CN1687099A - 射干总黄酮提取物及其制备方法和其在药物制备中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种射干总黄酮提取物及其制备方法。该提取物是从射干或鸢尾中提取而得，总黄酮的含量为55％～90％；其中含有鸢尾甙；以及选自鸢尾甙元、野鸢尾甙、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的一种或多种；鸢尾甙的含量为10％～50％。其大孔树脂制备工艺具有简单、方便，重现性好，有效地富集了黄酮类成分，祛除了其非黄酮类成分如鸢尾醛等三萜类化合物、甾体等，成品质量易控制，含量高，提取效率高，可工业化生产等优点。本发明还提供了包含所述射干总黄酮提取物的药物组合物。该射干总黄酮提取物具有良好的抗骨质疏松作用、抗炎作用和抗心脑缺血作用，可广泛用于治疗和/或预防骨质疏松症、各种炎症以及心脑血管疾病。

Description

射干总黄酮提取物及其制备方法和其在药物制备中的应用

技术领域

本发明涉及一种射干提取物，尤其涉及一种射干总黄酮提取物。

本发明还涉及该提取物的制备方法。

本发明还涉及该提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松症药物中的应用。

本发明还涉及该提取物在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用。

本发明还涉及该提取物在制备抗炎药物中的应用。

本发明还涉及包含该提取物的药物组合物。

背景技术

骨质疏松症(有时也简称为骨质疏松)是全身骨骼成分减少的一种骨骼疾病，主要表现为骨组织内单位体积中骨量减少，骨矿物质和骨基质随年龄的增加(或妇女绝经后)等比例的减少，骨组织的显微结构发生改变而致其骨组织的正常荷载功能发生变化。骨质疏松在临床上表现为腰背疼、病理性骨折、椎体变形、体态变形致“龟背”出现，伴有周身骨骼的疼痛等症状。

原发性骨质疏松症占骨质疏松症的90％。它是老年人的一种常见病，一种全身性骨病。主要表现是骨组织的矿物质和骨基质均有减少、骨量低和骨的微细结构有破坏，导致骨的脆性增加和容易发生骨折。女性较男性多见，常见于绝经后妇女和老年人，在轻微外伤或无外伤的情况下都容易发生骨折，75岁以上的妇女骨折发生率高达80％以上。

骨质疏松症是骨骼代谢异常的疾病，它的产生原因至今尚未明确，但医学界认为与下列因素有关：内分泌因素，其中雌激素降低是骨质疏松症发生的主要原因，此外与营养、遗传、营养状况、生活方式等密切相关。

目前临床上用于治疗骨质疏松症的主要药物有维生素D类药物、甲状旁腺素(PHT)、氟化物、同化激素、双磷酸盐类等。这些药物长期应用均产生严重的毒副作用，同时一些患者因禁忌症不能应用这些药物，因此研制安全、有效地治疗骨质疏松症的天然药物具有其重要的社会和经济价值。

心脑血管疾病是指心脏和动脉血管发生硬化而引起心脏和脑的缺血或出血的疾病。其主要包括心肌梗塞、心绞痛、高血压、动脉硬化、脑出血、脑血栓、高脂血症及冠心病等，发病率和死亡率已居各种类疾病首位，被喻为人类第一杀手。由于症状不明显，发病突然，直接损害重要器官，危及生命，又称为“无声杀手”。

心血管疾病主要为缺血性心血管疾病，其是指心脏和动脉血管发生硬化而引起心脏的疾病，主要包括心肌梗塞、心绞痛、高血压、动脉硬化及冠心病、心率失常、心力衰竭等。

脑血管疾病多指脑动脉硬化引起的脑组织缺血、坏死(脑梗死)及脑部病变的血管破裂造成脑出血，统称脑卒中，脑卒中包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中(即脑出血)。

脑血管疾病和心血管疾病之间在病理学方面存在一定的相关性系，但二者的疾病、症状、病因、治疗方法存在很大差异。对心血管作用的药物一般直接作用于心脏和血管，以改善心脏负荷、心肌供血、调整血流动力学特征为药理目标，而治疗脑血管病药物一般选择性作用周围血管，尤其是选择性作用于脑血管，以改善脑局部供血为药理学目标，或者以神经原保护等作为药理目标，而非直接作用于血管。

植物雌激素，能有效治疗绝经后骨质疏松症，改善原发性骨质疏松症和其它代谢性骨疾病。它可通过抑制破骨母细胞的增殖、分化、成熟和破骨细胞的活性而发挥抗骨吸收作用；同时刺激成骨细胞的前体和成骨细胞对PTH反应性的调节发挥作用，加强成骨细胞的活性；维持成骨细胞和破骨细胞活性间的动态平衡，有效的防治骨质疏松症。

射干为鸢尾科(Iridaceae)射干属植物射干(Belamcanda chinensis(L.)DC.)的干燥根茎，为常用正品中药，主产于河南、湖北、浙江、安徽、江苏等省。

鸢尾为鸢尾科(Iridaceae)鸢尾属植物鸢尾(Iris tectorum Maxim.)的干燥根茎，为西南地区地方习用射干品种，主产于四川、云南、贵州等省。

在本草著作中，从《唐本草》至宋代《图经》，所述之射干均为今《中国药典》所载之射干(Belamcanda chinensis(L.)DC.)，而其它各时期本草所收载的射干多为鸢尾(Iris tectorium Maxim.)的根茎。

现代药理学研究表明，射干具有抗炎、解热、抗氧化、兴奋咽喉粘膜以及促进唾液分泌等作用。

鸢尾总甙含鸢尾甙元、鸢尾甙、染料木素等。已有研究表明，鸢尾甙元、染料木素等与雌激素受体结合，影响成骨细胞的活性以及骨基质的产生、分泌和骨矿化的过程(Kaiko Morito，Tohru Aomori，Toshiharu Hirose etc.，Interactionof phytoestrogens with estrogen receptors αand β，Biol.pharm.Bull.，25：1，48-52，2002)。

中国专利申请99804123.8公开了用鸢尾科和总状花升麻(Cimicifugaracemosa(L.)Nutt.)的提取物和鸢尾黄素作为一种雌激素型对器官有选择性而无趋子宫作用的药物。该发明涉及用鸢尾科和总状花升麻的提取物和鸢尾黄素作为一种雌激素型对器官有选择性的药物，用于选择性治疗和/或预防心血管疾病，特别是动脉粥样硬化、骨质疏松和更年期疾病，例如预防或减轻热潮红，但该专利对鸢尾科提取物的制备方法未作详细说明及其所得提取物的组分也未作定量检测，因此其所述提取物的化合物组成不清晰。

尽管已知射干所含部分异黄酮类化合物具有植物雌激素活性，但是，对于植物提取物而言，此类成分是共存的，并且存在其它已知和未知成分。目前，此种情况下的植物提取物的活性作用以及与各单体成分之间的关系尚不明了。

对于射干提取物的提取工艺，现有文献涉及到乙醇提取条件的研究(吉文亮，秦民坚等，中药材，2000，23(8)：486-487)，但研究仅涉及采用乙醇进行初步提取，即未见对该提取物进行进一步精制或处理。

中国专利申请99804123.8提到了用有机溶剂或超临界CO₂提取射干提取物。由于有机溶剂范围极广，不同溶剂提取所得产物的化学组成、得率以及生物活性均可能存在极大差异。现有技术中，超临界CO₂的提取方法一般是提取低极性成分，而射干或鸢尾中所含异黄酮类成分以极性成分鸢尾甙为主。因此，采用此技术提取含鸢尾甙提取物的价值仍待考察。

现有文献中均未见涉及射干和/或鸢尾溶剂提取物的进一步精制的工艺研究。鉴于射干中所含非黄酮类成分如鸢尾醛(具有刺激咽喉黏膜作用)等三萜类化合物，而此类成分存在于多数有机溶剂提取物中，因此，对射干和/或鸢尾溶剂提取物进行进一步精制是必要的。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种射干总黄酮提取物。

