PT1507554E

PT1507554E - Lactoferrina no tratamento de neoplasmas malignos e outras doenças hiperproliferativas

Info

Publication number: PT1507554E
Application number: PT03755357T
Authority: PT
Inventors: Atul Varadhachary; Rick Barsky; Frederica Pericle; Karel Petrak; Yenyun Wang
Original assignee: Agennix Inc
Priority date: 2002-05-10
Filing date: 2003-05-09
Publication date: 2011-11-21
Also published as: CN100467059C; ATE519499T1; CA2484656A1; CN1668325A; CN1668326A; EP1507554A1; EP1507554B1; US20040082504A1; JP5156084B2; US20040009895A1; HK1083203A1; JP2011079858A; AU2003273182A1; JP2005533029A; US20110076295A1; AU2003239393A1; AU2003273182B2; JP4685443B2; WO2003099323A1; WO2003094952A1

Description

DESCRIÇÃO

LACTOFERRINA NO TRATAMENTO DE NEOPLASMAS MALIGNOS E OUTRAS DOENÇAS HIPERPROLIFERATIVAS

[0001] Este pedido de patente reivindica prioridade em relação ao Pedido Provisório de Patente norte-americana N.° 60/379,442 depositado a 10 de Maio de 2002, ao Pedido Provisório de Patente norte-americana N.° 60/379,441 depositado a 10 de Maio de 2002 e ao Pedido Provisório de Patente norte-americana 60/379,474 depositado a 10 de Maio de 2002.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se a métodos de tratamento de uma doença hiperproliferativa através da administração de uma composição de lactoferrina isoladamente ou em combinação com terapêuticas antineoplásicas recomendadas. A composição de lactoferrina é administrada oralmente.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Actualmente, há poucas opções eficazes para o tratamento de muitos tipos de cancro comuns. O curso do tratamento para determinado indivíduo depende do diagnóstico, da fase de desenvolvimento da doença e de factores como a idade, sexo e saúde geral do doente. As opções de tratamento oncológico mais convencionais são a cirurgia, a radioterapia e a quimioterapia. A cirurgia desempenha um papel central no diagnóstico e tratamento do cancro. Habitualmente, é necessária uma abordagem cirúrgica para a realização de biópsias e para a remoção de um crescimento canceroso. Contudo, se o cancro estiver metastizado e disseminado, é pouco provável que a cirurgia resulte em cura e é necessária uma abordagem alternativa. Os efeitos secundários da cirurgia incluem redução da função do órgão ou estrutural e maior risco de infecção, hemorragia ou complicações associadas à coagulação. Radioterapia, quimioterapia, bioterapia e 1 imunoterapia são alternativas ao tratamento cirúrgico do cancro (Mayer, 1998; Ohara, 1998; Ho et ai., 1998).A desvantagem de muitas das terapêuticas alternativas são os efeitos secundários, que podem incluir mielossupressão, irritação cutânea, dificuldade em engolir, boca seca, náuseas, diarreia, perda de cabelo, perda de peso e perda de energia (Curran, 1998; Brizel, 1998) .

[0004] A lactoferrina é uma glicoproteina de cadeia simples de ligação ao ferro. Sabe-se que muitos tipos de células, como os monócitos, macrófagos, linfócitos e células intestinais com "borda em escova", têm receptores para a lactoferrina. Para além da lactoferrina ser um factor de crescimento essencial para os linfócitos B e T, tem também uma ampla gama de funções relacionadas com os mecanismos de defesa primários do hospedeiro. Por exemplo, a lactoferrina tem revelado activar os linfócitos NK (Natural Killer), induzir a actividade de estimulação de colónias, activar neutrófilos polimorfonucleares (PMN), regular a granulopoiese, aumentar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos, estimular a actividade das células citotóxicas activadas por linfoquinas (LAK) e potenciar a toxicidade dos macrófagos.

[0005] Recentemente, a lactoferrina bovina (bLF) foi usada como uma profilaxia para a formação de tumores e/ou para tumores estabelecidos. A presente invenção é a primeira a usar a lactoferrina como tratamento e não como profilaxia para tumores estabelecidos.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

[0006] A presente invenção diz respeito a lactoferrina humana para uso num método de redução do crescimento ou de retracção de um neoplasma estabelecido, através da administração oral da lactoferrina humana a um sujeito com um neoplasma estabelecido, numa quantidade suficiente para reduzir o crescimento ou retrair o neoplasma no referido sujeito. 2 A invenção também inclui: - um agente quimioterápico para uso no método aqui definido em combinação com lactoferrina humana administrada oralmente; - um antiácido para uso no método aqui definido em combinação com lactoferrina humana administrada oralmente; o uso de lactoferrina humana para fabrico de uma composição para reduzir o crescimento ou fazer retrair um neoplasma estabelecido através da administração da composição oralmente a um sujeito com um neoplasma estabelecido, numa quantidade suficiente para reduzir o crescimento ou retrair o neoplasma estabelecido; - o uso de um agente quimioterápico para o fabrico de uma composição para reduzir o crescimento ou retrair um neoplasma estabelecido em combinação com lactoferrina humana administrada oralmente; e - o uso de um antiácido para o fabrico de uma composição para reduzir o crescimento ou retrair um neoplasma estabelecido em combinação com lactoferrina humana administrada oralmente.

[0007] A presente invenção refere-se a um método para tratamento de uma doença hiperproliferativa que compreende o passo de administrar oralmente a um sujeito uma composição de lactoferrina humana numa quantidade suficiente para permitir uma melhoria da doença hiperproliferativa no sujeito. Mais especificamente, a quantidade da composição que é administrada é de cerca de 1 mg a cerca de 100 g por dia, mais preferencialmente 20 mg a cerca de 10 g por dia. Outra modalidade refere- -se à administração de um antiácido em conjunção com a composição de lactoferrina humana.

[0008] Em modalidades especificas, a composição de lactoferrina humana é dispersada num veiculo farmacologicamente aceitável. Mais especificamente, a lactoferrina humana é lactoferrina humana recombinante. 3 [0009] A doença hiperproliferativa é também definida como cancro, em que cancro inclui um neoplasma. 0 neoplasma é seleccionado do grupo constituído por melanoma, cancro do pulmão de células não-pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, hepatocarcinoma, retinoblastoma, astrocitoma, gliobastoma, leucemia, neuroblastoma, cancro das células escamosas, neoplasmas da cabeça, pescoço, gengivas, língua, mama, pâncreas, próstata, ovário, cérebro, cólon, bexiga, renal, ósseo, testicular, mesotelioma, sarcoma, cervical, gastrointestinal, linfoma. Mais especificamente, o neoplasma é um neoplasma hematopoiético. Por exemplo, o neoplasma hematopoiético é seleccionado do grupo constituído por leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, síndrome mielodisplásica, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia mielomonocítica juvenil, mieloma múltiplo e leucemia linfocítica crónica.

[0010] Noutras modalidades, a doença hiperproliferativa é seleccionada do grupo constituído por artrite reumatóide, doença inflamatória intestinal, osteoartrose, leiomiomas, adenomas, lipomas, hemangiomas, fibromas, oclusão vascular, reestenose, aterosclerose, lesões pré-neoplásicas, carcinoma in situ, leucoplasia pilosa oral e psoríase.

[0011] Outra modalidade refere-se a um método de tratamento de uma doença hiperproliferativa que compreende o passo de suplementar o sistema imunitário das mucosas num sujeito, aumentando a quantidade de lactoferrina humana no tracto gastrointestinal. A lactoferrina humana é administrada oralmente e estimula a produção de interleucina-18 e Factor de Estimulação de colónias de macrófagos e granulócitos (GM-CSF).

[0012] Ainda outra modalidade, refere-se a um método para reforçar a resposta imunitária das mucosas no tracto gastrointestinal de um sujeito, que compreende o passo de administrar a lactoferrina humana oralmente ao sujeito. A lactoferrina humana estimula a interleucina-18 e o CM-CSF no 4 tracto gastrointestinal. A IL-18 estimula a produção, maturação, migração ou actividade das células imunitárias, e.g., linfócitos T ou linfócitos NK. Os linfócitos T são seleccionados do grupo constituído por células CD4+, CD8+ e CD3+. 0 GM-CSF também estimula a produção, maturação, migração ou actividade das células imunitárias, e.g. células dendríticas e outras células apresentadoras de antigénio. Outra modalidade refere-se ao tratamento de uma doença hiperproliferativa que compreende administrar oralmente a um sujeito uma composição de lactoferrina humana em combinação com quimioterapia, bioterapia, imunoterapia, cirurgia ou radioterapia. Mais particularmente, a quimioterapia é uma quimioterapia à base de platina como a cisplatina ou uma quimioterapia baseada em taxanos como o docetaxel.

[0013] A invenção refere-se a um método de reduzir o crescimento de um neoplasma num sujeito que compreende o passo de administrar oralmente ao sujeito uma composição de lactoferrina humana numa quantidade suficiente para reduzir o crescimento do neoplasma no sujeito. Adicionalmente, a composição de lactoferrina podem ser administrada em combinação com quimioterapia, bioterapia, imunoterapia, cirurgia ou radioterapia.

[0014] Também é descrito um método para tratamento de uma doença hiperproliferativa que compreende o passo de administrar uma composição de lactoferrina a um sujeito por via intravenosa numa quantidade suficiente para permitir uma melhoria da doença hiperproliferativa. A quantidade de composição administrada varia de cerca de 0,1 pg até cerca de 10 g por dia. Mais especificamente, a lactoferrina é lactoferrina de mamífero, por exemplo, humana ou bovina, e pode ser lactoferrina recombinante.

[0015] Também é descrito um método de tratamento de uma doença hiperproliferativa que compreende o passo de suplementar o sistema imunitário sistémico num sujeito, aumentando a quantidade de lactoferrina na circulação sistémica. A 5 lactoferrina é administrada por via intravenosa. Adicionalmente, a composição de lactoferrina é administrada em combinação com quimioterapia, bioterapia, imunoterapia, cirurgia ou radioterapia.

[0016] Também é descrito um método para reforçar uma resposta imunitária sistémica após o passo de administrar por via intravenosa a composição de lactoferrina ao sujeito. A lactoferrina estimula a interleucina-18 e o GM-CSF. Prevê-se que a interleucina-18 estimule a produção ou actividade das células imunitárias, por exemplo linfócitos T ou linfócitos NK, e o CM-CSF promova a migração e maturação das células imunitárias, incluindo células dendriticas e outras células apresentadoras de antigénio.

[0017] Também é descrito um método para tratamento de uma doença hiperproliferativa que compreende o passo de administrar topicamente uma composição de lactoferrina a um sujeito numa quantidade suficiente para permitir uma melhoria da doença hiperproliferativa. A quantidade de composição administrada varia de cerca de 0,1 pg até cerca de 10 g por dia. A composição pode ser um gel tópico, uma solução, cápsula ou um comprimido com uma concentração de lactoferrina de cerca de 0,01% a cerca de 20%. Mais especificamente, a lactoferrina é lactoferrina de mamífero, por exemplo, humana ou bovina, e pode ser lactoferrina recombinante.

