KR20120102152A - 진피 미세 기관, 그를 생산 및 이용하기 위한 방법 및 장치 - Google Patents

진피 미세 기관, 그를 생산 및 이용하기 위한 방법 및 장치 Download PDF

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KR20120102152A
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스테펜 에프. 벨로모
이트자크 리핀
길레르모 알베르토 피바
리오르 로젠버그
모르데차이 버크만
바루크 에스. 스턴
다비드 샬헤베트
메나쳄 디. 샤비트
앤드류 엘. 펄만
샤니 노암
에이나트 알몬
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메드제닉스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 진피 미세 기관(DMO), 그의 생산 방법 및 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 이들이 유래된 조직 또는 기관의 미세구조와 이들이 유래된 진피 조직의 3차 구조를 실질적으로 유지하는 복수개의 진피 구성성분을 포함하는 DMO를 제공하며, 상기 DMO는 불충분한 영양분 및 노폐물의 축적으로 인한 세포 독성과 이로 인한 사멸을 최소화하기 위해, 적절한 영양분 및 가스의 DMO내 세포로의 수동적 확산 및 MO 세포 밖으로의 세포 노폐물의 확산을 허용하도록 선택된 크기를 가진다. 아울러, 본 발명은 DMO를 채취하기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 본 발명의 일 구현예에 따른 DMO를 채취하기 위한 장치는 채취될 DMO로부터 피부 관련 조직 구조를 지지시키는 지지 부재, 및 상기 DMO를 피부 관련 조직 구조로부터 분리시킬 수 있는 절단 도구를 포함할 수 있다. 그 밖의 구현예는 본 발명의 상세한 설명, 및 청구의 범위에 기재되어 있다.

Description

진피 미세 기관, 그를 생산 및 이용하기 위한 방법 및 장치 {DERMAL MICRO ORGANS, METHODS AND APPARATUSES FOR PRODUCING AND USING THE SAME}
본 발명은 조직 기재의 미세 기관, 조직을 기재로 한 치료용 미세 기관, 및 진피 조직을 채취, 처리, 이식, 및 조작하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
치료제를 전달하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들면, 치료제는 경구, 경피, 흡입, 주사 및 서방형 저장층에 의해 전달될 수 있다. 각각의 경우에 있어서, 전달 방법은 치료제가 거치게 되는 체내 과정에 의해, 빈번한 투여 요구에 의하여, 및 이용될 수 있는 분자의 크기 상의 제한에 의하여 제한된다. 일부 방법에서, 치료제의 양은 투여에 따라 변화한다.
진피 미세 기관(DMO: dermal micro organ)은 신체 외부("생체외", 또는 "시험관내")에서 자율적인 기능 상태로 장시간 동안 유지될 수 있기 때문에, 상기 진피 미세 기관에 다양한 방법으로 조작한 다음, 피하 또는 체내에 이식함으로써, 질환 또는 장애의 치료에, 혹은 성형 수술에 이용할 수 있다. 또한, DMO는 관심 대상인 유전자 산물을 발현하도록 변형될 수 있다. 전술한 바와 같이, 변형된 진피 미세 기관을 통상적으로는 치료용 진피 미세 기관(DTMO: dermal therapeutic micro organ)이라 칭한다.
표피조직층 및 진피조직층을 비롯하여 피부 미세 기관, 예를 들면, PCT/IL02/0880에 개략적으로 기재된 바와 같은 피부 미세 기관은 다양한 임상 시도와 관련하여 관찰되어 왔다. 그런데, 환자의 피부 샘플을 채취할 때에 환자의 신체에 외상이 생기고, 이 같은 외상이 몇 주간 남아있을 수 있고, 흉터로 남을 수도 있다. 또한, 피부 미세 기관을 피하 이식 또는 보다 깊은 체내 부위에 이식하는 경우에는 케라틴 낭 또는 케라틴 미세낭이 발생하는 것으로 알려진 바 있다. 뿐만 아니라, 피부 표면에 이식편과 같은 피부 미세 기관을 "슬릿" 내 이식하는 경우에는 적절한 위치를 유지시키면서 MO를 조정해야 하므로, 상당한 기술 전문가가 필요하다.
예를 들면, 성형 수술 또는 미용적 시술에서 "충전재(filler material)"로서 이용되는 진피를 채취하는 기술은 종래 기술에 공지되어 있다. 종래의 채취 기술로서는, 진피의 단면을 노출시키기 위해 피부절편기 또는 스캘펠(scalpel)을 이용하여 표피를 박리하는 기법이 포함된다. 진피 단면을 노출시킨 다음에는 상기 피부절편기 또는 스캘펠을 이용하여, 노출된 진피의 단면을 수동적으로 채취할 수 있다.
진피를 채취하는 종래의 장치를 예시하면, 널리 사용되지는 않지만 Padgett(Part No. P-225)에서 시판하는 Martin Dermal Harvester를 들 수 있으며, 상기 장치는 미용상의 입술 확대 수술 시에 진피의 코어를 입술 내로 이식하기 위해, 등에서 진피의 코어를 채취하는 장치이다. 널리 사용되지는 않는 상기 장치의 조작 시에는 내경이 약 4.5 ㎜이고 두꺼운 벽을 갖는 재사용 가능한 튜브를 포함하는 예리한 절단 튜브를 대단히 느린 속도로 수동 회전시켜야 한다. 일반적으로, 이러한 형태의 장치를 이용하기 위해서는 상기 절단 튜브를 전방으로 밀 때, 채취 부위 위에서 피부 표면에 직접적으로 압력을 가하고, 강하게 잡아 당기면서 봉합사를 설치해야 한다. 아울러, 전술한 바와 같이 채취된 진피는 일반적으로 크기가 균일하지 않고, 진피 코어의 양 단부에 표피의 "플러그"를 포함한다.
본 발명의 개요
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명은 원하는 치료제의 높은 생산 및 분비 수준을 유지하면서, 다양한 조작을 수행할 수 있고, 생체외에서 통상적으로 생존 가능한 상태가 유지될 수 있는 DMO/DTMO를 제공한다. 또한, 본 발명의 일 구현예로서, 본 발명은 DMO를 채취한 다음, 예를 들면, DTMO를 피하 또는 체내 깊숙한 부위에 이식할 때, 케라틴 낭 또는 케라틴 미세낭을 형성하지 않으면서 DTMO를 이식하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 아울러, 본 발명의 구현예에 따른 방법 및 장치가 비교적 간편하기 때문에, 본 발명의 방법의 수행 및/또는 본 발명의 장치의 이용에 있어서 전문가에게 요구되는 수준은 종래의 방법을 수행하는 데 필요하였던 수준만큼 높지 않다.
본 발명의 구현예에 있어서, 본 발명은 복수개의 진피 구성성분을 갖는 진피 미세 기관(DMO)를 제공하며, 상기 진피 미세 기관은 진피 조직의 세포 및 그 주위의 기질(matrix)을 포함한다. 일 구현예에 따른 DMO는, 통상적으로 진피 미세 기관이 유래된 진피 조직의 미세구조 및 3차 구조를 실질적으로 유지하며, 진피 미세 기관에서의 불충분한 영양 및 노폐물의 축적으로 인한 세포 독성과 그에 따른 사멸을 최소화하기 위해, 진피 미세 기관의 세포로의 적절한 영양분 및 가스의 수동적 확산 및 진피 미세 기관의 세포 밖으로의 세포 노폐물의 확산을 허용할 수 있는 크기를 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 진피 미세 기관은 케라틴을 생성하지 않거나, 또는 무시할 수 있을 정도의 양으로 케라틴을 생성한다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 진피 미세 기관은 피하 이식 또는 신체 내 깊숙한 부위에 이식된 이후에 케라틴 및/또는 케라틴 낭을 생성하지 않는다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명의 진피 미세 기관은 피하 이식된 다음, 비교적 단시간 내, 예컨대, 며칠 또는 몇 주 내에 위축될 수 있는 케라틴 미세낭을 생성한다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명의 진피 미세 기관은 단시간, 예컨대, 며칠 또는 몇 주 후에 위축될 수 있는 모낭 및 피지샘을 포함한다.
또한, 일 구현예에 있어서, 본 발명의 진피 미세 기관은 단시간, 예컨대, 며칠 또는 몇 주 후에 피부 표면에 연결될 수 있는 글랜드(gland)를 포함한다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 진피 미세 기관을 채취하기 위한 방법 및 장치를 제공한다. 상기 방법은 예를 들면, 원하는 형상으로 및/또는 원하는 위치에 상기 피부 관련 조직 구조가 유지될 수 있도록, 진피 미세 기관이 채취될 피부 관련 조직 구조를 고정 및/또는 지지시키는 단계; 상기 피부 관련 조직 구조로부터 상기 진피 미세 기관의 적어도 일부를 분리하는 단계; 및 분리된 진피 미세 기관을 신체로부터 분리시키는 단계를 포함할 수 있다. 이들 구현예에 따르면, 지지 부재는 제1 관형 요소를 포함할 수 있고, 절단 도구는 상기 제1 관형 요소를 따라서, 그리고 실질적으로 상기 제1 관형 요소와 동일한 축으로 삽입될 수 있는 제2 관형 요소를 포함할 수 있다. 또한, 그 밖의 구현예에 따르면 상기 지지 부재는, 상기 절단 도구에 의해 상기 DMO가 상기 피부 관련 조직 구조로부터 분리될 수 있도록, 상기 피부 관련 조직 구조를 원하는 형상으로 및/또는 원하는 위치에 유지시킬 수 있는 내부 지지 표면을 갖는 진공 체임버를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 1종 이상의 재조합 유전자 산물을 발현하는 유전자적으로 변형된 진피 미세 기관을 제공하며, 여기서, 상기 진피 미세 기관은 진피 미세 기관이 유래된 진피 조직의 미세구조 및 3차 구조를 실질적으로 유지하는, 진피 조직의 세포와 기질을 포함하는 복수개의 진피 성분을 포함하고, 진피 미세 기관에서의 불충분한 영양 및 노폐물의 축적으로 인한 세포 독성과 그에 따른 사멸을 최소화하기 위해, 진피 미세 기관의 세포로의 적절한 영양분 및 가스의 수동적 확산 및 진피 미세 기관의 세포 밖으로의 세포 노폐물의 확산을 허용도록 선택된 크기를 가지며, 상기 진피 미세 기관의 세포의 적어도 일부는 하나 이상의 재조합 유전자 산물, 또는 상기 하나 이상의 재조합 유전자 산물의 적어도 일부를 발현하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 구현예로서 본 발명은, 하나 이상의 재조합 단백질을 발현하는 유전자적으로 변형된 진피 미세 기관을 제공하며, 상기 진피 미세 기관은 상기 진피 조직의 세포 및 기질을 비롯하여, 진피 미세 기관이 유래된 진피 조직의 미세구조 및 3차 구조를 실질적으로 유지하는 진피 조직의 세포와 기질을 포함하는 복수개의 진피 성분을 포함하고, 진피 미세 기관에서의 불충분한 영양 및 노폐물의 축적으로 인한 세포 독성과 그에 따른 사멸을 최소화하기 위해, 진피 미세 기관의 세포로의 적절한 영양분 및 가스의 수동적 확산 및 진피 미세 기관의 세포 밖으로의 세포 노폐물의 확산을 허용하도록 선택된 크기를 가지며, 상기 진피 미세 기관의 적어도 일부 세포는 하나 이상의 재조합 단백질의 적어도 일부를 발현하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자적으로 변형된 진피 미세 기관은 실질적으로 케라틴을 생성하지 않는다.
또한, 일 구현예에 있어서, 본 발명은 수용체에게 상기 진피 미세 기관에 의해 생산된 재조합 유전자 산물을 전달하는 방법을 제공한다.
일 구현예에 있어서, 본 발명은 수용체에 진피 미세 기관을 이식함으로써 국소 또는 전신의 생리학적 효과를 유도하는 방법을 제공한다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 주목 대상인 단백질을 대상체에게 전달하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전자적으로 변형된 진피 미세 기관을 피부내, 피하 또는 신체 내 기타 위치에서 이식하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에 있어서, 본 발명은 케라틴 낭의 형성을 억제 또는 저하시키기 위해 진피 미세 기관을 이식하는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
특정한 적용예 및 그에 따른 요건과 관련하여, 당업자로 하여금 본 발명을 제조 및 실시할 수 있도록 하기 위한 설명이 아래 기재된다. 당업자라면 기재된 예에 대한 여러가지 변형을 명확히 이해할 것이며, 본원에서 규정된 일반적인 원칙은 그외 예들에서도 적용될 것이다. 따라서, 본 발명은 하기 특정 예로 한정되지 않으며, 본 발명의 원리 및 신규 특성과 부합되는, 가장 넓은 범위를 허용하는 것으로 의도된다. 그외 예들에서, 공지 방법, 공정 및 구성 요소들에 대해서는 본 발명을 불명확하게 하지는 않는 범위에서 상세한 설명을 생략한다.
하기 구체적인 설명들에서, 다수의 특정 세부사항들이 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된다. 그러나, 당업자는 본 발명이 이러한 특정 세부사항없이 실시될 수 있음을 이해할 것이다.
본 발명에 사용된 용어들의 일반적인 정의
본원의 용어 "외식편(explant)"은, 개체의 하나 이상의 조직 또는 기관으로부터 제거된 생조직 또는 기관을 의미한다.
본원의 용어 "진피 미세 기관(dermal micro organ)" 또는 "DMO"는 조직 또는 기관이 채취된 것과 유사한 생체내 상호작용을 적어도 일부 유지하면서 세포의 생존성 및 기능에 도움이 되는 방식으로 제조된, 외식편으로부터 유도되거나 외식편과 동일한 분리된 조직 또는 기관 구조를 의미한다. 진피 미세 기관은 이들이 유래된 조직 또는 기관의 미세구조와 이들이 유래된 진피 조직의 3차 구조를 유지하는 복수개의 진피 구성성분들을 포함할 수 있으며, 불충분한 영양분 및 노폐물의 축적으로 인한 세포 독성과 이로 인한 사멸을 최소화하기 위해, 적절한 영양분 및 가스의 MO내 세포로의 수동적 확산 및 MO 세포 밖으로의 세포 노폐물의 확산을 허용하도록 선택된 크기를 가진다. 진피 미세 기관은 필수적으로 복수개의 진피성 구성성분들(표피 하부에 위치된 피부 조직 성분들)로 구성될 수 있다. 이러한 구성성분들로는, 피부 섬유아세포, 상피 세포, 그외 세포 종류, 모낭 기저, 신경종말, 피지샘, 땀샘, 혈관 및 림프관을 함유할 수 있다. 하기에서, MO에 대한 실시예의 설명은 또한 진피 MO에 관한 것이다. 용어 "진피 조직"이 사용되는 경우, 그것은 또한 "진피 기관"도 해당된다.
본원의 일부 예들에서, 용어 "미세구조(microarchitecture)"는 외식편이 일예에서 세포 집단의 적어도 약 50% 이상, 다른 예에서 적어도 약 60% 이상, 또 다른 예에서 적어도 약 70%이상, 또 다른 예에서 적어도 약 80%이상, 또 다른 예에서는 적어도 약 90%이상이, 생체내에서 물리적 및/또는 기능적 접촉을 가지는 하나의 세포 또는 비세포성 물질과 시험관내에서도 이들의 물리적 및/또는 기능적인 접촉을 유지하는 특성을 의미한다. 바람직하기로는, 외식편의 세포는 이들이 분리된 기관 또는 조직의 생물학적 활성을 한가지 이상 유지한다.
용어 "공여체"는 본 발명의 일부 예들에서 외식편이 제거되어 하나 이상의 미세 기관을 형성하거나 또는 이미 하나 이상의 미세 기관을 형성하는데 이용되는 개체를 의미한다.
용어 "치료용 미세 기관(TMO)"은 본 발명의 일부 예들에서, 예컨대 단백질 또는/및 RNA 분자와 같은 치료 물질을 생산하기 위해 유전자적으로 변이 또는 변형된 미세 기관과 같이, 치료 목적을 용이하게 하는데 사용될 수 있는 미세 기관(MO)을 의미한다. 상기 치료 물질은 천연 생체 물질이거나 아닐 수 있다. 이하 모든 경우에서, 본 발명의 예들은 TMO에 관한 것이며, 또한 본 발명의 일부 예들에서는 유전자적으로 변형될 수 있는 치료용 진피 MO인 DTMO에 관한 것이다.
용어 "이식"은 본 발명의 일부 예들에서, 수용체에 하나 이상의 TMO 또는 DTMO를 도입하는 것을 의미하며, 상기 TMO 또는 DTMO는 수용체의 조직에서 유래된 것이거나 또는 다른 개체나 동물의 조직으로부터 유래된 것일 수 있다. TMO 또는 DTMO는 피하 이식에 의해 또는 치환에 의해 수용체 신체내 원하는 부위의 피부 상처(slit)내로 이식될 수 있다.
용어 "수용체"는 본 발명의 일부 예들에서, 하나 이상의 TMO 또는 DTMO가 이식되는 개체를 의미한다.
용어 "클램핑(clamping)"(예, 피부)은 모든 유사한 행위 또는 유사한 목적을 가진 모든 행위를 의미하며, 예컨대 "핀칭(pinching)"(예, 피부)이 있다.
용어 "시험관내"는 "생체외(ex-vivo)"를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "코어링 튜브(coring tube)"는 개별적으로 또는 총괄적으로 용어 "절단 도구(cutting tool)", "절단 튜브(cutting tube)" 및 "코어링 바늘(coring needle)" 뿐만 아니라 그외 유사한 기능성을 가진 모든 요소에 관한 것일 수 있다.
한편, 명확성 및 완전성을 위해, DTMO의 생산 및 이용에 대한 모든 측면들이 본 명세서에 기재되어 있으며, 본 발명의 예들에서 공정의 시작에서 종료까지가 개시되어 있으나, 본 명세서에 개시된 각각의 측면은 다른 방법론 및/또는 다른 측면을 수행하기 위한 장치와 함께 이용될 수 있으며, 본 발명에 기술된 일부분은 다른 목적으로 사용될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 본 발명은 DTMO로의 형질전환을 위한 진피 미세 기관의 제조 및 유지에 대한 부분을 포함한다. 이러한 본 발명의 측면에 따라 제조된 진피 미세 기관은 DTMO로의 형질전환 이외의 목적으로 이용될 수는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 일부 예들에서, 미세 기관은 복수개의 진피 구성성분들, 예컨대 섬유아세포 및/또는 신경 말단 및/또는 땀샘 및/또는 피지샘 및/또는 혈관 및 림프관 및/또는 엘라스틴 섬유 및/또는 콜라겐 섬유 및/또는 내피 성분들 및/또는 면역 시스템 유래 세포 및/또는 세포외 기질을 함유한 상피 성분들을 포함하는, 진피 미세 기관이다. 하기 실시예 부분에서 요약된 테스트 결과로 입증된 바와 같이(실시예 5, 도 8), 기존의 표피 층("층일부 피부 MO")을 포함한 미세 기관의 마우스 및 돼지(돼지에 대한 결과는 미첨부함)로의 피하 이식시, 케라틴 낭 또는 거대-케라틴 낭이 형성될 수 있다. 이와는 대조적으로, 본 발명의 예시적인 예에 따라 피부 조직을 견본으로 사용하여 DMO를 채취하는 경우, 마우스, 돼지 또는 인간에게서 낭 또는 거대 낭은 발견되지 않는다. 본 발명의 예에 있어, DTMO의 생물학적 활성(예, 에리트로포이에틴과 같은 치료 단백질의 분비 및 그 결과로서 적혈구용적율 상승)은, 층일부 피부(실시예 4)로부터 유래된 TMO에서와 유사하거나 이보다 더 높을 수 있음을 주지하여야 한다. 즉, 두가지 종류의 제조물 모두 동일 함량으로 에리트로포이에틴을 분비할 수 있지만, DTMO는 층일부에서 유래된 TMO에 비해 단위 당 더 많은 단백질을 생산 및 분비할 수 있다.
일반적으로, DTMO의 생산에는 DMO 채취 단계, DMO 유지 단계 및/또는 DMO 변형 단계 및/또는 이들의 유전자적 변이 단계를 포함할 수 있으며, 일부 예들에서는 DMO에 의한 원하는 물질(예, 단백질)의 생산을 입증하는 단계를 포함할 수 있다. DTMO의 이용에는, 개체 치료를 위한 환자나 동물 본인의 체내에서의 치료 물질, 예컨대 단백질의 생산을 포함할 수 있다. 예컨대, DTMO는 개체의 피부에, 피부하에 또는 체내에 이식되어, 생체내에서 물질/단백질을 생산할 수 있다. 다른 개체에서 유래된 조직의 경우, 이식체는 수용체의 면역계 반응으로부터 선택적으로 보호되며, 예컨대 면역보호성(immuunoprotective) 캡슐 또는 시쓰(sheath)내에 DTMO가 하우징됨으로써 보호된다. 예컨대, DTMO 이식 전에 캡슐내에 위치시키거나, 또는 그외 다른 방법에 의해, DTMO를 둘러싸도록 막을 배치할 수 있다. 상기 막은 영양분, 노폐물 및 치료제는 충분히 통과할 수 있지만 면역계 세포는 통과하지 못하는 크기의 구멍을 가져야 한다.
