CN1876078A - 保护血管内皮细胞功能的中药复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保护血管内皮细胞功能的中药复合物，该中药复合物主要包括下述重量份的药物：地龙2～4份、水蛭1～3份、陈皮1～3份、半夏1～3份，将上述各中药原料用水浸泡后经文火煎3次，将每次煎得的药汁合并，过滤后用100℃水浴浓缩后的药液即得。它的制备工艺按下述步骤进行：a.上述配方的重量份取各药物；b.将全部药物用自来水浸泡半小时，用文火煎一小时，倒出药汁，共煎3次，将药汁合并；c.将所得药汁用纱布过滤，过滤后用100℃水浴浓缩至100ml的药液，即得成品。本发明很好的解决采用西药针对冠心病急性心肌缺血的防治，存在毒副作用较大的缺点，而现在没有很好用于治疗的中药复合物等方面存在的问题。

Description

保护血管内皮细胞功能的中药复合物及其制备方法

一、技术领域：本发明涉及一种中药复合物及其制备方法，尤其是一种用于保护血管内皮细胞功能的中药复合物和它的制备方法。

二、背景技术：冠心病是目前最常见的多发的心血管疾病，在我国的发病率近几年有明显增高的趋势，成为死亡的重要原因之一，尤其是急性心肌缺血严重危害人类的身体健康，因而对其发病机理及其防治的研究，已日益受到学者们的重视。进入九十年代对冠心病急性心肌缺血发病机理的认识已深入到分子生物学水平。针对冠心病急性心肌缺血的防治，国内外对西药的研究达到了比较高的水平，但由于其毒副作用较大的缺点，故许多学者转而投向对中药的研究，目前虽已取得可喜的进展，但中药对冠心病急性心肌缺血防治的作用机制，还没有形成较完整的理论体系，所以，进一步研究中药防治冠心病急性心肌缺血的机理，具有重要的学术价值和临床意义。

中医学认为冠心病急性心肌缺血属于“胸痹”范畴，病机主要是气虚血瘀、痹阻脉络，不通则痛。因此治疗上多以益气活血化瘀为原则，但中医有津血同源理论，且津停为痰，又认为久病入络，故宜搜风通络，治血与治风相通，故治疗以“益气搜风祛痰”为治疗方法。基于此原则发明人研制了活心汤，并应用于临床，已取得了较好的疗效。心肌缺血时细胞内皮功能失调是目前研究的热点，本发明旨在通过动物实验，通过分子生物学水平来进一步揭示中药活心汤对内皮功能的影响作用机制，为中药抗心肌缺血提供了可靠的理论依据。

三、发明内容：

1、发明目的：本发明提供一种保护血管内皮细胞功能的中药复合物及其制备方法，其目的是解决采用西药针对冠心病急性心肌缺血的防治，其存在毒副作用较大的缺点，而中医对冠心病急性心肌缺血防治的作用机制还没有形成较完整的理论体系，现在也没有很好用于治疗的中药复合物等方面存在的问题。

2、技术方案：本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种保护血管内皮细胞功能的中药复合物，其特征在于：该中药复合物主要包括下述重量份的药物：地龙2～4份、水蛭1～3份、陈皮1～3份、半夏1～3份，将上述各中药原料用水浸泡后经文火煎3次，将每次煎得的药汁合并，过滤后用100℃水浴浓缩后的药液即得。

上述中药复合物中还包括如下重量份的药物：丹参2～4份、黄芪8～10份、生地1～3份、白术2～4份。

一种保护血管内皮细胞功能的中药复合物的制备方法，其特征在于它按下述步骤进行：

a.按权利要求1配方的重量份取各药物；

b.将全部药物用自来水浸泡半小时，用文火煎一小时，倒出药汁，共煎3次，将药汁合并；

c.将所得药汁用纱布过滤，过滤后用100℃水浴浓缩至100ml的药液，即得成品。

3、优点及效果：通过本发明技术方案的实施，能够很好地解决采用西药针对冠心病急性心肌缺血的防治，其存在毒副作用较大的缺点，而中医对冠心病急性心肌缺血防治的作用机制还没有形成较完整的理论体系，现在也没有很好用于治疗的中药复合物等方面存在的问题。本发明具有较好的抗心肌缺血作用，提高N0和NOS的水平，增加NOS的mRNA表达，降低ET水平，降低ECE的mRNA的表达，增强缺血心肌中的NOS阳性免疫反应，降低ET的阳性免疫反应，从而保护血管内皮细胞增加对心肌的保护作用。