本发明的另一个目的在于提供该射干总黄酮提取物的制备方法。

本发明的再一个目的在于提供该提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松症药物中的应用。

本发明的又一个目的在于提供该提取物在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物中的应用。

本发明的又一个目的在于提供该提取物在制备抗炎药物中的应用。

本发明的还一个目的在于提供包含该提取物的药物组合物。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种射干总黄酮提取物。该提取物是从射干或鸢尾中提取而得，总黄酮的含量为55％～90％重量；其中含有鸢尾甙(tectoridin)；以及选自野鸢尾甙(iridin)、鸢尾甙元(tectorigenin)、野鸢尾黄素(irigenin)和次野鸢尾黄素(irisflorentin)的一种或多种；鸢尾甙的含量为10％～50％重量。

其中，所述鸢尾甙(中文又称射干苷、鸢尾苷)即Tectoridin，4’，5-二羟基-6-甲氧基异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖甙(4’，5-dihydroxy-7-(β-D-gluco-pyranosyloxy)-6-methoxy-isoflavone[CAS登录号：611-40-5])，其分子式：C₂₂H₂₂O₁₁，分子量：462。

可采用紫外分光光度法，以鸢尾甙为对照品，在266nm测定射干总黄酮提取物中总黄酮的含量。

当色谱条件为：C18色谱柱，规格为4×250mm，柱温30℃，流动相为水和乙腈，梯度洗脱，洗脱程序为0min时，水∶乙腈为88∶12；20min时，水∶乙腈为72∶28，60min时，水∶乙腈为40∶60，流速为1ml/分钟，用高效液相色谱法检测，在标准品鸢尾甙的保留时间为12.3分钟时，野鸢尾甙的保留时间为13.8±0.2分钟，和/或鸢尾甙元的保留时间为22.3±0.2分钟，和/或野鸢尾黄素的保留时间为24.1±0.2分钟，和/或次野鸢尾黄素的保留时间为31.3±0.2分钟。在本发明的一个具体实施方式中，使用Hypersil BDS C18填料常规色谱柱进行检测。

进一步的，所述总黄酮的含量为55％～80％重量；更进一步的，所述总黄酮的含量为55％～70％重量。

进一步的，所述鸢尾甙的含量为10％～40％重量；更进一步的，所述鸢尾甙的含量为10％～30％重量。

优选的，所述射干总黄酮提取物含有鸢尾甙；以及选自野鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的至少两种。

更优选的，所述射干总黄酮提取物含有鸢尾甙；以及选自野鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的至少三种。

再优选的，所述射干总黄酮提取物同时含有鸢尾甙、野鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素。

最优选的，鸢尾甙∶野鸢尾甙∶鸢尾甙元∶野鸢尾黄素∶次野鸢尾黄素的重量比为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。

本发明所述的射干总黄酮提取物可以通过下述方法制备得到：

1)药材用含水乙醇提取；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液；

3)以水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用水洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用乙醇洗脱吸附柱并收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到射干总黄酮提取物。

进一步的，本发明所述的射干总黄酮提取物可以通过下述方法制备得到：

1)药材用50～80％的乙醇水溶液热回流提取2～3次，合并提取液；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液至原药材的6～10倍体积；

3)以3～5倍体积的水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/小时的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用50～90％的乙醇，以0.5～2.5BV/小时的流速洗脱吸附柱，收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到射干总黄酮提取物。

本发明所述的“射干总黄酮提取物”，是指采用任何方法从鸢尾科(Iridaceae)植物射干(Belamcanda chinensis(L.)DC.)或鸢尾(Iris tectorumMaxim.)，特别是从射干或鸢尾的根茎中提取获得的，以总黄酮类化学成分作为主要组分的提取物。因此，该射干总黄酮提取物为所含各个活性成分协同起效的混合物，它不同于活性单体，它的药效也不同于各个活性成分药效的简单加和。本发明所述的提取物中，总黄酮的含量≥55％，本领域技术人员通常将这样的提取物称为有效部位。在本说明书中为了叙述方便，有时将“射干总黄酮提取物”简称为“射干总黄酮”。

本发明所用的射干和鸢尾同属于鸢尾科，具有相似的成分和性质，因此均可用于本发明，以制备上述射干总黄酮提取物。

本发明采用高效液相色谱法、高效液相色谱—电喷雾质谱法和薄层色谱对所述射干总黄酮提取物进行了含量控制、指纹图谱特征和非黄酮类杂质分析的研究。

1、含量控制：采用紫外分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)分别测定由实施例1和2制备得到的射干总黄酮提取物中总黄酮的含量和鸢尾甙的含量。以鸢尾甙为对照品，在266nm进行检测。分析测定结果表明其总黄酮的含量为55～90％(重量比)；鸢尾甙的含量为10～50％(重量比)。

2、指纹图谱：采用高效液相色谱—电喷雾质谱法，对射干总黄酮的主要成分进行了分析和鉴定，确定其黄酮主要为鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾甙、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素。

以高效液相分析方法检测，以峰面积归一法计算，其相对峰比例分别为，鸢尾甙∶野鸢尾甙∶鸢尾甙元∶野鸢尾黄素∶次野鸢尾黄素为∶1∶0.12～0.5∶0.10～0.3∶0.20～0.6∶0.1～0.3。

由此推算，鸢尾甙∶野鸢尾甙∶鸢尾甙元∶野鸢尾黄素∶次野鸢尾黄素的重量比为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。

3、杂质分析：采用薄层色谱法，对射干总黄酮提取物中所含杂质进行分析，结果表明其不含有射干或鸢尾药材中包含的致敏物质鸢尾醛。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了所述射干总黄酮提取物的制备工艺。本发明首次对射干总黄酮进行大孔树脂吸附制备工艺的研究，提供了一种射干总黄酮的大孔树脂吸附纯化方法，该纯化方法是将射干液经上树脂柱、洗脱、收集洗脱液、浓缩、干燥，获得纯化的射干总黄酮，从而有效地富集了总黄酮，并去除了杂质如鸢尾醛等。

该提取物的制备方法包括以下步骤：

1)药材用含水乙醇提取；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液；

3)以水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用水洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用乙醇洗脱吸附柱并收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到射干总黄酮提取物。

其中：

步骤1中，所述含水乙醇提取是指以含水乙醇作溶剂，采用本领域内已知的常规技术提取，例如，热回流提取、渗漉法提取、连续逆流提取等，其中，所述含水乙醇是指10倍体积(与药材重量比)浓度为50～80％的乙醇水溶液。举例来说，对于热回流提取，其溶剂用量为药材重量的8～10倍(溶剂体积/药材重量，V/W)；提取次数为2～3次；加热温度可以为60～85℃。

步骤2中，提取液浓缩后，其体积(L)优选为原药材(kg)的6～10倍体积。

步骤3中，浓缩液优选以加3～5倍体积的水稀释。

步骤4中，吸附柱吸附提取液后，优选用1～5BV(柱床体积)的水洗涤，洗脱液流速优选为0.5～2.5BV/hr；洗脱乙醇优选采用50～90％乙醇水溶液，洗脱液流速优选为0.5～2.5BV/hr。

所述大孔树脂通常为苯乙烯型共聚体的含有酯基或氰基的中等极性吸附树脂，其结构为大孔网状结构，例如D-101大孔树脂、SIPI-40大孔树脂、SIPI-21大孔树脂或SIPI-8大孔树脂等。

在上样前，应当对大孔树脂进行前处理，以防止有效成分从废液中流失。在树脂前处理时，通常先用5％HCl洗脱，后用纯化水洗至中性，再用2％NaOH洗脱，后用纯化水洗至中性，连续生产时，用95％乙醇洗柱，后用纯化水洗至醇为零度，即可再次使用。

步骤5中，得到的射干总黄酮提取物进行干燥处理，得到干燥形式的提取物，所用的干燥方法包括真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等。

因此，进一步的，本发明所述的射干总黄酮提取物可以通过下述方法制备得到：

1)药材用50～80％的乙醇水溶液热回流提取2～3次，合并提取液；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液至原药材的6～10倍体积；