본 발명의 일부 예들에서, 진피 미세 기관은 표피 기저층과 선택적으로 그외 피부의 표피층을 함유할 수 있다. 다른 예들에서 진피 미세 기관은 기저층의 조직을 포함하지 않는다.
본 발명의 일부 예들에서, DMO는 표피층을 포함하지 않는다. 다른 예들에서, DMO는 표피 조직의 일부 층을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, DMO는 진피의 전체 횡단면을 포함한다. 본 발명의 다른 예에서, 진피 미세 기관은 진피 횡단면의 일부분을 포함한다. 다른 예에서, DMO는 진피의 횡단면 대부분을 포함하며, 즉 유두 진피 및 망상진피를 포함한 대부분의 진피 층과 성분을 포함한다. 다른 예에서, DMO는 일차(primary) 진피 조직을 포함하지만, 지방 조직을 포함할 수도 있다. 본 발명의 일부 예들에서, DMO는 케라틴을 생성하지 않거나 또는 무시할 수 있을 정도의 소량의 케라틴을 생성하므로, 따라서 수용체에 피하 이식된 후 케라틴 낭 형성이 방지된다.
채취될 DMO는 동 기술 분야에 공지된 조직 제거 수단, 예를 들면, 생검 수단에 의해 의해 신체로부터 제거될 수 있다. 상기 채취 과정에 의해, 제거된 조직의 미세구조가 손상되지 않은 상태로 유지될 수 있다. 일 구현예에서, DMO는 직접적인 생검에 의해 얻을 수 있으며, DMO를 얻은 다음에는 원하는 크기로 절단하거나, 또는 원하지 않는 조직을 절단할 수 있다. 다른 구현예로서, 조직 샘플을 직접적인 생검에 의해 얻을 수 있으며, 상기 생검에 의해 원하는 크기를 갖는 진피 미세 기관이 얻어지므로, 추가의 프로세스를 수행할 필요가 없다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 진피 미세 기관은 신체로부터 직접 채취되며, 상기 진피 미세 기관을 절단하는 데 사용되는 절단 장치는 예를 들면, 직경이 약 1~4 ㎜일 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 절단 장치는 직경이 1.71 ㎜일 수 있다. 또 다른 구현예로서, 상기 절단 장치는 직경이 1~3 ㎜일 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 절단 장치는 직경이 2~4 ㎜일 수 있다. 아울러, 다른 구현예로서, 상기 절단 장치는 직경이 1~2 ㎜일 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 절단 장치는 직경이 약 1.5 ㎜일 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 절단 장치는 직경이 약 2 ㎜일 수 있다. 또 다른 구현예로서, 채취된 진피 미세 기관은 채취된 이후에는 실린더 형상이 유지되지 않을 수 있으며, 다시 말하면, 상기 채취된 진피 미세 기관 횡단면의 적어도 한 크기는 확장되고, 적어도 다른 크기는 축소될 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 예를 들면, 상기 진피 미세 기관 횡단면의 적어도 한 크기는 0.5~3.5 ㎜일 수 있고, 다른 크기는 1.5~10 ㎜일 수 있다.
다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 5~100 ㎜일 수 있다. 또 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 10~60 ㎜일 수 있다. 아울러, 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 20~60 ㎜일 수 있다. 또한, 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 20~50 ㎜일 수 있다. 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 20~40 ㎜일 수 있다. 또 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 20~100 ㎜일 수 있다. 아울러, 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 30~100 ㎜일 수 있다. 또한, 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 40~100 ㎜일 수 있다. 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 50~100 ㎜일 수 있다. 또 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 60~100 ㎜일 수 있다. 아울러, 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 70~100 ㎜일 수 있다. 또한, 다른 구현예로서, 채취된 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 80~100 ㎜일 수 있다. 다른 구현예로서, 채취되는 조직의 크기를 예시하면, 상기 조직의 길이는 약 90~100 ㎜일 수 있으며, 폐쇄된 멸균 바이오반응기 장치를 이용하여, ㎜ 단위의 길이를 갖는 채취된 조직에 DMO 또는 DTMO를 및/또는 수송, 제공, 및/또는 변형시킬 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 조직의 길이는 약 20 ㎜일 수 있다. 또 다른 구현예로서, 상기 조직의 길이는 약 30 ㎜일 수 있다. 아울러, 다른 구현예로서, 상기 조직의 길이는 약 40 ㎜일 수 있다.
진피 MO가 전술한 바와 같은 크기를 갖는 경우, 상기 진피 MO의 크기는 적절한 조직 배양 조건 하에서의 시험관내, 예를 들면, 성장 배지 내에서 장시간 동안, 예컨대, 수 일, 수 주 또는 몇 개월 동안 유지될 수 있다. 예를 들면, 상기 DMO의 크기는 정해진 성장 배지 내 시험관 내에서 유지될 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 성장 배지는 성장 인자, 소태아혈청(FCS), 또는 인간 혈청, 예컨대, 합성 혈청 대체물(SSS: synthetic serum substitute)을 포함할 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 성장 배지는 공여체 또는 수용체로부터 유래된 혈청을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예로서, 상기 성장 매체는 자가조직 혈청을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 도 22를 참조하여 이하에 기재된 바와 같이, 상기 DMO 또는 DTMO를 채취, 변형, 및 이식 프로세스를 통해, 수송, 지지, 및/또는 변이시키기 위해서 예를 들면, 상기 DMO 또는 DTMO의 채취부터 이식을 수행하기까지 폐쇄된 멸균 바이오반응기를 이용할 수 있다. 본 발명의 몇몇 구현예에 따르면, 상기 바이오반응기의 적어도 일부는 일회용 물질로 형성될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 바이오반응기는 도킹 스테이션(docking station) 내로 로딩될 수 있으며, 상기 도킹 스테이션은 적절한 조건 하에 각종 프로세스를 수행하는 데, 및/또는 상기 DMO/DTMO를 유지시키는 데 이용될 수 있다. 상기 반응기는 프로토콜에 따라서 컴퓨터에 의해 선택적으로 제어될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 생산된 DTMO의 일부만을 주어진 치료 기간 동안 이용할 수 있다. 나머지 DTMO 조직은 회수하여 그 상태를 유지시킬 수 있고/있거나, 저장(예를 들면, 저온 저장 또는 그 외의 저장)하여 이후에 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에 따르면, 이하에 기재된 바와 같이 복수 개의 진피 미세 기관을 배치 프로세스에서 DTMO 내로 함께 처리할 수 있다. 이렇게 함으로써, 보다 편리하게 처리할 수는 있지만, 각각의 DTMO의 분비 수준을 개별적으로 결정할 수는 없다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 치료제의 효능 분석을 수행하여, 하나의 DTMO 또는 DTMO 배치(batch)에 의해 치료제를 생산 및/또는 분비할 수 있다. 예를 들면, 상기 효능 분석은 상기 세포의 성장 배지 내에 함유된 치료제의 존재 여부에 따라 세포 증식 반응이 받는 영향을 확인하는 세포 증식 분석을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 관련 조직 구조(skin-related tissue structure)"란, 진피 미세 기관을 채취할 수 있도록 본 발명에 따라 정의된 장치에 의해 고정될 수 있고/있거나 상기 장치에 제공될 수 있는 조직 성분들의 구조를 일컫는다. 상기 피부 관련 조직 구조에는 표피 조직 성분 및 진피 조직 성분이 포함될 수 있다. 선택적으로, 상기 피부 관련 조직 구조에는 상기 진피 조직 부근에 존재하는 지방 조직 및/또는 근육 조직이 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 이하에 기재된 바와 같이, 진피 미세 기관의 채취 방법은 진피 미세 기관이 채취될 피부 관련 조직 구조를, 예를 들면, 적어도 진피 미세 기관 및/또는 그 부근의 하나 이상의 기타 조직 세그먼트가 원하는 형상 및/또는 위치를 유지하도록, 고정 및 지지시키는 단계; 주위 조직으로부터 상기 진피 미세 기관의 적어도 한 부분을 분리하는 단계; 및 분리된 진피 미세 기관을 인출하는 단계를 포함할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 DMO 및 DTMO의 생산 및 이용 방법(200)을 블록 다이어그램 형태로 개략적으로 도시한 도면이다. 도 1을 참조하여 볼 때, 블록(202)에서 DMO를 대상체로부터 채취한다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 DMO는 이후에 치료할 대상체와 동일한 대상체로부터 채취된다. 본 발명의 일 구현예로서, 상기 DMO는 진피 조직으로부터 채취된다. 선택적으로, 진피 조직과 관련하여 이하에 기재한 방법과 유사한 방법으로 기타 조직을 채취하여 사용할 수 있다. 이하에 기재한 방법은 일례로서, 조직 샘플을 채취하는 기타 방법을 이용할 수도 있다. 필요한 경우에는 상기 DMO를 저온 저장하여, 이후에 사용할 수 있다 (즉, 상기 프로세스 중 전술한 바와 동일한 단계에서 도입함). 다른 구현예로서, 상기 DMO는 치료, 미용, 또는 그 밖의 생리학적 효과를 얻기 위해 상기 DMO를 채취한 환자에게로 다시 직접 이식될 수 있다.
DMO가 생존 가능한 미세 기관이기 위해서는 상기 DMO가, 영양분이 상기 DMO와 접촉하는 영양 배지로부터 DMO의 모든 세포로 확산되고, 폐산물이 상기 DMO로부터 상기 배지로 확산되기에 충분히 작은 적어도 1차원 치수를 가져야 한다. 이렇게 함으로써, 하기의 추가적 처리, 및 단백질과 같은 치료제 소스로서 DMO를 선택적으로 이용하기에 충분한, 긴 시간 동안 DMO가 시험관내에서 생존할 수 있다. 전술한 바와 같이 DMO를 채취하는 경우에는 시험관내 수명이 수 개월인 DMO가 얻어진다.
상기 DMO를 채취한 다음에는 상기 DMO의 크기 및 형태가 적절한 지를 결정하기 위해 선택적으로 육안 검사한다. 아울러, 이러한 검사는 광학적으로 수행될 수 있다. 선택적으로, 채취된 DMO를 지지대 상에 놓은 다음, 상기 DMO를 유전자적으로 변형시킬 수 있는 장치(하기와 같이, 바이오반응기)로 수송한다(블록 206). 적절한 유전자 변형제를 준비한다(블록 208). 다른 예로서, 상기 유전자 변형제를 제조하는 다른 방법은, 저온 저장 및 해동이 가능한 바이러스와 같은 변형화제의 특정 희석액을 이용하여, 제어된 온도(0~4℃)에서 변형제를 이용하여 원하는 양의 분취물 제조한 다음, 상기 변형화제의 활성을 확인하는 단계를 포함한다. 이러한 모든 프로세스는 종래 기술에 공지되어 있다. 이 때, 상기 DMO는 저온 저장될 수 있으며, 이후에 상기 프로세스에서 동일한 부위에 도입될 수 있다. 상기 방법은 조직 및 세포를 점진적으로 냉동시키기 위한 공지된 프로토콜, 예를 들면, 10% DMSO를 포함하는 DMEM 배지를 이용하여 수행될 수 있다.
그런 다음, 블록(210)에서와 같이, DMO를 유전자 변형시킨다. 전술한 바와 같이, 다양한 유전자 변형 방법이 알려져 있으며, 본 발명과 관련하여 이용될 수 있다. 그 예로서, 이하에 기재된 방법은 바이러스 벡터를 이용하여, 유전자를 상기 DMO 세포로 이식하는 것을 기본으로 한다. 상기 프로세스에 대해서는 잘 알려져 있기 때문에, 바이러스를 DMO에 도입하기 위한 특정 방법 및 장치를 제외하고는 더 설명하지 않기로 한다.
이어서, 블록(212)에서와 같이, 유전자적으로 변형된 DTMO에 대해서 치료제의 생산 속도 및 분비 속도를 선택적으로 테스트한다. 분비량을 측정하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 예컨대, ELISA, 그 밖의 면역분석법, 스펙트럼 분석법 등을 들 수 있다. 상기 분비량 이외에도 예를 들면, 분비된 단백질의 무균도 및 활성에 대해 선택적으로 테스트한다. 상기 테스트는 주기적으로 또는 연속적으로 온-라인 상에서 수행될 수 있다. 이 때, DTMO는 이후에 사용하기 위해 저온 저장될 수 있다.
다음으로 블록(214) 및 블록(216)에서와 같이, 원하는 치료 효과를 얻는데 필요한 DTMO의 양을 결정한다. 이하에 기재하는 바와 같이, 치료에 필요한 투여량은 분비 속도, 환자의 파라미터, 및 시험관내 분비 수준과 생체내 혈청 수준 간의 상관도(측정값 또는 공지된 값)에 대한 모집단 통계로부터 측정될 수 있다.
그리고, 블록(218)에서와 같이, 이식 장치에 DTMO를 선택된 개수만큼 로딩한다. 상기 이식 장치의 예는 위에서 설명한 바와 같다. 필요한 경우에는 동종이식 또는 이종이식을 위해, 혹은 그 외의 이유 때문에 상기 DTMO를 캡슐화할 수 있다. 상기 DTMO를 상기 이식 장치에 수송하기 전에 상기 DTMO를 수송해야 하는 경우에는 선택적으로 상기 DTMO를 유지 스테이션에 유지시켜(220), 상기 DTMO가 수송 중에 생존한 상태가 되도록 하는 수준으로 온도, 습도 등을 유지시킨다. 나머지 DTMO 물질은 선택적으로 시험관내에 유지시킴으로써, 이후에 사용할 수 있다. 다시 말하면, 상기 나머지 DTMO 물질을 전술한 바와 같은 조건인 고온의 배양 조건(30~37℃)에서, 또는 저온의 배양 조건(4℃)으로 시험관내에서 유지시킴으로써, 시험관내 생존률을 증가시킬 수 있다.
그런 다음, 블록(224)에서와 같이, DTMO 서브세트를 대상체에 이식한다. 이 때 이용되는 이식 방법의 예는 위에서 설명한 바와 같다. 그 밖의 이식 방법은 동 기술 분야의 당업자들이라면 잘 알 수 있고, 상기 이식 방법의 선택은 사용되는 대부분 미세 기관의 특정 기하구조에 따라 좌우된다. 동물 연구에 의해 알려진 바로서, 상기 DTMO가 생체내에 이식된 이후, DTMO에 의해 치료제의 생산 및 분비가 몇 주간, 또는 몇 개월간 지속적으로 수행된다는 사실로 추정해 볼 때, 상기 DMO 및 DTMO는 생체내에서 생존 가능한 상태로 존재한다 (도 7). 동물 연구에서 치료학적 양은 160일 이하(또는 그 이상)의 기간 동안 생산된다. 상기 DMO 또는 DTMO의 조직은 이들이 이식되는 대상체의 조직에 통합된 형태 또는 적절하게 수용된 형태로 나타나며(특히, 상기 조직이 채취된 조직과 동종의 조직 내에 이식되는 경우), 상기 DMO 또는 DTMO를 포함하는 세포는 치료제를 지속적으로 생산 및 분비한다.
일 구현예로서, 생체내에서의 DTMO의 효능은 선택적으로 결정된다(블록 228). 이러한 평가는 예를 들면, 및/또는 과거의 환자의 데이터(블록 226)을 토대로 하여, 다음에 기재하는 바와 같이, 이식량을 증가시키거나, 이식체 중 일부를 제거함으로써 환자에게 투여하는 투여량을 조정할 수 있다. 이식체의 효능이 변할 때, DTMO를 추가적으로 이식할 수 있다.
유전자 변이는 통상적으로 선택된 유전자 또는 선택된 복수 개의 유전자를 세포 내에 유전공학적으로 조작함으로써, 상기 세포가 단백질과 같은 원하는 치료제를 생산, 및 선택적으로 분비하도록 하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 구현예로서, 유전자 변이 과정 중에 상기 DMO의 유전자 변이 프로세스뿐만 아니라 상기 DMO를 유지시키는 프로세스의 적어도 일부는 바이오반응기 내에서 이하에 기재하는 바와 같이 수행될 수 있다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 진피 미세 기관의 채취 방법을 개략적으로 도시한 플로우 차트이고, 각각의 도 11a 내지 도 11c는 도 10에 도시된 방법에 따른, 피부 조직 부분(1120) 하부에 위치한 진피 미세 기관(1160)을 채취하는 단계를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 10을 참조해 볼 때 블록(1002)에서와 같이, 상기 방법은 마취제, 예를 들면, 동 기술 분야에 공지된 마취제를 채취될 DMO의 부근에 국소 투여하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다.
그리고, 블록(1004)에 나타낸 바와 같이, 상기 방법은 내부 가이드(1110)를 조직 부분(1120)에 삽입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 때, 내부 가이드(1110)의 삽입을 보다 용이하게 하고, 표피 조직의 채취를 억제 또는 최소화하기 위해서, 바람직하게는 외과용 칼, 스캘펠, 또는 그 밖의 예리한 프로브를 이용하여 외피(outer skin)를 가늘게 절개("랜스 절개(lance cut)")(1190 및 1130)할 수 있다. 내부 가이드(1110)는 절개(1190)에 의해 조직 부분(1120) 내로, 예를 들면, 일반적으로는 피부 표면에 평행하게, 및/또는 진피 내 피부 바로 아래에 원하는 깊이로 삽입될 수 있다. 내부 가이드(1110)는 미세한 바늘, 막대, 또는 그 외의 진피 내부 또는 피하 공간 내에 둘 수 있는 미세한 형태, 통상적으로는 직선형의 적절한 물체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 내부 가이드(1110)는 동 기술 분야에 공지된 바와 같이, 20~25G 사이즈, 예컨대 22G 사이즈의 바늘을 포함할 수 있다. 또한, 내부 가이드(1110)는 진피 또는 피하 공간 내로 삽입될 수 있고/있거나, 전체적으로 수평으로, 즉, 피부 표면과 평행하게 삽입될 수 있다. 진피 내로의 내부 가이드(1110) 삽입 깊이는 채취될 DMO의 깊이와 상응할 수 있다. 예컨대, 내부 가이드(1110)를 수동 삽입하여, 진피 내의 원하는 깊이에 수동으로 가이드할 수 있으며, 이 때의 삽입 깊이는 삽입 프로세스를 통해 실질적으로 일정하게 유지될 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 내부 가이드(1110)의 삽입 시에, 수동적으로 섬유 진피와 하부의 평탄한 지방층 사이의 경계를 감지하여, 내부 가이드(1110)를 피하 공간 내로, 그리고 피하 공간을 따라 삽입할 수 있다.
또한, 블록(1006)에 나타낸 바와 같이, 상기 방법은 내부 가이드(1110)를 피부로부터, 예를 들면, 절개 지점(1130)에서 인출하기 위해 상기 내부 가이드를 가이드하는 단계를 선택적으로 포함할 수 있다. 다른 구현예로서, 절개 지점(1190 및 1130) 간의 거리는 DMO를 채취하는 데 필요한 절개 거리와 실질적으로 동일하거나, 그 보다 길 수 있다.
그리고, 블록(1008)에서와 같이, 상기 방법은 DMO를 포획할 수 있도록, 즉, DMO가 내부 가이드(1110)와 절단 도구 사이에 위치하도록 하기 위해서, 관형 절단 도구를 내부 가이드(1110)와 실질적으로 동일한 축으로, 및 내부 가이드(1110) 주위에 삽입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 전술한 단계는 예를 들면, 내부 가이드(1110)의 외경보다 큰 내경을 갖는 관형 절단 도구를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 절단 도구는 적절한 절단 도구, 예컨대, 코어링 튜브(1150)를 포함할 수 있다. 코어링 튜브(1150)는 통상적으로 대칭 형태의 예리한 관형 기구, 예를 들면, 단면의 엣지(edge)가 원하는 형태를 갖도록 처리된 절단 하이포 튜브를 포함할 수 있다. 코어링 튜브(1150)는 예를 들면, 두꺼운 벽, 예컨대 0.05 ㎜ 내지 0.3 ㎜ 두께의 벽을 갖는 표준적인 의학용 수준의 튜브를 포함할 수 있다. 코어링 튜브(1150)는 직경, 예컨대, 1 ㎜ 내지 10 ㎜ 범위의 직경을 가질 수 있다. 상기 코어링 튜브(1150)의 크기, 예를 들면, 직경, 및/또는 내부 가이드(1110)의 크기는 채취하고자 하는 DMO의 부피 및/또는 크기를 토대로 미리 정할 수 있다. 코어링 튜브(1150)는 절단 엣지로서 적절한 예리한 선단("팁(tip)")(1140)을 가질 수 있다. 표피 조직의 채취를 억제하기 위해서는 바람직하게는, 피부의 외표면 상에 최초의 절개 지점, 예를 들면, 절개 지점(1130)을 형성한 다음, 코어링 튜브(1150)를 조직 부분(1120)을 관통하여 삽입할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 예를 들면 도 11b에 도시한 바와 같이, 상기 방법은 먼저 내부 가이드(1110)의 원위 말단 상부에 코어링 튜브(1150)의 선단(1140)을 놓은 다음, 내부 가이드(1110)의 길이 방향으로, 예를 들면, 절개 지점(1190) 방향을 따라서 코어링 튜브(1150)를 슬라이드시킴으로써, 진피의 DMO를 채취하는 단계를 포함할 수 있다.
