CN1668326A - 通过瘤内施用乳铁蛋白治疗恶性肿瘤和其他高度增生性疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单独应用乳铁蛋白组合物或与标准癌症治疗手段相结合治疗高度增生性疾病的方法。

Description

通过瘤内施用乳铁蛋白治疗恶性肿瘤 和其他高度增生性疾病
本申请要求2002年5月10日递交的美国临时申请号60/379,442以及2002年5月10日递交的美国临时申请号60/379,474的优先权，此处完整引入作为参考。
发明领域
本发明涉及单独应用乳铁蛋白组合物或与标准癌症治疗手段相结合治疗高度增生性疾病的方法。乳铁蛋白组合物可以通过口服、静脉、瘤内或局部等多种途径施用。
发明背景
目前对许多癌症类型缺乏有效的治疗方法。某一特定病人的治疗疗程需要根据诊断结果、疾病进展的阶段、以及病人的年龄、性别和一般健康状况等来确定。癌症治疗最传统的方法是手术、放射治疗和化学治疗。手术在癌症的诊断和治疗中起到中心的作用。一般需要通过手术进行活检和切除癌症生长。但如果癌症已经转移或扩散，手术不太可能有疗效，必需使用其他方法。手术的副作用包括组织器官功能减退、感染危险增加、出血或与凝血相关的并发症。手术之外的治疗方法包括放射治疗、化学治疗、生物治疗和免疫治疗。这些众多疗法的缺点是有副作用，可能包括骨髓功能抑制、刺激皮肤、吞咽困难、口干、恶心、腹泻、脱发、体重减轻以及能量损失等(Curran，1998；Brizel，1998)。
乳铁蛋白是一种单链金属结合糖蛋白。已知许多细胞类型，例如单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞以及小肠刷状边缘细胞都具有乳铁蛋白的受体。除了作为B淋巴细胞和T淋巴细胞的必须生长因子外，乳铁蛋白还具有与机体初级防御机制相关的众多功能。例如，有报道表明乳铁蛋白可以激活自然杀伤(NK)细胞、诱导集落刺激活性、激活多形核中性粒细胞(PMN)、调节颗粒形成、增强抗体依赖的细胞毒性、刺激淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)活性以及增强巨噬细胞毒性。
最近，牛乳铁蛋白(bLF)已被用于预防肿瘤形成和/或已建立的肿瘤。本发明是第一次应用乳铁蛋白治疗，而不是预防，已建立的肿瘤。
发明简述
本发明涉及治疗高度增生性疾病的方法。治疗方法包括瘤内使用乳铁蛋白。
本发明的一个实施方案是治疗高度增生性疾病的方法，包括给受试者瘤内施用乳铁蛋白组合物，其用量足以使高度增生性疾病好转。所使用的乳铁蛋白组合物的用量为每天约0.1μg到约10g。
乳铁蛋白组合物分布在可药用的载体中。更优选，乳铁蛋白是哺乳动物乳铁蛋白，例如人的或牛的。在具体的实施方案中，乳铁蛋白是重组的乳铁蛋白。
高度增生性疾病进一步定义为癌症，包括肿瘤。肿瘤选自：黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、成视网膜细胞瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、白血病、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、齿龈癌、舌癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌和膀胱癌。
更进一步，高度增生性疾病可以选自风湿性关节炎、炎性肠道病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉硬化、整形损伤、原位癌、口腔绒毛黏膜白斑病以及牛皮癣。
本发明的另一个实施方案是治疗高度增生性疾病的方法，包括提高受试者病灶附近乳铁蛋白的含量而加强全身和/或局部免疫系统。乳铁蛋白通过瘤内施用。乳铁蛋白增强、刺激和/或上调白介素-18和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。可设想白介素-18可以刺激免疫细胞(例如T淋巴细胞或自然杀伤细胞)的产生或活性；而GM-CSF可以促进包括树突状细胞和其他抗原呈递细胞在内的免疫细胞的迁移和成熟。
本发明的另一个实施方案是在受试者瘤内施用乳铁蛋白后提高肿瘤附近局部免疫应答的方法。可设想乳铁蛋白组合物可以刺激注射部位白介素-18和/或GM-CSF的产生，而它们将刺激免疫细胞(如T淋巴细胞或自然杀伤细胞)的产生或活性。T淋巴细胞可以从由CD4+，CD8+和CD3+组成的一组细胞中选择。
本发明具体的实施方案是治疗高度增生性疾病的方法，其包括对受试者瘤内施用乳铁蛋白组合物，并与化学治疗、生物治疗、免疫治疗、手术或放射治疗相结合。
前文泛泛地略述了本发明的特点和技术优势，以使下文对本发明的详细描述更容易理解。本发明的其他特点和优势将在下文描述，并组成本发明权利要求的主题。熟悉本领域的人员将了解到，本发明所公开的概念和具体实施方案可以很容易地用做修改或设计其他体系的基础，以实现与本发明相同的目的。他们也将认识到那些与本发明等价的构想不会离开本发明的精髓和范围，正如从属权利要求中所提出的那样。若与附图一起考虑，我们将会从下述描述中更好地理解本发明包括其组织手段和操作方法在内的新颖独特之处，以及进一步的目标和优点。但我们必需明确地了解提供这些附图的目的仅仅是为了说明和描述，而不是限定本发明的范围。
附图简述
为了更完全地理解本发明，此处与附图相配合进行说明。
图1显示通过口服、静脉和瘤内施用重组人乳铁蛋白或不使用乳铁蛋白，鳞状细胞肿瘤的生长情况
图2显示接受乳铁蛋白、顺铂以及乳铁蛋白和顺铂配伍治疗的动物的肿瘤生长抑制百分比
图3显示乳铁蛋白和不同剂量的顺铂配伍使用后肿瘤生长抑制的百分比
图4显示乳铁蛋白处理后NK细胞的活性
图5显示每天瘤内施用乳铁蛋白1次或2次，或不使用乳铁蛋白，鳞状细胞肿瘤的生长情况
发明详述
很显然，熟悉本领域人员不用背离本发明的范围和精髓就可以对在本实际应用中公开的发明进行多种实施和修改。
权利要求和/或说明书中“个”就如此处与术语“包含”或“包括”联用时一样，可能意味着“一个”，但也可以意味着“一个或更多”、“至少一个”或“一个或不止一个”等。
此处使用的术语“高度增生性疾病”指任何细胞增殖地比正常组织生长快的疾病或异常。因而，一个高度增生的细胞是指比正常细胞增殖地快的细胞。
此处使用的术语“肠胃外施用”包括使化合物不经过小肠而被机体吸收的任何施用方式。本发明中使用的“肠胃外施用”包括(但不限于)肌肉、静脉、腹膜内、瘤内、眼内或关节内等施用方式。
此处使用的术语“静脉施用”包括通过静脉注射或输注而使乳铁蛋白组合物进入循环系统的所有技术。
此处使用的术语“瘤内施用”包括通过注射、电穿孔、膏剂、洗液等使乳铁蛋白组合物进入肿瘤处的所有技术。
此处使用的术语“口服”包括口腔、面颊、肠、胃内等施用方式。
此处使用的术语“局部施用”包括对皮肤、表皮、皮下和粘膜表层施用。
此处使用的术语“可药用载体”包括任何的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌抗真菌药剂、等渗剂和吸收延缓剂等等。这些介质和药剂在药用活性成分中的使用已为大家所熟知。所有传统的介质或药剂只要与本发明的栽体或细胞相容，都会在治疗用组合物中考虑使用。组合物中也可能整合进补充的活性成分。
此处使用的术语“乳铁蛋白”或“LF”指天然的或重组的乳铁蛋白。天然的乳铁蛋白可以从哺乳动物的乳汁或初乳或其他的天然来源中提取。重组乳铁蛋白(rLF)可以在基因修饰的动物、植物、真菌、细菌、或其他的原核或真核物种中重组表达或直接产生、或通过化学合成等方法获得。
此处使用的术语“受试者”是指根据此处描述的方法施以乳铁蛋白组合物的任何哺乳动物受试对象。一个实施方案是用本发明的方法治疗人类。另一个实施方案是治疗患了高度增生性疾病的人。
此处使用的术语“治疗有效剂量”是指能使疾病或状况有改善或有好转的剂量。
此处使用的术语“治疗”是指给受试者使用治疗有效剂量的一种乳铁蛋白组合物，以使其有所好转。好转是指症状的任何改善或好转。这种改善是观察到的或是测量到的。因而，熟悉本领域的人员会意识到治疗可能会改善疾病状况，但不一定完全治好疾病。具体地说，病人癌症的改善可能包括肿瘤稳定、肿瘤收缩、肿瘤进展减缓、病人生存时间延长或生活质量提高。测量CD4+、CD8+、NK以及CD40+等免疫细胞的数量和活性可能会反映出治疗对免疫系统的有益影响。
