CN1863526A - 胶原产生增强剂及其制造方法和用途 - Google Patents
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Abstract
以提供胶原产生增强剂及其用途作为课题,确定了作为有效成分含有L-抗坏血酸类和脂肪酸类的胶原产生增强剂及其用途,解决了上述课题。
Description
技术领域
本发明涉及到新的胶原产生增强剂、更详细讲涉及到作为有效成分含有L-抗坏血酸和/或其类似物(以下、只要没有特别说明,称为“L-抗坏血酸类”)和脂肪酸类的胶原产生增强剂及其制造方法和用途。
背景技术
本申请人在特开2002-201883号公报中,公布了作为生物体中的胶原产生增强剂,即作为有效成分含有L-抗坏血酸类和蜂王浆类的胶原产生增强剂。该胶原产生增强剂通过蜂王浆类增强L-抗坏血酸类的胶原产生诱导能力。
然而,虽然使蜂王浆类相对于L-抗坏血酸类的混合比例增加,上述胶原产生增强剂起到的胶原产生增强作用有增大的倾向,但存在着高价的蜂王浆类用的越多,最终制品胶原产生增强剂价格越高的缺点。另外,上述胶原产生增强剂所起的胶原产生增强作用由于混合的蜂王浆类的来源、其制备方法不同而有显着变化,所以还存在着其品质管理难的缺点。
在这样的状况下,渴望确立能够廉价提供工业上确实而且稳定地增强L-抗坏血酸类的胶原产生增强作用的胶原产生增强剂。
发明内容
本发明是借鉴以往技术而完成的发明,目的在于提供确实而且稳定地增强L-抗坏血酸类的胶原产生增强作用的新的手段及其用途。
本发明人等为了解决上述课题,以在鲜蜂王浆类中含有的特定成分增强L-抗坏血酸类的胶原产生诱导能力的前提为基础,进行了为阐明其成分究竟是何物的深入研究。结果发现鲜蜂王浆类中存在的10-羟基-2-癸烯酸(以下、称为“10-HDA”。)是其中的一个成分。发现如果将该10-HDA与L-抗坏血酸按规定比例并用,L-抗坏血酸类的胶原产生增强作用被确实而且稳定地增强了。另外发现与L-抗坏血酸同样,在将其它的L-抗坏血酸类与10-HDA以外的其它脂肪酸类应用于包括人在内的动物时也起到所能期望的效果。本发明人等进一步研究发现当将L-抗坏血酸类与脂肪酸类并用时,也发挥了生物体内的TGF-β产生增强作用。
即,本发明者等确立作为有效成分含有L-抗坏血酸类和脂肪酸类的胶原产生增强剂及其制造方法和用途之后,完成了本发明。
附图的简要说明
图1图1是表示在AA2G(L-抗坏血酸2-葡糖苷)和/或10-HDA存在下或不存在下,培养NHDF细胞时的胶原产生量的图。
图2图2是表示在AA2G(L-抗坏血酸2-葡糖苷)和各种浓度的10-HDA存在下,培养NHDF细胞时的胶原产生量的图。
图3图3是表示在AA2G(L-抗坏血酸2-葡糖苷)和10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA)、10-羟基癸酸(10H癸酸)、癸酸、2-癸烯酸、或癸二酸存在下培养NHDF细胞时的胶原产生量的图。
图4图4是表示在L-抗坏血酸或AA2G(L-抗坏血酸2-葡糖苷)与10-HDA存在下培养NHDF细胞时的胶原产生量的图。
具体实施方式
本发明的胶原产生增强剂是作为有效成分含有L-抗坏血酸类和脂肪酸类的能够确实而且稳定地增强生物体的皮肤的胶原产生的组合物。
本发明中所说的L-抗坏血酸类指的是应用于包括人在内的动物时,诱导胶原产生的L-抗坏血酸以及以它的盐类为代表的所有类似物。具体来说,作为L-抗坏血酸的盐类,例如L-抗坏血酸的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、烷基铵盐、L-抗坏血酸磷酸盐、L-抗坏血酸硫酸盐等L-抗坏血酸的无机盐等。作为L-抗坏血酸的其它类似物,如L-抗坏血酸的前体、L-抗坏血酸2-葡糖苷、L-抗坏血酸2-糖苷等L-抗坏血酸的糖衍生物、L-抗坏血酸2-葡糖苷的酰化衍生物、L-抗坏血酸2-糖苷的酰化衍生物、以及DL-α-生育酚2-L-抗坏血酸磷酸二酯、L-抗坏血酸2-磷酸等L-抗坏血酸的有机盐、无机盐以及酯等。在本发明中,可以适当组合其中的1种或大于等于2种使用。上述的L-抗坏血酸类中L-抗坏血酸2-葡糖苷成或以L-抗坏血酸2-糖苷为代表的L-抗坏血酸的糖衍生物由于胶原产生诱导能力、安全性、稳定性优良,所以最适合在本发明中使用。
在将本发明的胶原产生增强剂应用于具有L-抗坏血酸合成能力的动物时,作为L-抗坏血酸类,或与L-抗坏血酸类一起,可使用L-抗坏血酸的前体L-古洛糖酸-γ-内酯。
在本发明的胶原产生增强剂中混合的L-抗坏血酸类的混合量可以根据该胶原产生增强剂的形态、给予量、给予途径、给予频率、给予期间而变动,通常,相对于总组合物质量按L-抗坏血酸质量换算,在大于等于0.01质量%、优选0.1至99质量%、更优选1至99质量%、更优选5至99质量%的范围内使用L-抗坏血酸类。当本发明的胶原产生增强剂中混合的L-抗坏血酸类的量低于上述下限时,不会获得所期望的作用效果。而本发明的胶原产生增强剂中混合的L-抗坏血酸类量的上限应当考虑由于过量摄取导致对生物体不好的副作用、经济性等之后决定。