그리고, 본 발명의 일 구현예로서 블록(1010)에 나타낸 바와 같이, 상기 방법은 절단 도구를, 예를 들면, 상기 내부 가이드의 근위 말단 방향으로 전진시키면서 회전시키는 단계를 포함한다. 예컨대, 코어링 튜브(1150)를 수동 또는 자동으로 전진시키면서, 의학용 드릴 또는 그 밖의 적절한 기구, 또는 회전 메카니즘을 이용하여 회전시킴으로써, 보다 순조롭게 DMO(1160)를 채취할 수 있다. 이를테면, 코어링 튜브(1150)의 근위 말단(1180)은 Aesculap Micro Speed 드릴(Aesculap AG & Co. KG에서 제조, 독일 D-78532 Tuttlingen, Am Aesculap Platz에 소재함) 같은 의학용 드릴(1170)에 연결되어 있을 수 있으며, 상기 의학용 드릴은 카탈로그 번호가 각각 GD650, GD658, GB661, GB166, 및 GB660인 제어 유닛, 모터, 접속 코드, 핸드 피스(hand piece) 및/또는 풋 스위치(foot switch)를 포함할 수 있다. 이러한 드릴, 또는 그 밖의 적절한 드릴, 또는 회전 메카니즘을 이용하여, 상기 진피 조직을 절단하기에 적절한 회전 속도, 이를테면, 비교적 높은 회전 속도, 예를 들면, 1,000 RPM보다 높은 속도, 예를 들면, 1,000 RPM 내지 10,000 RPM 범위의 속도로, 상기 절단 도구의 절단 엣지를 회전시킬 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 코어링 튜브(1150)를 2,000 RPM보다 빠른 속도, 예를 들면, 약 7,000 RPM의 속도로 회전시킬 수 있다. 다른 구현예로서, 코어링 튜브(1150)를 1,000 RPM 미만의 비교적 낮은 회전 속도로 회전시키거나, 또는 이하에 기재하는 바와 같이 전혀 회전시키지 않을 수도 있다. 선택적으로, 상기 드릴의 회전 속도는 진동 방법에 따라 변화시킬 수 있으며, 즉, 회전 방향을 시계 방향과 반시계 방향으로 주기적으로 변화시킬 수 있다. 드릴(1170)에 의해 코어링 튜브(1150)를 회전시킴으로써, 상기 코어링 튜브(1150)는 수동 또는 자동으로 전진, 예를 들면, 내부 가이드(1110)의 근위 말단, 이를테면, 절개 지점(1190)을 향해 전진할 수 있다. 또한, 상기 방법은 예를 들면, 팁(1140)이 절개 지점(1190) 바로 아래까지 전진했을 때, 코어링 튜브(1150)의 전진 운동을 중지시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 예를 들면, 다음에 기재되는 바와 같이, 후속적인 수행 시에, 채취된 조직을 상기 절단 도구 내표면으로부터 용이하게 분리하기 위해, 및/또는 절단 시에 상기 조직에 작용하는 힘을 감소시키기 위해 코어링 튜브(1150)의 내표면 및/또는 외표면 중 적어도 일부를 마찰도가 낮은 물질, 예컨대, 테플론, 패럴린(Parylene), 또는 그 밖의 적절한 코팅 물질로 코팅할 수 있다.
다른 구현예로서, 예컨대, 코어링 튜브(1150)를 실질적으로 회전시키지 않으면서, 채취중인 목표물에 코어링 튜브(1150)를 관통시켜, 진피를 절단하는 데, 속효성의, 예를 들면, 스프링 로딩된 삽입 메카니즘을 이용할 수 있다.
이어서, 블록(1012)에 나타낸 바와 같이, 상기 방법은 내부 가이드(1110), 예를 들면, 상부에 DMO(1160)가 삽입된 내부 가이드를 코어링 튜브(1150)로부터 인출함으로써, 조직 부분(1120)으로부터 DMO를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, DMO(1160)는 내부 가이드(1110)에 삽입된 채로 둘 수 있다. 전술한 경우, 내부 가이드(1110)는 DMO(1160)를 조정, 수송, 및/또는 조작할 수 있다. 다른 구현예로서, 예를 들면, 도 22를 참조하여 이하에 기재하는 바와 같이, DMO(1160)는 예를 들면, 내부 가이드(1110)로부터 상기 DMO를 서로 다른 양으로 수송하도록 바이오반응기 처리 체임버 내로, 또는 각종 수송 장치(도시되지 않음)로 제거될 수 있다. 이러한 수송 장치는 예를 들면, 집게, 진공 그리퍼(vacuum gripper), 또는 DMO(1160)를 집을 수 있고/있거나, DMO를 내부 가이드(1110) 외부로 배출할 수 있는 그 밖의 기계적 장치를 포함할 수 있다. 또한, 내부 가이드(1160)로부터 DMO를 제거하기 위해 멸균 유체와 같은 적절한 유체를 단독으로 사용하거나, 또는 전술한 바와 같은 수단들과 병용할 수 있다.
블록(1014)에 나타낸 바와 같이, 상기 방법은 피부 조직 부분(1120)으로부터 절단 도구, 예를 들면, 코어링 튜브(1150)를 인출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
동 기술 분야의 당업자들이라면, 전술한 단계를 임의로 조합하여, 본 발명의 구현예에 따른 DMO의 채취를 수행할 수 있다. 또한, 그 밖의 단계 또는 그 밖의 일련 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서 이하에 기재하는 바와 같이, 상기 채취 방법은 진피를 예컨대, 상기 내부 가이드에 의해 내부로부터 고정 및/또는 지지시키는 것 이외에도, 채취될 DMO 및/또는 상기 DMO 부근에 존재하는 조직을 예를 들면, 외부 제공 장치 및/또는 메카니즘을 이용하여, 외부로부터 고정 및/또는 지지시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 진피 채취 장치와 함께 이용될 수 있는 클램핑 기구(1200)를 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 클램핑 기구(1200)는 클램핑 엣지(1210)를 갖는 클램핑 메카니즘을 포함할 수 있다. 예를 들면, 클램핑 기구(1200)는 동 기술 분야에 공지된 바와 같은 핀치 클램프 또는 집게를 포함할 수 있다. 클램핑 기구(1200)는 일정한 클램핑력, 또는 제어 가능한 가변적 클램핑력을 갖는 스프링 클램프를 포함할 수 있다. 클램핑 기구(1200)는 예를 들면, 상기 클램핑 기구(1200)가 닫힐 때, 클램핑 엣지(1210)가 내부 가이드(1110) 아래에 위치할 수 있도록 내부 가이드(1110)의 어느 한쪽에 상기 내부 가이드와 평행하게 둘 수 있다. 각각의 클램핑 엣지(1210)가 서로 인접할 때에는 코어링 튜브(1150)에 의해 상기 DMO가 절단되는 한편, 상기 DMO가 고정될 수 있도록, 상기 클램핑 엣지(1210)에 의해 내부 가이드(1110) 및/또는 채취될 DMO와 관련된 피부 영역(1240)이 고정 및/또는 지지될 수 있다. 전술한 경우, 힘이 가해지는 동안, 코어링 튜브(1150)는 상기 내부 가이드(1110)와 동심원 또는 비동심원상의 클램핑 엣지(1210)를 통과하여 밀어넣을 (pushing) 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 클램핑 엣지(1210)는 상기 조직 영역(1240)의 향상된 클램핑력을 제공하기 위해, 예를 들면, 코어링 프로세스 중에 상기 피부의 측부로의 움직임을 감소, 예컨대, 최소화하기 위해, 1열 또는 2열 이상의 열의 톱니(1260)을 구비할 수 있다.
본 발명에서는 상기 내부 가이드 주위의 진피를 실질적으로 압축시키기 위해 외피에 힘을 가하는 데, 그 밖의 기구 및/또는 메카니즘을 이용할 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 내부 가이드를 비틀어서, 상기 코어링 튜브의 회전과 관련하여 실질적으로 고정된 위치에 고정하는 것과 같은, 채취할 진피를 고정하기 위한 그 밖의 장치 및/또는 방법이 이용될 수 있다.
도 13은 본 발명의 실시예에 따라 내부 가이드(1110)와 동일한 축으로, 상기 내부 가이드를 따라서 삽입된 코어링 튜브(1150)의 횡단면을 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명의 일 구현예로서, 내부 가이드(1110)는 내부 가이드(1110)의 축(1125)이 실질적으로 DMO(1160)의 중앙에 위치하도록 하는 위치의 피부 조직 부분(1120)에 설치될 수 있다. 전술한 경우, 코어링 튜브(1150)는 실질적으로 내부 가이드(1110)와 동일한 축으로 배치될 수 있으므로, DMO(1160)가 실질적으로 대칭되도록 내부 가이드(1110) 상에 삽입될 수 있다.
그러나, 본 발명의 일 구현예로서, 상기 내부 가이드 및 코어링 튜브는 전술한 것 이외의 적절한 배열로 배치될 수 있다. 예를 들면, 상기 내부 가이드는 채취하고자 하는 DMO가 상기 내부 가이드 위쪽에 위치하도록 한 다음, 상기 DMO를 포획할 수 있도록 피하 공간 내에 설치할 수 있다. 그러므로, 상기 코어링 튜브는 내부 가이드 상부로 삽입되고/삽입되거나, 상기 코어링 튜브가 상기 DMO를 절단할 때에 상기 내부 가이드가 상기 코어링 튜브의 하방 내표면과 인접 또는 접촉하도록 가이드될 수 있다. 전술한 경우, 상기 내부 가이드는 상기 DMO를 고정할 수 있어, 예를 들면, 상기 내부 가이드를 제거할 때에는 상기 내부 가이드의 상부 표면을 따라서 둘 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 DMO를 채취하기 위한 전 과정 또는 일부 과정을 수행하기 위해 구성된 통합형 장치(도시되지 않음)를 이용하여 전술한 수동적인 과정을 수행할 수 있다. 예를 들면, 일 구현예에 따른 채취 방법에서, 상기 통합형 장치는 내부 가이드(1110)의 삽입 위치를 지정하여, 삽입을 가이드하고, 클램핑 기구(1200)를 부착하고, 코어링 튜브(1150)의 삽입을 가이드하고, 절단 프로세스 중에 상기 코어링 튜브(1150)의 운동을 제어하고, 및/또는 내부 가이드(1110)에 부착되는 DMO를 제거할 수 있도록 구성될 수 있다. DMO의 채취 시에 이러한 장치를 이용함으로써, 비교적 간단한 조작으로 채취가 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 대상체로부터 DMO를 채취하는 방법은 상기 절단 도구가 DMO의 적어도 일부를 상기 DMO 부근에 존재하는 조직으로부터 분리할 수 있도록 원하는 형상 및 위치에서 DMO와 관련이 있는 피부 관련 조직 구조, 예컨대, DMO를 채취하기 위해 목표로 하는 채취 부위에 위치한 피부 관련 조직 구조를 생성 및/또는 유지시키는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 피부 관련 조직 구조의 적어도 일부가 원하는 형상으로 및/또는 원하는 위치에서 들어올려질 수 있도록, 상기 진피 영역의 적어도 일부를 미리 정해진, 예컨대, 실질적으로 평탄한 표면 영역에 부착시킴으로써, 목표로 하는 채취 부위 부근의 진피 영역을 들어올릴 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 진피를 미리 정해진 표면 영역에 부착시키는 단계는 이를테면 이하에 기재하는 바와 같이 진공 조건을 적용하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 구현예로서, 또는 이와 더불어, 상기 진피를 미리 정해진 표면에 부착하는 단계는 상기 표면에 접착제를 적용하는 단계를 포함할 수 있다.
각각의 도 14a 내지 도 14c는 본 발명의 일 구현예에 따른 DMO를 채취하기 위한 진피 채취 장치(1400)를 개략적으로 도시한 각각의 전면도, 측면도, 및 상면도이고, 도 15는 본 발명의 일 구현예에 따라 원하는 위치에서 DMO(1510)를 포함하는 피부 관련 조직 구조를 외부에서 지지하기 위한 삽입중인 장치(1400)의 횡단 측면도를 개략적으로 도시한 도면이다.
진피 채취 장치(1400)는 진공 체임버, 예를 들면, 복수의 채널(1404)을 통해 진공 도입구(1402)와 유체 소통된 상부 지지 표면(1430)을 갖는, 일반적으로 세로 방향 실린더형 체임버(1406)를 포함할 수 있다. 체임버(1406)에 진공을 인가할 수 있도록, 진공 도입구(1402)는 진공 소스(vacuum source), 예를 들면, 진공 펌프(도시되지 않음)와 유체 소통될 수 있다. 상부 지지 표면(1430) 및/또는 채널(1404)은 체임버(1406)에 예컨대 진공 소스에 의해 진공을 가할 때, DMO(1510)과 관련이 있는 표피층(1508), 예를 들면, 일반적으로는 DMO(1510)의 상부에 위치한 표피층(1508)의 적어도 일부가 상기 표면(1430)에 부착될 수 있도록 구성될 수 있다.
또한, 진피 채취 장치(1400)는 절단 도구, 예를 들면, 코어링 튜브(1520)를 가이드하고, 상기 절단 도구를 미리 정해진 위치, 예를 들면, 상부 지지 표면(1430)에서부터 정해진 거리에 고정시키는 가이딩 채널(1416)을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 절단 도구(1520)의 상부 표면은 예를 들면, 상부 지지 표면(1430)으로부터 약 1 ㎜의 거리에 위치할 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 상부 표면은 0.3~2.0 ㎜의 거리에 위치할 수 있다. 가이딩 채널(1416)은 예를 들면, 코어링 튜브(1520)의 외경보다 약간 큰 직경을 갖는 일반적으로 실린더형의 채널을 포함할 수 있다. 그리고, 코어링 튜브(1520)는 예를 들면, 크기가 1 ㎜ 내지 10 ㎜ 범위, 예컨대, 14G(외경이 약 2.11 ㎜인 것에 해당함)이며, 대칭형의 날카로운 절단 엣지를 갖는 코어링 바늘을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상부 지지 표면(1430)은 평탄형, 일반적으로는 곡선형일 수 있으며, 혹은 그 밖의 적절한 형태를 가질 수 있다. 예를 들면, 상부 지지 표면(1430)은 곡률 반지름이 약 3.5 ㎜일 수 있다. 일 구현예로서, 체임버(1406)는 폭이 예컨대, 약 4 ㎜일 수 있다. 아울러, 다른 구현예로서, 체임버(1406)는 높이가 예컨대, 약 5 ㎜일 수 있다. 또 다른 구현예로서, 상기 상부 지지 표면(1430)의 곡률 반지름 및/또는 폭 및/또는 높이는 그 밖의 범위, 예를 들면, 3~25 ㎜ 범위일 수 있으며, 3~25 ㎜ 범위의 임의의 적절한 크기를 가질 수 있다. 상기 체임버(1406)의 길이는 일반적으로 채취되는 DMO의 길이와 유사할 수 있으며, 예를 들면, 길이가 약 30 ㎜일 수 있다. 그러나, 상기 체임버의 길이는 그 밖의 범위, 예를 들면, 5~100 ㎜의 범위일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서 이하에 기재하는 바와 같이, 진피 채취 장치(1400)는 표피층(1508)을 클램핑할 수 있도록, 각각이 체임버(1406)의 양측을 따라 적어도 부분적으로 위치하는 2개의 채널(1408)을 포함할 수 있다. 채널(1408)은 예를 들면, 중앙에 원하는 높이로, 예를 들면, 채취될 DMO의 중앙의 높이와 실질적으로 동일한 높이로 위치할 수 있다. 일 구현예로서, 상기 채널(1408)의 중심은 클램핑에 의해 절단될 조직을 고정 및/또는 지지할 수 있도록, 상부 지지 표면(1430)의 하방 약 2 ㎜ 높이에 위치할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 실질적으로 체임버(1406)에 적용된 진공 조건에 영향을 끼치지 않으면서, 상기 조직의 외부에서 클램핑할 수 있도록 하기 위해, 진피 채취 장치(1400)는 채널(1408)의 내표면 또는 외표면 상에 2개의 가요성 막 요소(1412)를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 진피 채취 장치(1400)는 가요성 막 요소(1412) 및/또는 채널(1408)을 포함하지 않을 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예로서, 진피 채취 장치(1400)를 이용한 DMO(1510)의 채취 방법은 DMO(1510)와 관련된 피부 영역에 정해진 거리에, 예를 들면, 코어링 튜브(1520)가 표피(1508)에 진입 및 인출되도록 하는 지점("삽입 및 빼내는 부위")과 상응하는 약 30 ㎜ 거리에, 2개의 절개점(도시되지 않음), 예를 들면, 스캘펠을 이용하여 2개의 랜스 절개점을 형성하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 절개 부위의 효과적인, 즉, 신속한 치유를 위하여, 및/또는 비교적 경미한 흉터가 남도록 하기 위하여, 채취된 DMO(1510)의 양 단부에 진피 성분이 실질적으로 존재하지 않도록, 및/또는 삽입 부위의 원하는 형상이 유지될 수 있도록 절개점을 형성할 수 있다. 아울러, 상기 방법은 상기 절개점이 체임버(1406) 아래에, 즉, 지점(1410)과 지점(1410) 사이에 위치하도록 진피 채취 장치(1400)를 표피층(1508)("채치 부위")과 접촉시켜 배치하는 단계를 더 포함할 수 있다. 체임버(1406)에 진공이 인가되면, 상기 랜스 절개점을 "개방된" 상태가 될 수 있도록, 상기 절개점은 각각 지점(1410) 및/또는 지점(1414)에 위치하거나, 또는 지점(1410)과 지점(1414) 사이에 위치할 수 있다. 본 발명의 일 구현예로서, 진피 채취 장치(1400)는 예컨대, 진피 채취 장치(1400)를 채취 부위에 둔 다음, 그리고 체임버(1406)에 진공을 인가하기 이전에, 랜스 절개를 수행하기 위해 구성된 메카니즘, 예를 들면, 랜스 절개를 수행하기 위한 스프링 로딩된 스프링 랜싯(spring lancet)을 선택적으로 포함할 수 있다.
아울러, 상기 방법은 코어링 튜브(1520)를 채널(1416)에 삽입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 코어링 튜브(1520)는 예를 들면, 커넥터, 예컨대, Jacobs Chuck 또는 마찰 홀더(friction holder)를 통해, 코어링 튜브(1520)를 회전시킬 수 있는 의학용 드릴 또는 기타 적절한 기구 및/또는 메카니즘, 예컨대, 드릴 1170(도 11)에 연결될 수 있다. 선택적으로, 상기 드릴의 회전 속도는 진동 방법에 따라서 다를 수 있으며, 다시 말하면, 회전 방향에 따라서 주기적으로 "시계 방향" 및 "반시계 방향"으로 변할 수 있다.
또한, 상기 방법은 체임버(1406)에 진공을 인가하는 단계, 예를 들면, 진공 소스를 활성화시킴으로써 진공을 인가하는 단계를 포함할 수 있다. 이에 따라, 상기 피부 관련 조직 구조는 체임버(1406) 및 표피(1508) 내, 예를 들면, 랜스 절개점 사이로 당겨질 수 있으며, 상부 지지 표면(1430)에 대해서 단단히 고정될 수 있다. 표피(1508), 진피(1506), 및/또는 지방 조직 성분(1504)은 각각의 조직층의 두께와 체임버(1406)의 크기에 따라서 체임버 내로 추가적으로 흡인될 수 있다. 그러므로, 하나 이상의 조직층의 두께 및/또는 외부 클램핑을 감안하여 체임버(1406)의 크기를 고안할 수 있으며, 예를 들면, 이하에 기재하는 바와 같이, 진공 체임버(1406) 내로 당겨진 지방 조직(1504)이 체임버(1406) 하부로, 실질적으로는 체임버 외부로 당겨질 수 있도록 체임버(1406)의 크기를 적용할 수 있다.