[0018] Também é descrito um método para tratamento de uma doença hiperproliferativa através da administração tópica de uma composição de lactoferrina em combinação com quimioterapia, bioterapia, imunoterapia, cirurgia ou radioterapia.

[0019] Também é descrito um método para reforçar uma resposta imunitária local ou sistémica após o passo de administrar por via tópica a composição de lactoferrina ao sujeito. A lactoferrina estimula a produção de interleucina-18 e/ou do GM-CSF pelos queratinócitos. Prevê-se que a interleucina-18 6 estimule a produção ou a actividade das células imunitárias, por exemplo linfócitos T ou linfócitos NK, e o GM-CSF promova a migração e maturação das células imunitárias, incluindo células dendriticas e outras células apresentadoras de antigénio.

[0020] Também é descrito um método de estimular, reforçar ou regular positivamente a interleulcina-18 e/ou o GM-CSF através da administração de uma composição de lactoferrina a um sujeito.

[0021] O resumo acima apresentado delineou em traço gerais as caracteristicas e vantagens técnicas da presente invenção de modo a que a seguinte descrição detalhada da invenção possa ser melhor compreendida. Caracteristicas e vantagens adicionais da invenção serão descritas de seguida, constituindo o conteúdo das reivindicações da invenção. Os especialistas compreenderão que o conceito e modalidade específicos revelados podem ser prontamente utilizados como base para modificar ou desenhar outras estruturas que permitam executar os mesmos propósitos da presente invenção. Os especialistas deverão estar cientes de que tais construções equivalentes não se afastam do âmbito da invenção tal como apresentado nas reivindicações anexas. As caracteristicas inovadoras que se considera serem próprias da invenção, tanto no que se refere à sua organização como ao método de operação, em conjunto com outros objectivos e vantagens serão melhor compreendidas a partir da descrição que se segue quando tomada em consideração em conjunto com as figuras anexas. Deverá ser expressamente compreendido, contudo, que cada uma das figuras é fornecida apenas para fins de ilustração e descrição e não se destina a definir os limites da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0022] Para uma compreensão mais completa da presente invenção, analisemos as descrições que se seguem em conjunção com os desenhos anexos. 7 [0023] A FIG. 1 mostra um crescimento tumoral de células escamosas com e sem administração oral, intravenosa e intratumoral de lactoferrina humana recombinante.

[0024] A FIG. 2 mostra a percentagem de inibição do crescimento tumoral em animais que receberam lactoferrina, cisplatina e lactoferrina em combinação com cisplatina.

[0025] A FIG. 3 mostra a percentagem de inibição do crescimento tumoral com lactoferrina em combinação com várias doses de cisplatina.

[0026] A FIG. 4 mostra a actividade das NK após o tratamento com lactoferrina.

[0027] A FIG. 5 mostra o crescimento tumoral das células escamosas com e sem administração intratumoral de lactoferrina recombinante um ou duas vezes ao dia.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0028] É imediatamente evidente para um especialista que é possivel concretizar várias modalidades e modificações à invenção reveladas neste Pedido de patente, sem afastamento do âmbito da invenção.

[0029] Como aqui empregue, o uso das palavras "um" ou "uma" em conjunção com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou na especificação pode significar "uma unidade", mas também significa "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais do que um" .

[0030] O termo "doença hiperproliferativa" como aqui empregue refere-se a qualquer doença ou distúrbio no qual as células proliferam mais rapidamente do que o crescimento de tecido normal. Assim, uma célula hiperproliferativa é uma célula que prolifera mais rapidamente do que as células normais.

[0031] 0 termo "administração parentérica" como aqui usado inclui qualquer forma de administração na qual o composto é absorvido pelo sujeito sem envolver absorção através dos intestinos. Exemplos de administração parentérica incluem a administração intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intratumoral, intra-ocular ou intra-articular.

[0032] O termo "administração intravenosa" como aqui empregue inclui todas as técnicas para fornecer uma composição de lactoferrina à circulação sistémica através de infusão ou injecção intravenosa.

[0033] O termo "administração intratumoral" como aqui empregue inclui todas as técnicas de administração de uma composição de lactoferrina ao local de um tumor incluindo injecção, electroporação, cremes, loções ou outras formas de administração.

[0034] 0 termo "administração oral" como aqui empregue inclui a administração oral, bucal, entérica ou intragástrica.

[0035] 0 termo "administração tópica", como aqui empregue, inclui a aplicação a uma superfície dérmica, epidérmica, subcutânea ou mucosa.

[0036] 0 termo "veículo farmacologicamente aceitável", como aqui empregue, inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção ou similares. 0 uso destes meios e agentes para substâncias farmacologicamente activas é do conhecimento geral. Excepto quando algum meio ou agente convencional é incompatível com os vectores ou células da presente invenção, está previsto o seu 9 uso nas composições terapêuticas. Também é possível incorporar ingredientes activos suplementares nas composições.

[0037] O termo "lactoferrina" ou "LF", como aqui empregue, refere-se a lactoferrina nativa ou recombinante. A lactoferrina nativa pode ser obtida por purificação a partir de leite ou colostro de mamífero ou de outras fontes naturais. A lactoferrina recombinante (rLF) pode ser produzida por expressão recombinante ou produção directa por animais, plantas, fungos ou bactérias, geneticamente modificados, ou outras espécies procarióticas ou eucaróticas ou através de síntese química.

[0038] 0 termo "sujeito", como aqui empregue, pretende referir qualquer sujeito mamífero ao qual a composição de lactoferrina é administrada de acordo com os métodos aqui descritos. Numa modalidade específica, os métodos são empregues para tratar um sujeito humano. Também é descrito o tratamento de um sujeito humano afectado por uma doença hiperproliferativa.

[0039] 0 termo "quantidade terapeuticamente eficaz", como aqui usado, refere-se a uma quantidade que produz uma melhoria ou correcção dos sintomas da doença ou condição clínica.

[0040] O termo "tratar" e "tratamento" como aqui usado refere-se à administração a um sujeito de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição de lactoferrina, de modo a que sujeito tenha uma melhoria na doença. A melhoria é qualquer melhoria ou correcção dos sintomas. A melhoria é observável ou mensurável. Assim, um especialista sabe que um tratamento pode melhorar a condição clínica, mas não significar uma cura completa da doença. Especificamente, as melhorias em doentes com cancro podem incluir estabilização do tumor, retracção do tumor, aumento do tempo até à progressão da doença, aumento da sobrevivência ou melhorias na qualidade de vida. O efeito benéfico também pode reflectir-se numa melhoria do sistema imunitário do doente conforme medido pelo número e 10 actividade das células imunitárias em circulação, como por exemplo, células CD4+, células CD8+, células NK e células CD40+.

[0041] O termo "proximidade" como aqui empregue significa dentro ou em torno da área ou local do tumor e/ou doença hiperproliferativa. Por exemplo, "proximidade de um tumor" pode designar a área dentro ou em torno do tumor ou margens do tumor. Proximidade inclui a área adjacente ao tumor, a área sobre o tumor, a área sob o tumor, a margem do tumor ou a área adjacente à margem do tumor. A. Composições farmacêuticas [0042] A lactoferrina usada de acordo com a presente invenção pode ser obtida através do isolamento e purificação a partir de fontes naturais, por exemplo, mas não se limitando a, leite de mamífero. A lactoferrina é lactoferrina humana. Em modalidades preferidas, a lactoferrina é lactoferrina humana produzida através de tecnologia recombinante usando técnicas de engenharia genética bem conhecidas e usadas na arte, como a expressão recombinante ou a produção directa em animais, plantas ou organismos eucariotas geneticamente modificados, ou por síntese química. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. N.° 5,571,896, 5,571,697 e 5,571,691.

[0043] A administração das composições de lactoferrina de acordo com a presente invenção é oral. Estas composições serão normalmente administradas como composições farmacologicamente aceitáveis como aqui descrito.

[0044] As composições da presente invenção podem ser formuladas em forma de sal ou numa forma neutra. Os sais farmacologicamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácidos (formados com os grupos amino livres da proteína) e que são formados por ácidos inorgânicos como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos como o acético, oxálico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxilo 11 livres podem também ser derivados de bases inorgânicas como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico e bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares.

[0045] As soluçoes injectáveis estéreis são preparadas através da incorporação da lactoferrina na quantidade necessária no solvente adequado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação de vários ingredientes activos esterilizados num veiculo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários de entre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções estéreis injectáveis, os métodos preferidos de preparação são as técnicas de secagem com vácuo e secagem por congelação que produz um pó de ingrediente activo mais algum ingrediente adicional pretendido a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração.

[0046] Ainda de acordo com a presente invenção, a composição de lactoferrina para administração oral é habitualmente fornecida num veiculo farmacologicamente aceitável com ou sem um diluente inerte. 0 veiculo deve ser assimilável ou comestível e inclui veículos líquidos, semi-sólidos, í.e., pastas, ou sólidos. Exceptuando quando algum meio, agente ou veículo convencional é prejudicial ao sujeito ou à eficácia terapêutica de uma preparação de lactoferrina aí contida, é adequado o seu uso numa lactoferrina oralmente administrável para uso na aplicação dos métodos da presente invenção. Exemplos de veículos ou diluentes incluem gorduras, óleos, água, soluções salinas, lípidos, lipossomas, resinas, ligantes, aditivos de enchimento e similares, ou combinações destes.

[0047] De acordo com a presente invenção, a lactoferrina é combinada com o veículo de qualquer modo prático e conveniente, í.e., por solução, suspensão, emulsificação, mistura, 12 encapsulação , microencapsulação, absorção e similares. Estes procedimentos são rotina para os especialistas na arte.

[0048] Numa modalidade especifica da presente invenção, a lactoferrina sob a forma de pó é combinada ou homogeneizada com um veiculo sólido ou semi-sólido. A mistura pode ser efectuada de qualquer modo conveniente, por exemplo, moendo. Podem também ser adicionados agentes de estabilização no processo de mistura, de modo a proteger a composição da perda de actividade terapêutica, por exemplo, por desnaturação no estômago. Exemplos de estabilizadores para uso numa composição administrável oralmente incluem tampões, antagonistas da secreção de ácidos gástricos, aminoácidos como glicina e lisina, hidratos de carbono como dextrose, manose, galactose, frutose, lactose, sacarose, maltose, sorbitol, manitol, etc., inibidores das enzimas proteoliticas e similares. Mais preferencialmente, para uma composição administrada oralmente, o estabilizador pode também incluir antagonistas da secreção de ácidos gástricos.

