CN1518453A

CN1518453A - 抗应激反应剂

Info

Publication number: CN1518453A
Application number: CNA028071638A
Authority: CN
Inventors: 村上正裕; 高田繁生; 长户康和; 冈部进
Original assignee: Amato Pharmaceutical Products Ltd
Current assignee: Amato Pharmaceutical Products Ltd
Priority date: 2001-01-24
Filing date: 2002-01-22
Publication date: 2004-08-04
Also published as: WO2002060457A1; KR20030070137A; NO20033324L; JPWO2002060457A1; CA2436000A1; EA200300828A1; US20040116520A1; EP1362594A1; NO20033324D0

Abstract

本发明的目的是提供可以用来抑制应激反应的新的抗应激反应剂。按照本发明，其提供了含有缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物的抗应激反应剂。

Description

抗应激反应剂

技术领域

本发明涉及抗应激反应剂。具体地讲，本发明涉及可以用作药物、特殊保健用食品、保健食品等的抗应激反应剂，其有效用于预防和减轻由于紧张状态导致的精神和身体症状。

背景技术

现代社会处于科技日益进步密集且社会急剧变化的环境中。人们接触多种类型的物理、化学、生理和社会应力。特别是在国际化的社会中，已形成复杂的人际关系，出现了由精神紧张状态引起的多种症状。

已知精神紧张状态对循环系统、免疫系统等造成很大影响。应激反应的科学概念和定义尚存在不明之处，并且在对应激反应的评价中存在很多问题。近几年来，实行体格检查。

例如，有报告称接受应力时，血管紧张素II等升高，由于钠离子的再吸收活体中的钠离子含量过剩，引起血压升高(Osamu Mohara；Metabolism 28(2)；323，1911)。此外，基于这些发现，对用作高血压治疗剂的血管紧张素转化酶抑制剂依那普利和阿拉普利(alacepril)对应激反应引起的高血压进行了研究(The American Journal ofCardiology；68(15)1362(1991)，International Medicine；32(9)691(1993))。

此外，有报告称当大脑觉察到生理应力时，大脑部位的大部分区域释放去甲肾上腺素，引起焦虑和紧张等精神症状(Masatoshi Tanaka，Metabolism Vol.26：122-131，1989)。作为其机理，有报告称下丘脑释放促肾上腺皮质素释放因子(CRF)，且机体对此做出反应，脑垂体增加分泌促肾上腺皮质素(ACTH)，于是由于ACTH的作用由肾上腺皮质释放肾上腺皮质激素，以便启动生物防御机制(Brabdenberger，G等，(1980)Biol.Physiol.Vol.10：239-252)。

另一方面，下丘脑是自主神经系统的中枢，并刺激交感神经分泌去甲肾上腺素。人们假设交感神经存在于肾上腺髓质中，而对其进行的刺激导致肾上腺素分泌到血液中，并通过这些儿茶酚胺的作用，发生了物理变化如心跳加快、血压升高及面部潮红(Dimsdale，JE.，Moss，J.(1980)J.Am.Med.Assoc.Vol.243：340-342)。

当应激反应强或者持续时间长时，该应激反应对整个身体的多种器官产生影响，结果可能发生严重的精神生理紊乱如消化性溃疡、局部缺血性心脏病、脑血管病、高血压和高血脂症。

作为减轻和预防应激反应引起的精神和身体症状的制剂，使用化学合成药物如镇静剂、抗焦虑剂和安眠药。但是，这些药物具有成瘾问题和副作用，因此，为了预防应激反应引起的精神和身体症状每天使用它们是不可取的。作为对轻度精神疲劳的对症治疗，放松和香气疗法是已知的。但是，其作用存在很大的个体差异，因此，需要长期和持续的治疗。

因此，需要开放新的抗应激反应剂，其可以重复使用，没有安全性问题，并显示出减轻和预防应激反应引起的精神和身体症状的作用。

从迄今进行的研究来看，有报告称缩合度为3至20的环和/或直链聚L-乳酸的混合物用作抗肿瘤剂(日本专利申请公开号9-227388和10-130153。但是，没有有关缩合度3至20的环和/或直链聚L-乳酸抗应激反应作用评价的报告。

发明内容

本发明的目的是提供可以用于抑制应激反应的新的抗应激反应剂。更具体地讲，保密法的目的是提供可以重复使用、安全性高并能减轻和预防应激反应引起的精神和身体症状的抗应激反应剂。进一步讲，本发明的另一个目的是提供抑制应激反应的食物和饮料。

为了研究解决上述目标的目的，本发明人给大鼠使用缩合度为3至20的环和/或直链聚L-乳酸的混合物，并研究由水浸束缚应力引起的胃粘膜损伤的发生率。结果发现，通过使用聚乳酸的混合物可以显著抑制胃粘膜损伤的发生。

本发明人还研究了聚乳酸的混合物对接触寒冷应力的糖尿病小鼠模型存活率的作用。结果发现，使用聚乳酸混合物的糖尿病小鼠模型的存活率较高。

此外，本发明人检测了出于应激状态的小鼠中的淋巴细胞数目、肿瘤的形成及厌氧酶活性。结果发现，通过使用聚乳酸混合物，由于应激反应造成的淋巴细胞数目降低和厌氧酶活性升高得到了抑制，并达到了抗肿瘤作用。

在这些发现的基础上完成了本发明。

因此，按照本发明，其提供了一种抗应激反应剂，其含有缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物。

