CN1816280A - 真皮微器官和产生及应用该真皮微器官的方法和装置 - Google Patents

Abstract

本发明的实施方案提供了真皮微器官(DMO)和产生及应用所述DMO的方法和装置。本发明的一些实施方案提供了具有多个真皮成分的DMO，其基本上保持它们所来源的真皮组织的微观结构和三维结构，具有选定的尺寸从而允许充足的养分和气体被动扩散至所述真皮微器官的细胞以及细胞废物扩散出所述细胞，从而将由于在所述真皮微器官中营养不足和废物积累所致的细胞毒性和伴随的死亡减至最低。本发明的一些实施方案提供了用于采集DMO的方法和装置。根据一些示例性实施方案，用于采集DMO的装置可包括一支撑构造，用于支撑待从中采集DMO的皮肤相关组织结构，和一能够将DMO从所述皮肤相关组织结构中分离的切割工具。还描述和要求保护其它的实施方案。

Description

真皮微器官和产生及应用该真皮微器官的方法和装置

发明领域

本发明涉及基于组织的微器官、治疗性的基于组织的微器官以及采集、加工、植入和操作真皮组织的方法和装置的领域。

发明背景

已知有多种输送治疗剂的方法。例如，治疗剂可以经口服、透皮、吸入、注射及带缓释的药物库(depot)来输送。在每种情况下输送方法均受到治疗剂所经历的机体过程、频繁给药的需要以及可以应用的分子的大小的限制等方面的限制。对于某些方法，治疗剂的量在不同给药之间变化。

可以以自主功能状态在体外(“回体(ex vivo)”或“体外(invitro)”)保持一段延长时间并且对其可以施加各种操作的真皮微器官(Dermal Micro Organ，DMO)随后可以皮下植入或体内植入以用于治疗疾病或病变，或者用于整形外科手术目的。DMO可以被修饰以表达感兴趣的基因产物。这些修饰的真皮微器官通常被称作真皮治疗性微器官(Dermal Therapeutic Micro Organ，DTMO)。

已经观察到例如如PCT/IL02/0880所述的包括表皮和真皮组织层在内的皮肤微器官与各种临床挑战相关。采集皮肤样品使得在患者身上留下一个表面伤口，其可能持续几周并且可能留下疤痕。采集的皮肤样品需要大量的处理以从这一样品产生微器官。而且，已经发现在皮下或者在机体更深处植入皮肤微器官导致产生角质囊肿(keratincyst)或角质微囊肿(keratin micro-cyst)。另外，皮肤微器官作为移植物植入皮肤表面上的狭长裂口(slit)需要很高的技术能力来处理MO且同时保持其合适的方向。

采集真皮以例如用作整形外科或美容方法中的“填充材料(fillermaterial)”是现有技术中已知的。传统的采集技术包括使用取皮机或解剖刀剥离表皮层以暴露真皮部分。然后可再次使用取皮机或解剖刀以手工采集真皮的暴露部分。

另一项不常用的采集真皮的常规装置是Padgett出产的MartinDermal Harvester(Part No.P-225)，其提示了从背部采集真皮核心，从而随后在美容厚唇程序中植入嘴唇中。为了操作这一不常用的装置，将一种锋利的切割管(其包括内径约4.5mm的可重复利用的厚壁管)以非常低的速度进行手工旋转。使用这一类型装置通常需要直接在采集部位上方向皮肤表面施加压力，并且随着切割管的前进而通过主动牵引而实现缝合。另外，所得到的采集的真皮通常在尺寸上不均匀并且在真皮核心的一端包括表皮“塞(plug)”。

发明概述

本发明一些方面的实施方案提供了DMO/DTMO，其能够以通常存活状态保持在体外(ex vivo)，使得在DMO上实现各种操作，而同时保持所希望的治疗剂的高生产和分泌水平。另外，本发明的一些方面的实施方案提供了采集DMO并随后植入DTMO的方法，其在例如将DTMO植入皮下或机体的更深处时不会形成角质囊肿或角质微囊肿。另外，本领域技术人员能够理解本发明一些实施方案的方法和装置可以是相对不复杂的，因此对实现本发明方法和/或使用本发明装置的专业人员的技术水平的需求可不像常规方法所需求的那样高。

本发明的一些举例实施方案提供了具有多种真皮组分的真皮微器官(DMO)，其包括真皮组织细胞和周围基质。本发明实施方案的DMO通常可以保持其所获自的真皮器官的微观结构和三维结构，并且DMO的尺寸可以使得充足的养分和气体被动扩散进细胞以及细胞废物扩散出细胞，从而使由于养分不足和废物积累导致的细胞毒性和伴随的死亡降至最低。

在本发明的一些示例性实施方案中，本发明的真皮微器官不产生角蛋白或者产生可忽略量的角蛋白。

在本发明的一些实施方案中，在植入皮下或机体更深处后，所述真皮微器官不产生角蛋白和/或角质囊肿。

在本发明的另一实施方案，本发明的真皮微器官会产生微小的角质囊肿，其随后在相对较短的时间例如皮下植入后几天或几周内萎缩。

在本发明的另一实施方案中，本发明的真皮微器官含有毛囊和皮脂腺，它们在短时间例如几天或几周后萎缩。

在本发明的另一实施方案中，本发明的真皮微器官含有腺体，其在短时间如几天或几周后与皮肤表面相接。

本发明的进一步的示例性实施方案提供了采集真皮微器官的方法和装置。所述方法可包括稳定和/或支撑一种待采集真皮微器官的皮肤相关组织结构，从而例如所述皮肤相关组织结构保持在所希望的形状和/或位置，从所述皮肤相关组织结构分离至少一部分真皮微器官，以及将所述分离的真皮微器官从机体分离出。根据一些示例性实施方案，支撑构造可包括一种第一管状构件，切割工具可包括一种第二管状构件，该第二管状构件适于沿第一构件呈基本同轴方向插入。根据其它的示例性实施方案，支撑构造可包括一真空腔，其具有能将皮肤相关组织结构保持在所希望的形状和/或位置的内支撑表面，以便使切割工具能从所述皮肤相关组织结构分离DMO。

本发明的进一步示例性实施方案提供了表达至少一种重组基因产物的遗传修饰的真皮微器官，所述真皮微器官具有多个真皮成分，包括真皮组织的细胞和基质，它们保持其所来源的真皮组织的微观结构和三维结构，并且具有所选择的尺寸从而可以向细胞被动扩散充足的养分和气体并且将细胞废物扩散出细胞外以使由于养分不足和废物积累导致的细胞毒性和伴随的死亡最小化，其中所述真皮微器官的至少一些细胞表达至少一种重组基因产物或至少所述一种重组基因产物的至少一部分。

本发明的进一步示例性实施方案提供了表达至少一种重组蛋白的遗传修饰的真皮微器官，所述真皮微器官具有多个真皮成分，包括真皮组织的细胞和基质，它们保持其所来源的真皮组织的微观结构和三维结构，并且具有所选择的尺寸从而可以向细胞被动扩散充足的养分和气体并且将细胞废物扩散出细胞外以使由于养分不足和废物积累导致的细胞毒性和伴随的死亡最小化，其中所述真皮微器官的至少一些细胞表达至少一种重组蛋白的至少一部分。

在本发明的一些实施方案中，本发明的遗传修饰的真皮微器官基本上不产生角蛋白。

在本发明的一些实施方案中，本发明提供了一种向受体输送由真皮微器官产生的重组基因产物的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了一种通过在受体中植入真皮微器官而导入局部或系统性生理效应的方法。

在另一实施方案中，本发明提供了一种输送感兴趣的蛋白质给一个个体的方法。所述方法包括将遗传修饰的真皮微器官植入皮肤中、植入皮肤下或植入机体的其它部位。

在另一实施方案中，本发明提供了一种植入真皮微器官从而避免或降低角质囊肿形成的方法。

附图简述

以下参照附图描述本发明的非限制性实施方案。在附图中，在一个以上图中出现的相同或类似的结构、构件或其部分在它们所出现的图中通常用相同或类似的标记代表。图中所示成分和特征的尺寸主要是为方便和清楚而选择，而非大小必须是这样。

图1是根据本发明的一个示例性实施方案，产生和利用真皮治疗性微器官(DTMO)的示例性方法的示意性框图流程图。

图2A和2B分别显示了根据本发明的一个实施方案，植入前的mINFα-TMO和hEPO-TMO的体外分泌以及其植入后的血清体内水平之间的相关性分析。

图3A和3B分别显示了根据本发明的一个实施方案，在自体TMO植入小型猪后由ELISA分析测定的升高的血清hEPO水平和网织红细胞计数升高。

图4是显示从六种不同人皮肤制备的DTMO-hEPO分泌人促红细胞生成素(hEPO)的水平的示意图。

图5显示了DTMO和分层皮肤TMO(split thickness skin TMO)的组织学。

图6显示了DTMO的免疫组织化学(IHC)和苏木精曙红(H&E)染色。

图7证实将DTMO-hEPO和分层皮肤TMO-hEPO皮下植入SCID小鼠后的体内hEPO血清水平和对血细胞比容水平的生理学作用。

图8显示了皮下植入SCID小鼠中的DTMO-hEPO和分层皮肤TMO-hEPO的临床和组织学分析。

图9显示了接入皮肤裂缝(skin slit)中的皮肤MO(分层皮肤MO，右侧)或皮下植入健康志愿者中17天后的皮肤MO(DMO，左侧)的组织学分析。

图10是示出本发明一些示例性实施方案中的采集DMO的方法的示意性流程图。

图11a-11c是根据图10的方法采集DMO的示例性步骤的示意图。

图12是根据本发明的一些示例性实施方案的真皮采集装置可以使用的夹持工具示意图。

图13是根据本发明的一些示例性实施方案的真皮采集装置的示意图，该装置包括一个插入源组织获取DMO的钻取管(coring tube)，并且用一内导引针(inner guide needle)共轴采集。

图14a-14c分别是根据本发明的一个示例性实施方案的真皮真空采集装置的正视图、侧视图和俯视图。

图15是根据本发明的一个示例性实施方案将真皮微器官保持在希望的位置的图14a-14c的装置的横截面侧视图。

图16是在外部保持待采集的真皮微器官在一希望位置的图15的装置的横截面侧视图。

图17是根据本发明的另一示例性实施方案的真皮采集装置的示意图。

图18是根据本发明的再一示例性实施方案的真皮采集装置的示意图。

图19是操作图18的采集装置以用于采集DMO的示意图。

图20是根据本发明的一些实施方案的DTMO植入方法的流程图。

图21是根据本发明的一些实施方案的DTMO切除方法的流程图。

图22是根据本发明的一些实施方案的处理采集的DMO的系统的示意图。

示例性实施方案的详细描述

以下描述使得本领域技术人员能够根据特定的应用及其需求制造和使用本发明。所描述的实施方案的各种改变对于本领域技术人员而言是显而易见的，本文所描述的一般原理可以适用于其它实施方案。因此，本发明并非限于所显示和描述的特定实施方案，而是符合与本文公开的原理和新特征相符合的最宽的范围。在其它情况中，在不妨碍本发明的情况下，一些熟知的方法、程序和成分没有详细描述。

在以下详细描述中，指出了各种具体的细节以便详细理解本发明。但是，本领域技术人员能够理解本发明无需这些具体细节即可实施。

本文所用术语的示例性定义

本文所用术语“外植体(explant)”在本发明的某些实施方案中是指从一个个体的一或多种组织或器官取下的活组织或器官部分。

本文所用术语“真皮微器官”或“DMO”在本发明的某些实施方案中是指来自一外植体的或与该外植体相同的分离的组织或器官结构，其以一种有益于细胞存活性和功能的方式被制备，并且保持至少一些与其所来源的组织或器官相似的体内相互作用。真皮微器官可包括多个保持了其所来源的组织或器官的微观结构和其所来源的真皮组织的三维结构的真皮成分，其尺寸的选择是允许充足的养分和气体能被动扩散至MO内的细胞并且允许细胞废物扩散出MO的细胞，从而使由于营养不足和废物积累所致的细胞毒性和伴随的死亡最小化。真皮微器官可基本上由多个真皮成分(位于表皮之下的皮肤组织成分)组成。这些成分可含有皮肤成纤维细胞、上皮细胞、其它细胞类型、毛囊基部、神经末梢、汗腺和皮脂腺以及血管和淋巴管。当下文使用时，与MO相关的实施方案的描述也涉及真皮MO。当使用术语“真皮组织”时，其也涉及“真皮器官”。

本文所用术语“微观结构(microarchitecture)”在本发明的某些实施方案中是指外植体这样的特征，其中在一个实施方案中至少约50％、在另一实施方案中至少约60％、在另一实施方案中至少约70％、在另一实施方案中至少约80％、在另一实施方案中至少约90％或更多的群体细胞在体外保持它们与其在体内所物理和/或功能性接触的至少一个细胞或非细胞物质的物理和/或功能性接触。优选地，外植体的细胞保持其所分离自的器官或组织的至少一种生物学活性。

本文所用术语“供体”在本发明的某些实施方案中是指一个对象，从该个体取出了外植体并用于形成一或多个微器官或者其已经呈一或多个微器官的形式。

本文所用术语“治疗性微器官(TMO)”在本发明的某些实施方案中是指可以用于实现治疗目的的微器官(MO)，例如一种已被遗传改变或修饰以产生一种治疗剂如蛋白质或RNA分子的MO。治疗剂可以是天然存在的机体物质或者可以不是。当以下使用时，相关于TMO的实施方案的描述也涉及DTMO，其是一种在本发明的某些实施方案中可以是遗传修饰的治疗性真皮MO。

本文所用术语“植入(implantation)”在本发明的某些实施方案中是指将一或多个TMO或DTMO导入一个受体，其中所述TMO或DTMO可以来自受体的组织或者来自另一个体或动物的组织。TMO或DTMO可以通过皮下植入而植入皮肤内的一个裂缝中，或者通过放置在受体体内其它希望的部位而植入。

本文所用术语“受体”在本发明的某些实施方案中是指一个对象，其中植入了一或多个TMO或DTMO。

本文所用术语“夹持(clamping)”(例如皮肤)可以指任何类似的动作或具有类似目的的动作，例如“捏(pinching)”(例如皮肤)。

本文所用术语“体外(in vitro)”应被理解为包括“回体(ex vivo)”。

本文所用术语“钻取管(coring tube)”可以单独地或统称地涉及术语“切割工具”、“切割管”和“钻取针”以及具有类似功能的任何其它构件。

尽管为了描述的清楚和完整，本文中描述的DTMO的产生和应用的所有方面并且本发明的实施方案的描述从过程的起始描述到结束，但是应理解的是，本文描述的每一方面可以与实现其它方面的其它方法学和/或设备一起应用并且可以用于其它目的，这些其它目的中的一些在本文中有描述。本发明包括用于制备和保持真皮微器官以转化成DTMO的那些部分。应理解的是根据本发明的这些方面产生的真皮微器官可以用作转化成DTMO以外的其它目的。