本发明中提到的脂肪酸类指的是当与L-抗坏血酸类并用时,发挥胶原产生增强作用的脂肪酸及其类似化合物。具体来说,如大于等于C3的直链或支链饱和或不饱和脂肪酸和它们的类似化合物,优选大于等于C10直链或支链饱和或不饱和脂肪酸和它们的类似化合物,更优选C10~C18直链或支链饱和或不饱和脂肪酸和它们的类似化合物。上述脂肪酸类中,最适合本发明中使用的是10-HDA、10-羟基癸酸、癸酸、2-癸烯酸、癸二酸、以及它们的类似化合物。而这样的脂肪酸类在L-抗坏血酸类存在下也增强成纤维细胞的转化生长因子的产生(以下称为“TGF-β”)。由于已知TGF-β产生是由存在于皮肤表皮内的角化细胞产生的,表明脂肪酸类与角化细胞的TGF-β产生机制有关。
作为在本发明中使用的脂肪酸类,只要不妨碍所期望的目的实施,并不只限定于高纯度品,即使是纯度比较低的商品也可以。而在本发明中,希望使用从天然物提取的,或化学合成得到的脂肪酸类以外的纯化至杂质含量少、纯度大于等于50%、优选纯度大于等于80%、更优选纯度大于等于90%的高纯度脂肪酸类。具体来说,如作为试剂市售的脂肪酸类。另外,作为从鲜蜂王浆等天然物制备本发明中使用的脂肪酸类的方法,如将鲜蜂王浆悬浊于水等水性溶剂,对得到的悬浊液静置或进行离心处理分成上清和沈淀物,向沈淀物添加从氢氧化钠、氢氧化钾、氨、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸铵等选择的1种或大于等于2种的碱液,进行溶解,将得到的溶液用从盐酸、硝酸、硫酸、乳酸以及氯化肉毒碱等中选择的1种或大于等于2种酸剂进行中和,以及将该溶液通过膜分离、凝胶过滤等手段采集脂肪酸类或含有它的脂肪酸类。上述一系列操作通常可在室温下实施,根据需要,进行加热、冷却,在0~70℃范围实施。这样的脂肪酸类的分离方法作为从鲜蜂王浆分离脂肪酸类的简便而有效的分离方法非常有用。
本发明的胶原产生增强剂是作为有效成分含有上述的L-抗坏血酸类和脂肪酸类的组合物,脂肪酸类由于可有效增强L-抗坏血酸类的胶原产生诱导作用,通过与L-抗坏血酸类并用,可提供多种多样的胶原产生增强剂,即从单独用L-抗坏血酸类没有看到胶原产生诱导作用程度的含有少量L-抗坏血酸类的胶原产生增强剂直至只靠单独L-抗坏血酸类不能发挥的程度的发挥高水平胶原产生增强作用的胶原产生增强剂。本发明的胶原产生增强剂中的L-抗坏血酸类与脂肪酸类的合适混合比例通常相对于L-抗坏血酸类1质量份(根据L-抗坏血酸质量换算。)在大于等于0.0001质量份、优选0.01乃至1质量份、更优选0.1乃至1质量份的范围混合脂肪酸类。
在本发明的胶原产生增强剂中,如果相对于L-抗坏血酸类混合的脂肪酸类低于上述下限,不能期望获得期待的作用效果。另外,相对于L-抗坏血酸类混合的脂肪酸类虽然没有上限,但应当从过量给予产生的对生物体的坏影响或经济的观点考虑后设定。另外、作为有效成分的L-抗坏血酸类与脂肪酸类的混合量通常可以在对本发明的胶原产生增强剂形态、给予量、给予频率、给予期间、以及给予的生物体、例如、包括人在内的动物的性别、年龄、体重、身体状况等调研之后通常设定为比较低。
另外、L-抗坏血酸类与脂肪酸类并用导致的胶原产生增强作用可以通过下面实验2所示的使用人成纤维细胞的胶原产生量测定法进行研究。
本发明的胶原产生增强剂实质上指的是在含有作为有效成分的L-抗坏血酸类与脂肪酸类的组合物、或在这样的组合物中根据需要混合从饮食品、健康食品、特殊用途食品、化妆品、药品、准药品、饲料、饵料、或宠物食品用材料选择的1种或大于等于2种其它成分构成的所有组合物。作为上述其它成分,可举出抗氧化剂、增粘剂、稳定剂、赋形剂、增量剂、pH调节剂、增粘剂、酸味剂、提取物类、糖类、糖醇类、氨基酸类、L-抗坏血酸类以外的维生素类(例如、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素E、维生素P(包括芸香甙、柚苷、桔皮苷等)、水、醇、淀粉质、蛋白质、纤维质、脂质、矿物质、着香料、着色料、甜味料、调味料、香辛料、防腐剂、乳化剂、以及表面活性剂、还有软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮质素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、透明质酸、以及aluronic acid的盐类等葡糖胺聚糖等。
