PT1653807E

PT1653807E - Micro-órgãos dérmicos, métodos e dispositivos para produção e utilização dos mesmos

Info

Publication number: PT1653807E
Application number: PT04760621T
Authority: PT
Inventors: Stephen F Bellomo; Itzhak Lippin; Guillermo Alberto Piva; Lior Rosenberg; Mordechay Bukhman; Baruch S Stern; David Shalhevet; Menachem D Shavitt; Andrew L Pearlman; Shani Noam; Einat Almon
Original assignee: Medgenics Inc
Priority date: 2003-05-01
Filing date: 2004-04-29
Publication date: 2012-07-23
Also published as: KR101249877B1; JP5129382B2; EP1653807B1; IL171501A; EP1653807A4; US9101595B2; JP2007527853A; IL213283A0; KR101134435B1; IL213282A0; KR20120049398A; KR20110089461A; CN1816280A; KR20120102152A; WO2013118109A8; US20170143374A1; US8771291B2; EP2936984A1; KR20110089460A; WO2013118109A1

Description

1 ΡΕ1653807

DESCRIÇÃO "MICRO-ÓRGÃOS DÉRMICOS, MÉTODOS E DISPOSITIVOS PARA PRODUÇÃO E UTILIZAÇÃO DOS MESMOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção refere-se ao campo do tecido com base em micro-órgãos, tecido terapêutico com base em micro-órgãos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO São conhecidos vários métodos para distribuir agentes terapêuticos. Por exemplo, os agentes terapêuticos podem ser distribuídos oralmente, transdermicamente, por inalação, por injecção e por depósito com libertação lenta. Em cada um destes casos o método de distribuição é limitado pelos processos corporais aos quais o agente é sujeito, pela necessidade de administração frequente, e limitações no tamanho das moléculas que podem ser utilizadas. Para alguns dos métodos, a quantidade de agente terapêutico varia entre as administrações.

Um micro-órgão dérmico (DM0) , que pode ser mantido fora do corpo ("ex-vivo" ou "in-vitro") num estado autonomamente funcional durante um periodo de tempo prolongado, e em que várias manipulações podem ser aplicadas, pode então ser implantado subcutaneamente ou no corpo com o 2 ΡΕ1653807 propósito de tratar doenças, ou distúrbios, ou para propósitos de cirurgia plástica. 0 DM0 pode ser modificado para expressar um produto de gene de interesse. Estes micro-órgãos dérmicos modificados são geralmente referidos como Micro-Órgãos Dérmicos Terapêuticos (DTMOs).

Observou-se que os micro-órgãos da pele, incluindo camadas de tecidos epidérmicos e dérmicos, por exemplo; como delineado na PCT/ILO2/0S80, estavam associados com um número de desafios clinicos. A colheita de uma amostra de pele deixa uma ferida superficial no doente que pode durar várias semanas e pode deixar cicatrizes. A amostra de pele colhida necessita de processamento significativo para produzir micro-órgãos a partir desta amostra. Também se verificou que o implante de micro-órgãos de pele subcutaneamente ou mais profundamente no corpo resultava no desenvolvimento de quistos de queratina ou microquistos de queratina. Adicionalmente, o implante de micro-órgãos de pele como um enxerto numa superfície de pele em "incisões" requer uma experiência técnica significativa de modo a manipular o MO embora mantendo a sua própria orientação. A colheita de derme, e.g., a ser utilizada como um "material de enchimento" num procedimento de cirurgia plástica ou cosmético, é conhecido na técnica. As técnicas de colheita convencionais incluem a utilização de um dermátomo ou lâmina para retirar uma camada de epiderme de modo a expor uma secção da derme. 0 dermátomo ou lâmina pode ser então utilizada de novo para recolher manualmente a secção da derme exposta. 3 ΡΕ1653807

Outro dispositivo convencional para colheita de derme, embora não normalmente utilizado, é o Martin Dermal Harvester comercializado por Padgett (Parte N° P-225) para a indicação de colheita de núcleos dérmicos das costas para subsequente implante nos lábios durante procedimentos cosméticos de aumento de lábios. Para operar este dispositivo, que não é normalmente utilizado, um tubo de corte afiado, que inclui um tubo reutilizável de parede fina com um diâmetro interno de aproximadamente 4,5 mm, é manualmente rodado a uma velocidade muito lenta. Utilizando este tipo de dispositivo requer geralmente a aplicação de pressão na superfície da pele directamente acima do sítio de colheita e instalação de suturas com arrastamento activo à medida que o tubo de corte é empurrado para a frente. Além disso, a derme recolhida resultante não é geralmente uniforme em dimensões e inclui "rolhões" de epiderme em qualquer das extremidades do núcleo dérmico.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção como definido nas reivindicações 1-12 em anexo, refere-se em primeiro lugar a um micro-órgão dérmico geneticamente modificado que expressa pelo menos um produto de gene recombinante, em que o, pelo menos um produto de gene recombinante é um agente terapêutico, em que o referido micro-órgão dérmico é um explante de tecido vivo consistindo essencialmente numa pluralidade de componentes dérmicos e que não inclui camadas epidérmicas 4 ΡΕ1653807 que retêm a microarquitectura e a estrutura tridimensional do tecido dérmico a partir do qual são derivados, possuindo dimensões selecionadas de modo a permitirem difusão passiva de nutrientes adequados e qases para as células do referido micro-órgão dérmico e eliminação do lixo celular por difusão das referidas células de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de lixo no referido micro-órgão dérmico em que uma dimensão do comprimento é 10-60 mm, em que pelo menos uma dimensão de secção cruzada é 0,5-3,5 mm, em que pelo menos algumas das referidas células expressam pelo menos uma porção de pelo menos um produto de gene recombinante, e em que o referido micro-órgão dérmico é mantido como um explante, in vitro durante vários meses, e em que o referido micro-órgão dérmico geneticamente modificado para utilização num método de tratamento, em que o micro-órgão dérmico geneticamente modificado é implantado na ou sob a pele de um sujeito receptor e em que o micro-órgão dérmico geneticamente modificado produz e segrega o referido pelo menos um produto de gene recombinante. A invenção refere-se também à utilização de um micro-órgão dérmico geneticamente modificado que expressa pelo menos um produto de gene recombinante, em que pelo menos um produto de gene recombinante é um agente terapêutico, em que o referido micro-órgão dérmico é um explante de tecido vivo consistindo essencialmente numa pluralidade de componentes dérmicos e não incluindo camadas epidérmicas, que retêm a microarquitectura e estrutura 5 ΡΕ1653807 tridimensional do tecido dérmico a partir do qual são derivados, possuindo dimensões selecionadas de modo a permitir a remoção de lixo das referidas células por difusão celular de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de lixo no referido micro-órgão dérmico em que uma dimensão do comprimento é 10-60 mm, em que pelo menos uma dimensão de secção cruzada é 0,5-3,5 mm, em que pelo menos algumas das referidas células expressam pelo menos uma porção de pelo menos um produto de gene recombinante, e em que o referido explante micro-órgão dérmico é mantido como um explante, in vitro durante vários meses, para determinação in vitro do nivel de secreção de pelo menos um produto de gene recombinante. É aqui revelado um DMO/DTMO com a capacidade para ser mantido ex-vivo num estado geralmente viável, que pode permitir que várias manipulações sejam efectuadas no DMO, embora mantendo uma elevada produção e nivel de secreção do agente terapêutico desejado. Adicionalmente, é aqui revelado um método de colheita de um DMO e subsequentemente o implante de um DTMO sem formar quistos de queratina ou microquistos de queratina, e.g., após implante do DTMO subcutaneamente ou mais profundamente no corpo. Além disso, deve ser entendido pelas pessoas especialistas na técnica que os métodos e dispositivos de acordo com algumas formas de realização podem ser relativamente não complicadas e, deste modo, o nivel de especialidade necessária a um profissional para efectuar métodos e/ou utilizar os 6 ΡΕ1653807 dispositivos pode não ser tão exigente como o necessário para procedimentos convencionais. É aqui revelado um micro-órgão dérmico (DM0) possuindo uma pluralidade de componentes dérmicos, que pode incluir células do tecido dérmico e uma matriz circundante. 0 DM0, de acordo com formas de realização da invenção, pode geralmente reter uma microarquitectura e estrutura tridimensional do órgão dérmico a partir do qual é obtido e as dimensões do DM0 podem permitir a difusão passiva de nutrientes adequados e gases para as células e remoção do lixo celular por difusão das células de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de lixo.

Em algumas formas de realização exemplificativas da invenção, o micro-órgão dérmico da invenção não produz queratina ou produz quantidades negligenciáveis de quera-tina.

Em algumas formas de realização da invenção, o micro-órgão dérmico não produz queratina e ou quistos de queratina após implante subcutâneo ou implante mais profundo num corpo.

Numa outra forma de realização da invenção, o micro-órgão dérmico produz microquistos de queratina após o que atrofia num período de tempo relativamente curto, e.g., dias ou semanas após implante subcutâneo. 7 ΡΕ1653807

Em outra forma de realização, o micro-órgão dérmico da invenção contém foliculos de cabelo e glândulas sebáceas, que atrofiarão após um curto período de tempo, e.g., dias ou semanas.

Numa outra forma de realização, o micro-órgão dérmico da invenção contém glândulas que ligarão a superfície da pele após um curto período de tempo, e.g., dias ou semanas. São ainda aqui revelados um método e dispositivo de colheita de um micro-órgão dérmico. 0 método pode incluir estabilizar e/ou suportar uma estrutura de tecido relacionada com a pele a partir da qual um micro-órgão dérmico deverá ser colhido, e.g., de modo que a estrutura de tecido relacionada com a pele é mantida numa forma e/ou posição desejada, separando pelo menos uma porção do micro-órgão dérmico da estrutura de tecido relacionada com a pele, e isolando o micro-órgão dérmico separado do corpo. A configuração de suporte pode incluir um primeiro elemento tubular, e o utensílio de corte pode incluir um segundo elemento tubular adaptado para ser inserido ao longo de e substancialmente coaxialmente com o primeiro elemento. A configuração de suporte pode incluir uma câmara de vácuo possuindo uma superfície de suporte interno capaz de manter a estrutura relacionada com a pele numa forma e/ou posição desejada para permitir que o utensílio de corte separe o DM0 da estrutura relacionada com a pele. ΡΕ1653807 É ainda aqui revelado um micro-órgão dérmico geneticamente modificado que expressa pelo menos um produto de gene recombinante possuindo o micro-órgão dérmico uma pluralidade de componentes dérmicos, incluindo células e matriz do tecido dérmico, que retêm a microarquitectura e estrutura tridimensional do tecido dérmico a partir do qual são obtidos, e possuindo dimensões seleccionadas de modo a permitir a difusão passiva de nutrientes adequados e gases para as células e remoção do lixo celular das células por difusão de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de lixo, em que pelo menos algumas das células do micro-órgão dérmico expressa pelo menos um produto de gene recombinante ou pelo menos uma porção do referido pelo menos um produto de gene recombinante. É ainda aqui revelado um micro-órgão dérmico geneticamente modificado que expressa pelo menos uma proteina recombinante, possuindo o micro-órgão dérmico uma pluralidade de componentes dérmicos, incluindo células e matriz do tecido dérmico, que retém a microarquitectura e estrutura tridimensional do tecido dérmico a partir do qual é obtido, e possuindo dimensões seleccionadas de modo a permitir a difusão passiva de nutrientes adequados e gases para as células e remoção do lixo celular das células por difusão de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de lixo, em que pelo menos algumas das células do micro-órgão 9 ΡΕ1653807 dérmico expressam pelo menos uma porção de pelo menos uma proteína recombinante.

Em algumas formas de realização, o micro-órgão dérmico geneticamente modificado da invenção não produz substancialmente queratina. É aqui revelado um método de distribuição a um receptor de um produto de gene recombinante produzido pelo micro-órgão dérmico. É aqui revelado um método de indução de um efeito fisiológico local ou sistémico através de implante de um micro-órgão dérmico num receptor. É aqui também revelado um método de distribuição de uma proteína de interesse a um indivíduo. 0 método inclui o implante do micro-órgão dérmico geneticamente modificado na pele, sob a pele ou em outras localizações no corpo.

Adicionalmente, é aqui revelado um método de implante de um micro-órgão dérmico de modo a evitar ou a reduzir a formação de quisto de queratina.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As formas de realização não limitantes são descritas na descrição que se segue, a ser lida com 10 ΡΕ1653807 referência às figuras a esta ligada. Nas figuras, as estruturas idênticas e semelhantes, elementos ou partes destas que aparecem em mais do que uma figura são geralmente marcadas com as mesmas referências ou semelhantes nas figuras em que aparecem. As dimensões de componentes e caracteristicas apresentadas nas figuras são primariamente selecionadas para conveniência e clareza de apresentação e não estão necessariamente à escala. A Figura 1 é um diagrama em bloco esquemático de um método exemplificativo de produzir e utilizar micro-órgãos dérmicos terapêuticos (DTMOs), de acordo com uma forma de realização exemplificativa da invenção;

As Figuras 2A e 2B mostram, respectivamente, uma análise de correlação entre a secreção in vitro de mlFNa-TMOs e hEPO-TMOs pré-implantados e os niveis de soro in vivo após o seu implante;

As Figuras 3A e 3B mostram, respectivamente, niveis elevados de hEPO no soro determinados por um Ensaio ELISA e subida da contagem de reticulócitos após implante autólogo de TMO num suino miniatura; A Figura 4 é uma ilustração esquemática de um gráfico que mostra os niveis de secreção da eritropoietina humana (hEPO) de DTMO-hBPO preparado a partir de seis peles humanas diferentes; 11 ΡΕ1653807 A Figura 5: mostra a histologia de DTMO e a TMO de pele de espessura parcial; A Figura 6 mostra a imuno-histoquimica (IHC) e a coloração com Hematoxilina & Eosina (H&E) de DTMO; A Figura 7 demonstra os niveis de soro de hEPO In vivo e o efeito fisiológico nos niveis de hematócrito após implante subcutâneo de DTMO-hEPO e TMO-hEPO de pele de espessura parcial em murganhos SCID; A Figura 8 demonstra a análise clinica e histológica de DTMO-hEPO e o TMO-hEPO de pele de espessura parcial implantado subcutaneamente em murganhos SCTD; A Figura 9 mostra a análise histológica de MOs da pele enxertados em fendas da pele (MO de espessura parcial, direita) ou implantada S.C. (DMO, Esquerda) 17 dias após implante em voluntários humanos; A Fig. 10 é um diagrama de fluxo esquemático que ilustra um método de colheita de um DMO;

As Figs, lla-llc são ilustrações esquemáticas de estádios exemplificativos de colheita de um DMO de acordo com o método da Fig. 10; A Fig. 12 é uma ilustração esquemática de um utensilio de gancho que pode ser utilizada por um dispositivo de colheita dérmica; 12 ΡΕ1653807 A Fig. 13 é uma ilustração esquemática de um dispositivo de colheita dérmica incluindo um tubo de perfuração numa fonte de tecido para um DM0, e colheita coaxial com uma agulha guia interna;

As Figs. 14a- 14c são ilustrações esquemáticas de vista frontal, uma vista lateral, e vista de topo, respectivamente, de um dispositivo de colheita dérmica em vácuo; A Fig. 15 é uma ilustração esquemática de uma vista lateral transversal do dispositivo das Figs 14a-14c que suporta um micro-órgão dérmico numa posição desejada; A Fig. 16 é uma ilustração esquemática de uma vista transversal do dispositivo da Fig. 15 que suporta externamente um micro-órgão dérmico a ser colhido numa posição desejada; A Fig. 17 é uma ilustração esquemática de um dispositivo de colheita dérmica; A Fig. 18 é uma ilustração esquemática de um dispositivo de colheita; A Fig. 19 é uma ilustração esquemática da implementação do dispositivo de colheita da Fig. 18 para colheita de um DM0; 13 ΡΕ1653807 A Fig. 20 é uma ilustração em diagrama de fluxo de um método de implante de DTMO; A Fig. 21 é um diagrama de fluxo que ilustra um método de ablação de um DTMO; e A Fig. 22 é uma ilustração esquemática de um sistema para processamento de um DM0 colhido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO EXEMPLIFICATIVAS A descrição que se segue é apresentada para permitir que normal especialista da técnica produza e utilize a invenção como proporcionado no contexto de uma aplicação particular e seus requisitos. Noutros casos, os métodos, procedimentos, e componentes bem conhecidos não foram descritos em detalhe de modo a não obscurecer a presente invenção.

Na descrição detalhada que se segue, são apresentados vários detalhes específicos de modo a proporcionar uma compreensão exaustiva da present invenção. Contudo, deverá ser entendido pelos especialistas na técnica que a presente invenção pode ser posta em prática sem estes detalhes específicos. 14 ΡΕ1653807

DEFINIÇÕES EXEMPLIFICATIVAS DOS TERMOS AQUI

UTILIZADOS O termo "explante" como aqui utilizado, refere-se, em algumas formas de realização da invenção, a uma secção removida de tecido vivo ou órgão de um ou mais tecidos ou órgãos de um indivíduo. 0 termo "micro-órgão dérmico" ou "DM0" como aqui utilizado, refere-se em algumas formas de realização da invenção, a uma estrutura de tecido ou órgão isolados derivados de um ou idênticos a um explante que foi preparado de uma maneira que conduz a viabilidade celular e função, embora mantendo pelo menos algumas interacções in vivo semelhantes às dos tecidos ou órgãos a partir dos quais foram obtidos. Os micro-órgãos dérmicos podem incluir uma pluralidade de componentes dérmicos que retêm a microarquitectura do tecido ou órgão a partir do qual foram derivados, e estrutura tridimensional do tecido dérmico a partir do qual foram derivados, possuindo dimensões seleccionadas de modo a permitir a difusão passiva de nutrientes adequados e gases para células no MO e remoção do lixo celular das células do MO por difusão de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de lixo. Os micro-órgãos dérmicos podem consistir essencialmente numa pluralidade de componentes da derme (componentes do tecido da pele localizados abaixo da epiderme). Estes componentes podem conter fibroblastos da pele, células epiteliais, 15 ΡΕ1653807 outros tipos de células, bases de folículos de cabelo, terminais nervosos, glândulas sudoríparas e sebáceas, e vasos sanguíneos e linfáticos. Sempre que utilizado a seguir, a descrição das formas de realização relacionadas com o MO refere-se também a MO dérmico. Sempre que o termo "tecido dérmico" é utilizado, refere-se também a "órgão dérmico".