在本发明的一些实施方案中，微器官是包括多种真皮成分的真皮微器官，所述多种真皮成分例如为成纤维细胞和/或含有神经末梢和/或汗腺和/或皮脂腺和/或血管和淋巴管和/或弹性蛋白纤维和/或胶原蛋白纤维的上皮成分和/或内皮成分和/或免疫系统衍生的细胞和/或胞外基质。如以下实施例部分总结的测试结果所示(实施例5、图8)，在小鼠和猪(在猪中的数据未示出)中进行包括表皮层的微器官(“分层皮肤MO”)的传统皮下植入可能导致角质囊肿或大角质囊肿的形成。相反，当根据本发明示例性实施方案取皮肤组织样品以获得DMO时，在小鼠、猪或人中未观察到囊肿或大囊肿。应注意的是根据本发明的实施方案的DTMO的生物学活性(例如，对治疗性蛋白质例如促红细胞生成素的分泌以及其所导致的血细胞比容的升高)可以与分层皮肤衍生的TMO相当或甚至更高(见实施例4)。也即，两种类型的制备方法可以释放相同量的促红细胞生成素；但是DTMO每单位可产生和分泌比分层皮肤衍生的TMO更高的蛋白质水平。

总之，DTMO的产生可以包括DMO采集、保持DMO和/或修饰DMO和/或对它们进行遗传改变，以及在某些实施方案中验证DMO是否产生所需药剂(例如蛋白质)。DTMO的应用可包括在患者或动物自身身体内产生治疗性物质如蛋白质以治疗对象。例如，DTMO可被植入对象皮肤内或皮肤下或身体内以体内产生药剂/蛋白质。在组织来源于另一对象的情况中，任选地植入体被保护例如通过将DTMO装入免疫保护性囊(capsule)或鞘(sheath)而免于与受体的免疫系统反应。例如，可放置一种膜来围绕DTMO，这可以通过在植入前将DTMO置于囊中来实现，或者以其它方式实现。膜的孔大小应足够大以允许养分、废物和治疗剂的穿过，且足够小以防止免疫系统细胞穿过。

在本发明的一些实施方案中，真皮微器官可以含有基底表皮层的组织和任选地皮肤其它表皮层。在其它一些实施方案中，真皮微器官不包括基底层组织。

在本发明的一些实施方案中，DMO不包括表皮层。在其它一些实施方案中，DMO可含有几层表皮组织。

在本发明的一个实施方案中，DMO包括整个真皮剖面(cross-section)。在本发明的另一实施方案中，真皮微器官包括真皮剖面的一部分。在另一实施方案中，DMO包括真皮剖面的大部分，即真皮各层和成分的大部分，包括乳头状和网状真皮。在另一实施方案中，DMO主要包括真皮组织，但也可包括脂肪组织。在本发明的一些实施方案中，DMO不产生角蛋白或产生可忽略量的角蛋白，从而防止在皮下植入受体后产生角质囊肿。

待采集的DMO可以通过现有技术中已知的任何切除组织的手段如活检法从身体中切下。采集程序保持组织微观结构完整。在一个实施方案中，DMO可通过直接活检获得，然后被切割成所需大小或者从其中切割掉不希望的组织。在另一实施方案中，组织样品可以通过直接活检获得，其获得所需大小的真皮微器官而无需进一步加工。

在本发明的一些实施方案中，真皮微器官直接从身体采集，用于采集真皮微器官的切割工具的大小可以例如直径为约1-4mm。在另一实施方案中，尺寸可以是例如直径1.71mm。在另一实施方案中，尺寸可以是例如直径1-3mm。在另一实施方案中，尺寸可以是例如直径2-4mm。在另一实施方案中，尺寸可以是例如直径1-2mm。在另一实施方案中，尺寸可以是例如直径约1.5mm。在另一实施方案中，尺寸可以是例如约2mm。在一些实施方案中，采集的真皮微器官可以在采集后不保持其圆柱体形状，即其剖面的至少一维可以扩大，而其剖面的至少另一维可以收缩。在一个实施方案中，至少一维可以是0.5-3.5mm且至少一维可以是1.5-10mm。

在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约5-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约10-60mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约20-60mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约20-50mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约20-40mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约20-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约30-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约40-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约50-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约60-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约70-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约80-100mm。在另一实施方案中，被采集的组织的尺寸可以是例如长度为约90-100mm。在本发明的一些实施方案的一个方面，在采集过程中可以使用一种封闭的、无菌的生物反应器装置来携带、支撑和/或改变DMO或DTMO。在另一实施方案中，长度可以是约20mm。在另一实施方案中，长度可以是约30mm。在另一实施方案中，长度可以是约40mm。

当真皮MO具有上述尺寸时，其可以在合适的组织培养条件下体外保持在例如生长培养基中一段延长时间，例如几天、几周或几个月。DMO可以例如体外保持在已知成分的生长培养基中。在一个示例性实施方案中，生长培养基可以包括生长因子、胎牛血清(FCS)或人血清，例如合成血清替代品(SSS)。在另一示例性实施方案中，生长培养基可包括来自供体或受体对象的血清。在另一实施方案中，生长培养基可包括自体血清。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，在采集、改变和植入全过程中、例如从采集至植入，可以使用一种封闭的、无菌的生物反应器装置来携带、支撑和/或改变DMO或DTMO，如下例如参照图22所详细描述。根据一些示例性实施方案，生物反应器装置的至少一部分可以由可置换材料形成。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，生物反应器装置可以置于一底座中，其可以用于进行各种方法和/或保持DMO/DTMO在所希望的条件下。装置可以任选地根据一个方案由计算机控制。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，仅仅是所产生的DTMO的一部分可以用于给定的治疗过程。其余的DTMO可以返回进行保持和/或可以被贮存(例如低温或其它方式)以便以后使用。

本发明的一些实施方案的一个特征是许多真皮微器官可以在一种分批方法中一起被加工成DTMO，如下所述。这使得加工更方便，但是却不能单独测定每一DTMO的分泌水平。

在本发明的一些示例性实施方案中，可以对可以由一个单DTMO或一批DTMO产生和/或分泌的治疗剂进行一种效力分析。效力分析可包括例如细胞增殖分析，其中细胞的增殖应答主要依赖于治疗剂在细胞的生长培养基中的存在。

本文所用术语“皮肤相关组织结构”是指组织成分的一种结构，其可以由本文定义的装置稳定化和/或支撑从而使得可以从其采集真皮微器官。皮肤相关组织结构可以包括表皮组织成分和真皮组织成分。任选地，皮肤相关组织结构可以包括位于真皮组织附近的脂肪组织和/或肌肉组织。

根据本发明的一些实施方案，采集皮肤微器官的方法可以包括稳定和支撑待采集真皮微器官的皮肤相关组织结构，从而至少真皮微器官和/或其附近的一或多种其它组织片段被保持在所希望的形状和/或位置，从周围组织分离至少一部分真皮微器官，以及提取所分离的真皮微器官，如下所详细描述。

图1以框图形式显示了根据本发明的一个示例性实施方案的用于产生和应用DMO和DTMO的方法学200的概括。在框202，从一个对象采集DMO。在本发明的一些实施方案中，DMO采集自稍后要进行治疗的同一对象。在本发明的一个实施方案中，DMO来自真皮组织。任选地，以与以下参照真皮组织描述的类似的方式采集和使用其它组织。但是，下面描述的方法是示例性的，其它的采集组织样品的方法可以用在本发明的一些实施方案中。如果需要，DMO可以低温储存直至以后使用(即在方法的同一阶段引入)。或者，对于某些实施方案，DMO可以直接植入回到其所采集自的患者以产生治疗性、美容性或其它生理学影响。

为了使DMO成为活的微器官，其必须有至少一维尺寸足够小从而养分可以从接触DMO的营养培养基扩散到DMO的所有细胞，并且废产物可以扩散出DMO进入培养基中。这使得DMO能在体外存活足够长以进行以下描述的进一步加工以及任选地进一步应用DMO作为治疗剂如蛋白质的来源。如上所述的采集DMO的方法通常产生具有几个月的体外寿命的DMO。

采集DMO后，任选地目视检查以确定其合适地形成并且其具有所希望的尺寸。检查也可以光学手段进行。任选地将其置于一架子上并运送(框206)至一装置(生物反应器，如下文所述)，在该装置中其可以被遗传改变。制备一合适的遗传修饰剂(框208)。制备遗传修饰剂的另外的示例性方法包括用预定的稀释缓冲液产生修饰剂例如一种病毒载体的具有所需量的等份，在控制的温度(0-4℃)下可低温储存和融化修饰剂，以及验证修饰剂的活性。所有这些方法均是现有技术中熟知的。在这一点，可以低温储存DMO，以便以后导入方法中的同一处。这可以用已知的利用含有10％DMSO的DMEM培养基的用于组织和细胞的逐渐冷冻方案进行。

在框210，DMO被遗传改变。如上所述，已知有许多遗传改变方法并可与本发明结合使用。作为一个例子，以下的描述基于使用一种病毒载体以将基因导入DMO的细胞中。这一方法是熟知的，以下不进一步描述，但是将病毒导入DMO的特定的方法学和装置将会被描述。

在框212，遗传改变的DTMO任选地被测试以确定治疗剂的产生和分泌率。有各种方法确定分泌的数量，例如ELISA、其它免疫测定、光谱分析等。另外，任选地确定分泌的质量，例如分泌的蛋白质的无菌性和活性。这可以定期进行或者连续线性进行。在这一点DTMO可以低温储存以便以后使用。

在框214和框216，确定产生所希望的治疗效果所需的DTMO的量。如下所示，可以从所测量的分泌率、患者参数和对于估计的或已知的体外分泌和体内血清水平之间的关系的群体统计来估计治疗剂量需求。

在框218，将选定数目的DTMO置于植入工具中。示例性的实施工具如上所述。如果需要，为了同种异体移植或异种移植或者其它原因，DTMO可以被包囊化。如果DTMO必须在转运至植入工具之前被转运，其任选地保持(220)在维持站中，在此温度、湿度等被保持在使得DTMO在转运过程中能存活的水平。剩余的DTMO材料任选地在体外维持以备将来应用。这可以在可延长其体外存活性的暖保温条件(30-37℃)、在上述条件中或在冷保温条件(4℃)下。

在框224，DTMO的一个亚群被植入对象中。植入方法的一个示例性实施方案如上所述。本领域技术人员已知其它方法，这些方法主要基于所使用的微器官的具体几何形状。动物研究已经表明DMO和DTMO在体内保持存活，因为在植入后DTMO在几周和几个月内持续产生和分泌治疗剂(图7)。在动物研究中，在直至160天(或更长)期间内产生了治疗量。当DMO或DTMO的组织看起来是完整的或者被很好地带进其所植入的对象的组织内(特别是如果组织被植入其被采自的同种组织中)时，包括DMO或DTMO的细胞持续产生和分泌治疗剂。

在每种情况下，任选地确定DTMO的体内性质(框228)。基于例如这一评价和/或过去的患者数据(框226)，患者剂量可随后通过增加植入物的量或除去植入物的一部分而调节(框230)，如下所述。随着植入物功效改变，可植入额外的DTMO。

遗传改变可通常包括将选定的一个或多个基因通过遗传工程操作进入细胞，从而使细胞产生并任选地分泌所希望的治疗剂如蛋白质。在本发明的一个实施方案中，在遗传改变过程中保持DMO的方法的至少一部分以及遗传改变本身在一生物反应器中进行，如下所述。

现参照图10，其示意性描述了根据本发明的一些示例性实施方案进行的采集真皮微器官的方法的流程图，还参照图11a-11c，其示意性描述了根据图10的方法采集位于皮肤组织部分1120之下的真皮微器官1160的各代表性阶段。

如框1002所示，所述方法可任选地包括将一种本领域已知的麻醉剂局部给予待采集的DMO的附近。

如框1004所示，所述方法可进一步包括将一种内导杆(innerguide)1110插入组织部分1120。可优选地用外科手术柳叶刀、解剖刀或其它锋利探针在外部皮肤形成细切口(“柳叶刀切口”)，以使得内导杆1110更易于插入，并且还防止采集表皮组织或使表皮组织采集减至最低。内导杆1110还可经切口1190插入部分1120，例如大概平行于皮肤表面和/或位于真皮内所期望的深度或者就在皮肤下。内导杆1110可包括一细的针、杆或能够被置于真皮内或皮下间隙的任何其它合适的细的通常为直的物体。例如，内导杆1110可包括一本领域已知的大小为20-25G、例如约22G的针。内导杆1110可被插入真皮中或皮下间隙和/或被大致水平地推进，即与皮肤表面大致平行。导杆1110在真皮内的穿透长度可大致相应于待采集的DMO的长度。例如，内导杆1110可被手工插入，并且在真皮内经手动导引在所希望的深度，该深度可以在整个插入过程中被保持基本上一致。或者，内导杆1110可随着其被插入通过手工感应纤维质真皮和之下的平滑脂肪层的界限而沿着皮下间隙被插入其中。

如框1006所示，所述方法可任选地包括将内导杆1110例如在切口1130导出皮肤。根据一些示例性实施方案，切口1190和1130之间的距离可大约等于或大于待采集的DMO的所需长度。

如框1008所示，所述方法还可包括将一管状切割工具围绕内导杆1110共轴插入，从而DMO可被捕获，即位于内导杆1110和切割工具之间。这可以通过例如使用具有一大于内导杆1110外径的内径的管状切割工具实现。所述切割工具可包括任何合适的切割工具，例如一种钻取管1150。钻取管1150可包括一大致上对称的锋利的管状工具，例如一hypo管，其加工成具有希望形状的锋利刀刃。钻取管1150可包括例如一标准的医用级管，具有薄壁，例如具有0.05mm至0.3mm的厚度。钻取管1150可具有例如1mm至10mm的直径。钻取管1150的尺寸例如直径和/或内导杆1110的尺寸可基于要采集的DMO的体积和/或尺寸预定。钻取管1150可具有锋利的末端(“尖头”)1140，其适于作为刀刃。优选地在皮肤外表面上产生初始切口例如切口1130之后，钻取管1150可被插入穿过组织部分1120，以防止采集表皮组织。

根据本发明的一个示例性实施方案，例如如图11b所示，所述方法可包括将钻取管1150的末端1140初始定位在内导杆1110的远端上，例如在切口1130，并沿内导杆1110的长度滑动钻取管1150，例如滑向切口1190，以采集真皮DMO。

