CN107206030B - 包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物。并且，本发明涉及包含生酸拟杆菌(Bacteroide s acidifaciens)作为有效成分的用于脂肪氧化或用于抑制二肽基肽酶‑4(DPP‑4)的组合物。并且，本发明涉及树突状细胞中的Atg7基因缺失的表现瘦表型的转化体。

Description

包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病 的药学组合物
技术领域
本发明涉及包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物。
并且，本发明涉及包含生酸拟杆菌(Bacteroides acidifaciens)作为有效成分的用于脂肪氧化或用于抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)的组合物。
背景技术
代谢性疾病(Metabolic Disease)是指与因体内的过剩营养蓄积及缺乏运动而引起的如肥胖、糖尿病、高血压及动脉硬化等危险因素一同产生的综合征，最近通过由世界保健机构和美国国立保健研究院的心、肺、血液研究所制定的成人治疗程序III来正式命名为代谢综合征或胰岛素抵抗(Insulin resistance syndrome)综合征。并且，根据在2011年公布的美国全美胆固醇教育计划(NCEP，National Cholesterol Education Program)的ATP，在一名患者中出现男性腰围为40英寸(102cm)以上且女性腰围为35英寸(88cm)以上的腹部肥胖、中性脂肪(甘油三酯(triglycerides))为150mg/dL以上、男性高密度脂蛋白(H DL)胆固醇为40mg/d以下且女性高密度脂蛋白胆固醇为50mg/dL以下、血压为130/85mmHg以上、空腹血糖(fasting glucose)为110mg/dL以上等五种危险因素中的三种以上的情况下，将其判定为代谢性疾病，在东方人的情况下，将腹部肥胖的因素稍微调整为男性腰围为90以上且女性腰围为80以上，最近有研究报道称，在适用如上所述的规定的情况下，在全人口的25％左右的韩国人出现代谢综合征症状。
一方面，粘膜免疫组织是指由到呼吸器官、生殖器官及消化器官的粘膜覆盖的组织，这些组织直接与外部环境相连接而容易暴露于外部抗原及病原体的组织。在人体的粘膜组织中有达到100兆个细菌、霉、原生动物等多种微生物形成群落并与它们共存。与全身免疫组织相比，粘膜免疫组织具有效于与共生微生物共存的免疫耐性机制，另一方面，具有为了对病原微生物第一次防御而可产生快速且强大的免疫反应的体系。
肠道微生物通过各种机制对参与肠道稳态维持及代谢调节的人类的健康和疾病产生影响。肠道微生物通过发酵未消化的多糖类(Polysaccharides)来形成短链脂肪酸(Short chain fatty acids)并供给肠上皮细胞的能源。可将人的肠道微生物菌群大致分为4门(Phylum)，为作为革兰阴性杆菌的拟杆菌(Bacteroidetes)和蛋白菌(Proteobacteira)、作为革兰阳性杆菌的拟杆菌的硬壁菌门(Firmicutes)和放线菌(Actinobacteria)。
尤其，肥胖为与如心血管疾病、糖尿病、骨质疏松症等疾病相关的对健康造成威胁的危险因素之一。最近有很多研究结果发表称，肥胖与肠道微生物菌群的变化及多样性有密切关系。将肥胖小鼠(ob/obmouse)的肠道微生物与正常体重小鼠的肠道微生物进行比较，硬壁菌门增加且拟杆菌门减少。相似地，若向肥胖的人供给低碳水化合物饮食或低脂饮食，则拟杆菌门增加，在对双胞胎对象进行的研究中报告称，据对肥胖的人的肠道微生物的分析，多样性减少且拟杆菌门减少。
据报告，对消瘦的人和肥胖的人的肠道微生物基因结构进行分析的结果，在肠道微生物种类及数量上具有显著的差异。即，缺乏肠道微生物的肥胖患者中出现如脂肪过多症、胰岛素抵抗症、血脂障碍及炎症反应等症状，且相比于富有肠道微生物的肥胖的人，体重更容易增加。
