 2, 394 (1963). Výchozí 1,3-di-O-(n-vyšší alkyl )glyceroly je možno získat způsobem podle publikace Daimico R. a další, J. Lipid Res., 8, 63 (1967). Výchozí 1,2- a 1,3-di-O-(n-vyšší alkenyljglyceroly je možno získat způsobem podle publikace Baumain W. J. a Magold H. K., J. Org. Cihem., 31, 498 (1966J.

Protivirový účinek sloučenin obecného vzorce I byl stanoven dvěma základními na sobě nezávislými postupy. Při prvním postupu se zkoumaná látka podává myším intraperitoneálně 18 až 24 hodin před podáním smrtné dávky viru encefalomyokarditidy (EMC). 10 dní potom se zkoumá počet přežívajících myší a srovnává se s počtem myší, které přežívají bez ošetření. Postup se provádí tak, že se zkoumaná sloučenina podává daleko od místa, na němž se podává virus, takže je možno vyloučit vzájemné vlivy mezi účinnou látkou a virejm a zjistit pouze látíky, které skutečně systeimi,ciky zvyšují odolnost proti viru.

Při druhém postupu se jednoduché vrstvy buněk lidských nosních polypů pěstují na plotnách malých rozměrů. Tyto buňky se¹ pak uvedou ve styk se zkoumanými slouičeninalmi přibližně 18 .hodin před tím, -než se k buňkám přidá smrtná dávka viru vasikuláirní stomiatitidy (VSV). Zkoumaná látka se před nanesením viru z tkáňové kultury vymyje. Tekutina, která .se extrahuje z ploten ,po infekci, se titruje, aby bylo možno zjistit obsah viru, který je na kulturách myších fibroblastů L-929. Stanovené hodnoty se srovnávají s hodnotami z tkáňových kultur, které nebyly uvedeny ve styk se sloučeninami podle vynálezu. ·

Mimoto byla celá řada sloučenin vyráběných způsobem podle vynálezu zkoumána na svou schopnost zvýšit známou protivirovou účinnost poly/nosinqvé a polycytidylové kyseliny. Mimoto byly některé sloučeniny zkoumány na svoji schopnost indukovat tvorbu interferonu u myší po parenterálním podání způsobem· popsaným v publikaci Hoffman, W. W., a další, Antimicrobial Agents and Gheimotherapy, 3, 498 až 501 (1973).

Při parenterálním, místním nebo intranazálním podání svrchu uvedených aminů savcům před infekcí virem dochází k rychlému vzniku odolnosti proti viru. S výhodou by mělo k podání účinné látky dojít alespoň 2 dny nebo den před infekcí, přestože se tato hodnota poněkud mění podle druhu viru a podle druhu živočicha, kterému se sloučenina podává.

Sloučeniny obecného· vzorce I se nejsnadněji a nejhoispodárněji podávají v dispergované formě spolu is vhodným nosičem. Pokud jde o pojem, dispergované formy, jde o to, aby částice byly udrženy po jednotlivých molekulách v ppavém roztoku ,ve vhodném rozpouštědle, dále může jít o koloidní částice, které tvoří popřípadě suspenzi nebo eimulzi. Může také jít o částice rozptýlené v pevném nosiči, takže vzniká prášek. Takto· vyrobené směsi jsou vhodné k použití jako špiraye, ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí účinných látek podle vynálezu.

•Při parenterálním, tj. podkožním· nitirosvaloivém nebo intraperitoneálním podání sloučenin obecného vzorce I se užívá dávek 1 až 250 mg/kg živé hmotnosti, s výhodou 5 až 100 mg/kg živé hmotnosti, zvláště 5 až 50 mg/kg živé hmotnosti. Dávka samozřejmě závisí na druhu .savce, na aminu a je huitno· ji stanovit výsledkem, který se získá při prvním podání. Obvykle Se podávají na počátku imalé dávky, které se postupně zvyšují až do· dosažení optimálního účinku.