如框1010所示，在一个实施方案中，所述方法可包括在例如朝向内导杆的近端推进切割工具的同时旋转该切割工具。例如，在钻取管1150被手动或自动推进时，可使用一种医用钻或其它合适的工具或旋转机构旋转该钻取管1150，从而更平稳地采集DMO 1160。例如，钻取管1150的近端1180可被连接至一种医用钻1170，如由AesculapAG & Co.KG，Am Aesculap Platz，D-78532 Tuttlingen，Germany生产的Aesculap Micro Speed钻，其可包括控制装置、马达、连接软线、手机和/或脚踏开关，货号分别为GD650、GD658、GB661、GB166和GB660。这种钻或任何其它合适的钻或旋转机构可用于以适于切割真皮组织的转速、例如相对较高的转速例如高于1000RPM的速度、例如1000RPM至10000RPM之间的速度旋转切割工具的刀刃。例如管1150可被以高于2000RPM、例如约7000RPM的转速旋转。或者，可使用小于1000RPM的相对较低的转速，或者不旋转，如下所述。任选地，钻的转速可以摆动方式变化，即旋转方向可定期在“顺时针”和“逆时针”方向之间变化。当由钻1170旋转时，钻取管1150可被手动或自动推进，例如朝向内导杆1110的近端，例如朝向切口1190。所述方法还可包括例如当尖头1140前进至刚超过切口1190时，停止钻取管1150的前进运动。根据本发明的一些示例性实施方案，管1150的至少部分内表面和/或外表面可被一种低摩擦材料如Teflon、Parylene或任何其它合适涂覆材料涂覆，以便在后续作用中易于将采集的组织从切割工具的内表面分离和/或降低在切割作用过程中作用于组织上的任何力，如下所述。

在另一实施方案中，可使用一种快速作用的例如弹簧承载的插入机构以辅助钻取管1150穿透采集靶位并切割真皮，例如基本上不旋转钻取管。

如框1012所示，所述方法可包括从钻取管1150内撤出内导杆1110，例如使DMO 1160钉在其上(impaled thereon)，从而从1120所示部分抽取DMO 1160。

根据一些实施方案，DMO 1160可被留在内导杆1110上。在这种情况下，内导杆1110可用于留持(handle)、转运(transport)和/或操作(manipulate)DMO 1160。或者，DMO 1160可以，例如，被小心地从内导杆1160移至生物反应器加工腔中，例如如下参照图22所详细描述的那样；或者移至各种适于将DMO转移至不同载片上的转移装置中(未示出)；或移至用于进一步加工的腔室中。这种转移装置可包括例如镊子、真空钳或任何其它能夹住DMO 1160和/或使DMO 1160离开内导杆1110的机械装置。另外，可以单独或与上述手段一起使用合适的液体如无菌液体以辅助将DMO移出内导杆1160。

如框1014所示，所述方法还可包括从皮肤部分1120撤出切割工具例如钻取管1150。

本领域技术人员能理解的是可以实施上述动作的任何组合以进行本发明实施方案所述的采集。另外，可以使用其它动作或系列动作。

根据本发明的一些实施方案，采集方法除了例如通过内导杆在内部稳定和/或支撑真皮之外，还可包括例如用外部支撑装置和/或机构在外部稳定和/或支撑待采集的DMO和/或在待采集的DMO附近的组织，如下所述。

还参见图12，其示出了起稳定作用的夹持工具1200，其可与根据本发明的一些示例性实施方案的真皮采集装置一起使用。

根据本发明的示例性实施方案，工具1200可包括一具有夹持边缘(clamping edges)1210的夹持机构。例如，工具1200可包括例如本领域已知的尖嘴钳(pinching clamp)或镊子。工具1200可包括一具有恒定夹紧力或可控制的可变夹紧力的弹簧夹。工具1200可被置于皮肤表面上与内导杆1110平行并位于其任一侧上，从而，例如，当闭合时，夹持边缘1210可位于内导杆1110之下。夹持边缘1210当被合拢时可稳定和/或支撑内导杆1110和/或与待采集的DMO相关的皮肤部分1240，从而DMO在被管1150切割时可保持稳定。在这种情况下，当施加力时，钻取管1150可经与内导杆同中心或不同中心的夹持边缘1210推进。根据本发明的一些示例性实施方案，夹持边缘1210可包括至少一排或两排锯齿1260以便更好地夹持部分1240并降低在钻取过程中皮肤的横向运动，例如使这种运动最小化。

可以使用其它工具和/或机构以施加力至外部皮肤以引起围绕在内导杆周围的真皮的类似压缩。或者，可使用用于稳定待采集的真皮的其它装置和/或方法，如扭动内导杆并使之保持在相对于钻取管的旋转而言基本上固定的位置。

另外参见图13，其示意性示出根据本发明的一些示例性实施方案共轴沿内导杆1110插入其上的钻取管1150的横截面视图。

根据本发明的一些实施方案，内导杆1110可被置于皮肤部分1120中，其放置位置是使得导杆1110的轴1125基本上位于DMO 1160的中心。在这种情况下，钻取管1150可基本上与内导杆1110共轴排列，从而DMO 1160以大约对称的方式钉在内导杆1110上。

但是，根据本发明的其它示例性实施方案，内导杆和钻取管可以任何其它合适的排列方式放置。例如，内导杆可被置于皮下间隙，从而所需的待采集的DMO可主要位于内导杆上并包裹围绕之。相应地，钻取管可被插入在内导杆上和/或被导引从而当钻取管切割DMO时内导杆位于钻取管下部内表面附近或接触该下部内表面。在这种情况下，内导杆可保持DMO，在取出过程中DMO可例如保留在内导杆上表面。

根据本发明的一些实施方案，被构造以用于实现上述采集DMO的一些或全部程序的集成装置(未示出)可辅助上述手动程序。例如，在一个采集方法实施方案中，该集成装置可被构造成能定位和指导内导杆1110的插入，附着夹持工具1200，指导钻取管1150的插入和控制其在切割过程中的运动，和/或取出附着于内导杆1110上的DMO1160。这种装置可使得在进行采集程序时实现相对简单的操作。

根据本发明的一些示例性实施方案，从一个对象采集DMO的方法可包括产生和/或维持所需形状和位置的例如通常位于用于采集DMO的靶采集部位的与DMO相关的皮肤相关组织结构，以便切割工具能从DMO附近的组织分离至少一部分DMO。例如，位于靶采集部位附近的表皮部分可被拉起，这例如通过将至少部分所述表皮部分附着于一预定的例如基本上平的表面区域而实现，从而至少部分所述皮肤相关组织结构被拉起并保持在所需的形状和/或位置。根据一些示例性实施方案，附着表皮至预定的表面可包括施加一真空条件，例如如下所述。或者或额外地，附着表皮至预定的表面可包括向表面施加一粘合剂。

现在参见图14a-14c，其分别示意性描述了根据本发明的一个示例性实施方案的用于采集DMO的真皮采集装置1400的主视图、侧视图和俯视图。另外参见图15，其示意性描述了正在实施的装置1400的横截面侧视图，该装置正在根据本发明的一个示例性实施方案实施用于将包括DMO1510的皮肤相关组织结构外部支撑在一期望位置。

装置1400可包括一真空腔，例如一大致为圆柱体的长腔1406，其具有一经多个通道1404与真空入口1402流体相通的上支撑表面1430。真空入口1402可与至少一个真空源例如真空泵(未示出)流体相通，以向腔1406提供真空条件。表面1430和/或通道1404可构造成当例如通过真空源向腔1406施加真空条件时，能使与DMO 1510相关的表皮层1508的至少一部分，例如大致位于DMO 1510之上的部分，附着在表面1430。

装置1400还可包括一导向通道(guiding channel)1416以导引切割工具例如钻取管1520，并将切割工具保持在预定位置，例如，距离上表面1430预定的距离。例如，切割工具1520的上表面可距离上表面1430一定距离，例如约1mm。在另一实施方案中，也可以使用其它范围如0.3-2.0mm。通道1416可包括例如一直径稍大于钻取管1520的外径的大致为圆柱体的通道。钻取管1520可包括一尺寸例如为1mm至10mm之间、例如14G(相当于外径约为2.11mm)并具有基本对称的锋利刃口的钻取针(coring needle)。

根据本发明的示例性实施方案，表面1430可以是平的、通常是曲面，或可以具有任何其它合适形状。例如，在一个实施方案中，表面1430可以具有约3.5mm的曲率半径。在一个实施方案中，腔1406可具有例如约4mm的宽度。另外，在一些实施方案中，表面1430的曲率半径和/或腔1406的宽度和/或高度也可使用其它范围例如3-25mm，例如，在本发明一些实施方案中可以使用在3-25mm范围内的任何合适尺寸。腔1406的长度可以通常类似于被采集的DMO的长度，例如长度约30mm；但是腔长度也可以是其它范围，例如，5-100mm的范围。

根据一些示例性实施方案，装置1400可包括两个通道1408，其分别至少部分沿腔1406两侧分布，以使得能夹持表皮层1508，如下所述。通道1408可以定位于例如中心位于希望的高度，例如与待采集的DMO的中心大约相同的高度。在一个实施方案中，通道1408的中心可位于上表面1430之下约2mm的高度，从而夹持可稳定和/或支撑被切割的组织。根据这些示例性实施方案，装置1400还可包括在通道1408的内表面或外表面的两个柔性膜构件1412，从而使得在外部夹持组织而基本上不影响施加于腔1406的真空条件。根据本发明的其它实施方案，装置1400可不包括构件1412和/或通道1408。

根据本发明的示例性实施方案，用装置1400采集DMO 1510的方法可包括形成两个切口(未示出)，例如用解剖刀在与DMO 1510相关的皮肤部分以预定的距离例如约30mm形成两个柳叶刀切口，所述预定的距离可相应于钻取管1520要进入表皮1508和从表皮1508出来的点(“穿透进入和穿透出口部位”)。可形成这些切口以保证在采集的DMO 1510的两端基本上没有表皮成分，和/或维持穿刺部位的所希望的形状从而它们可以高效即快速愈合和/或留下相对较小的疤痕。所述方法也可包括将装置1400与表皮层1508(“采集部位”)接触从而切口位于腔1406之下，即位于点1410和1414之间。切口可以分别位于点1410和/或1414，或者可以位于点1410和1414之间以帮助柳叶刀切口在真空条件被施加于腔1406时“张开”。根据一些示例性实施方案，装置1400可任选地包括构造用于例如在装置1400被置于采集部位上之后并且真空条件被施加于腔1406之前时产生柳叶刀切口的机构，例如产生柳叶刀切口的弹簧柳叶刀。

所述方法还可包括将钻取管1520插入通道1416。钻取管1520可例如通过一接头例如捷可勃斯夹头(Jacobs Chuck)或一摩擦固定器与一医用钻或能旋转钻取管1520的任何其它合适工具和/或机构例如钻1170(图11)连接。任选地，钻的旋转速度可以摆动方式变化，即旋转方向可定期在“顺时针”和“逆时针”方向之间变化。

所述方法还可包括向腔1406施加真空条件，例如通过激活真空源而施加。结果，皮肤相关组织结构可被吸入腔1406中，并且例如在柳叶刀切口之间的表皮1508可以相对于表面1430而被牢固地保持。根据每种组织层的厚度以及腔1406的尺寸，表皮1508、真皮1506和/或脂肪组织成分1504可额外地被吸入腔1406。因此，腔1406的尺寸可以根据一或多个组织层的预计厚度而被设计，和/或可以施加例如本文所述的外部夹持，从而被吸进真空腔1406的脂肪组织1504可被向下驱使并基本上离开腔1406。

所述方法可进一步包括例如用钻1170(图11)以相对较高的速度例如高于1000RPM、例如1000RPM和10000RPM之间、旋转钻取管1520。例如，钻取管可以高于2000RPM、例如约7000RPM的转速被旋转。或者，可以使用低于1000RPM的相对较低的速度，或者根本不旋转，如上所述。所述方法还可包括将钻取管1520沿真空腔1406前进，例如至少沿腔1406的整个长度前进。钻取管可被导向通过通道1416以保证真皮微器官1510采集自与沿腔1406的皮肤相关组织结构的深度大约相同的深度。钻取管1520可被手动推进或者使用一种电动驱动装置(未示出)推进，从而例如控制钻取管1520前进的速度。

所述方法还可包括使DMO 1510与DMO 1510周围的组织剥离。例如，装置1400可包括一伸长件(extension)1418，例如长度在1mm和5mm之间，并且其半径基本上等于通道1416的半径，其基本上位于通道1416的相反侧，从而钻取管在穿过通道1406后可前进到伸长件1418中。或者，例如由硅氧烷或其它合适材料制成的切割表面1440可位于伸长件1418中，从而钻取管可切割进表面1440中以剥离采集的DMO。另外，可在钻取管1520内施加真空条件，例如从其后端开始，以便DMO 1510可被主动吸入钻取管1520中，由此使DMO从其周围组织中最终剥离。

所述方法可进一步包括从装置1400中撤出钻取管1520、包括其中的DMO 1510。

参照图16，其示意性示出了正在实施的装置1400的横截面侧视图，装置1400正在根据本发明的另一示例性实施方案被操作以在外部支撑皮肤相关组织结构在一希望的位置。

根据图16的示例性实施方案，可通过外部夹持支撑在真空腔内的皮肤相关组织结构来实现真皮1506的改进的稳定化和/或改进的防止脂肪1504进入真空腔1406内。例如，可操作一种类似于图12中的所述的夹持工具的夹持工具1600以例如对称地“夹紧(pinch)”支撑在真空腔1406中的皮肤相关组织结构。夹持工具1600的两个夹持末端1502可分别插入腔1408中。工具1600可被闭合从而夹持末端1502可下压柔性件1412。由此，腔1406中的皮肤相关组织结构可被从两侧夹持而基本上不影响腔1406中的真空条件。由夹持末端1502施加的夹紧力可相应于例如弹簧1512或其它合适装置的恒力或变力。

尽管上述描述可参照在长轴上具有基本上恒定形状和/或大小的真空腔，但是本领域技术人员能理解根据本发明的其它实施方案，真空腔可以具有任何其它预定的尺寸和/或形状，例如如下所述。

参照图17，其示意性描述了根据本发明另一示例性实施方案的真皮采集装置1700。

装置1700可包括一真空腔1701，该真空腔1701包括一高位突出体1706。高位突出体1706可具有预定的大小和/或形状，其适于例如产生高于钻取管1716轨道之上的大致平向的皮肤组织单层“平台(plateau)”。例如，部分1706可高于腔1701的其它部分，从而脂肪层1718可被吸入部分1706中并沿钻取管1716的轨道支撑。其结果是，在采集预定长度的DMO后，钻取管1716可被轻轻推进脂肪层1718中，由此将采集的DMO与围绕DMO的组织分离开。在钻取管1716撤出身体后，采集的DMO保持在钻取管1716内。装置1700的构造可以无需在皮肤中形成例如如上所述的“出口”切口，由此使得可以仅用一个切口即可采集DMO。