[0049] Além disso, a lactoferrina para administração oral que é combinada com um veículo semi-sólido ou sólido pode ser também formulada em cápsulas de gelatina duras ou moles, comprimidos ou pílulas. De preferência, as cápsulas de gelatina, comprimidos ou pílulas têm um revestimento entérico. Os revestimentos entéricos evitam a desnaturação da composição no estômago ou intestino superior onde o pH é ácido. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N.° 5,629,001. Ao chegar ao intestino delgado, o pH básico aí existente dissolve o revestimento e permite que a composição seja libertada e absorvida por células especializadas, i.e., enterócitos epiteliais e células M das placas de Peyer.

[0050] Noutra modalidade, um composição em pó é combinada com um veiculo liquido como, p. ex., água ou solução salina, com ou sem um agente estabilizador.

[0051] Uma formulação específica que pode ser usada é uma solução de lactoferrina num tampão à base de fosfato hipotónico 13

que é isenta de potássio, cuja composição é a seguinte: fosfato de sódio monobásico monohidratado 6mM, fosfato de sódio dibásico heptahidratado 9mM, cloreto de sódio 50mM, pH 7,0 ± 0,1. A concentração de lactoferrina num tampão hipotónico pode variar de 10 microgramas/ml a 100 miligramas/ml. Esta formulação pode ser administrada por qualquer via de administração, por exemplo, administração intratumoral.

[0052] Além disso, uma composição para administração tópica que é combinada com um veiculo semi-sólido pode ser também formulada num gel. Um veiculo preferido para a formação de um gel é um polímero de gel. Os polímeros preferidos que são usados para fabrico de uma composição em gel incluem, mas não se limitam aos polímeros carbopol, carboximetilcelulose e Pluronic. Especificamente, uma composição de lactoferrina em pó é combinada com um gel aquoso contendo um agente de polimerização como Carbopol 980 numa dosagem entre 0,5% e 5% peso/volume para aplicação à pele para tratamento de doença hiperproliferativa na pele ou sob a pele.

[0053] Após a formulação, as soluções podem ser administradas de modo compatível com a forma farmacêutica e numa quantidade que seja terapeuticamente eficaz para resultar numa melhoria ou correcção dos sintomas. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas farmacêuticas, tais como soluções digeríveis para ingestão, cápsulas de libertação prolongada e similares. Pode haver alguma variação na dosagem dependendo da condição clínica do sujeito a tratar. A pessoa responsável pela administração pode, em todo o caso, determinar a dose adequada para o sujeito individual. Além disso, para administração humana, as preparações cumprem as normas de esterilidade, segurança geral e pureza, conforme exigido pelas padrões do FDA, Office of Biologics. B. Tratamento de doenças hiperproliferativas [0054] De acordo com a presente invenção, uma composição de 14 lactoferrina fornecida em qualquer dos veículos farmacêuticos acima descritos pode ser administrada a um sujeito com um neoplasma estabelecido. Um perito na arte pode determinar a quantidade terapeuticamente eficaz de lactoferrina humana a ser administrada a um sujeito com base em várias considerações, como a absorção, metabolismo, método de administração, idade, peso, gravidade da doença e resposta à terapêutica.

[0055] A via de administração é a oral.

[0056] A administração oral da composição de lactoferrina inclui a administração oral, bucal, entérica ou intragástrica. Também está previsto que a composição possa ser usada como um aditivo alimentar. Por exemplo, a composição é polvilhada sobre a comida ou adicionada a um líquido antes da ingestão.

[0057] Um neoplasma é um crescimento anómalo de tecido, geralmente formando uma massa distinta que cresce por proliferação celular mais rapidamente do que o crescimento de tecido normal. Os neoplasmas revelam uma total ou parcial falta de organização estrutural e de coordenação funcional com o tecido normal. Podem ser classificados, grosso modo, em três tipos principais. Os neoplasmas malignos que surgem em estruturas epiteliais são denominados carcinomas, os neoplasmas malignos que têm origem no tecido conjuntivo como, por exemplo, músculo, cartilagem, gordura ou osso, são denominados sarcomas e os neoplasmas malignos que afectam as estruturas hematopoiéticas (estruturas associadas à formação de células sanguíneas) incluindo componentes do sistema imunitário, são denominados leucemias, linfomas e mielomas. Um tumor é o crescimento neoplásico da doença oncológica. Como aqui empregue, um "neoplasma", também designado de "tumor", pretende incluir neoplasmas hematopoiéticos, assim como neoplasmas sólidos. Exemplos de neoplasmas incluem, mas não se limitam a melanoma, cancro do pulmão de células não-pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, hepatocarcinoma, retinoblastoma, astrocitoma, gliobastoma, leucemia, neuroblastoma, neoplasmas da cabeça, pescoço, gengivas, língua, mama, pâncreas, próstata, ovário, 15 cérebro , cólon, bexiga, renal, cervical, ósseo, testicular, gastrointestinal, mesotelioma, sarcoma, linfoma, mieloma ou outros neoplasmas malignos ou benignos.

[0058] Outras doenças hiperproliferativas incluem, neurofibromatose, artrite reumatóide, granulomatose de Wegener, doença de Kawasaki, lúpus eritematoso, granuloma letal da linha média, doença inflamatória intestinal, osteoartrose, leiomiomas, adenomas, lipomas, hemangiomas, fibromas, oclusão vascular, reestenose, aterosclerose, lesões pré-neoplásicas, carcinoma in situ, leucoplasia pilosa oral ou psoriase, e pré-leucemias, anemia com excesso de blastos e sindrome mielodisplásica.

[0059] Neoplasmas com um interesse particular para a presente invenção incluem, mas não se limitam a, neoplasmas hematopoiéticos. Por exemplo, um neoplasma hematopoiético pode incluir leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, sindrome mielodisplásica, leucemia mielomonocitica crónica, leucemia mielomonocitica juvenil, mieloma múltiplo e leucemia linfocitica crónica, ou outras doenças malignas de origem hematológica.

[0060] Na presente invenção, as composições de lactoferrina destinam-se a ser administradas numa quantidade eficaz para diminuir, reduzir, inibir ou eliminar o crescimento de um tumor. A quantidade pode variar de cerca de 0,1 pg a cerca de 100 g da composição de lactoferrina. De preferência, a composição de lactoferrina é administrada oralmente no intervalo de 1 mg a 100 g por dia, mais preferencialmente de cerca de 20 mg a cerca de 10 g por dia com a dose mais preferida sendo 4,5 g por dia. De preferência, a solução, cápsula ou comprimido compreende uma concentração de lactoferrina de cerca de 0,01% a cerca de 20%. Mais preferivelmente, a solução, cápsula ou comprimido pode compreender uma concentração de lactoferrina de cerca de 1% a cerca de 8,5%.

[0061] Os regimes de tratamento podem também variar e, 16 frequentemente, dependem do tipo de tumor, localização do tumor, progressão da doença, idade e estado geral de saúde do doente. Obviamente, determinados tipos de tumor requerem um tratamento mais agressivo e, simultaneamente, alguns doentes podem não tolerar mais protocolos esgotantes. 0 médico é quem está em melhores condições de tomar essa decisão com base na eficácia conhecida e toxicidade (caso exista) das formulações terapêuticas.

[0062] Em determinadas modalidades, o tumor a tratar pode não ser ressectável, pelo menos inicialmente. Os tratamentos com a composição de lactoferrina podem aumentar a possibilidade de ressecção do tumor devido à retracção nas margens ou através da eliminação de determinadas porções particularmente invasivas. Após os tratamentos, pode ser possível a ressecção. Tratamentos adicionais subsequentes à ressecção servirão para eliminar resíduos microscópicos no local do tumor.

[0063] A presente invenção pode ser usada no momento da cirurgia e/ou depois desta, para tratar doença residual ou metastases. Por exemplo, o leito tumoral resseccionado pode ser injectado ou perfundido com uma formulação que compreende a composição de lactoferrina. A perfusão pode ser continuada após a ressecção, por exemplo, deixando um cateter implantado no local da cirurgia. Também está previsto tratamento pós-cirúrgico periódico.

[0064] A administração contínua pode também ser aplicada quando apropriado, por exemplo, quando há excisão de um tumor e o leito tumoral é tratado para eliminar doença residual, microscópica. É preferida a administração através de seringa ou cateterização. Esta perfusão contínua pode ocorrer por um período de cerca de 1-2 horas até cerca de 6-12 horas, de cerca de 12-24 horas a cerca de 1-2 dias, a cerca de 1-2 semanas ou mais após o início do tratamento. Geralmente, a dose da composição terapêutica via perfusão contínua será equivalente à que é administrada através de uma única ou múltiplas injecções, ajustada ao longo de um 17 período de tempo durante o qual ocorre a perfusão. Está ainda prevista a utilização da perfusão de um membro para administrar composições terapêuticas, particularmente no tratamento de melanomas e sarcomas.

[0065] Em modalidades específicas, a composição de lactoferrina pode ser administrada numa dose unitária ou em doses múltiplas. A dose unitária pode ser administrada diariamente, múltiplas vezes ao dia, múltiplas vezes por semana, mensalmente ou múltiplas vezes ao mês. Noutra modalidade, a composição de lactoferrina pode ser administrada numa série de doses. A série de doses pode ser administrada diariamente, múltiplas vezes ao dia, semanalmente, múltiplas vezes por semana, mensalmente ou múltiplas vezes ao mês.

[0066] Descrevemos um método para tratar uma doença hiperproliferativa, que compreende o passo de suplementar o sistema imunitário das mucosas aumentando a quantidade de lactoferrina no tracto gastrointestinal. Preferencialmente, a lactoferrina é administrada oralmente.

[0067] Também descrevemos um método de reforço da resposta imunitária da mucosa no tracto gastrointestinal num sujeito, que compreende o passo de administrar oralmente ao referido sujeito uma composição de lactoferrina, de preferência lactoferrina humana. Prevê-se que a lactoferrina estimule a interleucina-18 e o GM-CSF no tracto gastrointestinal, o que reforça as células imunitárias. Por exemplo, a interleucina-18 reforça os linfócitos T ou os linfócitos NK e o GM-CSF promove a maturação e migração das células imunitárias incluindo células dendríticas e outras células apresentadoras de antigénio. Em modalidades especificas, a interleucina-18 (IL-18) reforça as células CD4+, CD8+ e CD3+. É do conhecimento dos peritos que a IL-18 é uma citocina Thl que actua em sinergia com a interleucina-12 e a interleucina-2 na estimulação da produção IFN-gama pelos linfócitos. Outras citocinas podem também ser reforçadas, por exemplo, mas não se limitando a, IL-lb, IL-12 ou IFN-gama. 18

Também se considera que a lactoferrina estimula a interleucina-18 após a administração oral, o que inibe a angiogénese e, deste modo, tem actividade contra as células tumorais que dependem da neovascularização.