四、附图说明：附图1为对家兔的冠脉结扎前描记到正常心电图；

附图2为表明家兔急性心肌缺血模型的心电图；

附图3a为本发明中药组的NOS原位杂交图；

附图3b为模型组的NOS原位杂交图；

附图3c为西药组的NOS原位杂交图；

附图3d为正常组的NOS原位杂交图；

附图4a为本发明中药组的ECE原位杂交图；

附图4b为模型组的ECE原位杂交图；

附图4c为西药组的ECE原位杂交图；

附图4d为正常组的ECE原位杂交图；

附图5a为本发明中药组的ET免疫组化图；

附图5b为模型组的ET免疫组化图；

附图5c为西药组的ET免疫组化图；

附图5d为正常组的ET免疫组化图；

附图6a为本发明中药组的NOS免疫组化图；

附图6b为模型组的NOS免疫组化图；

附图6c为西药组的NOS免疫组化图；

附图6d为正常组的NOS免疫组化图。

五、具体实施方式：

本发明保护血管内皮细胞功能的中药复合物，它是用于保护血管内皮细胞功能的药物，该中药复合物主要包括下述重量份的药物：地龙2～4份、水蛭1～3份、陈皮1～3份、半夏1～3份，将上述各中药原料用水浸泡后经文火煎3次，将每次煎得的药汁合并，过滤后用100℃水浴浓缩后的药液即得。上述中药复合物中还包括如下重量份的药物：丹参2～4份、黄芪8～10份、生地1～3份、白术2～4份。本发明中药复合物的制备方法按下述步骤进行：a.按上述配方的重量份取各药物；b.将全部药物用自来水浸泡半小时，用文火煎一小时，倒出药汁，共煎3次，将药汁合并；c.将所得药汁用纱布过滤，过滤后用100℃水浴浓缩至100ml的药液，即得成品。

本发明中药复合物的组方依据如下：冠心病病症的发生以气虚为本，血瘀为标，属本虚标实之症，故气虚血瘀是冠心病主要发病机制。中医有津血同源理论，且津停为痰，又认为久病入络，故宜搜风通络，治血与治风相通，故治疗以“益气搜风祛痰”为治疗方法。本发明中药复合物由地龙、水蛭、黄芪、陈皮、半夏、生地、白术等药物组成。方中黄芪是补气的要药，而且善补胸中大气，大气旺则气滞行，血瘀通，即：“大气一转，其结乃散”之谓；水蛭为破血逐瘀之药；生地为养血补血之功效；陈皮理气健脾，燥湿化痰。半夏燥湿化痰，降逆止呕，清痞散结。地龙清热息风，通络；白术补气健脾燥湿利水。

现代药理研究证明各药物成份功能如下：

黄芪：对心血管系统作用，对心脏的作用：黄芪水煎剂对离体蛙心无明显作用，醇提取液可使离体蛙或蟾蜍心脏收缩增强，振幅明显扩大，大剂量时则产生抑制。黄芪皂甙50μg/ml～200μg/ml剂量时对离体工作鼠心有正性肌力作用，黄芪对缺糖缺氧所致大鼠心肌细胞核畸形改变、核染色质凝集、线粒体肿胀或形成空泡，糖原颗粒减少、结构改变等超微结构，亦有明显保护作用。有报道，黄芪能使人心肌细胞乳酸脱氢酶及琥珀酸脱氢酶含量有不同程度的增高。有研究表明，黄芪对柯萨奇B₃病毒(CVB₃)感染大鼠心肌细胞及正常对照心肌细胞的Ca2+内流均呈显著抑制作用(p＜0.01，p＜0.05)；若在病毒感染1h后加黄芪，经48h培养，对正常对照及感染细胞的Ca2+内流亦有抑制作用(p＜0.05)；同时细胞中CVB₃-RNA含量显著少于病毒对照组(p＜0.001)。提示黄芪具有钙拮抗作用，可减少病毒感染引起的心肌Ca2+内流量，有可能减轻感染细胞的继发性Ca2+损伤；且对细胞中病毒RNA的复制具有抑制作用，显示了其在病毒性心肌炎临床治疗上的应用价值。高浓度黄芪皂甙(50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)使Wistar大鼠离体工作心脏的心脏收缩性能立即呈剂量依赖性增强，作用与毒毛旋花子甙K(0.72μg/ml)相似，低浓度黄芪皂甙(30μg/ml)使心脏收缩性能立即减弱，提高细胞外钙不能反转此效应，洗脱后黄芪皂甙的作用迅速消失，提示黄芪皂甙对心肌有正性肌力作用，与强心甙类药物相似。