根据本发明的一些示例性实施方案，装置1700还可包括一钻制动器(drill stopper)1708以使得可以沿腔1701手动前进钻取管1716一段预定距离，例如前进至钻取管1716稍进入脂肪组织1718的一个位置。

参照图18，其示意性描述了根据本发明的再一示例性实施方案的真皮采集装置1800。图19示意性描述了操作图18的采集装置1800以用于采集DMO 1830的横截面图。

根据一些示例性实施方案，可以使用如下所述的类似于例如在乳腺癌活检中使用的装置的活检钻取装置来采集DMO。装置1800可包括一切割工具1808，例如如上所述，和一皮下采集套针(HST)1806，例如一种具有锋利尖头1804和例如稍大于切割工具1808外径的合适内径的皮下针，从而切割工具1808可被插入HST 1806内并基本上与其共轴。HST 1806可包括一合适宽度(例如1mm或更高)以及合适长度(例如基本上等于待采集的DMO的所希望长度)的槽口(notchcutout)(“窗口”)1802。

根据图18的示例性实施方案，可例如用一解剖刀片形成一单切口例如柳叶刀切口，通过这一切口HST 1806可与切割工具1808例如作为一个单元插入到皮肤之下或皮肤中的所希望位置，优选地在皮下间隙中，并且使槽口1802方向向上朝向真皮层1840。切割工具1808在穿透过程中可以被置于HST 1806内，以便窗口1802可被“关闭”以允许HST 1806大致平滑地穿透。工具1808和其所插入的HST 1806可沿皮下界面前进槽口1802的长度，且末端1804可不穿出皮肤表面。到达合适位置后，工具1808可被缩回以露出槽口1802并使得真皮组织基本上充满槽口。例如使用合适的夹持工具例如上述参照图12描述的夹持工具可以在皮肤表面上施加合适的压力，和/或可以通过例如位于槽口1802之下的真空歧管(未示出)向HST 1806内施加真空条件以辅助真皮基本上充满槽口1802。工具1808可以与一例如如上所述的马达连接以旋转工具1808，转速适于切割真皮组织，例如一相对较高的转速，例如高于1000RPM的速度，例如在1000RPM至10000RPM之间的速度。例如，工具1808可被以高于2000RPM、例如约7000RPM的转速旋转。工具1808可以随后例如经手动或自动推进，例如直至其穿过窗口槽口1802的末端以切割槽口1802内的DMO1830。当完成时，可以停止工具1808的前进和旋转运动，可缩回切割工具1808并且采集的DMO 1830位于其内。HST 1806随后可从采集部位取出。DMO 1830可以从切割工具1808上取下，例如使用注射器用无菌液体例如盐水冲洗通过工具1808，或者用真空源从切割工具1808的后端(未示出)吸出DMO 1830。

本领域技术人员能理解装置1800使得能够仅形成一个切口就可采集DMO。另外，装置1800可有效用于从具有相对较厚皮肤的区域例如从供体后背区域采集DMO。

本领域技术人员能理解例如如上所述的根据本发明实施方案的采集方法和/或装置可以包括在真皮内导入薄组织切割装置。因此根据本发明的实施方案的采集方法和/或装置可使得在采集DMO时对外部皮肤表面产生相对最小的损伤，并因此可提供一种侵害性最小的采集所希望的组织的方法。

尽管本文所述的本发明的一些实施方案是用于采集DMO的方法和/或装置，但是本领域技术人员能理解根据本发明的其它实施方案，至少一些方法和/或装置可用于实施任何其它程序，例如整形外科程序、皮肤病学程序或包括采集组织的任何其它程序。例如，本发明实施方案的方法和/或装置可用于采集例如在一后续实施中待用作填充材料的真皮组织。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种用于回体(ex-vivo)(体外“in vitro”)处理或加工真皮微器官的系统和方法。作为直接MO被采集的真皮组织可被留在作为MO支撑物的内导杆上。在这些实施方案中，内导杆可被用于在后续加工中保持MO的位置和方向。在其它一些实施方案中，真皮MO可被从内导杆上取下并直接置于组织培养孔或生物反应器的转导腔内，例如如下参照图22的详细描述。在一些实施方案中，例如，如果DMO从皮肤取出后留在钻取管中，可用生物学相容液体例如盐水或生长培养基施加于钻取管的后端而将DMO从钻取管中冲洗出。DMO的冲洗可以是使得其被直接冲入生物反应器的腔中，例如如下所述。或者，可以向钻取管的后端施加真空以“吸出”DMO，例如直接进入生物反应器的腔中。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种用于植入DTMO的方法。在产生和/或例如通过遗传修饰DMO而加工DMO后，修饰的DMO或DTMO可被植回患者内，以例如用于基于蛋白质或RNA的治疗。被植入的完全或部分DTMO的数目可根据分泌的蛋白质的期望治疗剂量而确定。DTMO可植入皮下或者身体内的任何其它位置。使用套针皮下植入例如可以使得DTMO在皮下间隙中保持线性形式。在以后需要切除DTMO例如以终止治疗或降低治疗性蛋白质的剂量的情况下，线形形式的植入可有助于定位。也可以使用其它已知的几何形状植入模式。线性植入也可有助于真皮组织整合进周围组织。

现参照图20，其示意性描述了根据本发明的一些实施方案的DTMO植入方法的流程图。

如框2002所示，可任选地在期望植入的部位给予局部麻醉。

如框2004所示，根据本发明的一些实施方案，DTMO、任选地与周围的无菌盐水一起可被吸进一载体例如一植入针中，例如附着于一注射器的植入针。针可以具有任何合适的直径，例如在17口径-12口径(gauge)之间。任选地，针头可附有一硅氧烷管或类似物的短伸长件，以便于在缩回注射器活塞时DTMO吸进针管内。

如框2006所示，载有DTMO的植入针可被推进皮肤，例如不带有硅氧烷管伸长件，进入皮下位置，前进大约等于DTMO的长度的距离。

如框2008所示，根据一些实施方案，所述方法可包括在吸入的真皮治疗性微器官上施加压力以使得真皮治疗性微器官离开载体进入植入部位。

如框2010所示，在出口点可用一夹具例如镊子抓住DTMO的末端。

如框2012所示，植入针可被缩回穿过皮下间隙，从植入针释放DTMO并将DTMO沿针道线性放置。如果需要，例如可通过在缩回过程中轻轻向下推注射器活塞而给予辅助以帮助释放DTMO。

如框2014所示，一旦将DTMO入位，可由夹具释放DTMO的末端。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种系统和方法以用于体内分界和定位植入的真皮微器官。例如当需要终止蛋白质治疗或降低分泌的蛋白质的剂量时，对加工的组织如DTMO在皮下植入或身体内任何其它位置的植入的位置的鉴别可以是很重要的。例如，终止或滴定剂量可通过完全除去一或多个DTMO和/或通过切除一个植入的DTMO、一个植入的DTMO的一部分或一个以上植入的DTMO而进行。为了鉴别皮下植入的DTMO，根据一个实施方案，可在植入前用一种含有生色团的惰性生物相容性油墨或染料染色DTMO，其肉眼可见或可需要特殊的显示条件来观察。以这种方式，DTMO可通过目视检查和/或用增强的成象手段而与其周围组织区分开。

根据一个实施方案，DTMO的外周表面可用例如生物相容性碳颗粒、生物相容性文身墨或其它合适的材料包被。皮下植入后，DTMO肉眼可见或者用一合适的增强成象装置可见。增强植入的DTMO的可见性的其它方式可包括在皮肤表面上使用强光源，或者夹起皮肤并使光源从一侧照向皮肤，从而皮肤可呈半透明状，而染色的DTMO更可见。或者，染料可以是荧光的，仅当用UV光照射时可见，例如使用荧光塑料珠。

根据另一实施方案，皮下植入的DTMO的位置可通过将一种生物相容性结构与DTMO共植入而鉴别。这种生物相容性结构的一个例子是许多外科手术中常用的非吸收性单股尼龙缝合线。这种缝合线可被植入与DTMO相同的植入道内，或可被植入上部真皮中位于DTMO的正上方，从而DTMO的空间位置可通过缝合线的位置而确定。另外，DTMO的深度可以是已知在皮下间隙的深度。缝合线肉眼可见，可用照明装置观察和/或可用其它合适的成象装置如超声波而观察。或者，缝合线可以是荧光的，并在合适的UV照射下透过皮肤可见。缝合线也可以是可吸收材料，从而其可以使得在期望的时间内如几个月内进行定位。

根据另一实施方案，DTMO可以被遗传修饰或工程化以包括一表达荧光标记或其它能被观察的标记的基因。例如，DTMO可用GFP(绿色荧光蛋白)基因或萤光素酶报道基因修饰，这种基因可以例如与治疗性蛋白质的基因一起表达。以这种方式，DTMO可用合适的UV或其它合适的照明和成象条件非侵入性观察。

根据本发明的一些实施方案，提供了一种除去或切除植入的DTMO的系统和方法。在一种情况下，例如当患者的基于DTMO的疗法必须被终止时，或者如果蛋白质分泌必须被降低时，每一植入的DTMO可以被部分或全部除去，或被分别或全部切除。除去DTMO的一个实施方案是用类似于或直径稍大于直接采集DMO所用的钻取管的钻取管进行。

如图21所示，在框2102，可以确定植入的皮下DTMO的位置。在框2103，可任选地在DTMO除去的部位给予局部麻醉。在框2104，可沿DTMO的长度皮下插入一内导杆，以采集包括DTMO的一束组织。在框2106，可将一与植入针相同或直径大于植入针直径的钻取针(例如11口径或类似的)插在内导杆上并于内导杆共中心。在框2108，可采集包括DTMO的该束组织。在框2110，具有该束组织的内导杆和钻取针可从皮肤中抽出，带出DTMO。在一个实施方案中，这种钻取方法可组合真空抽吸以帮助从身体中取出切割材料。

根据本发明的一个实施方案，可以使用原位切除DTMO的侵害性最小或非侵入性方法以使程序损伤性更小并且对于患者的侵害更小。在一个实施方案中，在染色的DTMO情况下，可以使用激光例如非侵入型Yag激光。Yag激光的能量例如可被生色团选择性吸收，从而能量被主要导向DTMO，而对周围组织的损害非常小。也可使用其它光源。

根据另一实施方案，DTMO可通过从沿DTMO长度插入到皮下间隙中的最小侵害性探头传递破坏性能量而切除。这种探头可传递各种类型的能量，包括射频、低温、微波、电阻热等。可使用共植入的结构如缝合线来确定DTMO的位置，从而使探头能例如沿缝合线或位于缝合线正下方而被插入皮下。在这种情况下，例如，破坏性能量可在缝合线仍在原来位置时被传递。或者，缝合线可在放置探头后及传递破坏性能量之前除去。施加的能量可以是如经透热疗法凝固过程中变性组织中的蛋白质所需的能量。额外地或者另外，施加的能量可以是烧焦组织的电动手术切割装置中所用的那么高的能量。当然，也可以使用其它定位手段和其它传递破坏性能量的手段。

在采集DMO之后，例如，根据本发明的实施方案，DMO任选地被遗传改变。可使用现有技术中已知的任何方法学来遗传改变组织。一个代表性方法是用一重组病毒载体将一基因插入组织细胞中。可以使用现有技术中已知的各种不同载体中的任一种，如病毒载体、质粒载体、线性DNA等，以将编码治疗剂的外源核酸片段导入靶细胞和/或组织。这些基因可使用如下任何方法插入，例如感染、转导、转染、磷酸钙介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质体介导的转染、基因枪法(biolistic)基因输送、使用融合阴离子脂质体(其是使用阳离子脂质体的替代方法)的脂质体基因输送、直接注射、受体介导的摄入、磁穿孔、超声和本领域已知的其它方法。这种基因插入可通过将载体导入DMO附近从而载体可与DMO细胞反应来实现。一旦外源核酸片段已掺入细胞，可定量由所述核酸片段编码的治疗剂的生产率和/或分泌率。

根据本发明的一些实施方案，DMO的遗传吸收可修饰内源基因表达谱。这可通过例如导入一增强子或控制内源基因表达的阻抑或诱导型调控构件而实现。

在另一实施方案中，本发明提供了通过将本发明的遗传修饰的DMO植入一对象而将感兴趣的基因产物输送给对象的方法。

如上所述，在此过程中DMO可与一种营养溶液接触。因此，由DTMO产生的治疗剂可以分泌进该溶液中，由此测量其浓度。感兴趣的基因可以是编码任何RNA分子(有义或反义)、肽、多肽、糖蛋白、脂蛋白或其组合或编码任何其它后修饰的多肽的任何基因。在本发明的一个实施方案中，感兴趣的基因可以是组织样品中天然表达的基因。在本发明的另一个实施方案中，组织样品可以被遗传工程化以便至少一个细胞会表达感兴趣的基因，该感兴趣的基因是该细胞天然不表达的或者在该细胞中具有改变的表达谱。

本文所用术语“核酸”是指多核苷酸或寡核苷酸如脱氧核糖核酸(DNA)，并且当合适时，是指核糖核酸(RNA)或其模拟物。该术语应该也被理解为包括作为等价物的从核苷酸类似物制备的RNA或DNA类似物，以及如所描述的实施方案适用时，也包括单链(有义或反义)和双链多核苷酸。该术语包括由天然存在的碱基、糖和共价核苷间(骨架)连键组成的寡核苷酸以及具有非天然部分的功能类似的寡核苷酸。这种修饰的或取代的寡核苷酸因为其期望的性质如增强的细胞摄入、对核酸靶的增强的亲和力和增强的在核酸酶存在下的稳定性而通常比天然形式优选。

如本领域技术人员已知的，术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”是指通过肽键以特异的序列连接在一起的氨基酸线性聚合物。本文所用术语“氨基酸”是指氨基酸的D或L立体异构体形式，除非特别指明。本发明范围还包括例如具有纯化的野生型肿瘤抑制蛋白的生物学活性的等价蛋白质或等价肽。“等价蛋白质”或“等价多肽”是指与天然存在的蛋白质或多肽的线性序列不符但是具有不改变其生物学活性的氨基酸取代的化合物。这些等价物可以通过用相关氨基酸例如具有相似电荷的氨基酸置换一或多个氨基酸或者取代或修饰侧链或官能团而与天然序列不同。