Como aqui utilizado, o termo "microarquitectura" refere-se à caracteristica do explante em que as células da população, mantêm, in vitro, o seu contacto fisico e/ou funcional com pelo menos uma célula ou substância não celular com que estavam em contacto fisico e/ou funcional in vivo. De um modo preferido, as células do explante mantêm pelo menos uma actividade biológica do órgão ou tecido do qual foram isoladas. 0 termo "dador" como aqui utilizado, refere-se em algumas formas de realização da invenção a um individuo, do qual o explante é removido e utilizado para formar, ou que já está na forma de, um ou mais micro-órgãos. 0 termo "micro-órgão terapêutico (TMO)" como aqui utilizado, refere-se em algumas formas de realização da invenção a um micro-órgão (MO) que pode ser utilizado para facilitar um objectivo terapêutico, tal como, por exemplo, um MO que foi geneticamente alterado ou modificado para produzir um agente terapêutico, tal como uma proteina ou e molécula de RNA. 0 agente terapêutico pode não ser uma 16 ΡΕ1653807 substância que ocorre naturalmente no corpo. Sempre que que aqui utilizado, a descrição das formas de realização relacionadas com TMO refere-se também a um DTMO que é um MO dérmico terapêutico que é geneticamente modificado. 0 termo "implante" como aqui utilizado, refere-se em algumas formas de realização, para a introdução de um ou mais TMOs ou DTMOs num receptor, em que os referidos TMOs ou DTMOs podem ser derivados de tecidos do receptor ou de tecidos de outro individuo ou animal. Os TMOs ou DTMOs podem ser implantados numa fenda na pele, através de implante subcutâneo, ou através de colocação em outros sitios desejados no corpo do receptor. 0 termo "receptor" como aqui utilizado refere-se, em algumas formas de realização da invenção, a um individuo, no qual um ou mais TMOs ou DTMOs são implantados. 0 termo "apertar" (e.g., a pele) como aqui utilizado pode referir-se a qualquer acção semelhante ou qualquer acção com um propósito semelhante, por exemplo, "beliscar" (e.g., a pele). 0 termo "in vitro" como aqui utilizado deve ser entendido como excluindo "ex vivo”. "agulha 0 termo "tubo de perfuração" como aqui utilizado pode relacionar-se, individualmente ou colectivamente, com os termos "utensílio de corte", "tubo de corte" e 17 ΡΕ1653807 interna", assim como com quaisquer outros elementos com funcionalidades semelhantes.

Enquanto, para clareza e para completar a apresentação, todos os aspectos da produção e utilização de DTMOs são descritos neste documento, e formas de realização da invenção são descritas desde o inicio dos processos até ao seu fim, deve ser entendido que cada um dos aspectos aqui descritos pode ser utilizado com outras metodologias e/ou equipamento para a realização de outros aspectos e pode ser utilizado para outros propósitos, alguns dos quais são aqui descritos. A presente revelação inclui porções dedicadas à preparação e manutenção de micro-órgãos dérmicos para transformação em DTMOs. Deve ser entendido que os micro-órgãos dérmicos produzidos de acordo com estes aspectos podem ser utilizados para outros propósitos que não os de transformação em DTMOs. 0 micro-órgão é um micro-órgão dérmico incluindo uma pluralidade de componentes da derme, por exemplo, fibroblastos e/ou componentes epiteliais contendo extremidades nervosas e/ou glândulas sudoríparas e/ou glândulas sebáceas e/ou vasos sanguíneos e linfáticos e/ou fibras de elastina e/ou fibras de colagénio e ou componentes endoteliais e/ou células derivadas do sistema imunitário e/ou matriz extracelular. Como apresentado pelos resultados de teste resumidos na secção dos Exemplos a seguir (Exemplo 5, Figura 8), implante subcutâneo convencional de um micro-órgão incluindo camadas epidérmicas ("MO de pele de 18 ΡΕ1653807 espessura parcial") em murganhos e porcos (dados em porcos não são apresentados), pode resultar na formação de quistos de queratina ou macro-quistos de queratina. Em contraste, quando o tecido de pele é amostrado para obter um DM0, não são observados quistos ou macroquistos em murganhos, porcos ou em humanos. Deve ser notado que a actividade biológica (por exemplo, secreção de uma proteina terapêutica, e.g., eritropoietina e subida do hematócrito como um resultado) de um DTMO pode ser comparável a ou mesmo maior do que a de um TMO derivado de pele de espessura parcial (ver Exemplo 4). Nomeadamente, alguns tipos de preparação podem libertar a mesma quantidade de eritropoietina; contudo, o DTMO pode produzir e segregar níveis de proteína superiores por unidade do que os TMO derivados de espessura parcial.

Em geral, a produção de DTMOs pode incluir a colheita de DMO, mantendo o DM0 e/ou modificando o DM0 e/ou alterando-o geneticamente e, em algumas formas de realização, verificando a produção de um agente desejado (por exemplo proteínas) pelo DMO. A utilização do DTMO pode incluir a produção, no próprio corpo do doente ou animal, de substância terapêutica, tal como proteínas, para o tratamento de um indivíduo. Por exemplo, o DTMO pode ser implantado na ou sob a pele ou no corpo do indivíduo para produzir o agente/proteína in vivo. No caso de tecido de outro sujeito, o implante é opcionalmente protegido da reacção pelo sistema imunitário do, por exemplo, alojando o DTMO numa cápsula ou camada imunoprotectora. Por exemplo, uma membrana pode ser posicionada para circundar o DTMO, 19 ΡΕ1653807 colocando o DTMO numa cápsula antes do implante ou de outra forma. A membrana deve ter um tamanho de poro que é suficientemente larga para permitir a passagem de nutrientes, residuos e o agente terapêutico e ainda suficientemente pequeno para evitar a passagem de células do sistema imunitário. 0 DM0 não inclui camadas da epiderme.

Numa forma de realização da invenção, o DM0 inclui toda a secção longitudinal da derme. Em outra forma de realização da invenção, o micro-órgão dérmico inclui parte da secção longitudinal da derme. Numa outra forma de realização, o DM0 inclui a maior parte da secção longitudinal da derme, nomeadamente, a maior parte das camadas e componentes da derme incluindo a derme papilar e reticular. Numa outra forma de realização, o DM0 inclui primariamente tecido dérmico, mas pode também incluir tecido gordo. Em algumas formas de realização da invenção, o DM0 não produz queratina ou produz uma quantidade negligenciável de queratina, prevenindo deste modo a formação de quistos de queratina após implante subcutâneo num receptor. 0 DM0 a ser colhido pode ser removido do corpo por qualquer meio de remoção de tecidos conhecido na técnica, tal como os procedimentos de biópsia. 0 procedimento de colheita mantém intacta a microarquitectura do tecido a partir do qual é removido. Numa forma de realização o DM0 pode ser obtido por biópsia directa e ser então cortado 20 ΡΕ1653807 para o tamanho necessário ou não ter nenhum corte desejado a partir do tecido. Numa outra forma de realização, uma amostra de tecido pode ser obtida por biópsia directa, em que o tamanho desejado do micro-órgão dérmico é obtido e não é necessário outro processamento.

Em algumas formas de realização aqui reveladas, o micro-órgão dérmico é directamente recolhido do corpo, e as dimensões de um utensílio de corte utilizado para recolher o micro-órgão dérmico podem ter, por exemplo, cerca de 1 -4 mm de diâmetro. Em outra forma de realização, a dimensão pode ter, por exemplo, 1,71 mm de diâmetro. Em outra forma de realização a dimensão pode ter, por exemplo, 1-3 mm em diâmetro. Em outra forma de realização, a dimensão pode ter, por exemplo, 2-4 mm em diâmetro. Em outra forma de realização a dimensão pode ter, por exemplo, 1-2 mm de diâmetro. Em outra forma de realização a dimensão pode ter, por exemplo, cerca de 1,5 mm de diâmetro. Em outra forma de realização, a dimensão pode ter, por exemplo, cerca de 2 mm de diâmetro. Em algumas formas de realização, o micro-órgão dérmico recolhido pode não reter a sua forma cilíndrica após colheita, i.e., pelo menos uma dimensão da sua secção longitudinal pode expandir-se enquanto pelo menos outra dimensão da sua secção longitudinal pode contrair. Numa forma de realização, por exemplo, pelo menos uma dimensão pode ter 0,5 - 3,5 mm e pelo menos uma dimensão pode ter 1,5 — 10 mm. as dimensões do

Em outra forma de realização 21 ΡΕ1653807 tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 5 -100 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 10 - 60 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 20 - 60 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ser, por exemplo, cerca de 20 - 50 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 20 - 40 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 20 -100 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 30 — 100 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 40 - 100 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 50 - 100 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 60-100 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ser de, por exemplo, cerca de 70 - 100 mm de comprimento. Noutra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 80 - 100 mm de comprimento. Em outra forma de realização, as dimensões do tecido a ser colhido podem ter, por exemplo, cerca de 90 - 100 mm, um dispositivo biorreactor fechado, estéril, pode ser 22 ΡΕ1653807 utilizado para efectuar, suportar e/ou alterar o DM0 ou DTMO ao longo de uma recolha, com mm de comprimento. Em outra forma de realização o comprimento pode ter cerca de 20 mm. Em outra forma de realização, o comprimento pode ter cerca de 30 mm. Em outra forma de realização, o comprimento pode ter cerca de 40 mm.

Quando um MO dérmico tem as dimensões listadas acima, pode ser mantido in vitro, e.g., num meio de crescimento sob as condições de cultura de tecido durante periodos de tempos prolongados, por exemplo, vários dias, várias semanas ou vários meses. 0 DM0 pode ser mantido, por exemplo, in vitro em meios de crescimento definidos. Numa forma de realização exemplificativa, os meios de crescimento podem incluir factores de crescimento, soro de vitelo fetal (FCS), ou soro humano, e.g., Substituto Sintético de Soro (SSS). Em outra forma de realização exemplificativa os meios de crescimento podem incluir soro do indivíduo dador ou do receptor. Ainda em outra forma de realização os meios de crescimento podem incluir soro autólogo. É aqui revelado um dispositivo biorreactor fechado, estéril, que pode ser utilizado para efectuar, suportar e/ou alterar o DM0 ou DTMO ao longo de uma colheita, processo de alteração e implante, e.g., da colheita ao implante, como descrito em detalhe a seguir, e.g., com referência à Fig. 22. De acordo com algumas formas de realização exemplificativas, pelo menos parte do dispositivo biorreactor pode ser formado com material descartável. 23 ΡΕ1653807

Aqui revelado, o biorreactor dispositivo pode ser colocado numa estação de ancoragem, que pode ser utilizada realizar vários processos e/ou para manter o DMO/DTMO sob condições desejadas. 0 dispositivo pode ser opcionalmente um computador controlado de acordo com um protocolo.

De acordo com um aspecto de algumas formas de realização aqui reveladas, apenas uma porção do DTMO produzido pode ser utilizada numa determinada sessão de tratamento. 0 restante tecido DTMO pode ser devolvido para manutenção e/ou pode ser armazenado (e.g., criogenicamente ou de outra forma) para utilizar mais tarde. É uma caracteristica de algumas formas de realização aqui reveladas que um grande número de micro-órgãos dérmicos podem ser processados em conjunto num processo em série em DTMOs, como descrito a seguir. Isto pode permitir um processamento mais conveniente, mas não permitirá a determinação do nivel de secreção de cada DTMO separadamente .

Em algumas formas de realização exemplificativas da invenção pode ser realizado um ensaio de potência para o agente terapêutico, que pode ser produzido e/ou segregado por um único DTMO ou uma série de DTMOs. 0 ensaio de potência pode incluir, por exemplo, um ensaio de proliferação de células em que a resposta de proliferação das células é principalmente dependente da presença do agente terapêutico nos meios de crescimento das células. 24 ΡΕ1653807 O termo "estrutura relacionada com a pele", como aqui utilizado, refere-se a uma estrutura de componentes de tecido que pode ser estabilizada e ou suportada pelos dispositivos aqui definidos para permitir a colheita de um micro-órgão dérmico. A estrutura de tecido relacionada com a pele pode incluir componentes do tecido epidérmico, e componentes do tecido dérmico. Opcionalmente, a estrutura de tecido relacionada com a pele pode incluir tecido gordo e/ou tecido muscular na vizinhança do tecido dérmico.

Aqui revelado, um método de colheita do micro-órgão dérmico pode incluir a estabilização e suporte de uma estrutura relacionada com a pele a partir da qual o micro-órgão dérmico vai ser colhido, e.g., de modo a que pelo menos o micro-órgão dérmico e/ou um ou mais de outros segmentos de tecido na sua vizinhança são mantidos numa forma e/ou posição desejada, separando pelo menos uma porção do micro-órgão dérmico do tecido circundante, e extraindo o micro-órgão dérmico separado, como descrito em detalhe a seguir. A Figura 1 mostra uma vista geral de uma metodologia 200 para produção e utilização de DMOs e DTMOs, em forma de diagrama de blocos. No bloco 202 um DM0 é colhido de um indivíduo. Em algumas formas de realização da invenção, o DM0 é colhido do mesmo indivíduo a quem a terapia será mais tarde aplicada. Na invenção, o DM0 é de um tecido dérmico. Enquanto o método descrito a seguir é 25 ΡΕ1653807 exemplificativo, outros métodos de colheita de amostras de tecido podem ser utilizados. Se desejado, o DM0 pode ser criogenicamente armazenado para utilização posterior (i.e., a introdução no mesmo estádio do processo). Alternativamente, para certas formas de realização, o DM0 pode ser implantado directamente de novo no doente a partir do qual foi colhido para produzir um efeito terapêutico, cosmético, ou outro fisiológico.

De modo a que o DM0 seja um micro-órgão viável, deve ter pelo menos uma dimensão que é suficientemente pequena para que os nutrientes possam difundir para todas as células do DM0 a partir do meio de nutrientes que contacta o DM0 e que os produtos de excreção possam difundir para fora do DM0 e para o meio. Isto permite que o DM0 seja viável in vitro o tempo suficiente para o processamento posterior descrito a seguir e para a outra utilização opcional do DM0 como uma fonte para um agente terapêutico, tal como uma proteína. 0 método de colheita de um DM0 como descrito acima, resulta geralmente num DM0 possuindo um tempo de vida in vitro de vários meses.

Após a colheita do DM0, é opcionalmente inspec-cionado visualmente para determinar que é formado de forma apropriada e que tem as dimensões desejadas. A inspecção pode também ser efectuada opticamente. É então opcionalmente montado num suporte e transportado (bloco 206) para um dispositivo (o biorreactor, como será descrito a seguir) em que pode ser geneticamente alterado. Um agente de modi- 26 ΡΕ1653807 ficação genética adequado é preparado (bloco 208). Métodos alternativos exemplificativos de preparação do agente incluem a criação de aliquotas com uma quantidade desejada utilizando um tampão de diluição pré-definido do agente de modificação tal como, por exemplo, um vector virai, possível armazenamento criogénico e descongelamento do agente de modificação, sob temperatura controlada (0-4 °C), e validação da actividade do agente de modificação. Todos estes processos são bem conhecidos na técnica. Neste ponto, o DM0 pode ser criogenicamente armazenado, para posterior introdução no mesmo local no processo. Isto pode ser efectuado utilizando protocolos conhecidos para o congelamento gradual de tecidos e células, utilizando por exemplo, meio DMEM contendo DMSO a 10%.

No bloco 210 o DMO é geneticamente alterado. Como descrito acima, muitos métodos de alteração genética são conhecidos e podem ser utilizados em conjunto com a presente invenção. Como um exemplo, a descrição que se segue é baseada na utilização de um vector virai para inserir um gene nas células do DMO. Este processo é bem conhecido e não será detalhadamente descrito, excepto na metodologia particular e dispositivo para introdução do vírus no DMO.

No bloco 212 o DTMO geneticamente alterado é opcionalmente testado para as taxas de produção e secreção do agente terapêutico. Existem vários métodos de determinação da quantidade da secreção, por exemplo, ELISA, outros 27 ΡΕ1653807 imunoensaios, análise espectral, etc. Adicionalmente, a qualidade da secreção é opcionalmente testada, por exemplo para esterilidade e actividade da proteína segregada. Isto pode ser efectuado periodicamente ou continuamente em tempo real. Neste ponto o DTMO pode ser criogenicamente armazenado para utilização posterior.

Nos blocos 214 e 216, é determinada a quantidade de DTMO necessária para produzir um efeito terapêutico desejado. Como indicado a seguir, as necessidades de dose terapêutica podem ser estimadas a partir das taxas de secreção medidas, parâmetros do doente e estatística da população na relação estimada ou conhecida entre a secreção in vitro e níveis de soro in vivo.

No bloco 218 o número seleccionado de DTMOs é aplicado nos utensílios de implante. Os utensílios de implante exemplificativos foram descritos acima. Se necessário, para aloenxertos ou xenoenxertos ou para outras razões, o DTMO pode ser encapsulado. Se o DTMO tem de ser transportado antes de ser transportado para os utensílios de implante, é opcionalmente mantido (220) numa estação de manutenção, em que a temperatura, humidade, etc. são mantidos em níveis que permitem que o DTMO permaneça viável durante o transporte. 0 restante material de DTMO é opcionalmente mantido in vitro para futura utilização. Este pode estar em condições de incubadora quente (30-37 °C), em condições como descrito acima ou em condições de incubadora de frio (4 °C) , que pode prolongar a sua viabilidade in vitro. 28 ΡΕ1653807

No bloco 224, um subconjunto dos DTMOs é implantado no indivíduo. Uma forma de realização exemplificativa de um método de implante é descrita acima. Outros métodos de fazer isso ocorrerão às pessoas especialistas na técnica e são primariamente dependentes da geometria específica do micro-órgão a ser utilizado. Os estudos em animais mostraram que os DMOs e DTMOs permanecem viáveis in vivo, no sentido em que o DTMO continua para produzir e segregar o agente terapêutico durante um período de semanas e meses após o implante (Figura 7). Em estudos animais, as quantidades terapêuticas são produzidas durante períodos até 160 dias (ou mais) . Enquanto o tecido do DMO ou DTMO parece ser integrado ou bem incorporado no tecido do indivíduo em que é implantado (especialmente se o tecido é implantado num tecido do mesmo género do qual foi colhido), as células incluindo o DMO ou o DTMO continuam a produzir e segregar o agente terapêutico.

Em qualquer dos casos, o desempenho in vivo do DTMO é opcionalmente determinado (bloco 228) . Com base nesta avaliação, por exemplo, e/ou em dados passados de doentes (bloco 226), a dosagem do doente pode então ser ajustada (bloco 230) aumentando a quantidade do implante ou removendo algum do implante, como descrito a seguir. Como a eficácia do implante se altera, pode ser implantado um DTMO adicional. A alteração genética pode geralmente incluir a 29 ΡΕ1653807 manipulação genética de um gene ou genes seleccionados nas células que levam as células a produzir e opcionalmente a segregar um agente terapêutico desejado tal como uma proteína. Numa forma de realização da invenção, pelo menos parte do processo de manter o DM0 durante a alteração genética, assim como a própria alteração genética, pode ser efectuada num biorreactor, como descrito a seguir. É agora feita referência à Fig. 10, que ilustra esquematicamente um diagrama de fluxo de um método de colheita de um micro-órgão dérmico de acordo com algumas formas de realização exemplificativas da invenção, e às Figs. lla-llc, que ilustra esquematicamente estádios exemplificativos de colheita de um micro-órgão dérmico 1160 localizado sob uma porção de tecido de pele 1120 de acordo com o método de Fig. 10.