아울러, 상기 방법은 코어링 튜브(1520)를 예를 들면, 드릴(1170)(도 11 참조)를 이용하여 비교적 높은 회전 속도로, 예컨대, 1,000 RPM보다 높은 속도, 이를테면, 1,000 RPM 내지 10,000 RPM 범위의 속도로 회전시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 코어링 튜브(1520)를 2,000 RPM보다 높은 속도, 예를 들면, 약 7,000 RPM의 속도로 회전시킬 수 있다. 다른 구현예로서, 위에 기재한 바와 같이, 1,000 RPM 미만의 비교적 낮은 회전 속도를 이용하거나, 또는 전혀 회전시키지 않을 수도 있다. 또한, 상기 방법은 진공 체임버(1406)을 따라서, 예를 들면, 적어도 체임버(1406)의 전체 길이 방향을 따라서 코어링 튜브(1520)를 전진시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 그리고, 코어링 튜브(1520)는 진피 미세 기관(1510)을 체임버(1406)를 따라서 상기 피부 관련 조직 구조의 깊이와 실질적으로 동일한 깊이로부터 채취할 수 있도록, 채널(1416)을 통해 가이드될 수 있다. 코어링 튜브(1520)는 수동으로, 또는 예를 들면, 코어링 튜브(1520)가 전진하는 속도를 제어하기 위하여 모터에 의해 구동되는 장치(도시되지 않음)를 이용하여 전진시킬 수 있다.
또한, 상기 방법은 DMO(1510)를 DMO(1510) 주위의 조직으로부터 탈착시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 진피 채취 장치(1400)는 연장부(1418), 예컨대, 길이가 1 ㎜ 내지 5 ㎜ 범위이고, 채널(1416)의 반지름과 실질적으로 동일한 반지름을 가지며, 코어링 튜브(1520)가 체임버(1406)을 통과한 다음에 연장부(1418)로 전진할 수 있도록 실질적으로 채널(1416)의 맞은편에 위치한 연장부를 포함할 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 코어링 튜브가 표면(1440) 내로 절단되어, 채취된 DMO를 탈착시킬 수 있도록, 절단 표면(1440), 예를 들면, 실리콘 또는 기타 적절한 물질로 형성된 절단 표면이 연장부(1418)에 위치할 수 있다. 이외에도, DMO(1510)가 코어링 튜브(1520) 내로 강하게 당겨짐으로써, 끝으로 주위 조직으로부터 상기 DMO가 탈착될 수 있도록, 코어링 튜브(1520), 예를 들면, 그 후면 단부로부터 코어링 튜브(1520) 내에 진공 조건을 인가할 수 있다.
또한, 상기 방법은 DMO(1510)를 포함하는 코어링 튜브(1520)를 진피 채취 장치(1400)로부터 인출하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 원하는 위치에서 피부 관련 조직 구조를 외부로부터 지지하기 위해 삽입되는 진피 채취 장치(1400)를 개략적으로 도시한 횡단 측면도이다.
도 16을 참조하여 볼 때, 진공 체임버 내에 지지된 피부 관련 조직 구조를 외부에서 클래밍함으로써, 진피(1506)의 고정도를 향상시키고, 및/또는 지방(1504)이 진공 체임버(1406) 내로 진입하는 것을 억제할 수 있다. 예를 들면, 진공 체임버(1406) 내부에 지지된 피부 관련 조직 구조를 이를테면, 대칭형으로 "끼워 넣기" 위해서, 클램핑 기구(1600), 예컨대, 도 12를 참조하여 설명한 클램핑 기구와 유사한 클램핑 기구를 삽입할 수 있다. 또한, 클램핑 기구(1600)의 2개의 클램핑 단부(1502)를 각각 채널(1408)에 삽입할 수 있다. 그리고, 클램핑 단부(1502)가 가요성 막 요소(1412)에 대해서 하방으로 가압될 수 있도록, 절단 도구(1600)를 폐쇄시킬 수 있다. 이렇게 함으로써, 체임버(1406) 내의 진공 조건에 실질적으로 영향을 끼치지 않으면서, 체임버(1406) 내의 피부 관련 조직 구조를 측부로부터 클램핑할 수 있다. 아울러, 클램핑 단부(1502)에 의해 인가되는 클램핑력은 예를 들면, 일정한 힘 또는 가변적인 힘을 갖는 스프링(1512) 또는 그 밖의 적절한 장치에 의해 가해지는 힘일 수 있다.
위의 설명에 따르면, 일반적으로 일정한 형태 및/또는 그의 길이방향 축을 따라서 일정한 크기를 갖는 진공 체임버를 이용하는 경우에 대해 설명하였지만, 동 기술 분야의 당업자들이라면, 이하에 기재하는 바와 같이 그 밖의 정해진 크기 및/또는 형상을 갖는 것을 이용할 수 있다는 것을 알 수 있다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 진피 채취 장치(1700)를 개략적으로 도시한 도면이다.
진피 채취 장치(1700)는 융기된 돌기부(1706)를 갖는 진공 체임버(1701)를 포함할 수 있다. 융기된 돌기부(1706)는 코어링 튜브(1716)의 궤적 상부에 융기된 적절한, 예를 들면, 일반적으로 평탄한 배치의 "평탄형" 단일층 피부 조직을 생산하기에 적절한 정해진 크기 및/또는 형태를 가질 수 있다. 예를 들면, 지방 조직층(1718)이 돌기부(1706) 내부로 당겨져서, 코어링 튜브(1716)의 궤적을 따라 지지될 수 있도록, 돌기부(1706)는 체임버(1701)의 기타 부분들보다 높게 융기해 있을 수 있다. 그 결과, 정해진 길이의 DMO를 채취한 다음, 코어링 튜브(1716)가 지방 조직층(1718) 내로 약간 진전함으로써, 채취된 DMO를 상기 DMO 주변의 조직으로부터 분리시킬 수 있다. DMO를 신체로부터 채취하였을 때, 채취된 DMO는 코어링 튜브(1716) 내에 잔류해 있을 수 있다. 진피 채취 장치(1700)의 구성에 따르면, 피부에 예컨대, 전술한 바와 같은 "인출용 절개점"을 형성할 필요가 없기 때문에, 하나의 절개점을 형성하는 경우에도 DMO를 채취할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 진피 채취 장치(1700)는 코어링 튜브(1716)를 체임버(1701)를 따라서 정해진 깊이로, 예를 들면, 코어링 튜브(1716)가 지방 조직층(1718) 내로 약간 전진하는 위치로, 수동으로 전진시킬 수 있는 드릴 제지기(1708)를 더 포함할 수 있다.
도 18은 본 발명의 다른 실시예에 따른 채취 장치(1800)를 개략적으로 도시한 도면이고, 도 19는 DMO(1830)를 채취하기 위해 삽입되는 장치(1800)의 단면을 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명의 일 구현예로서, 아래에 기재하는 바와 같이, 예를 들면, 유방암 생검용으로 사용되는 장치와 유사한 코어 생검 장치를 이용하여, DMO를 채취할 수 있다. 장치(1800)는 절단 도구(1808), 예를 들면, 위에서 설명한 바와 같은 절단 도구, 및 절단 도구(1808)가 HST(1806) 내부로, 그리고 HST(1806)과 실질적으로 동일한 축으로 삽입되도록, 피하 채취용 트로카(HST: subcutaneous harvest trocar)(1806), 예컨대, 예리한 팁(1804) 및 적절한 내경, 예를 들면, 절단 도구(1808)의 외경보다 약간 큰 내경을 갖는 피하 주사용 바늘을 포함할 수 있다. HST(1806)는 적절한 깊이, 예컨대, 1 ㎜ 이상의 깊이, 및 적절한 길이, 예컨대, 채취될 DMO의 원하는 길이와 실질적으로 동일한 길이를 갖는 노치 컷아웃(notch cutout)("윈도우")(1802)을 포함할 수 있다.
도 18을 참조하여 볼 때, 예컨대, 스캘펠 블레이드를 이용하여 하나의 절개점, 예를 들면, 랜싯 절개점을 형성할 수 있으며, 이 절개점을 통해서 HST(1806)가 절단 도구(1808)와 함께, 예를 들면, 단일 유닛으로서, 피부 아래 또는 피부 내에, 바람직하게는 진피층(1840)을 향해 상부로 배치된 노치 컷아웃(1802)을 갖는 피하 공간 내 원하는 위치에 삽입될 수 있다. 절단 도구(1801)는 노치 컷아웃(1802)이 "폐쇄"되어, HST(1806)가 순조롭게 삽입될 수 있도록, 그 삽입 시에 HST(1806) 내에 위치할 수 있다. 절단 도구(1808) 및 상기 절단 도구 내부로 삽입된 HST(1806)는 노치 컷아웃(1802)의 길이 방향으로 피하 계면을 따라서 이동할 수 있으며, 팁(1804)은 피부 표면을 통과하여 빠져나올 수 없다. 절단 도구(1808)의 위치가 적절히 잡히면, 절단 도구(1808)를 후퇴시켜서, 노치 컷아웃(1802)이 노출되도록 함으로써, 노치가 실질적으로 진피 조직으로 충전되도록 할 수 있다. 그리고, 예를 들면, 노치 컷아웃(1802)이 실질적으로 진피 조직으로 충전되도록 하기 위해서, 적절한 클램핑 기구, 구체적으로 예를 들면, 도 12를 참조하여 설명한 클램핑 기구를 이용하여 상기 피부 표면에 적절한 압력을 인가할 수 있고, 및/또는 예를 들면, 노치 컷아웃(1802) 하부에 위치한 진공 매니폴드(vacuum manifold)(도시되지 않음)에 의해 HST(1806) 내에 진공 조건을 적용할 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 상기 진피 조직을 절단하기에 적절한 회전 속도, 예를 들면 비교적 높은 회전 속도, 예컨대, 1,000 RPM보다 높은 회전 속도, 구체적으로 예시하면, 1,000 RPM 내지 10,000 RPM 범위의 회전 속도로 절단 도구(1808)를 회전시키기 위해, 절단 도구(1808)는 예를 들면, 모터에 연결될 수 있다. 예를 들면, 절단 도구(1808)를 2,000 RPM보다 높은 회전 속도, 예컨대 약 7,000 RPM의 회전 속도로 회전시킬 수 있다. 그런 다음, 절단 도구(1808)를 예를 들면, 절단 도구(1808)가 노치 컷아웃(1802) 단부 아래를 통과할 때까지 수동 또는 자동으로 전진시켜, 노치 컷아웃(1802) 내의 DMO(1830)를 절단할 수 있다. 절단이 완료되면, 절단 도구(1808)의 전진 또는 회전 운동을 중지시킬 수 있으며, 절단 도구(1808) 내에 채취된 DMO(1830)를 이용하여 절단 도구(1808)를 후퇴시킬 수 있다. 그런 다음, HST(1806)를 채취 부위로부터 제거할 수 있다. 예를 들면, 멸균 유체, 예컨대, 멸균수를 절단 도구(1808)에 통과시켜 플러싱(flushing)하기 위해 주사기를 이용하여, 또는 DMO(1830)를 절단 도구(1808)의 후면 단부(도시되지 않음)로부터 추출해내기 위해 진공 소스를 이용하여, 절단 도구(1808)로부터 DMO(1830)를 제거할 수 있다.
동 기술 분야의 당업자들이라면, 장치(1800)를 이용하는 경우, 하나의 절개점만을 형성하여 DMO의 채취가 가능하다는 것을 알 수 있다. 아울러, 장치(1800)는 비교적 두꺼운 피부를 갖는 영역, 예를 들면, 공여체의 등 부분에서 DMO를 채취하는 데 효과적으로 적용될 수 있다.
동 기술 분야의 당업자들이라면, 본 발명의 채취 방법 및/또는 장치는 전술한 바와 같이, 두꺼운 조직의 절단 장치를 표피에 도입하는 단계를 포함할 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 채취 방법 및/또는 장치에 따르면, 피부 외표면의 상해를 최소화하면서 DMO를 추출할 수 있으므로, 원하는 조직의 침습을 최소화한 채취 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구현예는 DMO의 채취 방법 및/또는 장치에 관한 것이지만, 동 기술 분야의 당업자들이라면 그 외의 구현예에 따른 적어도 일부의 방법 및/또는 장치를 기타 과정, 예를 들면, 성형외과수술, 피부과수술, 또는 조직의 채취를 포함하는 그 밖의 과정 중에 삽입할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 일 구현예에 따른 방법 및/또는 장치는 예컨대, 피하 이식 시에 사용될 진피 조직을 채취하기 위해, 충전 물질로서 삽입될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 진피 미세 기관의 생체외("시험관내") 조절 또는 처리용 시스템 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 직접적인 MO로서 채취된 진피 조직를 MO에 상응하는 양만큼 내부 가이드에 둘 수 있다. 일 구현예로서, 후속적인 처리 시에 상기 내부 가이드를 이용하여, MO의 위치 및 배향을 유지시킬 수 있다. 다른 구현예로서, 도 22를 참조하여 이하에 기재하는 바와 같이, 상기 진피 MO는 상기 내부 가이드로부터 제거된 다음, 조직 배양 웰 내에, 또는 바이오반응기의 형질도입 체임버 내에 직접 둘 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 DMO를 피부로부터 추출할 때, 상기 DMO가 코어링 튜브 내에 잔류하는 경우에는 상기 코어링 튜브의 후면 단부에 적용되는 생물학적으로 상용 가능한 유체, 예를 들면, 식염수 또는 성장 배지를 이용하여, 상기 DMO를 상기 코어링 튜브로부터 플러싱할 수 있다. 상기 DMO의 플러싱은 예를 들면, 이하에 기재하는 바와 같이, 상기 DMO가 바이오반응기의 체임버 내로 직접적으로 플러싱되도록 수행될 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 코어링 튜브의 후면 단부에 진공을 인가하여, 상기 DMO를 예를 들면, 상기 바이오반응기의 체임버 내로 직접 "인출"할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, DTMO를 이식하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. DMO를 생산 및/또는 처리, 예를 들면, 상기 DMO를 유전자적으로 변형시킴으로써 처리한 다음에는 단백질 또는 RNA 기재의 치료를 위해, 변형된 DMO 또는 DTMO를 환자의 등에 이식할 수 있다. 이식되는 전체 또는 부분적인 DTMO의 개수는 바람직한 치료학적 투여량의 선택된 단백질에 의해 결정될 수 있다. DTMO는 피하에 또는 신체 내 그 밖의 위치에 이식될 수 있다. 예를 들면, 바늘 트로카를 이용하여 DTMO를 피하 이식함으로써, DTMO가 피하 공간 내에 선형 상태로 남아있도록 할 수 있다. 이러한 선형 이식에 의해, 예를 들면, DTMO를 이식한 이후에 치료를 중단하거나, 치료학적 투여량의 단백질을 감소시키기 위해, 상기 DTMO를 제거해야 하는 경우, 위치의 파악이 가능하다. 전술한 이식 패턴 외에도 그 밖의 공지된 기하학적 이식 패턴을 이용할 수 있다. 아울러, 전술한 바와 같은 선형 이식에 의해, 진피 조직을 주위 조직에 통합시킬 수 있다.
도 20은 본 발명의 실시예에 따른 DTMO의 이식 방법을 개략적으로 도시한 플로우 차트이다.
블록(2002)에 나타낸 바와 같이, 이식하고자 하는 부위에서 선택적으로 국소 마취를 수행할 수 있다.
이어서, 블록(2004)에 나타낸 바와 같이, 선택적으로 주위의 멸균 식염수와 함께 DTMO를 캐리어(carrier), 예를 들면, 삽입 바늘, 예컨대, 주사기에 부착된 삽입 바늘 내로 흡입시킬 수 있다. 상기 바늘은 적절한, 예를 들면, 17 게이지 내지 12 게이지 범위의 직경을 가질 수 있다. 주사기의 플런저(plunger)가 후퇴하면서 상기 바늘 삽입관 내로 DTMO가 흡입될 수 있도록, 선택적으로 상기 바늘의 팁은 상기 팁에 첨부된 실리콘 튜빙 등의 짧은 연장부를 가질 수 있다.
블록(2006)에 나타낸 바와 같이, 예를 들면, 실리콘 튜빙 연장부를 갖지 않는 상기 삽입 바늘을 로딩된 DMO와 함께 상기 DTMO의 길이와 실질적으로 동일한 깊이로, 피부내로 관통시킬 수 있다.
이어서, 블록(2008)에 나타낸 바와 같이, 상기 삽입 바늘을 삽입 부위의 원위 말단에서 피부 표면을 통해 인출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 방법은 DTMO를 상기 캐리어로부터 이식 부위 내로 인출시키기 위해서, 흡입된 DTMO에 압력을 가하는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 블록(2010)에 나타낸 바와 같이, 그립 기구, 예를 들면, 겸자를 이용하여, 인출 지점에서 DTMO의 팁을 잡을 수 있다.
그리고, 블록(2012)에 나타낸 바와 같이, 상기 DTMO를 상기 삽입 바늘로부터 방출한 다음, 상기 DTMO를 상기 바늘의 궤적에 따라 선형으로 놓으면서, 상기 삽입 바늘을 피하 공간을 통해서 인출할 수 있다. 필요한 경우, 상기 DTMO의 방출을 보다 용이하게 하기 위해서, 상기 바늘을 인출하는 도중에 상기 주사기의 플런저를 서서히 밀어낼 수 있다.
이어서, 블록(2014)에 나타낸 바와 같이, DTMO가 적절한 위치에 이식되면, 그립 기구를 이용하여 상기 DTMO의 팁을 방출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 이식된 진피 미세 기관의 체내 구획(demarcation) 및 위치 측정을 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 처리된 조직의 피하 삽입 또는 체내 그 밖의 위치에서의 이식 위치를 확인하는 것은 예를 들면, 단백질 치료를 중지시키거나, 또는 선택된 단백질의 투여량을 감소시켜야 하는 경우에 중요할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 DTMO를 완전히 제거함으로써, 및/또는 이식된 DTMO 중 하나, 한 부분, 또는 하나 이상을 변이시킴으로써, 투여의 종료 또는 적정을 수행할 수 있다. 일 구현예로서, 피하 이식된 DTMO를 확인하기 위해서는 상기 DTMO를 이식하기 전에, 비활성의 생체에 적합한 잉크, 또는 예컨대 발색단(chromophore)을 포함하는 염색에 의해 상기 DTMO를 착색시킴으로써, 육안으로 관찰할 수 있거나, 또는 특정 조명 조건 하에서 가시화할 수 있다. 이러한 방식으로 시각적으로 확인 및/또는 향상된 이미지화 수단의 이용에 의해 주위 조직으로부터 DTMO를 선별할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, DTMO의 말초 표면은 예를 들면, 생체에 적합한 탄소 입자, 생체에 적합한 문신용 잉크, 또는 그 밖의 적절한 물질이 코팅되어 있을 수 있다. DTMO를 피하 이식한 다음에는 상기 DTMO를 육안으로, 혹은 적절하게 개선된 감지 장치를 이용하여 관찰할 수 있다. 이식된 DTMO의 가시성을 향상시키기 위한 그 밖의 방법으로서는 피부를 반투명하게 하여, 염색된 DTMO가 보다 잘 관찰될 수 있도록, 피부 표면에 강한 광 소스를 이용하는 것, 또는 피부를 집어서 한쪽 끝에서부터 상기 피부에 광 소스를 조사하는 것이 포함될 수 있다. 다른 구현예로서, UV광을 이용하여 발광하는 경우에만 보일 수 있도록, 예를 들면, 형광성 플라스틱 비드를 이용하여 염색에 의해 형광 발광시킬 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 생체에 적합한 구조체를 상기 DTMO를 따라 함께 이식함으로써, 피하 이식된 DTMO의 위치를 확인할 수 있다. 상기 생체에 적합한 구조체를 예시하면, 각종 외과 수술에 통상적으로 사용되는 비흡수성 싱글 스트랜드 나일론 봉합사를 들 수 있다. 이러한 봉합사를 DTMO의 이식 궤적과 동일하게 삽입하거나, 또는 상부 진피 내의 DTMO 위에 직접적으로 삽입함으로써, 상기 봉합사의 위치를 이용하여 상기 DTMO의 공간적 위치를 결정할 수 있다. 아울러, 상기 DTMO의 깊이는 피하 공간의 깊이일 수 있다. 상기 봉합사는 육안으로 식별 가능하고, 조광 수단을 이용하여 관측할 수 있으며, 및/또는 초음파와 같은 적절한 감지 수단을 이용하여 관측할 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 봉합사는 형광 발광할 수 있으며, 적절한 UV 조명 하에 피부를 통해 볼 수 있다. 다른 구현예로서, 상기 봉합사는 적절한 시간, 예를 들면, 몇 개월 동안 위치를 파악할 수 있도록 흡수성 재료로 제조된 것일 수 있다.