Pokud jde o nosiče pro parenterální podání, může jít o vodné kapaliny, jako jsou voda, isotoinfciký roztok chloridu sodného nebo· dextrózy, Ringerův roztok, nebo· jde o kapaliny nevodné povahy, například živo208137 čišiné nebo rostlinné oleje, jako je olej z lněných semen, arašídový, kukuřičný a sezamioivý olej, 'použít je však možno jakékoli rozpouštědlo, které neruší účinnost sloučenin obecného vzorce I a není toxické. Jde například o glycerol, ethanol, propylenglykol nebo scrbitol. Kapalné přípravky s obsahem sloučenin podle vynálezu molhou tedy obsahovat i siměis různých kapalných ředidel, jako jsou propylenglykol, diethylkarbonát, glycerol nebo sorbitol.

Při intrapazálním podání sloučenin obecného· vzoiree I je možno· užít jakéhokoli způsobu, kterým, lze uvést protivjroivou sloučeninu ve styk is dýchacím systémem savce. Účinnými metodami jsou například podání nolsmích kapek nebo podání kapek přímo do noisohltanu, inhalace a rozprašování ve formě aerosolu. Tyto způsoby jsou zvláště důležité, protože jsou snadnými, bezpečnými a účinnými způsoby podání. Při imtranazálním podání se obvykle užívá sloučenina obecného· vzorce I spolu s nosičem v koncentraci 1 až TOO mg/ml nosiče. Koncentrace 30 až 50 (mg/ml obvykle nejlépe vyhovuje.

Při místním podání se sloučeniny obecného vzoiree I také s výhodou užívají spolu s vhodným nosičem, zejména proto, aby bylo možno zajistit dokonalé vstřebávání. V tomto případě se užívá koncentrace 1 až 250 mg/ml. Obvykle se ve svrchu uvedených dvou způsobech podání podává celíkem 1 až '250¹ mg/kg sloučeniny obecného vzoiree I, s výhodou 5 až 50 mg/kg.

Sloučeniny vyráběné způsobem podle vynálezu je možno· užít jako takové nebo ve směsi s 'jednou nebo více pomocnými látkami nebo is dalšími léčivy, jako· jsou analgetika, anestetika, antiisepťka, látky snižující překrvení, antibiotika, vakcíny, pufry a anorganické soli. Mimoto je možno· tyto sloučeniny podávat ve směsi s hyailuiromidázou, aby bylo· možno vyloučit nebo snížit na co· nejmenší míru podráždění a zvýšit rychlost vstřebávání sloučeniny podle vynálezu. Uvedený enzym se užívá v dávce alespoň 150 jednotek, přestože ve výjimečných případech je možno užít nižší nebo vyšší dávky.

Sloučeniny obecného vzorce I, které jsou nerozpustné ve vodě, nebo ty, jejichž rozpustnost ve vodě je nízká, se s výhodou podávají v suspenzích nebo emulzích, které dovolují tvorbu částic o· rozměru nižším než 20 mikronů. Velikost částic totiž ovlivňuje biologickou účinnost sloučenin podle vynálezu, tento jev je patrně založen na lepším vstřebávání účinné látky. V přípravcích, které tyto látky obsahují, je možno užít i různá smáčedla a ochranné koloidy. Vhodnými smáčedly jsou například parciální estery běžných alifatických kyselin, jako jsou kyselina laurová, olejová nebo· istearová, s hexitolovými atnhydíridy odvozenými od sorbitolu, a polyoxyethylenové deriváty těchto esterů. Tyto sloučeniny se běžně dodávají pod obchodními názvy „Spanis“ a „Tweens“ a je možno· je získat od ICI United States lne., Wilmngtoin, Del. Ethery celulózy, zvláště methylether celulózy (methocel, Dow Chemical Co., Midland, Mich.j, jsou vysoce účinné jako ochranné koloidy pro použití v emulzích, které obsahují sloučeniny podle vynálezu.

Jsou-li sloučeniny obecného vzoiree I ve vodě rozpustné, je nejvýhodnější podávat je ve formě vodných roztoků, zejména ve fyziologickém roztoku s obsahem fosforečnanoivého pulru. Ve vodě nerozpustné sloučeniny se is výhodou podávají v přípravcích svrchu uvedeného typu. Vhodným rozpouštědlem pro sloučeniny nerozpustné ve vodě je například dimethylsulfpxid. Takový přípravek obsahuje například 25 až 100 mg zvolené účinné látky ve formě emulze ve směsi se stejným množstvím přípravku Polysorbát 80 ve ,směsi s glycerinem, ke siměši se přidá voda o teplotě 80 °C za energického míchání. Ke koncentrovanému roztoku se přidá chlorid sodný do konečné koncentrace 0,14 M a fosforečnan sodný o· pH 7 do konečné koncentrace 0,01 M. Tímto způsobem je možno získat například následující přípravek:

účinná látka	mg/ml 50,0
Polysorbát 80	50,0
glycerin	50,0
mioinohydrogeinfoisfát, hydratovaný	1,4
chlorid so^ný	7,9
voda	842,0

1001,3

V těch případech, v nichž dochází ke shlukování částic účinné látky, je možno užit ultrazvuku k získání homogenního systému.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

1,2-di-O- (n-hexadeeyl j -3-O- (2-iscpropylaiminoethyljglycerolhydrochlorid

A. l,2-di-O-(n-hexadecyl)-3-0-allylglycerol

1,78 g (37 mimolů) hydridu sodíku ve formě 50 o/_o (hmotnostně) ďaperze v minerálním oleji se přidá při teplotě 60 °C ik roztoku 10 g (18,5 mimolu) l,2-di-O-(n-ihexa•decyl jglycerolu ve 100 ml N,N-d^;methylfoirimamidu a výsledný roztok se míchá 20 minut při teplotě 60 °C. Pak se po kapkách přildá 4,47 g (37 imimolů) allylbírcmidu a výsledná směs se míchá 3 hodiny při teplotě 90 °C, pak se zchladí, opatrně se zředí 200 ml vody ik zastavení reakce a pak se extrahuje třikrát 150 ml etheru. Etherové extrakty se slijí, piromyjí se nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltrují a odpaří ve vakuu na olejovitou kapalinu, která se čistí chromatogiraflí na silikagelu, který se vymývá· benzenem. Tímto způsobem se ive výtěžku 93 % získá 10 g olejoivité výsledné látky.

NMR-spektrum (CDCb) δ:

5,66 až 6,16 (m, 1, —OCH2CH=CH2),

5,25 (d dublety, 2, —OCH2CH=CH2) a 4,03 (d, 2, —OCH2CH=CH2).

B. 1,2-di-O-(n-hexadecyl)-3-O-f ormylmethylglycerol mg (0,354 mmolu.) kysličníku osimičelého se přidá k roztoku 6,5 g (7,75 mmolu)

1.2- di-O-(n-hexaide'cyl)-3-O-allylglycerolu ve 120 ml směsi tetrahydrofuranu a vody v poměru 3:1a vzniklý roztok se smíchá 5 minut ipři teplotě místnosti. Pak se přidá 9 g (4'2 mimolů) jodisitainu sodného· a reakční roztok se míchá 16 hodin při teplotě místnosti v atmosféře dusíku. Pak se reakční roztok zředí 150 ml vody a extrahuje se 2lkirát 150 ml etheru. Etherové extrakty se slijí, promyjí se 150 .ml vody, vysuší se síranem hořeČnatým. a odpaří ve vakuu na olejovitou kapalinu, která se čistí chroimatografií na sloupci silikagelu, který se vymývá sttněisí benzenu a ethylacetátu, čímž se ve výtěžku 57 % získá 2,6 g voskovité pevné látky.

Spektrum v infračerveném světle v chloroformu má maximum při 1735 om^-1.

NMR-spektrum (CDCb) δ:

9,38 (t, J = 1 Hz, 1, —OCH2CHO) a 4,07 (d, J = 1 Hz, 2, —OCH2CHO).

C. Výsledná látka

0,1 g (1,6 mimolu) kyanoborohydridu sodíku se ipřidá k roztoku 1,:5 g (2,6 mmolu)