本发明的抗应激反应剂可以用于，例如，预防和改善应激反应引起的医学症状，更具体地讲可以用于预防和改善应激反应引起的免疫功能的退化，预防和改善应激反应引起的溃疡或肿瘤，并改善患者抗应激反应的存活率。

优选，作为聚乳酸的重复单元的乳酸基本上由L-乳酸组成。

优选，缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物是如下反应获得的片断：在惰性气体中通过脱水缩合乳酸，将所得反应溶液中溶解于乙醇和甲醇的片断进行反相柱色谱，并用pH2至3的25至50％重量的乙腈水溶液洗脱，然后用pH2至3的90％重量或90％以上的乙腈水溶液洗脱。

优选，脱水缩合反应在氮气氛下逐步减压和升温下进行。

优选，反相柱色谱通过ODS柱色谱进行。

按照本发明的另一方面，其提供了抑制应激反应的食品和饮料，其中含有上述本发明的抗应激反应剂。

按照本发明的另一方面，其提供了缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物在制备抗应激反应剂或者抗应激反应食品及饮料中的用途。

按照本发明的另一方面，其提供了抑制应激反应的方法，其中包括给哺乳动物如人使用有效量的缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物。

附图简述

附图1显示了制备实施例1制备的聚乳酸的混合物的质谱。

附图2显示了CPL对由水浸束缚应力引起的大鼠胃粘膜损伤进程的影响。

附图3显示了CPL对接触寒冷应力的糖尿病小鼠模型的存活率的作用。

附图4显示了糖尿病小鼠模型的禁食血糖水平的检测结果。

实施本发明的最佳方式

实施本发明的实施方案和方法详述如下。

本发明的抗应激反应剂含有缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物作为活性成分，并可以用于减轻和预防应激反应引起的精神和身体症状。

应激反应的诱因(应激反应原)，其是使用本发明的抗应激反应剂的向靶，没有特定限制。例如，应激反应原包括物理环境因素(温度、噪声、地震等)、社会和文化因素(战争、经济危机、政变等)、个人环境条件(家庭、学校、办公室等)的变化(运动、转学、工作变动、退休等)，以及生物因素如人际关系中的不协调和冲突，以及过度疲劳、外伤、身体病变等。可以理解在目前观察到的很多病生理疾病中，这些应激反应原是疾病发作的直接原因或者在其发作中起重要作用。

应激反应被认为是精神和身体扭曲，其发生于上述应激反应的诱因(例如，身体征兆如疾病，例如，疼痛和发烧，以及紊乱；精神征兆，例如，社会和家庭中人际关系引起的紧张、焦虑和恐惧；以及物理环境因素如噪声、气象变化)施加给生命体时。

生命体对引起任何干扰的刺激显示出特定的反应。同时，不论刺激的类型如何，交感神经-肾上腺髓质系统和脑垂体-肾上腺皮质系统的活性升高，并分泌肾上腺素，于是升高了血压并加快脉搏和呼吸频率。另一方面，肾上腺皮质分泌的称为皮质醇的激素升高，生命体显示出保护或适应反应。该反应称为应激反应，已知该反应通过如下机制发生。当生命体接触物理或精神应激反应原时，其信息到达中枢神经系统并延伸至下丘脑。由其中给出对应激反应的指示。其传递主要通过两个途经进行。其中之一是通过交感神经系统，而大部分交感神经系统本身到达生命体中的多种器官，由外周神经释放去甲肾上腺素以表现出作用。其中一小部分到达肾上腺髓质，刺激髓质分泌肾上腺素。通过另一个应激信息传递途经，下丘脑分泌刺激脑垂体分泌ACTH激素的激素(CRH)，导致脑垂体分泌ACTH。通过血液ACTH转运至肾上腺皮质中，刺激肾上腺皮质促进皮质醇激素的分泌。

应激反应在生命体的保护反应中起重要作用。假定在该反应中分泌了太多的皮质醇和肾上腺素，并因此对很多器官产生有害作用，导致生命体的体内平衡无法维持，引起应激疾病。即，过量的皮质醇破坏胃和十二指肠粘膜，引起胃十二指肠溃疡并抑制免疫功能。因此，对感染的抵抗力越来越低，而且容易发生癌症。过量的肾上腺素使高血压和循环系统疾病易于发生。

较不使用该制剂的情况而言，当给对象使用本发明的抗应激反应剂时，生理指数如免疫功能的退化的变化(其是针对施加应力的反应)小。因此，可以理解本发明的抗应激反应剂具有降低对象患者的应激反应的作用，并可以预防患者每天接触的各种应激引起的医学症状的发作，并可以减轻和缓解这些症状。

应激状态引起的医学症状包括免疫功能降低、溃疡或肿瘤的发生、患者的存活率的降低。

应激状态引起的特定医学症状，例如，循环系统疾病如动脉硬化、局部缺血性心脏病(心绞痛、心肌梗塞)、特发性高血压、心脏神经机能病和心律异常；呼吸系统疾病如支气管哮喘、换气过度综合征和神经性咳嗽；消化系统疾病如消化性溃疡、溃疡性结肠炎、应激性肠综合征、神经性食欲缺乏、神经性呕吐、胃部膨胀和吞气症；内分泌代谢系统疾病如肥胖症、糖尿病、强迫性饮水症和巴塞多氏病；神经系统疾病如偏头痛、肌肉萎缩性头痛和自主性张力障碍；泌尿系统疾病如尿床症、阳痿和神经原性膀胱障碍；骨肌肉系统疾病如慢性关节风湿病、系统性肌痛和脊柱痛；皮肤系统疾病如神经性皮炎、斑秃、多汗和湿疹；耳鼻喉科疾病如迷路综合征、咽喉外来物感觉、听力紊乱、耳鸣、晕车、及失音和结巴；眼科疾病如原发性青光眼、眼疲劳、睑痉挛和眼癔症；妇产科疾病如痛经、闭经、月经病、功能障碍性子宫流血、更年期紊乱、交媾困难和不育症；儿科病如自立循环紊乱、复发性脐绞痛、神经性发烧和夜惊；术前和术后症状如肠粘连、胃颠倒症、外科手术癖(polysurgery)及整形手术后神经坏死；口腔科疾病如猝发性舌痛、特定的口腔炎、口臭、流涎异常、咬肌肌肉牙咬合(masseter muscle check bite)和假牙神经坏死；神经坏死；抑郁；及肿瘤发生。