上述其它成分中,抗氧化剂是为了抑制本发明的胶原产生增强剂含有的有效成分的氧化分解的目的混合的。具体例子如类黄酮类、多酚等。在本发明的胶原产生增强剂中混合的抗氧化剂的混合量没有特别限制,对于该胶原产生增强剂为口服摄取方式的制剂时,这些抗氧化剂可按照食品领域中通常使用的混合比例使用,优选以比该比例低的量使用。
另外,上述其它成分中,作为糖类可举出葡萄糖、果糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳蔗糖、糖稀水饴等糖类、α-、β-以及γ-环糊精、具有环{→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→6)-α-D-吡喃葡糖基-(1→3)-α-D-吡喃葡糖基-(1→}结构的环状四糖等糖类、赤藓糖醇、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、还原水饴等糖醇类、阿斯巴甜、甜叶菊提取物、三氯蔗糖(Sucralose)、乙酰氨基磺酸钾(acesulfame K)、糖精等高甜味度甜味料、芽霉多糖(pullulan)、痂囊腔菌聚糖(elsinan)、角叉菜胶、呫吨胶、愈疮胶、结冷胶(gellan gum)、罗望子胶等多糖类和天然胶类、羧甲基纤维素等合成增粘剂等。这些糖类在目的是赋予本发明的胶原产生增强剂甜味、味道改善、固状化、稳定化等可有利利用。
另外,上述其它成分中、提取物类,例如来自特开平10-203952号公报公布的山毛榉科(the family Faguceae)山毛榉属的树的芽的提取物等、包括具有胶原产生增强作用成分的银杏提取物、松树提取物、矮竹提取物、梅子提取物、paffia提取物、紫苏提取物、蓼篮提取物(indigo extract)、牡蛎提取物等提取物类。
作为这样得到的本发明的胶原产生增强剂的形态,可例举液状、糖浆状、糊状、片状、粉末状、颗粒状、固态状、球粒状、胶囊状等形态。
将本发明的胶原产生增强剂以口服、非口服(例如、透皮)方式应用于包括人在内的动物时,有效成分被生物体吸收,增强存在于真皮、脏器等的成纤维细胞的胶原产生。通过将本发明的胶原产生增强剂连日或隔日应用于生物体,使生物体中胶原持续产生,不用说对于维持健康的皮肤状态是有效的,而且可以提高伴随年龄增加的皮肤老化以及受到紫外线等其它外在要因引起的损伤的皮肤组织的胶原产生能力,使皮肤恢复到正常的状态。结果表明可赋予肌(皮肤)弹性与润滑,改善或消除小皱纹等褶皱。另外对于小皱纹等褶皱的预防也有用。
将本发明的胶原产生增强剂口服应用时,虽然因作为对象的包括人在内的动物(包括宠物、家畜、家禽、鱼类)的种类、健康状态、年龄、性别/雌雄有差异,但作为该胶原产生增强剂中含有的L-抗坏血酸类的给予量(根据L-抗坏血酸质量换算),每公斤体重,通常定为0.1至500mg、优选1至500mg、更优选1至250mg的范围。另外,作为本发明的胶原产生增强剂中含有的脂肪酸类的给予量,按质量计,相对于L-抗坏血酸类1质量份(根据L-抗坏血酸质量换算),在大于等于0.0001质量份、优选0.01至1质量份、更优选0.1至1质量份的范围内混合脂肪酸类。本发明的胶原产生增强剂的给予频率按照1至数次/日的比例,根据作用效果的程度、生物体状态可连日或设置大于等于1日的间隔使用。
另外,虽然通过非口服方式给予本发明的胶原产生增强剂时,可以根据作为对象的包括人在内的动物(包括宠物、家畜、家禽、鱼类)的种类、健康状态、年龄、性别/雌雄而有所差异,但作为该胶原产生增强剂中含有的L-抗坏血酸类给予量(按L-抗坏血酸质量换算),每公斤体重,通常为0.1至500mg、优选1至500mg、更优选1至250mg范围。而作为本发明的胶原产生增强剂中的脂肪酸类给予量,按质量,相对于1质量份L-抗坏血酸类(按L-抗坏血酸质量换算),在大于等于0.0001质量份、优选0.01至1质量份、更优选0.1至1质量份范围内混合脂肪酸类。本发明胶原产生增强剂的给予频率按照1至数次/日的比例,可以根据作用效果的程度、生物体的状态连日或大于等于隔1日使用。
为了制造含有本发明的胶原产生增强剂的组合物,可以根据目标胶原产生增强剂的用途,混合L-抗坏血酸类以及脂肪酸类,以及根据需要,适量混合上述提到的饮食品、健康食品、特殊用途食品、化妆品、药品、准药品、饲料、饵料、或宠物食品用材料的1种或大于等于2种的成分,通过常规方法加工成所希望的形式之后做成各种形式的组合物。只要是能够按规定比例混合L-抗坏血酸类和脂肪酸类,混合其它成分的顺序、时期没有限制。作为本发明的胶原产生增强剂,为了得到固态形态的制剂,可以将在本发明的胶原产生增强剂中混合的有效成分和其它适宜成分混合后运用减压干燥、真空干燥、温风干燥等通常干燥方法。作为干燥方法,例如当使用本申请人在特开平6-170221号公报中公布的无水α,α-海藻糖时,不经过采用加热的干燥工序就可以很容易得到固态胶原产生增强剂。具体来说,可例举添加与L-抗坏血酸类和脂肪酸类的合计质量大于等于等量的无水α,α-海藻糖等无水糖类,混合后,通常于小于等于常温进行静置或搅拌,做成固态物的方法。对于采用该方法的场合,由于不需要加热,所以具有可以避免对热不稳定的L-抗坏血酸类热失活的优点。作为无水糖类,除了上述无水α,α-海藻糖之外,也可以适当组合使用1种或大于等于2种无水α,β-海藻糖、无水葡萄糖、以及无水麦芽糖等后使用。