다른 구현예로서, 상기 DTMO는 형광 표지 또는 가시화 가능한 그 밖의 표지를 발현하는 유전자를 포함하도록 유전자적으로 또는 유전공학적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 DTMO는 GFP(Green Fluorescent Protein) 유전자 또는 루시페레이즈(Luciferase)에 의해 확인되는 유전자로 변형될 수 있으며, 예를 들면, 치료용 단백질에서의 유전자를 따라서 발현할 수 있다. 이러한 방법으로, 적절한 UV 조명 또는 그 외에 적절한 조명, 및 이미지화 조건을 이용하여 상기 DTMO를 비침습적으로 가시화할 수 있다.
또한, 다른 일 구현예로서, 이식된 DTMO를 제거 또는 절제하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 예를 들면, 환자를 대상으로 DTMO를 기재로 하는 치료를 중단해야만 하는 경우, 이식된 각각의 DTMO를 부분적으로 또는 전체적으로 제거하거나, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 절제할 수 있다. 일 구현예로서, 상기 DMO를 직접 채취하는 데 이용되는 수단과 유사한 직경을 갖는 코어링 튜브, 또는 상기 수단보다 약간 큰 직경을 갖는 코어링 튜브를 이용하여, DTMO를 제거할 수 있다.
도 21에 도시된 블록(2102)를 참조해 볼 때, 피하 이식된 DTMO의 위치를 결정할 수 있다. 또한, 블록(2103)에 나타낸 바와 같이, 상기 DTMO 제거 부위에서 선택적으로 국소 마취를 수행할 수 있다. 그런 다음, 블록(2104)에 나타낸 바와 같이, 상기 DTMO의 길이 방향에 따라 내부 가이드를 피하 삽입함으로써, 조직으로부터 DTMO를 포함하는 코어를 채취할 수 있다. 그리고, 블록(2106)에서와 같이, 삽입 바늘의 직경(예를 들면, 11 게이지 또는 그와 유사한 게이지)과 동일하거나 그보다 큰 직경의 코어링 바늘을 상기 내부 가이드와 동심원 상에서 삽입할 수 있다. 이어서, 블록(2108)에 나타낸 바와 같이, 상기 DTMO를 포함하는 조직의 코어를 채취할 수 있다. 그런 다음, 블록(2110)에서와 같이, 코어링된 조직을 갖는 내부 가이드 및 상기 코어링 바늘을 상기 DTMO와 함께 피부로부터 인출할 수 있다. 일 구현예로서, 이러한 코어링 프로세스는 신체로부터 상기 절단 물질을 제거하기 위해 진공 흡인을 병행할 수 있다.
본 발명의 예에 있어서, DTMO를 정위치(in-situ)에서 제거하는 최소한의 침습적 또는 비침습적 방법을 이용하여, 환자에 대해 극히 일부의 외상적이고 침습적인 절차를 만들 수 있다. 일예에서, 염색된 DTMO의 경우, 레이저, 예컨대 비침습성 야그(Yag) 레이저를 이용할 수 있다. 야그 레이저의 에너지는, 예컨대 발색단(chromophore)에 의해 선택적으로 흡수되어, 주변 조직의 손상을 최소화하면서 일차적으로 DTMO로 향할 수 있다.
다른 예에 있어서, DTMO는, 삽입된 최소 침습성의 프로브로부터 DTMO 길이의 피하 공간으로의 파괴성 에너지 전달에 의해 제거될 수 있다. 이러한 프로브는 고주파, 극저온, 마이크로파, 내열성 등을 포함한 다양한 에너지 타입을 전달할 수 있다. 함께 삽입된 구조체, 예컨대 봉합선은 DTMO의 위치를 결정하는데 사용될 수 있으며, 따라서, 프로브는 예컨대 봉합선을 따라 또는 봉합선 바로 밑에 피하로 삽입되어질 수 있다. 이러한 경우, 예컨대 상기 파괴성 에너지는 봉합선이 여전히 위치되어 동안에 전달될 수 있다. 또한, 봉합선은 프로브 배치 이후에 그리고 파괴성 에너지 전달 이전에 제거될 수 있다. 인가되는 에너지량은 투열 요법에 의한 응고와 같이 조직내 단백질을 변성시키는데 요구되는 함량일 수 있다. 덧붙여, 또는 대안적으로, 인가되는 에너지량은, 조직을 태우는 전기 외과 절단 기기에 사용되는 만큼 많을 수 있다. 물론, 그외 국지화 방법 및 기타의 파괴성 에너지 전달 방법들이 사용될 있다.
DMO를 채취한 후, 예컨대 본 발명의 예를 따라, DMO는 선택적으로 유전자적으로 변이된다. 조직을 유전자적으로 변이시키는 모든 공지 방법론들이 사용될 수 있다. 한가지 예시적인 방법으로는, 조직 세포내에 재조합 바이러스 벡터와 함께 유전자를 이식하는 방법이 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 예컨대 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 선형 DNA 등과 같은 여러가지 다수의 벡터들 중 임의의 하나를 사용하여, 치료 물질을 코딩하는 외인성 핵산 절편을 표적 세포 및/또는 조직에 도입할 수 있다. 이러한 벡터들은, 예컨대 감염, 형질전이, 형질감염, 칼슘-포스페이트 매개 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 전기충격, 리포좀-매개 형질감염, 바이올리스틱 유전자 전달(biolistic gene delivery), 융합성 및 음이온성 리포솜을 이용한 리포솜 유전자 전달(이는 양이온성 리포좀의 이용과는 다르다), 직접 주입법, 리셉터 매개 흡수, 자석투과(magnetoporation), 초음파 및 그외 공지된 방법 등을 이용하여 삽입될 수 있다. 이러한 유전자 삽입은, DMO 부근에 벡터를 도입함으로써 실시되며, 따라서 상기 벡터는 DMO의 세포와 반응할 수 있다. 외인성 핵산 절편이 일단 세포내로 병합되면, 상기 핵산 절편에 의해 코딩된 치료 물질의 생산율 및/또는 분비율은 정량할 수 있다.
본 발명의 일부 예시적인 예에 있어서, DMO의 유전자적 변형은 내인성 유전자의 발현 양상을 변결할 수 있다. 이는, 예컨대 내인성 유전자의 발현을 조절하기 위한 인핸서, 억제성 조절 요소 또는 유도성 조절 요소의 도입에 의해 실현될 수 있다.
다른 예에 있어서, 본 발명은 본 발명의 유전자적으로 변형된 DMO를 개체에게 이식함으로써 개체에게 대상 유전자 산물을 전달하는 방법을 제공한다.
전술한 바와 같이, DMO는 공정중에 영양액과 접촉상태일 수 있다. 따라서, 상기 DMO에 의해 제조된 치료 물질은 이의 농도를 측정할 수 있는 용액내로 분비될 수 있다. 대상 유전자는 모든 RNA 분자(센스 또는 안티센스), 펩티드, 폴리펩티드, 당단백질, 지단백질 또는 이들의 조합이나, 그외 후 변형된 폴리펩티드를 코드화하는 임의의 유전자일 수 있다. 본 발명의 일예에서, 대상 유전자는 조직 시료에서 자연적으로 발현될 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 상기 조직 시료는 유전자적으로 조작될 수 있으며, 따라서 하나 이상의 세포는 대상 유전자를 발현할 것이며, 이는 세포에서 자연적으로 발현되지 않거나 또는 세포내에서 변이된 발현 양상을 가진다.
본원에서, 용어 "핵산"은 데옥시리보뉴클레익 산(DNA)와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 의미하며, 경우에 따라 리보뉴클레익산(RNA) 또는 이의 모방체를 의미한다. 상기 용어는 또한 등가물로서 핵산 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체, 및 기재되는 예에 적용가능한 바와 같이 단일(센스 또는 안티센스) 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는, 자연적으로 형성된 뉴클레오베이스, 당 및 공유결합의 인터뉴클레오사이드(벡본) 결합으로 구성된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라, 유사하게 작용하지만 자연적으로 형성되지 않은 부분을 가지는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이런 변형 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 세포 흡수 강화, 핵산 표적물질에 대한 친화성 강화 및 뉴클레아제 존재시 안정성 증가와 같은 적절한 특성으로 인해, 종종 천연형에 비해 더 바람직하다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 용어 "단백질", "펩티드" 또는 "폴리펩티드"는, 펩티드 결합으로 특정 서열이 결합된 아미노산의 선형 중합체를 의미한다. 본원에서, 용어 "아미노산"은 별도로 언급하지 않는 한 D 또는 L의 입체이성체 아미노산을 의미한다. 또한 예컨대 천연형의 종양 억제 단백질 정제물의 생물학적 활성을 가지는 등가물 단백질 또는 등가물 펩티드 역시 본 발명의 범위내에 포함된다. "등가물 단백질" 및 "등가물 폴리펩티드"는, 자연적으로 형성된 단백질 또는 폴리펩타이드의 선형 서열과는 차이가 있지만 그것의 생물학적 활성이 변화지 않은 아미노산 치환체를 가지는 화합물을 의미한다. 이러한 등가물은 하나 이상의 아미노산이 관련 아미노산, 예컨대 유사한 전하의 아미노산 또는 측쇄 또는 관능기가 치환 또는 변형된 아미노산으로의 치환에 의해 천연 서열과 상이할 수 있다.
단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 당단백질 또는 지단백질은 하기 단백질 또는 여러가지 조합 중 어느 것일 수 있으나, 이에 한정되진 않는다: 단백질분해효소, 리파제, 리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제, 혈액 응고 인자, 시토크롬 p450 효소, 전사 인자, MHC 구성인자, 사이토카인, 인터루킨, BMP, 케모카인, 성장 인자, 호르몬, 효소, 모노클로날 항체, 단일 체인 항체, 산화환원효소, p450, 페록시다제, 하이드로게나제, 디하이드로게나제, 카탈라제, 트랜스퍼라제, 하이드롤라제, 이소머라제, 라이게이즈, 아미노아실-trna 신테타제, 키나제, 인단백질, 돌연변이유발원 트렌스포존(mutator transposon), 산화환원효소, 콜린에스테라제, 글루코아밀라제, 글리코실 하이드롤라제, 트랜스카르브아밀라제, 뉴클레아제, 메가뉴클레아제, 리보뉴클레아제, 아트파제(atpase), 펩티다제, 환형 뉴클레오티드 신테타제, 포스포디에스테라제, 인단백질, DNA 또는 RNA 조합성 단백질(associated protein), 고이동성 그룹의 단백질(high mobility group protein), 한쌍의 박스 단백질(paired box protein), 히스톤, 중합효소, DNA 복구 단백질, 리보좀 단백질, 전자 수송 단백질, 글로빈, 메탈로티오네인(metallothionein), 막 수송 단백질, 구조 단백질, 리셉터, 세포 표면 리셉터, 핵 리셉터, G-단백질, 후각 리셉터, 이온 채널 리셉터, 채널, 티로신 키나제 리셉터, 세포 부착 분자 또는 리셉터, 광리셉터, 활성 펩티드, 단백질분해효소 저해자, 샤페론, 샤페로닌, 스트레스 관련 단백질, 전사 인자 및 키메라 단백질.
본 발명의 일예에서, 예비-이식시 DMO에 의해 분비되는 단백질의 함량은 적어도 1.6 ㎍/DTMO/day이다.
본 발명의 일예에서, 대상 유전자는 에리트로포이에틴 또는 그것의 등가 단백질을 코딩할 수 있다.
본 발명의 다른 예에서, 대상 유전자는 임의의 아래 단백질, 아래 단백질들의 임의 조합 및 그것의 임의 등가물을 코딩할 수 있으나, 이에 한정되진 않는다: 인슐린, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 엘라스타제, 아밀라제, 혈청 흉선성 인자(serum thymic factor), 흉선의 체액성 인자(thymic humoral factor), 티모포이에틴, 게스트린, 세크레틴, 소마토스타틴, 물질 P, 성장 호르몬, 소마토메딘(somatomedin), 집락 자극 인자, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 간의 에리트로포이에틴 인자(헤파토포이에틴), 간세포 성장 인자, 인터루킨, 음성 성장 인자(negative growth factor), 섬유아세포 성장 인자 및 β 계열의 형질전환 성장 인자, 인터페론, 인터페론 α, 인터페론 β, 인터페론 γ, 인간 성장 호르몬, G-CSF, GM-CSF, TNF-리셉터, PDGF, AAT, VEGF, 슈퍼 옥사이드 디스뮤타제, 인터루킨, TGF-β, NGF, CTNF, PEDF, NMDA, AAT, 액틴, 액티빈 β-A, 액티빈 β-B, 액티빈 β-C, 액티빈 β-E, 아데노신 디아미나제, 아데노신 디아미나제, 아가라제-β(Agarase-Beta), 알부민 HAS 알부민, 알콜 디하이드로게나제, 알돌라제, 알피메프라제 α(Alfimeprase Alpha), 1-안티트립신 α 갈락토시다제 α-1-산 당단백질(AGP), α-1-안티키모트립신, α-1 안티트립신 AT, α-1-마이크로글로불린 A1M, α-2-마크로글로불린 A2M, α-페토단백질(Fetoprotein), α-갈락토시다제, 아미노산 옥시다제, D-, 아미노산 옥시다제, L-, 아밀라제, α, 아밀라제, β, 안지오스타틴, 안지오텐신, 변환 효소, 안키린, 아포리포단백질, APO-SAA, 아르기나제, 아스파라기나제, 아스파틸 아미노트랜스퍼라제, 심방 나트륨이뇨 인자(Atrial Natriuretic factor)(Anf), 심방 나트륨이뇨 펩티드, 심방 나트륨이뇨 펩티드(Anp), 아비딘, β-2-당단백질 1, β-2-마이크로글로불린, β-N-아세틸글루코사미니다제 B-NAG, β 아밀로이드, 뇌 나트륨이뇨 단백질(Bnp), 뇌 유래 향신경성 인자(BDNF), 카드헤린(cadherin) E, Calc a, Calc b, 칼시토닌(Calcitonin), 칼시클린(Calcyclin), 칼데스몬(Caldesmon), 칼기자린(Calgizzarin), 칼그래뉼린(Calgranulin) A, 칼그래뉼린 C, 칼모듈린(Calmodulin), 칼레티큘린(Calreticulin), 칼바스큘린(Calvasculin), 카보닉 안하이드라제(Carbonic Anhydrase), 카르복시펩티다제, 카르복시펩티다제 A, 카르복시펩티다제 B, 카르복시펩티다제 Y, 심장 트로포닌(CARDIAC TROPONIN) I, 심장 트로포닌 T, 카세인, α, 카탈라제(Catalase), 카테닌(Catenin), 카텝신(Cathepsin) D, CD95L, CEA, 셀룰라제, 센트로미어 단백질 B, 세룰로플라스민(Ceruloplasmin), 세루플라스민(Ceruplasmin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 콜레스테롤 에스테라제(Cholesterol Esterase), 콜린에스테라제(Cholinesterase), 아세틸, 콜린에스테라제 부티릴, 융모성 고나도트로핀(Chorionic Gonadotrophin)(HCG), 융모성 고나도트로핀 β 코어(BchCG), 키모트립신, 키모트립시노겐, 키모트립신, 크레아틴 키나제, K-BB, CK-MB(크레아틴 키나제-MB), CK-MM, 세기관지세포 인지질 결합성 단백질(Clara cell phospholipid binding protein), 클로스트리파인(Clostripain), 클루스테린(Clusterin), CNTF, 콜라겐, 콜라게나제, 콜라겐(1-VI 형), 집락 자극 인자, 보체(Complement) C1q, 보체 C3, 보체 C3a, 보체 C3b-α, 보체 C3b-β, 보체 C4, 보체 C5, 보체 인자 B, 콘카나발린(Concanavalin) A, 코르티콜리베린(Corticoliberin), 코르티코트로핀 분비성 호르몬(Corticotrophin releasing hormone), C-반응성 단백질(CRP), C-형 나트륨이뇨 펩티드(Cnp), 시스타틴 C, D-이량체(Dimer), δ 1, δ계 키나제 1(Dlk1), 데옥시리보뉴클레아제, 데옥시리보뉴클레아제 I, 데옥시리보뉴클레아제 II, 데옥시리보뉴클레익산, 데르살라진(Dersalazine), 덱스트라나제(Dextranase), 디아포라제(Diaphorase), DNA 라이게이즈(Ligase), T4, DNA 중합효소 I, DNA 중합효소, T4, EGF, 엘라스타제(Elastase), 엘라스타제(Elastase), 엘라스틴, 내분비샘 유래 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF), 엘라스틴 엔도텔린(Elastin Endothelin), 엘라스틴 엔도텔린(Elastin Endothelin) 1, 엘라스틴 에옥탁신(Elastin Eotaxin) 엘라스틴, 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드-78(ENA-78), 에리트로포이에틴(Epo), 에스트리올(Estriol), 엑소두스(Exodus), 인자(Factor) IX, 인자 VIII, 지방산-결합 단백질, 페리틴(Ferritin), 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 14, 섬유아세포 성장 인자 15, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 18, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 2, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 3, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 9, 파이브로넥틴(Fibronectin), 국소 부착 키나제(focal-adhesion kinase)(FAK), 폴리트로핀 α(Follitropin alfa), 갈락토스 옥시다제, 갈락토시다제, β, γIP-10, 게스트린, GCP, G-CSF, 신경교 유래 향신경성 인자(Glial derived Neurotrophic Factor)(GDNF), 신경교원섬유 산 단백질(Glial fibrillary acidic Protein), 신경교 사상체 단백질(Glial filament protein)(GFP), 신경교 유래 향신경성 계열 리셉터(glial-derived neurotrophic factor family receptor)(GFR), 글로불린, 글루코스 옥시다제, 글루코스-6-포스페이트, 디하이드로게나제, 글루코시다제, α, 글루코시다제, β, 글루쿠로니다제, β, 글루타메이트 디카르복실라제(Glutamate Decarboxylase), 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 글리세롤 디하이드로게나제, 글리세롤 키나제, 글리코젠 포스포릴라제 ISO BB, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 성장 자극 단백질(GRO), 성장 호르몬, 성장 호르몬 분비성 호르몬, 헤모펙신(Hemopexin), 간의 에리트로포이에틴 인자(hepatic erythropoietic factor)(헤파토포이에틴), 헤레굴린(Heregulin) α, 헤레굴린 β 1, 헤레굴린 β 2, 헤레굴린 β 3, 헥소키나제(Hexokinase), 히스톤, 인간 골 형성 단백질(Human bone morphogenetic protein), 인간 릴랙신(Human relaxin) H2, 히알루로니다제(Hyaluronidase), 하이드록시스테로이드 디하이드로게나제(Hydroxysteroid Dehydrogenase), 하이폭시아 유도성 인자-1(Hypoxia-Inducible Factor-1) α (HIF-1 α), I-309/TCA-3, IFN α, IFN β, IFN γ, IgA, IgE, IgG, IgM, 인슐린, 인슐린계 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린계 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론, 인터페론 유도성 T 세포 α 화학유인물질(I-TAC), 인터루킨, 인터루킨 12 β, 인터루킨 18 결합 단백질, 장 트레호일 인자(Intestinal trefoil factor), IP10, 자그드(Jagged) 1, 자그드 2, κ 경쇄, 각질형성세포 성장 인자(KGF), 키스1(Kiss1), La/SS-B, 락테이트 디하이드로게나제(Lactate Dehydrogenase), 락테이트 디하이드로게나제(Lactate Dehydrogenase), L-, 락토페린, 락토페록시다제(Lactoperoxidase), λ 경쇄, 라미닌 α 1, 라미닌 α 2, 라미닌 β 1, 라미닌 β 2, 라미닌 β 3, 라미닌 γ 1, 라미닌 γ 2, LD78β, 렙틴(Leptin), 류신 아미노펩티다제(leucine Aminopeptidase), 류텐화 호르몬(Leutenizing Hormone)(LH), LIF, 리파제, 간 세포 성장 인자, 간 발현 케모카인(LEC), LKM 항원, TNF, TNF β, 루시퍼라제, 류텐화 호르몬 분비성 호르몬, 림프구 활성화 유전자-1 단백질(LAG-1), 림포탁틴(Lymphotactin), 리소자임(Lysozyme), 대식세포 염증성 단백질 1 α(MIP-1 Alpha), 대식세포 유래 케모카인(MDC), 말레이트 디하이드로게나제, 말타제, MCP(macrophage/monocyte chemotactic protein)-1,2 및 3,4, M-CSF, MEC (CCL28), 막-유형 프리즐 관련 단백질(Membrane-type frizzled-related protein)(Mfrp), 미드킨(Midkine), MIF, MIG(monokine induced by interferon gamma), MIP 2 내지 5, MIP-1β, Mp40; P40 T-세포 및 비만세포 성장 인자, 마이엘린 염기성 단백질 마이엘로페록시다제(Myelin Basic Protein Myeloperoxidase), 미오글로빈(Myoglobin), 미오스타틴 성장 분화 인자(Myostatin Growth Differentiation Factor)-8(GDF-8), 미오신(Mysoin), 미오신 LC, 미오신 HC, ATPase, NADase, NAP-2, 음성 성장 인자, 신경 성장 인자(NGF), 뉴라미다제(Neuraminidase), 뉴레굴린(Neuregulin) 1, 뉴레굴린 2, 뉴레굴린 3, 신경 특이적 에놀라제(Neuron Specific Enolase), 신경 특이적 에놀라제(Neuron-Specific