水蛭：

(1).抗凝血作用：提外实验表明，水蛭水煎剂有强抗凝血作用，能显著延长纤维蛋白的凝聚时间。水蛭素是仅从医用水蛭中提出的一种有效成分，能与凝血酶结合，形成一种非工价复合物，这种复合物极其稳定，而且反应速度极快。水蛭不仅能阻止纤维蛋白原凝固，也能阻止凝血酶催化的进一步血瘀反应，如抑制因子V、VIII的活化及凝血酶诱导的血小板反应，而血液凝固被推迟或完全被阻止。水蛭素能抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。。能抑制凝血酶同血小板的结合，血小板受凝血酶刺激的释放，并能使凝血酶与血小板解离。从而产生极强的抗凝血作用；

(2).抗血栓作用：纤维蛋白的纤溶作用，作用强于单参和大黄。静脉注射水蛭素1g/kg，能明显抑制大鼠体、内血栓的形成水蛭的水提物、水蛭素对ADP诱导的大鼠血小板聚集有显著的作用；

(3).对血脂和血液流变性的影响：水蛭能降低大鼠的全血比粘度和血浆比粘度，水蛭水煎剂给肌注地塞米松所致血液流变异性异常的大鼠灌胃，可使全血粘度、血浆粘度、红细胞压积显著降低，纤维蛋白元含量明显下降，并使甘油三酯含量和β-脂蛋白含量明显降低，但对胆固醇作用不明显；

(4).对心血管系统的作用：30g/kg水蛭素腹腔注射，有明显增加小鼠心肌营养性血流量的作用。水蛭对家兔主动脉粥样硬化斑块有明显的消退作用，斑块内胶原纤维增生，胆固醇结晶减少，说明水蛭对防止动脉粥样硬化有潜在应用价值。水蛭注射液2g/kg耳缘静脉注射，连续7天，对家兔实验性脑血肿模型可显著抑制血肿压迫刺激所致脑组织炎性细胞浸润面积和脑细胞形成实质细胞坏死的范围，并有促进脑血肿吸收趋势。因而缓解颅内压升高。

生地：

(1).对心血管系统的影响：用北京野生地黄制成流浸膏，经实验证明对蛙心的收缩力有明显的增强作用，对衰弱的心脏更显著。但大量能使正常蛙心中毒。用70％怀地黄的乙醇提取物、水提取物给大白鼠实验性肾性高血压有明显的降血压、改善肾功能、降低病死率的作用。怀地黄水、醇、醚提取液分别给大鼠腹腔注射，用颈总动脉直接测血法，观察对血压的影响，结果表明：水提取液对急性实验性高血压有明显降压作用。而醇、醚提取液对高血压没有明显影响，对寒冷(室温23摄氏度)情况下的血压则有稳定作用。

地龙：

(1).降压作用广地龙热浸液和乙醇浸出液静注，对麻醉犬均有显著降压作用；给正常大鼠和肾性高血压大鼠灌胃，亦呈现显著的降压作用。地龙B1(除去6-羟基嘌呤的地龙水溶性半纯品)灌胃，对正常大鼠和肾性高血压大鼠也有降压作用。地龙降压作用部位在脊髓以上的中枢部分，或直接通过某些内感受器反射地影响中枢神经系统引起部分内脏血管的扩张，从而降低血压。将溶栓丸(地龙干燥粉末)水浸液给麻醉兔静注，血压先轻度上升，随后下降，维持1～2小时；又大鼠静注地龙煎剂0.25g/kg，血压立即下降；与静注血小板活化因子(PAF)0.25g/kg的降压过程相似；预先静注特异性血小板活化因子受体阻断剂CV6209，则显著拮抗地龙和PAF的降压作用。故认为PAF是地龙的重要将压成分；现从地龙脂质中分离到这种PAF，含量约90～130μg/g。给易卒中自发性高血压鼠(SHRSP)喂饲地垄饲料，可降低SHRSP血压，并对卒中危险因素有预防作用。

(2).抗心律失常作用：地垄注射液对氯仿-肾上腺素、乌头碱、氯化钡、唑巴因4种方法造成的心律失常有明显对抗作用，并有抑制心脏传导作用。

陈皮：

(1).对心脏的作用陈皮煎剂、醇提取物及橙皮甙均能兴奋离体及在位蛙心。橙皮甙静脉注射，能使在位兔心收缩力加强，输出量增加，而心率变化不大。陈皮煎剂能扩张冠脉。大剂量的甲基橙皮甙40mg/kg，能使冠脉阻力下降，冠脉流量增加，降低血压，减慢心率，这种作用可持续30分钟以上，但对心肌耗氧量及心肌氧利用率无明显影响。