此处使用的术语“附近”表示肿瘤和/或高度增生性疾病的区域或位点的内部或周围。例如，“一个肿瘤的附近”可能指肿瘤的内部或周围，或肿瘤的边缘。“附近”包括肿瘤邻近的区域、肿瘤上部的区域、肿瘤下部的区域、肿瘤周围的边缘区域、或肿瘤边缘区域的邻近区域。
A.药物组合物
本发明的乳铁蛋白可以从天然来源中通过分离和纯化获得，例如(但不限于)哺乳动物的乳汁。乳铁蛋白最好是哺乳动物来源的，例如牛或人的乳铁蛋白。在优选的实施方案中，乳铁蛋白应是应用众所周知的和广为使用的基因工程技术生产的重组人乳铁蛋白，例如通过重组表达或通过基因修饰的动物、植物或真核生物或化学合成等方式产生。参阅美国专利5581896、5571697和5571691，此处以参考文献的方式引入。
根据本发明，乳铁蛋白组合物将通过任何常规的途径：口腔、胃肠道外或局部等方式施用。可用的途径包括，但不限于，口腔、鼻腔、颊部、直肠、阴道、肌肉、腹膜内、静脉、动脉、瘤内或皮内。这些组合物一般是此处描述的可药用的组合物。
本发明的组合物可配方为中性或盐的形式。可药用的盐包括酸加成盐(通过蛋白质的游离氨基基团形成)，可通过无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等)形成。无机碱(如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和有机碱(如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等)也可以与游离羧基基团形成盐。
用合适的溶剂溶解所需用量的乳铁蛋白，并与上文所列的各成分混合，并按照要求进行无菌过滤，制备出无菌的注射液。一般情况下，各种无菌的活性成分加入到含有基本分散介质和所需的如上列举的其他成分的无菌容器中，并进行分散。若制备无菌粉末，最好使用真空干燥和冷冻干燥技术，所产生的粉末含有上述无菌过滤溶液中所含有的活性成分和任何所需的其他成分。
进一步依照此发明，适于口服的组合物的提供方式是含在有或无惰性稀释剂的可药用载体中。载体应该是可吸收的或可食用的，包括液体的、半固体的(如膏状)或固体的。如果任何传统的介质、药剂、稀释剂或载体对受试者或对其所含有的乳铁蛋白组合物的疗效无害，那么用它们实现本发明口服乳铁蛋白的用法就是合适的。载体或稀释剂的例子包括脂肪、油、水、盐水、脂类、脂质体、树脂、结合物、填充物等等，或者它们的组合。
依照此发明，可以使用任何方便实际的方法把组合物与载体组合起来。如通过溶解、悬浮、乳化、混合、胶囊、微胶囊、吸附等。这些对于熟悉本领域的人员来说都是常规程序。
本发明的一个具体实施方案中，粉末形式的组合物与半固体或固体的载体组合或充分混合。混合可以通过任何一种方便的方式实现，例如研磨。混合过程中也可以加入稳定剂，以保护组合物由于例如胃内变性等因素而失去治疗活性。口服的稳定剂的例子包括缓冲液、胃酸分泌拮抗剂、甘氨酸和赖氨酸等氨基酸、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等糖类、蛋白酶抑组合物等等。对于口服的组合物，稳定剂中最好含有胃酸分泌的拮抗物。
进一步，与半固体或固体结合的口服施用组合物可进一步制成硬的或软的胶囊、片剂或丸剂。胶囊、片剂或丸剂最好附上肠溶膜，以免组合物在胃内或小肠上部的酸性环境中变性。请参阅美国专利5629001。药物进入小肠后，小肠内的碱性pH将溶解肠溶膜，释放出组合物，而被特定的细胞即肠上皮细胞和肠系膜淋巴结M细胞所吸收。
另外一个实施方案是粉末型的组合物与液体载体如水或盐水结合，可以加入，也可以不加入稳定剂。
本发明可能用到的一个具体的配方是一种配于无钾等渗磷酸盐缓冲液中的乳铁蛋白溶液。缓冲液的组成是：6mM一水磷酸二氢钠、9mM七水磷酸氢二钠，50mM氯化钠，pH7.0±0.1。这一配方可以用于任何施用途径，例如(但不限于)瘤内施用。
进一步，与半固体结合用于局部施用的组合物可以进一步制成胶状药膏剂型。最好用凝胶聚合物制作胶状药膏。本发明制作胶状组合物所优选的聚合物包括(但不限于)carbopol、羧甲基纤维素和Pluronic聚合物。具体地，乳铁蛋白粉末组合物与含有聚合作用的药剂(如重量/体积含量为0.5％-5％的Carbopol 980)的液体凝胶混合，用于皮上或皮下治疗高度增生性疾病。
配制后，通过与配方剂量一致的方式使用溶液。其用量应达到治疗有效，使症状好转或改善。剂型应该包括易于使用不同剂量形式，如可吸收溶液、药物释放胶囊等等。根据受试者的不同情况，可能会选用不同的剂量。负责施用者在任何情况下可以决定对某一特定受试者的施用剂量。此外，给人类施用要满足FDA生物组合物标准办公室所要求的无菌度、安全性和纯度等标准。
B.治疗高度增生性疾病
依照本发明，对患有或可能患有高度增生性疾病的受试者，使用复合于上述任何一种药用载体中的乳铁蛋白组合物予以治疗。根据各种考虑，如药物的吸收、代谢、施用途径、受试者的年龄、疾病的严重程度以及对治疗的反应等，对本领域熟悉的人员可以决定使用人乳铁蛋白的用量以达到治疗有效。
施用途径将根据损伤的位置和性质的不同而不同。例如皮内、透皮、肠胃外、静脉、肌内、鼻内、皮下、经皮、气管内、腹内、瘤内、灌注、灌洗、直接注射以及口服等。
乳铁蛋白组合物的口服施用包括口腔、颊部、小肠或胃内等施用方式。设想组合物可以作为食品添加剂使用。例如，在吸收前，可以把组合物喷到食物表面或加入液体中。
乳铁蛋白组合物的瘤内施用包括瘤内注射、电穿孔或通过外科手术或内窥器植入。对于可接近的离散的固体瘤特别考虑瘤内注射，或注入瘤内脉管系统。局部、区域、或全身施用也可能是适合的。
高度增生性疾病包括(但不限于)肿瘤。肿瘤是指异常的组织生长，一般形成一个独特的肿块，通常细胞增殖比正常组织生长得快。肿瘤部分地或全部缺乏组织结构以及与正常组织的功能协作。可粗略分为三种类型。来源于上皮结构的恶性肿瘤称为癌症；来源于如肌肉、软骨、脂肪、骨等结缔组织的恶性肿瘤称为肉瘤；而影响造血结构包括免疫系统的恶性肿瘤称为白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。此处“肿瘤”包括造血系统肿瘤和实体瘤。
肿瘤的例子包括(但不限于)黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺癌、肝癌、视网膜癌、神经胶质瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、齿龈癌、舌癌、白血病、成神经细胞瘤、头癌、颈癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌、膀胱癌、骨髓癌，或其他恶性或良性肿瘤。
其他高度增生性疾病包括(但不限于)神经纤维瘤病、类风湿性关节炎、Waginer氏肉芽肿、Kawasaki氏病、红斑狼疮、中线肉芽肿、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管阻塞、再狭窄、动脉硬化、肿瘤前损伤、原位癌、口腔绒毛粘膜白斑症、牛皮癣、前白血病、原始细胞增多性贫血以及脊髓发育不良综合症。
本发明特别感兴趣的肿瘤包括(但不限于)造血系统肿瘤。例如，一个造血系统肿瘤可能包括急性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病或其他造血源性恶化。
本发明的一个优选的实施方案是，使用有效量的乳铁蛋白组合物减少、减轻、抑制或去除肿瘤的生长。乳铁蛋白组合物的使用量可在每天约0.1μg到约100g之间变化。优选每天约1mg到约100g之间，更优选每天约20mg到约10g，最优选每天4.5g。静脉内施用的乳铁蛋白可在每天约0.1μg到约10g范围内变化，优选每天约0.1μg到约1mg，最优选每天250mg。局部施用的乳铁蛋白可在每天约1μg到约100g范围内变化，优选地，局部用的凝胶、溶液、胶囊或药片含有的乳铁蛋白浓度在约0.01％到约20％之间，最优选约1％到约8.5％。
