CS208156B2

CS208156B2 - Způsob výroby nových aminových derivátů propandiolů

Info

Publication number: CS208156B2
Application number: CS791945A
Authority: CS
Inventors: Allen Richard Kraska
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1977-08-18
Filing date: 1979-03-23
Publication date: 1981-08-31
Also published as: CS208157B2

Description

(54) Způsob výroby nových aminových derivátů propandiolů

Vynález se týká způsobu výroby nových aminových derivátů propandiolů s protivircvým účinkem.

Virové infekce, které napadají siavce včetně člověka, jsou nakažlivé a mohou způsobit velké zdravotní obtíže a hospodářské ztráty. Na neštěstí jsou objevy protivirových sloučenin daleko složitější a obtížnější, než je tomu v případě a nti bakteriálních látek a sloučenin účinných proti houbám. Jde patrně o· to, že na překážku výzkumů je blízká strukturní příbuznost virů a některých podstatných složek buněk, například kyseliny .ribonukleové a delsoxyribonukleové. Přesto byla objevena řada protiviírcvých látek nevirového původu, to jest sloučenin, jimiž je možno předcházet nebo léčit virové infekce, nebo- jde o materiály, kteiré podstatně zvyšují tvorbu protilátek, zlepšují jejtoh účinnost, zvyšují nespecifickou odolnost, urychlují uzdravení nebo snižují příznaky. [Heirrman a další, Prcc. Soc. Exptl. -Biol. Med., 103, 625 (1960)]. Mezi protivínové činidla patří například interferon a syntetické materiály, jako aimantad'ohydrcidhloirld, pyrčmidiny, třguanidy, guapidin, .pterldiny a methisazon. Protože každou z tŠGíhto látek je možno léčit jen několik málo virových infekcí, je nutno· nacházet nové syntetické proti,virové látky, aby bylo možno lépe předcházet virovým infekcím a léčit je.

Buňky savců produkují při virové Infekci látku, která umožňuje buňce inhibovat rozmnožování viru. Tyto sloučeniny se nazývají interferony. Inteirf&rony jsou glykoppote'ny, kteiré se mohou lišit svými fyizikálněchenrcikými vlastnostmi, mají však stejné biologické vlastnosti, a to inhibici široké škály vzájemně nepříbuzných virů. Přitom tyto sloučeniny nemají toxické ani jiné nepříznivé účinky na buňky a jsou specifické v rámci jednoho· druhu. (Lockairt, Frontiers of Biology, sv. 2, „Interferons“, vydavatel Finiteir, W. B. Saun.de,rs Co., Philadelphia, 19'Q6, str. 19 až 20).

Až dosud nebyla navržena žádná hospodárná a prakticky použitelná metoda k výrobě exogeinníího· interfaronu pro běžné chemické použití. Byly proto vyvíjeny snahy v jiném směru, aby bylo možno podat zvířatům nebo člověku, který má být chráněn proti infekci, látku nevirové povahy, která podporuje nebo vyvolá tvorbu interferonu v buňkách. Interferom získaný tímto způsobem se nazývá endogenní interferoin.

V US patentu č. 2 733 351 se uvádí, že sloučeniny obecného vzorce

Rl—X—CHz

CH—Z—ALK—B ,

Rz—Y—CHz kde znamenají

Rl a Rz alkyl, aralkyl, aryl, cylkloalkyl, aryl, substituovaný nitroskupinou neíbo atomem halogenu, popřípadě alkylovou nebo alkoxylovou skupinou,

X, Y a Z atom kyslíku, atom síry nebo eulfoinylotvou skupinu,

ALK alkylem o 1 až 6 atomech uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem a

B bi (nižší jalkylaminoskupinu, piperiidinovou skupinu, morfolinovou skupinu, pyprolidinovou skupinu, (nižší)alkylpymrolidinovou skupinu, N‘-alkylpiperazinovou skupinu nebo pipekolinovou skupinu, jsou místní anestetika. Při vysvětlení různých ces't k výrobě těohto sloučenin, například ve sloupci 1 ma straně 11 v řádku 57 až 70 uvedeného patentu jsou uváděny meziprodukty svrchu uvedeného vzorce, v nichž B znamená aminoskupinu nebo nižší alkylaminoskupinu. Žádná z uvedených sloučenin však neobsahuje ve významu Ri nebo Rz vyšší alkylovou skupinu než n-pemtyl. Mimoto žádné z uvedených sloučenin neznamenají oba substituenty Ri a Rz alkyl a X i Y atom kyslíku.