1.2- di-O- (n-hexadeicyl) -3-O-f ormylmethylglyícerolu a 0,89 g (15 mmolu) isoprcpylaimfhu ve směsi methanolu a tetrahydrcfurainu v poměru 1 : 1 v množství 50 ml a směs se míchá 2 hodiny při teplotě místnosti. Pak se upraví ipH na hodnotu 6 přidáváním 5 N methanolového roztoku kyseliny chlorovodíkové, přidá se ještě 1,1 g (1,6 mttnolu) kyanoborohydridu sodíku a realkčiní směs se míchá dalších 60 hodin při teplotě místnosti, pak se zfiltruje, přidá se 10 ml 3 N vodného roztoku hydroxidu sodného a 200 ml nasyceného vodného roztoku chloridu sodného, načež se směis extrahuje 2krát 150 ml etheru. Etherové extrakty se slijí, vyisuší se síranem hořeČnatým, zfiltrují a odpaří ve vakuu na olejovitou pevnou látku, která se čistí chromatografií na sloupci silikagelu, který se vymývá siměsí benzenu a ethanolu, načež se výsledná látka rozpustí v meitlhainolu. Roztok se smísí s plynným. chlorovodíkem a odpaří ve vakuu na pevnou látku, která se nechá překiryistalovat z ethylacetátu. Tímto způsobem )se ve výtěžku 23 % zíiská 400 img pevné látky o teplotě tání 71 až 72 °C. Tato látka obsahuje 1/4 molu vody na 1 mol produktu.

NMR-spektrum (CDCb) δ:

1,42 [d, J = 6 Hz, 6, —NHCH(CH3)2). Elementární analýza: vypočteno:

72,02 o/_o C, 12,76 % H, 2,10 Q/o N, nalezeno·:

71,89 % C, 12,34 % H,. ,2,09 '% N. Příklad 2

Účinnost l,3-di-O-(n-hexadecyl)-2-O- (3-amincprQpyl )glycerolhydiroehtoridu proti EMC viru in vivo

Přípravek ve formě emulze· byl připraven roztavením a promísením stejných dílů účinné látky, přípravku polysoirhát 80 a glycerinu s následnou disperzí směsi v horké vodě za energického míchání. Koncentrace směsi pak byla upravena na 0,14 M chloridu sodného s přídavkem; 0,01 M fosforečnanu sodného o pH 7. Další ředění bylo· prováděno pufrem, sestávajícím ze s-měisi 0,14 M chloridu sodného a 0,01 M fosforečnanu sodného o pH 7.

Třem skupinám samic bílých, myší o· hmotnosti 20 až 25 g bylo podáno· 1,5, 5 a 15 mg účinné látky na 1 kg ve formě intráíperítoneální injekce o objemu 0,5 ml. Čtvrtá, kontrolní skupina 10 myší byla ponechána bez ošetření. 18 až 24 hodin ,po podání injekce bylo podáno všem čtyřem Skupinám v objemu 0,2 ml ve formě podkožní injekce množství, rovné 20násohku LDso, tj. dávky, 'která způsobí uhynutí 50 o/₀ myší v průběhu 10 dnů, k injekci byl užit virus encefalomyokairditidy (EMC). V průběhu 10 dnů byl zaznamenáván počet přežívajících myší a byla zaznamenávána průměrná doba přežití (S_r).

Dávka účinné látky	Sr (průměr ze 7 pokulšů)
15 img/lkg	61
5 mg.kg	45
1,5 mg/kg	24

Protivírová účinnost se vyjadřuje jako· relativní doba přežití (S_r) v experimentálních skupinách ve srovnání s kontrolními skupinami 10. dine po injekci viru. Tato· hodnota je definována následujícím způsobem:

s,i,=1sl10 č = 1&Z.10

Ο'ΐ,

100 +100 xíOO (Li, i*1*i10 kde znamená

S_r poměrnou dobu přežití,

S_x procento přežití po 10 dnech v ipolkusiné skupině,

Xi počet přežívajících myší v den „i“ v pokusné skupině a ej počet přežívajících myší v den „i“ v kontrolní skupině.

Přikladl

Snížení výtěžku viru z buněk lidského pollypu in vitro* při použití l,3-di-O-(n-hexadecyl j -2-0- (3-amimopropyl j glyicerolhydrotchloridu

Růstové prostředí bylo připraveno tak, že 100 ml Eaglova základního prostředí bylo doplněno 2 ml lOOkrát koncentrovaného' roztoku pro pěstování materiálu k určení účinnosti s ohisahem antibiotika antimykotickýoh látek, 1 ml (200 mmolůj roztoku glutaminu, 1 ml lOOkrát koncentrovaného roztoku neelseinciálních aminokyselin, 1 ml roztoku pyrobroznamu sodného* o koncentraci 100 mimolů a 10 % fetálního telecího séira, inaktivovaného teplem. Bylo užito destiček pro mikirotitraci s 96 vyhloubeními, do každého z těchto vyhloubení bylo* vneseno 50 000 buněk lidského nosního polypu ve formě sušpenze v 0,2 ml růstového prostředí. Destičky pak byly inkulbovány 8 až 10 dní při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % kysličníku uhličitého, aby se vytvořily souvislé jednoduché vrstvy buněk.