Como indicado no bloco 1002 , o método pode opcionalmente incluir a administração localmente de um anestésico, e. g., como é conhecido na técnica, na vizi- nhança do DMO a ser colhido.

Como indicado no bloco 1004, o método pode ainda incluir a inserção de um guia interno 1110 na porção de tecido 1120. As incisões na pele ("cortes lancetados”) 1190 e 1130 podem ser formadas na pele exterior, de um modo preferido utilizando uma lanceta cirúrgica, bisturi, ou outra sonda afiada, de modo a permitir a inserção mais fácil do guia interno 1110, e também para prevenir ou 30 ΡΕ1653807 minimizar uma colheita de tecido epidérmico. 0 guia interno 1110 pode ser inserido na porção 1120 via a incisão 1190, e.g., geralmente paralelo à superfície da pele e/ou a uma profundidade desejada na derme ou mesmo sob a pele. O guia interno 1110 pode incluir uma agulha fina, vareta, ou qualquer outro objecto fino adequado, geralmente direito, capaz de ser colocado no interior da derme ou num espaço subcutâneo. Por exemplo, o guia interno 1110 pode incluir uma agulha de tamanho 20-25 G, por exemplo, cerca de 22G, como é conhecido na técnica. O guia interno 1110 pode ser inserido na derme ou espaço subcutâneo e/ou empurrado geralmente horizontalmente, i.e., geralmente em paralelo com a superfície da pele. 0 comprimento da penetração do guia 1110 na derme pode geralmente corresponder ao comprimento do DM0 a ser colhido. Por exemplo, o guia interno 1110 pode ser inserido manualmente, e guiado manualmente pela derme até uma profundidade desejada, profundidade essa que pode ser mantida substancialmente uniformemente ao longo do processo de inserção. Alternativamente, o guia interno 1110 pode ser inserido no e ao longo do espaço subcutâneo, sentido manualmente a margem entre a derme fibrosa e uma camada de gordura fina macia subjacente à medida que o guia interno é inserido.

Como indicado no bloco 1006, o método pode opcionalmente incluir um guia interno 1110 que guie para a saída da pele, e.g., na incisão 1130. De acordo com algumas formas de realização exemplificativas, a distância entre as incisões 1190 e 1130 podem ser aproximadamente iguais a ou 31 ΡΕ1653807 maiores do que um comprimento necessário para que o DM0 seja recolhido.

Como indicado no bloco 1008, o método pode também incluir a inserção de um utensílio tubular de corte coaxialmente com e à volta do guia interno 1110, de modo que o DMO pode ser capturado, i.e., posicionado, entre o guia interno 1110 e o utensílio de corte. Isto pode ser conseguido, por exemplo, utilizando um utensílio tubular de corte possuindo um diâmetro interno maior do que o diâmetro externo do guia interno 1110. O utensílio de corte pode incluir qualquer utensílio de corte adequado, por exemplo, um tubo de perfuração 1150. O tubo de perfuração 1150 pode incluir um utensílio tubular geralmente simetricamente afiado, e.g., um hipotubo processado para ter uma ponta de corte afiada com uma forma desejada. 0 tubo de perfuração 1150 pode incluir, por exemplo, um tubo de grau médico convencional, possuindo uma parede fina, e.g., possuindo uma espessura entre 0,05 mm e 0,3mm. O tubo de perfuração 1150 pode ter um diâmetro, por exemplo, entre 1 mm e 10 mm. As dimensões, e.g., o diâmetro, do tubo de perfuração 1150 e/ou as dimensões do guia interno 1110 podem ser pré-determinadas com base no volume e/ou dimensões do DMO que se pretende recolher. 0 tubo de perfuração 1150 pode ter uma extremidade afiada ("ponta") 1140 adaptada para servir como ponta de corte. 0 tubo de perfuração 1150 pode ser inserido através da porção de tecido 1120, de um modo preferido após ter criado incisões iniciais, E.G., INCISÃO 1130, na superfície externa da pele de modo a prevenir a colheita de tecido epidérmico. 32 ΡΕ1653807

Como ilustrado na Fig. 11b, o método pode incluir o posicionamento inicial da extremidade 1140 do tubo de perfuração 1150 ao longo de uma extremidade distai do guia interno 1110, e.g., na incisão 1130, e tubo de perfuração deslizante 1150 ao longo do comprimento do guia interno 1110, e.g., em direcção à incisão 1190, para recolher o DMO dérmico.

Como indicado no bloco 1010, o método pode incluir a rotação do utensílio de corte enquanto o utensílio de corte avança, e.g., em direcção à extremidade proximal do guia interno. Por exemplo, um berbequim médico ou outro utensílio adequado ou o mecanismo de rotação pode ser utilizado para rodar o tubo de perfuração 1150 enquanto é avançado manualmente ou automaticamente, colhendo deste modo o DMO 1160 de uma forma mais suave. Por exemplo, uma extremidade proximal 1180 do tubo de perfuração 1150 pode ser ligada a um berbequim médico 1170, tal como, por exemplo, o berbequim Aesculap Micro Speed fabricado por

Aesculap AG & Co. KG, Am Aesculap Platz, D-78532 Tuttlingen, Alemanha, que pode incluir uma unidade de controlo, um motor, uma corda de conexão, uma peça manual e/ou um interruptor de pé, números de catálogo GD650, GD658, GB661, GB166 e GB660, respectivamente. Este berbequim, ou qualquer outro berbequim adequado ou mecanismo de rotação, pode ser utilizado para rodar a ponta de corte do utensílio de corte a uma velocidade rotacional apropriada para corte do tecido dérmico, por exemplo, uma 33 ΡΕ1653807 velocidade rotacional relativamente elevado, por exemplo, uma velocidade superior a 1 000 RPM, e.g., entre 1 000 RPM e 10 000 RPM. Por exemplo, o tubo 1150 pode ser rodado a uma velocidade rotacional superior a 2 000 RPM, e.g., aproximadamente 7 000 RPM. Alternativamente, pode ser utilizada uma velocidade rotacional relativamente baixa inferior a menos do que 1000 RPM, ou nenhuma rotação, como descrito a seguir. Opcionalmente, a velocidade rotacional do berbequim pode variar de uma forma oscilatória, i.e., a direcção de rotação pode variar periodicamente entre as direcções do "sentido dos ponteiros do relógio" e do "contra o sentido dos ponteiros do relógio". Enquanto é rodado pelo berbequim 1170, o tubo de perfuração 1150 pode ser manualmente ou automaticamente avançado, e.g., em direcção à extremidade proximal do guia interno 1110, e.g., em direcção à incisão 1190. O método pode também incluir a interrupção do movimento para a frente do tubo de perfuração 1150, por exemplo, quando a ponta 1140 foi avançada até à incisão 1190. Pelo menos parte de uma superfície interna e/ou uma superfície do tubo 1150 pode ser revestida com um material de baixa fricção, e.g., Teflon, Parylene ou qualquer outro material de revestimento adequado, e.g., para facilitar a separação do tecido colhido da superfície interno do utensílio de corte numa acção subsequente e/ou para reduzir quaisquer forças que actuam no tecido durante a acção de corte, como descrito a seguir.

Um mecanismo de inserção de acção rápida, e.g. 34 ΡΕ1653807 accionado por mola, pode ser utilizado para auxiliar o tubo de perfuração 1150 na penetração o alvo de colheita e cortar a derme, e.g., substancialmente sem movimento rotacional do tubo de perfuração.

Como indicado no bloco 1012, o método pode incluir a retirada do guia interno 1110, e.g., tendo o DMO 1160 preso, do tubo de perfuração 1150, extraindo deste modo o DMO 1160 da porção 1120. O DMO 1160 pode ser deixado preso no guia interno 1110, neste caso, o guia interno 1110 pode ser utilizada para manipular, transportar, e/ou manipular o DMO 1160. Alternativamente o DMO 1160 pode ser, por exemplo, cuidadosamente removido do guia interno 1160 numa câmara de processamento de biorreactor, e.g., como descrito em detalhe a seguir com referência à Fig. 22, ou em vários dispositivos de transferência (não apresentado) adaptados para transferir o DMO para uma diferente montagem ou para uma câmara para processamento posterior. Estes dispositivos de transferência podem incluir, por exemplo, fórceps, ventosas ou quaisquer outros dispositivos mecânicos capaz de pinças DMO 1160 e/ou puxar o DMO 1160 para fora do guia interno 1110. Em adição, fluidos adequados, tais como fluidos estéreis, podem ser utilizados, isolados ou em conjunto com os meios listados acima, para auxiliar na remoção do DMO do guia interno 1160.

Como indicado no bloco 1014, o método pode também 35 ΡΕ1653807 incluir a remoção do utensílio de corte, e.g., tubo de perfuração 1150, da porção de pele 1120.

Deve ser entendido pelos especialistas da técnica que qualquer combinação das acções acima pode ser implementada para efectuar a colheita. Além disso, outras acções ou séries de acções podem ser utilizadas. O método de colheita pode adicionalmente incluir a estabilização e/ou suporte externamente do DMO e/ou tecido a ser colhido na vizinhança do DMO a ser colhido e.g., utilizando um dispositivo e/ou mecanismo de suporte externo, por exemplo, em adição à estabilização e/ou suporte internamente da derme, e.g., pelo guia interno, como descrito a seguir. É também feita referência à Fig. 12, que ilustra esquematicamente um utensílio de estabilização por grampo 1200, que pode ser utilizado em conjunto com um dispositivo de colheita dérmica. O utensílio 1200 pode incluir um mecanismo de aperto possuindo as extremidades fixadoras 1210. Por exemplo, o utensílio 1200 pode incluir um grampo de aperto ou fórceps, e.g., como são conhecidos na técnica. 0 utensílio 1200 pode incluir um grampo de mola possuindo uma força de aperto constante, ou uma força de aperto controlavelmente variável. O utensílio 1200 pode ser colocado na superfície da pele paralela a e de qualquer 36 ΡΕ1653807 lado do guia interno 1110, e.g., de modo que quando fechado, as extremidades de aperto 1210 podem ser posicionadas abaixo do guia interno 1110. As extremidades de aperto 1210, quando colocadas juntas, podem funcionar para estabilizar e/ou suportar o guia interno 1110 e/ou uma porção de pele 1240 associada com o DMO a ser colhido, de modo que o DMO pode ser estabilizado enquanto é cortado pelo tubo 1150. O tubo de perfuração 1150, neste caso, pode ser empurrado através das extremidades de aperto 1210 concêntricas ou não concêntricas para o guia interno 1110, enquanto é aplicada a força. As extremidades de aperto 1210 podem incluir pelo menos uma ou duas linhas de dentes de serra 12 60 de modo a proporcionar uma aperto melhorada da porção 1240 e reduzir, e.g., minimizar, o movimento lateral da pele durante o processo de colheita.

Outros utensílios e/ou mecanismos podem ser utilizados para aplicar a força à pele externa de modo a causar compressão semelhante da derme que circunda o guia interno. Alternativamente, podem ser utilizados outros dispositivos e/ou métodos para estabilizar a derme a ser colhida, tais como a torção do guia interno e mantendo-o numa posição substancialmente fixa no que respeita à rotação do tubo de perfuração. É também feita referência à Fig. 13, que ilustra esquematicamente uma vista da secção transversal do tubo de perfuração 1150 inserido coaxialmente acima e ao longo do guia interno 1110. 37 ΡΕ1653807 O guia interno 1110 pode ser colocado na porção de pele 1120 numa posição de modo que um eixo 1125 do guia 1110 é posicionado substancialmente no centro do DMO 1160. Neste caso, o tubo de perfuração 1150 pode ser substancialmente coaxialmente alinhada com o guia interno 1110, de modo que o DMO 1160 é empalado no guia interno 1110 numa forma aproximadamente simétrica.

Contudo, o guia interno e o tubo de perfuração pode ser posicionado em qualquer outro arranjo adequado. Por exemplo, o guia interno pode ser posicionado no espaço subcutâneo, de modo que o DMO desejado a ser colhido pode ser primariamente localizado acima do guia interno e envolvido por este. De acordo com os exposto, o tubo de perfuração pode ser inserido em cima do guia interno e/ou guiado de modo que o guia interno é posicionado perto de ou toca a superfície interna abaixo do tubo de perfuração à medida que corta o DMO. Neste caso, o guia interno pode segurar o DMO, que pode ficar, por exemplo, ao longo da superfície superior do guia interno enquanto está a ser removido.

Os procedimentos manuais acima descritos podem ser facilitados através de um dispositivo integrado (não apresentado) configurado para efectuar algumas ou todos os procedimentos acima para colheita do DMO. Por exemplo, no que respeita a uma forma de realização do método de colheita, o dispositivo integrado pode ser configurado para 38 ΡΕ1653807 permitir o posicionamento e guiando a inserção do guia interno 1110, prendendo o utensílio de aperto 1200, guiando a inserção do tubo de perfuração 1150 e controlando o seu movimento durante o processo de corte, e/ou removendo o DM0 1160 ligado ao guia interno 1110. Este dispositivo pode permitir a operação relativamente simples quando se efectua um procedimento de colheita.

Um método de colheita de um DM0 de um indivíduo pode incluir a produção e/ou manutenção de uma estrutura relacionada com a pele associada com o DMO, e.g., localizada geralmente num sítio alvo de colheita para recolha do DMO, numa forma e posição desejadas de modo que o utensílio de corte pode ser capaz de separar pelo menos parte do DMO do tecido na vizinhança do DMO. Por exemplo, uma porção de epiderme na vizinhança do sítio alvo de recolha pode ser levantado, e.g., prendendo pelo menos parte da porção da epiderme a uma área de superfície pré-definida, e.g., substancialmente plana, de modo que pelo menos parte da estrutura relacionada com a pele pode ser levantada e mantida na forma e/ou posição desejada. De acordo com algumas formas de realização exemplificativas, prender a epiderme à superfície pré-definida pode incluir a aplicação de uma condição de vácuo, e.g., como descrito a seguir. Alternativamente ou adicionalmente, prender a epiderme à superfície pré-definida pode incluir a aplicação de um adesivo na superfície. É agora feita referência às Figs. 14a-14c, que 39 ΡΕ1653807 ilustram esquematicamente uma vista frontal, uma vista lateral, e uma vista de topo, respectivamente, de um dispositivo de colheita dérmica 1400 para colheita de um DM0, e à Fig. 15, que ilustra esquematicamente a vista lateral da secção transversal do dispositivo 1400 a ser implementada para suportar externamente uma estrutura relacionada com a pele incluindo um DMO 1510 numa posição de desejada. 0 dispositivo 1400 pode incluir uma câmara de vácuo, e.g., uma câmara longitudinal geralmente cilíndrica 1406, possuindo uma superfície de suporte de topo 1430 fluidicamente ligada através de uma pluralidade de canais 1404 a uma entrada de vácuo 1402. A entrada de vácuo 1402 pode ser f luidicamente ligada a pelo menos uma fonte de vácuo, e.g., uma bomba de vácuo (não apresentado), para proporcionar uma condição de vácuo na câmara 1406. A superfície 1430 e/ou canais 1404 podem ser configurados para permitir a ligação à superfície 1430 de pelo menos parte de uma camada epidérmica 1508 associada com o DMO 1510, e.g., localizada geralmente acima do DMO 1510, quando uma condição de vácuo é aplicada à câmara 1406, e.g., pela fonte de vácuo. 0 dispositivo 1400 pode também um canal de guia 1416 para guiar um utensílio de corte, e.g., um tubo de perfuração 1520, e manter o utensílio de corte numa localização pré-determinada, e.g. uma distância pré-determinada da superfície superior 1430. Por exemplo, a 40 ΡΕ1653807 superfície superior do utensílio de corte 1520 pode estar localizada a uma distância, por exemplo, de aproximadamente 1 mm da superfície superior 1430. Em outra forma de realização, outros intervalos, tais como por exemplo, 0,3-2,0 mm, pode também ser utilizado. O canal 1416 pode incluir, por exemplo, um canal geralmente cilíndrico possuindo um diâmetro ligeiramente maior do que o diâmetro externo do tubo de perfuração 1520. O tubo de perfuração 1520 pode incluir uma agulha interna possuindo um tamanho de, e.g., entre 1 mm e 10 mm, por exemplo, 14G (correspondendo a um diâmetro externo de aproximadamente 2,11 mm) e possuindo um extremidade de corte simetricamente afiada. A superfície 1430 pode ser plana, geralmente curvada, ou pode possuir qualquer outra forma adequada, Por exemplo, numa forma de realização, a superfície 1430 pode ter um raio de curvatura de cerca de 3,5 mm. Numa forma de realização a câmara 1406 pode possuir uma largura de, por exemplo, cerca de 4 mm. Além disso, em algumas formas de realização, a câmara 1406 pode ter um peso de, por exemplo, cerca de 5 mm. Em outras formas de realização, outros intervalos, como por exemplo, 3-25 mm, podem também ser utilizados para o raio de curvatura da superfície 1430 e/ou uma largura e/ou altura da câmara 1406, por exemplo, quaisquer dimensões desejadas no intervalo de 3-25 mm podem ser utilizadas em algumas formas de realização. O comprimento da câmara 1406 pode ser geralmente semelhante ao comprimento do DMO a ser colhido, por exemplo, aproximadamente 30 mm de comprimento; contudo, outros 41 ΡΕ1653807 intervalos, por exemplo, no intervalo entre 5 - 100 mm, pode ser utilizada para o comprimento da câmara. 0 dispositivo 1400 pode incluir dois canais 1408 localizados pelo menos parcialmente ao longo de dois lados da câmara 1405, respectivamente, para permitir o aperto da camada de epiderme 1508, como descrito a seguir. Os canais 1408 podem ser posicionados, e.g., centrados, a uma altura desejada, por exemplo, a aproximadamente à mesma altura do centro do DMO a ser colhido. Numa forma de realização, o centro dos canais 1408 pode ser posicionado a uma altura de cerca de 2 mm abaixo a superficie inferior 1430 de modo que o aperto pode estabilizar e/ou suportar o tecido a ser cortado De acordo com estas formas de realização exemplificativas, o dispositivo 1400 pode também incluir dois elementos de membrana flexíveis 1412, na superficie interna ou superficie externa dos canais 1408, de modo a permitir um aperto externo do tecido sem afectar substancialmente a condição de vácuo aplicada à câmara 1406. De acordo com outras formas de realização da invenção, o dispositivo 1400 pode não incluir os elementos 1412 e/ou os canais 1408.