V japonském patentu č. J7-6042-177 se uvádějí insekticidní a miticidní sloučeniny obecného vzorce

Rl—CHz

CH—(CHz)_q—A ,

Rz—CHz kde znamenají

Ri a Rz mimo jiné nižší alkylthioiskupiinu, q 0 až 5 a

A mimo jiné 1-piperidinovou skupinu nebo di,(nižší alkyl jaminoskupinu.

Nyní bylo zjištěno, že některé nové aminové deriváty di-O-(n-vyšší alkyl a alkenyl jglycerolů a -piroipandiolů jsou látkami, které mohou sloužit k potírání virových infekci u savců.

Nové aminové deriváty glyceirolů a propandiolů s protivínovým účinkem, obecného vzorce I,

né adiční soli těchto sloučenin s kyselinami, kde

Ri a Rz znamenají alkyl s přímým řetězcem o 12 až 20 atomech uhlíku nebo alkenyl o 12 až 20 atomech uhlíku, s výjimkou zbytků, které obsahují dvojnou vazbu v poloze 1, se vyrábějí způsobem podle vynálezu, jehož podstatou je, že se redukuje sloučenina obecného vzoirce II,

kde

Ri a R2 mají výše uvedený význam, a výsledná sloučenina obecného vzorce I se popřípadě převede na svou z farmaceutického hlediska přijatelnou adiční sůl s kyselinou.

Nové sloučeniny vyráběné způsobem podle vynálezu mají přímý protivirový účinek na celou řadu virů in vivo u. savců a in vitro ve tkáňových kulturách buněk savců. Podstatná čásit tohoto účinku spočívá patrně v tom, že sloučeniny podle vynálezu vyvolávají v buňkách tyorbu inteirfeironu, jde tedy o endogenní interferon.

•Pod pojmem „z farmaceutického hlediska přijatelné“ adiční soli s kyselinami se rozumějí soli, kíteiré jsou netoxické v užívaných dávkách. Jde o soli rozpustné i nepozpustné ve vodě, jako jsou hydrochloridy, hydrobromidy, fosforečnany, dusičnany, sírany, octany, hexafluorofosforeěnany, citirónany, glukonáty, benzoáty, propionáty, máselnany, sulfosalicyláty, maleáty, lauráty, jablečnany, fumaráty, jantarany, šťavelany, vínany, am,sonáty (4,4‘-diaminosilbein-2,2‘-disulfolnáty), pamoáty (l,l‘-methylem-bls-2-tiýdroxy-3-naftoáty), steairáty, 3-hydiroxy-2-maftoáty, p-toluen,sulfonáty, methansulfonáty, laktáty a soli se suraminem.

Výhodnou skupinou sloučenin vzorce I jsou hydrochloridy těchto sloučenin.

Dalšími výhodnými skupinami sloučenin vzorce I jsou:

látky, v nichž Ri a Rz znamenají alkyl s přímým řetězcem o 15 až 18 atomech uhlíku;

sloučeniny, v nichž Ri a Rz znamenají alkyl s přímým řetězcem o 14 až 18 atomech uhlíku, přičemž obě skupiny jsou totožné; látky, v nichž Ri a Rz znamenají n-hexadecyl.

Zvláště cenné jsou následující sloučeniny a jejich z farmaceutického hlediska přijatelné adiční soli s kyselinami:

1- [ 2,3-di- (n-oktadeicyloxy jpropyl ] -4-aminomethyl-4-fenylpiperidin, jakož i z farmaceutického hlediska přijatel208156

1- [ 2,3-di- (n-hexadecyloxy Jpropyl] -4-aiminomethyl-4-fenylpiperidin a

1- [ 2,3-di- (in-tetriadecyloxy )ipropyl] -4-aminomethyl-4-fenylpiperi'din.

Sloučeniny obecného vzorce I je možno získat z příslušného· l,2-di-O-(n-vyšší alkyl . nebo· alkenyl) glyceirolu známýtml způsoby. Například tosylový derivát výchozí látky je možno uvést v reakci se 4-kyano-4-feinylpiperidinhydrochloridem s následnou redukcí takto získané sloučeniny.