Enolase), 뉴로트로핀(neurotrophin)-3(NT-3), 뉴로트로핀-4 (NT-4), 뉴투린(Neuturin), NGF, NGF-β, 니카스트린(Nicastrin), 니트레이트 리덕타제(Nitrate Reductase), 산화질소 합성효소, 노르테스토스테론(Nortestosterone), 노치(Notch)1, 노치 2, 노치 3, 노치 4, NP-1, NT-1 내지 4, NT-3 Tpo, NT-4, 뉴클레아제, 온코스타틴(Oncostatin) M, 오르니틴 트랜스카르바모일라제(Ornithine transcarbamoylase), 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin), 오발부민, 옥살레이트 디카르복실라제(Oxalate Decarboxylase), P16, 파파인(Papain), PBP, PBSF, PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PEDF, 펩신(Pepsin), 펩티드 YY (PYY), 페록시다제, 페르세핀(Persephin), PF-4, P-당단백질, 포스파타제, 산, 포스파타제, 알칼라인, 포스포디에스터라제 I, 포스포디에스터라제 II, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포글루코뮤타제(Phosphoglucomutase), 포스포리파제, 포스포리파제 A2, 포스포리파제 A2, 포스포리파제 C, 포스포티로신 키나제, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드(Pituitary adenylate cyclase activating polypeptide), 태반 락토겐(Placental Lactogen), 플라코글로빈(Plakoglobin), 플라코필린(Plakophilin), 혈장 아민 옥시다제(Plasma Amine Oxidase), 혈장 레티놀 결합 단백질(Plasma retinol binding protein), 플라스미노겐(Plasminogen), 플레이오트로핀(Pleiotrophin)(PTN), PLGF-1, PLGF-2, 억새풀 항바이러스 독소(Pokeweed Antiviral Toxin), 프레알부민(Prealbumin), 임신 관련 혈장 단백질(Pregnancy assoc Plasma Protein) A, 임신 특이적 β1 당단백질(Pregnancy specific beta 1 glycoprotein)(SP1), 프로디노르핀(Prodynorphin), 프로엔케팔린(Proenkephalin), 프로게스테론 프로인슐린(Progesterone Proinsulin), 프로락틴(Prolactin), 프로-멜라닌-농축성 호르몬(Pro-melanin-concentrating hormone)(Pmch), 프로-오피오멜라노코르틴(Pro-opiomelanocortin), 프로오르파닌(proorphanin), 전립선 특이 항원(Prostate Specific Antigen) PSA, 전립선 산 포스파타제(Prostatic Acid Phosphatase) PAP, 프로트롬빈, PSA-A1, 폐의 계면활성제 단백질(Pulmonary surfactant protein) A, 피루베이트 키나제(Pyruvate Kinase), 란피르나제(Ranpirnase), RANTES, 릴린(Reelin), 레닌(Renin), 레시스틴(Resistin), 레티놀 결합성 글로불린(Retinol Binding Globulin) RBP, RO SS-A 60kda, RO/SS-A 52kda, S100 (human brain) (BB /AB), S100(human) BB 동종이량체(homodimer), 사포신(Saposin), SCF, SCGF-α, SCGF-β, SDF-1 α, SDF-1 β, 분비성 프리즐드 관련 단백질(Secreted frizzled related protein) 1 (Sfrp1), 분비성 프리즐드 관련 단백질(Secreted frizzled related protein) 2 (Sfrp2), 분비성 프리즐드 관련 단백질 3 (Sfrp3), 분비성 프리즐드 관련 단백질 4 (Sfrp4), 분비성 프리즐드 관련 단백질 5 (Sfrp5), 세크레틴(secretin), 혈청 흉선 인자 결합성 글로불린(SHBG), 소마토메딘(somatomedin), 소마토스타틴(somatostatin), 소마토트로핀(Somatotropin), s-RankL, 물질 P, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide Dismutase), TGF α, TGF β, 티오레독신(Thioredoxin), 트롬보포이에틴(Thrombopoietin)(TPO), 트롬보스폰딘(Thrombospondin) 1, 트롬보스폰딘 2, 트롬보스폰딘 3, 트롬보스폰딘 4, 트롬보스폰딘 5, 트롬보스폰딘 6, 트롬보스폰딘 7, 흉선의 체액성 인자(thymic humoral factor), 티모포이에틴(thymopoietin), 티모신(thymosin) a1, 티모신 α-1, 흉선 및 활성화 조절성 케모킨(Thymus and activation regulated chemokine)(TARC), 흉선 발현성 케모킨(Thymus-expressed chemokine)(TECK), 티글로불린(Thyroglobulin) Tg, 갑상선 미소체 항원(Thyroid Microsomal Antigen), 갑상선 페록시다제, 갑상선 페록시다제 TPO, 티록신(Thyroxine)(T4), 티록신 결합성 글로불린 TBG, TNFα, TNF 리셉터, 트랜스페린(Transferin), 트랜스페린 리셉터(Transferrin receptor), B 계열의 형질전환 성장 인자(transforming growth factor of the b family), 트랜스티레틴(Transthyretin), 트리아실글리세롤 리파제(Triacylglycerol lipase), 트리요오도티로닌(Triiodothyronine)(T3), 트로포미오신(Tropomyosin) α, 트로포미오신 관련 키나제(tropomyosin-related kinase)(trk), 트로포닌(Troponin) C, 트로포닌 I, 트로포닌 T, 트립신, 트립신 저해제, 트립시노겐, TSH, 트위크(Tweak), 티로신 디카르복실라제(Tyrosine Decarboxylase), 유비퀴틴(Ubiquitin), UDP 글루쿠로닐 트랜스퍼라제(glucuronyl transferase), 유레아제(Urease), 유리카제(Uricase), 뇨 단백질(Urine Protein) 1, 유로코르틴(Urocortin) 1, 유로코르틴 2, 유로코르틴 3, 유로텐신(Urotensin) II, 방-유사(Vang-like) 1 (Vangl1), 방-유사 2 (Vangl2), 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor)(VEGF), 혈관작용 장 펩티드 전구체(Vasoactive intestinal peptide precursor), 비멘틴(Vimentin), 비타민 D 결합 단백질, 본 빌레브란트 인자(Von Willebrand factor), Wnt1, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt12, Wnt13, Wnt14, Wnt15, Wnt16, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9, 크산틴 옥시다제(Xanthine Oxidase), 클레라 세포 인지질 결합 단백질(Clara cell phospholipid binding protein), 클로스트리파인(Clostripain), 클루스테린(Clusterin), CNTF, 콜라겐, 콜라게나제, 콜라겐(1-VI형), 집락 자극 인자, 보체 C1q, 보체 C3, 보체 C3a, 보체 C3b-α, 보체 C3b-β , 보체 C4, 보체 C5, 보체 인자 B, 콘카나발린(Concanavalin) A, 코르티콜리베린(Corticoliberin), 코르티코트로핀 분비성 호르몬(Corticotrophin releasing hormone), C-반응성 단백질(C-Reactive Protein)(CRP), C-형 나트륨이뇨 펩티드(Cnp), 시스타틴(Cystatin) C, D-이량체, δ 1, δ계 키나제 1(Dlk1), 데옥시리보뉴클레아제(Deoxyribonuclease), 데옥시리보뉴클레아제 I, 데옥시리보뉴클레아제 II, 데옥시리보뉴클레익 산, 데르살라진(Dersalazine), 덱스트라나제(Dextranase), 디아포라제(Diaphorase), DNA 라이게이즈, T4, DNA 중합효소 I, DNA 중합효소, T4, EGF, 엘라스타제(Elastase), 엘라스타제(Elastase), 엘라스틴, 내분비선 유래 혈관 내피 성장 인자(EG-VEGF), 엘라스틴 엔도텔린, 엘라스틴 엔도텔린 1, 엘라스틴 에오탁신 엘라스틴(Elastin Eotaxin Elastin), 표피 성장 인자(EGF), 상피 호중구 활성화 펩티드-78(ENA-78), 에리트로포이에틴(Epo), 에스트리올(Estriol), 엑소두스(Exodus), 인자 IX, 인자 VIII, 지방산 결합 단백질, 패리틴, 패리틴, 섬유아세포 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자 10, 섬유아세포 성장 인자 11, 섬유아세포 성장 인자 12, 섬유아세포 성장 인자 13, 섬유아세포 성장 인자 14, 섬유아세포 성장 인자 15, 섬유아세포 성장 인자 16, 섬유아세포 성장 인자 17, 섬유아세포 성장 인자 18, 섬유아세포 성장 인자 19, 섬유아세포 성장 인자 2, 섬유아세포 성장 인자 20, 섬유아세포 성장 인자 3, 섬유아세포 성장 인자 4, 섬유아세포 성장 인자 5, 섬유아세포 성장 인자 6, 섬유아세포 성장 인자 7, 섬유아세포 성장 인자 8, 섬유아세포 성장 인자 9, 파이브로넥틴, 국속 부착 키나제(FAK), 폴리트로핀 α, 갈락토스 옥시다제, 갈락토시다제 β, γIP-10, 게스트린, GCP, G-CSF, 신경교 유래 향신경성 인자(GDNF), 신경교 원섬유 산 단백질, 신경교 사상체 단백질(GFP), 신경교 유래 향신경성 인자계 리셉터(GFR), 글로불린, 글루코스 옥시다제, 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코시다제 α, 글루코시다제 β, 글루쿠로니다제 β, 글루타메이트 디카르복실라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 디하이드로게나제, 글리세롤 디하이드로게나제, 글리세롤 키나제, 콜라겐 포스포릴라제 ISO BB, 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF), 성장 자극 단백질(GRO), 성장 호르몬, 성장 호르몬 분비 호르몬, 헤모펙신(Hemopexin), 간의 에리트로포이에틱 인자(헤파토포이에틴), 헤레굴린 α, 헤레굴린 β 1, 헤레굴린 β 2, 헤레굴린 β 3, 헥소키나제, 히스톤, 인간 골 형성 단백질, 인간 릴랙신 H2, 히알루로니다제, 하이드록시스테로이드 디하이드로게나제, 하이폭시아 유도성 인자-1 α(HIF-1 α), I-309/TCA-3, IFN α, IFN β, IFN γ, IgA, IgE, IgG, IgM, 인슐린, 인슐린계 성장 인자 I(IGF-I), 인슐린계 성장 인자 II(IGF-II), 인터페론, 인터페론 유도성 T 세포 α 화학유인물질(I-TAC), 인터루킨, 인터루킨 12 β, 인터루킨 18 결합 단백질, 당 트레호일 인자, IP10, 자그드 1, 자그드 2, κ 경쇄, 각질형성세포 성장 인자(KGF), Kiss1, La/SS-B, 락테이트 디하이드로게나제, 락테이트 디하이드로게나제, L-, 락토페린, 락토페록시다제, λ 경쇄, 라미닌 α 1, 라미닌 α 2, 라미닌 β 1, 라미닌 β 2, 라미닌 β 3, 라미닌 γ1, 라미닌 γ2, LD78β, 렙틴, 류신 아미노펩티다제, 류텐화 호르몬(LH), LIF, 리파제, 간 세포 성장 인자, 간 발현 케모킨(LEC), LKM 항원, TNFβ, 루시퍼라제, 류텐화 호르몬 분비 호르몬, 림프구 활성화 유전자-1 단백질(LAG-1), 림포탁틴, 라이소자임, 대식세포 염증성 단백질 1 α (MIP-1 α), 대식세포 유래 케모킨(MDC), 말레이트 디하이드로게나제, 말타제, MCP(macrophage/monocyte chemotactic protein)-1, 2 및 3, 4, M-CSF, MEC(CCL28), 막 형 프리즐드 관련 단백질(Mfrp), 미드킨, MIF, MIG(monokine induced by interferon gamma), MIP 2 내지 5, MIP-1β, Mp40; P40 T-세포 및 비만세포 성장 인자, 마이엘린 염기성 단백질 마이엘로페록시다제, 미오글로빈, 미오스타틴 성장 분화 인자-8 (GDF-8), 미오신, 미오신 LC, 미오신 HC, ATPase, NADase, NAP-2, 음성 성장 인자, 신경 성장 인자(NGF), 뉴라미니다제, 뉴레굴린 1, 뉴레굴린 2, 뉴레굴린 3, 신경 특이적 에놀라제, 신경 특이적 에놀라제, 뉴로트로핀(neurotrophin)-3(NT-3), 뉴로트로핀-4(NT-4), 뉴투린(Neuturin), NGF, NGF-β, 니카스트린(Nicastrin), 니트레이트 리덕타제(Nitrate Reductase), 산화질소 합성효소, 노르테스토스테론, 노치 1, 노치 2, 노치 3, 노치 4, NP-1, NT-1 내지 4, NT-3 Tpo, NT-4, 뉴클레아제(Nuclease), 온코스타틴 M, 오르니틴 트랜스카르바모일라제, 오스테오프로테게린, 오발부민, 옥살레이트 디카르복실라제, P16, 파파인, PBP, PBSF, PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PEDF, 펩신, 펩티드 YY(PYY), 페록시다제, 페르세핀, PF-4, P-당단백질, 포스파타제, 산, 포스파타제, 알칼라인, 포스포디에스테라제 I, 포스포디에스테라제 II, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 포스포글루코뮤타제, 포스포리파제, 포스포리파제 A2, 포스포리파제 A2, 포스포리파제 C, 포스포티로신 키나제, 뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제 활성화 폴리펩티드, 태반 락토겐, 플라코글로빈(Plakoglobin), 플라코필린(Plakophilin), 혈장 아민 옥시다제, 혈장 레티놀 결합 단백질, 플라스미노겐, 플레이오트로핀(Pleiotrophin)(PTN), PLGF-1, PLGF-2, 억새풀 항바이러스 독소, 프리알부민(Prealbumin), 임신 관련 혈장 단백질(Pregnancy assoc Plasma Protein) A, 임신 특이적 β 1 당단백질(SP1), 프로디노르핀(Prodynorphin), 프로엔케팔린(Proenkephalin), 프로게스테론 프로인슐린(Progesterone Proinsulin), 프로락틴, 프로-멜라닌 농축 호르몬(Pmch), 프로-오피오멜라노코르틴(Pro-opiomelanocortin), 프로오르파닌(proorphanin), 전립선 특이 항원 PSA, 전립선 산 포스파타제 PAP, 프로트롬빈, PSA-A1, 폐 계면활성제 단백질 A, 피루베이트 키나제, 라니피르나제(Ranpirnase), RANTES, 릴린(Reelin), 레닌, 레시스틴, 레티놀 결합 글로불린 RBP, RO SS-A 60kda, RO/SS-A 52kda, S100(인간 뇌)(BB /AB), S100 (인간) BB 동형이량체, 사포신, SCF, SCGF-α, SCGF-β, SDF-1 α, SDF-1 β, 분비성 프리즐드 관련 단백질1(Sfrp1), 분비성 프리즐드 관련 단백질 2(Sfrp2), 분비성 프리즐드 관련 단백질 3 (Sfrp3), 분비성 프리즐드 관련 단백질 4 (Sfrp4), 분비성 프리즐드 관련 단백질 5 (Sfrp5), 세크레틴, 혈청 흉선성 인자, 결합성 글로불린(SHBG), 소마토메딘, 소마토스타틴, 소마토트로핀, s-RankL, 물질 P, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, TGF α, TGF β, 티오레옥신, 트롬보포이에틴(TPO), 트롬보스폰딘 1, 트롬보스폰딘 2, 트롬보스폰딘 3, 트롬보스폰딘 4, 트롬보스폰딘 5, 트롬보스폰딘 6, 트롬보스폰딘 7, 흉선의 체액성 인자, 티모포이에틴, 티모신 a1, 티모신 α-1, 흉선 및 활성화 조절 케모킨(TARC), 흉선-발현 케모킨(TECK), 티로글로불린 Tg, 갑상선 미소체 항원, 갑상선 페록시다제, 갑상선 페록시다제 TPO, 티록신(T4), 티록신 결합성 글로불린 TBG, TNFα, TNF 리셉터, 트랜스페린, 트랜스페린 리셉터, B 계열의 형질전환 성장 인자, 트랜스티레틴, 트리아실글리세롤 리파제, 트리요오도티로닌(T3), 트로포미오신 α, 트로포미오신 관련 키나제(trk), 트로포닌 C, 트로포닌 I, 트로포닌 T, 트립신, 트립신 저해제, 트립시노겐, TSH, 트위크, 티로신 디카르복실라제, 유비퀴틴, UDP 글루쿠로닐 트랜스퍼라제, 유레아제, 유리카제, 뇨 단백질 1, 유로코르틴 1, 유로코르틴 2, 유로코르틴 3, 유로텐신 II, 방계 1 (Vangl1), 방계 2 (Vangl2), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 혈관작용 장 펩티드 전구체, 비멘틴, 비타민 D 결합 단백질, 본 빌레브란트 인자, Wnt1, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt12, Wnt13, Wnt14, Wnt15, Wnt16, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9 및 크산틴 옥시다제.
유전자적 변형 이후에, 상기 조직 시료는 대상 유전자의 발현을 검증하기 위해 분석될 수 있다. 이는 공지된 임의의 방법, 예컨대 ELISA에 의한 단백질 검출 또는 RNA에 대한 노던 블롯으로 실행될 수 있다. 특정 발현 벡터 시스템과 세포내로 핵산을 도입하는 방법의 효율성은, 당업계에 일반적으로 사용되는 표준적인 방법으로 평가할 수 있다. 예컨대, 세포로의 DNA 도입은 필터 혼성화 기술(예, 서든 블롯팅)에 의해 검출할 수 있으며, 도입된 DNA의 전사에 의한 RNA 제조는 예컨대 노던 블롯팅, RNase 보호 또는 역전사효소-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)로 검출할 수 있다. 유전자 산물은 적당한 분석법, 예컨대 특이 항체를 이용한 제조된 단백질의 면역학적 검출 또는 효소학적 분석과 같이 유전자 산물의 기능적인 활성을 검출하기 위한 기능 분석에 의해 검출할 수 있다. 세포에서 발현되는 대상 유전자의 산물을 쉽게 분석할 수 없다면, 먼저 발현 시스템에 사용된 조절 요소 및 벡터에 연결된 리포터 유전자를 이용하여 발현 시스템을 최적화할 수 있다. 리포터 유전자는 쉽게 검출가능한 유전자 산물을 코딩하고 있으므로, 따라서 시스템의 효율을 평가하는데 사용할 수 있다. 당업계에 사용되는 표준적인 리포터 유전자로는, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 루시퍼라제, GFP/EGFP 및 인간 성장 호르몬을 코딩하는 유전자가 있다.
본 발명은, 생물체 이식을 위한 유전자적으로 변형된 DTMO의 용도를 포함한다. 본원에서 용어 "주입", "도입", "삽입" 및 "이식"은 서로 호환적으로 사용될 수 있으며, 원하는 부위에 DTMO를 위치시키는 결과를 파생하는 방법 또는 경로에 의한 본 발명의 DTMO의, 개체, 예컨대 자가조직의, 동종이형의 또는 이종의 개체로의 배치를 의미한다. 적어도 일부분의 DTMO 세포가 생존하는 방식으로, DTMO는 개체내 원하는 위치에 이식된다. 본 발명의 일예에서, 적어도 약 5% 이상, 본 발명의 다른 예에서, 적어도 약 10% 이상, 본 발명의 다른 예에서, 적어도 약 20% 이상, 본 발명의 다른 예에서, 적어도 약 30% 이상, 본 발명의 다른 예에서, 적어도 약 40% 이상, 본 발명의 다른 예에서, 적어도 약 50% 이상의 세포가 개체내에 주입된 후에도 생존상태로 남아있다. 개체로의 주입 이후에, 세포의 생존 기간은 짧게는 수 시간, 예컨대 24시간 내지 몇 일, 길게는 몇 주 내지 몇 달 또는 몇 년일 수 있다. 예컨대, 돼지-인간 이식과 같은 이종 이식시, 숙주에 의한 면역 공격을 받을 수 있는 조직으로의 세포 집단의 이식을 용이하게 하기 위해, DTMO는 생체적합한 면역보호된 물질, 예컨대 재충전가능한, 비-생분해성 또는 생분해성 기기로 이식하거나 캡슐화시킬 수 있으며, 이후 수용체 개체에게 이식될 수 있다. 이러한 세포/조직에 의해 제조된 유전자 산물은, 예컨대, 화합물, 예, 단백질성 바이오의약품(proteinaceous biopharmaceutical)을 포함한 약물의 조절적인 전달을 위해 고안된 중합성 기기를 통해 전달될 수 있다. 생분해성 및 비-생분해성 중합체 둘다를 포함한, 다양한 생체적합성 중합체(예컨대 하이드로겔 포함)를 사용하여, 본 발명의 세포 집단에 의한 유전자 산물이 특정 표적 부위에서 지속적으로 분비되도록 이식할 수 있다. 이러한 이식은, 일반적으로 당업계에 알려져 있다. 예컨대, Concise Encyclopedia of Medical & Dental Materials , ed. By David Williams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990); the Sabel et al. 미국 특허 4,883,666; Aebischer et al. 미국 특허 4,892,538; Aebischer et al. 미국 특허 5,106,627; Lim 미국 특허 4,391,909; 및 Sefton 미국 특허 4,353,888를 참조한다. 본 발명의 DTMO내 세포 집단은, 멸균 염수 및 수성 완충 용액과 같이 약학적으로 허용가능한 담체나 희석제내로 주입될 수 있다. 상기 담체 및 희석제의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다.
