SE503261C2 - Användning av 5-isopropyl-2'-beta-deoxyuridin för framställning av en komposition för utvärtes användning mot herpesvirus - Google Patents

Description

15 20 25 50 505 261 2 II, pp. 272 - 347, Springer Verlag, New York, 1975).

Bland pyrimidinderivaten har också 5-alkylsubsti- tuerade 2'-B-deoxyuridiner testats beträffande antiviral verkan. Under betingelser in vitro utövade dessa före- ningar mycket mindre verkan än haloderivaten (De Clercq, E. et al.: Curr. Chemother. 552 - 554 /1978/).

E. De Clercq har utfört test in vitro beträffande verkan hos 5-substituerade 2'-deoxyuridiner mot virusty- pen l av herpes simplex (Prcc. of the 4th Int. Round Table on Nucleosides, Nucleotides and Their Biological Applications, Antwerpen, 1981). Cellkulturer av fibro- blast som helt nyligen isolerats från humant embryo infek- terades med herpesviruset HSV-l (refereras i litteraturen såsom HTL). rande virus bestämde han den virusdos som orsakar cytopa- togen verkan i 50 % av de infekterade cellkulturerna ETCID5O (tissue culture infective dose 50 %X]. Cellkul- turerna infekterades med testviruset i en koncentration som svarade mot TCIDEO och lösningar av varje 5-substitue- rat 2'-deoxyuridinderivat som upplösts i näringsmedlet i olika koncentrationer tillsattes till de infekterade cellkulturerna. Näringsmedel: Minimal Essential Medium Eagle (HEM, GIBCO) med Earles Salts. Detta komplettera- des med 10 % kalvserum, 10 IU/ml penicillin och 100/ng/ml streptomycin i hans experiment vid pH 7,4. Nedelst denna metod kan minimikoncentrationen av den aktiva beståndsdel som kräves för att minska TCIDSO-värdet för viruset med en logaritmisk enhet bestämmas. De resultat som erhålles på detta sätt och som väl karakteriserar verkan hos före- Genom ändring av koncentrationen av infekte- ningarna framgår av tabell l. 10 15 20 Tabell 1 Minimikoncentration Testad förening hämmande mot HSV-l §ug/ml) 5-bromvinyl-2'-deoxyuridin 0,008 (BVDU) 5-etyl-2'-deoxyuridin 0,5 (EDU) 5-jod-2'-deoxyuridin 0,15 (IDU) 5-isopropyl-2'-deoxyuridin 4 (IPDU) Data i tabell l indikerar att 5-isopropyl-2'-ß-de- oxyuridin med formeln (I) (IPDU) har en antiherpesverkan som är en storleksordning lägre än densamma hos de andra 5-substituerade 2'-B-deoxyuridinerna och är i praktiken ineffektiv in vitro mot herpes simplex viruset. Detta konstaterande överensstämmer väl med påståendet av K.K.

Gauri och R.D. Walter (Chemotherapy l§, 269 /1975/) som konstaterade att 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin inte kan användas inom terapin för herpesvirus.

Föreliggande uppfinning har till ändamål att åstad- komma en farmaceutisk komposition för utvärtes användning som kan tillföras mera effektivt än de tidigare komposi- tionerna för dermatologisk behandling av sjukliga föränd- ringar som orsakas av olika herpesvirus.

Uppfinningen bygger på den kunskapen att 5-isopro- pyl-2'-ß-deoxyuridin som tillföres huden i en lämplig bä- rare ackumuleras i huden och på så sätt besitter den ut- märkta antivirala egenskaper.

I tabell 2 är summerade resultaten av farmaceutis- ka undersökningar. Studierna utfördes med 140-märkt 5- -isopropyl-2'-B-deoxyuridin. Resultaten visade att en sammansättning av salva som innehöll IPDU applicerad på huden resorberades fullständigt under 15 min och i motsats till vad som förväntades ackumulerades 20 - 25 % av den 10 505 261 4 resorberade aktiva beståndsdelen i huden och dess koncen- tration förblir praktiskt taget oförändrad under ca 8 timmar.