Adiční soli sloučenin obecného vzorce I s kyselinami je možno· připravit běžnými způsoby, například tak, že se smíisí aminový derivát ve vhodném rozpouštědle s požadovanou kyselinou a sůl se izoluje odpařením nebo vysrážením po přidání rozpouštědla, v němž se sůl nerozpouští. Hydrochloridy lze snadno připravit tak, že se nechá procházet chlorovodík roztokem aminového derivátu v organickém rozpouštědle. Je zřejmé, že řada .hydrochloridů nebo díhydrochloridů sloučenin obecného vzorce I obsahuje po· izolaci určité množství vody. Není známo·, jde-li o krystalovou vodu nebo o tvorbu skutečných hydrátů, avšak i tyto soli je možno zpracovat na farmaceutické přípravky a podávat bez předchozí dehydratace.

Výchozí l,2-di-O-(n-vyšší alkyl Jglyceiroly je možno· získat způsobem podle publikace Kateis M. a další, Biochemistry, 2, 394 (1963). Výchozí l,3-di-O-(.n-vyšší alkyl J glyceroly je možno získat způsobem podle publikace Darnico.R. a další, J. Lipid Res., 8, 63 (1967). Výchozí 1,2- a l,3-di-O-(n-vyšší alkenyl Jglyceroly je možno získat způsobem podle publikace Bauíman W. ). a Mangold Η. K., ). Org. Chem. 31, 498 (1966).

iProtiviirový účinek sloučenin podle vynálezu byl stanoven dvěma základními na sobě nezávislými postupy. Při prvním postupu se zkoumaná látka podává myššíni intraperitoneálně 18 až 24 hodin před podáním smrtelné dávky viru encefalomyokiarditidy (EMC). 10 dní potom se zkoumá počet přežívajících myší a srovnává se s počtem myší, které přežívají bez ošetření. Postup se pirovádí tak, že se zkoumaná sloučenina podává daleko od místa, na němž se podává virus, takže je možno vyloučit vzájemné vlivy mezi účinnou látkou a virem a zjistit pouze látky, které skutečně systeimiclky zvyšují odolnost proti viru.

Při druhém postupu se jednoduché vrstvy buněk lidských nosných polyipů pěstují na plotnách malých rozměrů. Tyto buňky se pak uvedou ve styk se zkoumanými sloučeninami přibližně 18 hodin před tím, než se k buňkám přidá smrtelná dávka viru vesikulátrní stomatitidy (VSV). Zkoumaná látka se před nanesením viru z tkáňové kultury vymyje. Tekutina, která se extrahuje z plote,ϊϊ infekci, se titruje, aby bylo možno· zjistit obsah viru, který je na kulturách myších fibrobilaistů L-929. Stanovené hodnoty se srovnávají s hodnotami z tkáňových kultur, které nebyly uvedeny ve styk se sloučeninami podle vynálezu.

Mimoto byla celá řada sloučenin podle vynálezu zkoumána na svou schopinolst zvýšit známou protivirovou účinnost polyiinoteinoivé a polycytidylové kyseliny. Mimoto byly některé sloučeniny zkoumány na svoji schopnost indukovat tvorbu interferonu u myší po parenterálním podání způsobem· popsaným v publikaci Hoffman, W. W., a další, Antiímicirobial Agents and Chemotheirapy, 3, 498 až 501 (1973).

Při parenterálním, místním nebo intirainazálníím podání svrchu uvedených aminů nebo amidinů savcům před infekcí virem dochází k rychlému vzniku odolnosti proti viru. S výhodou by mělo k podání účinné látky dojít alespoň 2 dny nebo dein před infekcí, přestože se tato hodnota poněkud mění podle druhu viru a podle druhu živočicha, kterému se sloučenina podává.

Sloučeniny podle vynálezu se nejsnadiněji a nejhospodárněji podávají v dispergované formě spolu s vhodným nosičem. Pokud jde o pojem, dispergované foirtmy, jde o· to, aby částice byly udrženy po jednotlivých molekulách v pravém roztoku ve vhodném rozpouštědle, dále může jít o koloidní částice, které tvoří popřípadě suspenzi nebo etoulzi. Může také jít o částice, rozptýlené v pevném nosiči, takže vzniká prášek. Takto vyrobené směsi jsou vhodné k použití jako spreje ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí účinných látek podle vynálezu.