治疗方案也可能各不相同，而常常依赖于肿瘤的类型、肿瘤的位置、疾病进展情况以及病人的健康状况和年龄。显然，某些肿瘤类型需要积极的治疗，而同时，某些病人难以承受繁重的治疗程序。根据治疗配方的已知效果和毒性(如果有)，医生最适于作出此类决定。
在某些实施方案中，所治疗的肿瘤可能至少在开始的阶段是可切除的。用乳铁蛋白组合物治疗会使肿瘤的边缘收缩或去除肿瘤的某些侵袭性部位，因而使切除肿瘤的可能性大增。经过乳铁蛋白治疗，肿瘤的切除也许是可能的。切除后继续以乳铁蛋白治疗会去除肿瘤位点的微观残留病灶。
另一个选择是，本发明可能会用在手术时和/或手术后治疗残留的或转移的疾病。例如，切除后的瘤床可以注射或灌注含有乳铁蛋白的组合物。灌注可以在术后继续进行，例如在手术部位留一导管。也设想在术后进行定期的治疗。
如果合适，也可进行连续的施用。例如肿瘤被切除，对瘤床进行处理以去除残留的、微观的疾病。最好选用注射器或导管施用。这种连续灌注可持续到处理后约1-2小时、约6-12小时、约12-24小时、约1-2天、约1-2周或更长的时间。一般情况下，在连续灌注期间经过调整，所用的治疗组合物的用量应与通过一次或多次注射所用的用量相等。也可考虑通过四肢灌注方式施用本发明的治疗组合物，尤其在用于治疗黑素瘤和肉瘤时。
在具体实施方案中，乳铁蛋白组合物提供单剂量形式或多剂量形式。单剂量可以每日使用一次、或每日多次，或每周多次、或每月一次、或每月多次。在进一步的实施方案中，乳铁蛋白以系列剂量形式提供。系列剂量可以每日施用一次、或每日多次，或每周一次，或每周多次、或每月一次、或每月多次。
本发明的另一个实施方案是治疗高度增生性疾病的方法，其包括通过提高胃肠道乳铁蛋白含量以补充粘膜免疫系统的步骤。优选，乳铁蛋白通过口服。
而一个进一步的实施方案是提高受试者胃肠道内粘膜免疫应答的方法，其包括给受试者口服施用乳铁蛋白组合物，优选人乳铁蛋白的步骤。乳铁蛋白刺激胃肠道内白介素-18和GM-CSF的表达，它们进一步增强免疫细胞。例如，白介素-18可以增强T淋巴细胞或NK细胞活性而GM-CSF可以增强包括树突状细胞和其他抗原呈递细胞在内的免疫细胞的活性。具体的实施方案是白介素-18(IL-18)可以增强CD4+，CD8+和CD3+细胞的活性。熟悉本领域的人员都了解IL-18是一种TH1细胞因子，与白介素-12和白介素-2协同作用，刺激淋巴细胞产生IFN-γ。也可能刺激其他细胞因子的产生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可设想乳铁蛋白在口服后刺激白介素-18的产生，从而抑制血管形成。由于肿瘤细胞生长依赖新血管的生成，故而乳铁蛋白具有抗肿瘤细胞的活性。
本发明的进一步实施方案是治疗高度增生性疾病的方法，其包括通过增加循环系统中乳铁蛋白的含量而加强全身免疫系统的步骤。优选，乳铁蛋白组合物经静脉施用。可以设想乳铁蛋白刺激组织内IL-18和GM-CSF的产生，从而增强免疫细胞活性。例如，IL-18可增强T淋巴细胞或NK细胞而GM-CSF促进包括树突状细胞和其他抗原呈递细胞在内的免疫细胞的成熟和迁移。在具体的实施方案中，IL-18增强CD4+，CD8+和CD3+细胞。熟悉本领域的人员都了解IL-18是一种TH1细胞因子，与白介素-12和白介素-2协同作用，刺激淋巴细胞产生IFN-γ。IL-18也可能刺激其他细胞因子的产生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可设想乳铁蛋白在静脉施用后刺激白介素-18的产生，从而抑制血管形成。由于肿瘤细胞生长依赖新血管的生成，故而乳铁蛋白具有抗肿瘤细胞的活性。
本发明的进一步实施方案是治疗高度增生性疾病的一种方法，其包括通过增加肿瘤附近乳铁蛋白的含量而增强局部或全身免疫系统的步骤。“肿瘤附近”指肿瘤的一般区域，例如乳铁蛋白可以直接用于肿瘤内部或上部，也可用于肿瘤的一般区域而不直接用在肿瘤的内部。一般区域可以包括肿瘤区域的边缘或边缘的附近或邻近。优选，乳铁蛋白组合物直接用于肿瘤内部。可以设想乳铁蛋白刺激局部组织中白介素-18和GM-CSF的表达而增强免疫细胞。例如，白介素-18可以增强T淋巴细胞或NK细胞活性而GM-CSF可以增强包括树突状细胞和其他抗原呈递细胞在内的免疫细胞的活性。在一个具体实施方案中，IL-18增强CD4+，CD8+和CD3+细胞。熟悉本领域的人员都了解IL-18是一种TH1细胞因子，与白介素-12和白介素-2协同作用，刺激淋巴细胞产生IFN-γ。IL-18也可能刺激其他细胞因子的产生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可设想乳铁蛋白在瘤内施用后刺激白介素-18的产生，从而抑制血管形成。由于肿瘤细胞依赖新血管的生成，故而乳铁蛋白具有抗肿瘤细胞的活性。
本发明的进一步实施方案是治疗高度增生性疾病的一种方法，其包括通过提高肿瘤附近皮肤内乳铁蛋白的含量而加强局部或全身免疫系统的步骤。优选，乳铁蛋白组合物通过局部施用。如上所述，肿瘤附近施用包括在肿瘤边缘的附近或邻近施用，或直接在肿瘤的边缘施用。设想乳铁蛋白可以刺激局部组织(如角质细胞)中IL-18和GM-CSF的产生，从而增强免疫细胞的活性。例如，白介素-18可以增强T淋巴细胞或NK细胞活性而GM-CSF可以增强包括树突状细胞和其他抗原呈递细胞在内的免疫细胞的活性。
在一个实施方案中，IL-18增强CD4+，CD8+和CD3+细胞。熟悉本领域的人员都了解IL-18是一种TH1细胞因子，与白介素-12和白介素-2协同作用，刺激淋巴细胞产生IFN-γ。IL-18也可能刺激其他细胞因子的产生，例如(但不限于)IL-1b或IL-12或IFN-γ。也可设想乳铁蛋白在局部施用后刺激白介素-18的产生，从而抑制血管形成。由于肿瘤细胞依赖新血管的生成，故而乳铁蛋白具有抗肿瘤细胞的活性。
C.联合治疗
为了提高本发明的人乳铁蛋白组合物的效果，把本发明的组合物与其他治疗高度增生性疾病有效的药剂(例如抗癌药剂)或手术结合起来可能是理想的。“抗癌”药剂可以反面地影响受试者的癌症，例如，可以杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞的增长率、减少转移的发生或数量、减小肿瘤体积、抑制肿瘤生长、降低对肿瘤或癌细胞的输血量、防止或抑制癌的进展、或提高癌症患者的寿命。抗癌药剂包括生物药剂(生物治疗)、化学治疗药剂和放射治疗药剂。更一般地，这些其他组合物将使用能联合有效杀死或抑制细胞增殖的剂量。这一过程可能包括同时使用本发明的人乳铁蛋白组合物和其他药剂或各种因素。为达到上述目的，可以使用一种同时包括两种药剂的组合物或剂型；或同时使用两个完全分开的组合物或剂型、或在协同作用的有效期内分别使用。其中，一种组合物含有乳铁蛋白，而另一个含有第二药剂。
另一个选择是本发明的乳铁蛋白组合物可在其他抗癌药剂治疗之前或之后施用，间隔可以从几分钟到几周。在实施中，对癌细胞分别使用其他抗癌药剂和乳铁蛋白组合物时，应该保证它们的间隔不要超过一定期限，以使抗癌药剂和乳铁蛋白组合物仍可对癌细胞发挥有益的协同作用。在这种情况下，可以考虑在互相间隔1-14天内使用两种疗法，优选在12-24小时之间。在一些情况下，也可延长治疗间隔，如几天(2、3、4、5、6或7)或几个星期(2、3、4、5、6、7或8)。
1.化学治疗
癌症治疗也包括很多基于化学药剂的疗法。一些化学治疗药剂包括(而不限于)抗生素化学治疗药剂，如阿霉素(Doxorubicin)、柔红霉素、阿霉素(adriamycin)、丝裂霉素(也成为突变霉素和/或丝裂霉素-C)、放线菌素D、博来霉素(争光霉素)、Plicomycin等；植物碱，如紫杉醇(Taxol)，长春新碱，长春碱等；其他药剂如基于铂的药剂(如顺铂(CDDP))、依托泊苷(VP16)、肿瘤坏死因子、烷化剂如卡莫斯汀、美法仑(左旋溶肉瘤素，苯丙氨酸氮芥)、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安(马勒兰，甲磺酸丁二醇二酯)等、基于taxane的药剂(如多西他赛)以及罗氮芥等。