[0068] Descrevemos igualmente um método para tratar uma doença hiperproliferativa, que compreende o passo de suplementar o sistema imunitário sistémico aumentando a quantidade de lactoferrina na circulação sistémica. Preferencialmente, a composição de lactoferrina é administrada por via intravenosa. Considera-se que a lactoferrina estimula a interleucina-18 e o GM-CSF nos tecidos, o que reforça as células imunitárias. Por exemplo, a interleucina-18 reforça os linfócitos T ou os linfócitos NK e o GM-CSF promove a maturação e migração das células imunitárias incluindo células dendriticas e outras células apresentadoras de antigénio. Em modalidades especificas, a interleucina-18 (IL-18) reforça as células CD4+, CD8+ e CD3+. É do conhecimento dos peritos que a IL-18 é uma citocina Thl que actua em sinergia com a interleucina-12 e a interleucina-2 na estimulação da produção IFN-gama pelos linfócitos. Outras citocinas podem também ser reforçadas, por exemplo, mas não se limitando a, IL-lb, IL-12 ou IFN-gama. Também se prevê que a lactoferrina estimule a interleucina-18 após a administração intravenosa, o que inibe a angiogénese e, deste modo, tem actividade contra as células tumorais que dependem da neovascularização.

[0069] Descrevemos igualmente um método para tratar uma doença hiperproliferativa, que compreende o passo de suplementar o sistema imunitário local ou sistémico aumentando a quantidade de lactoferrina na proximidade do tumor. Proximidade do tumor refere-se à área geral do tumor, por exemplo a lactoferrina pode ser administrada directamente sobre ou para dentro do tumor, ou na área geral do tumor, mas não directamente para dentro do tumor. A área geral pode incluir as margens do tumor ou a área próxima ou adjacente à margem do tumor. Preferencialmente, a composição de lactoferrina é administrada por via intratumoral. 19

Prevê-se que a lactoferrina estimule a interleucina-18 e o GM-CSF no tecido local, o que reforça as células imunitárias. Por exemplo, a interleucina-18 reforça os linfócitos T ou os linfócitos NK e o GM-CSF promove a maturação e migração das células imunitárias incluindo células dendriticas e outras células apresentadoras de antigénio. Em modalidades especificas, a interleucina-18 (IL-18) reforça as células CD4+, CD8+ e CD3+. É do conhecimento dos peritos que a IL-18 é uma citocina Thl que actua em sinergia com a interleucina-12 e a interleucina-2 na estimulação da produção IFN-gama pelos linfócitos. Outras citocinas podem também ser reforçadas, por exemplo, mas não se limitando a, IL-lb, IL-12 ou IFN-gama. Também se considera que a lactoferrina estimula a interleucina-18 após a administração intratumoral, o que inibe a angiogénese e, deste modo, tem actividade contra as células tumorais que dependem da neovascularização.

[0070] Descrevemos igualmente um método para tratar uma doença hiperproliferativa, que compreende o passo de suplementar o sistema imunitário local ou sistémico, aumentando a quantidade de lactoferrina na pele na proximidade do tumor. De preferência, a composição de lactoferrina é administrada topicamente. Conforme indicado acima, a administração na proximidade do tumor inclui a administração próxima ou adjacente às margens do tumor ou directamente nas margens do tumor. Prevê-se que a lactoferrina estimule a interleucina-18 e o GM-CSF no tecido local (e.g., queratinócitos) , o que reforça as células imunitárias. Por exemplo, a interleucina-18 reforça os linfócitos T ou os linfócitos NK e o GM-CSF promove a maturação e migração das células imunitárias incluindo células dendriticas e outras células apresentadoras de antigénio. Em modalidades específicas, a interleucina-18 (IL-18) reforça as células CD4+, CD8+ e CD3+. É do conhecimento dos peritos que a IL-18 é uma citocina Thl que actua em sinergia com a interleucina-12 e a interleucina-2 na estimulação da produção IFN-gama pelos linfócitos. Outras citocinas podem também ser reforçadas, por exemplo, mas não se limitando a, IL-lb, IL-12 ou IFN-gama. 20

Também se considera que a lactoferrina estimula a interleucina-18 após a administração intratumoral, o que inibe a angiogénese e, deste modo, tem actividade contra as células tumorais que dependem da neovascularização. C. Tratamentos de combinação [0071] De modo a aumentar a eficácia da composição de lactoferrina humana da presente invenção, pode ser desejável combinar a composição da presente invenção com outros agentes eficazes no tratamento da doença hiperproliferativa, como por exemplo agentes anticancerosos ou com cirurgia. Um agente "anticancro" é capaz de afectar negativamente o cancro num sujeito, por exemplo, matando células cancerosas, induzindo a apoptose destas células, reduzindo a sua taxa de crescimento, reduzindo a incidência ou número de metastases, reduzindo o tamanho do tumor, inibindo o crescimento do tumor, reduzindo o fornecimento de sangue ao tumor ou às células cancerosas, promovendo uma resposta imunitária contra as células cancerosas ou tumor, evitando ou inibindo a progressão do cancro ou aumentando a esperança de vida de um sujeito com cancro. Os agentes anticancro incluem agentes biológicos (bioterapia), agentes quimioterápicos e agentes radioterapêuticos. No geral, estas outras composições seriam fornecidas numa quantidade combinada eficaz para matar ou inibir a proliferação da célula. Este processo pode envolver a administração de uma composição de lactoferrina humana da presente invenção e do agente(s) ou factor(es) ao mesmo tempo. Isto pode ser realizado através da administração de uma única composição ou formulação farmacológica que inclui ambos os agentes, ou através da administração de duas composições ou formulações distintas, simultaneamente ou em momentos suficientemente próximos para ocasionar uma sobreposição de efeitos, em que uma composição inclui a composição de lactoferrina humana e a outra inclui o segundo agente (s) . 21 [0072] Em alternativa, a composição de lactoferrina da presente invenção pode preceder ou suceder ao outro agente anticancro com um intervalo de minutos a semanas. Em modalidades nas quais o outro agente anticancro e a composição de lactoferrina são administrados ou aplicados separadamente à célula, é necessário garantir que não passa um período de tempo significativo entre o momento de cada administração, de forma a que o agente e a composição de lactoferrina possam ainda exercer um efeito vantajosamente combinado sobre a célula. Assim, considera-se desejável realizar a administração dos dois agentes com um intervalo de cerca de 1-14 dias, mais preferencialmente com um intervalo de cerca de 12-24 horas. Nalgumas situações, contudo, pode ser desejável prolongar significativamente o período de tempo do tratamento, podendo decorrer vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) entre as respectivas administrações. 1. Quimioterapia [0073] As terapêuticas antineoplásicas também incluem uma variedade de tratamentos químicos. Alguns exemplos de agentes quimioterápicos incluem, sem limitação, antibióticos quimioterápicos, como a doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina (também conhecido como mutamicina e/ou mitomicina-C), actinomicina D (Dactinomicina) , bleomicina, plicamicina, alcaloides de plantas como o taxol, vincristina, vinblastina, agentes vários como os agentes à base de platina (e.g., cisplatina (CDDP)), etoposido (VP16), factor de necrose tumoral, e agentes alquilantes, como a carmustina, melfalano (também designado Alkeran, L-fenilalanina mostarda, fenilalanina mostarda, L-PAM, ou L-sarcolisina, (um derivado da fenilalanina da mostarda de nitrogénio) , ciclofosfamida, clorambucil, bussulfano (também designado Myleran), agentes baseados em taxanos (e.g., docetaxel) e lomustina.

[0074] Alguns exemplos de outros agentes incluem, mas não se 22 limitam a, carboplatina, procarbazina, mecloretamina, irinotecano, topotecano, ifosfamida, nitrosureias, etoposido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, toremifeno, idoxifeno, droloxifeno, TAT-59, zindoxifeno, trioxifeno, ICI 182,780, EM-800, agentes de ligação ao receptor de estrogénio, gemcitabina, Navelbine, inibidores da farnesil transferase, transplatina, 5-fluorouracilo, peróxido de hidrogénio, e metotrexato, temozolomida (uma forma aquosa de DTIC), Mylotarg, Dolastatina 10, briostatina, ou qualquer análogo ou variante derivada destes. 2. Agentes radioterapêuticos [0075] Os agentes e factores radioterapêuticos incluem radiação e ondas que induzem lesões no DNA, por exemplo, radiação gama, raios X, radiação UV, microondas, emissões electrónicas, radioisótopos e similares. A terapêutica pode ser realizada irradiando o local do tumor localizado, através das formas de radiação acima descritas. O mais provável é que todos estes factores induzam um largo espectro de lesões ao DNA, aos precursores do DNA, à replicação e reparação do DNA e à união e manutenção dos cromossomas.

[0076] As doses de raios X variam de doses diárias de 50 a 200 roentgen para períodos de tempo prolongados (3 a 4 semanas) a doses unitárias de 2000 a 6000 roentgen. Os intervalos de dose para radioisótopos variam grandemente e dependem da semivida do isótopo, da intensidade e tipo de radiação emitida, e da captação pelas células neoplásicas. 3. Cirurgia [0077] Aproximadamente 60% das pessoas com cancro serão submetidas a algum tipo de cirurgia, incluindo cirurgia preventiva, diagnóstica ou de preparação, curativa e paliativa. A cirurgia curativa é um tratamento oncológico que pode ser usado em conjunção com outras terapêuticas, tais como o 23 tratamento aqui descrito, quimioterapia, radioterapia, terapêutica hormonal, terapêutica genética, imunoterapia e/ou terapias alternativas.

[0078] A cirurgia curativa inclui ressecção na qual o todo ou uma parte do tecido canceroso é fisicamente removido, excisado e/ou destruído. A ressecção tumoral refere-se à remoção física de pelo menos parte de um tumor. Para além da ressecção tumoral, o tratamento por cirurgia inclui cirurgia a laser, criocirurgia, electrocirurgia e cirurgia micrográfica de Mohs. Está ainda previsto que a presente invenção possa ser usada em conjunção com a remoção de cancros superficiais, estados pré-cancerosos ou quantidades incidentais de tecido normal.

[0079] Após a excisão de parte ou da totalidade do tumor, tecido ou células cancerosas, pode formar-se uma cavidade no corpo. O tratamento pode ser realizado por perfusão, injecção directa ou aplicação local na área com uma terapêutica anticancro adicional. Este tratamento pode ser repetido, por exemplo, a cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dias ou a cada 1, 2, 3, 4 e 5 semanas ou cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 meses. Estes tratamentos podem ser em dosagens também variáveis. 4. Outros agentes de bioterapia [0080] Está previsto que possam ser utilizados outros agentes biológicos em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Estes agentes adicionais incluem, sem limitação, agentes que afectam a regulação positiva dos receptores de superfície da célula e junções comunicantes (gap junctions), agentes citostáticos e de diferenciação, inibidores da adesão celular, agentes que aumentam a sensibilidade das células hiperproliferativas a indutores apoptóticos ou outros agentes biológicos, assim como bioterapia como, por exemplo, hipertermia.