Při parenterálním, tj. podkožním, nitro•svalovém nebo· intraperítoneálním, podání sloučenin podlé vynálezu se užívá dávek 1 až 250 mg/kg hmotnosti s výhodou 5 až 100 mig/ikg, zvláště 5 až 50 mg/ikg. Dávka samozřejmě závisí na diruhu savce a na aminu a je nutno ji stanovit výsledkem, který se získá při prvním podání. Obvykle se podávají na počátku malé dávky, které se postupně zvyšují až do· dosažení optimálního účinku.

Pokud jde o nosiče pro parentorální podání může jít o vodné kapaliny, jako jisou voda, isotonioký roztok chloridu sodného nebo· dextrózy, Ringerův roztok, nebo jde o· kapaliny nevodné povahy, například živočišné nebo rostlinné oleje, jako je olej z lněných semen, arašídový, kukuřičný a sezamový olej, použít je však možno jakékoli rozpouštědlo, které neruší účinnost sloučenin podle vynálezu ia nelni toxické. Jde například o glycerol, ethanol, piropylenglylkol nebo sorbitol. Kapalné přípravky s obisahem sloučenin podle vynálezu .mohou tedy obsahovat i směs různých kepalinýich ředidel, jako jsou propylenglylkol, diethylkarbonát, glycerol nebo sorbitol.

Při intranazálním podání sloučenin padle vynálezu je možno užít jakéhokoli způsobu, kterým lze uvést protivirovou sloučeninu ve styk s dýchacím systémem savce. Účinnými metodami jsou například podání nosních kapek nebo podání kapek přímo do nosohltanu, Inhalace a rozprašování ve foirmě aerosolu. Tyto způsoby jsou zvláště důležité, protože jsou snadnými, bezpečnými a účinnýlml způsoby podání. Při Intranazálnítm podání se obvykle užívá sloučenina podle vynálezu spolu s nosičem v koncentraci 1 až IDO mg/iml nosiče. Koncentrace 30 až 50 mg/ml obvykle nejlépe vyhovuje.

Při místním¹ podání se sloučeniny podle vynálezu také s výhodou užívají spolu s vhodným nosičem, zejména proto·, aby bylo možno zajistit dokonalé vstřebávání. V tomto· případě se užívá koncentrace 1 až 250 mg/ml. Obvykle se ve svrchu uvedených dvou způsobech podání podává celkem 1 až 250 mg/kg sloučeniny podle vynálezu, s výhodou. 5 až 50 mg/kg.

Sloučeniny podle vynálezu je možno užít jako takové nebo ve směsi s jednou nebo více pomocnými látkami nebo s dalšími léčivy, jako jsou analgetika, anestetika, antiseptika, látky snižující překrvení, antibiotika, waikcíny, pufry a anorganické soli. Mimoto je možno tyto sloučeniny podávat ve směsi s hyialuronidázou, aby bylo možno vyloučit .nebo· snížit na co nejmenší míru podráždění a zvýšit .rychlost vstřebávání sloučeniny podle vynálezu. Uvedený enzym se užívá v dávce alespoň 150 jednotek, přestože ve výjimečných případech je možno užít nižší nebo vyšší dávky.

Sloučeniny podle vynálezu, kiteiré jisou nerozpustné ve vodě nebo ty, jejichž rozpustnost ve vodě je nízká, se s výhodou podávají v suspenzích nebo emulzích, ktoré dovolují tvorbu částic o rozměru nižším než 20 mikronů. Velikost částic totiž ovlivňuje biolog ekou účinnost sloučenin podle vynálezu, tento jev je patrně založen na lepším vstřebávání účinné látky. V přípravcích, kiteré dy,to látky obsahují, je možno užít i různá smáčedla a ochranné koloidy. Vhodnými smáčedly jsou například parciální estery běžných alifatických kyselin, jako jsou kyselina laurová, olejová nebo stearová, s hexltclovými anhydridy odvozenými od sorbitolu a polyoxyethylenové deriváty těchto eísteirů. Tyto sloučeniny se běžně dodávají pod obchodními názvy „Spalns“ a „Tweenls“ a je možno je získat od ICI United States Inc., Wilmington, Del. Ethery celulózy, zvláště meithylether celulózy (imetihocel, Dow Chemical Co., Midland, Mich.), jsou vysoce účinné jako ochranné kolohly pro použití v emulzích, které obsahují sloučeniny podle vynálezu.