本发明的抗应激反应剂具有预防作用，即在接触应力前摄入该制剂使人很难处于紧张状态，即使该人处于紧张状态，也容易预防医学症状的发生。因此，优选以保健品或药品的形式每天使用本发明的抗应激反应剂。

在本发明的抗应激反应剂和抑制应激反应的食品和饮料中，缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物用作活性组分。

用于本发明的术语“聚乳酸的混合物”指以任何比例存在的缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物。就是说，术语“混合物”不仅指缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物，还用来指包括环状和直链聚乳酸的混合物的概念。如本说明书下文中所述，通过脱水，然后按照适当的方法进行纯化，通过缩合乳酸可以获得“聚乳酸的混合物”。虽然为了方便起见，在本发明中使用术语“聚乳酸的混合物”，但是该术语还包括由单一组分，例如，具有单一缩合度的环聚乳酸或者具有单一缩合度的直链聚乳酸，组成的聚乳酸。

术语“缩合度”用来指聚乳酸中重复单元乳酸的数目。例如，假设环聚乳酸具有如下结构式，其中n表示缩合度(n＝3至20)。

当本说明书中简要地述及“乳酸”时，该乳酸包括L-乳酸、D-乳酸或者含有任何比例的这些类型的乳酸的混合物。在本发明中，优选乳酸基本上由L-乳酸组成。本文中使用的术语“基本上”指在聚乳酸混合物中L-乳酸单元的比例(L-乳酸单元数目/L-乳酸单元数目+D-乳酸单元数目×100)是，例如，不小于70％，优选不小于80％，更优选不小于85％，进一步更优选不小于90％，并特别优选不小于95％。聚乳酸的混合物中L-乳酸单元的比例依赖于用作起始物的乳酸中存在的L-乳酸与D-乳酸的比例。

制备缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物的方法没有特别限制，例如，通过描述于日本专利申请公开号9-227388和10-130153或者日本专利申请号11-39894(本文中引用的所有出版物以其整体引入本文作为参考)中的制备方法，可以制备聚乳酸的混合物。

更具体地讲，例如，缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物可以通过下面的方法A获得。

方法A：

首先，在惰性气体中乳酸(优选乳酸基本上由L-乳酸组成)通过脱水缩合。惰性气体的实例包括氮气和氩气，并优选氮气。

脱水和缩合反应在110℃至210℃，优选130℃至190℃温度下在常压至约1mmHg的减压下进行，并特别优选该反应在逐步减压下和逐步升温下进行。可以适当地确定反应时间。例如，该反应可以进行1至20小时。当进行逐步减压和逐步升温时，该反应通过将反应时间分为两个或多个部分反应阶段进行，并再决定每个反应阶段的压力和温度。当进行逐步减压时，例如，压力可以从常压降低至150mmHg，然后降低至3mmHg。当进行逐步升温时，例如，温度可以由145℃升至155℃，然后至185℃。具体地讲，该反应可以通过联合使用以下这些反应调节进行，例如，145℃、常压，3小时；145℃、150mmHg、3小时；155℃、3mmHg、3小时；及185℃、3mmHg、1.5小时。

接着，将乙醇和甲醇加入到脱水和缩合反应得到的反应混合物中，并将此混合物过滤。将所得滤液干燥为溶解于乙醇和甲醇的馏分。术语“溶解于乙醇和甲醇的馏分”在本说明书中指溶解于乙醇和甲醇的混合溶液中的馏分。为了得到溶解于乙醇和甲醇的馏分，将脱水和缩合反应获得的反应混合物与乙醇和甲醇混合，其中乙醇和甲醇的比例可以适当地确定。例如，该比例是乙醇∶甲醇＝1∶9。向反应混合物中加入乙醇和甲醇的顺序、方法等不受限制，并可以适当选择。例如，可以向脱水和缩合反应所得反应混合物中先加入乙醇，然后再向其中加入甲醇。

将如此获得的溶解于乙醇和甲醇的馏分进行反相柱色谱，特别是使用十八烷基硅烷(ODS)柱的色谱。首先，除去用pH2至3的25至50重量％乙腈水溶液洗脱的馏分，然后收集用pH2至3的的90重量％或90重量％以上乙腈水溶液，优选99重量％或99重量％以上乙腈水溶液洗脱的馏分，以便获得缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物。

如此获得的环状和/或直链聚乳酸的混合物用碱性物质如氢氧化钠中和，然后减压下干燥，然后再按照标准技术，可以将该混合物配制为如下的形式。

用于本发明的缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物的制备方法的其它实例，包括日本专利申请号11-26571 5描述的方法(下文中称为方法B)，或者描述于日本专利申请号11-265732中的方法(下文中称为方法C)(本文中引用的所有出版物以其整体引入作为参考)。方法B和C具体描述如下。