_;Na konci 8 až 10 dnů růstu byly takto* získané vristvy buněk čtyřikrát promyty fyziologickým roztokem chloridu sodného s ohisahem fosfátového* pufru, načež bylo přidáno do' každého vyhloubení 0,2 ml udržoValcího prolstředí, které obsahovalo 10, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 a 0 jug/ml účinné látky. Udržovací pjroistředí mělo totéž složení jako růstové prostředí s tínn rozdílem, že obsahovalo pouze 2 % fetálního telecího* séra. Destičky byly inkuhovány dalších 18 hodin při teplotě 37 ^CC, načež byly vrstvy buněk znovu čtyřikrát promyty fyziologickým roztokem 's obsahem fosfátového* pufru, čímž byla odstraněna účinná látka, načež byla do* vyhloubení přiváděna dávka odpovídající 1000'krát TCID50, což je dávka, ktelrá způsobí '50% infekci u nechráněných ikultuir. Byl úžit virus veisikulární stomatitidy (VCV), 'který byl ponechán v kulturách 2 hodiny při 'teplotě 37 °C, pak byly kultury promyjty čtyřikrát fyziologickým roztokem chloridu sodného ;s obsahem, fosfátového pufru ik odstranění neadsorbovaných částic viru a do každého* vyhloubení bylo znovu přidáno* 0,2 ml udržovacího prostředí. Pak byly destičky inkubovány 7 hodin při teplotě 37 °*C, načež 'byla z každé destičky odehrána kapalina, tato kapalina byla skladována ve zmrzlém ‘stavu ive zkumavkách a byla titroiváma na množství infekčního viru při použití vyšších fibroiblaistů L-929. Tyto kultury myších buněk byly po 3 až 4 dnech analyzovány, v následující tabulce jsou uvedeny poklesy výtěžků viru proti kontrole, stanovené pro pět použitých koncentrací svrchu uvedené účinné látky.

Snížení výtěžku viru* v % Koncentrace účinné látky v (jug/ml)

5,0 1,0 0,5 0,1 % 90 % 84 % 75 % < 68 %

Přikládá

Způsobem podle příkladu 3 bylo* Stanoveno snížení výtěžků viru z buněk lidského* polypu in vitro i pro sloučeninu uvedenou v následující tabulce:

208137

Příklad Sloučenina vyrobena číslo· ,podle příkladu číslo % snížení výtěžku viru³ koncentrace (^g/ml)

5,0 1,0 0,5 0,1

11 (a) + ξ > 68o/_o snížení, + = ~ 68% snížení, + + — ND ND —- = < 68% snížení, ND ξ nebylo· provedeno.

Příklad 5

Schopnost 1,3-di-O- (n-hexadecyl )-2-0- (3-amimopropyljglyceirolhydrochíoridu vyvolat tvorbu interfeironu, kte(rý lze prokázat v oběhu

Siměs stejných hmotnostních dílů účinné látky, přípravku polysorbát 80 a glyceirolu se 'roztaví a pak se homogenizuje v horkém roztoku chloridu, sodného o koncentraci 0,14 M is obsahem 0,01 M fosforečnanu sodného· o· ipH 7 (PBS). Výsledná emulze typu olej ve vodě se dále ředí PBS před podáním.