3)以3～5倍体积的水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/小时的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用50～90％的乙醇，以0.5～2.5BV/小时的流速洗脱吸附柱，收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到射干总黄酮提取物。

上述BV(Bed Volum)为树脂柱装载的树脂后的柱床体积。树脂柱的处理能力与它的树脂装载量成正比。洗脱液的流量和速率以BV或BV/hr为计算单位。

在采用上述工艺制备提取物之前，通常需要先将该射干药材进行前处理，即将射干粉碎，洗净，晒干，粉碎，过筛。

根据本发明的再一个方面，本发明提供了所述射干总黄酮提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松症药物中的应用。

本发明所述的骨质疏松症包括原发性骨质疏松症、继发性骨质疏松症及原因不明特发性骨质疏松症。

所述原发性骨质疏松症包括老年性骨质疏松症、绝经后骨质疏松症等。

所述继发性骨质疏松症包括甲亢性骨质疏松症、糖尿病性骨质疏松症等。

所述原因不明特发性骨质疏松症包括遗传性骨质疏松症等。

进一步的，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症。

药效试验结果表明，射干总黄酮提取物能明显改善大鼠因雌激素缺乏引起的骨矿丢失，提高骨矿密度，改善骨骼力学性能，增加股骨和胫骨的湿重，提高胫骨的湿比重，对雌激素缺乏诱导的大鼠骨质疏松症有一定的保护作用；射干总黄酮提取物的抗骨质疏松作用具有一定的量效关系，随着剂量的增加而增加。

急性毒性试验结果表明，射干总黄酮提取物经灌胃给药途径，ICR小鼠的食量、体重未见异常，LD₅₀＞6.0g/kg，表明毒性低，具有很好的用药安全性，而未经该工艺处理的乙醇提取物和超临界提取物具有一定的毒性。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了所述射干总黄酮提取物在制备预防和/或治疗脑血管疾病药物中的应用。所述脑血管疾病主要包括高血压、动脉硬化、脑出血、脑血栓、高脂血症及冠心病等。

进一步的，所述心脑血管疾病为缺血性心脑血管疾病。所述缺血性心脑血管疾病主要包括心肌梗塞、心绞痛、高血压、动脉硬化、脑血栓、高脂血症及冠心丙等。

药效学实验结果表明，大鼠反复脑缺血可引起脑组织Ca²⁺-ATPase、SOD活性降低，Ca²⁺、MDA含量升高，造成严重的脑水肿损伤。射干总黄酮提取物能显著对抗上述作用，其作用与尼莫地平相似，提示它对脑缺血有保护效果，也提示对心血管疾病包括心肌缺血等有一定的作用。

根据本发明的又一个方面，本发明提供了所述射干总黄酮提取物在制备抗炎药物中的应用。

由于本发明的射干总黄酮提取物有效的去除了具有刺激咽喉黏膜作用的非黄酮类杂质鸢尾醛，因此该提取物尤其适合于预防和/或治疗各种炎症引起的呼吸道疾病，如咽喉炎、气管炎等。

药效学实验结果表明，结果表明，射干总黄酮提取物对小鼠耳廓二甲苯致炎和大鼠足跖角叉胶致炎均有明显的抑制作用，与对照组相比具有显著性差异，其作用与阿司匹林相似，显示本发明的总黄酮提取物具有良好的抗炎作用。

根据本发明的还一个方面，本发明提供了包含所述提取物的药物组合物。

本发明所述的药物组合物，包含所述射干总黄酮提取物。本发明的射干总黄酮提取物为包含多种活性成分的混合物，因此，该提取物本身也应当被视为本发明所述的药物组合物。

上述两种药物组合物均可以进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。例如，一种药物组合物可以是将射干总黄酮提取物和药学上可接受的载体和/或赋形剂按照一定的配比混合而成；还可以是将射干总黄酮提取物、其它中药提取物和药学上可接受的载体和/或赋形剂按照一定的配比混合而成。

上述药物组合物可进一步按照常规制剂方法配制成可供给药的形式，包括经口或胃肠外给药形式。在可供给药的形式中，应包含治疗有效量的射干总黄酮提取物。所谓“治疗有效量“是指在该剂量下，本发明的提取物能够改善或减轻疾病症状，或能够抑制或阻断疾病的发展。

可供给药的组合物可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂、贴剂、凝胶剂、粉剂或液体制剂(如口服或无菌胃肠外溶液或悬浮液)。这些可供给药的组合物还可以根据需要制备成缓控释制剂或靶向制剂。

口服给药的形式可以为片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂等，它们可以含有常规赋形剂如粘合剂像糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；填充剂如乳糖、蔗糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸；压片润滑剂如硬脂酸镁；崩解剂如淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、交聚维酮、羟乙酸淀粉钠或微晶纤维素或药学上可接受的润湿剂如十二烷基硫酸钠。

液体组合物(如口服液体组合物)可以制备为乳液、糖浆剂或酏剂形式，或者将它们制备为干燥产物形式，在使用前用水或其它适当的溶媒溶解。此类液体制剂可以含有常规的添加剂，如悬浮剂像山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶、氢化可食用脂肪；乳化剂如卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯或阿拉伯胶；非水溶性溶媒(可以包括食用油)如杏仁油、分馏椰子油、油性酯如甘油、丙二醇或乙醇的酯；防腐剂如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨醇；并且如果需要可以含有常规的矫味剂或着色剂。

胃肠外组合物(如胃肠外给药组合物)可以含有所述活性化合物和无菌溶媒，根据使用的浓度，所述活性化合物可以悬浮于或溶解于该溶媒中。制备胃肠外给药的溶液时，可以将本发明的组合物溶于注射用水中，过滤除菌，然后灌装于适当的管制瓶或安瓿中并密封。最好将辅助剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂溶解于所述溶媒中。为增加稳定性，可以将该组合物灌装于管制瓶中后冷冻并真空去除水分。以基本相同的方法可以制备胃肠外悬浮液，但是所述活性化合物是悬浮于溶媒中而不是溶解于溶媒中，并且除菌不能通过过滤进行。可以将所述化合物通过暴露于环氧乙烷中灭菌，然后将其悬浮于无菌溶媒中。最好该组合物中含有表面活性剂或润湿剂以有助于活性组分的均匀分布。

本发明具备以下优点：

1、本发明提供的射干总黄酮提取物的制备工艺能有效地富集总黄酮，去除杂质，其总黄酮含量高，且其质量控制方法可通过紫外分光光度方法和高效液相分析方法进行含量测定和高效液相指纹图谱进行分析，该分析方法简单易控。

2、该射干总黄酮提取物具有明显的抗骨质疏松的作用，高含量的总黄酮制剂能够达到良好治疗效果；该射干总黄酮还具有显著的抗脑缺血和抗炎作用，其中射干总黄酮抗脑缺血的作用为本专利发明人首次发现。

与其中所含单一成分相比，射干总黄酮提取物在培养24hr、48hr及72hr均有促进成骨细胞增殖和分化的作用，作用均较单一黄酮明显。

3、急性毒性试验结果表明，射干总黄酮提取物的毒性低，具有很好的用药安全性，而未经该工艺处理的乙醇提取物和超临界提取物具有一定的毒性。这充分提示了本工艺制备的射干总黄酮提取物的临床用药的安全性。

4、本发明提供的射干总黄酮提取物制备工艺中采用树脂纯化方法，该方法简便、快捷、重现性好；所选用的大孔吸附树脂吸附量大，解吸率大，可反复使用；所选用的溶剂乙醇，价廉、无毒。

该工艺技术突出优点是：(1)提取效率高；(2)有效地富集了主要活性成分-黄酮类成分，且提取物体积小，提高了中药的内在质量；(3)充分祛除了其非黄酮类成分如鸢尾醛(具有刺激咽喉黏膜作用)等三萜类化合物、甾体等；(4)减少了产品的吸潮性；(5)去除了大量的无机盐、粘液质等，从而增强了产品的稳定性；(6)容易制备成外观美观的各种剂型；(7)大孔树脂再生处理方便，降低了工艺成本。