Um método de colheita do DMO 1510 utilizando o dispositivo 1400 pode incluir a formação de duas incisões (não apresentado), e.g., formando dois cortes de incisão utilizando um bisturi, numa porção de pele associada com o DMO 1510 numa distância pré-determinada, e.g., aproximadamente 30 mm, que pode corresponder aos pontos em que se 42 ΡΕ1653807 pretende que o tubo de perfuração 1520 entre e saia da epiderme 1508 ("sítios de penetração de entrada e de saída"). As incisões podem ser formadas de modo a assegurar que não exista substancialmente componente epidérmico nas duas extremidades do DMO 1510 colhido, e/ou para manter uma forma desejada dos sítios de penetração de modo a poderem sarar eficientemente, i.e., rapidamente e/ou deixando cicatrizes relativamente pequenas. 0 método pode também incluir a colocação do dispositivo 1400 em contacto com a camada de epiderme 1508 ("o sítio de recolha") de modo que as incisões são posicionadas debaixo da câmara 1406, i. e., entre os pontos 1410 e 1414. As incisões podem ser posicionadas nos pontos 1410 e/ou 1414, respectivamente, ou podem ser posicionadas entre os pontos 1410 e 1414 para auxiliar na força dos cortes de incisão para "abrir" uma vez que a condição de vácuo é aplicada à câmara 1406. De acordo com algumas formas de realização exemplificativas, o dispositivo 1400 pode opcionalmente incluir um mecanismo configurado para criar os cortes de incisão, por exemplo, lancetas com carga de mola que produzem as incisões de corte, e.g., após o dispositivo 1400 ter sido colocado no sítio de recolha antes da condição de vácuo ser aplicada à câmara 1406. O método pode também incluir a inserção do tubo de perfuração 1520 no canal 1416. O tubo de perfuração 1520 pode ser ligado, por exemplo, através de um conector, e.g., um suporte Jacobs Chuck ou de fricção, a um berbequim médico ou qualquer outro utensílio e/ou mecanismo adequado, 43 ΡΕ1653807 e.g., berbequim 1170 (Fig. 11), capaz de rodar o tubo de perfuração 1520. Opcionalmente, a velocidade rotacional do berbequim pode variar de uma forma oscilatória, i.e., a direcção de rotação pode variar periodicamente entre as direcções do "sentido dos ponteiros do relógio" e "contra o sentido dos ponteiros do relógio". O método pode também incluir a aplicação uma condição de vácuo à câmara 1406, e.g., por activação da fonte de vácuo. Consequentemente, a estrutura relacionada com a pele pode ser drenada para a câmara 1406 e epiderme 1508, e.g., entre os cortes da incisão, pode ser firmemente mantidos contra a superficie 1430. A epiderme 1508, derme 1506, e ou os componentes fordos do tecido 1504 podem adicionalmente ser procedimentos para a câmara 1406, dependendo da espessura de cada uma destas camadas de tecido e as dimensões da câmara 1406. Deste modo, as dimensões da câmara 1406 podem ser concebidas de acordo com a espessura antecipada de uma ou mais camadas de tecido e/ou aperto exterior, e.g., como descrito aqui, pode ser aplicado de modo a que o tecido gordo 1504 removido para a câmara de vácuo 1406 pode ser forçado para baixo e substancialmente para fora da câmara 1406. O método pode ainda incluir a rotação do tubo de perfuração 1520, e.g., utilizando o berbequim 1170 (Fig. 11) a uma velocidade rotacional relativamente elevada, e.g., superior a 1 000 RPM, e.g., entre 1 000 RPM e 10 000 RPM. Por exemplo, o tubo de perfuração 1520 pode ser 44 ΡΕ1653807 rotado a uma velocidade rotacional superior a 2 000 RPM, e.g., aproximadamente 7 000 RPM. Alternativamente, uma velocidade rotacional relativamente baixa inferior a 1000 RPM pode ser utilizada, ou sem rotação de todo, como descrito acima. O método pode também incluir um tubo de perfuração de avanço 1520 ao longo da câmara de vácuo 1406, e.g., pelo menos ao longo de todo o comprimento da câmara 1406. O tubo de perfuração 1520 pode ser guiado através do canal 1416 de modo a assegurar que o micro-órgão dérmico 1510 é colhido de aproximadamente a mesma profundidade na estrutura relacionada com a pele ao longo da câmara 1406. O tubo de perfuração 1520 pode ser avançado manualmente, ou utilizando um actuante motorizado (não apresentado), e.g., para controlar a que a velocidade nesse tubo de perfuração 1520 pode avançar.

O método pode também incluir a raspagem do DMO 1510 do tecido circundante o DMO 1510 . Por exemplo, o dispositivo 1400 pode incluir uma extensão 1418, e.g., possuindo um comprimento entre 1 mm e 5 mm e um raio substancialmente igual ao raio do canal 1416, localizado substancialmente oposto ao canal 1416 de modo que o tubo de perfuração 1520 pode avançar para a extensão 1418 após seguir pela câmara 1406. Alternativamente, uma superfície de corte 1440, e.g., formada de Silicone ou outro material adequado, pode ser posicionado na extensão 1418 de modo a que o tubo de perfuração possa cortar na superfície 1440 para raspar o DMO colhido. Adicionalmente, pode ser aplicada uma condição de vácuo no tubo de perfuração 1520, 45 ΡΕ1653807 e.g., a partir da sua extremidade, de modo que o DMO 1510 pode ser activamente drenadas para o tubo de perfuração 1520, impulsionando deste modo a descolagem final do DMO do tecido circundante. O método pode ainda incluir a retirada do tubo de perfuração 1520, incluindo nele o DMO 1510, do dispositivo 1400 . É feita referência à Fig. 16, que ilustra esquematicamente uma vista lateral transversal do dispositivo 1400 a ser implementado para suportar externamente uma estrutura relacionada com a pele numa posição desejada.

Na Fig. 16, a estabilização melhorada da derme 1506 e/ou a prevenção melhorada do recrutamento da gordura 1504 para a câmara de vácuo 1406 pode ser conseguida por aperto externo da estrutura relacionada com uma pele mantida na câmara de vácuo. Por exemplo, um utensílio de aperto 1600, e.g., análogo ao utensílio de aperto descrito acima com referência à Fig. 12, pode ser implementado para "pingar" a estrutura relacionada com a pele mantida dentro da câmara de vácuo 1406, e.g., simetricamente. As duas extremidades de aperto 1502 do utensílio de aperto 1600 podem ser inseridas nos canais 1408, respectivamente. O utensílio 1600 pode ser fechado de modo a que as extremidades de aperto 1502 podem pressionar para baixo contra os elementos flexíveis 1412. Deste modo, a estrutura relacionada com a pele na câmara 1406 pode ser fixada a 46 ΡΕ1653807 partir dos lados sem afectar substancialmente a condição de vácuo na câmara 1406. A força de aperto aplicada pelas extremidades de aperto extremidades 1502 pode corresponder, por exemplo, a uma força constante ou variável de uma mola 1512 ou outro dispositivo adequado.

Embora a descrição acima possa referir uma câmara de vácuo possuindo uma forma e/ou tamanho geralmente constante ao longo do seu eixo longitudinal, deve ser entendido pelos especialistas na técnica que, a câmara de vácuo pode ter qualquer outro tamanho e/ou forma pré-determinada, e.g., como descrito a seguir. É agora feita referência à Fig. 17, que ilustra esquematicamente um dispositivo de colheita dérmica 1700.

0 dispositivo 1700 pode incluir uma câmara de vácuo 1701 incluindo uma protrusão elevada 1706. A protrusão elevada 1706 pode ter um tamanho e/ou forma pré-determinados adaptados, por exemplo, para permitir a criação de um "patamar" de uma única camada simples de tecido de pele numa orientação geralmente plana, elevada acima da trajectória de um tubo de perfuração 1716. Por exemplo, a secção 1706 pode ser superior a outras secções da câmara 1701, de modo que uma camada de gordura 1718 pode ser drenada na secção 1706 e mantida ao longo da trajectória do tubo de perfuração 1716. Como um resultado, após colheita de um DMO de um comprimento pré-determinado, o tubo de perfuração 1716 pode ser ligeiramente avançado na 47 ΡΕ1653807 camada de gordura 1718, separando deste modo o DM0 colhido do tecido circundante ao DM0. 0 DM0 colhido pode permanecer no tubo de perfuração 1716 à medida que é removido do corpo. A configuração do Dispositivo 1700 pode eliminar a necessidade para formar uma incisão de "saída" na pele, e.g., como descrito acima, permitindo assim a colheita de um DM0 com apenas uma única incisão. 0 dispositivo 1700 pode também incluir uma interruptor de berbequim 1708 para permitir avançar manualmente o tubo de perfuração 1716 para uma distância pré-determinada até à câmara 1701, e.g., para uma posição em que o tubo de perfuração 1716 tenha avançado suavemente até ao tecido gordo 1718. É agora feita referência à Fig. 18, que ilustra esquematicamente a colheita dispositivo 1800, e à Fig. 19, que ilustra esquematicamente uma vista de secção transversal do dispositivo 1800 a ser implementado para colheita de um DMO 1830.

Os dispositivos de biópsia interna dispositivos com semelhanças com os dispositivos utilizados, por exemplo, em aplicações de biópsia de cancro da mama, como descrito a seguir, podem ser utilizados para colheita de um DMO. O dispositivo 1800 pode incluir a utensílio de corte 1808, e.g., como descrito acima, e um Subcutaneous Harvest Trocar (HST) 1806, e.g., uma agulha hipodérmica com uma ponta afiada 1804 e um diâmetro interno adequado, e.g., 48 ΡΕ1653807 sendo ligeiramente maior do que o diâmetro externo do utensílio de corte 1808, de modo que o utensílio de corte 1808 pode ser inserido no e substancialmente coaxialmente no HST 1806. O HST 1806 pode incluir um entalhe recortado ("janela") 1802 com uma profundidade adequada, e.g., 1 mm ou mais, e um comprimento adequado, e.g., substancialmente igual ao comprimento desejado do DMO a ser colhido.

Na Fig. 18, uma única incisão, e.g., corte com lanceta, pode ser formada, e.g., utilizando uma lâmina de bisturi, através do qual o HST 1806 pode ser inserido em conjunto com um utensílio de corte 1808, e.g., como uma unidade simples, na posição desejada abaixo de ou na pele, de um modo preferido no espaço subcutâneo com o corte 1802 orientado para cima em direcção à camada de derme 1840. O utensílio de corte 1801 pode ser posicionado no HST 1806 durante a penetração de modo que a janela de corte 1802 pode ser "fechada" para permitir uma penetração geralmente suave do HST 1806. O utensílio 1808 e HST 1806 aí inseridos podem migrar até interface a subcutânea para o comprimento doO corte 1802, e a extremidade 1804 pode não sair através da superfície da pele. Uma vez apropriadamente posicionado, o utensílio 1808 pode ser retraído para expor o corte 1802 e permitir que o tecido dérmico preencha substancialmente o corte. A pressão apropriada na superfície da pele pode ser aplicada, e.g., utilizando um utensílio de aperto adequado, por exemplo, como descrito acima com referência à Fig 12, e/ou uma condição de vácuo pode ser aplicada a partir do HST 1802 através de um manipulo de vácuo (não apresentado), 49 ΡΕ1653807 e.g., localizado abaixo do corte 1802, para ajudar a que a derme preencha substancialmente o corte 1802. O utensílio 1808 pode ser ligado a um motor, e.g., como descrito acima, para rodar o utensílio 1808 a uma velocidade rotacional apropriada para o corte do tecido dérmico, por exemplo, uma velocidade rotacional relativamente elevada, por exemplo, uma velocidade superior a 1 000 RPM, e.g., entre 1 000 RPM e 10 000 RPM. Por exemplo, o utensílio 1808 pode ser rodado a uma velocidade rotacional superior a 2 000 RPM, e.g., aproximadamente 7 000 RPM. O utensílio 1808 pode então ser avançado e.g., manualmente ou automaticamente, por exemplo, até passar para lá da extremidade da janela de corte 1802, para corar o DMO 1830 no corte 1802. Quando completos, os movimentos para a frente e rotacionais do utensílio 1808 podem ser interrompidos, e o utensílio de corte 1808 pode ser retraído com o DMO colhido 1830 dentro dele. O SHT 1806 pode então ser removido do sítio de colheita. O DMO 1830 pode ser removido do utensílio de corte 1808, e.g., utilizando uma seringa para pressionar que o fluido estéril, por exemplo salino, através do utensílio 1808, ou uma fonte de vácuo para remover o DMO 1830 de uma extremidade (não apresentado) do utensílio de corte 1808.

Deve ser entendido pelos especialistas da técnica que o dispositivo 1800 pode permitir a colheita do DMO formando apenas uma incisão. Além disso, o dispositivo 1800 pode ser eficientemente aplicado para colheita de um DMO das áreas possuindo uma pele relativamente fina, e.g., de uma região das costas do dador. 50 ΡΕ1653807

Deve ser entendido pelos especialistas da técnica que os métodos e/ou dispositivos de colheita, e.g., como descrito acima, podem incluir a introdução de dispositivos de corte fino de tecido na derme. Deste modo, os colheita métodos e/ou dispositivos podem permitir a colheita do DM0 com danos relativamente mínimos para a superfície exterior da pele, e deste modo pode proporcionar um método de colheita minimamente invasivo dos tecidos desejados. São aqui descritos métodos e ou dispositivos para colheita de um DM0, deve ser entendido pelos especialistas da técnica que de acordo com outras formas de realização que, pelo menos alguns dos métodos e/ou dispositivos podem ser implementados para quaisquer outros procedimentos, e.g., procedimentos de cirurgia plástica, procedimentos, dermatológicos ou quaisquer outros procedimentos incluindo a colheita de tecidos. Por exemplo, os métodos e/ou dispositivos de acordo com as formas de realização da invenção podem ser implementados para colheita do tecido dérmico a ser utilizado, e.g., num subsequente implante, como material de enchimento.

Um sistema e um método são proporcionados ex vivo ("in vitro") para a manipulação ou processamento de micro-órgãos dérmicos. 0 tecido dérmico que foi colhido como um MO directo pode ser deixado no seu guia interno como uma montagem para o MO. Nestas formas de realização, o guia interno pode ser utilizado para manter a posição e 51 ΡΕ1653807 orientação dos MOs durante o subsequente processamento. Em outras formas de realização, os MO dérmicos podem ser removidos do guia interno e directamente colocados em poços de cultura de tecidos ou câmaras de transdução de um biorreactor, como descrito em detalhe a seguir, e.g., com referência à Fig. 22. Em algumas formas de realização, e.g., se o DM0 permanece no tubo de perfuração uma vez removido da pele, o DM0 pode ser removido por enxaguamento do tubo de perfuração pela utilização de um fluido biologicamente compativel, e.g., salino ou meio de crescimento, aplicado à extremidade final do tubo de perfuração. 0 enxaguamento do DM0 pode ser de modo que é enxaguado directamente para uma câmara do biorreactor, e.g., como descrito a seguir. Alternativamente, o vácuo pode ser aplicado a uma extremidade final do tubo de perfuração para "remover" o DM0, e.g., directamente numa câmara do biorreactor.

De acordo com algumas formas de realização da presente invenção, um sistema e um método são proporcionados para implante de DTMOs. Após produção e/ou processamento de um DM0, por exemplo, modificando geneticamente o DM0, o DM0 ou DTMO modificado pode ser implantado de novo no doente, por exemplo, para terapia com base em proteina ou RNA. 0 número de DTMOs totais ou parciais que são implantados podem ser determinados pela dosagem terapêutica desejada da proteina segregada. Os DTMOs podem ser implantados subcutaneamente ou em quaisquer outras localizações no corpo. 0 implante subcutâneo por utilização de uma 52 ΡΕ1653807 agulha trocar, por exemplo, pode permitir que o DTMO permaneça numa forma linear no espaço subcutâneo. A forma linear do implante pode ajudar a facilitar a localização no caso de ser necessária a ablação tardia do DTMO, por exemplo, de modo a interromper o tratamento ou reduzir a dose de proteína terapêutica. Podem ser utilizados outros perfis de implante geométricos. O implante linear pode também ajudar na integração do tecido dérmico no tecido circundante. É agora feita referência à Fig. 20, que ilustra esquematicamente um diagrama de fluxo de um método de implante de um DTMO.

Como indicado no bloco 2002 um anestésico local pode ser opcionalmente administrado no sítio pretendido para o implante.

Como indicado no bloco 2004, o DTMO, opcionalmente em conjunto com o fluido salino estéril circundante pode ser aspirado para um transportador, por exemplo, uma agulha de implante, e.g., ligada a uma seringa. A agulha pode ter qualquer diâmetro adequado, por exemplo, entre o calibre 17 e calibre 12. Opcionalmente, uma ponta da agulha pode ter uma extensão curta de tubagem de sílica, ou semelhante, ligado a esta, para facilitar a aspiração do DTMO na cânula da agulha enquanto se retrai o êmbolo da serrnga. 53 ΡΕ1653807

Como indicado no bloco 2006, com o DTMO carregado, a agulha de implante, pode ser empurrada para a pele, e.g., sem a extensão de tubagem de silica, no destino subcutâneo, até uma distância aproximadamente equivalente ao comprimento do DTMO.

Como indicado no bloco 2008, a agulha de implante pode sair através da superficie da pele numa extremidade distai do sitio do implante. 0 método pode incluir a aplicação de pressão no micro-órgão dérmico terapêutico aspirado de modo a que o micro-órgão dérmico terapêutico sai do transportador no sitio do implante.

Como indicado no bloco 2010, a ponta do DTMO pode ser agarrado no ponto de saida com um utensilio de garra, por exemplo pinças.

Como indicado no bloco 2012, a agulha de implante pode ser retraida através do espaço subcutâneo, libertando o DTMO de uma agulha de implante e acamando o DTMO linearmente ao longo do tracto da agulha. Pode ser dada uma ajuda para auxiliar a libertar o DTMO, se necessário, por exemplo empurrando suavemente para baixo no êmbolo da seringa durante a retracção.

Como indicado no bloco 2014, uma vez deixado o DTMO no lugar, a ponta do DTMO pode ser libertado pelo utensilio de preensão. 54 ΡΕ1653807

Um sistema e método são proporcionados para a demarcação e localização in-vivo dos micro-órgãos dérmicos implantados. A identificação da localização de um implante subcutâneo ou implante em qualquer outra localização no corpo, do tecido processado, tal como um DTMO, pode ser importante por exemplo, no caso em que é necessário parar o tratamento com proteína, ou para diminuir a dosagem da proteína segregada. Por exemplo, a terminação ou titulação da dosagem pode ser efectuada por remoção de um ou mais DTMOs totalmente e/ou fazendo a ablação de um, uma porção de um, ou mais do que um dos DTMOs implantados. De modo a identificar um DTMO subcutaneamente implantado, de acordo com uma forma de realização, o DTMO pode ser colorido antes do implante por um tinta inerte, biocompatível ou corante contendo, por exemplo, um cromóforo, que pode ser visível a olho nu ou pode requerer condições de iluminação especial para o visualizar. Desta forma, um DTMO pode ser distinguido do seu tecido circundante por inspecção visual e/ou por utilização de meios por utilização de meios de imagem melhorada. A superfície periférica de um DTMO pode ser revestida com, por exemplo, partículas de carbono biocom-patíveis, tinta de tatuagem biocompatível, ou outros materiais adequados. Uma vez implantado subcutaneamente, o DTMO pode ser visível a olho nu ou com um dispositivo de imagem melhorada adequado. Outras formas para melhorar a visibilidade de um DTMO implantado pode incluir a 55 ΡΕ1653807 utilização de uma fonte de luz forte acima da superfície da pele, ou pinçando a pele e direcionando a fonte de luz na pele de um dos lados, de modo que a pele pode parecer transluzente e o DTMO corado pode ser mais visivel. Alternativamente, o corante pode ser fluorescente, visivel apenas quando iluminado utilizando luz UV, tal como a utilização de esferas de plástico fluorescentes.