예컨대 분비성 단백질의 비제한적인 예로는, 본 발명의 상기 예에 따른 임의의 단백질 일 수 있다. 본 발명의 일예에서, 대상 단백질은 에리트로포이에틴일 수 있다. 본 발명의 다른 예에서, 본 발명의 방법은 공지된 각 단백질, 모든 단백질 및 이들의 조합의 발현 및 분비에 사용될 수 있다. 또한 본 발명의 방법은 RNA 분자(센스 또는 안티센스)의 발현에 이용될 수 있다.
또한, 유전자적으로 변형된 세포를 포함하는 DMO는 시험관내에 유지될 수 있으며, 치료 물질은 조직 시료를 둘러싼 상청액 매질내 방치되거나, 이로부터 분리되거나, 동일하거나 상이한 개체에게로 주입 또는 적용될 수 있다.
대안적으로 또는 부가적으로, 유전자적으로 변형된 세포를 포함하는 진피 미세 기관은 공지된 방법에 의해 극저온으로 저장될 수 있으며, 상기 방법의 비제한적인 예로는, 조직 시료에서 제조된 후 즉시 또는 유전자 변이 후 즉시 10% DMSO를 함유하는 DMEM 내에서의 점진적인 동결(0℃, -20℃, -80℃, -196℃) 방법이 있다.
본 발명의 일부 예들의 일측면에 있어서, 유전자적으로 변형된 세포를 함유하는 조직 시료의 이식량은, 한 가지 이상의 다음 사항으로부터 결정된다: 유사한 개체에 대한 일정한 가이드라인, 특정 임상 프로토콜 또는 인구 통계를 토대로한 상기 개체에게 일상적으로 투여되는 관심 대상인 치료 물질의 상응 함량; 치료 물질을 주입 또는 그외 경로를 통해 사전에 수여받은 경우에서의 동일 개체에 특이적인, 대상 단백질과 같은 치료 물질의 상응 함량; 및 체중, 나이, 신체 상태, 임상적인 상태와 같은 개체에 대한 자료, 그외 유사 개체에게 주입된 유전자적으로 변형된 세포를 포함하는 조직 시료에 대한 약물동력학적 사전 자료, 유전자적으로 변형된 세포를 포함하는 조직 시료 주입에 대한 사전의 환자 반응.
본 발명의 일부 예들의 일측면에 있어서, 일부의 DTMO만이 일정한 치료 기간에 사용된다. 나머지 DTMO는 이후의 사용을 위해 유지시키거나 또는 저온 또는 저온이 아닌 상태로 보관할 수 있다.
본 발명의 일예에서, 환자에게 이식되는 치료용 진피 미세 기관의 함량을 결정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은, DTMO의 양에 의해 치료 물질의 분비율을 시험관내 방법으로 결정하는 단계, 상기 치료 물질의 시험관내 생산율 및 분비율과 생체내 혈청 수치 사이의 관련성을 조사하는 단계 및 측정된 분비율과 조사된 관련성을 토대로 DTMO의 이식량을 결정하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 관련성은 아래 인자 군으로부터 하나 이상 선택된 인자를 기초로 평가된다:
a) 체중, 나이 신체 상태, 임상적인 상태와 같은 개체에 대한 자료;
b) 다른 유사 개체에게 DTMO를 주입한 사전 경우에서의 약물 동력학적 자료; 및
c) 상기 개체에게 DTMO를 투여한 사전 경우에서의 약물 동력학적 자료.
선택적으로, 상기 관련성은 상기 인자들중 적어도 2가지 이상을 기초로 평가한다. 선택적으로, 상기 관련성은 상기 인자들중 적어도 3가지 이상에 의거한다.
본 발명의 일예에서, 환자에 대한 DTMO의 이식량은 하기 사항들 중 한가지 또는 이들 모두에 근거하여 결정한다:
유사 개체에 대한 일정한 가이드라인, 특정 임상학적 프로토콜 또는 인구 통계를 토대로한, 상기 개체에게 일상적으로 투여되는 대상 치료 물질의 상응 함량; 및
치료 물질을 주입 또는 그외 경로를 통해 사전에 수여받은 경우에서의, 동일 개체에 특이적인 동일 치료 물질의 상응 함량.
본 발명의 일예는, 결정된 양에 따라 이식용 DTMO를 상당량 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일예에서, 개체에게 이식된 DTMO에 의해 생산되는 치료 물질의 투여량을 조정하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 개체에서 치료 물질의 농도를 관찰하는 단계; (b) 상기 치료 물질의 농도를 원하는 수치와 비교하는 단계; (c) 상기 치료 물질의 수치가 최소치보다 낮은 경우, DTMO를 더 이식하는 단계; 및 (d) 상기 치료 물질의 수치가 최대치보다 높은 경우, 이식된 DTMO 일부를 불활성화시키거나 또는 제거하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 상기 방법은 주기적으로 (a)~(d)를 반복한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 불활성화 또는 제거 단계는 이식된 DTMO의 일부를 제거하는 단계로 이루어진다. 선택적으로, 제거는 외과적인 제거를 포함한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 불활성화 또는 제거하는 단계는 불활성화를 포함한다. 선택적으로, 불활성화는 이식된 DTMO 일부분을 사멸시키는 것을 포함한다. 선택적으로 불활성화는 이식된 DTMO 일부분의 제거를 포함한다.
도 1 및 전술한 바와 같이, 유전자 변이 과정중 DMO 유지 단계의 일부분 이상과 유전자 변이 자체는, 하기와 같이 바이오 반응기내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 일부 예에서, 상기 바이오 반응기는 아래 특성을 일부 또는 모두 가질 수 있다:
a) DMO 표면을 통해 영양분과 가스를 제공하여, 이들이 DMO내로 확산되어 DMO가 생존가능한 상태를 유지할 수 있도록 하는 특성. 따라서, DMO의 유효 면적 및 용적은 주변 유체와의 접촉이 차단되지 않을 수 있다.
b) 적합한 온도로 DMO 유지시키는 특성.
c) DMO 부근의 pH 및 기체 조성을 원하는 수준으로 유지시키는 특성.
d) DMO 및 바이오 반응기로부터 폐산물을 제거하는 특성
e) 벡터의 삽입으로 인하여 주변이 오염될 위험이 실질적으로 없는, 유전자적으로 변형된 벡터를 삽입하는 간단한 방법을 가능하게 하는 특성.
f) 과량의 미사용 벡터를 제거하는 특성
g) 생성된 치료 물질의 함량이 측정 가능한 특성
h) 실질적으로 멸균된 치료 물질의 제거가 가능한 특성
i) DMO의 용이한 이식 및 DTMO의 전체 양 또는 측정된 양의 용이한 제거.
도 22는 본 발명의 실시예에 따라 채취된 DMO(2204)를 처리하기 위한 시스템(2207)을 개략적으로 도시한 도면이다.
본 발명의 일 구현예로서, 시스템(2207)은 각각 DMO(2204)를 수용하기에 적절한 하나 이상의 처리 체임버(2202)를 갖는 바이오반응기(2200)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따른 바이오반응기(2200)는 특정 대상체로부터 채취된 DMO의 개수와 동일한 복수 개의 체임버를 포함하며, 상기 바이오반응기(2200)는 국소 유체 저장조(2208)로부터 적절한 유체, 예컨대, 성장 배지를 갖는 하나 이상의 처리 체임버(2202)를 제공하고, 및/또는 처리 체임버(2202)에 수용된 하나 이상의 유체를 예컨대, 이하에 기재하는 바와 같이, 폐수 컨테이너(2210)로 배출할 수 있다. 상기 유체는 도입 라인(2242), 예를 들면, 이하에 기재하는 바와 같이, 멸균 커넥터(2258)에 의해 저장조(2208)에 연결된 도입 라인(2242)을 경유하여, 저장조(2208)에 공급될 수 있다.
본 발명에 따르면, DMO(2204)를 채취하기 위해 사용되는, 예컨대 전술한 바와 같은 절단 도구를 이용하여, DMO(2204)를 처리 체임버(2202)로 수송할 수 있다. 체임버(2202)로의 DMO의 수송은 DMO(2204)를 채취한 다음, 멸균 조건을 유지하면서 직접 수행될 수 있다. 처리 체임버(2202)는 DMO(2204)를 수용하도록 하기 위한 DMO 이식 포트(2201)를 포함할 수 있다. 예를 들면, 이식 포트(2201)는 뭉툭한 삽입관을 수용할 수 있는 멸균된 중격(septum) 계면, 예컨대, B. Braun Medical Inc.에서 시판하는 SafeLine® Injection Site를 포함할 수 있다. 상기 절단 도구의 팁이 중격으로 삽입되면, DMO(2204)를 체임버(2202) 내로 통상의 멸균 방법에 따라, 예를 들면, 상기 절단 도구의 후면 단부에 연결된 주사기를 이용하여, 서서히 플러싱할 수 있다. 일 구현예로서, 체임버(2202) 내의 배지 배스(medium bath)(2206) 내로 DMO(2204)를 플러싱할 수 있다. 다른 구현예로서, 예를 들면, DMO(2204)를 상기 내부 가이드, 예컨대, 전술한 바와 같은 내부 가이드 내로 채취하는 경우에는 체임버(2202) 상부에 장착된 리드(lid)(2232)를 제거할 수 있으며, DMO(2204)를 상기 내부 가이드로부터 서서히 제거한 다음, 체임버(2202) 내에 둘 수 있으며, 리드(2232)를 다시 놓고, 체임버(2202) 상부를 밀봉함으로써, 체임버(2202)의 멸균도를 유지시킬 수 있다.
바이오반응기(2200)는 예를 들면, 통상의 방법에서와 같이, 상기 처리 체임버 중 적어도 일부에 수용되는 DMO에 대해서 하나 이상의 프로세스를 적용할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 바이오반응기(2200)는 하나 이상의 처리 체임버 중에 수용된 내용물을 그 외의 하나 이상의 체임버 중에 수용된 내용물로부터 유체 분리시킬 수 있도록 되어 있다.
또한, 일 구현예로서, 바이오반응기(2200)는 이하에 기재하는 바와 같이, 처리 체임버(2202) 내로의 및/또는 처리 체임버(2202)로부터의 유체 흐름을 제어하기 위한 메카니즘을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 바이오반응기(2200)는 비멸균 주사기 펌프(2214)와 유체 소통된 멸균 버퍼(2222)를 포함할 수 있으며, 상기 비멸균 주사기 펌프(2214)는 멸균 방법으로, 예컨대, 멸균 필터(2220), 이를테면, 0.45 ㎛ 기공의 공기 필터를 통해서, 공기를 버퍼(2222)에 주입하고/주입하거나, 버퍼(2222)으로부터 공기를 배출할 수 있다. 또한, 바이오반응기(2200)는 4개 이상의 위치에서, 예를 들면, 도입 저장조(2208)가 버퍼(2222)와 유체 소통된 도입구-버퍼 위치, 폐수 컨테이너(2210)가 버퍼(2222)와 유체 소통된 배출구-버퍼 위치, 체임버(2202)가 버퍼(2222)와 유체 소통된 체임버-버퍼 위치, 및 버퍼(2222), 체임버(2202), 도입 저장조(2208), 및 폐수 컨테이너(2210)이 서로 유체 소통되지 않는 비(非)소통 위치에 조절 밸브(2212)를 더 포함할 수 있다. 그리고, 서로 다른 위치 사이에 존재하는 밸브(2212)가 움직이도록 하기 위해서 밸브(2212)와 모터(2224) 사이를 피스톤(2226)으로 연결시킬 수 있다. 선택적으로, 풀무형 횡격막(bellows diaphragm)(2228)을 피스톤(2226) 상부에 장착함으로써, 예를 들면, 피스톤(2226)의 운동 중에 실질적으로 비멸균 공기가 별균 버퍼(2222) 수송되지 않도록 할 수 있다.
아울러, 시스템(2201)은 주사기 펌프(2214)의 플런저(2218)를 작동시키는 모터(2216)를 더 포함할 수 있다. 바이오반응기(2200)가 하나 이상의 체임버를 포함하는 경우에는 상기 체임버와 관련된 각각의 플런저가 동시에 구동시되도록 어느 한 모터를 삽입하거나, 또는 각각이 하나 이상의 플런저를 구동시킬 수 있는 복수의 모터를 삽입할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시스템(2201)은 아래에 기재하는 바와 같이, 모터(2216) 및/또는 모터(2224)의 작동을 제어할 수 있는 제어기(2286)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 예를 들면, 체임버(2202)를 충전하기 위해 유체를 저장조(2208)로부터 체임버(2202)로 제어 하에 수송할 수 있다. 예를 들면, 제어기(2286)에 의해 모터(2224)가 작동됨으로써, 밸브(2212)를 도입구-버퍼 위치에 위치시킬 수 있으며, 제어기에 의해 모터(2216)가 작동됨으로써, 주사기 펌프(2214)는 버퍼(2222)로부터 정해진 양의 공기를 배기시킬 수 있다. 이렇게 함으로써, 정해진 부피의 공기와 상응하는 정해진 부피의 유체를 도입 저장조(2208)로부터 버퍼(2222)로 "인출"할 수 있다. 그런 다음, 제어기(2286)의 제어 하에 모터(2224)를 작동시킴으로써, 밸브(2212)를 체임버-버퍼의 위치로 이동시킬 수 있고, 모터(2216)을 제어기의 제어 하에 작동시킴으로써 주사기 펌프(2214)는 버퍼(2222)의 유체를 체임버(2202) 내로 방출시킨다. 이와 유사한 방법으로, 상기 주사기 펌프 및 조절 밸브를 제어함으로써, 체임버(2202) 중의 내용물, 또는 그의 일부를 폐수 컨테이너(2210)로 배출할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 체임버(2202)에 수용된 유체는 예컨대, DMO(2204)에 적용되는 바이러스 형질전환 및/또는 그 밖의 생체외 유지 과정을 보다 용이하게 수행하기 위하여, 제어 가능하게 교반 및/또는 혼합될 수 있다. 예를 들면, 제어기(2286)는 상기 유체 또는 그 일부를 체임버(2202)로부터 버퍼로 주기적으로 배출하여, 버퍼(2222) 내의 유체를 다시 체임버(2202)로 주입하기 위해서, 위에서 설명한 바와 같이 모터(2216) 및/또는 모터(2224)를 제어 가능하게 작동시킬 수 있다.
또한, 다른 일 구현예로서, 예를 들면, 도입 저장조(2208), 폐수 컨테이너(2210) 및/또는 체임버(2202) 사이에 유체 소통되는 하나 이상의 "통로 라인"에 위치한 공기를 예를 들면, 체임버(2202), 도입 저장조(2208), 및/또는 버퍼(2222)로/로부터 유체를 이송한 다음에, 상기 통로 라인을 플러싱하기 위해 이용할 수 있다. 예를 들면, 제어기(2286)는 제어 가능하게 모터(2216)를 작동시킴으로써, 저장조(2208)로부터 버퍼(2222)로 유체를 인출하기 전에 주사기 플런저(2218)가 정해진 부피의 공기를 버퍼(2222)로 인출시키도록 할 수 있다. 버퍼(2222)는 상기 공기를 버퍼(2222) 내의 유체 상부로 상승시키고, 주사기 펌프(2214)의 작동 시에 버퍼(2222) 내의 유체를 먼저 배출할 수 있도록 하는 기하 구조를 가질 수 있으며, 이로써, 상기 통로 라인에 잔류하는 모든 또는 일부의 공기를 플러싱할 수 있다.
아울러, 본 발명의 일 구현예로서, 체임버(2202)의 바닥 표면(2230)은 예를 들면, 상기 유체가 실질적으로 일정한 방법에 따라서 체임버(2202) 내로 및/또는 체임버(2202)로부터 이송될 수 있도록, 및/또는 실질적으로 대부분의 유체가 체임버(2202)로부터 배출될 수 있도록, 복수의 홀(hole), 또는 메쉬와 유사한 패턴을 포함할 수 있다. 또한, 전술한 구성에 의해서, "데드-스폿(dead-spot)", 즉, 체임버(2202) 내에서 유체가 유통되지 않는 상태 및/또는 새로 공급되지 않는 상태인 영역의 발생도를 감소시킬 수 있다.
다른 일 구현예로서, 리드(2232)는 탈착 가능한 접착제에 의해 부착된 막, 실리콘 플러크 물질 등과 같은 제거 가능한 멸균 리드일 수 있다. 리드(2232)는 체임버(2202)와 주위 환경 간의 멸균 "장벽"이 유지되도록 할 수 있다. 선택적으로, 체임버(2202)와 주위 환경이 유체 소통되도록 멸균 공기 필터(2234), 예를 들면, 0.45 ㎛ 기공의 공기 필터를 삽입할 수 있으며, 이렇게 함으로써, 체임버(2202)와 주위 환경 사이의 멸균 장벽을 유지시키면서 압력이 평형을 이루도록 할 수 있다. 다른 구현예로서, 리드(2232)는 상기 압력의 평형화가 리드(2232)를 통해 가능할 수 있도록, "통기성" 물질을 포함할 수 있다.
저장조(2208) 및/또는 폐수 컨테이너(2210)는 통상적으로, 예를 들면, 하나 이상의 매니폴드(도시되지 않음)를 통해 특정 대상체에 대한 하나 이상의 처리 체임버(2202)에 연결되어 있을 수 있다. 다른 구현예로서, 도입 저장조(2208) 및/또는 폐수 컨테이너(2210)는 복수의 처리 체임버 중 각각 하나에 개별적으로 연결되어 있을 수 있다. 도입 저장조(2208) 및/또는 폐수 컨테이너(2210)는 멸균 방법에 따라서 압력을 평형화하는 메카니즘을 포함할 수 있다. 예를 들면, 도입 저장조(2208) 및/또는 폐수 컨테이너(2210)는 각각이 멸균 공기 필터(2236) 및/또는 멸균 공기 필터(2238)를 통해 주위 환경과 유체 소통될 수 있다. 필터(2236) 및/또는 필터(2238)는 예컨대, 0.45 ㎛ 기공의 공기 필터를 포함할 수 있다. 다른 구현예로서, 폐수 컨테이너(2210)는 압력을 평형화시킬 필요가 없도록, 그리고 이렇게 함으로써, 비멸균 공기 필터를 사용할 수 있도록 확장 가능한 폐수 컨테이너를 포함할 수 있다.
일 구현예로서, 바이오반응기(2200)를 이용함으로써, 체임버(2202)로의/로부터의 유체의 직접적인 주입 또는 배출이 가능하다. 샘플링 중격 포트(2240)는 예를 들면, ELISA, 글루코오스 흡수량, 락테이트 제조율, 또는 그 밖의 지시 파라미터와 같은 바이오반응기의 다양한 파라미터를 테스트하기 위해서 바이러스 벡터 유체의 직접적인 주입, 또는 성장 배지의 샘플링을 하는 데 이용될 수 있다. 중격 포트(2240)는 위에서 DMO 이식 포트(2201)에 대해 설명한 바와 같이, 바늘 삽입 또는 삽입관 포트에 이용되는 표준적인 실리콘 포트를 포함할 수 있다. 주사기(도시되지 않음)는 중격 포트(2240)를 통과하여 탈착 가능하게 삽입될 수 있다. 상기 주사기는 수동, 또는 자동으로, 예컨대 제어기(2286)에 의해 작동될 수 있는 모터, 예를 들면, 모터(2216)와 유사한 모터에 의해 작동될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 바이오반응기(2200)의 모든 구성 요소는 정해진 조건, 예를 들면, 약 37℃의 온도, 약 90~95%의 공기와 약 5~10%의 CO2의 가스 분위기, 및/또는 비교적 높은 습도, 예컨대, 85~100% 조건을 포함하는 배양 조건에서 유지될 수 있다. 일 구현예로서, 하나의 체임버(2202)를 배양 조건으로 유지시킬 수 있다. 전술한 바와 같이, 상기 배양 조건은 예를 들면, 상기 DMO 조직 배양물의 생명력를 유지시키기 위해 필요하다.