这样得到的固态状的本发明的胶原产生增强剂根据需要,再进行粉碎、造粒、压片,可以随意做成粉剂、颗粒剂、片剂、丸(粒)剂。
作为混合了本发明的胶原产生增强剂的饮食品、健康食品、特殊用途食品,例如、冰淇淋、冰点、cho icecream、雪糕(sherbet)等冰果,冰蜜等糖浆,加糖奶油浆、乳蛋糕乳脂、花酱、花生酱、果酱等糊和酱,巧克力、果子冻、木斯、糖果、uiro(asweet rice jelly)、焦糖、口香糖、果冻、约克夏布丁、奶油泡夫、松糕、蛋糕等洋点心,果子酱、橘子果酱、糖浆、糖果等加工果实或加工野菜、豆沙包、面条、馅、羊羹、水羊羹、蛋糕、糖球、米果(包括焼き菓子)等日本点心,酱油、粉末酱油、酱、粉末酱、蛋黄酱、调料、食用醋、三杯醋、餐用糖、咖啡用糖等调味料,合成酒、酿造酒、发泡酒、烧酒、果酒、洋酒等酒类,橙汁、矿物质饮料、碳酸饮料、乳酸饮料、乳酸菌饮料、运动饮料、饮(drinking)剂、绿茶·红茶·乌龙茶等茶饮料、咖啡、可可等清凉饮料、以及维生素类、矿物质类、蛋白质、药用人参、梅肉提取物、松提取物、竹子提取物、银杏提取物、蘑菇提取物、蜂王浆、蜂胶(propolis)、药草、低热量食品、低盐食品、低脂肪食品、自然食品、有机食品、海洋深层水等。
作为混合了本发明的胶原产生增强剂的化妆品或准药品,例如、皮肤外用洗液(lotion)、雪花膏、果子冻、木斯、除臭剂、乳液、固体剂、粉末剂、牙膏、口臭抑制剂、口清洗剂、肥皂、洗手皂、沐浴剂、浴液、洗发剂、洗剂(rinse)、pack、面膜(face mask)、眼膜以及香水等基础化妆品、洗涤用化妆品、入浴用化妆品、pack、口腔化妆品、防晒化妆品、止汗剂、上妆化妆品、头发化妆品(发毛剂、育毛剂、养毛剂、整发剂等)等。
另外作为混合了本发明的胶原产生增强剂的医药品,可例举、液体剂、粉剂、颗粒剂、片剂、软膏、丸(粒)剂、片状剂、外敷膏剂、敷布剂(wet pack)等皮肤外用剂、内服用剂等。
另外,作为混合了本发明的胶原产生增强剂的饲料、饵料、宠物食品,可举出与众所周知的饲料、饵料、宠物食品用材料适当混合后得到的饲料、饵料、娇养动物食品等。
另外,本发明的胶原产生增强剂也可以通过含浸、涂布、喷雾、附着等加到厨房用洗剂、海绵刷、发带、袖口绊带等杂货类、卫生巾等生理用品、以及裤子、裙子、帽子、短袜、长袜、手帕、毛巾、浴巾、手袋、包带、紧腰衣、鞋子、拖鞋等后使用。
为了制造上述各种组合物,在这些组合物制成之前的适当时期内可以混合本发明的胶原产生增强剂。通常、为了防止L-抗坏血酸类的热失活,经由加热工序的场合,希望在该加热工序后添加。
上述各种组合物中的本发明的胶原产生增强剂的混合量,每单位制品质量通常定为大于等于0.001质量%,优选0.01至99质量%,更优选0.05至50质量%。
如果将本发明的胶原产生增强剂或混合了该增强剂的各种组合物应用于生物体,作为有效成分的L-抗坏血酸类与脂肪酸类作用于生物体内皮肤中存在的成纤维细胞,可增强胶原产生。该结果可以强化皮肤、增强皮肤的生物体防御能力、防止伴随年龄增长的皮肤老化、使受到以紫外线为代表的因子导致的损伤的皮肤达到正常化。另外、如果将本发明的胶原产生增强剂应用于生物体,预期还有强化内脏和血管组织的效果。
另外、本发明的胶原产生增强剂如上述那样,由于可带来对皮肤有用的作用效果,所以具有发毛·育毛·养毛作用。因此,如果将本发明的胶原产生增强剂适用于带有体毛·羽毛的狗、猫、马、羊、鸟类等宠物、家畜、家禽,预期有活化这些动物的肌肤或表皮组织,增进体毛、羽毛的发育,改善毛色的效果。另外、将本发明的胶原产生增强剂应用于人的头皮等皮肤时,预期有发毛、育毛、养毛作用。另外,将本发明的胶原产生增强剂和/或含有该增强剂的组合物通过皮肤直接导入生物体时,例如、通过使用同一申请人提出的国际公开第WO 01/60388号公报公布的离子导入工具,可以有效地向皮肤导入该有效成分。
以下根据实验以及实施例对本发明进行更详细说明。
实验1
<来自蜂王浆的胶原产生增强成分的分离与鉴定>