所述蛋白质、肽、多肽、糖蛋白或脂蛋白可以是但不限于下述任一种蛋白质或其各种组合：蛋白酶、脂肪酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、凝血因子、细胞色素p450酶、转录因子、MHC成分、细胞因子、白细胞介素、BMP、趋化因子、生长因子、激素、酶、单克隆抗体、单链抗体、氧化还原酶、p450、过氧化物酶、氢化酶、脱氢酶、过氧化氢酶、转移酶、水解酶、异构酶、连接酶、氨基酰基-trna合成酶、激酶、磷蛋白、突变基因转座子、氧化还原酶、胆碱酯酶、葡糖淀粉酶、糖基水解酶、氨甲酰基转移酶、核酸酶、(兆碱基)大范围核酸酶(meganuclease)、核糖核酸酶、ATP酶、肽酶、环式核苷酸合成酶、磷酸二酯酶、磷蛋白、DNA或RNA相关蛋白、高迁移性基团蛋白、成对盒蛋白(paired box protein)、组蛋白、聚合酶、DNA修复蛋白、核糖体蛋白、电子传递蛋白、球蛋白、金属硫蛋白、膜转运蛋白、结构蛋白、受体、细胞表面受体、核受体、G蛋白、嗅觉受体、离子通道受体、通道、酪氨酸激酶受体、细胞粘着分子或受体、光受体、活性肽、蛋白酶抑制剂、分子伴侣、分子伴侣素(chaperonin)、应激相关蛋白、转录因子和嵌合蛋白。

在一个实施方案中，由本发明的DMO分泌的蛋白质的量在植入前一天至少为1.6μg/DTMO/天。

在本发明的一个实施方案中，感兴趣的基因可编码促红细胞生成素或其等价蛋白。

在本发明的另一实施方案中，感兴趣的基因可编码但不限于下述任一种蛋白质、下述蛋白质的任何组合和其任何等价物：胰岛素、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、弹性蛋白酶、淀粉酶、血清胸腺因子、胸腺体液因子、胸腺生成素、胃泌素、胰泌素、促生长素抑制素、物质P、生长激素、生长调节素、集落刺激因子、促红细胞生成素、表皮生长因子、肝促红因子(hepatopoietin)、肝细胞生长因子、白细胞介素、负生长因子、成纤维细胞生长因子和β3家族转化生长因子、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、人生长激素、G-CSF、GM-CSF、TNF受体、PDGF、AAT、VEGF、超氧化物歧化酶、白细胞介素、TGF-β、NGF、CTNF、PEDF、NMDA、AAT、肌动蛋白、苯丙酸诺龙(Activin)β-A、苯丙酸诺龙β-B、苯丙酸诺龙β-C、苯丙酸诺龙β-E、腺苷酸脱氨酶、腺苷酸脱氨酶、琼脂水解酶-β、白蛋白HAS白蛋白、醇脱氢酶、醛缩酶、埃芬瑞(Alfimeprase)、α1抗胰蛋白酶、α半乳糖苷酶、α-1-酸性糖蛋白(AGP)、α-1-抗凝乳蛋白酶、α-1-抗胰蛋白酶AT、α-1-微球蛋白A1M、α-2-巨球蛋白A2M、甲胎蛋白、α-半乳糖苷酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、α淀粉酶、β淀粉酶、Angiostatin、血管紧张肽、转化酶、锚蛋白、载脂蛋白、APO-SAA、精氨酸酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸氨基转移酶、心房利钠因子(Anf)、心钠肽、心钠肽(Anp)、抗生物素蛋白、β-2-糖蛋白1、β-2-微球蛋白、β-N-乙酰氨基葡糖苷酶B-NAG、β-淀粉样、脑钠肽(Bnp)、脑衍生神经营养因子(BDNF)、钙粘蛋白(Cadherin)E、Calc a、Calc b、降钙素、钙细胞周边蛋白(Calcyclin)、钙结合蛋白(Caldesmon)、Calgizzarin、钙粒蛋白(Calgranulin)A、钙粒蛋白C、钙调蛋白、钙网蛋白(Calreticulin)、钙血管蛋白(Calvasculin)、碳酸酐酶、羧肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、羧肽酶Y、心脏肌钙蛋白I、心脏肌钙蛋白T、酪蛋白α、过氧化氢酶、连环素(Catenins)、组织蛋白酶D、CD95L、CEA、纤维素酶、着丝粒蛋白B、血浆铜蓝蛋白、血清铜蓝蛋白(Ceruplasmin)、胆囊收缩素、胆固醇酯酶、乙酰胆碱酯酶、丁酰胆碱酯酶、绒膜促性腺激素(HCG)、绒膜促性腺激素β-核心(BchCG)、糜蛋白酶、糜蛋白酶原、肌氨酸激酶、K-BB、CK-MB(肌氨酸激酶-MB)、CK-MM、Clara细胞磷脂结合蛋白、梭菌蛋白酶、凝聚素(Clusterin)、CNTF、胶原蛋白、胶原蛋白酶、胶原(I-VI型)、集落刺激因子、补体C1q、补体C3、补体C3a、补体C3b-α、补体C3b-β、补体C4、补体C5、补体因子B、伴刀豆蛋白A、促皮质激素释放素、促肾上腺皮质激素释放激素、C-反应蛋白(CRP)、C-型利钠肽(Cnp)、胱抑素(Cystatin)C、D-二聚体、Delta 1、Delta样激酶1(Dlk1)、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、脱氧核糖核酸、Dersalazine、葡聚糖酶、黄递酶(Diaphorase)、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I、T4DNA聚合酶、EGF，弹性蛋白酶、弹性蛋白、内分泌腺衍生血管内皮生长因子(EG-VEGF)、弹性蛋白内皮缩血管肽、弹性蛋白内皮缩血管肽1、弹性蛋白嗜酸性粒细胞趋化蛋白(Eotaxin)弹性蛋白、表皮生长因子(EGF)、上皮嗜中性粒细胞激活肽-78(ENA-78)、促红细胞生成素(Epo)、雌三醇、Exodus、因子IX、因子VIII、脂肪酸结合蛋白、铁蛋白、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子14、成纤维细胞生长因子15、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子18、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子2、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子3、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子9、纤连蛋白、粘着斑激酶(FAK)、促滤泡素α、半乳糖氧化酶、β半乳糖苷酶、γIP-10、胃泌素、GCP、G-CSF、胶质细胞衍生神经营养因子(GNDF)、胶质细胞原纤维酸性蛋白、胶质丝蛋白(GFP)、胶质细胞衍生神经营养因子家族受体(GFR)、球蛋白、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶、谷氨酸脱羧酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、甘油脱氢酶、甘油激酶、糖原磷酸化酶ISO BB、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长刺激蛋白(GRO)、生长激素、生长激素释放激素、血红素结合蛋白、肝促红因子(hepatopoietin)、Heregulin α、Heregulin β1、Heregulin β2、Heregulin β3、己糖激酶、组蛋白、人骨形态发生蛋白、人松驰素H2、透明质酸酶、羟基类固醇脱氢酶、低氧诱导因子-1α(HIF-1Alpha)、I-309/TCA-3、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgA、IgE、IgG、IgM、胰岛素、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)、干扰素、干扰素诱导型T细胞α化学引诱物(I-TAC)、白细胞介素、白细胞介素12β、白细胞介素18结合蛋白、肠三叶因子(Intestinal trefoil factor)、IP10、Jagged1、Jagged 2、κ轻链、角质形成细胞生长因子(KGF)、Kiss1、La/SS-B、乳酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、λ轻链、昆布氨酸(laminin)α1、昆布氨酸α2、昆布氨酸β1、昆布氨酸β2、昆布氨酸β3、昆布氨酸γ1、昆布氨酸γ2、LD78beta、瘦素(Leptin)、亮氨酸氨基肽酶、促黄体生成激素(LH)、LIF、脂肪酶、肝细胞生长因子、肝表达的趋化因子(LEC)、LKM抗原、TNF、TNF beta、萤光素酶、促黄体生成激素释放激素、淋巴细胞激活基因-1蛋白(LAG-1)、淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)、溶菌酶、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1Alpha)、巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)、苹果酸脱氢酶、麦芽糖酶、MCP(巨噬细胞/单核细胞趋化蛋白)-1、2、3和4、M-CSF、MEC(CCL28)、膜型卷曲相关蛋白(Mfrp)、中期因子(Midkine)、MIF、MIG(干扰素γ诱导的单核因子)、MIP2至5、MIP-1β、Mp40、P40T细胞和肥大细胞生长因子、髓磷脂碱性蛋白、髓过氧化物酶、肌红蛋白、肌肉抑制素(Myostatin)生长分化因子-8(GDF-8)、Mysoin、MysoinLC、Mysoin HC、ATPase、NADase、NAP-2、负生长因子、神经生长因子(NGF)、神经氨酸酶、Neuregulin 1、Neuregulin 2、Neuregulin3、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性烯醇化酶、神经营养蛋白(neurotrophin)-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、Neuturin、NGF、NGF-β、Nicastrin、硝酸还原酶、氧化氮合成酶、去甲睾酮(Nortestosterone)、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NP-1、NT-1至4、NT-3 Tpo、NT-4、核酸酶、制瘤素M、鸟氨酸氨甲酰转移酶、护骨素(Osteoprotegerin)、卵清蛋白、草酸脱羧酶、P16、木瓜蛋白酶、PBP、PBSF、PDGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PEDF、胃蛋白酶、肽YY(PYY)、过氧化物酶、Persephin、PF-4、P-糖蛋白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶I、磷酸二酯酶II、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡糖磷酸变位酶、磷脂酶、磷脂酶A2、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷酸酪氨酸激酶、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、胎盘催乳激素、γ-钙紧张素(Plakoglobin)、斑菲素蛋白(Plakophilin)、血浆胺氧化酶、血浆视黄醇结合蛋白、血纤维蛋白溶酶原、Pleiotrophin(PTN)、PLGF-1、PLGF-2、Pokeweed抗病毒毒素、前清蛋白、妊娠相关血浆蛋白A、妊娠特异性β1糖蛋白(SP1)、强啡肽原(prodynorphin)、脑啡肽原(proenkephalin)、孕酮胰岛素原、促乳素、促黑色素浓缩激素(Pmch)、前阿黑皮素(pro-opiomelanocortin)、前孤啡肽(pro-orphanin)、前列腺特异性抗原PSA、前列腺酸性磷酸酶PAP、凝血酶原、PSA-A1、肺表面蛋白A、丙酮酸激酶、Ranpimase、RANTES、Reelin、肾素、抵抗素、视黄醇结合球蛋白RBP、RO-SS-A 60kDa、RO/SS-A 52kDa、S100(人脑)(BB/AB)、S100(人)BB同二聚体、Saposin、SCF、SCGF-α、SCGF-β、SDF-1α、SDF-1β、分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)、分泌型卷曲相关蛋白2(Sfrp2)、分泌型卷曲相关蛋白3(Sfrp3)、分泌型卷曲相关蛋白4(Sfrp4)、分泌型卷曲相关蛋白5(Sfrp5)、胰泌素、血清胸腺因子、结合球蛋白(SHBG)、生长调节素、生长抑素(somatostatin)、生长激素(Somatotropin)、s-RankL、物质P、超氧化物歧化酶、TGFα、TGFβ、硫氧还蛋白、血栓形成素(thrombopoietin，TPO)、凝血栓蛋白1、凝血栓蛋白2、凝血栓蛋白3、凝血栓蛋白4、凝血栓蛋白5、凝血栓蛋白6、凝血栓蛋白7、胸腺体液因子、胸腺生成素、胸腺素a1、胸腺素α-1、胸腺和激活调节的趋化因子(TARC)、胸腺表达的趋化因子(TECK)、甲状腺球蛋白Tg、甲状腺微粒体抗原、甲状腺过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶TPO、甲状腺素(T4)、甲状腺素结合球蛋白TBG、TNFα、TNF受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体、b家族转化生长因子、Transthyretin、三酰甘油脂肪酶、三碘甲状腺原氨酸(T3)、原肌球蛋白α、原肌球蛋白相关激酶(trk)、肌钙蛋白C、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶原、TSH、Tweak、酪氨酸脱羧酶、遍在蛋白、UDP葡糖醛酸基转移酶、脲酶、尿酸酶、尿蛋白1、Urocortin 1、Urocortin 2、Urocortin 3、尿压素II、Vang-样1(Vangl1)、Vang-样2(Vangl2)、血管内皮生长因子(VEGF)，舒血管肠肽前体、波形蛋白、维生素D结合蛋白、Von Willebrand因子、Wnt1、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15、Wnt16、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9、黄嘌呤氧化酶、Clara细胞磷脂结合蛋白、梭菌蛋白酶、凝聚素(Clusterin)、CNTF、胶原蛋白、胶原蛋白酶、胶原(I-VI型)、集落刺激因子、补体C1q、补体C3、补体C3a、补体C3b-α、补体C3b-β、补体C4、补体C5、补体因子B、伴刀豆蛋白A、促皮质激素释放素、促肾上腺皮质激素释放激素、C-反应蛋白(CRP)、C-型利钠肽(Cnp)、胱抑素C、D-二聚体、Delta 1、Delta样激酶1(Dlk1)、脱氧核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶I、脱氧核糖核酸酶II、脱氧核糖核酸、Dersalazine、葡聚糖酶、黄递酶(Diaphorase)、T4DNA连接酶、DNA聚合酶I、T4 DNA聚合酶、EGF，弹性蛋白酶、弹性蛋白、内分泌腺衍生血管内皮生长因子(EG-VEGF)、弹性蛋白内皮缩血管肽、弹性蛋白内皮缩血管肽1、弹性蛋白嗜酸性粒细胞趋化蛋白弹性蛋白、表皮生长因子(EGF)、上皮嗜中性粒细胞激活肽-78(ENA-78)、促红细胞生成素(Epo)、雌三醇、Exodus、因子IX、因子VIII、脂肪酸结合蛋白、铁蛋白、成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子10、成纤维细胞生长因子11、成纤维细胞生长因子12、成纤维细胞生长因子13、成纤维细胞生长因子14、成纤维细胞生长因子15、成纤维细胞生长因子16、成纤维细胞生长因子17、成纤维细胞生长因子18、成纤维细胞生长因子19、成纤维细胞生长因子2、成纤维细胞生长因子20、成纤维细胞生长因子3、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子9、纤连蛋白、粘着斑激酶(FAK)、促滤泡素α、半乳糖氧化酶、β半乳糖苷酶、γIP-10、胃泌素、GCP、G-CSF、胶质细胞衍生神经营养因子(GNDF)、胶质细胞原纤维酸性蛋白、胶质丝蛋白(GFP)、胶质细胞衍生神经营养因子家族受体(GFR)、球蛋白、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、α葡糖苷酶、β葡糖苷酶、β葡糖醛酸糖苷酶、谷氨酸脱羧酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、甘油脱氢酶、甘油激酶、糖原磷酸化酶ISO BB、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长刺激蛋白(GRO)、生长激素、生长激素释放激素、血红素结合蛋白、肝促红因子(hepatopoietin)、Heregulin α、Heregulin β1、Heregulin β2、Heregulinβ3、己糖激酶、组蛋白、人骨形态发生蛋白、人松驰素H2、透明质酸酶、羟基类固醇脱氢酶、低氧诱导因子-1α(HIF-1 Alpha)、I-309/TCA-3、IFNα、IFNβ、IFNγ、IgA、IgE、IgG、IgM、胰岛素、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、胰岛素样生长因子II(IGF-II)、干扰素、干扰素诱导型T细胞α化学引诱物(I-TAC)、白细胞介素、白细胞介素12β、白细胞介素18结合蛋白、肠三叶因子(Intestinal trefoilfactor)、IP10、Jagged 1、Jagged 2、κ轻链、角质形成细胞生长因子(KGF)、Kiss1、La/SS-B、乳酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、λ轻链、昆布氨酸(laminin)α1、昆布氨酸α2、昆布氨酸β1、昆布氨酸β2、昆布氨酸β3、昆布氨酸γ1、昆布氨酸γ2、LD78beta、瘦素(Leptin)、亮氨酸氨基肽酶、促黄体生成激素(LH)、LIF、脂肪酶、肝细胞生长因子、肝表达的趋化因子(LEC)、LKM抗原、TNFβ、萤光素酶、促黄体生成激素释放激素、淋巴细胞激活基因-1蛋白(LAG-1)、淋巴细胞趋化因子(Lymphotactin)、溶菌酶、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1Alpha)、巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)、苹果酸脱氢酶、麦芽糖酶、MCP(巨噬细胞/单核细胞趋化蛋白)-1、2、3和4、M-CSF、MEC(CCL28)、膜型卷曲相关蛋白(Mfrp)、中期因子(Midkine)、MIF、MIG(干扰素γ诱导的单核因子)、MIP2至5、MIP-1β、Mp40、P40T细胞和肥大细胞生长因子、髓磷脂碱性蛋白、髓过氧化物酶、肌红蛋白、肌肉抑制素(Myostatin)生长分化因子-8(GDF-8)、Mysoin、Mysoin LC、Mysoin HC、ATPase、NADase、NAP-2、负生长因子、神经生长因子(NGF)、神经氨酸酶、Neuregulin1、Neuregulin 2、Neuregulin 3、神经元特异性烯醇化酶、神经元特异性烯醇化酶、神经营养蛋白(neurotrophin)-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、Neuturin、NGF、NGF-β、Nicastrin、硝酸还原酶、氧化氮合成酶、去甲睾酮(Nortestosterone)、Notch 1、Notch 2、Notch 3、Notch 4、NP-1、NT-1至4、NT-3 Tpo、NT-4、核酸酶、制瘤素M、鸟氨酸氨甲酰转移酶、护骨素(Osteoprotegerin)、卵清蛋白、草酸脱羧酶、P16、木瓜蛋白酶、PBP、PBSF、PDGF、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PEDF、胃蛋白酶、肽YY(PYY)、过氧化物酶、Persephin、PF-4、P-糖蛋白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、磷酸二酯酶I、磷酸二酯酶II、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、葡糖磷酸变位酶、磷脂酶、磷脂酶A2、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷酸酪氨酸激酶、垂体腺苷酸环化酶激活多肽、胎盘催乳激素、γ-钙紧张素(Plakoglobin)、斑菲素蛋白(Plakophilin)、血浆胺氧化酶、血浆视黄醇结合蛋白、血纤维蛋白溶酶原、Pleiotrophin(PTN)、PLGF-1、PLGF-2、Pokeweed抗病毒毒素、前清蛋白、妊娠相关血浆蛋白A、妊娠特异性β1糖蛋白(SP1)、强啡肽原(pro-dynorphin)、脑啡肽原(pro-enkephalin)、孕酮胰岛素原、促乳素、促黑色素浓缩激素(Pmch)、前阿黑皮素(pro-opiomelanocortin)、前孤啡肽(pro-orphanin)、前列腺特异性抗原PSA、前列腺酸性磷酸酶PAP、凝血酶原、PSA-A1、肺表面蛋白A、丙酮酸激酶、Ranpimase、RANTES、Reelin、肾素、抵抗素、视黄醇结合球蛋白RBP、RO-SS-A 60kDa、RO/SS-A 52kDa、S100(人脑)(BB/AB)、S100(人)BB同二聚体、Saposin、SCF、SCGF-α、SCGF-β、SDF-1α、SDF-1β、分泌型卷曲相关蛋白1(Sfrp1)、分泌型卷曲相关蛋白2(Sfrp2)、分泌型卷曲相关蛋白3(Sfrp3)、分泌型卷曲相关蛋白4(Sfrp4)、分泌型卷曲相关蛋白5(Sfrp5)、胰泌素、血清胸腺因子、结合球蛋白(SHBG)、生长调节素、somatostatin、Somatotropin、s-RankL、物质P、超氧化物歧化酶、TGFα、TGFβ、硫氧还蛋白、血栓形成素(thrombopoietin，TPO)、凝血栓蛋白1、凝血栓蛋白2、凝血栓蛋白3、凝血栓蛋白4、凝血栓蛋白5、凝血栓蛋白6、凝血栓蛋白7、胸腺体液因子、胸腺生成素、胸腺素a1、胸腺素α-1、胸腺和激活调节的趋化因子(TARC)、胸腺表达的趋化因子(TECK)、甲状腺球蛋白Tg、甲状腺微粒体抗原、甲状腺过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶TPO、甲状腺素(T4)、甲状腺素结合球蛋白TBG、TNFα、TNF受体、转铁蛋白、转铁蛋白受体、b家族转化生长因子、Transthyretin、三酰甘油脂肪酶、三碘甲状腺原氨酸(T3)、原肌球蛋白α、原肌球蛋白相关激酶(trk)、肌钙蛋白C、肌钙蛋白I、肌钙蛋白T、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶原、TSH、Tweak、酪氨酸脱羧酶、遍在蛋白、UDP葡糖醛酸基转移酶、脲酶、尿酸酶、尿蛋白1、Urocortin 1、Urocortin 2、Urocortin 3、尿压素II、Vang-样1(Vangl1)、Vang-样2(Vangl2)、血管内皮生长因子(VEGF)，舒血管肠肽前体、波形蛋白、维生素D结合蛋白、Von Willebrand因子、Wnt1、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt12、Wnt13、Wnt14、Wnt15、Wnt16、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9和黄嘌呤氧化酶。