方法B：

方法B是制备环乳酸低聚物的方法，其包括在RYLi表示的锂化合物[其中R表示脂烃基或芳基，Y表示氧原子或硫原子]存在下聚合乳酸。在进行聚合反应的情况下，锂化合物(RYLi)的量的比例为1-0.1摩尔，优选0.2-0.3摩尔每摩尔乳酸。反应温度为-100℃至0℃，优选-78至-50℃。反应优选起始于温度-78℃至-50℃，再逐步升温至室温。该反应优选在反应溶剂的存在下进行。作为反应溶剂，例如，可以使用环醚如四氢呋喃、乙醚和二甲氧基乙烷。反应气氛可以是惰性气体如氮气和氩气。该反应压力没有限制，并优选常压。

如上所得乳酸低聚物的组分(即环乳酸低聚物和链乳酸低聚物的混合比例)随反应助剂锂化合物而变动。当含1至3个碳原子的烷基醇的锂化合物(ROLi)(其中R表示含1至3个碳原子的烷基)用作锂化合物时，获得环乳酸低聚物和链低聚物的混合物(环乳酸低聚物的比例：80至85重量％)。当含4个和4个以上碳原子的烷基醇如叔丁醇的锂化合物，和噻吩化合物的锂化合物用作锂化合物时，基本上只选择性地得到环乳酸低聚物。

方法C：

该方法包括：

(i)第一加热步骤，包括在350至400mmHg压力条件下和温度120至140℃下加入乳酸，以进行脱水和缩合，蒸馏掉并除去唯一的副产物水，但不要蒸馏出乳酸；

(ii)通过脱水缩合合成产物的第二加热步骤，该产物中含有链乳酸低聚物作为主要组分，该步骤包括第一加热步骤完成后，将反应产物加热至150至160℃，同时将反应压力降低至15至20mmHg，减压速度为0.5至1mmHg/分钟，其中蒸馏掉并除去唯一的副产物水，同时避免蒸馏乳酸；此后，将反应压力降低至15至20mmHg，在同样的压力条件和反应温度150至160℃下维持该反应；

(iii)合成环低聚物的第三加热步骤，包括第二加热步骤完成后，在0.1至3mmHg压力条件和150至160℃下加热，环合链乳酸低聚物。

在此方法中，首先，在第一加热步骤中，乳酸在减压下加热进行脱水和缩合反应。在此情况下，反应时间为3至12小时，优选5至6小时。为了让此反应在第一加热步骤中顺利进行，蒸馏掉乳酸脱水缩合产生的副产物水。此时，进行副产物水的蒸馏，而不蒸馏掉乳酸的两个分子脱水缩合的产物二乳酸交酯。为了达到此目的，反应压力保持在减压下，优选300至500mmHg，更优选350至400mmHg。在此压力条件下，加热在100至140℃，优选130至140℃温度范围下进行。第一加热步骤中的反应产物主要包括3至23个分子的乳酸脱水缩合产物作为主要组分。

在上述第一加热步骤完成后，在第二加热步骤中，为了得到平均聚合度升高的低聚物，加热在比上述第一加热步骤的反应温度高的温度下进行，优选145至180℃，更优选150至160℃，同时压力降低至10至50mmHg，优选15至20mmHg，以便脱水和缩合反应继续进行。

正如在上述第一加热步骤中的反应，该反应进行的条件下副产物水被蒸馏掉，而二乳酸交酯没有被蒸馏掉，保证该反应顺利进行。反应压力降低至上述范围的速度(减压速度)一般需要维持在0.25至5mmHg/分钟，优选0.5至1mmHg/分钟，以避免蒸馏掉二乳酸交酯，并提高反应效率。不优选减压速度低于上述范围，这是因为这样增加了减压至上述范围所需要的时间。另一方面，也不优选减压速度高于上述范围，这是因为这样会引起二乳酸交酯与副产物水一起蒸馏掉。

该反应后，将压力降低至某个压力水平，在该反应压力下继续反应。此情况下加热时间为3至12小时，优选5至6小时。

通过上述第二加热步骤中的反应，获得平均聚合度为3至30，优选3至23的乳酸低聚物。在此情况下该低聚物中环低聚物的比例一般为约70至80重量％。

在第三加热步骤中，上述第二加热步骤完成后，反应压力维持在0.25至5mmHg，优选0.5至1mmHg，并在145至180℃，优选150至160℃下继续反应。反应时间为3至12小时，优选5至6小时。此情况下产生的副产物水也被蒸馏掉。在此情况下，优选避免蒸馏掉二乳酸交酯。但是，由于反应产物几乎不含二乳酸交酯，不需要特别降低减压速度。

通过上述第三加热步骤中的反应，获得平均聚合度为3至30，优选3至23的乳酸低聚物，且环低聚物的比例为90重量％或90重量％以上，优选99重量％或99重量％以上。

上述方法A、B和C只是制备用于本发明的聚乳酸混合物的方法的一些特定实例。通过其它方法制备的聚乳酸混合物也可以用于本发明。

例如，通过使用试验动物并通过水浸束缚诱导法引起的胃粘膜损伤，可以证实本发明抗应激反应剂的作用。具体地讲，将试验动物(例如，大鼠)置于应激反应笼中，在22℃至23℃范围内在一个容器中浸至剑突胸骨的高度，保持10小时，以施加应激刺激。在该应激刺激前使用药物。然后，给试验动物在乙醚麻醉下施行剖腹手术，切除胃，结扎胃的贲门，接着由十二指肠注射2％福尔马林溶液到胃，以将其固定。也将胃粘膜浸在此溶液中进行固定。接着，切开较大的胃弯以检测胃粘膜损伤的长度。胃粘膜损伤的长度比对照组的小，这证明了本发明抗应激反应剂的作用。