Jsou-li sloučeniny podle vynálezu ve vodě rozpustné, je nejvýhodnější podávat je ve formě vodných roztoků, zejména ve fyziologickém roztoku s obsahem fosfoireěnanového pufru. Ve vodě nerozpustné sloučeniny se s výhodou podávají v přípravcích svrchu uvedeného typu. Vhodným rozpouštědlem pro sloučeniny nerozpustné ve vodě je například dimethylsulfoxid. Takový přípravek obsahuje například 25 až 100 mg zvolené účinné láitky ve formě emulze ve směsi se stejným, množstvím přípravku Polyscrbát 80 ive směsi s glycerinem, ke směsi se přidá voda o teplotě 80 °C za energického míchání. Ke koncentrovanému roztoku se přidá chlorid sodný do konečné koncentrace 0,14 M a fosforečnan sodný o pH 7 do konečné koncentrace 0,01 M. Tímto způsobem je možno získat například následující přípravek:

mg/ml účinná látka 50,0

Polysoiribát 80 50,0 glycerin 50,0 monoihydrogenfosfát, hydratovaný 1,4 chlorid sodný 7,9 voda 842,0

1001,3

V těch případech, v nichž dochází ke shlukování částic účtoiné látky, je možno užíit ultrazvuku k získání homogenního systému.

Vynález bude osvětlen následujícími příklady.

P ř í k 1 a d 1

1- [ 2,3-di- (n-hexadecyloxy jpropyl ] -4-aminoimethyl-4-fenylp^!peridmdihydr ochlorid

A. l-[ 2,3-di- (n-ihexadecyloxy jpropyl ]-4-kyan-4-fenylpiperidin

Směs 6,96 g (10 mmol) l,2-di-O-(n-hexadeCyl)-3-O-(n-itosyl)glyceirolu, 2,23 g (10 mmol j 4-ky an-4-f enylpiperi dinhydtrochlcír idu, 2 ml triethylaminu a 40 m.l N,N-dimethylfonmamidu se míchá 16 hodin při teplotě 95 až 100 °C. Pak se reakční siměls zchladí, zředí se 200 ml vody a extrahuje se třikrát 150 ml ethylacetátu. Ethylaceitátové extrakty se slijí, vysuší se síranem hořečnatým, zfiltrují a odpaří dosucha ve vakuu, čímž se získá 6 g olejovité kapaliny, která se čistí chromatografií na sloupci, který se vymývá směsí benzenu a ethylacetátu.

Spektrum, v Infračerveném světle v chloroformu má maximum při 2220 om¹.

B. Výsledná látka

Roztek 2,5 g (3,6 mmol] l-[ 2,3-di-(n-hexadecyloxy jpropyl j -4-.kyan-4-f enylpiperidinu ve 100 mil etheru se smísí se 0,4 g (10,5 mmol) lithiumaluminiumhydridu a výsledná směs se míchá 4 hodiny při teplotě místnosti. Pak se reakční směs opatrně zředí 100 ml vody a extrahuje třikrát 100 ml etlheru. Etherové extrakty se slijí, vysuší síranem hořečnatým, zfiltrují a odpaří ve vakuu na olejovitou kapalínu, která se čistí chrcmatografií na silikagelu, sloupec se vymývá směsí benzenu a ethanolu, výsledná

Příklady 2 až 4

Způsobem podle příkladu 1 je možno· připravit následující sloučeniny příslušného l,2-di-0-(n-alkyl nebo alkenyl)-3-O-(p-tosyljglyícerolu:

látka se rozpustí a na 'roztok se působí plynnými chlorovodíkem, načež se roztok odpaří ve vakuu. Získá se pevná látka, která se nechá překrystalovat z ethylacetáitu. Ve výtěžku 40 o/o se získá 1,1 g pevné látky o teplotě tání 132 až 134 °C, která obsahuje přibližně 3/4 mol vody na 1 mol produktu.

Elementární analýza:

vypočteno:

70,60 % C, 11,53 % H, 3,50 % N; nalezeno·:

70,74 0/₀ C, 11,34 % H, 3,40 % N.

R-O-CH.