一些其他药剂的例子包括(但不限于)卡铂、甲基苄肼(甲苄肼)、二氯甲基二乙胺、伊立替康、拓扑替康、异环磷酰胺、Nitrosurea、依托泊苷(VP16)、它莫西芬(三苯氧胺)、雷洛昔芬、托瑞米芬、艾多西芬、着洛西芬、TAT-59、Zindoxifene、曲奥昔芬、ICI 182780、EM-800、雌激素受体结合剂、吉西他滨、异长春花碱、法尼基-蛋白转移酶抑制剂、反铂、5-氟尿嘧啶、过氧化氢、氨甲蝶呤、Temazolomide(DTIC的液态)、Mylotarg、Dolastatin-10、薯司他丁或上述任何药剂的类似物或衍生物。
2.放射治疗剂
放射治疗剂和因素包括可以诱导DNA损伤的放射线和波，例如γ辐射、X射线、紫外辐射、微波、电子放射、放射性同位素等等。可以利用上述放射形式对肿瘤所在的位点进行照射而完成治疗。上述各因素很可能对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生大面积的损伤。
X射线的剂量可在每日50-200伦琴并延续一段时间(3-4周)，到一次性单剂量2000-6000伦琴之间变动。放射性同位素的剂量范围很广，并依赖于同位素的半衰期、放射线的强度和类型、以及肿瘤细胞的摄取度。
3.手术
大约60％的癌症患者要接受某种形式的手术，包括预防性的、用于癌症诊断或分期的、治疗性的以及缓解性的手术。治疗性手术可与其他治疗结合起来，例如本发明的治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、基因治疗、免疫治疗和/或其他的治疗。
治疗性手术包括肿瘤切除，即对癌症组织全部或部分地物理去除、切离和/或破坏。肿瘤切除是指通过物理方法至少去除肿瘤的一部分。除了肿瘤切除，手术治疗还包括激光外科、冷冻外科、电外科以及显微外科(莫氏外科)。也可进一步考虑将本发明与去除表层癌、癌前病变或附带的正常组织相结合。
切除癌细胞、癌组织或肿瘤后体内可能会形成一个腔。可通过灌注、直接注射或局部施用等方式在该区域使用另外一种抗癌治疗。这种治疗可以重复，例如每1、2、3、4、5、6、7天或每1、2、3、4、5周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12月治疗一次。这些治疗的剂量也可能不同。
4.其他生物治疗药剂
本发明可考虑与其他生物药剂相结合，以加强治疗的效果。这些另外的药剂包括(不限于)影响细胞表面受体上调和缝隙连接的药剂、细胞生长抑组合物和细胞分化剂、细胞粘附抑组合物、增强高度增生性细胞对细胞凋亡诱导剂敏感度的药剂、或其他生物药剂或生物疗法，如热疗。
热疗是一种使病人的组织暴露于高温(高达106°F)的方法。可使用外用的或内用的加热器进行局部、区域或全身的热疗。局部热疗用于小面积加热，如肿瘤。可用体外设备对准肿瘤产生高频波而加热。内源加热可能会用到各种无菌探针，包括热的金属细丝、或装有热水的中空管、植入的微波探头或无线电频率电极等。
可使用产生高能的装置如磁铁对病人的器官或四肢加热进行区域治疗。或者抽取一些病人的血液并加热，然后再输回到某一需要内部加热的区域。如果癌症已经扩散全身，也可通过热水毯、热蜡、感应线圈以及温室等对全血进行加热。
本发明也可与激素治疗相结合。激素可能会被用来治疗某些特定癌症，如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宫颈癌，用以降低或阻断某些激素(如睾丸甾酮或雌激素)的效果，并且往往可以减少转移的危险。
本发明也可与佐剂治疗相结合。所用的佐剂或免疫调节剂包括(但不限于)肿瘤坏死因子；干扰素α、β和γ；IL-2和其他细胞因子；F42K和其他细胞因子类似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES、以及其他化学因子。
5.免疫治疗
免疫治疗一般依赖于使用效应细胞和分子来定位和破坏癌症细胞。例如，免疫效应物可以是某一肿瘤细胞表面标记物的特异抗体。抗体本身可作为治疗的效应分子，也可结合其他细胞来发挥细胞杀伤作用。抗体也可与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒素A、霍乱毒素、百日咳毒素等)等结合而仅仅作为靶向试剂。此外，效应物也可以是那些携带能与肿瘤靶标直接或间接结合的表面分子的淋巴细胞。这些不同的效应细胞包括细胞毒T细胞和NK细胞。
本发明可以考虑与用于治疗癌症的疫苗相结合而提高治疗效果。这种疫苗包括多肽疫苗或树突状细胞疫苗。多肽疫苗可以包括任何可被细胞毒T淋巴细胞识别的肿瘤特异抗原。进一步讲，熟悉本领域的人员会了解树突状细胞免疫是指应用多肽或抗原激活树突状细胞，并把此树突状细胞输到病人体中。
肿瘤特异抗原的例子包括(但不限于)gp100或MAGE-3，它们被用作黑素瘤疫苗。这些抗原被用做多肽疫苗和/或树突状细胞疫苗而施用。
D.实施例
下列实施例用以展示本发明优选的实施方案。熟悉本领域的人员应该了解到下列实施例中所公布的技术代表了发明者所发现的在发明实践中应用较好的技术，因而被认为构成了本发明优选的实践模式。然而，根据本公开，熟悉本领域的人员应该而了解到此处公开的实例可以进行多种改变而不背离本发明的精髓和范围。
                        实施例1
                    rhLF抑制肿瘤生长
使用人鳞状细胞癌(O12)。将细胞注入到无胸腺裸鼠右侧。rhLF通过瘤内(49只动物，7个剂量，剂量范围为0.05μg到125μg)、静脉(7只动物，每个剂量125μg)、或口服(7只动物，每个剂量20mg)施用。对照动物仅以载体处理，而不加入rhLF。接种肿瘤11天待肿瘤形成后，每天使用rhLF两次，持续5天(静脉组)或8天(所有其他组)。
通过实验期间和之后测量实体瘤体积来评价治疗效果；测量肿瘤的同时也测量体重。如图1和表1所示，同对照组相比，rhLF处理使肿瘤生长降低了46％-80％。事实上，口服20mg rhLF的效果最好，与对照组相比，肿瘤的生长被抑制了80％(P＝0.0073)。
       表1rhLF在小鼠O12肿瘤模型中抑制肿瘤生长的总结
    相对于安慰剂的抑制率           P值
    第19天*     第28天* 第19天*  第28天*
  瘤内样本数N＝49     28％     46％ 0.139  0.0263**
  静脉样本数N＝7     55％     65％ 0.0666  0.0233**
  口服样本数N＝7     76％     80％ 0.0175**  0.0073***
*指处理后时间
**具有显著统计学意义(p＜0.05)
***统计学意义十分显著(p＜0.01)
本研究的结果表明通过多种途径给药的rhLF可以在鳞状细胞小鼠肿瘤模型中显著地抑制肿瘤的生长。根据这些结果，可认为口服的乳铁蛋白通过增强免疫细胞活性而影响肿瘤。
                         实施例2
                 rhLF在不同肿瘤类型中的评价
多种肿瘤类型的肿瘤细胞注入到无胸腺裸鼠的右侧。在大约接种肿瘤11天待肿瘤长出后，或根据常规或已发表方法确定的其他时间，对实验动物口服使用rhLF、天然hLF或牛LF。对照动物仅以载体处理，而不含rhLF。给实验动物使用rhLF，每天一次或两次，持续1天、5天、7天、8天或14天。
通过实验期间和之后测量实体瘤体积来评价治疗效果；测量肿瘤的同时也测量体重。通过测量循环系统和小肠中细胞因子、T细胞和NK细胞的量来测量免疫应答。
                    实施例3
               口服rhLF和bLF的效果
对小鼠口服施用rhLF和bLF，并测量小肠内IL-18的产生。
小鼠以65mg/kg/day的rhLF、300mg/kg/day的rhLF或300mg/kg/day的bLF处理三天。对照组仅以药用载体处理。LF处理24小时后，或对照组3天后，对实验动物进行称重，并采集血和血清。血清用于通过ELISA测量细胞因子。
并且在这些时间点上，处理掉动物，分离出小肠用于进一步分析。小肠上皮用含有PBS、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠、含有10μg/mlPMSF的0.1％SDS裂解液匀浆。匀浆物在15000rpm下离心10分钟，上清储存于-80℃直到用于分析IL-18的水平。