(2).对血管与血压的作用陈皮煎剂给兔和狗静脉注射后血压迅速升高，还可使犬肾容积减少，肾血管收缩，尿量减少。橙皮甙对麻醉猫的周围血管有短暂而明显的扩张作用，但不含氧化物的纯品则无效。6-二乙胺基甲基陈皮甙，具有降低冠脉毛细血管脆性的作用。静脉注射陈皮水溶性注射液0.5ml，在3秒内麻醉大鼠血压上升(由70～80mmHg上升至130～150mmHg)，维持约3～4秒渐复正常，再次给药仍出现升压反应；对麻醉全优生要反应。

半夏：

对循环系统的作用：实验证明，半夏对离体蛙心和兔心有抑制作用，但对豚鼠离体心脏无明显影响。半夏给大鼠和犬静脉注射有一过性的降压作用，如反复给药则产生快速耐药性。半夏煎剂对犬室性心动过速及室性早搏的模型有明显的抗心律失常的作用。

沈俞钢等研究表明，具有益气补肾，活血通络功效的中药“益气通络丹”能提高冠心病患者血液超氧化物歧化酶(SOD)和NO水平，因而具有良好的治疗冠心病作用。丘瑞香等研究“心脉通”胶囊对冠心病患者血管活性性因子调节作用中发现其主要成分人参、三七、大黄，降脂作用。能抑制ET释放，降低ET血浆含量，是一种良好的血管活性因子调节剂，对血管内皮细胞起保护作用。雷燕等研究表明，主要由红参、三七组成的“愈心痛”胶囊在明显降低麻醉犬急性心肌缺血时血浆ET水平的同时，又能提高其NO水平，说明“愈心痛”胶囊能抑制ET的释放，促进NO生成和释放，从而实现对缺血心肌的保护作用。王智等给58例冠心病心绞痛患者静点参麦注射液，两周后其血液NO水平较治疗前显著升高[14]。谭效泽[15]等用中药“活血保心冲剂”治疗冠心病心绞痛120例，发现其能显著升高患者血浆NO合成酶和NO水平，提示“活血保心冲剂”是通过调节冠心病患者的心血管舒缩因子而发挥治疗作用。谢燕华等“通脉散”治疗冠心病心绞痛临床和实验研究表明，“通脉散”由三七、乳香、延胡、冰片等10余味中药组成，具有行气宽胸、活血止痛、方香温通之功能。本方活血不破血，行气不耗气，温通而不辛燥。使ET降低，降低血粘度，改善心肌缺血和临床症状。魏红磊等“保丹饮”颗粒治疗冠心病临床效应比较研究，由生黄芪、党参、丹参、麦冬、檀香、砂仁、石菖蒲等具有降低ET，有良好的抗心肌缺血作用。陈山泉“血府逐瘀汤”治疗冠心病心胶痛临床研究，结果显示，可使ET显著下降，机理是通过中药作用于平滑肌细胞和心肌细胞，使其合成或分泌ET减少，缓解冠脉痉挛，改善心肌缺血。

实施例1：

本发明一种保护血管内皮细胞功能的中药复合物，该中药复合物以下述重量的药物为主要原料：地龙20g、水蛭15g、陈皮15g、半夏15g，将上述中药原料用自来水浸泡半小时，经文火煎3次，每次煎煮一下时，将每次煎得的药汁合并，用纱布过滤，过滤后用100℃水浴浓缩至100ml的药液即得。药材配方中的地龙对心的收缩力有明显的增强作用，对衰弱的心脏更显著，水蛭有抗凝血作用，陈皮煎剂能扩张冠脉。大剂量的甲基橙皮甙40mg/kg，能使冠脉阻力下降，冠脉流量增加，降低血压，减慢心率，这种作用可持续30分钟以上，半夏煎剂对犬室性心动过速及室性早搏的模型有明显的抗心律失常的作用。这几种药材合用后可以更好的保护血管内皮、增强心肌功能，达到治疗冠心病的目的。

实施例2：

本发明中药复合物以下述重量的药物为主要原料：地龙20g、水蛭15g、丹参20g、陈皮15g、黄芪50g、全蝎15g、生地15g、陈皮15g、半夏15g、白术20g，将上述中药原料用自来水浸泡半小时，经文火煎3次，每次煎煮一下时，将每次煎得的药汁合并，用纱布过滤，过滤后用100℃水浴浓缩至100ml的药液即得。