R-O-CH

HgC <x fenyl

Příklad R číslo	Molekulární vzorec	Teplota tání (°C)	Elementární analýza vypočteno (%)
C	nalezeno (°/o) H	N
2	n-tetradeeyl	C13H80O21N2.2HC1	140 — 142	69,46	11,25	3,75
			69,45	11,00	3,45
3	n-oktadeeyl	C51H96O2N2.2HC.1	115 — 117	71,95	11,60	3,29
				71,67	11,19	3,38
4	n-oktadec-9-enyl	C51H92O2N2,2HC1	118 — 120	71,17	11,23	3,25
			71,06	10,84	3,09

Příklad 5

Účinnost 1,3-di-O- (n-hexadecyl )-2-0- (3-aminopropyl jglycerolhydrochlcridu proti EMC viru in vivo

Protiviirová účinnost se vyjadřuje jako relativní doba přežití (S_r) v experimentálních skupinách ve srovnání ,s kontrolními skupinami 10. dne ipo injekci viru. Tato hodnota je definována následujícím způsobem::

Přípravek ve formě emulze byl připraven roztavením a proimísením stejných dílů účinné látky, přípravku polysorbát 80 a glycerinu s následnou disperzí směsi v horké vodě za energického míchání. Koncentrace směsi pak byla upravena na 0,14 M chloridu sodného s přídavkem 0,01 M fosforečnanu sodného o pH 7. Další ředění bylo· prováděno¹ pufreitn, sestávajícím ze směsi 0,14 M chloridu sodného a 0,01 M fosforečnanu sodného o pH 7.

Třem. skupinám isámic bílých myší o hmotnosti 20 až 25 g bylo podáno 1,5, 5 a 15 mg účinné látky na 1 kg živé hmotnosti ve formě inteirperitoneálni injekce o objemu. 0,5 mil. Čtyrtá kontrolní skupina 10 myší byla ponechána bez ošetření. 18 až 24 hodin po poidání injekce bylo· podáno všem čtyřem skupinám v objemu 0,2 ml ve formě podkožní injekce množství, rovné 20násobku LDso, tj. dávky, která způsobí uhynutí 50 % myší v průběhu 10 dnů, k injekci byl užit virus eincefalomyokarditidy (EMC). V průběhu 10 dnů byl zaznamenáván počet přežívajících myší a byla zaznamenávána· průměrná doba přežiti (S_r).

^sx

Sr =

100 4-100

XL v=1á.z10 č = 1a.z10 x100 i, d.i10 kde znamená

S_r poměrnou dobu přežití,

S_x procento přežití po· 10 dnech v pokusné skupině, χ, počet přežívajících myší v den „i“ v pokusné skupině a· eí počet přežívajících myší v dein „i“ v kontrolní skupině.

Příklady 6 až 10

Stejným způsobem: jako v přikladu 5 byla účinnost proti EMC viru in viivo stanovena pro sloučeniny z následující tabulky.

Dávka účinné látky S_r (průměr ze 7 pokusů)

15 mg/ikg	61
5 mg/kg	45
1,5 mg/kg	24

0 81S 6

S_r při-dávce účinné látky (img/kg) . 5 1,5 0,5

Příklad číslo Sloučenina vyrobena podle příkladu číslo

43

44

45

46

47

77	58	26	_
76	85	42	—
52	42	32	—
79	72	28	—.
99	26	54	—

P ř í )k 1 a >d 11

Snížení výtěžku iviru z. buněk lidského polypu in ivitro při použití 1,3-di-O- (n-hexadecylj -2-0- (3-aimiinop-ropyl) glycerolhydrochloridu

Růstové prostředí bylo připraveno tak, že 100 iml Eag-l-ova základního' prolstředí bylo doplněno 2 iml lOQkrát koncentrovaného roztoku ípiro pěstování materiálu k určení účinnosti 8 obsahem antibiotika antijnykotický-ch látek, 1 ml (200 mimolů) roztoku glutamimu, 1 ml lOOtorát koncentrovaného roztoku neeseinciálních aminokyselin, 1 ml roztoku ipyrohrozmanu sodného o koncentraci 100 immolů a 10 o/_o fetálního- telecího séra, inaktivoyaného teplem. Bylo užito- destiček píro mikirotitraci s 96 vyhloubeními, do každého z těchto vyhloubení bylo vneseno 50 000 buněk lidského' nosního polypu ve formě suspenze v 0,2 ml růstového prostředí. Destičky pak byly inkubovány 8 až 10 dní při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % kysličníku uhličitého, aby se vytvořily souvislé jednoduché vrstvy buněk.