De acordo com outra forma de realização, a localização de um DTMO subcutaneamente implantado pode ser identificado por co-implante de uma estrutura biocompativel em conjunto com o DTMO. Um exemplo de uma destas estruturas biocompativeis é uma sutura de nylon de cadeia única não absorvível normalmente utilizada em muitos procedimentos cirúrgicos. Esta sutura pode ser implantada no mesmo tracto do implante com o DTMO, ou pode ser implantado directamente acima do DTMO na derme superior, de modo que a localização espacial do DTMO pode ser determinada pela localização da sutura. Além disso, a profundidade do DTMO pode ser conhecida por estar na profundidade do espaço subcutâneo. A sutura pode ser visível a olho nu, observada com a ajuda de meios de iluminação, e/ou observada com o auxílio de outro meio de imagem adequado, tal como os ultra-sons. Alternativamente, a sutura pode ser fluorescente e visível através da pele sob iluminação UV apropriada. A sutura pode alternativamente ser de um material absorvente, de modo que pode permitir a determinação da localização durante um período de tempo desejado, tal como alguns meses. 56 ΡΕ1653807 O DTMO pode ser geneticamente modificado ou manipulado para incluir um gene para expressar um marcador fluorescente ou outro marcador capaz de ser visualizado. Por exemplo, o DTMO pode ser modificado com o gene da GFP (Proteina Verde Fluorescente) ou gene repórter da Luciferase, que, por exemplo, pode ser expresso em conjunto com o gene para a proteina terapêutica. Desta maneira, o DTMO pode ser visualizado de forma não invasiva utilizando UVs apropriados ou outras condições adequadas de iluminação e imagem.

Um sistema e um método são proporcionados para remoção ou ablação de DTMOs implantado. Num caso, por exemplo, em qua a terapia à base de DTMO num doente deve ser terminada, ou se a secreção da proteina deve ser diminuida, cada DTMO implantado pode ser parcialmente ou totalmente removido, ou parcialmente ou totalmente extraido. Uma forma de realização para remoção de um DTMO é através de um tubo de perfuração semelhante a, ou ligeiramente maior de diâmetro do que, a utilizada para colheita directa de DM0.

Como pode ser observado com referência à Fig. 21, no bloco 2102 a localização do DTMO subcutâneo implantado pode ser determinado. No bloco 2103, pode ser opcionalmente administrado um anestésico local no sitio da remoção do DTMO. No bloco 2104, pode ser inserido um guia interno subcutaneamente ao longo do comprimento do DTMO, para recolha do centro do tecido, que inclui o DTMO. No bloco 57 ΡΕ1653807 2106 a agulha interna, do mesmo ou maior diâmetro do que o da agulha de implante (por exemplo, calibre 11 ou semelhante), pode ser inserido concentricamente ao longo do guia interno. No bloco 2108 um centro de tecido que inclui o DTMO pode ser colhido. No bloco 2110, o guia interno com o centro de tecido e a agulha interna pode ser extraída da pele, com o DTMO. Numa forma de realização, esta abordagem de extracçao pode ser combinada com sucção por vácuo para auxiliar na remoção do material de corte do corpo.

Os métodos minimamente invasivos ou não invasivos de ablação do DTMO in-situ podem ser utilizados para tornar o procedimento menos traumático e menos invasivo para o doente. Em uma forma de realização, no caso do DTMO corado, um laser, por exemplo, um laser Yag não invasivo pode ser utilizado. A energia do laser Yag, por exemplo, pode ser selectivamente absorvida pelo cromóforo, de modo que a energia é primariamente dirigida para o DTMO, com um mínimo de lesões causadas ao tecido circundante. Outras fontes de energia luminosa podem ser também utilizadas. O DTMO pode ser extraído distribuindo a energia destrutiva a partir de uma sonda minimamente invasiva inserida no espaço subcutâneo ao longo do comprimento do DTMO. Esta sonda pode permitir a distribuição de uma variedade de tipos de energia, incluindo radiofrequência, criogénica, microondas, calor de resistência, etc. Uma estrutura co-implantada, tal como uma sutura, pode ser utilizada para determinar a localização do DTMO, permitindo 58 ΡΕ1653807 deste modo que a sonda fosse inserida subcutaneamente, por exemplo, ao longo ou directamente a seguir à sutura. Neste caso, por exemplo, a energia destrutiva pode ser distribuída enquanto a sutura está ainda no lugar. Alternativamente, a sutura pode ser removida após a colocação da sonda e antes da distribuição da energia destrutiva. A quantidade de energia aplicada pode ser a necessária para desnaturar as proteínas no tecido tal como durante a coagulação por diatérmia. Adicionalmente ou alternativamente, a quantidade de energia aplicada pode ser tanta quanto é utilizada em dispositivos de corte electro-cirúr-gico, que queima o tecido. Obviamente, outros meios de localização e outros meios de distribuição de energia destrutiva podem ser utilizados.

Após ter sido colhido um DM0, e.g., o DM0 é opcionalmente geneticamente alterada. Qualquer metodologia conhecida na técnica pode ser utilizada para alterar geneticamente o tecido. Um método exemplificativo é a inserção de um gene nas células do tecido com um vector virai recombinante. Qualquer um de um número de vectores diferentes pode ser utilizado, estes vectores virais, vectores plasmídicos, DNA linear, etc., como conhecido na técnica para introduzir um fragmento exógeno de ácido nucleico que codifica um agente terapêutico nas células e/ou tecidos alvo. Estes vectores podem ser inseridos, por exemplo, utilizando qualquer da infecção, transdução, transfecção, transfecção mediada por fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, electroporação, 59 ΡΕ1653807 transfecção mediada por lipossoma, distribuição biolistica de genes, distribuição lipossómica de genes utilizando os lipossomas fusogénicos e aniónicos (que são uma alternativa à utilização de lipossomas catiónicos), injecção directa, incorporação mediada por receptor, magnetoporação, ultra-sons e outros como conhecido na técnica. Esta inserção de gene é conseguida por introdução do vector na vizinhança do DM0 de modo que o vector pode reagir com as células do DM0. Uma vez que o fragmento de ácido nucleico exógeno foi incorporado nas células, a produção e ou a taxa de secreção do agente terapêutico que codifica o fragmento de ácido nucleico podem ser quantificados.

De acordo com algumas formas de realização exemplificativas, a modificação genética do DM0 pode modificar o perfil de expressão de um gene endógeno. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por introdução de um estimulador, ou um elemento regulador repressível ou indutivel para controlo da expressão do gene endógeno.

Em outra forma de realização, a invenção proporciona um método de distribuição de um produto do gene de interesse num indivíduo por implante de um DM0 geneticamente modificado num indivíduo.

Como indicado acima, o DM0 pode estar em contacto com uma solução de nutrientes durante o processo. Deste modo, um agente terapêutico produzido pelo DTMO pode ser segregado na solução em que a sua concentração pode ser 60 ΡΕ1653807 medida. O gene de interesse pode ser qualquer gene que codifica qualquer molécula de RNA (com sentido ou anti-sentido), péptido, polipéptido, glicoproteina, lipoproteina ou combinação destes ou qualquer outro polipéptido pós modificado. Numa forma de realização da invenção, o gene de interesse pode ser naturalmente expressa na amostra de tecido. Em outra forma de realização desta invenção, a amostra de tecido pode ser geneticamente manipulada de modo que pelo menos uma célula irá expressar o gene de interesse, que não é naturalmente expressa pelas células ou possui um perfil de expressão alterada na célula.

Como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico" refere-se ao polinucleótido ou a oligonucleótidos tais como ácido desoxirribonucleico (DNA), e, quando apropriado, ácido ribonucleico (RNA) ou um seu mimético. 0 termo deve também ser compreendido para incluir, como equivalentes, análogos do RNA ou DNA formados por análogos de nucleó-tidos, e, conforme aplicável à forma de realização a ser descrita, polinucleótido simples (com sentido ou anti-sentido) e de cadeia dupla. Este termo inclui oligonucleótidos compostos de nucleobases que ocorrem naturalmente, açúcares e ligações internucleósido covalentes (estrutura) assim como oligonucleótidos possuindo porções que não ocorrem naturalmente que funcionam de forma semelhante. Estes oligonucleótidos modificados ou substituídos são frequentemente preferidos às formas nativas devido às propriedades desejáveis tais como, por exemplo, incorporação celular melhorada, afinidade melhorada para o 61 ΡΕ1653807 ácido nucleico alvo e estabilidade aumentada na presença de nucleases.

Como é conhecido pelos especialistas na técnica, o termo "proteina", "péptido" ou "polipéptido" significa um polímero linear de aminoácidos ligados numa sequência específica por ligações peptídicas. Como aqui utilizado, o termo "aminoácido" refere-se à forma D ou L do estereoisómero do aminoácido, a menos que especificado o contrário especificamente. Estão também incluídos proteínas equivalentes ou péptidos equivalentes, e.g., possuindo a actividade biológica da proteína supressora de tumor purificada do tipo selvagem. "Proteínas Equivalentes" e "polipéptidos equivalentes" referem-se a compostos que se afastam da sequência linear das proteínas que ocorrem naturalmente ou polipéptidos, mas que têm substituições de aminoácidos que não alteram a sua actividade biológica. Estes equivalentes podem diferir das sequências nativas pela substituição de um ou mais aminoácidos com aminoácidos relacionados, por exemplo, aminoácidos carregados de forma semelhante, ou a substituição ou modificação das cadeias laterais ou grupos funcionais. A proteína, péptido, polipéptido glicoproteína ou lipoproteína podem ser, sem estarem limitados, quaisquer das seguintes proteínas ou várias combinações destas: protease, uma lipase, uma ribonuclease, uma desoxirribo-nuclease, um factor de coagulação do sangue, uma enzima do citocromo p450, um factor de transcrição, um componente 62 ΡΕ1653807 MHC, uma citoquina, uma interleucina, um BMP, um quimio-quina, um factor de crescimento, uma hormona, uma enzima, um anticorpo monoclonal, um anticorpo de cadeia única, uma oxidorredutase, um p450, uma peroxidase, uma hidrogenase, uma desidrogenase, uma catalase, uma transferase, uma hidrolase, uma isomerase, uma ligase, uma aminoacil-trna sintetase, uma quinase, uma fosfoproteina, um transposão imitador, uma oxidorredutase, uma colinesterase, uma gluco-amilase, uma glicosil-hidrolase, uma transcarbamilase, uma nuclease, uma meganuclease, uma ribonuclease, uma atpase, uma peptidase, uma sintetase de nucleótidos ciclicos, uma fosfodiesterase, uma fosfoproteina, uma proteina associada a DNA ou RNA, uma proteina do grupo de elevada mobilidade, uma proteina de caixa emparelhada, uma histona, uma polimerase, uma proteina de reparação do DNA, uma proteina ribossómica, uma proteina de transporte de electrões, uma globina, uma metalotioneina, uma proteina de transporte de membrana, uma proteina estrutural, um receptor, um receptor de superfície da célula, um receptor nuclear, uma proteina G, um receptor olfactório, um receptor de canal de iões, um canal, um receptor da cinase de tirosina, uma molécula ou receptor de adesão celular, um foto-receptor, um péptido activo, um inibidor de protease, um chaperone, uma chaperonina, uma proteina associada ao stresse, um factor de transcrição e uma proteina quimérica.

Numa forma de realização a quantidade de proteina segregada pelo DM0 da invenção é pelo menos 1,6 pg de DTMO/dia no dia de pré-implante. 63 ΡΕ1653807

Numa forma de realização desta invenção, o gene de interesse pode codificar eritropoietina ou uma sua proteína equivalente.

Em outra forma de realização da invenção, o gene de interesse pode codificar, sem limitação, qualquer das seguintes proteínas, e quaisquer seus equivalentes: insulina, tripsinogénio, quimotripsinogénio, elastase, amilase, factor tímico do soro, factor tímico humoral, timopoietina, gastrina, secretina, somatostatina, substância P, hormona do crescimento, uma somatomedina, um factor estimulador de colónias, eritropoietina, factor de crescimento epidérmico, factor hepático eritropoiético (hepato-poietina), um factor de crescimento de células do fígado, uma interleuquina, um factor de crescimento negativo, factor de crescimento do fibroblasto e factor de crescimento de transformação da família β, Interferão a, Interferão β, Interferão γ, hormona do crescimento humana, G-CSF, GM-CSF, TNF-receptor, PDGF, AAT, VEGF, Superóxido dismutase, Interleuquina, TGF-β, NGF, CTNF, PEDF, NMDA, AAT, Actina, Activina beta-A, Activina beta-B, Activina beta-C, Activina beta-E, Adenosina Desaminase adenosina desaminase Agarase-Beta, Albumina HAS Albumina, Álcool Desidrogenase Aldolase, Alfimeprase Alfa 1-Antitripsina Alfa Galactosidase ácido Alfa-1 Glicoproteína (AGP), Alfa-1-Antiquimotripsina, Alfa-1 Antitripsina AT, Alfa-1-microglobulina AIM, Alfa-2-Macroglobulina A2M, Alfa-Fetoproteína, Alfa-Galactosidase, Aminoácido Oxidase, D-, 64 ΡΕ1653807

Aminoácido Oxidase, L-, Amilase, Alfa, Amilase, Beta, Angiostatina, Angiotensina, Enzima Conversora, Anquirina, Apolipoproteína, APO-SAA, Arginase, Asparaginase, Aspartil Aminotransferase, factor Natriurético Atrial (Anf), Péptido Natriurético Atrial, péptido natriurético Atrial (Anp), Avidina, Beta-2-Glicoproteina 1, Beta-2-microglobulina, Beta-N-Acetilglucosaminidase B-NAG, beta amiloide, proteina natriurética do Cérebro (Bnp), factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), Caderina E, Cale a, Cale b, Calcitonina, Calciclina, Caldesmon, Calgizarina, Calgranulina A, C granulina C, Calmodulina, Calreticulina, Calvasculina, Anidrase Carbónica, Carboxipeptidase, Carboxipeptidase A, Carboxipeptidase B, Carboxipeptidase Y, TROPONINA CARDÍACA I, TROPONINA CARDÍACA T, Caseína, Alfa, Catalase, Cateninas, Catepsina D, CD95L, CEA, Celulase, Proteína B do Centrómero, Ceruloplasmina, Ceraplasmina, calecistoquinina, Colesterol Esterase, Colinesterase, Acetil, Colinesterase Butiril, Gonadotrofina Coriónica (HCG), Gonadotrofina Coriónica Beta CORE (BchCG), Quimotripsina, Quimotri-psinogénio, Quimotripsina, Quimotripsina, Creatina cinase, K-BB, CK-MB (Creatina cinase-MB), CK-MM, proteína de ligação a fosfolípido de células Clara, Clostripaína, Clusterina, CNTF, Colagénio, Colagenase, Colagénios (tipo 1-VI), factor estimulador de colónias, Complemento Clq Complemento C3, Complemento C3a, Complemento C3b-alfa, Complemento C3b-beta, Complemento C4, Complemento C5, Complemento Factor B, Concanavalina A, Corticoliberina, hormona de libertação de Corticotrofina, Proteína C-Reactiva (CRP), péptido natriurético tipo C (Cnp), 65 ΡΕ1653807

Cistatina C, D-Dímero, Delta 1, cinase 1 do tipo Delta (Dlkl), Desoxirribonuclease, Desoxirribonuclease I, Deso-xirribonuclease H, ácidos Desoxirribonucleicos, Dersala-zina, Dextranase, Diaforase, DNA Ligase, T4, DNA Polimerase I, DNA Polimerase, T4, EGF, Elastase, Elastase, Elastina, factor de crescimento endotelial vascular derivado de glândula Endócrina (EG-VEGF), Elastina Endotelina Elastina Endotelina 1 Elastina Eotaxina Elastina, factor de crescimento Epidérmico (EGF), Péptido-78 Epitelial Activa-dor de Neutrófilos (ENA-78) Eritropoietina (Epo), Estriol, Exodus, Factor DC, Factor VHI, proteina de ligação a ácido

Gordo, Ferritina, factor de crescimento de fibroblasto, factor de crescimento 10 de Fibroblasto, factor de crescimento 11 de Fibroblasto, factor de crescimento 12 de Fibroblasto, factor de crescimento 13 de Fibroblasto, factor de crescimento 14 de Fibroblasto, factor de crescimento 15 de Fibroblasto, factor de crescimento 16 de Fibroblasto, factor de crescimento 17 do Fibroblasto, factor de crescimento 18 de Fibroblasto, factor de crescimento 19 de Fibroblasto, factor de crescimento 2 de Fibroblasto, factor de crescimento 20 de Fibroblasto, factor de crescimento 3 de Fibroblasto, factor de crescimento 4 de Fibroblasto, factor de crescimento 5 de

Fibroblasto, factor de crescimento 6 de Fibroblasto, factor de crescimento 7 de Fibroblasto, factor de crescimento 8 de Fibroblasto, factor de crescimento 9 Fibroblasto, Fibro-nectina, cinase da adesão focal-(FAK), Folitropina alfa, Galactose Oxidase, Galactosidase, Beta, gamaIP-10, gastri-na, GCP, G-CSF, Factor Neurotrófico derivado da Glia 66 ΡΕ1653807 (GDNF), Proteína acídica fibrilar da Glia, proteína do filamento da Glia (GFP), receptor da família do factor neurotrófico derivado da glia (GFR), globulina, Glucose Oxidase, Glucose-6-Fosfato Desidrogenase, Glucosidase, Alfa, Glucosidase, Beta, Glucuronidase, Beta, Glutamato Descarboxilase, Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase, Glicerol Desidrogenase, Glicerol Cinase, Glicogénio Fosforilase ISO BB, Factor estimulador de colónias de Macrófagos Granulócitos (GM-CSF), proteína estimuladora do crescimento (GRO), hormona do crescimento, Hormona libertadora da hormona do crescimento, Hemopexina, factor eritropoiético hepático (hepatopoietina), Heregulina alfa, Heregulina beta 1, Heregulina beta 2, Heregulina beta 3, Hexocinase, Histona, proteína morfogenética do osso Humano, relaxina Humana H2, Hialuronidase, Hidroxiesteróide Desidrogenase, Factor-1 alfa Indutível por Hipóxia- (HIF-1 Alfa), I-309/TCA-3, IFN alfa, IFN beta, IFN gama, IgA, IgE, IgG, IgM, Insulina, Factor de crescimento I do tipo Insulina (IGF-I), Factor de crescimento II do tipo Insulina (IGF-1T), Interferão, quimioatractivo alfa de células T indutível por Interferão (I-TAC), Interleucina, Interleu-cina 12 beta, proteína de ligação de Interleucina 18, factor trefoil Intestinal, IP10, Jagged 1, Jagged 2, cadeia leve Kapa, Factor de crescimento de Queratinócitos (KGF), Kissl, La/SS-B, Lactato Desidrogenase, Lactato Desidrogenase, L-, Lactoferrina, Lactoperoxidase, cadeia leve lambda, Laminina alfa 1, Laminina alfa 2, Laminina beta 1 Laminina beta 2, Laminina beta 3, Laminina gama 1, Laminina gama 2, LD78beta, Leptina, leucina Aminopeptidase, Hormona 67 ΡΕ1653807