本发明的抗应激反应剂的作用还可以通过检测接受空间限制约束应激刺激的试验动物中淋巴细胞计数的变化来证实。具体地讲，将试验动物(例如，小鼠)饲养在丙烯酸聚合物箱中并接受含有抗应激反应剂的固体饮食。开始接受该固体饮食一周后，将小鼠置于薄圆筒中一段时间，让其接受空间限制约束应激刺激4周(4次)。完成此约束后，立即在乙醚麻醉下由尾静脉采血，并在光学显微镜下计数淋巴细胞数目。当通过抑制应激反应淋巴细胞计数降低时，可以证实本发明抗应激反应剂的作用。

如果需要，除了上述基本组分外，可以通过任选地选择并使用不损害本发明作用的用于药物制剂、准药物等中的组分或添加剂，来制备本发明的抗应激反应剂。本发明的抗应激反应剂可以用作单一药物，并还可以含于和用于药物、准药物等中。

本发明的抗应激反应剂的剂型不受特别限制，可以从剂型中选择适于此目的的任何形式，进行口服或非肠道给药。

适于口服给药的剂型的实例包括片剂、胶囊、散剂、饮料、颗粒剂、丸剂、溶液剂、乳液、混悬剂、咀嚼片剂等。适于非肠道给药的剂型的实例包括但不限于注射剂(如皮下、肌肉内或静脉内注射剂等)、外用制剂、滴剂、吸入剂、喷雾剂、滴鼻剂、滴眼剂。

适于口服给药的液体制剂如溶液剂、乳液或糖浆，可以用如下组分制备：水；糖如蔗糖、山梨糖醇或者果糖；二醇如聚乙二醇或丙二醇；油如芝麻油、橄榄油或豆油；防腐剂如对羟基苯甲酸酯；以及较味剂如草莓香料和薄荷脑。为了制备固体制剂如胶囊、片剂、散剂或颗粒剂，可以使用赋形剂如乳糖、葡萄糖、蔗糖和甘露糖醇；崩解剂如淀粉或藻酸钠；润滑剂如硬脂酸镁或滑石；粘合剂如聚乙烯醇、羟丙基纤维素或明胶；表面活性剂如脂肪酸酯；以及增塑剂如甘油等。

适于非肠道给药的注射剂或滴剂，优选含有溶解于或悬浮于灭菌的、与受者血液等渗的、含水介质中的上述物质作为活性组分。例如，对于注射剂，可以用由盐水溶液、葡萄糖溶液或者盐水溶液和葡萄糖溶液的混合物组成的含水介质制备溶液。对于肠道使用的制剂，其可以用载体如可可脂、氢化脂类或者氢化羧酸来制备，并可以为栓剂形式。为了制备喷雾剂，作为活性组分的上述物质可以分散为微粒，可以使用不刺激受者口腔和呼吸道粘膜的并有利于该活性组分吸收的载体。载体的特定实例包括乳糖、甘油等。气雾剂或干粉等形式的制剂，可以根据活性组分和所用载体的性质来制备。可以向非肠道给药的制剂中，加入一种或两种或多种选自二醇、油、香料、抗菌剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、表面活性剂、注射剂等的辅剂。

本发明的抗应激反应剂的剂量和给药频率根据多种因素适当确定，如给药目的，剂型，条件如患者的年龄、体重或性别。一般来说，每天活性物质的剂量是1至10000mg/kg，优选10至2000mg/kg，并更优选10至200mg/kg。优选该制剂的上述剂量分别使用，每天1至4次。

本发明的抗应激反应剂的给药时间没有特别的限制。预计会接触应激刺激或者在应激刺激接触时，使用该制剂，可以预防或减轻该应激反应。有规律地使用该制剂，也可以预防或减轻应激反应。

本发明还涉及抑制应激反应的食品和饮料，其中含有缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物。因此，用于本发明的缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物不仅以上述单一制剂的形式使用，还可以与食品和饮料混合并使用。

本发明的抑制应激反应的食品和饮料的形式没有特别限制，只要其中含有的聚乳酸的混合物不分解即可。

本发明的抑制应激反应的食品和饮料产品的特定实例包括保健品或补品，包括饮料，如一般称为软饮料、饮品、保健品、特殊补品、功能性食品、功能活性食品、营养强化食品、营养强化剂、食物、食物添加剂等。

食品和饮料的特定实例包括糖果，如口香糖、巧克力、糖果、甜味片、果冻、糕点、饼干和酸奶；冷冻餐后甜点，如冰淇淋和冰冻果子露；饮料，如茶、软饮料(包括果汁、咖啡、可可茶等)，营养强化饮品和美容饮品；以及所有其它食品和饮料，如面包、火腿、汤、果酱、意大利面条及冷冻食品。或者，用于本发明的聚乳酸的混合物还可以加入到调味品、食品添加剂等中使用。通过使用本发明的食品和饮料，可以提供安全的食品和饮料，其可以发挥抑制应激反应作用并基本上没有毒副作用。