또한, 본 발명의 일 구현예로서, 유체 공급 장치를 이용하여, 하나 이상의 유체 탱크, 예를 들면, 유체 탱크(2244) 및 (2246)로부터 유체를 도입 라인(2242)으로 공급할 수 있다. 일 구현예로서, 한 탱크가 다른 탱크의 백업 저장조(backup reservoir)로서 이용될 수 있는 경우, 탱크(2244) 및 (2246)는 동일한 유체, 예를 들면, 성장 배지를 포함할 수 있다. 다른 구현예로서, 탱크(2244 및 2246)는 DMO 처리 시의 서로 다른 단계에서 사용되는 두 타입의 성장 배지와 같은, 서로 다른 2종의 유체를 포함할 수 있다. 탱크(2244) 및/또는 (2246)은 저장조(2208)과 관련하여 위에서 설명한 바와 같이, 멸균 방법에 따라서 압력을 유지시키기 위해 멸균 공기 필터를 포함할 수 있다. 다른 구현예로서, 탱크(2244) 및/또는 (2246)는 동 기술 분야에 공지된 바와 같은 접을 수 있는 탱크, 예컨대, 멸균 프라스틱 백을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 각각의 탱크(2244) 및 (2246)는 밸브(2252), 예를 들면, 핀치 밸브, 중격 커넥터(2248), 및 관통 스파이크(2250)를 경유하여 통합 커넥터(2254)와 유체 소통될 수 있다. 커넥터(2254)는 예를 들면, 동 기술 분야에 공지된 바와 같은 Y자형 또는 T자형 커넥터를 포함할 수 있다. 밸브(2252)는 탱크(2244) 및/또는 탱크(2246)으로부터 커넥터(2254)로의 유체 흐름을 제어할 수 있다. 펌프, 예컨대, 연동 펌프(2256)는 도입 라인(2242)을 따라서 커넥터(2254)와 커넥터(2258) 사이에 위치할 수 있다. 또한, 제어기(2286)를 사용하여, 모터(2257) 및/또는 밸브(2252)를 제어 가능하게 작동시킴으로써, 저장조(2208)에 제공되는 유체의 양 및/또는 유속을 제어할 수 있다.
다른 구현예로서, 탱크(2244) 및/또는 (2246) 내에 수용된 유체는 4℃의 냉장 조건에서 9일의 저장 수명을 가질 수 있다. 이에 따라, 냉장 시스템(도시되지 않음)을 이용하여, 탱크(2244) 및/또는 탱크(2246) 내 유체를 저장조(2208)의 배양 온도보다 낮을 수 있는 온도로 유지시킬 수 있다. 그러므로, 도입 라인(2242)은 냉장 조건 내지 배양 조건 사이의 경계면을 통과할 수 있다. 상기 탱크의 저장 수명이 다 되면, 탱크(2244) 및/또는 (2246)를 새로운 탱크로 교체할 수 있다.
일 구현예로서, 바이오반응기(2200)의 적어도 일부 요소들은 일회용의 멸균 플라스틱 성분으로 형성될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 바이오반응기(2200)는 멸균 포장된 일회용 바이오반응기를 포함할 수 있으며, 상기 일회용 바이오반응기는 DMO 채취 부위로 수송되어, 멸균 환경 하에 개방될 수 있으며, 성장 배지를 각각의 바이오반응기 체임버(2202) 내로 주입할 수 있도록 부위에서 제조될 수 있다. 상기 DMO의 채취 시에 이용되는 장치는 DMO 이식 포트(2201)를 통해 삽입됨으로써, 상기 DMO를 전술한 바와 같은 멸균 방법에 따라서 체임버(2202) 내로 플러싱할 수 있다. 시스템(2207)의 기타 성분, 예를 들면, 커넥터(2258), 모터(2216) 및/또는 (2224), 핀치 밸브(2252), 및/또는 연동 펌프(2256)에 연결될 수 있는 경우, 바이오반응기(2200)는 예를 들면, 배양 조건 하에 처리 부위로 수송될 수 있다. 그런 다음, 제어기(2286)는 채취될 DMO로부터 DTMO를 생성하는 전체 샹체외 프로세스 중에 DMO의 유지 및 형질전환을 제어할 수 있다. 그리고, 본 명세서에 기재한 바와 같이 약동학적 모델을 이용하여, 특정 대상체에 필요한 투여량을 결정할 수 있다. 이어서, 바이오반응기(2200)는 시스템(2207)으로부터 탈착될 수 있고, 예를 들면, 배양 조건 하에서 이식 부위로 이송될 수 있다. 예를 들면, 전술한 이식 방법에 따라, 특정 DTMO를 이식하기 위해서는 리드(2232)를 제거하여, 특정 DTMO에 대한 바이오반응기 체임버(2202)를 개방한 다음, 상기 DTMO를 상기 체임버로부터 제거할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 치료용 진피 미세 기관(DTMO)의 생산 및 이용 방법을 도시한 개략적 블록 다이어그램.
각각의 도 2A 및 도 2B는 본 발명의 실시예에 따른, 미리 이식된 mIFNα-TMO 및 hEPO-TMO의 시험관내 분비 수준과 이식 후의 체내 혈청 수준 간의 상관 관계 분석 결과를 도시한 도면.
각각의 도 3A 및 도 3B는 본 발명에 따라서 ELISA 분석에 의해 얻은 결과로서, 미니어쳐 돼지(miniature swine) 내에 자가조직 TMO 이식한 이후에 상승된 혈청 hEPO 수준, 및 망상 적혈구(reticulocyte)의 개수 증가를 도시한 도면.
도 4는 서로 다른 6명의 인간 피부로부터 제조된 DTMO-hEPO에 의한 인간의 적혈구생성인자(hEPO)의 분비 수준을 나타내는 그래프를 개략적으로 도시한 도면.
도 5는 DTMO 및 분할 두께 피부 TMO의 조직을 도시한 도면.
도 6은 DTMO의 면역조직화학(IHC: immunohistochemistry) 및 Hematoxylin & Eosin(H&E) 염색을 도시한 도면.
도 7은 SCID 마우스에 DTMO-hEPO의 피하 이식하여, 분할 두께 피부 TMO-hEPO를 수행한 이후의 체내 hEPO 혈청 수준, 및 적혈구용적률 수준에 대한 생리학적 효과를 도시한 도면.
도 8은 DTMO-hEPO 및 SCID 마우스에 피하 이식된 분할 두께 피부 TMO-hEPO의 임상학적 및 조직학적 분석 결과를 나타낸 도면.
도 9는 건강한 자원자에게 이식한 지 17일 경과 시의 피부 슬릿(분할 두께 피부 MO, 우측) 내, 또는 피하(S.C.) (DMO, 좌측) 이식으로 이식된 피부 MO의 조직학적 분석 결과를 나타낸 도면.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 DMO의 채취 방법을 개략적으로 도시한 플로우 차트.
도 11a 내지 도 11c는 도 10의 방법에 따라 DMO를 채취하는 단계를 개략적으로 도시한 도면.
도 12는 본 발명의 실시예에 따른 진피 채취 장치에 이용될 수 있는 클램핑 기구를 개략적으로 도시한 도면.
도 13은 본 발명의 실시예에 따라 DMO를 채취하기 위한 소스 조직 내로 삽입되고, 내부 가이드 바늘과 동일한 축으로 채취하는 코어링 튜브를 포함하는 진피 채취 장치를 개략적으로 도시한 도면.
도 14a 내지 도 14c는 본 발명의 실시예에 따른 DMO를 채취하기 위한 진피 채취 장치(1400)를 개략적으로 도시한 각각의 전면도, 측면도, 및 상면도.
도 15는 본 발명의 실시예에 따라 원하는 위치에서 진피 미세 기관을 지지하기 위한 도 14a 내지 도 14c에 도시된 장치의 개략적 횡단 측면도.
도 16은 원하는 위치에서 채취될 진피 미세 기관을 외부에서 지지하는 도 15의 장치의 횡단면도.
도 17은 본 발명의 다른 실시예에 따른 진피 채취 장치를 개략적으로 도시한 도면.
도 18은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 채취 장치를 개략적으로 도시한 도면.
도 19는 DMO를 채취하기 위한 도 18의 채취 장치의 이용을 개략적으로 도시한 도면.
도 20은 본 발명의 실시예에 따른 DTMO 이식 방법을 도시한 플로우 차트.
도 21은 본 발명의 실시예에 따른 DTMO 제거 방법을 도시한 플로우 차트.
도 22는 본 발명의 실시예에 따른 회수한 DMO의 처리 시스템의 개략적인 설명.
실시예 1
DTMO - hEPO 에 의한 인간 에리트로포이에틴의 시험관내 분비율
실험을 수행하여, 여러 개의 인간 피부 시료로부터 수득한 DTMOs-hEPO간의 시험관내 hEPO 분비율 다양성을 평가하였다.
실험 절차
6명의 사람으로부터 수득한 조직 시료로부터 DTMO-hEPO를 (3배수)로 제조하였고, 도 4에 도시한 바와 같이 바이러스 벡터를 제거한 후 다양한 시간대별로 hEPO 분비율을 측정하였다.
실험 결과
DTMO-hEPO 분비율은 여러가지 인간 피부 시료들에서 유사하였다. 또한 DTMO-hEPO 분비율은 층일부의 TMO-hEPO로부터 수득한 기존의 hEPO 분비율과 유사하였다(데이타 미기재).
실시예 2
조직학
DTMO가 대부분의 진피 성분들을 함유하는지를 평가하기 위해, 조직학적 분석을 수행하였다. MO를 층일부의 피부 또는 진피 시료로부터 준비하고, 피부-병리학으로 조직학적 분석을 실시하였다. 도 5의 좌측에서 확인할 수 있듯이, DTMO는 기저의 잔류 및/또는 표피 층없이 진피 층과 진피 성분을 함유하고 있다. 대조적으로, 도 5의 우측의 층일부의 TMO는 기저 및 표피 층을 포함한 모든 피부 층을 함유하고 있다.
실시예 3
면역조직화학 실험
어떤 세포가 DTMO-hEPO 조직으로 전이되는지를 연구하기 위해, DTMO-hEPO에 대한 조직학적 면역조직 화학적 분석을 항-hEPO 항체(1:20 희석)을 이용하여 수득후 9일째에 실시하였다. 분석으로, 도 6에 나타난 바와 같이 진피의 섬유아세포가 진하게 염색된 것으로 확인되었다. 상기 염색은 전체 DTMO에 전개되었다.
실시예 4
DTMO - hEPO 및 전체 TMO 로부터 유래된 SCID 마우스에서의 hEPO 의 장기간의 조혈 활성 비교
실험은 수행하여, SCID 마우스에서 피하 삽입된 DTMO-hEPO와 층일부에서 유래된 TMO-hEPO의 장기간 효과를 실험 및 비교하였다.
실험 절차
인간 DTMO-hEPO 및 층일부에서 유래된 TMO-hEPO를 준비하고, 두가지 군의 SCID 마우스(각 군당 5마리)에 피하 삽입하였다. 대조군에는 인간 DTMO와 Ad/lacZ 바이러스 벡터로 전이된 층일부 유래 TMO를 이식하였다.
실험 결과
도 7에 나타난 바와 같이, 두 가지 실험 군들에서 유사한 분비율 및 생리학적 반응이 확인되었으나, 대조군 마우스에서는 예측한대로 혈액내 hEPO가 관찰되지 않았다.
모든 실험군에서, 적혈구 용적률 상승을 이식 후 15일째에 초기에 관찰할 수 있었으며, 5달 이상 유지되었으나, 반면에 MO/lacZ 대조군 마우스에서는 이러한 적혈구 용적률 상승은 나타나지 않았다. 층일부에서 유래된 TMO-hEPO와 비교하였을때, DTMO-hEPO는 유사한 기간동안 유사한 수준의 분비를 발생시키는 것으로 보인다.
실시예 5
DTMO - hEPO 의 피하 삽입시 케라틴 낭은 형성되지 않는다.
실험 절차
DTMO-hEPO와 층일부에서 유래된 TMO-hEPO를 SCID 마우스에 피하 삽입하고, 임상적이고 조직학적인 분석을 통해 케라틴 낭 형성을 관찰하였다.
실험 결과
도 8에서 명확히 확인되는 바와 같이, 층일부에서 유래한 TMO-hEPO를 이식한 후 76 및 141일에 케라틴 낭이 관찰되었다. 반면에 DTMO-hEPO를 이식한 SCID 마우스에서는 이식후 113일동안 케라틴 낭이 관찰되지 않았다.
실시예 6
건강한 사람에게 층일부 유래된 MO 및 DMO 이식
실험 절차
인간의 진피 MO와 층일부에서 유래된 TMO를 시판되는 피부분절기(dermatome)(Aesculap GA 630)를 이용하여 수득하였다. 수득하기 전에 공여체 및 수용체 모두는 엠라 로션(도포 마취)와, 카르카인(Marcain) + 아드레날린(국소 마취)를 피하 주사를 이용하여 도포 및 국소 마취하였다.
인간 진피 MO와 인간 층일부에서 유래된 MO를 제조하기 위해 두가지 유형의 피부 시료를 수득하였다. 인간 층일부에서 유래된 MO의 경우, 건강한 피부 스트립(strip)을 복부 하단부에서 절제하였다. 상기 피부 단편으로부터 6개의 선형의 MO를 전술한 바와 같이 제조하였다. 동시에, 특정 크기의 상처를 조절가능한 슬릿(slit) 마커를 이용하여 삽입 부위에 만들고, 이후 MO를 피부 상처내로 곧 이식하였다. 인간 진피 MO의 경우, 피부는 두가지 단계로 수득하였다. 먼저, 두께 200 ㎛의 피부판을 수득하여 수분이 있는 거즈상에 보관하였다. 상기 피부판을 수득한 부위로부터 1 mm 두께의 진피 피부판을 적출하였다. 피부 수득후, 200 ㎛의 피부판을 공여 부위에 복귀시켜 생물학적 드레싱으로 역할하도록 하였다. 상기 수득한 진피판으로부터 4개의 진피 MO를, 상기 층일부 유래된 MO 제조방법과 동일한 방법으로 준비하였다. 인간 진피 MO는 이후 투관침을 이용하여 곧 피하 이식되었다. 공여체 및 이식 부위를 Bioclusive® 투명막(Johnson& Johnson, USA)을 이용하여 드레싱하였다. 1주일 후 드레싱을 교체하고 이식체들을 조사하여 이식 통합(graft integration)을 확인하였다. MO 이식 후 2 내지 3주에, 예정된 복부성형술 과정을 실시하여 이식체 및 이식 부위를 포함한 피부 단편을 적출하였다. 사진 및 조직학적 검사를 포함한 임상적인 분석을 이식 부위에 대해 실시하여 MO 통합을 확인하였다.
실험 결과
이식 후 1주일째에 실시된 임상적인 검사와, 복부성형술 이후에 곧 실시한 조직학적 분석(이식후 2-3주)으로, 피부 틈으로 이식된 MO가 진피 MO 피하 이식된 부위에서 현저히 통합된 것으로 확인되었다(도 9). 상처내에 이식된, 층일부에서 유래된 MO 또는 피하 이식된 진피 MO에서도 염증 또는 부종이 관찰되지 않았다.
실시예 7
인간 에리트로포이에틴을 발현하는, 미니어쳐 돼지 피부 선형 층일부 TMO 의 자가조직 이식(면역적격 동물로의 hEPO)
전신 마취한, 살아 있는 동물로부터 얻은 신선한 피부 조직 시료로부터 선형(30.6 mm 길이 및 0.6 ㎛ 폭) 미니어쳐 돼지(Sincler swine) 피부 미세 기관을 제조하였다. 시판용 피부분절기(Aesculap GA630)를 이용하여 0.9-1.1 mm 피부 두께(깊이)로 조직 시료를 절제하고, 페트리 디시(90 mm)에서 Pen-Strep 및 글루타민을 함유하는 DMEM으로 세정하였다.
선형의 미세 기관을 생산하기 위하여, 상술한 바와 같은 블레이드 구조를 이용한 프레스기로 상기 조직 시료를 원하는 크기: 30.6 mm x 600 ㎛로 절단하였다. 얻어진 선형의 미세 기관을, 37 ℃ 및 5% CO2 하에서 24시간 동안, 혈청 결핍하에, 웰당 500 ㎕의 DMEM(Biological Industries-Beit Haemek)를 함유하는 24웰 마이크로플레이트에 웰당 하나씩 두었다. 미니어쳐 돼지 피부 치료성 미세 기관(피그 피부-TMO)을 제조하기위해, 플레이트를 교반하면서 인간 에리트로포이에틴(아데노-hEPO) 유전자를 가진 아데노 바이러스 벡터(1 x 1010 IP/㎖)를 이용하여, 각각의 웰에서 형질전이를 24시간 동안 실시하였다. 배지는 2-3일 주기로 교체하고, 특정 ELISA 키트(Cat. # DEP00, Quantikine IVD, R & D Systems)를 이용하여 분비된 hEPO의 존재를 분석하였다.
상기 미니어쳐 돼지 피부 hEPO 선형의 TMO를 여러 마리의 면역적격 미니어쳐 돼지에게 각각 피하를 통해 삽입하고, 피부 이식편으로서 이식하였다(2마리의 미니어쳐 돼지에게 TMO-hEPO를 피하로 삽입하고, 다른 2마리의 미니어쳐 돼지에게는 TMO-hEPO를 1mm 깊이의 상처에 이식함). 충분한 개수의 TMO-hEPO를 각각의 미니어쳐 돼지에게 삽입하였고, 각 돼지에서 조합된 예비-삽입 분비율은 대략 7 ㎍/일이었다. ELISA 분석에 의하여 측정한 바, 혈청내 hEPO 수치 상승(도 3(A)), 및 세망세포 총 수 상승이 삽입 후 7일 동안 나타났다.
본 발명은 실시예로 제시된 구체적이나 비제한적인 예를 이용하여 설명되지만, 그러한 예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 예컨대, 한정된 갯수의 유전자 변이를 개시하고 있다. 그러나, 생조직의 환자 체내 재삽입에 대한 본원의 방법들, 및 삽입 후 그 조직의 체내 생존율을 토대로 한, 공지된 임의의 방법에 의해서 유발가능한 조직내 실질적인 모든 유전자적 변화는, 환자 체내에서 표적 단백질 또는 기타 치료 물질 분비를 발생시킴은 자명한 사실이다.
여러가지 구현예의 특징 조합을 포함한 본 발명의 다양한 구현예가 당업자에게서 이루어질 것이다. 본 발명의 범위는 청구의 범위에 의해서만 한정된다. 또한 청구의 범위와 관련하여 사용된 "포함하다", "함유하다" 또는 "가지다" 및 이들의 어미 변환어에 대한 혼선을 피하기 위하여, 이들 용어는 "반드시 제한적인 것이 아닌 의미로서, 포함한다"는 것을 의미한다.

Claims (4)

  1. 진피 조직의 세포들 및 기질을 포함한 복수 개의 진피 성분들로 이루어지며 표피층을 포함하지 않는, 생조직(living tissue)의 외식편(explant)인 진피 미세 기관(dermal micro-organ)으로서, 그들이 유래한 진피 조직의 미세구조 및 3차 구조를 유지하고, 진피 미세 기관에서의 불충분한 영양 및 노폐물의 축적으로 인한 세포 독성과 그에 따른 사멸을 최소화하기 위해, 진피 미세 기관 세포로의 영양분 및 가스의 수동적 확산 및 진피 미세 기관 세포 밖으로의 세포 노폐물의 확산을 허용하도록 선택된 크기를 가지며, 이때 상기 진피 미세 기관의 길이가 5~100 ㎜이고, 상기 진피 미세 기관 횡단면의 하나 이상의 크기가 0.5~3.5 ㎜이며, 시험관 내에서 몇 개월간 유지될 수 있는 것을 특징으로 하는 진피 미세 기관.
  2. 제1항에 있어서, 케라틴을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 진피 미세 기관.
  3. 제1항에 있어서, 지방 조직을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 진피 미세 기관.
  4. 제1항에 있어서, 상기 진피 미세 기관은 생체적합성 잉크 또는 착색제에 의해 이식 전에 착색되는 것을 특징으로 하는 진피 미세 기관.
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