正因为以上优点，充分说明了该工艺适合工业化生产，具有很大的实用性。

为了更好地理解本发明的本质，下面结合附图，通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。

附图的简要说明

图1为本发明射干总黄酮提取物的紫外色谱图；

图2为本发明射干总黄酮提取物的总离子流色谱图；

图3为本发明射干总黄酮提取物的薄层色谱图，图中：1、射干或鸢尾药材的石油醚萃取液；2、鸢尾醛；3、射干总黄酮提取物的石油醚萃取液。

发明的具体实施方式

本发明所用的射干(干燥根茎)购买于湖北省团风县，鸢尾(干燥根茎)购于四川省广元药材公司，经鉴定为鸢尾科植物鸢尾和射干的干燥根茎。本发明所用的试验材料如无特别说明均为市售购买产品。

                   射干总黄酮提取物的制备

【实施例1】从射干中提取射干总黄酮提取物

取射干药材500kg，加入5吨70％乙醇，加热回流提取3h，滤过，药渣继续加3吨乙醇回流提取2h，滤过，两次提取液合并。减压回收溶剂，温度45～60℃，浓缩到原药材的8倍体积，将浓缩液加3倍热水稀释，加入适量中药澄清剂ZTC A+B，离心，去沉淀，取上清液，上样于D101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用3BV纯水冲洗，水溶液弃除，改用3BV的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为1.5BV/h，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，喷雾干燥，即得。

【实施例2】从鸢尾中提取射干总黄酮提取物

取鸢尾药材300kg，加入3吨70％乙醇，加热回流提取3h，滤过，药渣继续加1吨乙醇回流提取2h，滤过，两次提取液合并。减压回收溶剂，温度45～60℃，浓缩到原药材的8倍体积，将浓缩液加3倍热水稀释，加入适量中药澄清剂ZTC A+B，离心，去沉淀，取上清液，上样于D101大孔树脂柱(在上样前分别用酸，碱，水，醇对树脂柱进行前处理)，上样后先用3BV纯水冲洗，水溶液弃除，改用1～3BV的70％乙醇洗脱，洗脱液流速为1～1.5BV/hr，收集该乙醇洗脱液。继续减压回收溶剂，收集浸膏，喷雾干燥，即得。

                   射干总黄酮提取物的质量分析

【实施例3】射干总黄酮提取物的质量分析

下列质量分析中所用样品包括：

样品1：按实施例1的方法，从射干中提取射干总黄酮提取物，共5个批号；

样品2：按实施例2的方法，从鸢尾中提取射干总黄酮提取物，共5个批号。

1、含量分析

1.1总黄酮的含量测定

采用紫外分光光度法测定射干总黄酮提取物的含量，其中紫外分光光度计为UV-2401PC型，运用标准曲线线性回归方法，以鸢尾甙为对照品，在266nm测定。

1.1.1标准品溶液配制

精密称取对照品鸢尾甙(自制)[(制备方法参照文献：钟鸣、谢志宏、施耀强，射干甙对照的制备，广东药学，2001，11(1)：16]，HPLC归一法，含量为99％)16.20mg，用适量70％乙醇溶解，定容于50ml容量瓶中，摇匀，作为储备液，精密吸取5ml储备液，70％乙醇定容于50ml容量瓶中，分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml中，定容于10ml容量瓶中，进行紫外测定，记录吸收度值，以对照品浓度(x)为横坐标，吸收度(y)为纵坐标进行回归计算。

1.1.2测定方法

分别精密称取20mg样品，加20ml 70％乙醇，超声提取半小时，提取液过滤，药渣按前法再操作1次，过滤，两次滤液合并，定容至50mL的容量瓶中，吸取0.5mL续滤液，定容于25mL的容量瓶中待测定，记录吸收度，按线性方程计算含量。由吸收度值计算总黄酮的含量。

1.1.3结果

样品1，五批结果表明，其总黄酮的含量为分别为55％，60％，70％，65％，61％，平均含量为62.20％；

样品2，五批结果表明，其总黄酮含量分别为76％，75％，90％，80％，70％，平均含量为78.2％；

通过多批号检测证明，运用本发明工艺制备的射干总黄酮提取物中总黄酮的含量范围在55％～90％重量。

1.2鸢尾甙的含量测定

采用高效液相色谱法(HPLC)，以鸢尾甙为对照品，测定射干总黄酮提取物中鸢尾甙的含量。

1.2.1色谱条件

高效液相色谱仪HP1100系列(美国惠谱公司)，Hypersil BDS C18填料常规色谱柱(5μm，4×250mm)，柱温(30℃)，水(A)和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0min时，A∶B为88∶12；20min时为72∶28，60min时为40∶60，流速1ml/min，紫外检测器(UV)，检测波长266nm。

1.2.2标准品溶液配制

称取对照品13.62mg，用适量70％乙醇溶解，定容于50ml的容量瓶中，摇匀，作储备液。精密吸取5ml储备液，70％乙醇定容于50ml的容量瓶中。分别吸取1，1.5，2，4，10mL，转移到10mL容量瓶中，用70％乙醇定容至刻度。以对照品浓度(x)为横坐标，吸收度(y)为纵坐标进行回归计算，得到回归方程Y＝43359.81X-8.43066，R＝0.9999，鸢尾甙在0.002724～0.02724mg/ML范围内具良好的线性关系。

1.2.3测定方法

取样品适量，精密称定20mg左右，转移至50mL容量瓶中，加70％乙醇40mL，常温下超声30min，取出冷却到室温，加70％乙醇至刻度，摇匀，吸取2mL至10mL容量瓶中，70％乙醇定容至刻度，摇匀，即可测定。根据标准曲线即可计算鸢尾甙的含量。

1.2.4结果

样品1，五批测定结果表明，其鸢尾甙的含量分别为12％，18％，15％，16％，17％，平均含量为15.6％；

样品2，五批测定结果表明，其鸢尾甙的含量分别为30％，30％，35％，32％，25％，平均含量为30.4％。

通过多批号检测证明，运用该工艺制备的射干总黄酮中鸢尾甙(射干甙)的含量范围在10％～50％重量。

2、指纹图谱分析

2.1样品溶液配制

分别取由实施例1和2得到的射干总黄酮样品20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加70％乙醇40ml，超声提取半小时，提取液过滤到50ml容量瓶中，冷却到室温，加适量70％乙醇并稀释至刻度，摇匀，吸取2ml，定容到10ml的容量瓶中，作为供试品溶液。

2.2测定方法

高效液相色谱-电喷雾质谱法(HPLC-EIMS)识别提取物化学组分，高效液相色谱法(HPLC)检测各组分含量。

2.2.1高效液相色谱—电喷雾质谱法的检测条件

高效液相色谱系统条件同1.2.1；质谱仪器：ICQ advantage型质谱仪(美国Finnigan公司)，Thermo Fingan surveryer(包括MS pump、Auto sampler-poADetector)；ESI离子源的鞘气(N₂)，流速70ml/min，辅助气((N₂)，流速20ml/min；源电压4.5KV；正离子检测；碰撞气体为氦气；喷雾毛细管温度280℃，毛细管电压43V；采用全离子扫描方式，扫描范围m/z＝200～1000。

2.2.2组分含量分析条件

高效液相色谱仪HP1100系列(美国惠谱公司)，Hypersil BDS C18填料常规色谱柱(5μm，4×250mm)，柱温(30℃)，水(A)和乙腈(B)为流动相，梯度洗脱，洗脱程序为0min时，A∶B为88∶12；20min时为72∶28，60min时为40∶60，流速1ml/min，紫外检测器(UV)，检测波长266nm，以鸢尾甙为对照品，进行检测。

2.3结果

2.3.1提取物化学组分识别

采用高效液相色谱—电喷雾质谱法，对射干总黄酮的主要成分进行分析和鉴定，确定其黄酮主要为鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾甙、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素。

在RT为12.30时，为鸢尾甙，其分子量为C₂₂H₂₂O₁₁(462)，UV为266，333，ESI中：m/z463为[M+1]+，301[M+1]⁺-glu(162)，286[M+1]⁺-glu(162)-CH₃，270[M+1]⁺-glu(162)-CH₃O。