[0081] A hipertermia é um procedimento no qual um tecido do 24 doente é exposto a temperaturas elevadas (até 41 °C). Podem ser usados dispositivos de aquecimento externos ou internos na aplicação de hipertermia local, regional ou a todo o organismo. A hipertermia local envolve a aplicação de calor a uma pequena área, como um tumor. O calor pode ser gerado externamente através de ondas de alta frequência dirigidas a um tumor por um dispositivo exterior ao corpo. O calor interno pode envolver uma sonda estéril com fios metálicos finos aquecidos ou tubos ocos enchidos de água quente, antenas de microondas implantadas ou eléctrodos de radiofrequência.

[0082] Um órgão ou membro de um doente é aquecido para terapêutica regional, o que é realizado usando dispositivos que produzem alta energia, como imans. Em alternativa, algum do sangue do doente pode ser removido e aquecido antes de ser perfundido numa área que se pretende aquecer internamente. O aquecimento do corpo todo pode também ser implementado em casos nos quais o cancro se disseminou por todo o organismo. Banhos de água quente, cera quente, bobinas de indução e câmaras térmicas podem ser usadas para este fim.

[0083] Também pode ser empregue terapêutica hormonal em conjunção com a presente invenção. 0 uso de hormonas pode ser empregue no tratamento de determinados cancros, como os cancros da mama, próstata, ovário ou cervical, para reduzir o nível de determinadas hormonas, como a testosterona ou os estrogénios, ou bloquear os seus efeitos, e isto frequentemente reduz o risco de metastases.

[0084] Também pode ser empregue terapêutica adjuvante em conjunção com a presente invenção. O uso de adjuvantes ou agentes imunomoduladores inclui, mas não se limita a, factor de necrose tumoral; interferão alfa, beta e gama; IL-2 e outras citocinas; F42K e outros análogos de citocinas; MIP-1, MIP-lbeta, MCP-1, RANTES e outras quimiocinas. 25 5. Imunoterapia [0085] Agentes imunoterápicos geralmente baseiam-se no uso de moléculas e células imunitárias efectoras para encontrar e destruir células de cancro. O efector imunitário pode ser, por exemplo, um anticorpo específico para algum marcador na superfície de uma célula tumoral. O anticorpo isoladamente pode servir como um efector na terapêutica ou pode recrutar outras células para destruir as célula cancerosas. O anticorpo pode também ser conjugado com um fármaco ou toxina (quimioterápico, radionuclídeo, cadeia A de rícino, toxina de cólera, toxina de tosse convulsa, etc.) e serve meramente como um agente alvo. Em alternativa, o efector pode ser um linfócito com uma molécula de superfície que interage, directa ou indirectamente, com uma célula tumoral alvo. Várias células efectoras incluem linfócitos T citotóxicos e células NK.

[0086] Está previsto que possam ser utilizadas vacinas para tratar o cancro em combinação com a presente invenção para melhorar a eficácia terapêutica do tratamento. Estas vacinas incluem vacinas de péptidos ou vacinas de células dendríticas. As vacinas de péptidos podem incluir qualquer antigénio tumoral específico que é reconhecido pelos linfócitos T citolíticos. Um especialista na arte sabe que a vacinação com células dendríticas inclui células dendríticas que são pulsadas com um péptido ou antigénio e as células dendríticas pulsadas são administradas ao doente.

[0087] Exemplos de antigénios tumorais específicos que estão a ser usados como vacinas no melanoma incluem, mas não se limitam a, gplOO ou MAGE-3. Estes antigénios estão a ser administrados como vacinas de péptidos e/ou como vacinas de células dendríticas. D. Exemplos [0088] Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar 26 modalidades preferidas da invenção. Os especialistas compreenderão que as técnicas reveladas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção e, como tal, podem ser consideradas como os modos preferidos de execução da mesma. Contudo, à luz da presente divulgação, os peritos deverão compreender que podem ser efectuadas muitas alterações nas modalidades especificas que são reveladas e ainda assim obter um resultado igual ou semelhante, sem afastamento do âmbito da invenção. Os Exemplos 13 a 23 são exemplos comparativos.

Exemplo 1

Inibição do crescimento tumoral por rhLF

[0089] Foi empregue o carcinoma das células escamosas humanas (012) . As células foram injectadas na aba direita de ratinhos "nude" atimicos. Foi administrada rhLF intratumoralmente (49 animais, 7 doses entre 0,05 pg e 125 pg por dose), por via intravenosa (7 animais, 125 pg/dose) ou oralmente (7 animais 20 mg/dose). Os animais de controlo foram tratados apenas com o veiculo; não foi administrada rhLF aos animais de controlo. Foi administrada rhLF duas vezes ao dia, durante cinco dias (grupo intravenoso) ou durante oito dias (todos os outros grupos), começando 11 dias após a inoculação com células tumorais para permitir a formação de tumores estabelecidos.

[0090] A eficácia do tratamento foi avaliada através da medição do tamanho do tumor sólido durante e no final da experiência; os pesos corporais foram também determinados no momento da medição dos tumores. Como pode ser observado na Figura 1 e na Tabela 1, o tratamento com rhLF reduz as taxas de crescimento tumoral relativamente ao controlo em 46% a 80%. De facto, o tratamento oral com 20 mg de rhLF reduziu mais significativamente o crescimento tumoral, em 80% comparativamente ao controlo (p=0, 0073) . 27

Tabela 1 Resumo da inibição do crescimento tumoral por rhLF no modelo tumoral 012 em ratinhos |Inibição jplacebo relativamente ao valor de P |Dia 19* bia 28* Dia 19* bia 28* Intratumoral N=49 128% 14 6% 0, 139 10, 0263** Intravenoso N=7 155% | 65% 0,0666 jo,0233** Oral N=7 17 6% 180% 0,0175** jo,0073*** *após o início do tratamento ** estatisticamente significativa (p<0,05) *** estatisticamente muito significativa (p<0,01) [0091] Os resultados deste estudo revelaram que a rhLF administrada por múltiplas vias inibiu significativamente o crescimento tumoral num modelo de tumor de células escamosas em ratinhos, sendo a administração oral a mais eficaz. Com base nestes resultados, considerou-se que a lactoferrina oral afecta o tumor reforçando a actividade das células imunitárias.

Exemplo 2

Avaliação da rhLF por tipos de tumor [0092] Células tumorais de uma ampla gama de tipos de tumor foram injectadas na aba direita de ratinhos "nude" atímicos. Os animais receberam rhLF, hLF nativo ou LF bovino oralmente. Os animais de controlo foram tratados apenas com o veiculo, não foi administrado qualquer rhLF aos animais de controlo. A rhLF é administrada ou uma ou duas vezes ao dia durante um, cinco, sete ou catorze dias ou durante oito dias a contar aproximadamente onze dias após a inoculação com células tumorais para permitir a formação de tumores estabelecidos ou noutro momento em que tal é geralmente efectuado nos regimes posológicos de referência ou publicados. 28 [0093] A eficácia do tratamento foi avaliada através da medição do tamanho do tumor sólido durante e no final da experiência; os pesos corporais foram também determinados no momento da medição dos tumores. A resposta imunitária foi medida através da determinação da quantidade de citocinas, linfócitos T e células NK em circulação e no intestino.

Exemplo 3

Efeito da administração oral de rhLF e bLF

[0094] Foram administradas oralmente lactoferrina humana recombinante e lactoferrina bovina a ratinhos e foi determinada a produção de IL-18 no intestino delgado.

[0095] Os ratinhos foram tratados diariamente durante três dias com 65 mg/kg/dia de rhLF, 300 mg/kg/dia de rhLF ou 300 mg/kg/dia de bLF. Para controlo, os ratinhos receberam apenas o veiculo farmacêutico. Vinte e quatro horas após a administração da LF ou do controlo durante 3 dias, os animais foram pesados e foram colhidos sangue e soro. O soro foi usado em ensaios ELISA para quantificação de citocinas.

[0096] Igualmente nestes pontos temporais, foram sacrificados animais e o tecido do intestino delgado foi removido para análise posterior. O epitélio do intestino delgado foi homogeneizado usando um tampão de lise constituído por PBS, Nonidet P-40 1%, desoxicolato de sódio 0,5% e dodecil sulfato de sódio 0,1% contendo 10 pg/ml de fluoreto de fenilmetilsulfonil. O homogenado foi centrifugado a 15,000 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante guardado a -80 °C até ser testado quanto aos níveis de IL-18.

[0097] Como pode ser observado na Tabela 2 e na Tabela 3, a administração de rhLF em ambas as doses aumentou significativamente as quantidades de IL-18 tanto no soro como no 29 extracto intestinal. A LF bovina causou um aumento inferior nos níveis de IL-18 intestinal e não aumentou os níveis séricos de IL-18.

Tabela 2. Efeito da rhLF e da bLF nos níveis séricos e intestinais de IL-18 (Extracto intestinal (pg) Soro (pg) : Controlo | 955 141 :300 mg/kg bLF 14.515 134 : 65 mg/kg rhLF j 7.87 9 259 ;300 mg/kg rhLF j 8.350 328

Tabela 3. Estimulação dos níveis séricos e intestinais de IL-18 por rhLF e bLF

Aumento em relação a Blf ! ; - 65mg/kg rhLF 17 5% 0,1490 | 94% 0,0366 -300 mg/kg rhLF | 85% 0,0617 1145% 0,0084

Exemplo 4

Efeito da rhLF oral na actividade NK in vivo [0098] Ratinhos selvagens Balb/c foram tratados oralmente com rhLF ou placebo uma vez ao dia durante 3 dias (ver Tabela 4). 30

Tabela 4. Regime de tratamento | Tratamento* N Dose (mg/kg) jvia (Esquema Grupo 1 (Placebo 6 0 j— j — Grupo 2 (rhLF 7 300 mg/kg/dia (Oral 13 dias [0099] No dia 4, os ratinhos foram sacrificados e os baços foram colhidos. As células NK foram separadas usando um ensaio de separação com esferas magnéticas (MACS anti-NK - DX5) e procedeu-se à sua contagem. As células foram então testadas in vitro quanto à actividade NK contra alvos YAC (cromossomas artificiais de levedura) usando um teste de libertação de lactato desidrogenase (LDH).

[0100] A Tabela 5 mostra que o tratamento oral com rhLF resultou num aumento significativo da actividade NK ex-vivo contra células YAC-alvo (10% @ 30:1 versus 2,8% do grupo de controlo). Não foi observada uma alteração significativa na actividade NK em ratinhos tratados com placebo.

Tabela 5. Actividade NK em ratinhos tratados com rhLF oral

Controlo j 5 5 Baixo jMédio j Alto \ \ \ j 0, 056 jo, 09 jo,407 \ \ | (Placebo (Tratado com rhLF Razão (% de j: E: A \ (citotoxicid $ j% de (Dados em bruto ade (Dados em bruto (citotoxicidade jmistura j control (Final (mistura control (Fin (Aumentou em jde | o \ (de O (al (relação ao | células jcélulas (células células ( (controlo j E: A lE \ (E: A E j 30:1 | 0,2 81 j 0,215 j 2,8 6 jO,358 0,267 j 9,8 (7** ......... V s j1 ( 15:1 jo,176 jo,110 j2,85 jo,214 0,143 | 4 , - 1,3 ................. \ 5 $ : 31

Controlo I2 ! 0, 074 | 0,4 :!0 N ! 0,042 |o jo 7,5:1 |θ,117 |θ,054 |2,21 |θ,131 3,7:1 10, 0 8 6 ] 0, 030 10, 19 |θ,096 * % de citotoxicidade = [(mistura de células efectoras: alvo controlo de células efectoras)] - controlo baixo/[(controlo elevado - controlo baixo)] X 100 ** p< 0,05 (valor de p bicaudal)

Exemplo 5

Efeito da administração oral da rhLF no GM-CSF in vivo [0101] Foram administradas oralmente lactoferrina humana recombinante ou placebo a ratinhos e foi determinada a produção de GM-CSF no intestino delgado.