Na konci 8 až 10 dnů růstu byly takto získané vrstvy buněk čtyřikrát promyty fyziologickým roztokem chloridu sodného· s obsahem fosfátového pufru, načež bylo přidáno do každého vyhloubení 0,2 mil udržovacího prostředí, které obsahovalo 10, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 a 0 ^g/iml účinné látky. Udržovací prostředí mělo totéž složení jako růstové prostředí s tím rozdílem, že obsahovalo pouze 2 ‘o/o fetálního telecího- séra. Destičky byly inkubovány dalších 18 hodin při teplotě 37 °C, načež byly vrstvy buněk znovu čtyřikrát promyty fyziologickým roztokem

Příklad Sloučenina vyrobena číslo podle příkladu číslo s obsahem fosfátového /pufru, čímž byla odstraněna účinná látka, načež byla do vyhloubení přiváděna dávka odpovídající 1000kirát TCOD50, což je dávka, která způsobí 50% infekci u nechráněných kultur. Byl užit virus vesikuláriní stomatitidy (VCV), kíteirý byl ponechán v kulturách 2 hodiny při teplotě 37 °C, pak byly kultury promyty čtyřikrát fyziologickým roztokem chloridu sodného s obsahem fosfátového- pufru k odstranění neads-orbovaných částic viru a do- každého vyhloubení bylo znovu přidáno 0,2 jni udržovacího prostředí. Pak byly destičky ínkuiboívány 7 -hodin při teplotě 37 “C, načež byla z (každé destičky odehrána kapalina, tato- kapalina -byla -skladována -ve zmrzlém stavu ve zkumavkách a byla titr-avána na množství infekčního viru při použití vyšších fibroblastů L-929. Tyto kultury myších buněk byly po 3 až 4 dinech an-alyz-ovány, v následující tabulce jsou uvedeny poklesy výtěžků vi-ru proti kontrole, stanovené píro pět použitých koncentrací svrchu uvedené účinné látky.

Sníže-ní výtěžku viru -v %; Koncentrace účinné látky v (/ig/m-lj

5,0 1,0 0,5 0,1 % 90 % 84 % 75 % < 68 %

Příklady 12 až 16

Způsobem podle příkladu 11 bylo stanoveno- snížení výtěžků -viru z buněk lidského p-olypu in vitro- i pro· sloučeniny uve-de-né v následující tabulce:

% snížení výtěžku viru^akoncentrace (pg/nil)

5,0 ,1,0 0,5 0,1

12	421
13	43
14	44
,15	45
16	46

+ + — — ND + ± · — — ND + + — — ND + + - - ND, + — — — ND

a) ξ= > 680/0 snížení, ± = ~ 68% snížení, — s < 68% snížení, NR ξ= nebylo provedeno/

Příklad 17

Schopnost l,3-di-O-(n-hexadecyl )-2-0- (3-aminopropyl) glycerolhydrochloridu vyvolat tvorbu interferonu, který lze prokázat v oběhu

Siměs stejných hmotnostních dílů účinné látky, přídavku polysorbát 80 a glycerolu se roztaví a pak se hoímogenizuje v horkém roztoku chloridu sodného o koncentraci 0,14 M s obsahem 0,01 M fosforečnanu sodného o pH 7 (PBS). Výsledná emulze typu olej ve vodě ise dále ředí PBS před podáními.

Švýcarským myším samicím o hmotnosti 20 až 25 g ise podá ye formě Intiraperiitoneální injekce o obsahu 0,5 mil množství zředěné emulze obsahující účinnou látku v dávce 25 mg/kg živé hmotnosti. 8., 12., 16. a 20. hodinu po injekcí byly odebrány vizoiriky plastu od čtyř myší a tyto vzorky byly slity. Sériové zředění v L-15 (Leibovitzově prostředí) s obsahem 5 ο/θ fetálního telecího séra bylo inkubováno- na destičkách pro· miikroititiraci přes noc při teplotě 37 °C na souvislé jednotlivé vrstvy myších fibiroblastů L-929. Vrstvy pak byly omyty prostředím, prostým bílkovin, načež byly uvedeny ve styk s dávkou odpovídající lOkrát TCIDso, což je dávka, která způsobí 50% infekci v nechráněných kulturách. K infekcí byl užit virus vezikúlární stomatitidy (VSV), kteirý byl s kulturou ve styku 1 hodinu při teplotě 37 °C, neadsorbovaný virus byl vymyt a buňky byly znovu uvedeny ve styk s prostředím L-15 s obsahem 5 % fetálního· telecího' séira, načež byly znovu inlkubovány 48 hodin při teplotě 37 °C. Kultury L-929 byly pak mikroskopicky zkoumány na cytopatologické změny způsobené virem, přičemž bylo možno prokázat nepřímou závislost mezi hladinou inteirferonu v plazmě a poškozením fibiroblaistů. Současně bylo stanoveno ředění plazmy, ,které může zaručit 50% ochranu jednoduchých vrstev buněk L-929.