Uppfinningen bygger vidare på den kunskapen att ackumuleringen av det aktiva medlet i huden visade sig vara mycket selektiv. Detta innebär att 75 - 80 % av do- sen som resorberas upptas i blodet och de organ i kroppen varifrån den elimineras snabbt. I de organ som anges i tabell 5 sjunker koncentrationen av IPDU under den detek- terbara nivån inom 5 - 6 timmar.

Tabell 2 Tid Total resorberad Radioaktivitet (min) radioaktivitet mätt i huden presenterad såsom procent av tillförd radioaktivitet 15 27,9 9,25 50 50,5 6,60 60 52,9 7.70 120 50,8 6,00 180 26,0 7,25 240 20,7 5,90 480 26,7 5,40 Tabell 5 Tid R lativ radioaktivitet d m/m or an (tim) e dpm7mg hud hud hjärna njure lever mjälte lunga 0,25 1,00 0,0006 0,01 0,008 0,005 0,008 0,50 1,00 0,0004 0,005 0,010 0,005 0,008 5,00 1,00 0,000l 0,005 0,002 0,002 0,002 6,00 1,00 0,000l 0,001 0,002 0,002 0,002 10 15 20 25 50 55 frwv n:'4 UUQ LO! 5 Data i tabell 5 indikerar tydligt att det radioak- tiva mediet ackumuleras övervägande i huden bland de an- givna organen, dvs resorption av IPDU i hudvävnaden är selektiv.

Uppfinningen baserar sig slutligen på den kunska- pen att IPDU, i motsats till de andra pyrimidinnukleosider som har medicinsk användning, är avsevärt stabilare mot nedbrytande enzym som klyver nukleosiderna till bas och 2-deoxyribos-l-fosfat. Detta konstaterades såväl genom enzymatiska reaktioner (se fig. l) och metabolismexperi- ment in vivo som utfördes med 140-märkt IPDU.

I fig. l visas hastigheten för klyvning av tymidin, 5-etyl-2'-B-deoxyuridin (EDU) och 5-isopropyl-2'-B-deoxy- uridin (IPDU) genom thymidinfosforylas.

Fig. 2 visar de metaboliska produkter som identifie- rats i urin från möss som behandlats med IPDU (I) (i.p. 200 mg/kg). Denna figur visar att 80 - 85 % av IPDU (I) försvinner ur kroppen i oförändrad form under det att en- dast 2 - 5 % försvinner i form av 5-isopropyl-uracil och lO - 15 % i form av 5-(1-metyl-2-hydroxietyl)-2'-deoxy- uridin.

I våra experiment har också konstaterats att 5-iso- propyl-2'-B-deoxyuridin är praktiskt taget icke toxisk, uppvisar ingen mutagen eller teratogen verkan och den framkallar inte sjukliga förändringar av huden eller al- lergi även om den användes mångfaldigt av den terapeutiskt verksamma dosen. På grundval av dessa gynnsamma egenska- per kan 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin utmärkt användas så- som en aktiv beståndsdel i antiviral komposition för der- matologisk användning, framför allt som medel mot herpes- virus.

På basis av de ovan nämnda kunskaperna hänför sig uppfinningen till farmaceutiska, antivirala kompositioner för utvärtes användning, vilka ackumuleras i huden. Den- na komposition innehåller 0,02 - 5 vikt-% av 5-isopropyl- -2'-B-deoxyuridin tillsammans med bärare, utspädningsmedel och/eller andra tillsatser som vanligtvis användes vid framställning av farmaceutiska kompositioner för utvärtes 10 15 20 25 50 55 503 261 6 användning.

Den antivirala kompositionen enligt uppfinningen kan framställas genom blandning av 0,02 - 5 vikt-% av 5-isopropyl-2'-5-deoxyuridin med bärare, utspädningsme- del och/eller andra tillsatser som vanligtvis användes vid framställning av farmaceutiska kompositioner för ut- värtes användning.

Den farmaceutiska, antivirala kompositionen enligt uppfinningen innefattar för oftalmologiska ändamål 0,1 - l vikt-% av 5-isopropyl-2'-5-deoxyuridin med bärare, ut- spädningsmedel och/eller andra tillsatser som vanligtvis användes vid framställning av farmaceutiska kompositioner.