[0102] Ratinhos (5 animais por grupo) foram tratados diariamente durante três dias com 300 mg/kg/dia de rhLF. Para controlo, os ratinhos receberam apenas o veiculo farmacêutico. Vinte e quatro horas após a administração da LF ou do placebo durante 3 dias, os animais foram sacrificados e foi removido tecido do intestino delgado para análise. O epitélio do intestino delgado foi homogeneizado usando um tampão de lise constituído por PBS, Nonidet P-40 1%, desoxicolato de sódio 0,5% e dodecil sulfato de sódio 0,1% contendo 10 pg/ml de fluoreto de fenilmetilsulfonil. O homogenado foi centrifugado a 15,000 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante guardado a -80 °C até ser testado quanto aos níveis de GM-CSF usando um kit ELISA.

[0103] Como representado na Tabela 6, tratamento com rhLF aumentou a produção de uma citocina chave imunoestimulatória, GM-CSF, no intestino delgado relativamente ao animais tratados com placebo. 32

Tabela 6. Efeito da rhLF nos niveis séricos e intestinais de GM-CSF Média (EPM) em pg Aumento em relação ao placebo Placebo 6, 48 (0,32) - 300 mg/kg rhLF 7,74 (0,19) 19,4% (p<0,01)

Exemplo 6

Combinação de hLF com quimioterapia [0104] Uma linha celular murina de carcinoma escamoso (SCCVII) foi injectada na parte inferior da boca através da pele do pescoço de ratinhos C3H imunocompetentes (Dia 0). Cinco dias após a implantação de células tumorais (Dia 5) foi efectuada uma incisão cutânea no pescoço inferior e a dissecção cirúrgica revelou os tumores estabelecidos. Os tumores foram medidos a três dimensões com calibradores.

[0105] Ratinhos portadores de tumor foram distribuídos aleatoriamente pelo grupo de controlo e por sete grupos de tratamento com rhLF e/ou cisplatina. A rhLF (4 mg; 200 mg/kg) foi administrada uma vez ao dia por intubação durante 8 dias nos dias 5 a 12. A cisplatina foi administrada como uma dose unitária de 5 mg/kg por via intraperitoneal ou no início da terapêutica com rhLF (dia 5), a meio (dia 8) ou no final da mesma (dia 12) . Os animais foram sacrificados no dia 12 após a implantação e as massas de tumor residuais foram medidas e processadas para análise posterior.

Tabela 7. Grupos experimentais ] Descrição N rhLF mg/kg Cisplatina Grupo A (Placebo 5 0 (Placebo) 0 Grupo B (Apenas rhLF 5 200 mg/kg 0 33

Descrição N rhLF mg/kg Cisplatina Grupo C CP Dia 5 5 0 5 mg/kg no dia 5* Grupo D CP Dia 8 5 0 5 mg/kg no dia 8* Grupo E CP Dia 12 4 0 5 mg/kg no dia 12 Grupo F rhLF/CP-5 5 200 mg/kg 5 mg/kg no dia 5* Grupo G rhLF/CP-8 5 200 mg/kg 5 mg/kg no dia 8* Grupo H rhLF/CP-12 5 200 mg/kg 5 mg/kg no dia 12* [0106] Ratinhos tratados com rhLF isoladamente, cisplatina isoladamente ou com ambos os agentes, apresentaram uma inibição de crescimento tumoral (ICT) relativamente aos animais que receberam placebo. A inibição máxima foi observada no grupo que recebeu ambas as terapêuticas (Tabela 7 e Figura 2).

[0107] Em todos os casos, os animais que receberam rhLF + cisplatina apresentaram uma ICT relativamente ao grupo relevante que recebeu cisplatina isoladamente. Quando agrupados para análise, os animais que receberam rhLF + cisplatina apresentaram uma ICT de 77% relativamente aos animais que receberam placebo (P<0, 0001), uma ICT de 66% relativamente a rhLF isoladamente (P<0,01) e uma ICT de 63% relativamente a cisplatina isoladamente (P<0,01) .

[0108] A dosagem de cisplatina imediatamente antes do início do tratamento com rhLF (rhLF + CP-5) ou durante o período de administração da rhLF (rhLF + CP-8) forneceu um benefício aumentativo superior ao da cisplatina administrada após a conclusão da terapêutica com rhLF (rhLF + CP-12). Contudo, apenas o regime abrangente (rhLF + CP-8) forneceu uma melhoria estatisticamente significativa (P<0,01), com uma ICT de 77% em relação à cisplatina isoladamente (CP Dia 8). 34

Tabela 8. Inibição do crescimento tumoral (ICT) por grupo de tratamento

Crescimento (Relativamente ao placebo* Grupo (EPM) jlCT (%) jvalor de p A (placebo) 741 (79) |- j- B (rhLF Isoladamente) 496 (155) 133% jo,0989 C (CP Dia 5) 240 (137) 168% jo,0066 D (CP Dia 8) 693 (146) | 6% jo,3898 E (CP Dia 12) 433 (175) 142% jo,0634 F (rhLF + CP-5) 14 (5) 198% j<0,0001 G (rhLF + CP—8) 159 (48) 17 9% jo,0001 H (rhLF + CP—12) 331 (47) 155% jo,0011 C a E (Todos CP) 457 (96) 138% jo,0564 F a H (Todos rhLF/CP) 168 (40) 177% j<0,0001 * Inibição e valor de p unicaudal relativamente ao grupo placebo ** Inibição e valor de p unicaudal relativamente aos grupos

Cisplatina respectivos

Exemplo 7

Dependência da dose de hLF combinada com quimioterapia [0109] Uma linha celular murina de carcinoma escamoso (SCCVII) foi injectada na parte inferior da boca através da pele do pescoço de ratinhos C3H imunocompetentes (Dia 0), como descrito no Exemplo 6. No Dia 5 após a implantação inicial, os tumores foram medidos para obter os valores de base do estudo, seguiu-se o tratamento com cisplatina (Dia 8, i.p., 5 mg/kg) isoladamente ou com cisplatina mais três doses de rhLF oral (diariamente por intubação durante 7-8 dias nos dias 5 a 11/12). Os animais foram sacrificados no Dia 11/12 e os tumores foram medidos. Verificou-se uma inibição dependente da dose do crescimento tumoral nos 35 animais que receberam rhLF e cisplatina, quando comparados com os animais que receberam apenas cisplatina, conforme representado na Figura 3.

Exemplo 8

Combinação de hLF com docetaxel [0110] Uma linha celular murina de carcinoma escamoso (SCCVII) foi injectada na parte inferior da boca através da pele do pescoço de ratinhos C3H imunocompetentes (Dia 0), como descrito no Exemplo 7. No Dia 5 após a implantação inicial, os tumores foram medidos para obter os valores de base, a que se seguiu o tratamento apenas com placebo oral (uma vez ao dia dos dias 5 a 12; 6 animais), com placebo e docetaxel (bolus i.v. de 31,3 mg/kg de docetaxel no Dia 8; 9 animais) ou com docetaxel mais rhLF oral (200 mg/kg, administrado uma vez ao dia por intubação dos dias 5 a 12; 9 animais) . Os animais foram sacrificados no

Dia 14 e os tumores foram medidos. O docetaxel isoladamente causou uma inibição do crescimento tumoral relativamente ao placebo e a combinação de rhLF e docetaxel induziu ainda mais a inibição do crescimento. A inibição e os valores de p (unicaudal) são apresentados na Tabela 9.

Tabela 9. Inibição do crescimento tumoral (ICT) por grupo de tratamento

Cresciment(Relativamente ao (Relativamente ao o (placebo* (docetaxel Grupo (EPM) jlCT (%) valor de p (ICT (%) valor de p Placebo 5,157 j — \ — — (497) | $ Docetaxel 2,103 15 9% <0, 0001 j — — (209) | \ Docetaxel + 1,288 (75% <0,0001 |39% 0,0175 rhLF (286) | $ 36

Exemplo 9

Combinação de hLF com radioterapia [0111] Uma linha celular murina de carcinoma escamoso (SCCVII) foi injectada na parte inferior da boca através da pele do pescoço de ratinhos C3H imunocompetentes (Dia 0) . Cinco dias após a implantação de células tumorais (Dia 5) foi efectuada uma incisão cutânea no pescoço inferior e a dissecção cirúrgica revelou os tumores estabelecidos. Os tumores foram medidos a três dimensões com calibradores.

[0112] Ratinhos portadores de tumor foram distribuídos aleatoriamente por seis grupos de tratamento com rhLF (200 mg/Kg) e/ou radioterapia, como descrito abaixo. A rhLF (4 mg; 200 mg/Kg) foi administrada uma vez ao dia por intubação durante 8 dias nos dias 5 a 12. A radioterapia foi administrada como uma dose unitária de 2 Gray no início (dia 5) ou durante a terapêutica com rhLF (dia 8). Os animais foram sacrificados no dia 14 após o tratamento e as massas de tumor residuais foram medidas e processadas para análises adicionais posteriores.

Tabela 10. Grupos experimentais | Descrição N rhLF mg/kg1 jRadiação Grupo A jPlacebo 10 0 (Placebo) SNenhuma Grupo B jApenas rhLF 10 200 mg/kg SNenhuma Grupo C |Radiação dia 5 8 0 S2 Gray no dia 5 Grupo D |rhLF/Rad 5 10 200 mg/kg |2 Gray no dia 5 Grupo E ^Radiação dia 8 10 0 |2 Gray no dia 8 Grupo F |rhLF/Rad 8 10 200 mg/kg |2 Gray no dia 8 37 1 rhLF/placebo foram administrados uma vez ao dia por intubação dos dias 5 ao 12.

[0113] Os ratinhos que receberam apenas rhLF, apenas radioterapia ou uma terapêutica de combinação apresentaram uma inibição do crescimento tumoral significativa (ICT) relativamente a ratinhos tratados com placebo. Os ratinhos que receberam tanto rhLF como radiação apresentaram um aumento modesto da ICT em relação à monoterapia com rhLF (28%, P<0,05) ou com radiação (15%, P=0,1207).