在RT为13.78时，为野鸢尾甙，其分子量为C₂₄H₂₆O₁₃(522)，UV为266，333，ESI中：m/z523为[M+1]⁺，361[M+1]⁺-glu(162)，331[M-glu(162)-CH₃O，301[M-glu(162)-2CH₃O，226[M+1]+glu(162)-145(4CH₃O，2OH，O)。

在RT为22.30时，为鸢尾甙元，其分子量为C₁₆H₁₂O₁₃(300)，UV为266，333，ESI中：m/z301为[M+1]⁺。

在RT为24.09时，为野鸢尾黄素，其分子量为C₁₈H₁₆O₈(360)，UV为267，322，ESI中：m/z361为[M+1]⁺，361[M+1]⁺-CH₃(15)，343[M+1]⁺-H₂O。

在RT为31.31时，为次野鸢尾黄素，其分子量为C₂₀H₁₈O₈(386)，UV为265，322，ESI中：m/z387为[M+1]⁺，357[M+1]⁺-CH₃O(15)，301.8。

2.3.2提取物中各化学组分含量

HPLC检测结果见图1。根据HPLC-EIMS结果可知，保留时间(RT)为12.30min的色谱峰为鸢尾甙峰；RT为13.78min的色谱峰为野鸢尾甙；RT为22.30min的色谱峰为鸢尾甙元峰；RT为24.09min的色谱峰为野鸢尾黄素峰；RT为31.31min的色谱峰为次野鸢尾黄素峰。

以峰面积归一法计算鸢尾甙∶野鸢尾甙∶鸢尾甙元∶野鸢尾黄素∶次野鸢尾黄素的相对峰比例。

样品1的五批结果相对峰面积比例分别为：

1∶0.16∶0.11∶0.25∶0.11；

1∶0.15∶0.13∶0.22∶0.2；

1∶0.16∶0.15∶0.25∶0.11；

1∶0.15∶0.13∶0.23∶0.10；

1∶0.13∶0.12∶0.21∶0.12。

样品2的五批结果相对峰面积比例分别为：

1∶0.26∶0.25∶0.4∶0.2；

1∶0.47∶0.28∶0.55∶0.28；

1∶0.45∶0.26∶0.45∶0.26；

1∶0.40∶0.25∶0.40∶0.22；

1∶0.38∶0.22∶0.37∶0.20。

所以，射干总黄酮五个峰(鸢尾甙、野鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素)相对比例归纳为：1∶0.12～0.5∶0.10～0.3∶0.20～0.6∶0.1～0.3。由此推算鸢尾甙、野鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素的百分含量依次为10.00～50.00％、2.80～28.00％、1.60～16.20％、2.33～23.30％、0.83～12.53％；鸢尾甙∶野鸢尾甙∶鸢尾甙元∶野鸢尾黄素∶次野鸢尾黄素的重量比约为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。

3、杂质分析

采用薄层色谱法对从射干中提取的射干总黄酮提取物进行分析，展开剂：石油醚∶丙酮(8∶2)，硅胶GF254层析板，以鸢尾醛和射干药材为参比。结果见图3，由结果可知，本发明的射干总黄酮中不含杂质鸢尾醛。

本发明对从鸢尾中提取的射干总黄酮提取物也进行如上的杂质分析，分析条件与结果均与上述相同，此处不作重复说明。

                    抗骨质疏松的药效学试验

【实施例4】从射干中提取的射干总黄酮提取物的抗骨质疏松实验

1、实验材料

1.1试验样品

样品1(简称1号)：按实施例1制备而得，总黄酮含量≥55％。

样品2(简称2号)：以乙醇提取所得到的乙醇提取物，总黄酮含量为10％左右。

样品3(简称3号)：以水煎制备所得的水提取物，总黄酮含量约为8％。

1.2试验动物

大鼠：购买于广东省医学实验动物中心。

2、试验动物分组及给药方法

101只健康大鼠，其中72只在40mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，按照常规方法切除双侧卵巢；其余的11只大鼠做相同的手术操作，但只摘除卵巢旁小块脂肪组织，不切除卵巢，作为假手术组(Sham)，常规抗菌；另取18只健康大鼠，不作任何手术处理，作为模型组(OVX)。

将切除卵巢的大鼠随机分为7组，每组12只，在手术后1周开始灌胃给药，Sham和OVX组每天给予0.5％CMC溶液；样品1大剂量和小剂量组每天分别给予100和20mg/kg(以总黄酮计)，灌胃给药，给药体积均为1.0ml/100g体重，连续4个月。样品2、3大剂量和小剂量组的每日给药量(提取物量)和给药方法与样品1相同(样品1、2、3组组内每日摄取总黄酮量相同)。饲养室温度20～26℃，湿度50～70％，喂以普通颗粒饲料，自由饮水。每1～2周称1次体重并按新体重调整给药体积。

3、骨密度的检测方法

骨密度和骨矿含量的测定：于给药2和4个月时，大鼠35mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，俯卧于骨密度仪测试板上，扫描后半身，并分析一侧股骨和胫骨的骨矿密度(BMD)和骨矿含量(BMC)。

4、检测结果

4.1对去卵巢大鼠骨矿密度(BMD)的影响

结果见表1。结果表明，大鼠去卵巢后股骨和胫骨的BMD略有下降；给药2个月时，1、2、3号样品对股骨的BMD均无明显影响，但明显增加胫骨的BMD水平；给药4个月时，1、2、3号样品对股骨和胫骨的BMD均无明显影响。

表1  对股骨和胫骨骨矿密度(BMD)的影响(mg/cm²)( X±SD)

组别	动物数只	股骨		胫骨
						2M	4M	2M	4M
		Sham	11	198±22	218±15					176±8	194±14
OVX	18					188±13	199±12##	169±9#	185±14

样品1D	12	191±12	202±12	183±15*	191±13
						样品1S	12	185±20	202±11	190±9*	185±9
样品2D	12	185±8	203±11	179±11*	189±11
						样品2S	12	187±15	198±13	169±12	178±14
样品3D	12	189±11	200±12	179±9*	189±14
						样品3S	12	193±10	203±8	174±5	187±7

与Sham组比较，#：P＜0.05，##：P＜0.01；与OVX组比较，^*：P＜0.05，^**：P＜0.01。D为大剂量组，S为小剂量组。

4.2对去卵巢大鼠股骨和胫骨BMC(骨矿含量，Bone Mineral Content)的影响

结果见表2。结果表明因为大鼠去卵巢后体重明显增加，承重骨(股骨和胫骨)体积也相对增大(骨骼投影面积增加，数据为列出)，因此使模型组股骨和胫骨的BMC和假手术比较无明显差异。

给药2个月时，1号大剂量组股骨BMC水平略高，对胫骨BMC无影响；其他2个样品组股骨和胫骨的BMC均无明显提高。

给药4个月时，1号大剂量组股骨的BMC略有增加，但幅度很小，胫骨BMC和模型组基本相似；1号小剂量组和2号和3号大、小剂量组股骨BMC均无明显增加。

                 表2  对股骨和胫骨BMC的影响(mg)( X±SD)

组别	动物数只	股骨		胫骨
						2M	4M	2M	4M
		Sham	11	436±72	473±61					334±65	394±52
OVX	18					421±45	446±50	348±42	394±48
		样品1D	12	448±49	478±47					354±70	399±48
样品1S	12					427±28	462±35	311±30*	395±36
		样品2D	12	423±38	464±44					357±71	400±41
样品2S	12					416±36	450±57	320±32	362±49
		样品3D	12	416±34	461±50					331±29	384±54
样品3S	12					426±39	456±41	328±34	384±36

与Sham组比较，#：P＜0.05，##：P＜0.01；与OVX组比较，^*：P＜0.05，

^**：P＜0.01。D为大剂量组，S为小剂量组。

5、试验小结

样品1为含量大于50％的射干总黄酮提取物，能明显改善大鼠因雌激素缺乏引起的骨矿丢失，提高骨矿密度，改善骨骼力学性能，增加股骨和胫骨的湿重，提高胫骨的湿比重，表明样品1对雌激素缺乏诱导的大鼠骨质疏松症有一定的保护作用，高含量的总黄酮制剂能够达到良好的治疗效果。样品2和3也有此作用，但强度较样品1差。结果说明了射干总黄酮抗骨质疏松作用的量效关系，也说明了本发明的制备工艺最大限度的富积了总黄酮，体现了该工艺的合理性和科学性。