本发明制得的中药复命物与西药对比实验如下：

(一).取对比的用的各药物

1.取本发明实施例1、2制得的中药复合物药液；

2.西药：合心爽片，30mg/片，由天津田边制药厂提供；

3.试剂：地高辛-dUTP标记试剂盒购自德国Boehringer Mannhein公司；SDS、蛋白酶K、去离子甲酰胺、鲑精DNA等购自华美生物医学公司；甘胺酸、Triton-100、多聚甲醛、左旋米唑均为Sigma产品；ET、NO、NOS、ECE原位杂交试剂盒均由北京邦定泰克生物技术有限公司提供，NOS、ECE基因探针其片段长度分别为1.1kb和660bp，按地高辛试剂盒说明书随机引物法标记探针。

(二).实验方法：

(1).实验分组：健康白兔40只，雌雄兼用，随机分为5组。①空白对照组：用生理盐水3ml/kg；②模型组：用生理盐水3ml/kg；③本发明制备的活心汤组：低剂量组相当于生药量8.21g/kg；④本发明制备的活心汤组：高剂量组相当于生药量32.84g/kg；⑤西药组：合心爽2.82mg/kg，上述药物在试验前用生理盐水制成等体积(3ml/kg)混悬液备用，然后对动物进行造模，灌胃给药。中药组、西药组、模型组连续给药6天，未次给药后1小时，冠状动脉结扎复制心肌缺血模型。

(2).动物造模

取兔用戊巴比妥钠45mg/kg腹腔麻醉固定于手术台，无菌操作，在胸骨左缘旁纵行切开3根肋骨，暴露心脏，剪开心包膜，以分离冠状动脉左前降支为标志。于左心耳根部下方2cm处进针，丝线穿过心肌表层在肺动脉圆锥出针，将直径2mm的塑料管置于结扎线与血管之间，拉紧结扎线，使塑料管压迫血管引起冠脉闭塞，造成心肌缺血。

(3).观测指标及测定方法

a.血清NO的测定：采用比色法，分别于结扎冠状动脉15分钟(结扎前)和结扎后60分钟，抽血4ml用其中2ml血1500rpm离心10分钟，分离血清，-30℃冻存。在酶标仪570nm测定样品吸光值，以亚硝酸钠为标准品，按标准曲线，可以间接测定NO浓度。

操作表：

	空白管	标准管	测定管
				双蒸水(ml)	0.1
100μmol/L标准应用液		0.1
				样本(ml)			0.1
试剂一(ml)	0.2	0.2	0.2
				试剂二(ml)	0.2	0.2	0.2

混匀，37℃准确水浴60分钟

试剂三(ml)	0.2	0.2	0.2
				试剂四(ml)	0.1	0.1	0.1

充分旋涡混匀30秒，室温静置10分钟，3500-4000转/分，离心10分钟，取上青显色。

上清(ml)	0.5	0.5	0.5
				显色剂(ml)	0.6	0.6	0.6

混匀，室温静置10分钟，蒸馏水调零，550nm，0.5cm光径，测各管吸光度值。

计算公式：NO含量(umo/l)＝测定管吸光度-空白管吸光度/标准吸光度-空白吸光度X标准品浓度X样品测试前稀释倍数

b.血浆ET的测定：采用放射免疫法测ET。具体操作如下：

取静脉血2ml，注入含10％EDTA二钠3μl和抑肽酶40μl的试管中，混匀，4℃，3000rpm离心10min，分离血浆，测定前，使样本置于室温或冰水中复融，再次4℃，3000rpm，离心5min，，取上清测定。按下表操作：

ET RIA力液程序(μl)

	T	NSB	SO	S1～S5	UO	U
							缓冲液	-	200	100	-	100	-
标准液	-	-	-	100	-	-
							样品	-	-	-	-	100	100
抗血清	-	-	100	100	-	100
							125I-ET	100	100	100	100	100	100
混匀，放4℃24h以上
							PR试剂	-	500	500	500	500	500
混匀，室温15min，4℃离心3500rpm 20min，吸弃上清液，在γ计数器上测定沉淀cpm数。