如表2和表3所示，两个剂量的rhLF都可以显著提高血清和小肠提取物中IL-18的含量。bLF可以较低程度地提高小肠IL-18的含量，但没有提高血清中IL-18的含量。
  表2rhLF和bLF对小肠和血清中IL-18水平的影响
 小肠提取物(pg)  血清(pg)
对照  955  141
300mg/kg bLF  4,515  134
65mg/kg rhLF  7,879  259
300mg/kg rhLF  8,350  328
       表3rhLF和bLF对小肠和血清中IL-18水平的刺激
 小肠提取物 血清
 增加％ P值 增加％ P值
相对于对照的增加
-300mg/kg bLF  373％ 0.0086 -5％ 0.5411
-65mg/kg rhLF  725％ 0.0034 84％ 0.0132
-300mg/kg rhLF  775％ 0.0001 132％ 0.0007
相对于Blf的增加
-65mg/kg rhLF  75％ 0.1490 94％ 0.0366
-300mg/kg rhLF  85％ 0.0617 145％ 0.0084
                        实施例4
              口服rhLF对体内NK细胞活性的影响
Balb/c幼鼠每天口服1次rhLF或安慰剂，共3天(见表4)。
                      表4处理方案
  治疗* 样本数 剂量(mg/kg)   途径     时间
组1   安慰剂 6 0   --     --
组2   RhLF 7 300mg/kg/天   口服     3天
第4天处理掉小鼠并采集脾。经磁珠细胞分离方法(MACSanti-NK-DX5)分离NK细胞并计数。应用乳酸脱氢酶释放试验测量NK细胞对YAC靶标的体外活性。
表5表明口服rhLF使得NK细胞对于YAC靶标细胞的离体活性显著增加(30∶1处为10％，而对照组为2.8％)。而安慰剂处理的对照组小鼠则没有显著的NK活性变化。
                               表5口服rhLF处理的小鼠的NK细胞活性
                  对照
低   中   高
0.056   0.09   0.407
               安慰剂组                    RhLF-处理组
效应细胞∶靶标细胞比例 原始数据             细胞毒百分比* 原始数据                    细胞毒百分比*
  效应细胞加靶标细胞   效应细胞对照 最终结果 效应细胞加靶标细胞  效应细胞对照                        相对于对照最终结果               的增长
30∶1   0.281   0.215     2.86 0.358  0.267     9.81     7**
15∶1   0.176   0.110     2.85 0.214  0.143     4.12     13
7.5∶1   0.117   0.054     2.21 0.131  0.074     0.44     0
3.7∶1   0.086   0.030     0.19 0.096  0.042     0     0
*细胞毒百分比＝[(效应细胞加靶标细胞-效应细胞对照)]-较低对照/[(较高对照-较低对照)]×100
**p＜0.05(双侧p值)
                       实施例5
               口服rhLF对体内GM-CSF的影响
给小鼠口服rhLF或安慰剂，测量小肠中GM-CSF的产生。
每天以300mg/kg的rhLF处理小鼠(每组5只动物)，连续3天。对照组仅使施药用载体。使用LF后24小时或使用安慰剂后3天处死动物，并分离小肠组织用于进一步分析。小肠上皮用含有PBS、1％Nonidet P-40、0.5％脱氧胆酸钠、含有10μg/ml PMSF的0.1％SDS裂解液匀浆。匀浆物在15000rpm下离心10分钟，上清储存于-80℃直到用于以ELISA试剂盒分析GM-CSF的水平。
如表6所示，相对于对照组动物，以rhLF处理动物使得小肠中一个主要的免疫刺激细胞因子即GM-CSF的产生增加。
              表6 rhLF对小肠和血清中GM-CSF水平的影响
    平均值(SEM)pg     相对于安慰剂的增长
安慰剂     6.48(032)     --
300mg/kg rhLF     7.74(0.19)     19.4％(p＜0.01)
                        实施例6
                  hLF与化学治疗的结合
通过颈部皮肤将一株小鼠鳞状细胞癌细胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底层(第0天)。接种肿瘤细胞5天后(第5天)在下颈处切开，将已建立的肿瘤切除。用游标卡尺测量肿瘤的三维尺度。
将荷瘤小鼠随机分成对照组和7组接受rhLF和/或顺铂的治疗。从第5天一直到第12连续8天，每天通过管饲法给小鼠喂食rhLF(4mg；200mg/Kg)。在rhLF治疗的开始(第5天)、中间(第8天)或结束(第12天)，给小鼠腹膜内注射5mg/Kg单一剂量的顺铂。在第12天处死动物，测量残余瘤块，并进行后继试验。
                               表7试验组
    描述   N     RhLF mg/kg     Cisplatin
  A组     安慰剂   5     0(安慰剂)     0
  B组     RhLF单独   5     200mg/kg     0
  C组     CP第5天   5     0     5mg/kg第5天*
  D组     CP第8天   5     0     5mg/kg第8天*
  E组     CP第12天   4     0     5mg/kg第12天
  F组     RhLF/CP-5   5     200mg/kg     5mg/kg第5天*
  G组     RhLF/CP-8   5     200mg/kg     5mg/kg第8天*
  H组     RhLF/CP-12   5     200mg/kg     5mg/kg第12天*
与安慰剂组相比，rhLF单独、顺铂单独或两者合用处理的小鼠，肿瘤生长抑制(TGI)。两者合用的抑制作用最强(表7和图2)。
在所有的样本中，与单独接受顺铂处理的相关动物相比，接受rhLF+顺铂处理的动物均表现出肿瘤生长抑制(TGI)。综合分析，rhLF+顺铂的TGI与安慰剂比较为77％(P＜0.0001)，与仅用rhLF比较为66％(P＜0.01)，与仅用顺铂比较为63％(P＜0.01)。
在rhLF治疗之前(RhLF+CP-5)立即使用顺铂或在rhLF治疗期间(RhLF+CP-8)使用顺铂比在rhLF治疗之后(RhLF+CP-12)使用顺铂的效果更好。然而，只有跨越治疗方案(RhLF+CP-8)相对于单独使用顺铂的TGI(77％)有显著的改善(P＜0.01)。
               表8治疗组的肿瘤生长抑制(TGI)
  生长          相对于安慰剂*
组   (SEM)     TGI(％)     P值
A(安慰剂)   741(79)     --     --
B(RhLF单独)   496(155)     33％     0.0989
C(CP第5天)   240(137)     68％     0.0066
D(CP第8天)   693(146)     6％     03898
E(CP第12天)   433(175)     42％     0.0634
F(RhLF+CP-5)   14(5)     98％     ＜0.0001
G(RhLF+CP-8)   159(48)     79％     0.0001
H(RhLF+CP-12)   331(47)     55％     0.0011