在室温下将巴西产鲜蜂王浆1g悬浊于精制水10mL中,通过3,000rpm、10分钟离心处理,分为上清级分和沈淀级分。向上述沈淀级分中添加1N-NaOH水溶液1mL,使固态物溶解,然后,用1N-HCl水溶液进行中和后,用精制水将全量配到10mL,使用分级分子量5,000道尔顿的UF膜分级为高分子级分和低分子级分。对于各级分运用下面的胶原分析法(以下、称为“胶原分析法”),研究有无胶原产生增强作用。结果表明沈淀级分中的低分子级分(以下、称为“级分A”)的胶原产生增强作用最高。因此,尝试对存在于级分A中的胶原产生增强成分进行分离与鉴定。即、使用C18反相高效液相色谱(以下称为“HPLC”)(柱子尺寸:内径4.6×长250mm、充填剂:硅胶上键合了十八碳烷基的凝胶(Biotech公司制))将级分A分为多个级分,通过胶原分析法特定胶原产生增强活性级分,进行回收。在洗脱时,洗脱速度为0.5mL/分钟,按照0.05%(w/v)三氟乙酸水溶液15分钟、含有乙腈20%(w/v)的0.05%(w/v)三氟乙酸水溶液5分钟洗脱柱子,再用乙腈浓度从20%(w/v)至80%(w/v)直线上升的0.05%(w/v)三氟乙酸水溶液洗脱柱子60分钟,同时于波长210nm处监测洗脱级分的吸收峰,回收这些吸收峰高的级分(级分B)。在波长210nm进行监测的理由是根据预备实验,是级分A中含有的具有胶原产生增强作用成分的吸收波长。再次将级分B于上述条件下通过C18反相HPLC进行层析,表现出胶原产生增强作用的成分(以下、称为“成分X”)在43~44分钟的位置洗脱下来。研究这个成分X的最大吸收波长,结果为215nm。
本发明人等在鉴定成分X时,通过HPLC分析方法,着眼于级分A中含有很多脂肪酸,这些脂肪酸中的70%是10-羟基-2-癸烯酸(10-HDA),作为成分X的候补举出10-HDA。从结论看,这一推定是正确的。即,本发明人等为了阐明成分X与10-HDA的异同,将市售的高纯度试剂10-HDA(アス·ウエル公司制)在与上述同样的条件下进行C18逆相HPLC,结果10-HDA在43.8分钟的位置洗脱下来。该洗脱位置与成分X的位置一致。另外,10-HDA在215nm有最大吸收,与成分X的一致。再将成分X和10-HDA进行薄层硅胶层析(5×15cm),对它们的比移值进行比较研究,结果两者完全一致。另外,为了研究成分X与10-HDA的异同,对于它们的胶原产生增强作用通过胶原分析法进行研究,结果单独10-HDA没有胶原产生诱导作用,在L-抗坏血酸存在下、表现出增强L-抗坏血酸的胶原产生的作用。其结果与成分X的结果一致。
另外,通过质量分析法(MS)测定成分X与10-HDA质谱,进行比较研究,结果两者的分子离子峰(m/z)是185[M-H]-,完全一致。
由以上结果鉴定从鲜蜂王浆纯化分离的成分X是10-HDA。
<胶原分析法>
将人成纤维细胞NHDF细胞(仓敷纺绩株式会社销售)按照细胞浓度达到2.5×104个/孔那样接种到含有添加了10%(v/v)胎牛血清与适量的盘尼西林的Dulbecco改进的Eagle培养基(株式会社日水销售、以下、称为“DMEM培养基”)(pH 7.1~7.4)的96孔微型板(BectonDickinson社销售),在5%(v/v)CO2条件下、于37℃下培养24小时。然后,将培养上清用添加了规定浓度样品和/或50μM的L-抗坏血酸2-葡糖苷(商品名“AA2G”、纯度大于等于98.0%、株式会社林原生物化学研究所制)的DMEM培养基200μL进行交换,培养5日。然后,对上述微型板中的各孔的细胞的胶原产生量用サ-コル·胶原·分析试剂盒(ハ·イオカラ-社制)进行定量。
实验2
<10-HDA的胶原产生增强作用>
通过实验1中所示胶原分析法,就10-HDA的胶原产生增强作用进行研究。即,在胶原分析法中,使用作为样品的150μg/mL的10-HDA和/或与实验1使用的同样的含有AA2G50μM的DMEM培养基,研究由10-HDA引起的胶原产生增强作用。对照为使用不含有样品的含有或不含有AA2G50μM的DMEM培养基的2个系统。结果如图1所示。
就像图1表明的那样,10-HDA在没有AA2G存在下,不表现出胶原产生增强作用。由该结果可判断在10-HDA自身没有胶原产生增强作用。另一方面,10-HDA在AA2G存在下表现出显著的胶原产生增强作用。由该结果得出10-HDA与AA2G并用时可发挥胶原产生增强作用。
另外,对于10-HDA浓度与胶原产生增强作用的关系也进行了研究。即,在胶原分析法中,作为样品,使用0至300μg/mL的10-HDA以及含有AA2G50μM的DMEM培养基,研究10-HDA引起的胶原产生增强作用。作为对照为使用不含有样品的含有AA2G50μM的DMEM培养基的系统。结果如图2所示。
就像图2表明的那样,在AA2G存在下,10-HDA表现出浓度依赖性的胶原产生增强作用。
另外,作为脂肪酸类除了代替10-HDA使用10-羟基癸酸(10H癸酸)、癸酸、2-癸烯酸以及癸二酸以外,其它与上述同样,研究它们的胶原产生增强作用。即,使用作为样品含有0.02、0.06、0.17、0.5或1.5mM上述脂肪酸类任一种的含有AA2G50μM的DMEM培养基,研究它们的胶原产生增强作用。结果如图3所示。