Leuteinizante (LH), LIF, Lipase, factor de crescimento de células do fígado, quimioquina expressa no fígado (LEC), Antigénio LKM, TNF, TNF beta, Luciferase, hormona de libertação da hormona Luteinizante, proteína gene-1 de activação de Linfócitos (LAG-1), Linfotactina, Lisozima, Proteína 1 alfa Inflamatória de Macrófagos (MTP-1 Alfa), quimioquina derivada de Macrófagos (MDC), Malato Desidrogenase, Maltase, MCP(proteína quimiotáctica de macrófago/monócito)-1, 2 e 3, 4, M-CSF, MEC (CCL28), proteína relacionada com Membrana do tipo frizada (Mfrp), Midquina, MTF, MIG (monoquina induzida por interferão gama), MIP 2 a 5, ΜΙΡ-lbeta, Mp40; célula T P40 e factor de crescimento de células de mastócitos, Proteína Mielina Básica, Mieloperoxidase, Mioglobina, Miostatina, Factor-8 de Crescimento e Diferenciação (GDF-8), Misoina, Misoina LC, Misoina HC, ATPase, NADase, NAP-2, factor de crescimento negativo, factor de crescimento do nervo (NGF), Neuraminidase, Neurregulina 1, Neurregulina 2, Neueregulina 3, Enolase Específica de Neurónio, Enolase Específica de Neurónio, neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), Neuturina, NGF, NGF-Beta, Nicastrina, Nitrato Redutase, Óxido Nítrico Sintetases, Nortestosterona, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, NP-1, NT-1 to 4, NT-3 Tpo, NT-4, Nuclease, Oncostatina M, Ornitina transcarbamoilase, Osteoprotegerina, Ovalbumina, Oxalato Decarboxilase, PI 6, Papaína, PBP, PBSF, PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PEDF, Pepsina, Péptido YY (PYY), Peroxidase, Persefina, PF-4, P-Glicoproteína, Fosfatase Ácida, Fosfatase Alcalina, Fosfodiesterase I, Fosfodiesterase H, Fosfoenolpiruvato 68 ΡΕ1653807

Carboxilase, Fosfoglucomutase, Fosfolipase, Fosfolipase A2, Fosfolipase A2, Fosfolipase C, Fosfotirosina Cinase, polipéptido activador da adenilato ciclase Pituitária, Lactogénio da Placenta, Placoglobina, Placofilina, Amina Oxidase do Plasma, proteína de ligação de retinol do Plasma, Plasminogénio, Pleiotiofina (PTN), PLGF-1, PLGF-2, Toxina Antiviral de Pokeweed, Pré-albumina, Proteína A do Plasma associada a Gravidez, glicoproteína beta 1 específico da Gravidez (SP1), Prodinorfilina, Proencefalina, Progesterona Pró-insulina, Prolactina, hormona concentradora Pró-melanina (Pmch), Pró-opiomelanocortina, proorfa-nina, Antigénio Específico para a Próstata PSA, Fosfatase de ácido Prostático PAP, Protrombina, PSA-A1, tensioactivo Pulmonar proteína A, Piruvato Cinase, Ranpirnase, RANTES, Reelina, Renina, Resistina, Globulina de Ligação a Retinol RBP, RO SS-A 60kda, RO/SS-A 52kda, S100 (cérebro humano) (BB /AB), S100 (humano) homodímero BB, Saposina, SCF, SCGF- alfa, SCGF- -Beta, SDF-I alfa, SDF- 1 Beta, proteína 1 relacionada com frisado Segregado (Sfrpl), proteína 2 relacionada com frisado Segregado (Sfrp2), proteína 3 relacionada com frisado Segregado (Sfrp3), proteína 4 relacionada com frisado Segregado (Sfrp4), proteína 5 relacionada com frisado Segregado 5 (Sfrp5), secretina, factor tímico de soro, Globulina de Ligação (SHBG), somatomedina, somatostatina, Somatotropina, s-RankL, substância P, Superóxido Dismutase, TGF alfa, TGF beta,

Tiorredoxina, Trombopoietina (TPO) , Trombospondina 1, Trombospondina 2, Trombospondina 3, Trombospondina 4, Trombospondina 5, Trombospondina 6, Trombospondina 7, 69 ΡΕ1653807

factor tímico humoral, timopoietina, timosina al, Timosina alfa-1, Timo e quimioquina de activação requlada (TARC), quimioquina expressa no Timo (TECK), Tiroqlobutina Tg, Antigénio Microssómico da Tiróide, Peroxidase da Tiróide, Peroxidase da Tiróide TPO, Tiroxina (T4), Globulina de Ligação a Tiroxina TBG, TNF alfa, TNF receptor, Transferrina, receptor de Transferrina, factor de crescimento de transformação da familia b, Transtirretina, Triacilglicerol lipase, Triiodotironina (T3), Tropomiosina alfa, cinase relacionada com tropomiosina (tri), Troponina C, Troponina I, Troponina T, Tripsina, Inibidores de Tripsina, Tripsinogénio, TSH, Tweak, Tirosina Decarboxi-lase, Ubiquitina, UDP glucuroniltransferase, Urease, Uricase, Proteína 1 da Urina, Urocortina 1, Urocortina 2, Urocortina 3, Urotensina II, tipo Vang 1 (Vangll), tipo Vang 2 (Vangl2), Factor de crescimento Endotelial Vascular (VEGF), precursor do péptido intestinal Vasoactivo, Vimentina, proteína de ligação a Vitamina D, factor Von Willebrand, Wntl, WntlOa, WntlOb, Wntll, Wntl2, Wntl3, Wntl4, Wntl5, Wntl6, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9, Xantina Oxidase, proteína de ligação a fosfolípido de células Clara, Clostripaína, Clusterina, CNTF, Colagénio, Colagenase, Colagénios (tipo 1-VI), factor estimulador de colónias, Complemento Clq Complemento C3, Complemento C3a, Complemento C3b-alfa, Complemento C3b-beta, Complemento C4, Complemento C5, Complemento Factor B, Concanavalina A, Corticoliberina, hormona de libertação de Corticotrofina, Proteína C-Reactiva (CRP) , péptido natriurético tipo C 70 ΡΕ1653807

GCP

G-CSF (Cnp), Cistatina C, D-Dimero, Delta 1, cinase 1 do tipo Delta (Dlkl), Desoxirribonuclease, Desoxirribonuclease I, Desoxirribonuclease H, ácidos Desoxirribonucleicos, Der-salazina, Dextranase, Diaforase, DNA Ligase, T4, DNA Polimerase I, DNA Polimerase, T4, EGF, Elastase, Elastase, Elastina, factor de crescimento endotelial vascular derivado de glândula Endócrina (EG-VEGF), Elastina Endotelina Elastina Endotelina 1 Elastina Eotaxina Elastina, factor de crescimento Epidérmico (EGF), Péptido-78 Epitelial Activador de Neutrófilos (ENA-78) Eritropoietina (Epo), Estriol, Exodus, Factor DC, Factor VHI, proteina de ligação a ácido Gordo, Ferritina, factor de crescimento de fibroblasto, factor de crescimento 10 de Fibroblasto, factor de crescimento 11 de Fibroblasto, factor de crescimento 12 de Fibroblasto, factor de crescimento 13 de Fibroblasto, factor de crescimento 14 de Fibroblasto, factor de crescimento 15 de Fibroblasto, factor de crescimento 16 de Fibroblasto, factor de crescimento 17 do Fibroblasto, factor de crescimento 18 de Fibroblasto, factor de crescimento 19 de Fibroblasto, factor de crescimento 2 de Fibroblasto, factor de crescimento 20 de Fibroblasto, factor de crescimento 3 de Fibroblasto, factor de crescimento 4 de Fibroblasto, factor de crescimento 5 de Fibroblasto, factor de crescimento 6 de Fibroblasto, factor de crescimento 7 de Fibroblasto, factor de crescimento 8 de Fibroblasto, factor de crescimento 9 Fibroblasto, Fibronectina, cinase da adesão focal-(FAK), Folitropina alfa, Galactose Oxidase, Galactosidase, Beta, gamaIP-10, gastrina, GCP, G-CSF, Factor Neurotrófico 71 ΡΕ1653807 derivado da Glia (GDNF), Proteína acídica fibrilar da Glia, proteína do filamento da Glia (GFP), receptor da família do factor neurotrófico derivado da glia (GFR), globulina, Glucose Oxidase, Glucose-6-Fosfato Desidrogenase, Gluco-sidase, Alfa, Glucosidase, Beta, Glucuronidase, Beta, Glutamato Descarboxilase, Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase, Glicerol Desidrogenase, Glicerol Cinase, Glicogénio Fosforilase ISO BB, Factor estimulador de colónias de Macrófagos Granulócitos (GM-CSF) , proteína estimuladora do crescimento (GRO), hormona do crescimento, Hormona libertadora da hormona do crescimento, Hemopexina, factor eritropoiético hepático (hepatopoietina), Heregulina alfa, Heregulina beta 1, Heregulina beta 2, Heregulina beta 3, Hexocinase, Histona, proteína morfogenética do osso Humano, relaxina Humana H2, Hialuronidase, Hidroxiesteróide Desidrogenase, Factor-1 alfa Indutível por Hipóxia- (HIF-1 Alfa), I-309/TCA-3, IFN alfa, IFN beta, IFN gama, IgA, IgE, IgG, IgM, Insulina, Factor de crescimento I do tipo Insulina (IGF-I), Factor de crescimento II do tipo Insulina (IGF-1T), Interferão, quimioatractivo alfa de células T indutível por Interferão (I-TAC), Interleucina, Interleu-cina 12 beta, proteína de ligação de Interleucina 18, factor trefoil Intestinal, IP10, Jagged 1, Jagged 2, cadeia leve Kapa, Factor de crescimento de Queratinócitos (KGF), Kissl, La/SS-B, Lactato Desidrogenase, Lactato Desidrogenase, L-, Lactoferrina, Lactoperoxidase, cadeia leve lambda, Laminina alfa 1, Laminina alfa 2, Laminina beta 1 Laminina beta 2, Laminina beta 3, Laminina gama 1, Laminina gama 2, LD78beta, Leptina, leucina Aminopeptidase, Hormona 72 ΡΕ1653807

Leuteinizante (LH), LIF, Lipase, factor de crescimento de células do fígado, quimioquina expressa no fígado (LEC), Antigénio LKM, TNF, TNF beta, Luciferase, hormona de libertação da hormona Luteinizante, proteína gene-1 de activação de Linfócitos (LAG-1), Linfotactina, Lisozima, Proteína 1 alfa Inflamatória de Macrófagos (MTP-1 Alfa), quimioquina derivada de Macrófagos (MDC), Malato Desidro-genase, Maltase, MCP(proteína quimiotáctica de macrófa-go/monócito)-1, 2 e 3, 4, M-CSF, MEC (CCL28), proteína relacionada com Membrana do tipo frizada (Mfrp), Midquina, MTF, MIG (monoquina induzida por interferão gama), MIP 2 a 5, ΜΙΡ-lbeta, Mp40; célula T P40 e factor de crescimento de células de mastócitos, Proteína Mielina Básica, Mielope- roxidase, Mioglobina, Miostatina, Factor-8 de Crescimento e Diferenciação (GDF-8), Misoina, Misoina LC, Misoina HC, ATPase, NADase, NAP-2, factor de crescimento negativo, factor de crescimento do nervo (NGF), Neuraminidase, Neurregulina 1, Neurregulina 2, Neueregulina 3, Enolase Específica de Neurónio, Enolase Específica de Neurónio, neurotrofina-3 (NT-3), neurotrofina-4 (NT-4), Neuturina, NGF, NGF-Beta, Nicastrina, Nitrato Redutase, Óxido Nítrico Sintetases, Nortestosterona, Notch 1, Notch 2, Notch 3, Notch 4, NP-1, NT-1 to 4, NT-3 Tpo, NT-4, Nuclease,

Oncostatina M, Ornitina transcarbamoilase, Osteoprote-gerina, Ovalbumina, Oxalato Decarboxilase, PI 6, Papaína, PBP, PBSF, PDGF, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PEDF, Pepsina, Péptido YY (PYY), Peroxidase, Persefina, PF-4, P-Glico-proteína, Fosfatase Ácida, Fosfatase Alcalina, Fosfodies-terase I, Fosfodiesterase H, Fosfoenolpiruvato Carboxilase, 73 ΡΕ1653807

Fosfoglucomutase, Fosfolipase, Fosfolipase A2, Fosfolipase A2, Fosfolipase C, Fosfotirosina Cinase, polipéptido activador da adenilato ciclase Pituitária, Lactogénio da Placenta, Placoglobina, Placofilina, Amina Oxidase do Plasma, proteína de ligação de retinol do Plasma, Plasminogénio, Pleiotiofina (PTN), PLGF-1, PLGF-2, Toxina Antiviral de Pokeweed, Pré-albumina, Proteína A do Plasma associada a Gravidez, glicoproteína beta 1 específico da Gravidez (SP1), Prodinorfilina, Proencefalina, Progesterona Pró-insulina, Prolactina, hormona concentradora Pró-melanina (Pmch), Pró-opiomelanocortina, proorfanina, Anti-génio Específico para a Próstata PSA, Fosfatase de ácido Prostático PAP, Protrombina, PSA-A1, tensioactivo Pulmonar proteína A, Piruvato Cinase, Ranpirnase, RANTES, Reelina, Renina, Resistina, Globulina de Ligação a Retinol RBP, RO SS-A 60kda, RO/SS-A 52kda, S100 (cérebro humano) (BB /AB) , S100 (humano) homodímero BB, Saposina, SCF, SCGF-alfa, SCGF-Beta, SDF-I alfa, SDF-1 Beta, proteína 1 relacionada com frisado Segregado (Sfrpl), proteína 2 relacionada com frisado Segregado (Sfrp2), proteína 3 relacionada com frisado Segregado (Sfrp3), proteína 4 relacionada com frisado Segregado (Sfrp4), proteína 5 relacionada com frisado Segregado 5 (Sfrp5), secretina, factor tímico de soro, Globulina de Ligação (SHBG), somatomedina, somatostatina, Somatotropina, s-RankL, substância P, Superóxido Dismutase, TGF alfa, TGF beta, Tiorredoxina, Trombopoietina (TPO), Trombospondina 1, Trombospondina 2, Trombospondina 3, Trombospondina 4, Trombospondina 5, Trombospondina 6, Trombospondina 7, factor tímico humoral, 74 ΡΕ1653807 timopoietina, timosina al, Timosina alfa-1, Timo e quimio-quina de activação regulada (TARC), quimioquina expressa no Timo (TECK), Tiroglobutina Tg, Antigénio Microssómico da Tiróide, Peroxidase da Tiróide, Peroxidase da Tiróide TPO, Tiroxina (T4), Globulina de Ligação a Tiroxina TBG, TNF alfa, TNF receptor, Transferrina, receptor de Transferrina, factor de crescimento de transformação da família b, Transtirretina, Triacilglicerol lipase, Triiodotironina (T3) , Tropomiosina alfa, cinase relacionada com tropomio-sina (tri), Troponina C, Troponina I, Troponina T, Tripsi-na, Inibidores de Tripsina, Tripsinogénio, TSH, Tweak, Tirosina Decarboxilase, Ubiquitina, UDP glucuroniltrans-ferase, Urease, Uricase, Proteína 1 da Urina, Urocortina 1, Urocortina 2, Urocortina 3, Urotensina II, tipo Vang 1 (Vangll), tipo Vang 2 (Vangl2), Factor de crescimento Endotelial Vascular (VEGF), precursor do péptido intestinal Vasoactivo, Vimentina, proteína de ligação a Vitamina D, factor Von Willebrand, Wntl, WntlOa, WntlOb, Wntll, Wntl2, Wntl3, Wntl4, Wntl5, Wntl6, Wnt2, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9 e Xantina Oxidase

Após o processo de modificação genética, a amostra de tecido pode ser então analisada de modo a verificar a expressão do gene de interesse através de uma amostra de tecido. Isto pode ser realizado por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo por detecção de proteínas por ELISA ou transferência de Northern para RNA. A eficácia de um particular sistema de vector de expressão 75 ΡΕ1653807 e método de introdução de ácido nucleico numa célula podem ser avaliados por abordagens convencionais rotineiramente utilizadas na técnica. Por exemplo, o DNA introduzido numa célula pode ser detectado por uma técnica de hibridação em filtro (e.g., transferência de Southern) e o RNA produzido por transcrição do DNA introduzido podem ser detectados, por exemplo, por transferência de Northern, protecção com RNase ou transcriptase reversa-reacção em cadeia polimerase (RT-PCR) . 0 produto do gene pode ser detectado através de um ensaio apropriado, por exemplo por detecção imunológica de uma proteína produzida, tal como com um anticorpo específico, ou através de um ensaio funcional para detectar uma actividade funcional do produto do gene, tal como um ensaio enzimático. Se o produto do gene de interesse a ser expresso pela célula não é facilmente ensaiável, um sistema de expressão pode ser primeiro optimizado utilizando um gene repórter ligado aos elementos reguladores e vector a serem utilizados. 0 gene repórter codifica um produto do gene que é facilmente detectável e, deste modo, pode ser utilizada para avaliar a eficácia do sistema. Os genes repórter convencionais utilizados na técnica incluem genes que codificam β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransfe-rase, luciferase, GFP/EGFP e hormona do crescimento humano.