通过将聚乳酸的混合物直接混合和分散于用于食品的常规原料中，再通过已知方法将该混合物加工为所需的形式，可以制备本发明的抑制应激反应的食品和饮料。

本发明的抑制应激反应的食品和饮料包括了各种形式的食品和饮料，而其形式没有特别的限制。就是说，通过将本发明的抗应激反应剂混合于上述多种食品和饮料、或者多种营养组合物(如多种口服和肠内营养制品或饮料)中，可以提供该食品和饮料。除了缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物外，此类食品和饮料的组分可以包括蛋白质、脂类、碳水化合物、维生素和/或矿物质。食品和饮料的形式没有特别限制，并可以是任何形式，如固体、粉末、液体、凝胶和浆液形式，只要该形式易于摄入即可。

在该食品和饮料中聚乳酸的混合物的含量没有特别限制，一般为0.1至20重量％，更优选约0.1至10重量％。

聚乳酸的混合物优选以达到本发明目的的起抑制应激反应作用的量含于食品和饮料中。每份将被摄入的食品或饮料优选含约0.1g至10g，更优选约0.5g至3g的聚乳酸的混合物。

作为本申请优先权基础的日本专利申请号2001-16145的说明书的内容，作为本说明书公开内容的一部分，引入本文中作为参考。

在下列实施例中进一步描述本发明，但是本发明的范围绝不限于这些实施例。

实施例

制备实施例1：聚乳酸的混合物(下文中称为CPL)的制备

将500mL的L-乳酸(其中也混合有D-乳酸)置于位于加热套中的独立的烧瓶中。搅拌的同时，通入300ml/分钟的氮气。通过加温下降型连接管，将蓄积的水引入装备有回流冷凝器的烧瓶中，同时在145℃下加热3小时。接着，压力降低至150mmHg且在相同温度下加热3小时后，将此混合物在3mmHg压力下在155℃下加热3小时，然后在3mmHg压力下在185℃下加热1.5小时，得到聚乳酸作为反应产物。

将所得聚乳酸保持在100℃，并分别向其中加入100ml的乙醇和400ml的甲醇，然后让此混合物冷却。将此混合物加入到500ml的甲醇中，并将此混合物充分搅拌，并放置。然后，将此混合物过滤纯化。滤液进行真空干燥，然后溶解于乙腈中，共得到200ml(贮存溶液)。

将该贮存溶液加样到事先平衡的反相ODS柱(TSK gel ODS-80 TM)上，并用各含0.01M盐酸的30％、50％和100％乙腈(pH2.0)分级洗脱，得到聚乳酸(缩合度为3至20)，其形式为乙腈100％洗脱馏分。所得物质的质谱见图1。在图1中由规则碎片离子峰清楚可见，所得聚乳酸的混合物主要含有环状缩合物，其中仍含有少量的链状缩合物。

试验实施例：大鼠模型中CPL对由水浸束缚应激刺激引起的胃粘膜损伤的作用

(材料和方法)

试验中使用6周龄的雄性Donryu系大鼠(日本SLC，试验时体重180至200g)。

将CPL溶解于加温至40℃的甘油中，然后加入丙二醇将体积调整至100mg/ml。此后，用蒸馏水稀释此溶液得到50mg/kg的剂量。该药以1ml/200g体重的比例每天口服给药一次，给药10天。在对照组中，只口服相同剂量的溶剂。

水浸束缚应激刺激诱发的胃粘膜损伤制备如下。开始试验前，大鼠禁食18小时，开始试验前2小时让大鼠自由地饮水，接着停止水的摄入。将大鼠置于Toudai Yakusa型应激刺激笼(Natsume SeisakusyoCO.，LTD)中，并在22℃至23℃范围内在一个容器中浸至剑突胸骨的高度，保持10小时，以施加应激刺激。在施加应激刺激前30分钟再次使用该药物。

通过如下步骤检测胃粘膜损伤的区域。给试验动物在乙醚麻醉下施行剖腹手术，切除胃。结扎胃的贲门，接着由十二指肠注射2％福尔马林溶液到胃，以将其固定10分钟。也将胃粘膜浸在此溶液中固定10分钟。接着，切开较大的胃弯以用双面显微镜检测胃粘膜损伤的长度(mm)。

结果以平均值±标准误差(平均值±S.E)(N＝10至11)。通过使用学生t检验计算差异的统计学显著性，P＜0.05被认为具有显著性。

(结果)

检测的结果见下表1和图2。

表1、胃粘膜损伤(mm)

对照组 CPL(50mg/kg)

1 20.0 8.0

2 22.0 19.0

3 20.0 6.0

4 19.0 16.0

5 15.0 18.0

6 16.0 15.0

7 12.0 10.0

8 12.0 16.0

9 15.0 10.0

10 28.0 15.0

11 11.0

平均值 17.9 13.1

标准偏差 1.6 1.3

如表1和图2所示，应激刺激诱发的损伤的长度之和的平均值为17.9±1.6mm。相反，10天反复使用CPL期间，水浸束缚应激刺激引起的胃粘膜损伤的发生率受到显著抑制，损伤长度之和的平均值为13.1±1.3mm。

试验实施例2：CPL对接受冷应激刺激的糖尿病小鼠模型存活率的作用

(方法)

特定的固体食物(1％CPL饲料)，其于标准固体食物CE2具有相同的营养含量并含有1％CPL，由CLEA JAPAN INC制备。

患有II型糖尿病的6周龄的雌性小鼠(C57-db/db)购自CLEAJAPAN INC。购买后，立即将小鼠分为两组，CE2组用标准固体食物CE2喂养，而CPL组用特定食物(1％CPL食物)喂养。对于饮水，自由饮用自来水。由CLEA JAPAN INC.制备的供试验动物用的热干燥的地板材料，“Clean Chip”，置于地板上，并每天更换新的。