就像图3表明的那样,试验的任一种脂肪酸类与L-抗坏血酸并用时都发挥显著的胶原产生增强作用。在试验的脂肪酸类中,10-HDA的胶原产生增强作用明显高,尤其浓度为大于等于0.17mM时,其作用最大。另外判明胶原产生增强作用首先是10-HDA,然后依10-羟基癸酸、2-癸烯酸、癸酸、癸二酸顺序,它们的作用也基本为浓度依赖性。
实验3
<10-HDA对L-抗坏血酸或AA2G存在下的胶原产生增强作用的影响>
为了研究10-HDA对L-抗坏血酸或AA2G的胶原产生增强作用的影响,进行了下述实验。即,在实验1中所示的胶原分析法中,使用作为样品含有0、0.1、0.2或0.5mg/mL的10-HDA,作为L-抗坏血酸类,含有L-抗坏血酸或按照L-抗坏血酸换算含有AA2G 50μM的DMEM培养基、以及作为样品含有0、0.1、0.2或0.5mg/mL的10-HDA的不含有L-抗坏血酸类的DMEM培养基,对培养细胞中的胶原产生量进行比较研究。结果如图4所示。
就像图4结果表明的那样,在L-抗坏血酸或AA2G存在下,10-HDA表现出浓度依赖性的胶原产生增强作用。另外,由10-HDA引起的胶原产生增强作用,作为L-抗坏血酸类使用AA2G时与使用L-抗坏血酸时进行比较,高约2倍,判明10-HDA与AA2G并用是有用的。
另外,虽然没有给出具体的数据,但与作为L-抗坏血酸类的L-抗坏血酸的盐类、酯类、醚类等L-抗坏血酸衍生物比较,L-抗坏血酸的糖衍生物与以10-HDA为代表的其它脂肪酸类并用时,有发挥更高的胶原产生增强作用的倾向。另外,L-抗坏血酸的糖衍生物中的AA2G与脂肪酸类并用时,发挥更显著的胶原产生增强作用。
实验4
<脂肪酸类对人成纤维细胞中TGF-β产生的影响>
使用补充了10%(v/v)胎牛血清的DMEM培养基,将人成纤维细胞NHDF细胞(仓敷纺绩株式会社销售)按照细胞浓度2.5×104个/孔接种在多个96孔微型板(Becton Dickinson公司销售),在5%(v/v)CO2培养箱中培养24小时。然后,除去培养上清后、将含有0、0.5或1.5mM的10-HDA以及含有AA2G 0.2μg/mL的新鲜DMEM培养基分别加到各个不同的微型板中,培养24小时。然后,通过“TGF-β1E酶放大免疫测定系统(MAX IMMUNO ASSAY SYSTEM)”(Promega公司销售)对各微型板各孔中培养上清中的TGF-β量进行定量统计处理。结果如表所示。
【表1】
10-HDA浓度(mM) | TGF-β产生量(μg/ml) |
0 | 26±46* |
0.5 | 292±68** |
1.5 | 378±74*** |
注:“*”、“**”和“***”分别表示p<0.05、p<0.05及p<0.01。
由表1结果判明在AA2G存在下,10-HDA浓度依赖性地增强人成纤维细胞中的TGF-β产生。
虽然没有给出具体的数据,但10-HDA以外的10-羟基癸酸、癸酸、2-癸烯酸以及癸二酸等脂肪酸类也与10-HDA同样增强TGF-β产生。
以下,根据实施例对本发明进行更详细说明。
实施例1
<胶原产生增强剂>
将以下所示各成分按照规定混合比例均匀混合,利用常规方法压片,制备每一片含300mg的本发明的胶原产生增强剂。本品适于用作包括人在内的动物的胶原产生增强剂。另外,本品也具有作为TGF-β产生增强剂的功能。
<成分>
L-抗坏血酸2-葡糖苷 20质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
10-HDA 0.1质量份
芽霉多糖 5质量份
精制水 5质量份
实施例2
<胶原产生增强剂>
将以下所示各成分按照规定混合比例均匀混合,流延到塑料制板上,于45℃下干燥过夜,裁成每边2cm的正方形,制得厚0.5mm的薄膜状胶原产生增强剂。本品日常通过口服摄取,或放置在预先涂了水或化妆水等的皮肤部位后使用的方法使用,可以有效增强皮肤的胶原产生,预防、改善小皱纹,赋予肌肤弹性和润滑。
<成分>
L-抗坏血酸2-葡糖苷 1质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
10-HDA 0.01质量份
无水结晶麦芽糖 1质量份
(商品名“フアイソト-ス”(注册商标)、株式会社林原商事销售)
三氯蔗糖 0.01质量份
芽霉多糖 10质量份
精制水 20质量份
实施例3
<胶原产生增强剂>
将以下所示各成分按照规定混合比例均匀混合,进行膜过滤,填充到200mL容量活塞式喷雾容器中,得到本发明的胶原产生增强剂。本品通过将它适量喷雾到人或动物的皮肤使用,使在包括人在内的动物的皮肤中胶原产生增强,对生毛、育毛、毛色的改善发挥显著效果。另外,本品还具有作为TGF-β产生增强剂的功能。
<成分>
L-抗坏血酸2-葡糖苷 20质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
10-HDA 10质量份
精制水 100质量份
防腐剂 1质量份
实施例4