以B/T计算NSB，SO结合百分率，以B/BO计算标准及待测样品结合百分率，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值，或由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度。

c.血清一氧化氮合酶(NOS)的测定：采用比色法测定NOS，试剂组成与配制：试剂一：底物缓冲液6ml×2瓶，-20℃以下避光冷冻保存。临用前化冻摇匀。试剂二：促进剂淡黄色或白色粉剂×3支，稀释液0.6ml×3支。测试前取稀释液一支0.6ml加入一支粉剂中充分混匀，然后剩余的试剂可放入-20℃以下冷冻保存，时间不超过一周。试剂三：黄色显色剂6ml×1瓶，4℃避光冷藏保存。试剂四：透明剂60ml×2瓶，室温保存。试剂五：终止剂60ml×2瓶，4℃保存。具体操作如下：

样本和试剂从冰箱中取出，37℃水浴3分钟

	空白管	总NOS测定管
			双蒸水(μl)	30
样本(μl)		30
			试剂一底物缓冲液(μl)	200	200
试剂二促进剂(μl)	10	10
			试剂三显色剂(μl)	100	100

混匀，37℃水浴准确反应5分钟

试剂四透明剂(μl)

100

100

试剂五终止剂(μl)

2000

2000

混匀，530nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。酶活性意义：每毫克组织蛋白每分钟生成的1nmolNO为一个活性单位。

计算公式为：总NOS活力(U/ML)＝总NOS测定管OD值-空白管OD值/呈色物纳摩尔消光系数X反应液总体积/取样量X1/比色光径X反应时间÷1000＝总NOS测定管OD值-空白管OD值/38.3*10^-6X2.41+30×1/15÷1000

d.原位杂交：结扎冠脉后2小时，立即取下兔心脏，冰生理盐水洗去残血，采用兔的心脏标取缺血区和非缺血区心肌组织约0.5cm大小，液态氮冻存，原位杂交前于室温下复温后，作5-6um厚连续冰冻切片，将其贴于有0.1％多聚赖氨酸的载波片上，晒干，4℃冰箱保存备用。原位杂交冰冻切片用4％多聚甲醛溶液固定5分钟，乙醇脱水，加入磷酸盐缓冲液(PBS)和0.1NHCL液室温下作用各10、20分钟，蛋白酶K(lug/ml)消化15分钟，2×标准枸橼酸盐水洗(SSC)5分钟，4％多聚甲醛后固定10分钟，PBS洗15分钟，每张切片上滴加预杂交液50ul，42℃预杂交2小时；弃取预杂交液，每片滴加40ul杂交液于湿盒中42℃过夜，次日经6×SSC，45％甲酰胺，2×SSC各洗片2次，每次15分钟，BufferI浸泡1分钟，BufferII浸泡30分钟，再次BufferI浸泡1分钟，滴加BufferI稀释的抗体结合物(1∶2500)，室温反应30分钟，BufferI洗15分钟，共2次，再用BufferIII平衡2分钟；加入显色液避光显色6小时，以TE液终止反应后脱水，固封，核酸杂交阳性物呈紫兰色。用无探针和RNAseA处理作为阴性对照。

e.免疫组化染色(1)冰冻切片以95％乙醇固定1min，吹干；(2)1.4％牛血清封闭，湿盒中37℃，60min，PBS洗；(3)滴加I抗，为抗兔NOS血清，湿盒中37℃，60min，PBS洗；(4)滴加1∶1000II抗，湿盒中37℃，60min，PBS洗；(5)DAB显色10min，封片，镜检。抗原阳性信号为细胞浆内呈兰色颗粒，以正常兔血清代替I抗作阴性对照。正常对照组用非缺血区心肌组织切片。

f.图象分析用联有NIKON光学显微镜的8520型自动图象分析仪原位定量测量各组心肌组织的NOS阳性反应颗粒面积百分比和光密度值(OD)。每1动物取1张切片，每片随机取3个视野，各组织块全部测得一均值，用F检验进行统计学处理。

(四).数据处理：结果用X±SD表示，显著性比较采用SPSS10.0统计软件包，采用方差分析和q检验。相关性采用直线相关分析。

实验结论：

(1).心电图：冠脉结扎前描记到正常心电图，ST段位于等电位线，结扎冠状动脉后可见ST段弓背上抬，T波逐渐高耸，整个缺血期缺血性ST-T变化非常明显，表明家兔急性心肌缺血模型造成，见图1、2。