检测血糖的前一天，18:00时不喂食，检测的当天在08:30至09:30之间采集血样。采血后，向0.01ml血液中加入0.12ml的5％TCA，搅拌此混合物并以10000rpm离心5分钟。所得上清夜用作样本。通过用邻甲苯胺方法检测葡萄糖来检测血糖。

使用ESCO，Ltd.(Densi Kagaku K.K.)制造的系统量热计作为比色计检测释放的热量。在09:00将小鼠置于系统量热计中，并在第二天17:00取出。在卡路里检测中让小鼠自由地摄取食物和水。

(结果)

CPL对接受冷应激刺激的糖尿病小鼠模型存活率的作用见图3。在CE2组中，通过在开始饲养动物第91天进行的31小时的卡路里检测，由于接触寒冷6只小鼠中有4只死亡。剩下了2只小鼠分别死于开始饲养动物后第181天和第254天。在CPL组中，通过在开始饲养动物第82天进行的31小时的卡路里检测，由于接触寒冷6只小鼠中有1只死亡。在开始饲养动物后第242天有1只死亡，而其余4只动物存活。

图4显示了禁食血糖的检测结果。在开始饲养后第310天，CPL组的4只存活动物的平均禁食血糖为210mg/dl。在开始饲养动物后第432天平均禁食血糖为170mg/dl。

表2显示了CPL组的4只存活动物的禁食血糖。在开始饲养后第472天4只动物中有3只的禁食血糖比开始饲养后第78天的禁食血糖低很多。具体地讲，db/db(4)和(6)的禁食血糖显示出正常值。喂食后没有检测出这2只动物有血糖尿。

表2、CPL对禁食血糖的长期作用

动物饲养时间(天)

78 148 432 472

db/db(1) 371 277 209 162

db/db(4) 434 340 176 99

db/db(5) 362 389 221 354

db/db(6) 202 168 84 91

表3显示了CPL对散热的作用。在开始饲养后第140天CPL组的平均散热量为32.0kJ/天，其是db/-组的77％。开始饲养后第480天平均散热量为41.5kJ/天，等于开始饲养后第140天db/-组的数值。

表3、CPL对散热量的作用(放热)

第140天第480天

db/-， CE2(n＝4) 41.3±4.0

db/db， CE2(n＝6) 22.5±7.7

db/db， CPL(n＝6) 32.0±4.8 41.5±10.2(n＝4)

如上所述，开始食用不含CPL的标准食物的db/db小鼠的存活期短，在出生后约10约内所有6只动物都死亡。在用含1％CPL的食物喂养的组别中，6只中有4只存活。存活的4只小鼠中有2只的禁食血糖在正常范围内，且没有检测出尿糖。即，II型糖尿病被治愈。4只小鼠中有1只的高血糖得以改善至几乎正常的数值，且只检测到非常低数值的尿糖。

试验实施例3、CPL对接受空间限制约束应激刺激的小鼠的淋巴细胞计数变化的作用

(方法)

在聚丙烯酸笼中饲养四周龄雄性CBA/JNCr小鼠。

将小鼠分为自由接受标准固体食物CE2(得自CLEA JAPAN INC.)的对照组以及自由接受在上述标准固体食物中含0.1％(重量)聚乳酸混合物的标准固体食物CE2(由CLEA JAPAN INC.制备)。开始喂食CPL后，将小鼠每周置于薄壁圆筒(直径2.7cm，长度9.5cm)19小时(17:00至次日早9:00)，空间限制约束应激刺激进行4周(4次)。约束完成后，立即在乙醚麻醉下由尾部静脉采集0.005ml血样，并在光学显微镜下计数淋巴细胞数目。

(结果)

淋巴细胞计数的结果见表4。如表4所述，到空间限制约束应激刺激开始后第3周，对照组的淋巴细胞计数线性降低至该试验开始前数值的30％。在第4周，数值没有显示出变化。在CPL组中，第一次空间限制约束应激刺激试验后类似于对照组，观察到淋巴细胞的降低。此后，重复空间限制约束应激刺激试验，但是淋巴细胞维持在几乎可比较的计数。

表4、CPL组与对照组由空间限制约束应激刺激引起的淋巴细胞计数变化的比较

淋巴细胞计数(×10⁴/mm³)

试验时间开始 1周 2周 3周 4周

对照组 33.6±10.7^a) 26.5±4.3 17.7±7.1^b) 10.8±2.0^c) 12.1±4.9^d)

CPL组 29.3±8.5 22.0±4.4 23.9±6.6 25.5±5.8 24.6±4.7

a)平均值±标准偏差

通过t检验与对照组试验开始时比较的显著性差异

b)p＜0.05

c)p＜0.001

d)p＜0.01

试验实施例4：应激刺激下CPL的瘤形成抑制作用

用于试验实施例3的小鼠为发生遗传性小泡上皮增生种系的小鼠。按照迄今的研究，肿瘤组织依赖厌氧糖原酵解获取能量。认识到CPL是具有通过抑制此糖原酵解而抑制上述瘤形成作用的物质(第56届日本癌症协会年会论文集，第605页；日本癌症治疗协会杂质32(5)：165；第57届日本癌症协会年会论文集，第646页；日本癌症治疗协会杂质33(3)：222)。因此，将小鼠保持在与试验实施例3相同的条件下，并研究在此应激刺激下抑制瘤形成的作用。