<健康食品>
将以下所示各成分按照规定混合比例均匀混合,通过常规方法于常温下减压干燥过夜后,用粉碎机破碎,得到作为本发明粉末状胶原产生增强剂发挥功能的健康食品。本品适合用作包括人在内的动物的胶原产生增强剂。另外,本品还具有作为TGF-β产生增强剂的功能。
<成分>
L-抗坏血酸2-葡糖苷 1质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
实验1中精制得到的成分X(10-HDA) 0.05质量份
2含水结晶海藻糖 2质量份
(商品名“トレハ”(登录商标)、株式会社林原商事销售)
本品作为具有柔和甜味和适度酸味,长期保存稳定性优越、具有胶原产生增强作用的健康食品有用。本品由于可以直接,或通过与适量的水等溶剂一起,或使它们溶解或分散于这些溶剂来容易地摄取,所以可作为人以及宠物或家畜等动物的口服摄取或经管给予用组合物,对于鱼、兔、虾、蟹等养殖鱼贝类可以直接或混合在饵料等中使用。
实施例5
<健康食品>
将以下所示各成分按照规定混合比例均匀混合,进行减压干燥,得到作为含水量5%的口服用粉末胶原产生增强剂发挥功能的健康食品。本品可有效用作人以及家畜、家禽、宠物(也包括昆虫)、观赏鱼用的胶原产生增强剂。另外、本品还具有作为TGF-β产生增强剂的功能。
<成分>
L-抗坏血酸钠 1.5质量份
L-抗坏血酸2-葡糖苷 1.0质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
10-HDA 0.25质量份
糖转移芸香甙(saccharide-transferred rutin) 1.0质量份
(商品名“αGルチソ”、株式会社林原商事销售)
无水结晶麦芽糖醇 1.5质量份
海藻糖 0.2质量份
精制水 10.0质量份
实施例6
<冰淇淋>
将鲜奶油(油脂含量约46质量%)15质量份、脱脂奶粉3质量份、全脂奶45质量份、海藻糖10质量份、芽霉多糖1质量份的混合物加热溶解,于65℃下保持30分钟杀菌后,通过匀浆机乳化分散,然后急冷至4℃,向其中加实施例1中得到的胶原产生增强剂0.5质量份,混合后,100g一份填充到适当容器,在-20℃冷冻,得到冰淇淋。
本品是具有胶原产生增强作用的适度甜味和优质风味的冰淇淋,日常吃可赋予皮肤润滑,防止皮肤老化。
实施例7
<果冻(fruit jelly)>
将以下所示成分中的蔗糖、海藻糖、明胶以及水加入到适当容器中,于95℃下加热溶解后,加蜜柑汁后混合,在80℃下进行30分加热杀菌,再加L-抗坏血酸2-葡糖苷(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)和加热处理的蜂王浆后进行冷却,制造果冻。
<成分>
蔗糖 10.0质量份
含水结晶海藻糖 2.0质量份
明胶 2.5质量份
蜜柑汁(L-抗坏血酸含量3%) 32.0质量份
精制水 45.0质量份
L-抗坏血酸2-葡糖苷 1.0质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
10-羟基癸酸 0.01质量份
10-HDA 0.01质量份
本品是具有胶原产生增强作用、有适度甜味和可柔软组织、保持肌肤健康状态,防止肌肤老化,保持、增进美容和健康的果冻。
实施例8
<健康饮料>
将以下所示成分按规定比例在适当容器中均匀混合,使得到的混合物25质量份分散、溶解于精制水150质量份,按一份200g装入褐色玻璃瓶中,于65℃下进行30分钟加热杀菌后得到健康饮料。
<成分>
无水结晶麦芽糖 500质量份
L-抗坏血酸2-葡糖苷 30质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
L-抗坏血酸钠 6质量份
10-HDA 2质量份
10-羟基癸烯酸 1质量份
蛋黄粉末 190质量份
脱脂奶粉 200质量份
氯化钠 4.4质量份
氯化钾 1.85质量份
硫酸镁 4质量份
硫胺素 0.01质量份
维生素E醋酸酯 0.6质量份
尼克酰胺 0.04质量份
糖转移桔皮苷 0.02质量份
(“αG桔皮苷PS”、东洋精糖株式会社销售)
本品作为具有胶原产生增强作用的用于美容、健康的饮料,以及作为经管给予用组合物可有利使用。
实施例9
<皮肤外用雪花膏>
向由规定混合量构成的如下所示成分1中添加成分2,于60℃下边加热搅拌边进行混合,冷却至室温后,加由规定混合量构成的成分3后,用氢氧化钾调到pH 6.5后,用匀浆机乳化、分散,制造具有胶原产生增强作用的皮肤外用雪花膏。
<成分1>
单硬脂酸聚氧化乙烯甘油酯 2.0质量份
自乳化型单硬脂酸甘油酯 5.0质量份
山嵛酸二十烷酯 1.0质量份
液体石蜡 1.9质量份
三辛酸三烃甲基丙烷 10.0质量份
<成分2>
1,3-丁二醇 5.0质量份
乳酸钠液 10.0质量份
高丽人参提取物 1.5质量份