【实施例5】从鸢尾中提取的射干总黄酮提取物的抗骨质疏松实验

1、试验样品

1.1待试药物：射干总黄酮提取物，按实施例2制备，总黄酮含量大于50％。

1.2阳性对照药：强骨胶囊(中药)，北京岐黄制药有限公司

2、仪器及试剂

电子天平；DXP-L型DEXA骨密度仪(美国Lunar公司)；岛津AG-20KNA型万能材料试验机(力学指标)；酶标仪(ELX800，Bio-Tek Instruments，INC.)；全自动γ免疫计数仪；硬组织切片机(Leica 2155)、碳化钨刀、半自动数字图像分析系统。

3、实验方案

3.1去势大鼠骨质疏松症预防给药实验

雌性SD大鼠，3％戊巴比妥钠45mg/kg腹腔注射麻醉后，按照文献的方法行双侧卵巢切除术(OVX)，手术切除后经病理学证实为大鼠卵巢组织，且包膜完整。假手术组切开皮肤、肌肉和腹膜后，仅切除小块脂肪组织，但不摘除卵巢。于卵巢切除5天后，给药，共2月，每周测体重籍以调节药量。各组大鼠实验期间予以普通饲料，自由摄食，饮水，室温控制在25℃±2℃，2个月后结束实验，用乌拉坦麻醉大鼠后取血液及骨标本供测试。

3.2去势大鼠骨质疏松症治疗给药实验

雌性SD大鼠，2％戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉后，按照文献的方法行双侧卵巢切除术(OVX)，手术切除后经病理学证实为大鼠卵巢组织，且包膜完整。假手术组切开皮肤、肌肉和腹膜后，仅切除小块脂肪组织，但不摘除卵巢。术后普通饲料饲养3个月。于卵巢切除3个月后，给大鼠灌药，共2月，每周测体重藉以调节药量。5个月后结束实验，用乌拉坦麻醉大鼠后取血液及骨标本供测试。

3.3测定指标

骨密度测定：测定右侧股骨密度，采用美国Norland公司生产的双能X线骨密度测量仪，型号XR-26。

4、实验结果

结果见表3、4。结果表明：从鸢尾中提取的射干总黄酮提取物具有显著的抗骨质疏松作用，且有一定的量效关系。

表3  预防给药抗去势致骨质疏松大鼠各组骨密度的变化( X±SD)

组别	剂量	例数	骨密度(g/cm2)
				空白组	-	12	0.276±0.01**
模型组	1mg/kg/周	12	0.250±0.01
				强骨胶囊对照组	90mg/kg/天	12	0.261±0.01**
小剂量组	50mg/kg/天	12	0.256±0.01*
				中剂量组	100mg/kg/天	11	0.264±0.01**
大剂量组	200mg/kg/天	10	0.269±0.01**

各组与模型组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01

表4  治疗给药抗去势致骨质疏松大鼠各组骨密度的变化( X±SD)

组别	剂量	例数	骨密度(g/cm2)
				空白组	-	12	0.28±0.03**
模型组	1mg/kg/周	12	0.25±0.02
				强骨胶囊对照组	90mg/kg/d	11	0.26±0.01*
RBF小剂量组	50mg/kg/d	12	0.26±0.01*
				中剂量组	100mg/kg/d	12	0.26±0.02*
大剂量组	200mg/kg/d	12	0.27±0.02**

与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

【实施例6】射干总黄酮提取物及其黄酮类单体对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响

1、实验材料

1.1试验动物

出生24h内SD大鼠，性别体重不限，购于广东省医学实验动物中心。

1.2试验样品：

DMEM培养基(GIBCO)、胰蛋白酶(GIBCO)、胶原酶II(Sigma)、噻唑蓝(MTT，sigma)、骨钙素放免试剂盒(由天津协和医药科技有限公司提供，批号020130)。

有效部位1(简称1号)：从射干中提取的射干总黄酮(按实施例1工艺方法制备，含量大于50％)。

有效部位2(简称2号)：从鸢尾中提取的射干总黄酮(按实施例2工艺方法制备，含量大于50％)。

鸢尾甙，鸢尾甙元，野鸢尾甙，野鸢尾黄素，次野鸢尾黄素，染料木素，均为自制(制备方法参照文献：钟鸣、谢志宏、施耀强。射干甙对照的制备，广东药学，2001，11(1)：16；刘合刚，胡新斌，葛建萍。栽培射干化学成分的分离及鉴定中药材，1997，20(6)：299黄射干的异黄酮类成分云南植物研究，1999，21(1)：125～130；吉文亮，秦民坚，王峥涛。射干的化学成分研究中国药科大学学报，2001，32(3)：197～199)，含量均大于95％。单体化合物剂量按有效部位中所含相应化合物的量设计。

2、试验方案

2.1新生大鼠颅骨成骨细胞的分离培养

无菌条件下，取出生24h内的大鼠颅盖骨，用平衡盐溶液冲洗数次，放入0.25％的胰蛋白酶溶液中，剔除骨表面被膜及软组织，将骨片剪成1～3mm³大小的骨粒，弃去胰蛋白酶溶液。在0.1％胶原酶II中室温消化45min，弃去消化液。将骨粒分散于100ml培养瓶中，加入含20％新生小牛血清的DMEM培养基培养，7天后，将骨粒弃去，细胞进行传代培养。细胞传至第5代，将细胞用胰蛋白酶消化，细胞计数后，用含10％小牛血清的DMEM培养基稀释成4×10⁴/ml的细胞悬液。以每孔0.2ml加入96孔培养板，每孔0.5ml加入24孔培养板，37℃，5％CO₂培养箱中培养，镜下观察待细胞70％融合时，将含血清培养基吸弃，平衡盐溶液冲洗两次，加入含不同浓度射干总黄酮提取物及上述六种单体的无血清培养基，继续培养，不同时间检测细胞的增殖与分化。

2.2细胞增殖实验

培养24h、48h和72h后，分别将一块96孔板从CO₂培养箱中取出，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续孵育4h，取出，吸弃培养基后，加入150μl二甲基亚矾，10min后在酶标仪上测492nm的吸光度。

2.3细胞分化试验

培养24h、48h和72h后，分别将两块24孔板取出。吸取培养基用于骨钙素测定。细胞用PBS冲洗3次后，每孔加入0.25ml 1％的Tritonx100(德国Merck公司)。10min后，收集每孔溶液，用于蛋白质的测定。骨钙素(BGP)测定采用放射免疫法(RIA)，蛋白质测定采用改良的lowry法。

2.4统计学处理

实验数据均以均数±标准差( X±SD)表示，组间差异用SAS8.0统计软件作方差分析。

3、实验结果

3.1射干总黄酮提取物对大鼠成骨细胞增殖的影响

取相同浓度的射干总黄酮及其单体实验，结果见表5。结果表明，大鼠成骨细胞在不同成分中培养24h、48h、72h后，射干总黄酮及其各种黄酮类成分均有不同程度的促进增殖作用。其中，有效部位1和2在不同培养时间内出现显著的促分化作用，较其他化合物作用显著。实验结果说明射干总黄酮具有显著的促大鼠成骨细胞增殖的作用。

表5  射干总黄酮及黄酮单体对大鼠成骨细胞增殖的影响( X±SD，n＝10)