Também é contemplada a utilização do DTMO geneticamente modificado para transplante num organismo. Como aqui utilizado os termos "administração", "introdução", "implante" e "transplante" podem ser utilizados indiferentemente e referem-se à colocação do DTMO num 76 ΡΕ1653807 indivíduo, e.g., um indivíduo autólogo, alogeneico ou xenogeneico, através de um método ou via que resulta na localização do DTMO num sítio desejado. 0 DTMO é implantado numa localização desejada no indivíduo de forma a que pelo menos uma porção das células do DTMO permanecem viáveis. Numa forma de realização desta invenção, pelo menos cerca de 5%, em outra forma de realização desta invenção, pelo menos cerca de 10%, em outra forma de realização desta invenção, pelo menos cerca de 20%, em outra forma de realização desta invenção, pelo menos cerca de 30%, em outra forma de realização desta invenção, pelo menos cerca de 40%, e em outra forma de realização desta invenção, pelo menos cerca de 50% ou mais das células permanecem viáveis após a administração a um indivíduo. O período de viabilidade das células após a administração a um indivíduo pode ser tão curto como algumas horas, e.g., vinte e quatro horas, a alguns dias, até algumas semanas a meses ou anos. Para facilitar o transplante das populações de células num tecido que pode ser sujeito a ataque imunológico pelo hospedeiro, e.g., em que é utilizado um enxerto xenogénico, tal como os transplantes suíno-humano, o DTMO pode ser inserido em ou encapsulado por material biocompatível imunoprotegido tais como dispositivos recarregáveis, não-biodegradáveis ou biodegradáveis e então transplantados no indivíduo receptor. Os produtos dos genes produzidos por estas células/tecido podem então ser distribuídos via, por exemplo, dispositivos poliméricos concebidos para a distribuição controlada de compostos, e.g., fármacos, incluindo biofarmacêuticos proteínicos. Uma variedade de 77 ΡΕ1653807 polímeros biocompatíveis (incluindo hidrogéis, por exemplo) , incluindo polímeros biodegradáveis e não degradáveis, podem ser utilizados para formar um implante para a libertação sustentada de um produto do gene das populações de células da invenção num sítio alvo particular. A produção destes implantes é geralmente conhecida na técnica. Ver, por exemplo, Concise Encyclopedia of Medicai & Dental Materials, ed. By David Williams (MIT Press: Cambridge, MA, 1990); a Patente US N° 4 883 666 de Sabei et al.; Patente US N° 4 8 92 538 de Aebischer et al.; Patente US N° 5 106 627 de Aebischer et al.; Patente US N° 4 391 909 de Lim; e Patente US N° 4 353 888 de Sefton. As populações de células no DTMO podem ser administradas num veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável, tais como soluções de salino estéril e de tampão aquoso. A utilização destes veículos e diluentes é bem conhecida na técnica. A proteína segregada tal como, por exemplo, sem limitação, pode ser qualquer proteína de acordo com as formas de realização da invenção acima descritas. A proteína de interesse pode ser, numa forma de realização desta invenção, eritropoietina. Em outra forma de realização, o método pode ser utilizado para a expressão e secreção de cada e qualquer proteína conhecida na técnica e combinações destas. Adicionalmente, o método da invenção pode ser utilizado para a expressão de moléculas de RNA (com sentido ou anti-sentido).

Alternativamente, o DMO, que inclui células gene- 78 ΡΕ1653807 ticamente modificadas podem ser mantidas in vitro e o agente terapêutico, deixado no sobrenadante do meio circundante da amostra de tecido, pode ser isolado e injectado ou aplicado ao mesmo indivíduo ou um diferente.

Alternativamente ou adicionalmente, um micro-órgão dérmico que inclui uma célula geneticamente modificada pode ser criogenicamente preservada por métodos conhecido na técnica, por exemplo, sem limitação, congelamento gradual (0°C, -20°C, -80°C, -196°C) em DMEM contendo DMSO a 10%, imediatamente após serem formados a partir da amostra de tecido ou após alteração genética.

As quantidades de amostra de tecido incluindo célula(s) geneticamente modificadas a ser implantadas são determinadas a partir de um ou mais de: quantidades correspondentes do agente terapêutico de interesse rotineiramente administradas a estes indivíduos com base em directivas reguladoras, protocolos clínicos específicos ou estatísticas da população para indivíduos semelhantes. As quantidades correspondentes do agente terapêutico, como a proteína de interesse, especificamente para esse mesmo indivíduo, no caso em que ele/ela o tenha recebido previamente através de injecções ou outras vias. Os dados do indivíduo tais como o peso, idade, condição física, estado clínico. Os dados farmacocinéticos de amostras de tecido anteriores que incluem a administração de uma célula geneticamente modificada a outros indivíduos semelhante responde a amostras de tecido anteriores que incluem a administração de uma célula geneticamente modificada a esse indivíduo. 79 ΡΕ1653807

De acordo com um aspecto de algumas formas de realização, apenas alguns dos DTMOs são utilizados numa determinada sessão de tratamento. Os restantes DTMOs podem ser devolvidos para manutenção (ou criogenicamente armazenado ou outras formas), para utilização posterior. É deste modo proporcionado, de acordo com uma forma de realização, um método de determinação da quantidade de um micro-órgão terapêutico dérmico a ser implantado num doente, incluindo o método a determinação de um nivel de secreção de um agente terapêutico por uma quantidade do DTMO in vitro; estimando a relação entre os niveis de produção e secreção in vitro e niveis no soro in vivo do agente terapêutico; e a determinação de uma quantidade de DTMO a ser implantado, com base na determinação do nivel de secreção e a relação estimada. Opcionalmente, a relação é estimada com base em um ou mais factores selecionados a partir do seguinte grupo de factores: a) Dados do indivíduo tal como peso, idade, condição física, estado clínico b) Dados farmacocinéticos da administração prévia de DTMO a outros indivíduos semelhantes; etc.) c) Dados farmacocinéticos da administração prévia de DTMO a esse indivíduo 80 ΡΕ1653807

Opcionalmente, a relação é estimada com base em pelo menos dois dos referidos factores. Opcionalmente, a relação é baseada em três dos referidos factores.

Numa forma de realização da invenção, a determinação de uma quantidade de um DTMO a ser implantado num doente é também baseada em ou ambos de: quantidades correspondentes da mesma proteina terapêutica rotineiramente administrada a estes indivíduos com base em directivas reguladoras, especificas de protocolos clinicos ou estatística da população indivíduos semelhantes; e quantidades correspondentes do mesmo agente terapêutico específico do que mesmo indivíduo no caso de o indivíduo ter recebido previamente através de injecções ou outras vias de administração. O método inclui a preparação de uma quantidade de DTMO para implante, de acordo com a quantidade determinada. É também proporcionado um método de ajuste de dosagem de um agente terapêutico produzido por um DTMO implantado num indivíduo e excreção de um agente terapêutico, incluindo (a) monitorização do nível do agente terapêutico no indivíduo; (b) comparação do nível do agente com um nível desejado; (c) se o nível é inferior a um nível 81 ΡΕ1653807 mínimo, então implanta-se um DTMO adicional; (d) e se o nível é superior a um nível máximo, então a inactivação ou remoção de uma porção do DTMO implantado. Opcionalmente, o método 10 inclui periodicamente a repetição de (a) - (d). Alternativamente ou adicionalmente, a inactivação ou remoção consiste na remoção de uma porção do DTMO implantado. Opcionalmente, a remoção inclui a remoção cirúrgica. Alternativamente ou adicionalmente, a inactivação ou remoção inclui a inactivação. Opcionalmente, a inactivação inclui a morte de uma porção do DTMO implantado. Opcionalmente, a inactivação inclui a extracção de uma porção do DTMO implantado.

Como descrito acima com referência à Fig. 1, pelo menos parte do processo de manter o DM0 durante a alteração genética, assim como a própria alteração genética, pode ser efectuada num biorreactor, como descrito a seguir. 0 biorreactor pode ter algumas ou todas das propriedades que se seguem: a) Permitir a provisão de nutrientes e gases às superfícies do DM0 de modo a estes poderem difundir no DM0 e o DM0 pode permanecer viável. Deste modo, não podem ser bloqueadas áreas e volumes significativos do DM0 pode não ser bloqueados de entrar em contacto com um fluido circundante. b) Permitir a manutenção do DM0 a uma temperatura 82 ΡΕ1653807 desej ada. c) Permitir a manutenção de um pH desejado e composição gás na vizinhança do DM0. d) Permitir a remoção de produtos de excreção do DM0 e/ou do biorreactor. e) Permitir um método simples de inserção do vector geneticamente modificante sem perigo substancial de gue o vector de inserção contamine os circundantes. f) Permitir a remoção de vector em excesso não utilizado. g) Permitir a medição da quantidade de agente terapêutico produzido, h) Permitir a remoção de agente terapêutico substancialmente estéril, permitir a fácil inserção do DM0 e remoção de todo ou medição de quantidades de DTMO. É agora feita referência à Figura 22, que ilustra esquematicamente um sistema 2207 para processamento de uma DM0 colhido 2204. 0 sistema 2207 pode incluir um biorreactor 2200 possuindo um ou mais câmaras de processamento 2202, cada uma adaptada para acomodar um DMO 2204. 0 biorreactor 2200, que numa forma de realização exemplificativa possui um 83 ΡΕ1653807 número de câmaras igual ao número de DMOs colhidos de um indivíduo particular, pode ser adaptado para proporcionar uma ou mais das câmaras de processamento 2202 com um fluido ou fluidos adequados, e.g., um meio de crescimento, de um reservatório de fluido local 2208 e/ou descarregar o fluido de uma ou mais das câmaras de processamento 2202, e.g., para um recipiente de desperdícios 2210, como descrito a seguir. O fluido pode ser suprido ao reservatório 2208 via uma linha de entrada 2242, e.g., ligar a um conector estéril 2258 ao reservatório 2208, como descrito a seguir. O DM0 2204 pode ser transferido para a câmara 2202 utilizando um utensílio de corte utilizado para a colheita do DM0 2204, e.g., como descrito acima. A transferência do DMO para a câmara 2202 pode ser de um modo preferido efectuado directamente após colheita do DMO 2204 e enquanto se mantém as condições estéreis. A câmara de processamento 2202 pode incluir uma porta de inserção DMO 2201 adaptada para receber o DMO 2204. Por exemplo, a porta 2201 pode incluir uma interface de septo estéril capaz de receber uma cânula romba, e.g., a SafeLine® Injection Site comercializada por B. Braun Medicai Inc. uma vez que a ponta do utensílio de corte é inserido através do septo, o DMO 2204 pode ser suavemente bombeado para a câmara 2202 de uma forma geralmente estéril, e.g., utilizando uma seringa ligada à extremidade de trás do utensílio de corte. De acordo com uma forma de realização exemplificativa, o DMO 2204 pode ser bombeado num banho de meio 2206 na câmara 2202. Alternativamente, se, por exemplo, o DMO 2204 for 84 ΡΕ1653807 colhido com um guia interno, e.g., descrito acima, uma tampa 2232 adaptou-se sobre a câmara 2202, e.g., como descrito a seguir, pode ser removida, o DM0 2204 pode ser suavemente removido do guia interno e colocado na câmara 2202, e a tampa 2232 pode ser virada e selada sobre a câmara 2202 para manter a esterilidade da câmara 2202. 0 biorreactor 2200 pode ser adaptado para aplicar, e.g., de um modo geralmente idêntico, um ou mais processos aos DMOs estando acomodado em pelo menos algumas das câmaras de processamento.

De acordo com formas de realização exemplifica- tivas da invenção, o biorreactor 2200 pode ser adaptado para separar fluidicamente os conteúdos de uma ou mais das câmaras de processamento dos conteúdos de uma ou mais outras câmaras de processamento, como descrito a seguir.

De acordo com uma forma de realização exempli- ficativa da invenção, o biorreactor 2200 pode também incluir um mecanismo para controlar o fluxo de um fluido para dentro e/ou para fora da câmara de processamento 2202, como descrito a seguir.

De acordo com uma forma de realização exemplifi-cativa, o biorreactor 2200 pode incluir um tampão estéril 2222 ligado fluidicamente a uma bomba de seringa não estéril 2214, que pode ser adaptada para injectar ar no tampão 2222 e/ou remover ar do tampão 2222 de um modo 85 ΡΕ1653807 estéril, e.g., através de um filtro estéril 2220, e.g. um filtro de ar com poro de 0,45 μ. O Biorreactor 2200 pode também incluir uma válvula de controlo 2212 capaz de ser movida entre pelo menos quatro posições, e.g., uma posição de entrada de tampão em que o reservatório de entrada 2208 está ligado fluidicamente ao tampão 2222, uma posição de saida de tampão em que o recipiente de residuo 2210 está ligado fluidicamente ao tampão 2222, uma posição de câmara-tampão em que a câmara 2202 está ligada fluidica-mente ao tampão 2222, e/ou uma posição de não ligação em que o tampão 2222, a câmara 2202, o reservatório de entrada 2208, e o recipiente de residuos 2210 estão desligados fluidicamente um do outro. Pode ser ligado um pistão 2226 entre a válvula 2212 e um motor 2224 adaptado para mover a válvula 2212 entre as diferentes posições. Opcionalmente, pode ser ajustado um diafragma de fole 2228 sobre o pistão 2226 de modo que não existe substancialmente nenhuma transferência de ar não estéril para o tampão estéril 2222, e.g., durante o movimento do pistão 2226. O sistema 2201 pode também incluir um motor 221 para actuar um pistão 2218 de bomba de seringa 2214. Se o biorreactor 2200 inclui mais do que uma câmara, então pode ser implementado um motor para fazer actuar em simultâneo cada um dos pistões associados com as câmaras, ou pode ser implementada uma pluralidade de motores, sendo cada um capaz de fazer actuar um ou mais dos pistões. O sistema 2201 pode incluir um controlador 2286 86 ΡΕ1653807 capaz de controlar a operação do motor 2216 e/ou motor 2224, e.g., como descrito a seguir. 0 fluido do reservatório 2208 pode ser transferido de uma forma controlável para a câmara 2202, e.g., de ordem a encher a câmara 2202. Por exemplo, o controlador 2286 pode activar o motor 2224 para posicionar a válvula 2212 na posição de entrada do tampão, e activar de forma controlada o motor 2216 de modo a que bomba de seringa 2214 evacue uma quantidade pré-determinada de ar do tampão 2222. Como resultado, um volume pré-determinado de fluido correspondente ao volume pré-determinado de ar pode ser "retirado" do reservatório interno 2208 para o tampão 2222. O controlador 2286 pode então activar de forma controlável o motor 2224 para mover a válvula 2212 para a posição da câmara-tampão, e activar de forma controlável o motor 2216 de modo a que a bomba de seringa 2214 descarregue o fluido do tampão 2222 para a câmara 2202. Da mesma maneira, a bomba de seringa e a válvula de controlo pode ser controlada para descarregar os conteúdos da câmara 2202, ou uma sua quantidade parcial, para o recipiente de resíduos 2210. 0 fluido na câmara 2202 pode ser agitado e/ou misturado de forma controlável, e.g., de modo a assistir à transdução virai e/ou qualquer outro procedimento de manutenção ex vivo aplicado a DMO 2204. Por exemplo, o controlador 2286 pode activar de forma controlável o motor 2216 e ou o motor 2224, e.g., como descrito acima, para 87 ΡΕ1653807 descarregar periodicamente o fluido, ou uma parte deste, da câmara 2202 para o tampão, e posteriormente injectar o fluido no tampão 2222 de volta para a câmara 2202.

Pode ser utilizado ar para purgar o fluido localizado numa ou mais "linhas de passagem", e.g., ligando de um modo fluido, entre o reservatório de entrada 2208, o recipiente de resíduos 2210 e/ou a câmara 2202, por exemplo, de modo a "enxaguar" as linhas de passagem após transferir o fluido de/para a câmara 2202, o reservatório de entrada 2208, e/ou o tampão 2222. Este aspecto pode ser útil, por exemplo, de modo a reduzir um "volume morto" de fluido, que pode ser "preso" em uma ou mais das linhas de passagem. Por exemplo, o controlador 2286 pode activar de um modo controlável o motor 2216 para mover o pistão da seringa 2218 de modo que um volume pré-determinado de ar seja removido para o tampão 2222, antes de retirar o fluido do reservatório 2208 para o tampão 2222. O tampão 2222 pode ter uma geometria de modo a que o ar suba acima do fluido no tampão 2222, de modo que após a actuação da bomba de seringa 2214 o fluido no tampão 2222 pode ser descarregado primeiro seguido pelo ar, que irá actuar para enxaguar as linhas de passagem de algumas ou a totalidade do fluido que aí permanece.

Uma superfície de fundo 2230 da câmara 2202 pode incluir uma pluralidade de buracos, ou um padrão do tipo malha, e.g., configurada para permitir que o fluido seja transferido para dentro e/ou para fora da câmara 2202 de um ΡΕ1653807 modo substancialmente uniforme, e/ou para permitir descarregar substancialmente a maior parte do fluido da câmara 2202. Esta configuração pode também permitir reduzir a ocorrência de "pontos mortos", i.e., áreas da câmara 2202 em que o fluido permanece estagnado e/ou não é refrescado. A tampa 2232 pode ser uma tampa removível tal como uma membrana afixada por um adesivo destacável, material de rolhão de silício, ou semelhantes. A tampa 2232 pode ser adaptada para manter uma "barreira" estéril entre a câmara 2202 e o ambiente. Opcionalmente, pode ser implementado um filtro de ar estéril 2234, e.g., um filtro de ar de poro 0,45 pm, para se ligar de uma forma fluida a câmara 2202 e o ambiente, permitindo desse modo o equilíbrio de pressões embora mantendo uma barreira estéril entre a câmara 2202 e o ambiente. Alternativamente, a tampa 2232 pode incluir um material "respirável", de modo a que o equilíbrio da pressão pode ser permitido através da tampa 2232 . O reservatório 2208 e/ou o recipiente de resíduos 2210 pode ser ligado de forma comum, e.g., através de um ou mais de saídas múltiplas (não apresentado) , para uma ou mais das câmaras de processamento 2202 para um indivíduo específico. Alternativamente, o reservatório de entrada 2208 e/ou o recipiente de resíduos 2210 pode ser ligado individualmente a cada uma das câmaras de processamento. O reservatório de entrada 2208 e/ou recipiente de resíduos 2210 pode incluir um mecanismo para equilibrar a pressão de 89 ΡΕ1653807 um modo estéril. Por exemplo, o reservatório de entrada 2208 e/ou o recipiente de resíduos 2210 pode ser ligado de um modo fluido ao ambiente através de um filtro de ar estéril 2236 e/ou um filtro de ar estéril 2238, respecti-vamente. O filtro 2236 e/ou o filtro 2238 pode incluir, por exemplo, um filtro de ar com um poro de 0,45 pm. Alternativamente, o recipiente de resíduos 2210 pode incluir um recipiente de resíduos expansível, de modo a que não seja necessário um equilíbrio de pressão e, deste modo, não possa ser utilizado para ele nenhum filtro de ar estéril.

Pode ser adaptado um biorreactor 2200 para permitir a injecção directa de fluido ou descarregar o fluido de/para a câmara 2202. Pode ser utilizada uma porta septo de amostragem 2240, por exemplo, para injecção directa de fluido de vector virai, ou para amostragem do meio de crescimento para testar para vários parâmetros do biorreactor, tal como ELISA, incorporação de glucose, produção de lactato ou qualquer outro parâmetro indicativo. A porta septo 2240 pode incluir uma porta de silício convencional adaptada para inserção de agulha ou uma porta de cânula, e.g., como descrito acima com referência à porta de inserção de DMO 2201. Pode ser destacada uma seringa (não apresentado) inserida através da porta septo 2240. A seringa pode ser movida por um motor, e.g., semelhante ao motor 2216, que pode ser activado manualmente ou automaticamente, e.g., pelo controlador 2286.

Pelo menos alguns e em algumas formas de 90 ΡΕ1653807 realização exemplificativas todos, os componentes do biorreactor 2200 podem ser mantidos em condições pré-determinadas, e.g., condições de incubador, incluindo uma temperatura de aproximadamente 37 °C, uma atmosfera gasosa de aproximadamente 90-95% de ar e aproximadamente 5-10% de CO2, e/ou um grau relativamente elevado de humidade, e.g., 85-100%. De acordo com uma forma de realização exemplar, apenas a câmara 2202 pode ser mantida nas condições do incubador. Como descrito acima, estas condições de incubador podem ser necessárias, e.g., para manter a vitalidade da cultura de tecidos DMO.