De farmaceutiska kompositionerna enligt uppfinning- en uppvisar utmärkt antiviral verkan. De kan framställas i form av salva, gel, emulsion, suspension, lösning, spray, adhesiv osv. Halten av den aktiva bestàndsdelen i de antivirala kompositionerna varierar alltefter typen av Tillfredsställande resultat kan vanligtvis uppnås genom användning av 0,5 - 2 vikt-% applikation och behandling. av 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin på huden som skall behand- las.

För framställning av de farmaceutiska kompositio- nerna enligt uppfinningen kan i första hand användas la- nolin, vaselin, polyetylenglykol, vaxer samt vidare vat- ten och organiska lösningsmedel såsom etanol. Beroende på typen av komposition kan man också använda stabilisa- torer, emulgatorer, ytaktiva medel och färgmedel samt and- ra tillsatser.

Den farmaceutiska kompositionen enligt uppfinningen kan också innehålla förutom 5-isopropyl-2'-ß-deoxyuridin även andra biologiskt aktiva substanser, exempelvis anti- flogistiska medel såsom kloramfenikol, hudsedativa medel såsom azulen, hudtorkande medel såsom zinkoxid osv.

De farmaceutiska kompositionerna enligt uppfinning- en kan framställas genom allmänt kända farmakoteknologis- ka förfaranden. 5-isopropyl-2'-3-deoxyuridin är en känd förening och kan framställas genom förfaranden som beskrivas i lit- 10 15 20 25 50 55 7 503 261 teraturen, exempelvis: Szabolcs, A., Sági, J. och Ütvös, L.: Carbohydrates, Nucleosides and Nucleotides 2, 197 - 211 (1975); Nucleic Acids Res. l, 49 - 52 (1975). De fy- sikaliska kännetecknen på föreningen är följande: Den är ett vitt, kristallint, luktfritt pulver med en något bit- ter smak. 181 - 1s5° c. löslig i vatten, metanol och etanol, varvid lösligheterna vid rumstemperatur är 7,9 mg/cmš, 25,4 mg/cm; respektive ll mg/cmš. Den är praktiskt taget olöslig i bensen, klo- roform och dietyleter. Den kan lagras under åratal vid rumstemperatur utan sönderdelning.

Tunnskiktskromatografi av föreningen på ark av si- likagel (Merck) med etylacetat-metanol (95:5) gav ett Rf- värde av 0,45. Absorptionsmaximum för ultraviolett kons- taterades vara vid 267,# i 0,4 nm med en molextinktions- koefficient av 95oo i 400, n = so.

Smälttemperatur: Föreningen är Akut toxicitet Värden pà akut toxicitet bestämdes på möss, råttor och kaniner. Föreningen administrerades intraperitonealt till djuren under 14 dagar och följande LDBO-värden obser- verades: Möss: 920 mg/kg Råttor: 820 mg/kg Kaniner: 2000 mg/kg 50-dagars toxicitet på råttor Djuren gavs en daglig dos om 5 - 50 mg/kg av det aktiva medlet intraperitonealt under 50 dagar. Under för- söksperioden observerades ingen skillnad mellan behandla- de och obehandlade (kontroll) djur. Inga skillnader i viktökning, intag av föda, sjukliga förändringar i nerv- systemet eller dödsfall observerades. Obduktionsresulta- ten hänvisade inte till någon verkan som var relaterad till toxiska förändringar. 6-veckors akuta och subakuta toxikologitester på råttor Djuren behandlades intraperitonealt med en daglig dos om 5 - 50 mg/kg av den aktiva bestándsdelen. Inga 10 15 20 25 50 55 505 261 8 toxiska symtom, förändringar i kroppsvikt eller dödsfall observerades varken under behandlingsperioden om 6 veckor eller under en ytterligare observationsperiod om 2 veckor.

Inga histologiska, sjukliga förändringar konstaterades vid dissektion.

Mutagen och karcinogen verkan hos det aktiva medlet fast- ställt med Ames test Undersökningar utfördes genom användning av Salmo- nella typhimurium bacteria som utsatts för mutation. Vat- tenhaltig suspension eller lösning av 0,125 - 8,0 vikt-% av 5-isopropyl-2'-3-deoxyuridin samt vidare fast pulver- form av det aktiva medlet användes vid experimenten. Dif- fusions-reversionstest, vätske-reversionstest (Ames, B.N. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Zl, 2281 /1975/) och andra tester med S9-fraktioner (Ames, B.N. et al.: Nutat.