浓度(mol/l)	培养24h(吸收度A)	培养48h(吸收度A)	培养72h(吸收度A)
				空白0	0.210±0.012	0.199±0.006	0.197±0.012
有效部位(1)1×10-5	0.234±0.016**	0.237±0.006**	0.280±0.007**
				有效部位(2)1×10-5	0.232±0.014**	0.230±0.003**	0.272±0.006*
鸢尾甙1.5×10-6	0.196±0.012*	0.225±0.007*	0.246±0.008*
				鸢尾甙元5×10-7	0.194±0.011*	0.225±0.009*	0.235±0.008*
野鸢尾甙4×10-7	0.190±0.010*	0.226±0.012	0.230±0.011
				野鸢尾甙元6×10-7	0.210±0.012	0.224±0.013*	0.228±0.014*
次野鸢尾黄素3×10-7	0.224±0.013*	0.220±0.014*	0.223±0.014*
				染料木素2×10-7	0.222±0.014*	0.226±0.012*	0.240±0.012*

与空白相对照，^*P＜0.05.^**P＜0.01

3.2射干总黄酮提取物对大鼠成骨细胞分化的影响

骨钙素是成骨细胞合成、分泌的主要非胶原蛋白，被认为是成骨细胞分化的晚期即矿化的标志。取相同浓度的射干总黄酮及其单体进行实验，结果见表6。结果表明，通过比较，有效部位1和2在培养24h时出现明显的促分化作用，培养48h和72h后继续出现促分化作用。各单一黄酮在培养24h后未出现明显的促分化作用，培养48h和72h后出现促分化作用，其促分化作用均弱于射干总黄酮。

表6  射干总黄酮及单一黄酮对大鼠成骨细胞外骨钙含量的影响

                    ( X±SD，n＝10)

浓度(mol/l)	培养24h(ng/mg蛋白)	培养48h(ng/mg蛋白)	培养72h(ng/mg蛋白)
				空白	3.5±1.2	2.5±0.7	6.20±1.0
有效部位(1)1×10-5	7.5±1.1**	9.4±1.2*	25.6±1.7**
				有效部位(2)1×10-5	7.8±1.2**	9.7±1.1**	27.2±1.3**
鸢尾甙1.5×10-6	2.8±0.6*	6.1±1.2*	10.6±1.1*
				鸢尾甙元5×10-7	2.7±0.9*	6.2±1.6*	9.8±1.0*
野鸢尾甙4×10-7	2.8±1.0*	6.2±1.3	9.8±1.2
				野鸢尾甙元6×10-7	2.9±1.2	6.5±1.2*	10.2±1.3*
次野鸢尾黄素3×10-7	2.5±1.3*	4.8±1.3*	8.9±1.2*
				染料木素2×10-7	2.8±1.5*	6.5±1.7*	10.5±1.6*

与空白相对照，^*P＜0.05.^**P＜0.01

4、结论

骨质疏松的组织学机制主要是由于骨重建负平衡所致，成骨细胞增殖受抑制及分化程度降低，是造成骨质硫松症的重要原因之一。只有成骨细胞不断增殖及分化才能产生丰富的骨胶原蛋白和非胶原性蛋白质，从而进一步形成更多的骨组织。由于体内实验存在许多复杂因素的干扰，不便于直接观察其药理作用，为此我们采用体外培养成骨细胞的方法，来观察射干总黄酮提取物及其单体对成骨细胞增殖和分化的直接影响。从本实验结果可以看出，射干总黄酮提取物在培养24h、48h及72h均有促进成骨细胞增殖和分化的作用，作用均较单一黄酮明显，这更说明我们选择总黄酮作为有效部位进行研究开发的合理性。

                        抗脑缺血的药效学实验

【实施例7】射干总黄酮提取物的抗脑缺血实验

1、实验材料

1.1试验样品

有效部位1(简称1号)：从射干中提取的射干总黄酮(按实施例1工艺方法制备，含量大于50％)

有效部位2(简称2号)：从鸢尾中提取的射干总黄酮(按实施例2工艺方法制备，含量大于50％)。

尼莫地平：西安博爱制药有限公司的产品。

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及Ca²⁺-ATPase试剂盒，为南京建成生物制品研究所提供。

1.2试验动物

大鼠：购于广东省医学实验动物中心

2、实验方案

2.1实验分组

将大鼠随机分为假手术组、反复脑缺血组、反复脑缺血给药组(有效部位1、有效部位2、尼莫地平)，每组10只。

2.2脑缺血模型的建立

以双侧总动脉结扎大鼠脑缺血模型方法，解剖大鼠两侧椎动脉，用动脉夹夹闭双侧颈总动脉5min，去夹间隔1h，如此反复3次，最后一次缺血再灌1h后取脑组织，测定各项指标。保温在37℃左右。

2.3大鼠脑组织含水量及Ca²⁺含量测定

大鼠脑组织取出后，取一半立即用冰冷Tris缓冲液(Tris110，葡萄糖220mmol/L，去离子水配制)冲洗干净，并吸干表面水分，称湿重，然后干燥至恒重，脑组织含水量＝(湿重-干重)/湿重×100％，称取定量干燥脑组织，经超纯硝酸及高氯酸消化，用岛津AA-670型原子吸收分光光度计测定Ca²⁺含量。

2.4 Ca²⁺-ATPase、SOD及MDA的测定

将另一半大鼠脑组织用冰冷的生理盐水低温匀浆。3000r/min，0℃离心15min，测定蛋白质及Ca²⁺-ATPase(钼酸铵法)，SOD(羟胺法)及MDA(TBA法)。

3、实验结果

3.1对反复脑缺血脑组织含水量及Ca²⁺含量的影响

结果见表7，t检验统计表明，反复脑缺血组脑组织含水量及Ca²⁺含量均非常显著地高于假手术组，PIF剂量依赖性地对抗这种升高作用。

表7  对反复脑缺血脑组织含水量及Ca²⁺含量( X±SD)

分组	剂量(mg/kg×d)	n	H2O％	Ca2+(μmol/g)
					假手术组		10	77.20±1.02***	12.12±1.00***
反复脑缺血组		10	80.17±0.75	17.22±1.61
					射干总黄酮(1)	200	10	79.20±1.22*	13.20±1.68**
射干总黄酮(2)	200	10	79.17±1.02*	13.20±1.66**
					尼莫地平	30×7	10	77.21±1.20**	12.03±1.10**

^*P＜0.05，^**P＜0.01

3.2对反复脑缺血大鼠脑组织Ca²⁺-ATPase、SOD活性及MDA含量的影响

结果见表8，与假手术组比，反复脑缺血组脑组织中Ca²⁺-ATPase及SOD活性非常显著地降低，而MDA含量非常显著地升高。PIF500mg/kg还能显著抑制MDA含量升高，非常显著地抑制Ca²⁺-ATPase活性降低，但对SOD活性影响不明显。

表8  对反复脑缺血大鼠脑组织Ca²⁺-ATPase、SOD活性及MDA含量的影响

                              ( X±SD)

分组	剂量mg/kg×d	n	Ca2+-TPase(μmolPi/mgPr·h)	SOD(μmol/mgPr)	MDA(nmol/mgPr)
						假手术组		10	9.14±1.10***	22.60±2.20***	6.85±0.60***
反复脑缺血组		10	6.10±1.05	19.30±1.50	8.65±0.62
						总黄酮(1)	200	10	8.22±1.08**	22.30±1.23**	7.30±0.57**
总黄酮(2)	200	10	8.21±1.09**	22.20±1.11***	7.32±0.67***
						尼莫地平	30×7	10	8.26±1.29***	22.11±1.80***	7.10±0.75***

^*P＜0.05，^**P＜0.01

4、结论

大鼠反复脑缺血可引起脑组织Ca²⁺-ATPase、SOD活性降低，Ca²⁺、MDA含量升高，造成严重的脑水肿损伤。射干总黄酮能显著对抗上述作用，其效果与尼莫地平相似，这提示它对脑缺血有保护效果，也提示对心血管疾病包括心肌缺血等有一定的作用。

                          抗炎的药效学实验

【实施例8】射干总黄酮提取物的抗炎作用实验

1、实验材料

1.1试验样品

有效部位1(简称1号)：从射干中提取的射干总黄酮(按实施例1工艺方法制备，含量大于50％)