C到E(所有CP)   457(96)     38％     0.0564
F到H(所有rhLF/CP)   168(40)     77％     ＜0.0001
*相对于安慰剂组的抑制及单侧P值
**相对于各个顺铂组的抑制及单侧P值
                         实施例7
                  hLF与化学治疗联用的剂量依赖
如实施例6所述，通过颈部皮肤将一株小鼠鳞状细胞癌细胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底层(第0天)。接种肿瘤5天后，测量肿瘤大小作为本底，而后以顺铂单独(第8天，腹腔注射，5mg/kg)或顺铂加上三个剂量的口服rhLF(从第5天到第11或12天通过管饲法连续喂服7到8天)处理。第11或12天处死小鼠，测量肿瘤。如图3所示，与单独使用顺铂相比，联合使用rhLF和顺铂对小鼠的肿瘤生长具有剂量依赖性的抑制作用。
                        实施例8
                   hLF与多西他赛联用
如实施例7所述，通过颈部皮肤将一株小鼠鳞状细胞癌细胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底层(第0天)。接种肿瘤5天后，测量肿瘤大小作为本底，而后单独口服安慰剂(第5-12天每天1次，6只动物)、安慰剂加多西他赛(第8天静脉施用31.3mg/kg多西他赛丸剂，9只动物)或多西他赛加上口服rhLF(200mg/kg，从第5-9天管饲法喂食；9只动物)。与安慰剂相比，多西他赛单独使用可以抑制肿瘤生长，而rhLF与多西他赛联用可进一步抑制肿瘤生长。抑制作用和P值(单侧)显示在表9中。
                                    表9治疗组的肿瘤生长抑制(TGI)
生长         相对于安慰剂*       相对于Docetaxel
组 (SEM)   TGI(％)     P值   TGI(％)     P值
安慰剂 5,157(497)   --     --   --     --
Docetaxel 2,103(209)   59％     ＜0.0001   --     --
Docetaxel+rhLF 1,288(286)   75％     ＜0.0001   39％     0.0175
                         实施例9
                    hLF与放射治疗联用
通过颈部皮肤将一株小鼠鳞状细胞癌细胞珠(SCCVII)注入到有免疫能力的C3H小鼠的口腔底层(第0天)。接种肿瘤细胞5天后(第5天)在下颈处切开，将已建立的肿瘤切除。用游标卡尺测量肿瘤的三维尺度。
将荷瘤小鼠随机分为6组，如下接受rhLF(200mg/Kg)处理和/或放射治疗。从第5天一直到第12天连续8天，每天通过管饲法给小鼠喂食rhLF(4mg；200mg/Kg)。在rhLF治疗的开始(第5天)和期间(第8天)给小鼠使用2戈瑞(Gray)的单一剂量照射。在处理后第14天处死动物，测量残余瘤块，并进行后继试验。
                         表10实验分组
描述  样本数   RhLF mg/kg*     照射
A组 安慰剂   10   0(安慰剂)     无
B组 RhLF独用   10   200mg/kg     无
C组 第5天照射   8   0     第5天2格雷
D组 RhLF/加第5天照射   10   200mg/Kg     第5天2格雷
E组 第8天照射   10   0     第8天2格雷
F组 RhLF/加第8天照射   10   200mg/kg     第8天2格雷
*从第5天到第12天每天口服RhLF/安慰剂
与安慰剂组相比，单独服用rhLF、单独放射治疗或两者合用的小鼠肿瘤生长得到明显抑制。两者合用的抑制作用比任何一种独用的抑制作用稍有增加，比独用rhLF增加28％(P＜0.05)，比独用发射治疗增加15％(P＝0.1207)。
                 表11治疗组的肿瘤生长抑制(TGI)
    生长         相对于安慰剂
组     (SEM)     抑制*     P值*
A(安慰剂)     2348(395)     --
B(单独用rhLF)     1074(163)     54％     0.0040
C(放射治疗第5天)     827(105)     65％     0.0021
D(rhLF及放射治疗第5天)     750(125)     689％     0.0006
E(放射治疗第8天)     977(112)     58％     0.0018
F(rhLF及放射治疗第8天)     797(119)     66％     0.0007
C/E(两组放射治疗)     911(78)     61％     ＜0.0001
D/F(两组rhLF及放射治疗)     774(84)     67％     ＜0.0001
*与安慰剂组相比的抑制作用以及单侧P值
因而，乳铁蛋白刺激免疫系统。进一步，乳铁蛋白与顺铂、多西他赛以及放射治疗联用致使肿瘤生长受到抑制。
                       实施例10
                      人类口服hLF
在四个国家(阿根廷、巴西、智利、美国)的多个中心进行的两个不同研究中，患有多种转移性癌症类型的人类患者口服了重组人乳铁蛋白。RhLF以每日1.5到9克的两个不同剂量使用14轮，每轮间隔14天。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控肿瘤大小的进展。首先进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每隔8用扫描一次CT，并且也与进入本研究之前的本底前CT扫描相比较。每4周测量一次肿瘤标记。采取血样测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
根据RECIST标准，19个评测病人中(经过1次本底CT扫描和至少1次治疗后扫描)，9个病人(47％)在第1次治疗后CT扫描时表现出疾病稳态。患有各种肿瘤类型的病人从使用乳铁蛋白中获益。
表12显示6个不同肿瘤类型的病人的肿瘤应答。用CT扫描测量在rhLF治疗前肿瘤大小增长的百分比(相应的持续时间显示在括号中)和随后两个时间段肿瘤的增长百分比，表明在所有病例中肿瘤增长率降低或显示出肿瘤收缩。
               表12接受口服rhLF治疗转移性癌症的病人的肿瘤应答
病人编号     癌症     治疗前肿瘤增长百分率(周)     治疗1后肿瘤增长百分率(周)     治疗2后肿瘤增长百分率(周)
  204号     乳腺癌     40％(8)     0％(10)     0％(6.5)
  106号     黑素癌     24％(19)     -18％(11)     没做
  104号     胃癌     25％(5.5)     10％(10)     -5％(7)
  102号     卵巢癌     30％(21)     -5％(10.5)     -7％(8.5)
  007号     肺癌     160％(5.5)     13％(7.5)     12％(8.5)
                          实施例11
                   在人类中用口服hLF联合治疗
人类病人可单独口服重组人乳铁蛋白或与标准抗癌方案结合以抑制肿瘤生长。
简单地说，根据实施例10中确定的最佳治疗方案和剂量使用rhLF，并且根据肿瘤类型选择标准的抗癌方案作为联合治疗的一部分。所附加的抗癌治疗的施用途径和方法遵照FDA批准的或经同行评议发表的方法。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控肿瘤大小的进展。首选进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每8周扫描一次CT，每4周测量一次肿瘤标记。采取血样以测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本以测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