对羟基苯甲酸甲酯 0.1质量份
透明质酸钠 0.1质量份
硫酸软骨素 0.1质量份
甘草提取物 0.5质量份
精制水 62.4质量份
<成分3>
L-抗坏血酸2-葡糖苷 2质量份
(商品名“AA2G”、株式会社林原生物化学研究所销售)
10-HDA 0.01质量份
癸二酸 0.01质量份
本品通过来自于成纤维细胞的TGF-β产生诱导,增强皮肤中胶原产生,保持皮肤水嫩、赋予肌肤弹性和润滑,防止肌肤僵硬的效果、对肌肤的保湿作用效果也好,所以作为基础化妆品也有用。
当本发明的胶原产生增强剂以口服或非口服方式应用于包括人在内的动物时,确实、且稳定地增强这些生物体皮肤中的胶原产生。即,通过将本发明的胶原产生增强剂应用于包括人在内的动物,可以发挥防止皮肤老化,促进、保持体毛、羽毛的成长,在美容与健康的保持、增进中有用的优越作用效果。
本发明的胶原产生增强剂作为有效成分的L-抗坏血酸类以及脂肪酸类任一种是可以无副作用、安全地混合在食品、化妆品或药品等的成分。另外、应用本发明的胶原产生增强剂,由于正确混合这些有效成分的期待量,所以工业化制造时,其品质管理很容易。另外,本发明的胶原产生增强剂由于并不混合高价的蜂王浆类,所以与以往的由L-抗坏血酸类和蜂王浆类构成的胶原产生增强剂比较,还具有可廉价制造的优点。
因此,本发明的胶原产生增强剂,除了本身可作为胶原产生增强剂利用的同时,也可以与从食品、健康食品、特殊用途食品、化妆品、药品、准药品、以及饲料、饵料、宠物食品用材料选择的1种或大于等于2种材料混合,做成各种食品、健康食品、特殊用途食品、化妆品、药品、准药品、以及饲料、饵料、宠物食品等各种形式的组合物利用。
另外,根据本申请说明书公布的从鲜蜂王浆分离脂肪酸类的方法,在本发明的胶原产生增强剂中,工业上可以容易、而且价廉地制造可作为有效成分使用的脂肪酸类。
本发明是起到如此显著作用效果的发明,是对本领域的确具有很大意义的发明。
Claims (16)
1.胶原产生增强剂,其中,作为有效成分含有L-抗坏血酸和/或其类似物和脂肪酸类。
2.权利要求1所述的胶原产生增强剂,其特征是相对于总组合物质量,按L-抗坏血酸质量换算,含有大于等于0.01质量%的L-抗坏血酸和/或其类似物。
3.权利要求1或2所述的胶原产生增强剂,其中相对于根据L-抗坏血酸质量换算的L-抗坏血酸和/或其类似物1质量份,含有大于等于0.0001质量份的脂肪酸类。
4.权利要求1、2或3所述的胶原产生增强剂,其中脂肪酸类来自蜂王浆。
5.权利要求1至4任一项所述的胶原产生增强剂,其中脂肪酸类是从10-羟基-2-癸烯酸、10-羟基癸酸、癸酸、2-癸烯酸和癸二酸中选择的1种或大于等于2种。
6.权利要求1至5任一项所述的胶原产生增强剂,其中还含有从饮食品、特殊用途食品、化妆品、药品、准药品、饲料、饵料以及宠物食品用材料中选择的1种或大于等于2种的其它成分。
7.权利要求6所述的胶原产生增强剂,其中其它成分是从抗氧化剂、增粘剂、稳定剂、赋形剂、增量剂、pH调节剂、增粘剂、酸味剂、提取物类、糖类、葡糖胺聚糖、糖醇类、氨基酸类、L-抗坏血酸以及其类似物以外的维生素类、水、醇、淀粉质、蛋白质、纤维质、脂质、矿物质、着香料、着色料、甜味料、调味料、香辛料、防腐剂、乳化剂以及表面活性剂中选择的1种或大于等于2种的成分。
8.权利要求1至7任一项所述的胶原产生增强剂,其中L-抗坏血酸的类似物是从L-抗坏血酸的盐类、L-抗坏血酸2-糖苷以及L-抗坏血酸2-葡糖苷中选择的1种或大于等于2种的物质。
9.权利要求8所述的胶原产生增强剂,其特征是L-抗坏血酸2-糖苷至少含有L-抗坏血酸2-葡糖苷。
10.权利要求7所述的胶原产生增强剂,其中葡糖胺聚糖是从软骨素、硫酸软骨素、硫酸皮质素、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、透明质酸以及aluronic acid的盐类中选择的1种或大于等于2种。
11.含有权利要求1至10任一项所述的胶原产生增强剂的饮食品、健康食品或特殊用途食品。
12.含有权利要求1至10任一项所述的胶原产生增强剂的化妆品。
13.含有权利要求1至10任一项所述的胶原产生增强剂的药品或准药品。
14.含有权利要求1至10任一项所述的胶原产生增强剂的饲料、饵料或宠物食品。
15.一种权利要求1至10任一项所述的胶原产生增强剂的制造方法,其特征是经过混合L-抗坏血酸和/或其类似物和脂肪酸类的工序。
16.从鲜蜂王浆分离脂肪酸类的方法,包括将鲜蜂王浆悬浊于溶剂的工序;将得到的悬浊液进行离心分离和/或过滤,分为上清级分和沈淀级分的工序;将得到的沈淀级分用碱剂溶解的工序;将得到的溶液用酸剂进行中和的工序;以及将中和后得到的溶液进行膜分离,收集脂肪酸类的工序。
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