有效部位2(简称2号)：从鸢尾中提取的射干总黄酮(按实施例2工艺方法制备，含量大于50％)。

阿司匹林：系sigma化学公司产品。

角叉菜胶：系sigma化学公司产品。

1.2试验动物

1.2.1昆明种小鼠，18～22g，购于广东省医学实验动物中心。

1.2.2 SD大鼠，体重180～220g，购于广东省医学实验动物中心。

2、实验方案和结果

2.1小鼠耳廓二甲苯致敏试验

小鼠随机分成4组，每组10只，分成有效部位1(150mg/kg)、有效部位2(150mg/kg)、阿司匹林对照组(0.3g/kg)及空白对照组。每日一次，连续5天，末次给药40min，各鼠左耳两面涂以二甲苯60UL致炎。右耳作对照，1h后脱颈椎处死，沿耳廓基部剪下两耳，用直径8mm打孔器取下相同部位耳片，称重。以对照耳片重量为100％，计算致炎耳炎症增重百分率。

结果见表9。结果表明，2小时即对小鼠耳廓二甲苯致炎的小鼠耳肿胀有明显的抑制作用，与对照组相比有显著性差异。

表9  射干总黄酮对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响(n＝10)( X±SD)

组别	剂量(g/kg)	耳重(右耳)	肿胀度	肿胀度抑制率(％)
					对照组	NS	10.3±1.00	9.4±2.70
阿司匹林	0.3	9.6±0.95	6.2±1.5**	44.3
					总黄酮(1)	0.15	9.8±0.81	7.7±2.4**	34.1
总黄酮(2)	0.15	10.1±0.82	7.8±2.2**	36.2

与对照组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

2.2大鼠足跖角叉胶致炎试验

大鼠随机分为4组，每组10只，分设有效部位1(150mg/kg)、有效部位2(150mg/kg)，阿司匹林对照组(0.3g/kg)及空白对照组。每日一次，连续5d，末次给药30min，向大鼠左后足垫部皮下注射0.8％角叉菜胶0.1ml后，用游标卡尺(精密度0.02mm)测定致炎前和致炎后的1.0、2.0、3.0h大鼠足跖厚度的差值为肿胀度，比较各组肿胀度的差异。

结果见表10。结果表明，与对照组相比，射干总黄酮提取物均对大鼠足跖角叉菜胶致炎有明显的减轻作用，

上述两个致炎试验说明该提取物具有良好的抗炎作用，其效果与阿司匹林相似。

表10  对角叉菜胶所致大鼠足跖炎症的影响(n＝10)( X±SD)

组别	剂量(g/kg)	1h	2h	3h
					对照组	NS	2.73±0.17	1.78±0.19	2.13±0.37
阿司匹林	0.3	2.81±0.16	1.24±0.17**	1.50±0.15**
					总黄酮(1)	0.15	2.82±0.16	1.60±0.30**	1.72±0.23*
总黄酮(2)	0.15	2.83±0.19	1.62±0.15**	1.70±0.25*

与对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

                        急性毒性试验

【实施例9】

本实验观察ICR小鼠单次灌服射干总黄酮后，由于吸收所产生的毒性反应和死亡情况。结果表明本发明提供的射干总黄酮6000mg/kg灌胃给药后，ICR小鼠的食量、体重未见异常。在给药后14天内，小鼠未发生死亡。因此，射干总黄酮灌胃给药的LD₅₀＞6000mg/kg。

1、试验材料

1.1动物

ICR小鼠，清洁级，20±3g，雌雄兼用，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号为沪动合格字第152号。

1.2受试药物

样品1：从射干中提取的射干总黄酮。(按实施例1工艺方法制备，含量大于50％)

样品2：从鸢尾中提取的射干总黄酮(按实施例2工艺方法制备，含量大于50％)。

样品3：以乙醇提取所得到的乙醇提取物，总黄酮含量为10％左右。

样品4：以超临界提取所得到的提取物，总黄酮含量为8％左右。

2、试验方法

ICR小鼠20只，给药前禁食12h(仅供水)。每只小鼠以受试药物(样品1，样品2)的最大可灌胃浓度(0.15g/ml)和小鼠的最大可灌胃容量(0.4ml/10g)给予6g/kg，受试药物(样品3，样品4)的最大可灌胃浓度(0.16g/ml)和小鼠的最大可灌胃容量(0.4ml/10g)给予5g/kg。观察记录给药后14天内动物全身状况、体重、呼吸、中枢神经系统、四肢活动等变化。若动物死亡，即立即进行尸检，记录病变情况。若有肉眼可见变化，则进行病理检查。

3、结果

结果见表11。由结果可知，给药组和对照组ICR小鼠的体重均有所升高，两者之间比较无显著性差异。

                        表11  急性毒性试验时的体重变化( X±SD)

组别	动物数	给药前(g)	给药后一周(g)	给药后二周(g)
					空白组	10	24.8±2.70	24.4±2.27	24.5±2.01
样品1	10	26.1±1.45	26.2±2.20	27.6±2.36
					样品2	10	26.8±1.25	27.2±1.10	27.6±1.16
样品3	10	25.1±1.12	25.2±1.00	25.4±1.05
					样品4	10	25.0±1.10	25.3±1.10	25.7±1.05

4、结论

样品1和2灌胃给药的LD₅₀＞6000mg/kg，这个结果提示该药物在用于临床时毒性不大；样品3和4灌胃给药的LD₅₀为5000mg/kg。这说明经过本发明制备工艺处理后的样品明显无毒。

以上对本发明的详细描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求所定义的范围。

Claims (12)

1、一种射干总黄酮提取物，其特征在于，该提取物是从射干或鸢尾中提取而得，总黄酮的含量为55％～90％重量；

其中含有鸢尾甙；

以及一种或一种以上的选自野鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素的化合物成分；其中，鸢尾甙的含量为10％～50％重量；

所述总黄酮含量，是以鸢尾甙为对照品，采用紫外分光光度法测定。

2、权利要求1所述的提取物，其特征在于，所述提取物同时含有鸢尾甙、野鸢尾甙、鸢尾甙元、野鸢尾黄素和次野鸢尾黄素。

3、权利要求2所述的提取物，其特征在于，鸢尾甙∶野鸢尾甙∶鸢尾甙元∶野鸢尾黄素∶次野鸢尾黄素的重量比为10～50∶2～28∶1～17∶2～24∶0.5～13。

4、权利要求1、2或3所述的提取物，其特征在于，其制备方法为：

1)药材用50～80％的乙醇水溶液热回流提取2～3次，合并提取液；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液至原药材的6～10倍体积；

3)以3～5倍体积的水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/小时的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用50～90％的乙醇，以0.5～2.5BV/小时的流速洗脱吸附柱，收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到射干总黄酮提取物。

5、一种权利要求1～3之一所述提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)药材用含水乙醇提取；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液；

3)以水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用水洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用乙醇洗脱吸附柱并收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到射干总黄酮提取物。

6、权利要求5所述的提取方法，所述方法包括下述步骤：

1)药材用50～80％的乙醇水溶液热回流提取2～3次，合并提取液；

2)减压浓缩步骤1)所得提取液至原药材的6～10倍体积；

3)以3～5倍体积的水稀释浓缩液，并作澄清处理，取上清液；

4)取上清液，过大孔树脂柱吸附，弃流出液；然后用1～5BV的水，以0.5～2.5BV/小时的流速洗涤所述吸附柱，弃水洗液；之后，采用50～90％的乙醇，以0.5～2.5BV/小时的流速洗脱吸附柱，收集该乙醇洗脱液；

5)浓缩、干燥乙醇洗脱液，得到射干总黄酮提取物。

7、一种药物组合物，其特征在于，含有权利要求1～4之一所述的射干总黄酮提取物。

8、权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，进一步包含药学上可接受的载体和/或赋形剂。

9、权利要求1所述射干总黄酮提取物在制备预防和/或治疗骨质疏松症药物中的应用。

10、权利要求9所述的应用，其特征在于，所述骨质疏松症为原发性骨质疏松症。

11、权利要求1所述射干总黄酮提取物在制备预防和/或治疗脑血管疾病药物中的应用。

12、权利要求1所述射干总黄酮提取物在制备抗炎药物中的应用。

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