Res. ål, 547 /1975/) användes vid studierna. Varken muta- gena eller karciogena effekter observerades.

Undersökning av mutagenicitet, teratogenicitet och embryo- toxicitet under in vivo betingelser Dessa undersökningar utfördes genom användning av Rousse1's "Mouse Spot Test" (Roussel, L.B. och Majos, M.H.: Genetics gg, 161 - 175 /157/; Roussel, L.B. et al.: Mutation Res. §§, 555 - 559 /1981/) På C57/BL-möss. Fy- siologisk saltlösning av 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin till- fördes i en koncentration om 460 respektive 250 mg/kg. I fallet med en dos om 250 mg/kg vilket är 45 gånger högre än den terapeutiska dosen observerades varken mutagen, embryotoxisk eller teratogen verkan.

Resorptionstest Undersökningar utfördes pà vita hanmöss CFLP med kroppsvikten 25 - 25 g under användning av en salva som framställts i enlighet med exempel l och som innehöll 0,8 vikt-% av 140-märkt 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin. Salvan användes i en dos om 50 mg per djur. 5 - 5 djur användes för varje experiment. Bukhuden hos djuren avhårades med "Depilan" (registrerat varumärke: Hamol International, Krk, Jugoslavien). 24 timmar efter avhàringen fixerades djuren dorsalt och salvan applicerades på ett område av 10 15 20 9 503 261 2 cm2 av den avhårade huden. De fastspända djuren hölls i metabolismkammare under 8 timmar, varefter den behand- lade hudytan torkades av och djuren fick röra sig fritt till slutet av observationsperioden. Observationstiderna var 15, 50, 60, 120, 180, 560 och 480 minuter. Radioak- tiviteten hos det avtorkade materialet och den som acku- mulerats i olika organ hos de behandlade djuren (hud, blod, lever, mjälte, njure, lunga och hjärna) fastställ- des tillsammans med radioaktiviteten i den urin hos dju- ren som uppsamlats under 24 timmar. Data framgår av ta- bell 4.

Tabell 4 Tid Radioaktivitet Radioaktivitet (min) avskrapad resorberad (95 (96) 0 100 0 15 72,1 27.9 60 67,1 52,9 120 68,2 50,8 180 74,0 26,0 240 79,5 20,7 480 75.3 26,7 Enligt de data som framgår av tabell 4 ändrades radioaktiviteten hos det resorberade materialet praktiskt taget inte efter de första 15 minuterna, dvs det radioak- tiva materialet resorberas in i huden från sammansättning- en av salvan under 15 minuter och kvarblir i huden under en mycket lång tidsperiod. Summan av den radioaktivitet som mätta i huden, blodet och andra organ indikerar att 20 - 55 % av det aktiva medlet resorberas från salvan och 65 - 80 % av denna mängd elimineras snabbt från de olika organen. Data visar att radioaktivt material kan detek- teras endast i spårmängder 5 timmar efter behandlingen (tabell 5).

A andra sidan ackumuleras det radioaktiva materia- 10 15 20 25 503 261 10 let väl i huden och dess koncentration förblir ungefär oförändrad under 8 timmar såsom framgår tydligt av data i tabell 2.

Toleranstest g Undersökningar utfördes med vita möss med kropps- vikten 25 - 50 g. pig. 2 - 5 cm2 av hudytan hos testmössen behandlades dag- ligen med en salva som innehöll 2,5 vikt-% av 5-isopropyl- Huden hos mössen var frisk eller kop- -2'-B-deoxyuridin under 6 veckor. Kontrollgruppen av möss behandlades med en salva som inte innehöll något aktivt medel (placebo). _ Eïter behandlingsperioden hölls djurenunderobser- vation under2 veckor. Inga förändringar (hudirritation, allergifenomen eller inflammation) upptäcktes hos de be- handlade mössen varken under behandlingsperioden eller Ej heller kunde några histopatolo- giska förändringar observeras.

Kliniska test Kliniska experiment utfördes på frivilliga med dia- gnostiserad virusinfektion med herpes simplex, herpes ge- nitalis respektive herpes zoster. Beroende på sjukdomen behandlades patienterna 5 - 5 gånger dagligen under 5 - 10 dagar med den farmaceutiska kompositionen enligt uppfin- ningen. Kliniska test utfördes med dubbel-blindmetoden.