Tabela 11. Inibição do crescimento tumoral (ICT) por grupo de tratamento ^Crescimento |Relativamente ao plac Grupo I(EPM) | Inibição1 (valor de A (placebo) 1234 8 (395) \ — B (rhLF isoladamente) 11074 (163) 154% jo,0040 C (radiação dia 5) |827 (105) | 65% jo,0021 D (rhLF/Rad 5) 1750 (125) | 68% jo,0006 E (radiação dia 8) |977 (112) 158% jo,0018 F (rhLF/Rad 8) (797 (119) | 66% jo,0007 C/E (dois grupos radiação) 1911 (78) | 61% j<0,0001 D/F (dois grupos rhLF/Rad) (774 (84) ( 67% !<o,oooi 38 1

Inibição e valor de p unicaudal comparativamente ao grupo placebo [0114] Assim, a lactoferrina estimulou o sistema imunitário. Mais, a lactoferrina em combinação com a cisplatina, o docetaxel e a radiação resultou na inibição do crescimento tumoral.

Exemplo 10

Administração oral de hLF em humanos [0115] Lactoferrina humana recombinante foi administrada oralmente a doentes humanos com vários tipos de cancro metastásico resistente à quimioterapia protocolar, em dois estudos diferentes conduzidos em múltiplos centros em quatro países (Argentina, Brasil, Chile, E.U.A.). A rhLF foi administrada em doses de 1,5 a 9 gramas diariamente em duas tomas em ciclos de 14 cada, com um intervalo de 14 dias.

[0116] A progressão do tamanho do tumor foi monitorizada através de tomografia computorizada (TC) e marcadores tumorais, quando disponíveis. Foram realizadas tomografias computorizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento, que também foram comparadas com uma tomografia prévia conduzida antes da selecção para participação no estudo. Os marcadores tumorais são medidos a cada 4 semanas. Foram colhidas amostras sanguíneas para medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. Foram colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

[0117] Em dezanove doentes avaliáveis (os que tinham uma TC no início do estudo e pelo menos uma TC após o tratamento) , nove doentes (47%) apresentaram doença estável segundo os critérios RECIST no momento da primeira TC após o tratamento. Doentes com uma ampla gama de tipos de tumor apresentaram benefícios em ter recebido a lactoferrina.

[0118] A Tabela 12 mostra a resposta tumoral de cinco doentes individuais com diferentes tipos de tumor. Em todos os casos, a percentagem de crescimento do tamanho do tumor antes do tratamento com rhLF (cuja duração relevante é apresentada entre parênteses) e o crescimento do tumor nos dois períodos que se seguiram, conforme medido por TC, revelou uma diminuição na respectiva taxa de crescimento tumoral ou mesmo uma retracção do tumor. 39

Tabela 12. Resposta tumoral de doentes a receber rhLF oral para o tratamento de cancro metastásico

Doente | Cancro % de crescimento |% de crescimento (% de crescimento n. a \ pré-tratamento | pó s-1ratamento 1 (pós-tratamento 2 (semanas) j(semanas) j(semanas) # 204 ^Mama 40% (8) )θ% (10) |θ% (6,5) # 106 (Melanoma 24% (19) (-18% (11) jTC ainda não s s | efectuada # 104 ( Gástrico 25% (5,5) (10% (10) |- 5% (7) # 102 (Ovário 30% (21) | -5% (10,5) |- 7% (8,5) # 007 (Pulmão 160% (5,5) 113% (7,5) 112% (8,5)

Exemplo 11

Terapêutica de combinação com hLF oral em humanos [0119] A lactoferrina humana recombinante é administrada oralmente a doentes humanos para inibir o crescimento tumoral, quer isoladamente, quer em combinação com regimes anticancro recomendados.

[0120] Resumidamente, a rhLF é administrada usando as doses e o regime óptimos identificados no Exemplo 10 e são empregues os regimes anticancro recomendados para o tipo de tumor seleccionado, como parte da terapêutica de combinação. A via de administração e o regime posológico da terapêutica anticancro adicional são os aprovados pela FDA para essa indicação ou são conforme descrito numa publicação com avaliação interpares.

[0121] A progressão do tamanho do tumor é monitorizada através de TC e marcadores tumorais, quando disponíveis. As tomografias computorizadas são realizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento. Os marcadores tumorais foram determinados a cada 4 semanas, uma vez iniciado o tratamento. São colhidas amostras sanguíneas para 40 medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. São colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL—2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

Exemplo 12

Imunoestimulação após administração de rhLF oral [0122] Ratinhos selvagens Balb/c foram tratados oralmente com rhLF ou placebo uma vez ao dia durante 3 dias. No dia 4, os ratinhos foram sacrificados e os baços foram colhidos. As células NK foram separadas usando um ensaio de separação com esferas magnéticas (MACS anti-NK - DX5) e procedeu-se à sua contagem. As células foram então testadas in vítro quanto à actividade NK contra alvos YAC (cromossomas artificiais de levedura) usando um teste de libertação de lactato desidrogenase (LDH).

[0123] Como revelado na Figura 4, o tratamento com rhLF oral resultou num aumento significativo da actividade NK ex-vivo contra células YAC alvo. Numa razão E:A de 30:1, a administração de rhLF resultou num aumento relativo de 243% em relação aos animais tratados com placebo (a partir de 2,86% a 9,81%; p<0,05).

Exemplo 13

Efeito da administração intravenosa [0124] A lactoferrina recombinante, a lactoferrina bovina e a lactoferrina nativa são administradas por via intravenosa a animais, de preferência ratos, e é determinada a produção de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-gama no plasma, soro e concentrado de células sanguíneas.

[0125] Resumidamente, os ratos são tratados durante catorze 41 dias consecutivos com 0,05 pg a 1000 pg por dose. Para controlo, os ratos recebem apenas o veiculo farmacêutico. Em pontos temporais específicos após a administração da LF ou do controlo durante 0 dias, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 9 dias e 14 dias, os animais são pesados e é colhido sangue e soro. Os níveis de células CD4+, CD8+ e NK são contados a partir do sangue que foi colhido. Plasma, soro e um extracto das células sanguíneas são usados em ensaios ELISA para quantificação de citocinas.

[0126] No 24° dia, os animais são sacrificados e os tecidos são removidos para análise. Os tecidos são homogeneizados usando um tampão de lise constituído por PBS, Nonidet P-40 1%,

desoxicolato de sódio 0,5% e dodecil sulfato de sódio 0,1% contendo 10 pg/ml de fluoreto de fenilmetilsulfonil. O homogenado é centrifugado a 15,000 rpm durante 10 minutos e o sobrenadante guardado a -80 °C até ser testado quanto aos níveis de citocinas IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN- gama.

Exemplo 14

Quimioterapia de combinação de rhLF por via intravenosa com outros agentes [0127] As células tumorais a ser testadas são injectadas na aba direita de ratinhos "nude" atímicos. Os animais recebem rhLF por via intravenosa isoladamente ou em combinação com outros regimes anticancro, como descrito no Exemplo 13. Os animais de controlo são tratados apenas com o veículo, não é administrada qualquer rhLF aos animais de controlo. A rhLF é administrada usando regimes posológicos identificados como sendo óptimos nos ensaios descritos no Exemplo 13. A terapêutica anticancro é administrada usando regimes recomendados ou publicados. A terapêutica começa aproximadamente 11 dias após a inoculação com células tumorais para permitir a formação de tumores estabelecidos ou noutro momento, como é geralmente realizado em regimes recomendados ou publicados. 42 [0128] A eficácia dos tratamentos individuais e de combinação é avaliada através da medição do tamanho do tumor sólido durante e no final da experiência; os pesos corporais são também determinados no momento da medição dos tumores.

Exemplo 15

Administração intravenosa de hLF em humanos [0129] A lactoferrina recombinante é administrada por via intravenosa a doentes para inibir o crescimento tumoral.

[0130] Resumidamente, é administrada rhLF numa dose de 500 mg por dia durante oito dias a doentes com cancro metastásico ou não ressectável. Em alternativa, a rhLF é administrada durante um a oito dias a doentes com cancro metastásico em doses diárias de 0,1, 1, 10, 100 e 1000 mg. A dose é administrada por via intravenosa.

[0131] A progressão do tamanho do tumor é monitorizada através de TC e marcadores tumorais, quando disponíveis. As tomografias computorizadas são realizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento. Os marcadores tumorais são medidos a cada 4 semanas. São colhidas amostras sanguíneas para medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. São colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

Exemplo 16

Terapêutica de combinação com hLF intravenosa [0132] A lactoferrina recombinante é administrada por via intravenosa a doentes para inibir o crescimento tumoral, quer 43 isoladamente, quer em combinação com regimes anticancro recomendados.

[0133] Resumidamente, a rhLF é administrada usando as doses e o regime óptimos identificados no Exemplo 15 e são seguidos os regimes anticancro de referência para o tipo de tumor seleccionado como parte da terapêutica de combinação. A via de administração e o regime posológico da terapêutica anticancro adicional são os aprovados pela FDA para essa indicação ou são conforme descrito numa publicação com avaliação interpares.

[0134] A progressão do tamanho do tumor é monitorizada através de TC e marcadores tumorais, quando disponíveis. As tomografias computorizadas são realizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento. Os marcadores tumorais foram determinados a cada 4 semanas, uma vez iniciado o tratamento. São colhidas amostras sanguíneas para medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. São colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

Exemplo 17

Actividade da rhLF intratumoral [0135] Células 012 humanas de tumor de carcinoma orofaríngeo de células escamosas foram injectadas na aba direita de ratinhos "nude" atímicos. A lactoferrina humana recombinante e os controlos de veículo foram doseados através de injecção intratumoral. Cada animal recebeu concentrações diferentes de rhLF em doses de 50 pL, consistindo em quatro injecções separadas de aproximadamente 12,5 pL da dose, em direcções e ângulos diferentes (aproximadamente S/N/E/O) para garantir que a dose era distribuída uniformemente por todo o tumor (em leque). 44

Tabela 13. Esquema de tratamento de injecções intratumorais de lactoferrina humana recombinante em tumores de carcinoma escamoso de células 012 humanas em ratinhos "nude"

Grupo Regime Dose de rhLF por animal no grupo 0 jl 2 13 14 j 5 Ξ. A Uma vez no dia 1, morte 8 dias 0 j10Ομ 250μ i 5 0 0 μ |250μ9 jn.a. depois (ratinhos nude) !g g jg j* i C Duas vezes ao dia durante 8 dias 0 |25pg 50μρ ;125μ ;250μρ :5 0 0 μ a começar no Dia 11 após a \ ί g j g inoculação, morte no Dia 20 ; (ratinhos nude) [0136] A Tabela 13 mostra o regime seguido por cada grupo experimental e a dose de rhLF por injecção para cada animal por grupo. Neste estudo, a rhLF foi administrada directamente para dentro do tumor. Cada animal foi monitorizado diariamente quanto ao crescimento tumoral através de medições com calibrador externo do tumor saliente.