                        实施例12
                    口服rhLF后的免疫刺激
Balb/c幼鼠每天口服rhLF或安慰剂1次，连续3天。1天后(第4天)，将小鼠处死，收集脾细胞。NK细胞以磁珠细胞分离试验(MACSanti-NK-DX5)分离并计数。而后通过乳酸脱氢酶释放试验体外测量NK细胞对YAC靶标的活性。
如图4所示，口服rhLF处理使得NK细胞对YAC靶标细胞的离体活性显著增加。在效应细胞∶靶标细胞的比例为30∶1时，使用rhLF使得相对于安慰剂处理组的活性提高了243％(从2.86％到9.81％，p＜0.05)。
                      实施例13
                   静脉施用的效应
对实验动物(优选大鼠)静脉使用rLF、bLF和天然LF，测量血浆、血清和血积层细胞产生IL-18、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IFNγ的量。
简单地说，以每个剂量0.05μg到100μg的量连续处理大鼠14天。对照组大鼠则使施用物载体。在使用LF或对照后的特定时间点，即0天、2天、3天、5天、9天和14天，称重动物，并采集全血和血清。从全血中计数CD4+、CD8+和NK的水平。血浆、血清和血细胞提取物则用于ELISA试验测量细胞因子。
另外，在24天时间点，处死动物，分离出组织用于进一步分析。组织用含有PBS、1％乙基苯基聚乙二醇P-40、0.5％脱氧胆酸钠、含10μg/ml PMSF的0.1％ SDS裂解液匀浆。匀浆物在15000rpm下离心10分钟，上清储存于-80℃直到用于分析IL-18、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、IL-12和IFNγ等。
                     实施例14
          静脉施用rhLF与其他药剂的联合化学治疗
将待测肿瘤细胞注入无胸腺裸鼠的右侧。如实施例13所述，单独静脉使用rhLF以及与其他抗癌方法结合。对照动物仅使用载体，而不含rhLF。根据实施例13中实验得出的最佳方法使用rhLF。抗癌治疗使用标准的或已发表的方法。治疗从接种后11天开始，以使肿瘤建立和形成。或根据标准或已发表方法在其他时间点上进行。
通过在实验之间或实验之后测量实体瘤体积来评估治疗效果。测量肿瘤时也同时测量动物的体重。
                      实施例15
                   人体静脉施用hLF
病人可静脉施用重组乳铁蛋白以抑制肿瘤生长。
简单地说，患有不可切除癌症或癌症已转移的病人每天使用500mgrhLF，连续8天。或者，癌症已转移的病人使用rhLF 1-8天，每天的剂量是0.1、1、10、100和1000mg。均通过静脉施用。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控肿瘤大小的进展。首先进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每隔8周扫描一次CT，每4周测量一次肿瘤标记。采取血样以测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本以测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
                       实施例16
                 用静脉施用的hLF联合治疗
通过静脉施用给病人单独使用重组乳铁蛋白，或与标准抗癌方法联用，以抑制肿瘤生长。
简单地说，根据实施例15中确定的最佳治疗方法和剂量使用rhLF，并且根据肿瘤类型选择标准的抗癌方法作为联合治疗的一部分。所附加的抗癌治疗的施用途径和方法遵照FDA批准的或经同行评议发表的方法。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控肿瘤大小的进展。首先进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每8周扫描一次CT，每4周测量一次肿瘤标记。采取血样以测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本以测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
                       实施例17
                     瘤内rhLF的活性
将人口咽鳞状细胞癌的O12肿瘤细胞注入无胸腺裸鼠的右侧。通过瘤内施用途径给动物使用重组人乳铁蛋白和载体对照。每个动物使用50μl剂量不同浓度的rhLF，每个50μl剂量由4个约12.5μl的分剂量组成，以不同的方向和角度注射(大约相当于东、南、西、北)，以使整个剂量均匀分布在整个肿瘤中(即铺展开)。
            表13通过瘤内注射重组人乳铁蛋白治疗裸鼠中人鳞状细胞癌的方案
 组     方案                  组内每只动物使用rhLF的剂量
    0  1   2   3  4 5
 E.A 第1天1次，8天后处死(裸鼠)     0  100μg   250μg   500μg  250μg* na
 C 接种后11天开始，每天2次，共8天。第20天处死(裸鼠)     0  25μg   50μg   125μg  250μg 500μg
表13显示了每个实验组的方案和每组每只动物每针使用rhLF的剂量。本研究中，将rhLF直接注入肿瘤。通过外部卡尺测量突出肿瘤，每日跟踪每只动物的肿瘤生长。
本模型中，与对照组相比，两个rhLF处理组肿瘤生长都十分明显地减小。从A组和C组中合并出安慰剂组，其肿瘤大小中等。与之相比，使用了单剂量rhLF组(A组)的动物的肿瘤在施用11天后其生长减少了50％(p＜0.05)；而每日2次施用组(C组)则减少了56％(见图5)。
                       实施例18
                瘤内施用rhLF后的免疫刺激
根据实施例17中的方法，正常C3H/HeJ小鼠接种SCCVII和RIF小鼠肿瘤细胞系中的一个。小鼠内肿瘤建立起来后，每天瘤内注射每个剂量为250μg或500μg的rhLF或载体对照，连续4天。最后一次注射24小时后处死小鼠并观察血中淋巴细胞数量。与安慰剂处理的对照动物相比，循环淋巴细胞的数量增加了34％到56％(表14)。
 表14瘤内注射rhLF后循环淋巴细胞的增加
CD3+ CD4+ CD8+
细胞数
-安慰剂组 2104 1800 785
-rhLF处理组 3291 2621 1054
经rhLF处理后的增长 56％ 46％ 34％
                     实施例19
             hLF与其他药剂联合化学治疗
将待测肿瘤细胞注入无胸腺裸鼠的右侧。如实施例1或实施例17中所述，单独瘤内施用rhLF以及与其他抗癌方法联用。对照动物仅使用载体，而不含rhLF。抗癌治疗使用标准的或已发表的方法。治疗从肿瘤细胞接种后约11天开始，以使肿瘤建立和形成；或根据标准或已发表方法在其他时间点上进行。
通过在实验之间或实验之后测量实体瘤体积来评估治疗效果。测量肿瘤时也同时测量动物的体重。
                    实施例20
                   瘤内施用hLF
病人可以通过瘤内施用重组乳铁蛋白抑制肿瘤生长。