Effektiviteten hos kompositionen enligt exempel l (A) un- dersöktes i jämförelse med den kommersiellt tillgängliga salvan 5-jod-2'-B-deoxyuridin (C) och placebosalvan som inte innehöll något aktivt medel (B). Resultaten av de kliniska testerna är uppställda i tabell 5. observationsperioden. 10 15 20 11 503 261 Tabell 5 Verkan Herpes Herpes Herpes simplex genitalis zoster IIAII IIBII IICII "All IIBII II CI! IIAII IIBII II CII Utmärkt 51 6 14 ll 0 10 16 0 5 Ändamàlsenlig 9 10 15 7 2 6 7 2 l Moderat 9 10 9 5 5 5 5 5 5 Ineffektiv 1 24 14 0 15 1 0 l 5 Försämring 1 1 1 1 1 O O O O Antal patienter 51 51 51 22 21 22 26 8 10 "A" salva som innehåller 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin "B" placebosalva "C" salva som innehåller 5-jod-2'-8-deoxyuridin (kontroll) Huvudfördelarna med kompositionen och förfarandet enligt uppfinningen är följande: a) Det aktiva medlet i kompositionen resorberas snabbt och selektivt i huden där det ackumuleras och på detta sätt kan den önskade effekten uppnås genom använd- ning av kompositionen med en låg halt av den aktiva be- ståndsdelen. b) Såsom följd av lokal användning av kompositio- nen blir den mängd aktivt medel som användes mindre än i de fall då man använder en komposition för invärtes bruk. c) Den aktiva beståndsdelen i kompositionen är märkbart stabil. Stabiliteten bidrar också till de goda resultat som erhålles med kompositioner med lågt innehåll av aktiv beståndsdel.

Kompositionen och förfarandet enligt uppfinningen belyses i detalj genom följande icke begränsande exempel.

Exempel 1 §alYe_fëz_§ar@229l9si§E_§a2ë2§ai§s 5-isopropyl-2'-3-deoxyuridin 8 g Polysorbat 60 (Ph. Hg. VII. 751) 56 g Flytande paraffin 50 g 10 15 20 25 505 261 12 Cetyl-stearylalkohol (Ph. Hg. VII. 751) 80 Vit vaselin 100 Glycerol 200 Vit vax 4 p-hydroxibensoesyrametylester 2 Destillerat vatten 500 Salvan kan lagras utan sönderdelning under åtmins ne 2 år vid rumstemperatur.

Exemgel 2 Gel för dermatologisk användning 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin 1,0 Metylcellulosa 4,0 Glycerol 20,0 Destillerat vatten 75,9 Natriumbensoat 0,1 Etanol (96 %) 0,9 p-hydroxibensoesyraetylester (nipagin) 0,1 Exemgel Q ëalxa_âëz_9⧧l@2l9ai§k_§nXä§ë2i§s 5-isopropyl-2'-B-deoxyuridin 0,8 Occulentum simplex 999,2 Sammansättningen hos occulentum simplex är såsom följer: Lanae-alkoholer (ullvax-alkoholer) 50 (Ph Hg VII, 1088) Paraffinum liquidum (flytande paraffin) 250 (Ph Hg VII, 1285) Vaselinum album oftalmicum (vit vaselin) 700 UQOQOQCQGQÜQ to- 09 CQCQGQOQOQGQGQ

Claims (3)

10 15 503 261 |3 Patentkrav

1. Användning av 5-isopropyl-2'-ß-deoxyuridin för framställning av en komposition, innefattande 0,02 - 5 viktsprocent av 5-isopropyl-2'-ß-deoxyuridin blandad med bärare, utspådningsmedel och/eller andra konventionellt använda tillsatser för utvärtes användning mot herpesvirus för ackumulering i huden.

2. Användning enligt kravet l för oftalmisk användning varvid nämnda komposition innehåller 0,1 - l viktsprocent av 5- isopropyl-2'-ß-deoxiuridin.

3. Användning enligt krav 1, varvid nämnda mängd 5-isopropyl- 2'-ß-deoxyuridin tillsammans med nämnda tillsatser omvandlas till salva, emulsion, suspension, gel, lösning, spray, adhesiv.