在遗传修饰过程后，组织样品可以随后被分析以验证组织样品对感兴趣基因的表达。这可以用现有技术中已知的任何方法进行，例如用ELISA检测蛋白质或用Northern印迹检测RNA。特定表达载体系统和导入核酸进细胞的方法可用现有技术中常规使用的标准方法进行评价。例如，导入到细胞中的DNA可用滤膜杂交技术(例如Southern印迹)检测，由导入的DNA转录产生的RNA可例如通过Northern印迹、RNase保护或逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)进行检测。基因产物可通过合适分析进行检测，例如用一特异性抗体对所产生的蛋白质进行免疫学检测，或者用一功能分析如酶分析检测基因产物的功能活性。如果细胞表达的感兴趣基因产物不能容易地被检测，可以先用一与调控元件和待使用的载体相连的报道基因优化表达系统。报道基因编码一种可容易地被检测的基因产物，因此可以用于评价系统的功效。现有技术中使用的标准报道基因包括编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶、GFP/EGFP和人生长激素的基因。

本发明在一个方面包括遗传修饰的DTMO在移植进一个生物体中的应用。本文所用术语“给予、给药”、“导入”、“植入”和“移植”可互换使用并且是指将本发明的DTMO置于一对象中，例如一自体、同种异体(allogeneic)或异种的对象，使用的方法和途径是使得DTMO定位在期望的部位。DTMO在对象中的期望位置的植入是使得DTMO的至少一部分细胞保持存活。在本发明的一个实施方案中至少约5％、在本发明的另一实施方案中至少约10％、在本发明的另一实施方案中至少约20％、在本发明的另一实施方案中至少约30％、在本发明的另一实施方案中至少约40％、在本发明的另一实施方案中至少约50％或更多的细胞在给予对象后保持存活。在给予对象后细胞存活时间可以短至几小时，例如24小时，至几天，至长达几周、几个月或几年。为了促进可受到宿主免疫学攻击的细胞群在组织内的移植，例如在使用异种移植物时如猪-人移植时，DTMO可被插入或包裹在生物相容性免疫保护材料如可再装载的非生物降解性或生物降解性装置中，然后被移植进受体对象中。由这种细胞/组织产生的基因产物随后可经例如设计用于受控输送化合物例如药物(包括蛋白质生物药物)的聚合装置而输送。各种生物相容性组合物(例如包括水凝胶)、包括生物降解性和非生物降解性聚合物可以被用于形成植入体以实现本发明的细胞群的基因产物在特定靶部位的持续释放。现有技术中通常已知这种植入体的产生方法，参见例如ConciseEncyclopedia of Medical & Dental Materials，ed.By David Williams(MIT Press：Cambridge，MA，1990)；Sabel等人，美国专利4,883,666；Aebischer等人，美国专利4,892,538；Aebischer等人，美国专利5,106,627；Lim，美国专利4,391,909；和Sefton，美国专利4,353,888。本发明DTMO内的细胞群可以在一药物学可接受的载体或稀释剂如无菌盐水和水性缓冲溶液中被给药。这类载体和稀释剂的使用是现有技术中熟知的。

分泌蛋白例如但不限于可以是根据手术本发明实施方案的任何蛋白质。在本发明的一个实施方案中，感兴趣的蛋白质可以是促红细胞生成素。在本发明的另一实施方案中，本发明方法可以用于表达和分泌现有技术中已知的每一和任一蛋白质或它们的组合。另外，本发明方法可用于表达RNA分子(有义或反义)。

或者，包括遗传修饰细胞的DMO可在体外保持，而留在组织样品周围的上清培养基中的治疗剂可以被分离并注射或施加于同一或不同对象。

另外地或额外地，包括遗传修饰细胞的真皮微器官可以通过本领域已知方法进行低温保存，例如但不限于在从组织样品形成后或在遗传改变后立即在含有10％DMSO的DMEM中逐渐冷冻(0℃、-20℃、-80℃、-196℃)。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，待植入的包括遗传修饰细胞的组织样品的量由以下一或多项确定：基于规章指导、具体临床方案或类似对象的群体统计而常规给予这类对象的感兴趣治疗剂的相应量；当该对象先前已通过注射或其它给药途径接受相同治疗剂时，特异给予该同一对象的治疗剂如感兴趣蛋白质的相应量；对象数据如体重、年龄、身体条件、临床状态；来自对先前给予其它类似对象的包括遗传修饰细胞的组织样品的药动学数据；对先前给予该对象的包括遗传修饰细胞的组织样品的应答。

根据本发明的一些实施方案的一个方面，仅有一些DTMO被用于给定的治疗过程。其余的DTMO可返回保持(或低温保存或以其它方式保存)，以备以后使用。

因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种确定待植入患者中的治疗性微器官的量的方法，该方法包括体外确定由一定数量的真皮微器官分泌的治疗剂的水平；估算治疗剂的体外产生和分泌水平与其在体内血清水平之间的关系；基于所确定的分泌水平以及所估算的关系，确定待植入的DTMO的量。任选地，所述关系基于选自如下一组的一或多种因素进行估算：

a)对象数据如体重、年龄、身体条件、临床状态；

b)来自对其它类似对象先前进行的DTMO给药的药动学数据；和

c)来自对该对象先前进行的DTMO给药的药动学数据。

任选地，所述关系基于至少两种所述因素进行估算。任选地，所述关系基于三种所述因素。

在本发明的一个实施方案中，确定待植入进患者中的DTMO的量也基于如下一或两项：

基于规章指导、具体临床方案或类似对象的群体统计而常规给予这类对象的相同治疗性蛋白质的相应量；以及

当该对象先前已通过注射或其它给药途径接受相同治疗剂时，特异于该同一对象的相同治疗剂的相应量。

在本发明的一个实施方案中，所述方法包括根据确定的量制备用于一定量的用于植入的DTMO。

在本发明的一个实施方案中，还提供了调整由植入一个对象中的DTMO产生的治疗剂的剂量并且排出治疗剂的方法，包括(a)监控该对象中治疗剂的水平；(b)将治疗剂的水平与一期望水平进行比较；(c)如果所述水平低于最低水平，则植入额外的DTMO；(d)如果所述水平高于最高水平，则失活或除去所植入的DTMO的一部分。任选地，所述方法包括定期重复(a)-(d)。另外地或额外地，失活或除去由除去植入的DTMO的一部分组成。任选地，除去包括手术除去。另外地或额外地，失活或除去包括失活。任选地，失活包括杀死植入的DTMO的一部分。任选地，失活包括切除植入的DTMO的一部分。

如上参照图1的描述，在遗传改变过程中保持DMO的方法的至少一部分以及遗传改变本身可以在一生物反应器中进行，如下所述。

根据本发明的一些实施方案，生物反应器可具有下述一些或全部特性：

能够提供养分和气体给DMO的表面以便它们可以扩散进DMO中并且DMO可保持存活。因此，DMO的大部分面积和体积不会被阻断与周围液体接触。

能够将DMO保持在期望的温度。

能够在DMO附近保持期望的pH和气体组成。

能够将废物从DMO和/或生物反应器除去。

能够提供插入遗传修饰性载体的简单方法，而没有插入载体会污染周围环境的危险。

能够除去过量的未使用的载体。

能够测量所产生的治疗剂的量。

能够取出基本上无菌的治疗剂。

能够容易地插入DMO且取出全部或测量量的DTMO。

现参照图22，其示意性描述了根据本发明的一些示例性实施方案的处理采集的DMO的系统2207。

根据本发明的一些示例性实施方案，系统2207可包括一生物反应器2200，该生物反应器2200具有一或多个加工腔室2202，每个腔室适于接受一个DMO 2204。在一个示例性实施方案中，生物反应器2200具有相同于从一特定对象采集的DMO数目的腔室数，其可以被调适以从一液体贮液池2208提供合适的液体例如生长培养基给一或多个加工腔室2202和/或将一或多个加工腔室2202中的液体排放进例如废物容器2210，如下所述。可经过例如通过无菌连接器2258与贮液池2208相连的入口管线2242给贮液池2208供应液体，如下所述。