(2).本发明药物活心汤对兔心肌缺血的血清NO的含量变化的影响本实验采用比色法测定血清NO的含量，结果表明：模型组结扎冠脉左前降支缺血模型NO含量为86.23±17.73umo/l，空白对照组NO含量为140.31±13.36umo/l，与空白对照组比较P＜0.01有显著性差别。低剂量中药组NO含量为105.40±25.24umo/l，高剂量中药组NO含量为134.65±8.62umo/l，低剂量和高剂量中药组与模型组比较均有显著性差异P＜0.01。西药组NO含量为138.20±33.60umo/l，西药组与模型组对比，P＜0.05有显著性差异。中药与西药组之间无显著性差异，P＞0.05。低剂量组与高剂量组之间无显著性差异，P＞0.05.，但高剂量组效果好于低剂量组。存在量效关系。

此结果表明本发明的中药活心汤能明显地提高缺血心肌的一氧化氮水平。(见表1)

表1：HXHY处理兔心肌缺血一氧化氮(NO)变化(x±SD)

组别	数量(只)	NO(umo/l)
			空白对照组模型心肌缺血组	88	140.31±13.36▲▲86.23±17.73
低剂量本发明中药组	8	105.40±25.24▲
			高剂量本发明中药组	8	134.65±8.62▲▲
西药组	8	138.20±33.60▲

^▲P＜0.05与模型组比较  ^▲▲P＜0.01与模型组比较

(3).本发明中药药液对兔心肌缺血的血浆ET含量变化的影响

本发明实验采用放射免疫方法测定血奖ET的含量，结果表明：模型组结扎冠脉左前降支缺血模型ET的含量为311.41±12.57ng/l，空白对照组ET的含量为100.08±4.23ng/l，与空白对照组比较P＜0.01有显著性差别。说明模型造摸成立。应用低剂量本发明中药组后ET的含量168.03±26.02ng/l，高剂量中药组ET的含量为127.85±13.35ng/l，本发明低剂量和高剂量中药组与模型组比较均有显著性差异P＜0.01。西药组ET的含量为153.37±24.58ng/l，西药组与模型组比较均有显著性差异P＜0.01，本发明中药与西药组之间无显著性差异，P＞0.05，本发明中药低剂量组与高剂量组之间无显著性差异，P＞0.05。但高剂量组效果好于低剂量组。存在量效关系。

此实验结果表明本发明中药活心汤能明显地抑制缺血心肌的内皮素释放。(见表2)

表2：HXHY处理兔心肌缺血内皮素(ET)变化(x±SD)

组别	数量(只)	ET(ng/l)
			空白对照组	8	100.08±4.23▲
模型心肌缺血组	8	311.41±12.57
			低剂量中药组	8	168.03±26.02▲
高剂量中药组	8	127.85±13.35▲▲
			西药组	8	153.37±24.58▲

^▲P＜0.05与模型组比较  ^▲▲P＜0.01与模型组比较

(4).本发明中药药液对兔心肌缺血的血浆NOS含量变化的影响

本实验结果表明：模型组结扎冠脉左前降支缺血模型组NOS含量为8.44+0.87U/ml，空白对照组NOS含量为26.36+3.07U/ml，与空白对照组比较P＜0.01有显著性差别。心肌缺血模型成立。低剂量中药组NOS含量为18.92+1.21U/ml，高剂量中药组NOS含量为22.01±1.39U/ml，低剂量和高剂量中药组与模型组比较均有显著性差异P＜0.01，西药组NOS的含量为23.93+1.76U/ml，西药组与模型组比较均有显著性差异P＜0.01，低剂量组与高剂量组之间无显著性差异，P＞0.05。但高剂量组效果好于低剂量组。存在量效关系。

此结果表明本发明中药活心汤能明显地提高缺血心肌的NOS水平。(见表3)

表3：HXHY处理兔心肌缺血一氧化氮合成酶(NOS)变化(X±SD)

组别	数量(只)	NOS(U/ml)
			空白对照组模型心肌缺血组低剂量中药组高剂量中药组西药组	88888	26.36±3.07**8.44±0.8715.92±1.21*22.01±1.39**23.93±1.76**

^▲P＜0.05与模型组比较  ^▲▲P＜0.01与模型组比较

(5).本发明中药活心汤对兔缺血心肌的NOSmRNA表达的影响：在非缺血区心肌细胞可见大量的NOSmRNA表达的紫兰色的阳性反应颗粒分布在胞浆中，由于颗粒密集，使整个细胞成兰色：模型组缺血心肌组织NOSmRNA表达量较少，且范围局限，本发明活心汤大剂量组NOSmRNA兰色杂交颗粒密布于心肌胞浆内，西药组表达也较丰富。原位杂交结果：心肌缺血时NOS呈表达下降，用本发明中药活心汤后NOS表达升高。