Švýcarským myším samicím' o· hmotnosti 20 až 25 g ise podá ve formě intrapeiritoneální injekce o obsahu 0,5 ml množství zředěné emulze obsahující účinnou látku v dávce 25 mg/kg živé hmotnosti. 8, 12, 16 a 20 hodin po· injekci byly odebírány (vzorky pilazímy od čtyř myší a tyto vzorky byly slity. Sériové zředění v L-15 (Leibovitzově prostředí] s obsahem 5 % fetálního telecího jséra bylo· inikubováno na destičkách pro· mikřotiitraici přes noc při teplotě 37 °C na souvislé jednotlivé vrstvy imyšíích fibroblaistů L-929. Vrstvy pak byly omyty prostředím ppolstýto bílkovin, načež byly uvedeny ve styk s dávkou odpovídající lOtkrát TCIDso, což je dávka, která způsobí 50’% infekci v nechráněných kulturách. K infekci byl užit virus vezikulární stomatitidy (VSV), kteirý byl β kulturou ve styku 1 hodinu při teplotě 37 °C, neadsorbovaný virus byl vymyt a buňky byly znovu uvedeny ve styk s prostředím L-15 s obsahem 5 o/_o fetálního telecího séra, načež byly znovu inkubovány 48 hodin při teplotě 37 ^QC. Kultury L-929 byly pak mikroskopicky zkoumány na cytopatologické změny způsobené virem, přičemž bylo· (možno prokázat nepřímou závislost mezi hladinou interferonu v plazmě a poškozením fibroblaistů. Současně bylo· stanoveno· ředění plazmy, které může zaručit 50% ochranu jednoduchých vrstev buněk L-929.

Druhý (pokus byl proveden obdobným, způsobem, s tím rozdílem, že toyšta bylo injeikčně podáno 10 mg účinné láitky/kg a pak byly odebrány vzorky peritoneální tekutiny od čtyř myší a tyto· vzorky byly slity. Vzorky byly opět odebírány 6, 9, 12, 15 a 18 hodin po injekci. Vzopky byly odebírány talk, že po otevření břišní dutiny bylo vstřílknuto 1 mi Hankova vyváženého rozteku s obsahem 100 jednotek penicilinu/ml a 100 ,ug sltrepitomyjcinu/ml, pak se krátce masíruje břicho, načež se odebere z peritoneální dutiny kapalina.

Výsledky získané z obou pokusů jsou uvedeny v následující tabulce:

Zdroj interferonu 6

Zdroj interferonu Hladitía interferonu (jednotky/ml) po injekci v (h)

9 12 15 16 . 18 plazma — 34 peritoneální kapalina 16 — — 67 —

768 320 448 — 40 — 448 —

208137

Claims (4)

1. Způsob výroby nových aminových derivátů glycerolů s protiviirovým účinkem, Obecného wzoree I,

CHz— Qi

CH—Qž I

CHz— ORz , (I) jaikož i z farmaceutického· hlediska přijatelných adičních solí těchto sloučenin s kyselinami, kde jedem ze symbolů

Qi a Qz znamená skupinu —O—Y—NH.R3 a druhý skupinu —ORi,

Ri a Rz znamenají alkyl -s přímým řeitězceim o· 12 až 20 atomech uhlíku,

Y znamená alkylen o 2 až 4 atomech uhlíku, jehož valence se nacháizejí na odlišných atomech uhlíku a

R3 znamená atom, vodíku neib-o alkyl o 2 až 4 atomech uhlíku, vyznačující se tím, že se uvede v reatoci sloučenina Obecného- vizorce II,

CHz—Qs

CH—Qe

CH2—ORz , (II) kde jeden ze symbolů

Q5 a Q6 znamená skupinu RiO—, kde Ri má shora uvedený význam, a druhý skupinu —O—Y‘—CHO,

VYNALEZU

Y‘ znamená alkylen o 1 až 3 atomech jejichž levé vazby jsou spojeny v atomy kyslíku, se Isloučeminou obecného vzorce NH2R3, kde R3 má výše uvedený význam, za (redukčních podmínek, a popřípadě se takto získaná sloučenina obecného- vzoiree I převede na svou z farmaceutického· hlediska přijatelnou sůl is kyselinou,

2. Způsob jpodle bodu 1, vyznačující se tím, že se užije výchozího materiálu Obecného vizorce II, v němž Ri a Rz znamenají alkyl ,s přímým řetězcem o 14 až 18 atomech uhlíku.

3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se užije výchozího materiálu obecného vzorce II, v němž Ri a Rz znamenají n-hexadecylový zbytek.

4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se -tím, že ise užije výchozího materiálu obecného vzorce II, v němž Ri a Rz znamenají n-hexadecylový zbytek, Y‘ znamená methylem, přičemž jde o sloučeninu, v níž je skupina —O—Y‘—CHO v poloze 2.