De acordo com formas de realização exemplifica-tivas da invenção, pode ser implementado um arranjo de fornecimento de fluido para fornecer o fluido à linha de entrada 2242 a partir de pelo menos um tanque de fluido, e.g., os tanques de fluido 2244 e 2246. Numa forma de realização exemplar, os tanques 2244 e 2246 podem conter o mesmo fluido, e.g., um meio de crescimento, em cujo caso um tanque pode ser utilizado como um reservatório de apoio para o outro tanque. Noutra forma de realização exemplar, os tanques 2244 e 2246 podem conter dois tipos diferentes de fluidos, tais como dois tipos de meio de crescimento para serem utilizados em diferentes estádios do processamento de DMO. 0 tanque 2244 e/ou o tanque 2246 pode incluir um filtro de ar estéril para equilibrar a pressão de um modo estéril, e.g., como descrito acima com referência ao reservatório 2208. Alternativamente, o tanque 2244 e/ou o tanque 2246 pode incluir um tanque desmontável, e.g., um saco de plástico estéril como é conhecido na arte. 91 ΡΕ1653807

Cada um dos tanques 2244 e 2246 pode ser ligado de um modo fluido a um sistema de ligação combinado 2254 através de uma válvula 2252, e.g., uma válvula de aperto, um conector de porta septo 2248 e um espigão de penetração 2250. O conector 2254 pode incluir, por exemplo um conector em forma de Y ou em forma de T como é conhecido na técnica. A válvula 2252 pode ser adaptada para controlar o fluxo do fluido do tanque 2244 e ou tanque 2246 para o conector 2254. Pode ser localizada uma bomba, e.g., uma bomba peristáltica, 2256 entre o conector 2254 e o conector 2258, ao longo da linha de entrada 2242. 0 controlador 2286 pode ser utilizado para controlar a quantidade e/ou a taxa de fluxo do fluido proporcionado para o reservatório 2208 através da actuação de forma controlável do motor 2257 e/ou das válvulas 2252.

De acordo com uma forma de realização exemplar, o fluido contido nos tanques 2244 e/ou no tanque 2246 pode ter uma vida de prateleira em armazenamento de 9 dias em condições refrigeradas a 4 °C. Deste modo, um sistema de refrigeração (não apresentado) pode ser empregue para manter o fluido dos tanques 2244 e/ou 2246 a uma temperatura, que pode ser mais baixa do que a temperatura de incubação do reservatório 2208. Consequentemente, a linha de entrada 2242 pode passar através da interface entre as condições do refrigerador e as condições do incubador. Após a vida de prateleira ter expirado, o tanque 2244 e/ou o tanque 2246 pode ser recolocado pelo novos tanques. 92 ΡΕ1653807

Pelo menos alguns dos elementos do biorreactor 2200 podem ser formados de componentes de plástico estéril. De acordo com estas formas de realização, o dispositivo do biorreactor 2200 pode incluir um dispositivo de biorreactor empacotado de forma estéril para uma utilização única, que pode ser transportado para um local de colheira de DMO e pode ser aberto num ambiente estéril e preparado no local de modo a que o meio de crescimento seja injectado em cada câmara do biorreactor 2202. O utensílio utilizado para a colheita os DMOs podem ser inseridos através das portas de inserção do DMO 2201 para enxaguar os DMOs nas câmaras 2202 de uma forma estéril, como descrito acima. O dispositivo de biorreactor 2200 pode ser transportado, e.g., em condições de incubador, para um local de processamento onde pode ser ligado a outros componentes do sistema 2207, e.g., o conector 2258, os motores 2216 e/ou 2224, as válvulas de aperto 2252, e/ou a bomba peristáltica 2256. O controlador 2286 pode então controlar a manutenção e transdução dos DMOs durante o processamento inteiro ex vivo em que o DTMO é produzido a partir do DMO recolhido. A dosagem necessária para o indivíduo específico pode ser determinado através da utilização do modelo farmacocinético, e.g., como aqui descrito. O dispositivo do biorreactor 2200 pode ser então destacado do sistema 2207 e transportado, e.g., em condições do incubador, para o local do implante. De modo a implantar um DTMO específico, e.g., de acordo com os métodos de implante descritos acima, a câmara de biorreactor 2202 pra o específico pode ser aberta removendo a tampa 2232 e o DTMO pode ser removido da câmara. 93 ΡΕ1653807

Exemplos Exemplo 1 Níveis de secreção de eritropoietina humana in vitro

através de DTMO -hEPO

Foram realizadas experiências para testar a variabilidade do nível de secreção de hEPO in vitro entre DTMOs-hEPO obtidos a partir de diferentes amostras de pele humana.

Procedimento Experimental

Foi preparado DTMO-hEPO (em triplicados) a partir de amostras de pele obtidas a partir de seis indivíduos humanos diferentes e os níveis de secreção de hEPO foram medidos em vários pontos no tempo, como indicado na Figura 4, após o vector virai ter sido lavado.

Resultados Experimentais

Os níveis de secreção de DTMO-hEPO foram semelhantes entre as diferentes amostras de pele humana. Adicionalmente, os níveis de secreção de DTMO-hEPO foram semelhantes aos níveis de secreção de hEPO previamente obtido a partir da TMO-hEPO de espessura parcial (resultados não apresentados). 94 ΡΕ1653807

Exemplo 2 Histologia

De modo a verificar que o DTMO contém principalmente componentes dérmicos, foi realizada uma análise histológica. Foram preparados MOs a partir de amostras de peles de espessura parcial skin ou amostras de pele dérmicas e a análise histológica foi efectuada por um dermatopatologista. Como podem ser observado do lado esquerdo da Figura 5, o DTMO contém camadas dérmicas e componentes dérmicos sem camadas basais e/ou epidérmicas residuais. Em comparação, os TMO de espessura parcial, apresentados no lado direito da Figura 5, contém todas as camadas de pele que incluem as camadas basais e epidérmicas.

Exemplo 3

Estudos Imunocitoquimicos

Para estudar que células são transduzidas no tecido DTMO-hEPO, foi realizada uma análise imuno-histoquímica histológica de DTMO-hEPO no dia 9 pós colheita, utilizando um anticorpo monoclonal anti-hEPO (diluição de 1:20). A análise revelou uma forte coloração dos Fibroblastos dérmicos, como apresentado na Figura 6. A coloração foi disseminada ao longo de todo o DTMO. 95 ΡΕ1653807

Exemplo 4

Comparação da actividade hematopoiética de hEPO a longo termo em murganhos SCID derivados de DTMO-hEPO e de todo o

TMO

Foi realizada uma experiência para examinar e compare os efeitos a longo termo de DTMO-hEPO implantados subcutaneamente e derivados de TMO de espessura parcial-hEPO em murganhos SCID.

Procedimento Experimental

Foram preparados TMO-hEPO derivados de DTMO-hEPO Humano e de espessura parcial humanos e implantados subcutaneamente em dois grupos de murganhos SCID (cinco murganhos por grupo). Foi implantado um grupo de controlo com DTMO humano e TMO derivado de espessura parcial transduzidos com um vector virai Ad/lacZ.

Resultados Experimentais

Como é apresentado na Figura 7, foram identificados niveis de secreção e respostas fisiológicas semelhantes nos dois grupos experimentais enquanto, como esperado, os murganhos do grupo de controlo não tivessem hEPO no seu sangue. 96 ΡΕ1653807

Em todos os grupos experimentais, pode ser observada uma elevação do hematócrito tão precocemente como nos 15 dias pós-implante e é mantida durante mais de 5 meses, enquanto os murganhos de controlo de MO/lacZ não apresentam uma tal elevação no nivel do hematócrito. O DTMO-hEPO parece resultar em niveis de secreção semelhantes durante períodos de tempo semelhantes quando comparado com os TMO derivados de espessura parcial-hEPO,

Exemplo 5

Os DTMO-hEPO não formam quistos de queratina quando implantados subcutaneamente

Procedimento Experimental DTMO-hEPO e TMO derivados de espessura parcial-hEPO foram implantados S.C. em murganhos SCID e a formação de quistos de queratina foi monitorizada através de análise clínica e histológica.

Resultados Experimentais

Como pode ser observado claramente na Figura 8, a formação de quistos de queratina foi observada enquanto se implantam os TMO derivados de espessura parcial-hEPO 76 e 141 dias após o implante. Em contraste, não foi observada formação de quistos em murganhos SCID com o DTMO-hEPO 113 dias após o implante. 97 ΡΕ1653807

Exemplo 6

Integração de DMO e derivados de espessura parcial em indivíduos humanos saudáveis

Procedimento Experimental 0 MO dérmico e TMO derivado de espessura parcial humana derivado de espessura parcial foram obtidos utilizando um dermátomo disponível comercialmente (Aesculap GA 630). Antes da colheita, foram efectuadas anestesias tópicas e locais tando para o local do dador como do receptor, utilizando loção Emla (anestesia tópica) e injecções subcutâneas de Marcaina + Adrenalina (anestesia local).

Foram colhidos dois tipos de pele de modo a produzir MO dérmico humano e MO derivado de espessura parcial. Para o MO derivado de espessura parcial humano, foi excisada uma tira de pele saudável a partir da parte mais baixa do abdómen. A partir desta secção de pele, foram preparados seis MOs lineares, como previamente descrito. Simultaneamente, foram realizadas cortes de dimensões especificas no sitio do implante utilizando um marcador de cortes ajustável, e os MOs foram enxertados pouco tempo depois nos cortes da pele. Para preparar MO dérmico Humano, foi colhida pele em dois passos. Primeiro, foi colhido um retalho de pele de 200 pm de profundidade e mantido em gaze 98 ΡΕ1653807 húmida. A partir deste sitio de recolha, foi recolhida uma tira de pele da derme com 1 mm de profundidade. Após a recolha da pele, o retalho de pele de 200 pm foi colocado novamente no sitio do dador que serve como uma compressa biológica. A partir do retalho da derme colhido acima, foram preparados quatro MO dérmicos utilizando um procedimento idêntico aquele para o MO derivados de espessura parcial TMO derivado de espessura parcial. Os MO dérmicos humanos foram implantados subcutaneamente pouco tempo depois, utilizando um trocarte. Os sitios do dador e do implante foram cobertos utilizando uma membrana transparente Bioclusive® (Johnson& Johnson, USA) . Após uma semana a compressa foi mudada e os implantes foram examinados para verificar a integração do enxerto. Duas a três semanas após o implante de MO, o procedimento de abdominoplastia agendado foi efectuado e foi excisada uma secção de pele, incluindo o enxerto e a área de implante. Foi realizada uma avaliação clinica na área de enxerto incluindo fotografias e exame histológico para determinar a integração do MO.

Resultados Experimentais

Uma inspecção clinica, que foi efectuada uma semana após o implante, e a análise histológica, que foi efectuado pouco tempo após a abdominoplastia (2-3 semanas após a enxertia), revelou uma integração excelente dos MOs enxertados nos cortes da pele nos sitios de implante de MO dérmicos subcutâneos (Figura 9) . Não foi encontrada indicação de inflamação ou inchaço em qualquer MO derivado 99 ΡΕ1653807 de espessura parcial que foram implantados nos cortes ou MO dérmicos que foram implantados subcutaneamente.

Exemplo 7 O implante autólogo em miniatura de TMOs de espessura parcial linear de pele de suino, que expressa a eritropoietina humana (hEPO em animais imunocompetentes).

Foram preparados micro-órgãos de pele de suino miniatura lineares (30,6 mm de comprimento e 0,6 micrómetros de largura) (suino Sinclar) a partir de amostras de tecido de pele frescos obtidos a partir de animais vivos sob procedimentos de anestesia geral. As amostras de tecido de 0,9-1,1 mm de espessura de pele parcial (profundidade) foram removidas utilizando um dermátomo comercial (Aesculap GA630) e lavadas utilizando DMEM contendo glutamina e Pen-Strep em placas de Petri (90 mm) .

De modo a produzir os micro-órgãos lineares, a amostra de tecidos acima foi cortada através de um dispositivo de pressão utilizando um estrutura laminar como descrito acima, nas dimensões desejadas: 30,6 mm x 600 micrómetros. Os micro-órgãos lineares resultantes foram colocados, um por poço, numa micro-placa de 24 poços contendo 500 μΐ por poço de DMEM (Biological Industries - Beit Haemek) na ausência de soro sob 5% de CO2 a 37 °C durante 24 horas. Cada poço sofreu um procedimento de transdução de modo a 100 ΡΕ1653807 produzir um micro-órgão terapêutico da pele de suino miniatura (pele de porco-TMO) utilizando um vector adeno virai (lxlO10 IP/mL) portador do gene da eritropoietina humana (Adeno-hEPO) durante 24 horas enquanto a placa era agitada. O meio foi mudado em cada 2-4 dias e analisada quanto à presença de hEPO segregada utilizando um kit ELISA especifico (Cat. # DEP00, Quantikine IVD, R&D Systems).

Os TMOs lineares de hEPO da pele de suíno miniatura acima descritos foram implantados subcutaneamente e enxertados como enxertos de pele em vários suinos miniatura imunocompetentes (em dois dos porcos miniatura, TMOs-hEPO foram implantado subcutaneamente, e em dois suinos miniatura diferentes, os TMOs-hEPO foram enxertados em cortes de 1 mm de profundidade). Um número suficiente de TMOs-hEPO foram implantados em cada suino miniatura de modo que o seu nivel de secreção combinada pré-implante em cada porco foi de aproximadamente 7 microgramas por dia. Os niveis elevados de hEPO no soro (Figura 3A) determinados por um ensaio ELISA e a elevação da contagem de reticulócitos foram obtidos durante sete dias após implante.

Foi apresentado um número limitado de alterações genéticas. Contudo, com base na metodologia aqui descrita em que um tecido vivo é replantado no corpo do doente, e a viabilidade desse tecido no corpo após implante, é claro que virtualmente qualquer alteração genética no tecido, induzida por virtualmente qualquer método conhecido 101 ΡΕ1653807 resultará em secreções de proteínas alvo ou outros agentes terapêuticos no doente.

As variações das formas de realização da invenção, incluindo as combinações de características das várias formas de realização ocorrerão às pessoas da técnica. O âmbito da invenção é assim limitado pelo âmbito das reivindicações. Além disso, para evitar qualquer questão relacionada com o âmbito das reivindicações, em que os termos "compreender" "incluir," ou "ter" e seus conjugados, são utilizados nas reivindicações, significam "incluindo mas não necessariamente limitadas a".

Lisboa, 16 de Julho de 2012

Claims

ΡΕ1653807 1 REIVINDICAÇÕES 1. Micro-órgão dérmico geneticamente modificado que expressa pelo menos um produto de gene recombinante, compreendendo o referido micro-órgão dérmico uma pluralidade de componentes dérmicos, que retêm a microarquitectura e estrutura tridimensional do tecido dérmico a partir do qual foi derivado, possuindo dimensões seleccionadas de modo a permitir a difusão passiva de nutrientes adequados e gases para as células do referido micro-órgão dérmico e remoção por difusão dos residuos celulares das referidas células de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de residuos no referido micro-órgão dérmico, em que pelo menos algumas das referidas células expressam pelo menos uma porção de pelo menos um produto de gene recombinante, em que uma dimensão do comprimento é 10-60 mm, em que pelo menos uma dimensão da secção transversal é 0,5-3,5 mm em que pelo menos algumas das referidas células expressam pelo menos um produto de gene recombinante; e em que o referido explante de micro-órgão dérmico é mantido como um explante, in vitro durante vários meses, e em que o referido micro-órgão dérmico geneticamente modificado é para utilização num método de tratamento em que o referido micro-órgão dérmico geneticamente modificado é implantado na ou sob a pele de um indivíduo receptor e em que o micro-órgão dérmico geneticamente modificado produz e segrega o referido pelo menos um produto do gene recombinante. 2 ΡΕ1653807
2. Micro-órgão dérmico geneticamente modificado da reivindicação 14, em gue referido micro-órgão dérmico inclui parte da secção transversal da derme.
3. Micro-órgão dérmico geneticamente modificado de qualquer uma das reivindicações 1-2, em que o referido micro-órgão dérmico inclui tecido gordo.
4. Micro-órgão geneticamente modificado dérmico de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que referido pelo menos um produto de gene recombinante é naturalmente produzido por um órgão a partir do qual o micro-órgão dérmico é derivado.
5. Micro-órgão geneticamente modificado dérmico de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido, pelo menos um, produto de gene recombinante não é naturalmente produzido pelo órgão a partir do qual o micro-órgão dérmico é derivado.
6. Micro-órgão dérmico geneticamente modificado de qualquer uma das reivindicações 1-5, em que o referido micro-órgão dérmico geneticamente modificado compreende uma demarcação in vivo.
7. Micro-órgão dérmico geneticamente modificado para a referida utilização de acordo com qualquer uma das 3 ΡΕ1653807 reivindicações 1-5, em que o referido micro-órgão dérmico é derivado do referido individuo.
8. Utilização de um micro-órgão dérmico geneticamente modificado que expressa um produto de gene recom-binante, em que pelo menos um produto de gene recombinante é um agente terapêutico, em que o referido micro-órgão dérmico é um explante de tecido vivo consistindo essencialmente numa pluralidade de componentes dérmicos e não incluindo camadas epidérmicas que retêm a microarquitectura e estrutura tridimensional do tecido dérmico a partir do qual foi derivado, possuindo dimensões seleccionadas de modo a permitir a difusão passiva de nutrientes adequados e gases para as células do referido micro-órgão dérmico e remoção por difusão dos residuos celulares das referidas células de modo a minimizar a toxicidade celular e morte concomitante devido a nutrição insuficiente e acumulação de residuos no referido micro-órgão dérmico, em que pelo menos algumas das referidas células expressam pelo menos uma porção de pelo menos um produto de gene recombinante, em que uma dimensão do comprimento é 10-60 mm, em que pelo menos uma dimensão da secção transversal é 0,5-3,5 mm em que pelo menos algumas das referidas células expressam pelo menos um produto de gene recombinante; e em que o referido explante de micro-órgão dérmico é mantido como um explante, in vitro durante vários meses, para a determinação in vitro do nivel de secreção do referido pelo menos um produto do gene recombinante. 4 ΡΕ1653807
9. Micro-órgão dérmico geneticamente modificado da reivindicação 8, em que o referido micro-órgão dérmico inclui parte da secção transversal da derme.
10. Utilização de qualquer uma das reivindicações 8-9, em que o referido micro-órgão dérmico inclui o tecido gordo.
11. Utilização de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido, pelo menos um, produto de gene recombinante é naturalmente produzido pelo micro-órgão dérmico a partir do qual foi derivado.
12. Micro-órgão dérmico geneticamente modificado de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o referido, pelo menos um, produto de gene recombinante não é naturalmente produzido pelo órgão a partir do qual o micro-órgão dérmico é derivado. Lisboa, 16 de Julho de 2012