Druhý pokus byl proveden obdobným způsobem, s tím rozdílem, že myším· bylo injelkčně podáno 10 mig účinné látlky/fcg živé hmotnosti a pak byly odebrány vzorky peritoneální tekutiny od čtyř myší a tyto· vzorky byly slity. Vzorky byly opět odebírány 6, 9, 12, 15 a 18 hodin po injekci. Vzorky byly odebírány tak, že po otevření břišní dutiny bylo vstříikmuto 1 ml Hankova vyváženého roztoku s obsahem 100 jednotek penicilinu/ml a 100 stireptomycinu/ml, pak se krátce masíruje břicho, načež se odebere z peritoneální dutiny kapalina.

Výsledky získané z obou pokusů jsou uvedeny v následující tabulce:

Zdroj interferonu 6 8

Zdroj interfeironu Hladina interferonu (jednotky/ml) po injekci v (h)

12 15 16

20

plazima perito- neální	—	34	—	67	—	52	—	40
kapalina	16	-	768	320	448	—	448	—

Příklad 18 Obdobným způsobem jako v	byla stanovena schopnost vyvolat tvorbu interfeiroinu pro sloučeninu z následující ta- příkladu 17 bulky:
Příklad číslo	Sloučenina připravena způsobem pcdle příkladu číslo	Hladina interferonu (jednotky/ml j^ačas po injekci (hj 8 12 16 20	Hladina interferonu (jednotky/ml )^bčas po injekci (hj 6 9 12 15 18
18	43	70^c 100 120^d 100^e	13 109 284 312 224

(aj zdroij interfeironu — plazma (b) zdroj interferonu — plazma (c) < 20 jednotky/ml po 6 h, 70 jednotky/ml po 9 h (dj 15 h (e) 18 h

Příklady 19 až 22 chu uvedených kyselin na buněčnou odolnost proti virové infekci i pro sloučeniny

Bylo· stanoveno zvýšení účinku obou syr- uvedené v následující tabulce:

1S

Zvýšení účinku kyseliny polyinosinové a polycytidyloivé v koncentraci ^g/rnl

4,0 0,8

- _ _ + + — + + ± = <· 5x zvýšení, ND = nebylo provedeno'

20&1S6

Příklad čllslo Sloučenina připravena ,podle příkladu číslo

19	43
20	44
21	45
22	46

(a) + ξξ > 5x zvýšení, + ξ= ~ 5x zvýšení, —

Claims

PREDMET

1. Způsob výroby nových aminových derivátů piropanidiolů s protivirovým účinkem obecného vzoirce I, jakož i z farmaceutického· hlediska přijatelných adičlníích solí těchto Sloučenin s kyselinami, kde íRi a R2 znamenají alkyl s přímým řetězcem o 12 až 20 atomech uhlíku nebo alikenyl o 12 až 20 atomech uhlíku s výjimkou zbytků, které obsahují dvojnou vazbu v poloze 1, vyznačující se tím, že se redukuje sloučenina obecného· vzoipce II, yn Al e z u kde

Ri a Rz mají výše uvedený význam,, a výsledná sloučenina vzorce I se popřípadě převede na svou z farmaceutického hlediska přijatelnou adičiní sůl s kyselinou.
2. Způsoib podle bodu 1, vyznačující se tím, že se použije sloučenina obecného vzorce II, kde Ri a Rz znamenají alkyl s přímým řetězcem o· 14 až 18 atomech uhlíku.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tim, že se použije sloučenina obecného vzorce II, kde Ri a Rz znamenají n-hexadeicylový zbytek.
4. Způsob podle bodu 2, vyznačující se tím, že se použije sloučenina obecného vzorce II, kde oba zbytky Ri a Rz zinaimenají n-ofctadecyl.