简单地说，患有无法切除或已转移癌症的病人每天使用1000μgrhLF，连续8天。或者，已转移癌症病人使用rhLF 1到8天，每天使用剂量为10、50、100、500以及1000μg。采用瘤内施用方式。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控肿瘤大小的进展。首先进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每隔8周扫描一次CT，每4周测量一次肿瘤标记。采取血样以测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本以测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
                     实施例21
                用瘤内hLF联合治疗
通过瘤内施用给病人单独使用重组乳铁蛋白，或与标准抗癌方法联用，以抑制肿瘤生长。
简单的说，根据实施例20中确定的最佳治疗方法和剂量使用rhLF，并且根据肿瘤类型选择标准的抗癌方法作为联合治疗的一部分。所附加的抗癌治疗的施用途径和方法采用FDA批准的或经同行评议发表的方法。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控肿瘤大小的进展。首先进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每隔8周扫描一次CT，每隔4周测量一次肿瘤标记。采取血样以测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本以测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
                      实施例22
                  在人类中局部使用hLF
给病人使用凝胶剂型的重组乳铁蛋白以抑制肿瘤生长。
简单地说，在患有转移性疾病的病人的皮肤或皮下癌症损伤部位每日使用2次的rhLF凝胶组合物，其强度为1％、2.5％或8.5％。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控转移性疾病大小的进展。首先进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每隔8周扫描一次CT。肿瘤标记每4周测量一次。采取血样以测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本以测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
                      实施例23
                 与局部使用hLF联合治疗
通过给病人单独使用凝胶剂型的重组乳铁蛋白，或与标准抗癌方法联用，以抑制肿瘤生长。
简单地说，根据实施例22中确定的最佳治疗方法和剂量使用rhLF，并且根据肿瘤类型选择标准的抗癌方法作为联合治疗的一部分。所附加的抗癌治疗的施用途径和方法采用FDA批准的或经同行评议发表的方法。
以CT扫描和可用的肿瘤标记物监控肿瘤大小的进展。首先进行本底CT扫描，一旦开始治疗，每隔8周扫描一次CT，每隔4周测量一次肿瘤标记。采取血样以测量循环淋巴细胞的亚型和NK细胞的活性。采取血浆、血清和血细胞提取物样本以测量循环IL-18、IL-1、IL-2和IL-4、IL-5、IL-10、IL-12以及IFNγ。
                      引用的参考文献
本说明书所提及的所有专利和出版物展示了熟悉本发明相关技术的人员的水平。本处引用所有专利和出版物作为参考文献，就如同单独地和特定地指出每一出版物被作为参考文献而引用一样。
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尽管已经详细描述了本发明及其优点，应该了解到此处可以进行多种变化、替换和改变，而不会偏离附加描述所定义的内涵和范围。而且，本发明的范围并不限于说明书中所描述的具体实施方案，包括过程、机器、制造、物质组成、途径、方法以及步骤等。本领域普通技术人员将很容易从本发明的公开中了解到，根据本发明，这些当前的或以后将开发的与此处描述的相应实施方案表现出相同的功能或获得相同的结果的发明、过程、机器、制造、物质组成、途径、方法或步骤等，很可能会被用到。因此，说明书旨在将这些过程、机器、制造、物质组成、途径、方法或步骤等包括进其范围。

Claims (34)

1.一种治疗高度增生性疾病的方法，其包括给受试者瘤内施用乳铁蛋白组合物的步骤，其中乳铁蛋白的用量足以改善所述受试者的高度增生性疾病。
2.权利要求1的方法，其中所述的乳铁蛋白组合物分散于药物可接受的载体中。
3.权利要求1的方法，其中所述的乳铁蛋白是指哺乳动物乳铁蛋白。
4.权利要求3的方法，其中所述的乳铁蛋白是人乳铁蛋白。
5.权利要求3的方法，其中所述的乳铁蛋白是牛乳铁蛋白。
6.权利要求3的方法，其中所述的乳铁蛋白是重组乳铁蛋白。
7.权利要求1的方法，其中所述的乳铁蛋白组合物的施用量是每天约0.1μg到约10g。
8.权利要求1的方法，其中所述的高度增生性疾病进一步定义为癌症。
9.权利要求8的方法，其中所述的癌症包括肿瘤。
10.权利要求9的方法，其中所述的肿瘤选自黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、肺肝癌、成视网膜细胞瘤、星状细胞瘤、成胶质细胞瘤、白血病、成神经细胞瘤、鳞状细胞癌、头癌、颈癌、齿龈癌、舌癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾癌、骨癌、睾丸癌、卵巢癌、间皮瘤、肉瘤、宫颈癌、胃肠癌、淋巴瘤、脑癌、结肠癌以及膀胱癌。
11.权利要求1的方法，其中所述的高度增生性疾病选自类风湿性关节炎、炎性肠病、骨关节炎、平滑肌瘤、腺瘤、脂肪瘤、血管瘤、纤维瘤、血管闭塞、再狭窄、动脉硬化、肿瘤前损伤、原位癌、口腔绒毛粘膜白斑病以及牛皮癣。
12.一种治疗高度增生性疾病的方法，其包括通过提高高度增生性疾病部位的乳铁蛋白含量而加强受试者全身免疫系统的步骤。
13.权利要求12的方法，其中所述的乳铁蛋白是重组乳铁蛋白。
14.权利要求12的方法，其中所述的乳铁蛋白经瘤内施用。
15.权利要求12的方法，其中所述的乳铁蛋白刺激白介素-18的产生。
16.权利要求12的方法，其中所述的乳铁蛋白刺激GM-CSF的产生。
17.一种治疗高度增生性疾病的方法，其包括通过提高高度增生性疾病部位的乳铁蛋白含量而加强受试者局部免疫系统的步骤。
18.权利要求17的方法，其中所述的乳铁蛋白是重组乳铁蛋白。
19.权利要求17的方法，其中所述的乳铁蛋白经瘤内施用。
20.权利要求17的方法，其中所述的乳铁蛋白刺激白介素-18的产生。
21.权利要求20的方法，其中所述的白介素-18刺激免疫细胞的产生、成熟或活化。
22.权利要求17的方法，其中所述的乳铁蛋白刺激GM-CSF的产生。
23.一种通过为所述受试者瘤内施用乳铁蛋白组合物而增强肿瘤附近局部免疫应答的方法。
24.权利要求23的方法，其中所述的乳铁蛋白是重组乳铁蛋白。
25.权利要求23的方法，其中所述的乳铁蛋白组合物刺激注射部位的白介素-18。
26.权利要求23的方法，其中所述的乳铁蛋白组合物刺激注射部位的GM-CSF。
27.权利要求25的方法，其中所述的白介素-18刺激免疫细胞的产生、成熟或活化。
28.权利要求27的方法，其中免疫细胞是指T淋巴细胞或自然杀伤细胞。
29.权利要求28的方法，其中T淋巴细胞选自CD4+、CD8+和CD3+细胞。
30.权利要求26的方法，其中所述的GM-CSF刺激免疫细胞的产生、成熟或活化。
31.权利要求30的方法，其中免疫细胞是指树突状细胞或其他抗原呈递细胞。
32.权利要求23的方法，其中所述的受试者患有高度增生性疾病。
33.权利要求1的方法，其进一步包括附加地施用化学治疗、免疫治疗、手术、生物治疗、放射治疗或其组合。
34.一种治疗高度增生性疾病的方法，其包括为受试者瘤内施用乳铁蛋白组合物，并与化学治疗、生物治疗、免疫治疗或放射治疗相联合。
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