DMO 2204可用一用于采集DMO 2204的切割工具转移进腔室2202，例如如上所述。DMO转移进腔室2202可优选地在采集DMO2204后并保持无菌条件的同时直接进行。加工腔室2202可包括一适于接受DMO 2204的DMO插入端口2201。例如，端口2201可包括一能接受钝套管例如由B.Braun Medical Inc.出售的SafeLineInjection Site的无菌隔片界面。当切割工具的尖头穿过隔片插入时，可以以基本上无菌的方式、例如使用与切割工具后端连接的注射器将DMO 2204轻轻冲进腔室2202中。根据一个示例性实施方案，DMO2204可被冲进腔室2202内的培养基浴2206中。或者，如果例如DMO2204是例如如上所述用内导杆采集的，则可以除去盖在腔室2202上的盖2232(例如如下所述)，可将DMO 2204轻轻从内导杆上取下并置于腔室2202内，然后将盖2232盖回并密封腔室2202以保持腔室2202的无菌性。

生物反应器2200可被调试使之例如以基本上相同的方式对装在至少一些加工腔室中的DMO施加一或多个过程。根据本发明的示例性实施方案，生物反应器2200可被调适以使之能将一或多个加工腔室中的内容物与一或多个其它加工腔室中的内容物流体分离，如下所述。

根据本发明的示例性实施方案，生物反应器2200还可包括一控制液体流进和/或流出加工腔室2202的机构，如下所述。

根据一个示例性实施方案，生物反应器2200可包括与非无菌注射泵2214流体连通的无菌缓冲器2222，其可适于例如经一无菌过滤器2220(例如0.45微米孔径的空气过滤器)以无菌方式将空气注入缓冲器2222和/或从缓冲器2222排放空气。生物反应器2200还可包括一控制阀2212，其能够在至少4个位置之间移动，例如入口-缓冲器位置，其中输入贮液池2208与缓冲器2222流体连通；出口-缓冲器位置，其中废物容器2210与缓冲器2222流体连通；腔室-缓冲器位置，其中腔室2202与缓冲器2222流体连通；和/或无连接位置，其中缓冲器2222、腔室2202、输入贮液池2208和废物容器2210互相流体不连通。活塞2226可连接在阀2212和马达2224之间以适于将阀2212在不同位置之间移动。任选地，可在活塞2226上安装一囊形膜板2228以便在活塞2226移动过程中基本上没有非无菌空气转移进无菌缓冲器2222中。

系统2201还可包括一马达2206以驱动注射泵2214的柱塞2218。如果生物反应器包括多于一个的腔室，则可安装一个马达以同时驱动与腔室相关的每一个柱塞，或者可安装多个马达，每个均可驱动一或多个柱塞。

根据本发明的示例性实施方案，系统2201可包括一控制器2286，其能够控制马达2216和/或马达2224的运转，例如如下所述。

根据本发明的示例性实施方案，来自贮液池2208的液体可以以可控方式转移进腔室2202，以例如充满腔室2202。例如，控制器2286可驱动马达2224以使阀2212处于入口-缓冲器(inlet-buffer)位置，并且以可控方式驱动马达2216从而使注射泵2214从缓冲器2222排出预定量的空气。其结果是相当于所述预定量体积空气的预定量体积的液体被从输入贮液池2208“吸引”进缓冲器2222。控制器2286随后可以可控方式驱动马达2224以将阀移动到腔室-缓冲器位置，并可控地驱动马达2216以便注射泵2214将缓冲器2222中的液体排放进腔室2202中。以类似的方式，注射泵和控制阀可被控制以将腔室2202中的内容物或其部分量排放进废物容器2210。

根据本发明的一些示例性实施方案，腔室2202内的液体可以被可控地搅拌和/或混合，例如以辅助病毒转导和/或施加于DMO 2204的任何其它体外维持程序。例如，控制器2286可以可控方式驱动马达2216和/或马达2224，例如如上所述，以定期将液体或其部分从腔室2202排放进缓冲器，之后将缓冲器中的液体注回腔室2202。

根据本发明的一些示例性实施方案，可使用空气净化位于例如流体连通输入贮液池2208、废物容器2210和/或腔室2202之间的一或多个“通道管线”中的液体，以便例如在将液体转移进/转移出腔室2202、输入贮液池2208和/或缓冲器2222后“冲洗”通道管线。这一方面是有用的，例如用于降低可能被“捕获”在一或多个通道管线中的液体的“死体积”。例如，控制器2286可以可控方式驱动马达2216以移动注射器活塞2218从而在将液体从贮液池2208导向缓冲器2222之前将预定体积的空气吸入缓冲器2222。缓冲器2222可具有一几何形状，从而在缓冲器2222内空气将上升到液体之上，由此在驱动注射泵2214时缓冲器2222中的液体首先被排放，然后是空气，空气会冲洗除去保留在通道管线中的一些或全部液体。

根据本发明一些示例性实施方案，腔室2202的底面2230可包括多个孔或网孔状图案，例如构造用于使液体以基本上均匀的方式转移进腔室2202和/或从腔室2202转移出，和/或使得从腔室2202排出基本上大部分液体。这一构造也可使得降低“静点”发生率，静点即腔室中液体保持不流动和/或不恢复流动的区域。

根据一些示例性实施方案，盖2232可以是可拆式无菌盖，如通过可剥离的粘合剂固定的膜、硅塞材料、或类似物。盖2232可适于在腔室2202和环境之间保持一无菌“屏障”。任选地，可安装一无菌空气过滤器2234例如0.45微米孔径的空气过滤器以使腔室2202和环境流体连通，由此在保持腔室2202和环境之间的无菌屏障的同时能平衡压力。或者盖2232可包括一“可呼吸”材料，以便可通过盖2232实现压力平衡。

贮液池2208和/或废物容器2210可例如经一或多个歧管(未示出)共同连接至针对具体对象的一或多个加工腔2202。或者，输入贮液池2208和/或废物容器2210可单独连接至每一个加工腔。输入贮液池2208和/或废物容器2210可包括一以无菌方式平衡压力的机构。例如，输入贮液池2208和/或废物容器2210可分别经一无菌空气过滤器2236和/或无菌空气过滤器2238与环境流体连通。过滤器2236和/或过滤器2238可包括例如0.45微米孔径空气过滤器。或者废物容器2210可包括一可扩展的废物容器，从而无需压力平衡并因此不需要使用无菌空气过滤器。

根据本发明的一个示例性实施方案，生物反应器2200可适于将液体直接注射进腔室2202或将液体从腔室2202排出。可使用一取样隔片端口(septum port)2240例如直接注射病毒载体液体或取样生长培养基以用于各种生物反应器参数的测试，如ELISA、葡萄糖摄入、乳酸产生或任何其它指示性参数。隔片端口2240可包括一适于针插入的标准硅端口或一套管端口，例如上述参照DMO插入口2201所述的那样。一种注射器(未示出)可脱离地通过隔片端口2240插入。该注射器可由一例如类似于马达2216的马达驱动，其可以手动驱动或用控制器2286自动驱动。

根据本发明的示例性实施方案，生物反应器2200的至少一些、在某些示例性实施方案中全部组件可被保持在预定条件例如保温条件下，包括约37℃的温度、约90-95％空气和约5-10％CO₂的气体环境和/或相对较高的湿度例如85-100％。根据一个示例性实施方案，仅仅腔室2202被保持在保温条件下。如上所述，这些保温条件可以是保持DMO组织培养物存活性所需的。

根据本发明的示例性实施方案，可安装一液体供应装置以从至少一个液体罐例如液体罐2244和2246向输入管线2242供应液体。在一个示例性实施方案中，罐2244和2246可含有相同的液体例如生长培养基，在这种情况下一个罐可用作另一罐的备份。在另一示例性实施方案中，罐2244和2246可含有两种不同类型的液体，如用于DMO加工的不同阶段的两种类型生长培养基。罐2244和/或罐2246可包括一无菌空气过滤器以便以无菌方式平衡压力，如上述参照贮液池2208所述那样。或者，罐2244和/或罐2246可包括一折叠式罐例如现有技术中已知的无菌塑料袋。

根据本发明的示例性实施方案，罐2244和2246的每一个可经阀2252例如夹紧阀、隔片端口连接器(septum port connector)2248和穿入针(penetration spike)2250与组合连接器(combining connector)2254液体连通。连接器2254可包括例如本领域已知的一Y型或T型连接器。阀2252可适于控制液体从罐2244和/或罐2246流向连接器2254。泵例如蠕动泵2256可沿输入管线2242位于连接器2254和连接器2258之间。控制器2286可通过可控伺服马达(actuating motor)2257和/或阀2252用于控制提供给贮液池2208的液体的量和/或流速。

根据一个示例性实施方案，罐2244和/或罐2246中所含的液体在冷却4℃条件下的储存期限是9天。因此可采用一致冷系统(未示出)保持罐2244和/或罐2246中的液体在一定温度，该温度可低于贮液池2208的保温温度。因此，输入管线2242可穿过致冷条件和保温条件之间的界面。在储存期限超过后，罐2244和/或罐2246可被换以新罐。

根据一示例性实施方案，生物反应器2200的至少一些构件可由一次性无菌塑料成分形成。根据这些实施方案，生物反应器2200可包括一次性使用的无菌包装的生物反应器装置，其可被运送到DMO采集部位并且可在无菌环境中被打开并在原位准备以使生长培养基注射进每一生物反应器腔室2202。用于采集DMO的工具可通过DMO插入口2201插入以便以无菌方式将DMO冲洗进腔室2202，如上所述。生物反应器装置2200可以例如在保温条件下被运送至加工部位，在加工部位其可与系统2207的其它部件连接，这些部件例如连接器2258、马达2216和/或2224、夹紧阀2252和/或蠕动泵2256。控制器2286随后在整个体外加工过程中可控制DMO的维持和转导，在此过程中从采集的DMO产生DTMO。具体对象所需的剂量可使用例如本文所述的药动学模型确定。生物反应器装置随后可从系统2207脱离，并例如在保温条件下被运送至植入部位。为了例如根据上述植入方法植入特异的DTMO，可通过移去盖2232而打开装有该特异DTMO的生物反应器腔室2202，可从腔室中取出DTMO。

                    实施例

                    实施例1

DTMO-hEPO的人促红细胞生成素体外分泌水平

进行实验以分析得自不同人皮肤样品的DTMO-hEPO之间的体外hEPO分泌水平的变异性。

                    实验程序

从得自6个不同人的皮肤样品制备DTMO-hEPO(各3份)，在洗涤病毒载体后在图4所示的不同时间点测量hEPO分泌水平。

                    实验结果

在不同人皮肤样品之间DTMO-hEPO分泌水平是类似的。另外，DTMO-hEPO分泌水平类似于先前从分层TMO-hEPO获得的分泌水平(数据未示出)。

                        实施例2

                        组织学

为了验证DTMO主要含有真皮成分，进行一组织学分析。从分层皮肤或真皮皮肤样品制备MO，由一皮肤病理学家进行组织学分析。如图5左侧所示，DTMO含有真皮层和真皮成分，没有残余的基底和/或表皮层。相比之下，图5右侧示出的分层TMO含有所有皮肤层包括基底和表皮层。

                       实施例3

                    免疫细胞化学研究

为了研究哪些细胞在DTMO-hEPO组织中被转导，在采集后第9天用抗hEPO单克隆抗体(1∶20稀释度)进行DTMO-hEPO的组织学免疫组织化学分析。分析揭示真皮成纤维细胞强染色，如图6所示。染色遍布整个DTMO。

                        实施例4

   来自DTMO-hEPO和完整TMO的在SCID小鼠中的长期hEPO造血

                        活性的比较

进行实验以检查和对比皮下植入的DTMO-hEPO和分层衍生的TMO-hEPO在SCID小鼠中的长期作用。

                        实验程序

制备人DTMO-hEPO和人分层衍生的TMO-hEPO并皮下植入到两组SCID小鼠(每组5只小鼠)中。对照组植入用Ad/lacZ病毒载体转导的人DTMO和分层衍生的TMO。

                        实验结果

如图7所示，在两个实验组中观察到相似的分泌水平和生理学应答，而如所预期的，对照组小鼠在其血液中没有hEPO。

在所有实验组中，早在植入后15天即可观察到血细胞比容的升高，并保持超过5个月，而MO/lacZ对照小鼠不显示这种血细胞比容水平的升高。当与分层衍生的TMO-hEPO相比时，DTMO-hEPO看起来产生了类似的分泌水平并维持了类似一段时间。

                    实施例5

        DTMO-hEPO当被皮下植入时不形成角质囊肿

                    实验程序

将DTMO-hEPO和分层衍生的TMO-hEPO皮下植入SCID小鼠中，经临床和组织学分析监控角质囊肿形成。

                    实验结果

如图8清楚可见，在植入后76天和141天观察到植入分层衍生的TMO-hEPO有角质囊肿形成。相反，在植入后113天具有DTMO-hEPO的SCID小鼠中没有观察到囊肿形成。

                    实施例6

        分层衍生的和DMO在健康人中的整合

                    实验程序

用商购的取皮机(Aesculap GA 630)获得人真皮MO和人分层衍生的分层衍生的TMO。在采集前，用Emla乳液(表面局部麻醉)和皮下注射Marcain+Adrenalin(局部麻醉)进行供体和受体部位的表面局部(topical)和局部(local)麻醉。

采集两种类型的皮肤样品以产生人真皮MO和人分层衍生的MO。为获得人分层衍生的MO，从腹部靠下部分切下一条健康皮肤。从这一皮肤部分如前所示制备6个线状MO。同时，用可调式裂缝制备机在植入部位制备具有特定尺寸的裂缝，稍后将MO移植进所述皮肤裂缝。为制备人真皮MO，以两步采集皮肤。首先，采集深度为200微米的皮瓣并保持在湿纱布中。从这一采集部位采集1mm深的真皮皮肤条。采集皮肤后，将所述200微米皮瓣放回供体部位以作为生物敷料。从上述采集的真皮条用制备分层衍生的分层衍生的TMO相同的程序制备4个真皮MO。将所述人真皮MO稍后用套针皮下植入。用Bioclusive透明膜(Johnson & Johnson，USA)覆盖供体和植入部位。一周后，更换敷料，检查植入物以检查移植整合。MO植入后两到三周，进行设计的腹壁成形术，切下包括移植和植入区域在内的一部分皮肤。在移植区域进行临床评价，包括照相和组织学检查以确定MO整合。

                        实验结果

植入后一周进行的临床检查和腹壁成形术后很快(移植后2-3周)进行的组织学分析显示移植的MO非常好地整合进皮肤裂缝中以及整合在真皮MO皮下植入部位(图9)。在植入进裂缝中的分层衍生的MO上以及在皮下植入的真皮MO上均未发现发炎或红肿迹象。