作为试验组，让对照组(应激刺激组)自由获取标准固体食物CE2(得自CLEA JAPAN INC.)，而应激刺激CPL组自由获取在上述标准固体食物中含0.1％(重量)CPL的标准固体食物CE2(由CLEA JAPAN INC.制备)。给上述组施加类似于试验实施例1的空间限制约束应激刺激。此外，在没有应激刺激条件下的接受CE2的组(CE2组)和在没有应激刺激条件下接受含CPL的CE2的组(CPL组)作为对照组。

将上述4组维持到第30周，在第20周和第30周在乙醚麻醉下施行安乐死，切除肺。制备薄的组织切片，用光学显微镜观察肺泡上皮增生的比例。结果见表5和6。表5显示了CPL给药开始后第20周时肺部肿瘤区域的比较。包括在每组6只动物(每只动物5至8个位点)的组织病理学薄切片中的肿瘤区域观察的结果以百分率给出。表6显示了CPL给药开始后第30周时肺部肿瘤区域的比较。包括在每组6只动物(每只动物5至8个位点)的组织病理学薄切片中的肿瘤区域观察的结果以百分率给出。

表5、CPL给药开始后第20周时肺部肿瘤区域的比较

肺组织病理学薄切片中肺泡上皮增生的区域(％)

10％和更低 10-30％ 30-50％ 50-80％ 80％或更高

CE2组 36.1 25.0 33.3 2.8 2.8

CPL组 51.4 29.7 16.2 2.7 0.0

应激刺激组 21.1 26.3 13.2 23.7 13.2

应激刺激CPL组 44.4 30.6 16.7 8.3 0.0

表6、CPL给药开始后第30周时肺部肿瘤区域的比较

肺组织病理学薄切片中肺泡上皮增生的区域(％)

10％和更低 10-30％ 30-50％ 50-80％ 80％或更高

CE2组 42.4 12.1 27.3 12.1 6.1

CPL组 69.2 15.3 11.5 3.8 0.0

应激刺激组 25.7 2.9 11.4 34.3 25.7

应激刺激CPL组 41.2 17.6 14.7 11.8 11.8

由表5结果，可以理解用CE2喂养的小鼠中，在应激条件下肿瘤区域扩大。但是，用CPL喂养的小鼠在应激刺激存在和不存在下肿瘤区域之间没有差别。用CE2喂养的情况中，应激刺激导致显示50％以上肿瘤区域的动物比例由5.4％增加至36.9％，但是在CPL喂养的情况中，该比例仅增加至8.3％。

由表6结果，可以理解用CE2喂养30周的小鼠中，显示50％肿瘤区域的动物比例为18.2％，是第20周的3.25倍。当小鼠接受此食物并保持在应激刺激条件下时，该比例增加至60％，而当食用CPL时该比例为23.6％。

此外，将第30周处死的小鼠的肺匀浆化制备样品，将该样品离心获得上清夜。用此上清夜来检测厌氧糖原酵解的酶活性，即己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性。结果见表7。

表7、第30周厌氧糖原酵解的酶活性

HK PFK PK LDH

CE2组(无应激) 75.5±7.7^a) 48.3±4.5 224.0±28.5 1330±105

应激刺激组 91.7±4.9^b) 64.0±4.4^c) 274.0±32.0^d) 1531±99^b)

应激刺激CPL组 69.4±8.7 51.6±7.6 229.0±28.1 1364±172

a)平均值±标准偏差

通过t检验与CE2应激组比较的显著性差异

b)p＜0.01

c)p＜0.001

d)p＜0.05

由此结果可以理解，空间限制束缚应激刺激显著增加了决定肺部糖酵解的酶活性的速度。但是，食用CPL后与CE2组相比，这些酶的活性都没有显示出显著差异。

试验实施例3和试验实施例4的结果表明通过使用CPL，由于应激刺激造成的淋巴细胞计数的降低和厌氧酶活性的增加受到了抑制，并获得了抗肿瘤作用。

工业实用性

本发明的抗应激反应剂可以用来减轻和预防多种应激反应。此外，作为活性组分的用于本发明聚乳酸的混合物是得自有机组分的乳酸低聚物，并因此显示出高的生物相容性和极小的副作用。因此，本发明的抗应激反应剂安全性非常好，使用时没有特殊的限制，为了预防和/或减轻应激反应，可以每天使用，例如，以饮料的形式。

Claims

1、抗应激反应剂，其含有缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物。

2、权利要求1的抗应激反应剂，用于预防和改善应激引起的医学症状。

3、权利要求1或2的抗应激反应剂，用于预防和改善应激引起的免疫功能衰退。

4、权利要求1或2的抗应激反应剂，用于预防和改善应激引起的溃疡或肿瘤。

5、权利要求1或2的抗应激反应剂，用于改善患者对抗应激刺激的存活率。

6、权利要求1至5任一项所述的抗应激反应剂，其中作为所述聚乳酸中作为重复单元的乳酸基本上由L-乳酸组成。

7、权利要求1至6任一项所述的抗应激反应剂，其中缩合度为3至20的环状和/或直链聚乳酸的混合物是通过下述方法获得的馏分：在惰性气体中通过脱水缩合乳酸，将所得反应溶液的溶解于乙醇和甲醇的馏分加样到反相柱色谱上，并用pH2至3的25至50重量％乙腈水溶液洗脱，然后用pH2至3的90重量％或90重量％以上的乙腈水溶液洗脱。

8、权利要求7的抗应激反应剂，其中通过脱水的缩合反应通过在氮气氛下逐步减压和升温进行的。

9、权利要求7或8的制剂，其中反相柱色谱是通过ODS柱色谱进行的。

10、抑制应激反应的食品和饮料，其中含有权利要求1至9任一项所述的抗应激反应剂。