此结果表明本发明中药活心汤能明显地提高缺血心肌的NOS mRNA的表达水平，见图3a、图3b、图3c、图3d。

(6).本发明中药活心汤对兔缺血心肌的ECE mRNA表达的影响：

以地高辛标记的ECE探针与心肌组织mRNA原位杂交，阳性杂交信号为深兰色细颗粒状，均位于胞浆内，主要分布在胞核周围。模型组缺血心肌组织ECE呈高度表达，细胞浆内可见大量的细密兰色颗粒，而本发明活心汤大剂量组可见杂交信号兰色颗粒明显低于模型组。西药组的杂交信号兰色颗粒明显低于模型组。非缺血区心肌组织仅有少量的较弱的阳性杂交信号。原位杂交结果：心肌缺血时ECE呈高度表达分布，用中药活心汤后ECE表达降低，此结果表明本发明中药活心汤能明显地抑制缺血心肌的ECEmRNA表达，见图4a、图4b、图4c、图4d。

杂交前用RNaseA处理的心肌组织切片和未加探针的阴性对照组均未获得阳性杂交信号，说明上述原位杂交是特异的。

(7).本发明中药活心汤对ET免疫组化反应的影响光镜下可见，非缺血区心肌细胞阳性免疫反应颗粒呈兰色，位于细胞浆内，模型组缺血心肌细胞内颗粒明显增多，本发明活心汤组明显低于模型组，西药组性免疫反应颗粒亦低于模型组，见图5a、图5b、图5c、图5d。

(8).本发明中药活心汤对NOS免疫组化反应的影响光镜下可见，非缺血区心肌细胞大量阳性免疫反应颗粒呈兰色，位于细胞浆内，模型组缺血心肌细胞内颗粒明显减少，且染色较浅，本发明活心汤组高于模型组，西药组性免疫反应颗粒亦高于模型组，见图6a、图6b、图6c、图6d。

(9).各组NOS免疫组化反应图象分析结果见表4

表4：HXHY处理兔心肌缺血一氧化氮合成酶(NOS)阳性反应颗粒面积百分比

                 和光密度值变化(x±SD)

组别	数量(只)	阳性颗粒面积(％)	光密度(OD)
				空白对照组	8	1.31±0.32▲▲	182.67±29.24▲▲
模型心肌缺血组	8	0.22±0.18	99.13±19.28

低剂量中药组高剂量中药组	88	0.72±0.27▲0.84±0.31▲▲	142.41±30.15▲149.26±25.73▲▲
				西药组	8	0.85±0.26▲▲	156.22±24.54▲▲

^▲▲P＜0.01与模型组比较 ^▲P＜0.05与模型组比较

模型组缺血心肌NOS阳性颗粒面积百分比及光密度值均比非缺血区显著减少(P＜0.01)，而各用药组与模型组比较明显增加，(P＜0.05；P＜0.01)，各用药组之间无明显差异。但高剂量组效果好于低剂量组。存在量效关系。10.心肌缺血组血浆ET和血浆中NO、NOS的关系：见表5。从表5可见血浆ET与NO的相关系数r＝-0.917，呈负相关(P＜0.001)。ET与NOS的相关系数r＝-0.950，呈负相关(P＜0.001)。

表5：心肌缺血组血浆ET与NO、NOS的相关性分析

检测项目	X±S	r	P
				ET(ng/L)NO(umo/l)NOS(U/ml)	311.41±12.5786.23±17.738.44±0.87	-0.917*-0.950△	＜0.001＜0.001

注：*为ET与NO的相关系数；△为ET与NOS的相关系数。

Claims (3)

1、一种保护血管内皮细胞功能的中药复合物，其特征在于：该中药复合物主要包括下述重量份的药物：地龙2～4份、水蛭1～3份、陈皮1～3份、半夏1～3份，将上述各中药原料用水浸泡后经文火煎3次，将每次煎得的药汁合并，过滤后用100℃水浴浓缩后的药液即得。

2、根据权利要求1所述的保护血管内皮细胞功能的中药复合物，其特征在于：上述中药复合物中还包括如下重量份的药物：丹参2～4份、黄芪8～10份、生地1～3份、白术2～4份。

3、一种保护血管内皮细胞功能的中药复合物的制备方法，其特征在于它按下述步骤进行：

a.按权利要求1配方的重量份取各药物；

b.将全部药物用自来水浸泡半小时，用文火煎一小时，倒出药汁，共煎3次，将药汁合并；

c.将所得药汁用纱布过滤，过滤后用100℃水浴浓缩至100ml的药液，即得成品。

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