                        实施例7

表达人促红细胞生成素(hEPO)的小型猪皮肤线性分层TMO自体植

                    入免疫相容性动物中

线状(30.6毫米长、0.6微米宽)小型猪(Sinclar猪)皮肤微器官从用普通麻醉程序得自活动物的新鲜皮肤组织样品制备。0.9-1.1mm分层皮肤(深度)的组织样品用商购取皮机(AesculapGA630)取下，并在皮氏皿(90mm)中用含有谷氨酰胺和Pen-Strep的DMEM清洁。

为了产生线状微器官，经加压装置使用上述刀刃结构将上述组织样品切割成所希望的尺寸：30.6毫米×600微米。将所得线状微器官置于不含血清的每孔含有500微升DMEM(Biological Industries-BeitHaemek)的24孔微滴板中，每孔1个微器官，在5％CO₂下于37℃保温24小时。在振荡平板的同时，使用一携带编码人促红细胞生成素的基因的腺病毒载体(Adeno-hEPO)(1×10¹⁰IP/ml)对每一孔进行转导程序以产生小型猪皮肤治疗性微器官(猪皮肤TMO)。每2-4天更换培养基并用一特异性ELISA试剂盒(Cat.#DEP00，QuantikineIVD，R & D Systems)分析培养基中是否存在hEPO。

将上述小型猪皮肤hEPO线状TMO皮下植入以及作为皮肤移植片移植进几个免疫相容性小型猪中(在两个小型猪中，皮下植入TMO-hEPO，在另外两个小型猪中，TMO-hEPO移植进1mm深的裂缝中)。在每一小型猪中植入走过数目的TMO-hEPO以便在每个猪中它们的组合的植入前分泌水平为约每天7微克。在植入后连续7天产生了经ELISA测定的升高的血清hEPO水平(图3A)和网状红细胞计数升高。

因此，很清楚本发明已利用实施方案的非限制性的详细描述进行了描述，这些实施方案是示例性的，并非意在限制本发明范围。例如，仅仅有限数量的遗传变化被显示。但是，基于本文所述的活组织被再植入患者体内的方法学，以及在植入后该组织在身体中的存活性，很清楚由基本上任何已知方法诱导的基本上任何的组织中的遗传变化都将产生靶蛋白或其它治疗剂在患者中的分泌。

本发明的实施方案的变化、包括各种实施方案的特征的组合对于本领域技术人员是能想到的。本发明的范围因此仅由权利要求书的范围限定。另外，为了避免有关权利要求书范围的任何问题，当权利要求书中使用术语“包含”、“包括”或“具有”或其后缀时，它们是指“包括但非必须限于”。

Claims (88)

1、一种包含多种真皮成分的真皮微器官，其基本上保持它们所来源的真皮组织的微观结构和三维结构，具有选定的尺寸从而允许充足的养分和气体被动扩散至所述真皮微器官的细胞以及细胞废物扩散出所述细胞，从而将由于在所述真皮微器官中营养不足和废物积累所致的细胞毒性和伴随的死亡减至最低。

2、权利要求1的真皮微器官，其中所述真皮微器官产生不超过可忽略量的角蛋白。

3、权利要求1或权利要求2的分离的真皮器官，其具有约5-100mm的长度。

4、权利要求1-3任一项的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括真皮剖面的一部分。

5、权利要求4的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括真皮剖面的大部分。

6、权利要求5的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括基本上整个真皮剖面。

7、权利要求1-6任一项的真皮微器官，其中所述真皮微器官进一步包括脂肪组织。

8、权利要求1-7任一项的真皮微器官，其中所述真皮微器官进一步包括来自至少一层表皮层的组织。

9、权利要求8的真皮微器官，其中所述至少一层表皮层包括基底表皮层。

10、权利要求1-9任一项的真皮微器官，其中所述真皮微器官可在体外维持至少几天。

11、权利要求10的真皮微器官，其中所述真皮微器官可在体外维持至少几周。

12、权利要求1-11任一项的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括体内分界线。

13、权利要求1-12任一项的真皮微器官，其中所述真皮微器官被包囊在一免疫保护性外壳中。

14、一种表达至少一种重组基因产物的遗传修饰的真皮微器官，所述真皮微器官包含多种真皮成分，其保持它们所来源的真皮组织的微观结构和三维结构，具有选定的尺寸从而允许充足的养分和气体被动扩散至所述真皮微器官的细胞以及细胞废物扩散出所述细胞，从而将由于在所述真皮微器官中营养不足和废物积累所致的细胞毒性和伴随的死亡减至最低，其中至少一些所述细胞表达至少一种重组基因产物的至少一部分。

15、权利要求14的遗传修饰的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括真皮剖面的一部分。

16、权利要求15的遗传修饰的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括真皮剖面的大部分。

17、权利要求16的遗传修饰的真皮微器官，其中所述真皮微器官包括基本上整个真皮剖面。

18、权利要求14-17任一项的遗传修饰的真皮微器官，其中所述真皮微器官进一步包括脂肪组织。

19、权利要求14-18任一项的遗传修饰的真皮微器官，其中所述至少一种重组基因产物是衍生该真皮微器官的器官所天然产生的。

20、权利要求14-18任一项的遗传修饰的真皮微器官，其中所述至少一种重组基因产物不是衍生该真皮微器官的器官所天然产生的。

21、权利要求14-20任一项的遗传修饰的真皮微器官，其中所述遗传修饰的真皮微器官包括体内分界线。

22、权利要求14-21任一项的遗传修饰的真皮微器官，其中所述遗传修饰的真皮微器官被包囊在一种免疫保护性外壳中。

23、一种在对象中诱导局部或系统性生理学作用的方法，包括在身体内植入权利要求1-22任一项的真皮微器官。

24、权利要求23的方法，其中植入所述真皮微器官包括将所述真皮微器官植入皮肤中或皮肤下。

25、一种将感兴趣的基因产物输送至一对象的方法，包括将权利要求14-24任一项的遗传修饰的真皮微器官植入身体中。

26、权利要求25的方法，其中植入所述遗传修饰的真皮微器官包括将所述遗传修饰的真皮微器官植入皮肤中或皮肤下。

27、权利要求23-26任一项的方法，其中所述真皮微器官来自所述对象。

28、权利要求23-26任一项的方法，其中所述真皮微器官来自供体。

29、权利要求28的方法，其中所述供体是人。

30、权利要求28的方法，其中所述供体是非人动物。

31、一种确定待植入患者中的治疗性真皮微器官的量的方法，所述方法包括：

体外确定由一定数量的真皮微器官产生和/或分泌的治疗剂的水平；

估算治疗剂的体外产生和/或分泌与其在体内血清水平之间的关系；

基于所确定的产生和/或分泌水平以及所估算的关系，确定待植入的治疗性真皮微器官的量。

32、一种将真皮治疗性微器官植入到植入部位的方法，包括：

在所述植入部位插入一种载体，该载体中吸入了所述真皮治疗性微器官；

撤出所述载体，同时将所述真皮治疗性微器官保持在所述植入部位。

33、权利要求32的方法，其中所述植入部位在皮肤内或在皮肤下。

34、一种将真皮治疗性微器官植入到植入部位的方法，包括：

在所述植入部位插入一种载体，该载体中吸入了所述真皮治疗性微器官；

在吸入的真皮治疗性微器官上施加压力以使得所述真皮治疗性微器官离开所述载体进入到所述植入部位。

35、权利要求34的方法，其中所述要植入的部位在身体内。

36、一种调节由植入对象中的治疗性真皮微器官产生的治疗剂的剂量并分泌出治疗剂的方法，包括：

监控对象中治疗剂的水平；和

基于所述治疗剂水平和至少一种阈值水平之间的对比而控制对象中治疗性真皮微器官的量。

37、权利要求36的方法，其中所述至少一种阈值水平包括最低水平和最高水平，并且其中控制治疗性真皮微器官的量包括：

如果所述治疗剂水平低于所述最低水平则植入额外的治疗性真皮微器官；以及

如果所述治疗剂水平高于所述最高水平则失活或除去一部分植入的治疗性真皮微器官。

38、权利要求37的方法，进一步包括定期重复所述监控和所述控制直至所述治疗剂的水平处于所述最低和所述最高水平之间。

39、权利要求37或权利要求38的方法，其中所述失活或除去所述部分包括除去所述部分。

40、权利要求37或权利要求38的方法，其中所述失活或除去所述部分包括手术除去所述部分。

41、权利要求37或权利要求38的方法，其中所述失活或除去所述部分包括切除所述部分。

42、权利要求37或权利要求38的方法，其中所述失活或除去所述部分包括杀死所述部分。

43、一种用于采集真皮微器官的装置，所述装置包括：

一种支撑构造，用以支撑待从其采集所述真皮微器官的皮肤相关组织结构；和

一种能将所述真皮微器官从所述皮肤相关组织结构分离出的切割工具。

44、权利要求43的装置，其中所述支撑构造包括一第一管状构件，且其中所述切割工具包括一第二管状构件，其适于沿所述第一构件插入并基本上与所述第一构件共轴。

45、权利要求44的装置，其中所述第一管状构件包括一内导引针。

46、权利要求44或权利要求45的装置，其中所述第一管状构件适于将所述真皮微器官从所述第二管状构件取出。

47、权利要求44-46任一项的装置，其中所述第二管状构件包括一钻取管，该钻取管当沿切割轴前进时能切割穿过所述皮肤相关组织结构。

48、权利要求47的装置，其中所述钻取管包括一可旋转钻取管。

49、权利要求47或权利要求48的装置，其中所述钻取管的内表面和外表面中的至少一个被低摩擦材料至少部分包被。

50、权利要求49的装置，其中所述低摩擦材料包括Teflon或Parylene。

51、权利要求44的装置，其中所述第一管状构件包括一槽口(notch cutout)。

52、权利要求43-51任一项的装置，其中所述支撑结构包括一夹持机构以支撑所述皮肤相关组织结构。

53、权利要求43的装置，其中所述支撑构造包括一真空腔，其具有能将所述皮肤相关组织结构维持在所希望的形状和位置的内支撑表面以便使所述切割工具将所述真皮微器官从所述皮肤相关组织结构分离出。

54、权利要求53的装置，其中当向所述腔施加真空条件时所述皮肤相关组织结构位于所述腔的内部。

55、权利要求53或权利要求54的装置，其包括与所述真空腔连接的一导向通道，所述导向通道构造用于当所述切割工具插入其中时将所述切割工具维持在离开所述支撑表面预定的距离。

56、权利要求55的装置，其中所述距离基于所述皮肤相关组织结构内用于采集所述真皮微器官的希望位置而预定。

57、权利要求53-56任一项的装置，其包括一或多个将所述表面的至少一部分与至少一个真空源流体连通的真空通道。

58、权利要求53-57任一项的装置，其包括一夹持构造，用于在所述皮肤相关组织结构被所述支撑表面支撑时夹持所述皮肤相关组织结构。

59、权利要求53-58任一项的装置，其中所述腔的至少一维尺寸基于所述真皮微器官的至少一维预期尺寸而预定。

60、权利要求53-59任一项的装置，其中所述切割工具适于从所述腔内抽取所述真皮微器官。

61、权利要求53-60任一项的装置，其中所述真空腔包括一高位突起，其能够保持皮肤平面普遍高于切割工具的轨迹，从而采集的真皮微器官仅用一个柳叶刀切口即可从身体分离。

62、权利要求43-61任一项的装置，其包括一能够旋转所述切割工具的旋转装置。

63、权利要求62的装置，其中所述旋转装置以至少1000RPM的速度旋转所述切割工具。

64、权利要求63的装置，其中所述旋转机构以至少2000RPM的速度旋转所述切割工具。

65、权利要求64的装置，其中所述旋转机构以至少7000RPM的速度旋转所述切割工具。

66、权利要求43-65任一项的装置，其中所述皮肤相关组织结构具有一总体上的圆柱形。

67、权利要求43-66任一项的装置，其中所述皮肤相关组织结构包括表皮组织成分和真皮组织成分。

68、权利要求67的装置，其中所述皮肤相关组织结构进一步包括至少一些脂肪组织和肌肉组织。

69、权利要求43-68任一项的装置，其中所述采集的真皮微器官包括至少一部分真皮剖面。

70、权利要求69的装置，其中所述真皮微器官还包括脂肪组织。

71、权利要求69或权利要求70的装置，其中所述真皮微器官还包括表皮组织。

72、权利要求43-71任一项的装置，其中所述真皮微器官包括多种真皮成分，其基本上保持它们所来源的真皮组织的微观结构和三维结构，具有选定的尺寸从而允许充足的养分和气体被动扩散至所述真皮微器官的细胞以及细胞废物扩散出所述细胞，从而将由于在所述真皮微器官中营养不足和废物积累所致的细胞毒性和伴随的死亡减至最低。

73、一种从对象采集真皮微器官的方法，包括：

支撑从其采集真皮微器官的皮肤组织相关结构；和

从所述皮肤相关组织结构分离所述真皮微器官。

74、权利要求73的方法，其中所述支撑包括将一内导杆插入所述皮肤相关组织结构，且其中所述分离包括将一切割工具沿所述内导杆插入并与其共轴。

75、权利要求74的方法，其中所述支撑包括夹持所述皮肤相关组织结构。

76、权利要求74或权利要求75的方法，进一步包括撤出所述内导杆从而抽取所述真皮微器官。

77、权利要求74-76任一项的方法，其中插入所述内导杆包括以与所述皮肤相关组织结构的皮肤表面大概平行的方式插入所述内导杆。

78、权利要求74-77任一项的方法，其中所述分离进一步包括旋转所述切割工具。

79、权利要求78的方法，其中所述旋转包括以高于1000RPM的速度旋转所述切割工具。

80、权利要求79的方法，其中所述旋转包括以高于2000RPM的速度旋转所述切割工具。

81、权利要求80的方法，其中所述旋转包括以约7000RPM的速度旋转所述切割工具。

82、权利要求73的方法，其中所述支撑包括向所述皮肤相关组织结构施加一真空条件。

83、权利要求73-82任一项的方法，其中所述皮肤相关组织结构包括表皮组织成分和真皮组织成分。

84、权利要求83的方法，其中所述皮肤相关组织结构进一步包括至少一些脂肪组织和肌肉组织。

85、权利要求73-84任一项的方法，其中所述真皮微器官包括至少部分真皮剖面。

86、权利要求85的方法，其中所述真皮微器官进一步包括脂肪组织。

87、权利要求73-86任一项的方法，包括形成至少一个柳叶刀切口。

88、权利要求73-87任一项的方法，其中所述真皮微器官包括多种真皮成分，其基本上保持它们所来源的真皮组织的微观结构和三维结构，具有选定的尺寸从而允许充足的养分和气体被动扩散至所述真皮微器官的细胞以及细胞废物扩散出所述细胞，从而将由于在所述真皮微器官中营养不足和废物积累所致的细胞毒性和伴随的死亡减至最低。

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