[0137] Usando este modelo, foi evidente uma redução significativo do crescimento do tumor em ambos os grupos tratados com rhLF relativamente aos animais de controlo. Comparativamente ao tamanho mediano do tumor para as amostras de placebo agrupadas dos grupos A e C, as taxas de crescimento tumoral em animais a receber uma única dose da rhLF (Grupo A) foram reduzidas em 50% no dia 11 após a administração de rhLF (p< 0,05) . As taxas de crescimento tumoral em animais que receberam a dose duas vezes ao dia (Grupo C) foram reduzidas em 56% quando comparadas com o grupo de controlo agrupado (p<0,01) (Ver Figura 5).

Exemplo 18

Estimulação imunitária após rhLF intratumoral [0138] Ratinhos C3H/HeJ normais receberam um implante de um de 45 dois tumores de rato, seguindo a metodologia descrita no Exemplo 17. Os tumores usados eram linhas celulares SCCVII e RIF de rato. Após o estabelecimento dos tumores nos ratinhos, os tumores receberam uma injecção intratumoral diária durante 4 dias de 250 pg ou 500 pg da rhLF por dose ou de controlo de veiculo. Vinte e quatro horas após a última injecção intratumoral, os animais foram sacrificados e o sangue foi analisado quanto a populações de linfócitos. O número de linfócitos em circulação aumentou 34% a 56% em relação aos animais de controlo tratados com placebo (Tabela 14).

Tabela 14. Aumento dos linfócitos na circulação após a administração intratumoral de rhLF CD3 + s CD4 + SCD8 + Número de células - Placebo 2104 j 1800 1785 - Tratamento com rhLF 3291 12621 j 1054 Aumento com rhLF 56% 14 6% j 34%

Exemplo 19

Quimioterapia de combinação de hLF com outros agentes

[0139] As células tumorais a ser testadas são injectadas na aba direita de ratinhos "nude" atímicos. Os animais receberam rhLF por via intratumoral isoladamente ou em combinação com outros regimes anticancro, como descrito no Exemplo 1 ou no Exemplo 7. Os animais de controlo são tratados apenas com o veiculo, não é administrada qualquer rhLF aos animais de controlo. A terapêutica anticancro é administrada usando regimes recomendados ou publicados. A terapêutica começa aproximadamente 11 dias após a inoculação com células tumorais para permitir a formação de tumores estabelecidos ou noutro momento, como é geralmente realizado em regimes recomendados ou publicados. 46 [0140] A eficácia dos tratamentos individuais e de combinação é avaliada através da medição do tamanho do tumor sólido durante e no final da experiência; os pesos corporais foram também determinados no momento da medição dos tumores.

Exemplo 20

Administração intratumoral de hLF

[0141] A lactoferrina recombinante é administrada por via intratumoral a doentes para inibir o crescimento tumoral.

[0142] Resumidamente, rhLF numa dose de 1000 pg por dia durante oito dias a doentes com cancro não ressectável ou metastásico. Em alternativa, a rhLF é administrada durante um a oito dias a doentes com cancro metastásico em doses diárias de 10, 50, 100, 500 e 1000 pg. A dose é administrada por via intratumoral.

[0143] A progressão do tamanho do tumor é monitorizada através de TC e marcadores tumorais, quando disponíveis. As tomografias computorizadas são realizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento. Os marcadores tumorais são medidos a cada 4 semanas. São colhidas amostras sanguíneas para medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. São colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

Exemplo 21

Terapêutica de combinação com hLF intratumoral [0144] A lactoferrina recombinante é administrada por via intratumoral a doentes para inibir o crescimento tumoral, quer 47 isoladamente, quer em combinação com regimes anticancro de referência.

[0145] Resumidamente, a rhLF é administrada usando as doses e o regime óptimos identificados no Exemplo 20 e são usados os regimes anticancro recomendados para o tipo de tumor seleccionado como parte da terapêutica de combinação. A via de administração e o regime posológico da terapêutica anticancro adicional são os aprovados pela FDA para essa indicação ou são conforme descrito numa publicação com avaliação interpares.

[0146] A progressão do tamanho do tumor é monitorizada através de TC e marcadores tumorais, quando disponíveis. As tomografias computorizadas são realizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento. Os marcadores tumorais foram determinados a cada 4 semanas, uma vez iniciado o tratamento. São colhidas amostras sanguíneas para medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. São colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

Exemplo 22

Administração tópica de hLF em humanos [0147] A lactoferrina recombinante numa formulação em gel é administrada a doentes para inibir o crescimento tumoral.

[0148] Resumidamente, gel de rhLF a 1%, 2,5% ou 8,5% é aplicado duas vezes ao dia à pele ou lesão cancerosa subcutânea num doente com metastases. A aplicação de gel de rhLF continua até à progressão tumoral.

[0149] A progressão em tamanho da doença metastásica é monitorizada através de tomografia computorizada e marcadores tumorais, quando disponíveis. As tomografias computorizadas são 48 realizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento. Os marcadores tumorais são medidos a cada 4 semanas. São colhidas amostras sanguíneas para medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. São colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ.

Exemplo 23

Terapêutica de combinação com hLF tópica [0150] A lactoferrina recombinante é administrada aos doentes numa formulação em gel para inibir o crescimento tumoral, quer isoladamente, quer em combinação com regimes anticancro de referência.

[0151] Resumidamente, a rhLF é administrada usando as doses e o regime óptimos identificados no Exemplo 22 e são usados os regimes anticancro recomendados para o tipo de tumor seleccionado, como parte da terapêutica de combinação. A via de administração e o regime posológico da terapêutica anticancro adicional são os aprovados pela FDA para essa indicação ou são conforme descrito numa publicação com avaliação interpares.

[0152] A progressão do tamanho da doença metastásica é monitorizada através de tomografia computorizada e marcadores tumorais, quando disponíveis. As tomografias computorizadas são realizadas no início do estudo e após cada período de 8 semanas, uma vez iniciado o tratamento. Os marcadores tumorais foram determinados a cada 4 semanas, uma vez iniciado o tratamento. São colhidas amostras sanguíneas para medir subclasses de linfócitos em circulação e actividade das células NK. São colhidas amostras de extractos de células sanguíneas, soro e plasma para medir os níveis em circulação de IL-18, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12 e IFN-γ. 49 REFERENCIAS CITADAS [0153] Todas as patentes e publicações mencionadas nas especificações são indicativas dos níveis dos especialistas aos quais a invenção se destina.

Patente americana 5,629,001

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Magi-Galluzzi et ai., Anal. Quant. Cytol. Histol., 20:343-350, 1998 . 3:Dl148-1160, 1998. . 2000, 91 (6) :582-8. 81-8,1998. 589-598, 1991. ., 56(8):915-920, 1998 . 992; 51:343 -9 • 63-2 78, 19 95 • 994; 357 : 13 -9 • 197- 218, 1 99 7 . 2000 , 91 (1 ) : 25-33. 2 (1- 4) : 8 3- 8 . 1999 , 90 (3 ) : 262-7. 2000 , 91 (1 0) :1022-7 998, 443 : 2 85 -91. 997, 00 00 2) : 1 84-90.

Mangray and King, Front Biosci., Masuda C, et ai. Jpn J Câncer Res Mayer, Radiat Oncol Investig. 6:2 Mumby and Walter, Cell Regul., 2: Natoli et ai., Biochem. Pharmacol Ohara, Acta Oncol. 37:471-4,1998. Shau H, et ai., J Leukocyte Biol. Solyanik et ai., Cell Prolif., 28 Spik G, et ai., Adv Exp Med Biol. Stokke et ai., Cell Prolif., 30(5 Tanaka T, et ai. Jpn J Câncer Res Tsuda H, et ai., Biofactors. 2000 Ushida Y, et ai. Jpn J Câncer Res Wang WP, et ai., Jpn J Câncer Res

Yoo YC, et ai., Adv Exp Med Biol Yoo YC, et ai., Jpn J Câncer Res 50 [0154] Embora a presente invenção e as suas vantagens tenham sido descritas detalhadamente, deverá compreender-se que podem ser efectuadas várias modificações, substituições e alterações, sem afastamento do âmbito da invenção, conforme definida pela descrição anexa. Além disso, o âmbito da presente invenção não deverá ser limitado às modalidades particulares do processo, aparelho, fabrico, composição, meios, métodos e passos descritos na especificação. Como um especialista de habilidade comum na arte compreenderá prontamente a partir da divulgação da presente invenção, os processos, aparelhos, fabrico, composições, meios, métodos ou passos, actualmente existentes ou que venham a ser desenvolvidos, que realizem substancialmente a mesma função ou obtenham substancialmente o mesmo resultado que as modalidades correspondentes aqui descritas, podem ser utilizados de acordo com a presente invenção. Deste modo, as descrições anexas pretendem incluir no seu âmbito esses processos, aparelhos, fabrico, composições, meios, métodos ou passos. 51

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Lactoferrina humana para uso num método de redução do crescimento ou de retracção de um neoplasma estabelecido, através da administração oral da lactoferrina humana a um sujeito com um neoplasma estabelecido, numa quantidade suficiente para reduzir o crescimento ou retrair o neoplasma no referido sujeito.
2. A lactoferrina humana da reivindicação 1, dispersa num veiculo farmacologicamente aceitável.
3. A lactoferrina humana da reivindicação 1 ou 2, em que a referida lactoferrina humana é lactoferrina humana recombinante.
4. A lactoferrina humana de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o neoplasma é seleccionado do grupo constituído por melanoma, cancro do pulmão de células não-pequenas, cancro do pulmão de células pequenas, hepatocarcinoma, retinoblastoma, astrocitoma, gliobastoma, leucemia, neuroblastoma, cancro das células escamosas, neoplasmas da cabeça, pescoço, gengivas, língua, mama, pâncreas, próstata, ovário, cérebro, cólon, bexiga, renal, ósseo, testicular, mesotelioma, sarcoma, cervical, gastrointestinal, linfoma e hematopoiético.
5. A lactoferrina humana da reivindicação 4, em que o neoplasma é um neoplasma hematopoiético seleccionado de entre leucemia mielóide aguda, leucemia linfoblástica aguda, síndrome mielodisplásica, leucemia mielomonocítica crónica, leucemia mielomonocítica juvenil, mieloma múltiplo e leucemia linfocítica crónica.
6. A lactoferrina humana de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a referida lactoferrina humana é administrada em combinação com quimioterapia, imunoterapia, cirurgia, bioterapia, radioterapia ou uma combinação destas. 1
7. A lactoferrina humana da reivindicação 6, em que a quimioterapia é um agente à base de platina ou agente baseado em taxanos.
8. A lactoferrina humana da reivindicação 7, em que a quimioterapia é cisplatina ou docetaxal.
9. A lactoferrina humana de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que é administrado um antiácido em conjunção com a referida lactoferrina humana administrada oralmente.
10. Um agente quimioterápico para uso no método definido na reivindicação 1, em combinação administrada oralmente. com lactoferrina humana
11. Um agente antiácido para uso no método definido na reivindicação 1, em combinação com administrada oralmente. lactoferrina humana 2