肠道微生物和宿主之间的相互作用对肥胖和代谢综合征的发病产生重要作用。推究在肠道中共存的微生物的作用，通过分离/鉴定并利用益生菌(probiotics)概念来使它们之间的相互作用产生变化，从而可预防/治疗肥胖的可能性高。
然而，尚未发现特定肠道微生物直接参与脂质代谢而可能对体重及脂肪量产生影响。
发明内容
技术问题
对此，本发明人确立表现瘦表型的转基因小鼠，对该小鼠特定特异性增加的肠道微生物，来确认该微生物可参与体内代谢，尤其可有效参与脂质代谢，从而完成本发明。
因此，本发明的一实施方式提供包含上述有效微生物的用于预防或治疗代谢性疾病的组合物。
本发明的再一实施方式提供包括向需要预防或治疗代谢性疾病的对象给药上述有效微生物的步骤的预防或治疗代谢性疾病的方法。在给药步骤之前，上述方法还可包括确认(identify)需要预防或治疗代谢性疾病的对象的步骤(例如，确认给药对象是否患有代谢性疾病或存在患代谢性疾病的危险的步骤)。
本发明的另一实施方式提供用于预防或治疗代谢性疾病或者使用于制备用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物中的上述有效微生物的用途。
并且，本发明一实施方式涉及包含上述有效微生物的用于脂肪氧化或抑制二肽基肽酶-4的组合物或者用于预防或治疗与其相关的疾病的组合物。
并且，本发明的再一实施方式涉及包括向需要抑制二肽基肽酶-4或脂肪氧化的对象给药上述有效微生物的步骤的抑制二肽基肽酶-4或促进脂肪氧化的方法或者预防或治疗与其相关的疾病的方法。在给药步骤之前，上述方法还可包括确认需要抑制二肽基肽酶-4或脂肪氧化的对象或者需要预防或治疗与其相关的疾病的对象的步骤。
本发明的另一实施方式涉及使用于抑制二肽基肽酶-4或脂肪氧化或者预防或治疗与其相关的疾病中的上述有效微生物用途或者使用于制备用于抑制二肽基肽酶-4或脂肪氧化或者预防或治疗与其相关的疾病的组合物中上述有效微生物的用途。
本发明的又一实施方式涉及树突状细胞中的Atg7基因缺失的表现瘦表型的转化体。
本发明的还有一实施方式涉及包括使树突状细胞中的Atg7基因缺失的步骤的表现瘦表型的转化体的制备方法。
并且，本发明还有一实施方式涉及包含Atg7或编码Atg7的基因的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物。
解决问题的方案
本发明的一实施方式提供包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物。再一实施方式提供包括向需要预防或治疗代谢性疾病的对象给药生酸拟杆菌的步骤的预防或治疗代谢性疾病的方法。在给药步骤之前，上述方法还可包括确认需要预防或治疗代谢性疾病的对象的步骤。另一实施方式提供用于预防或治疗代谢性疾病或者使用于制备用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物中的生酸拟杆菌的用途。
以下，详细地说明本发明。
在具体例中，本发明者确认当使树突状细胞中的Atg7基因缺失时，小鼠中发挥瘦表型后，确认了与对照组进行比较时，生酸拟杆菌在发挥瘦表型的Atg7ΔCD11c小鼠中以高的水平纯在。并且，确认了生酸拟杆菌使小鼠的体重及体脂肪减少，使血液中葡萄糖水平减少，使血液中胰岛素的生产增加。
并且，本发明的生酸拟杆菌(BA)引起脂肪组织内通过胆汁酸-G蛋白偶联受体5(TGR5)-过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)轴的脂肪氧化的活性，这引起高能量消耗。同时，生酸拟杆菌使内脏的二肽基肽酶-4活化，接着使胰高血糖素样肽-1(GLP-1)增加，由此参与葡萄糖稳态。胆汁酸、胆酸酯及牛磺酸也通过G蛋白偶联受体5来参与胰高血糖素样肽-1的活性，从而改善胰岛素感受性。
因此，本发明的生酸拟杆菌可用作用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物。
作为上述生酸拟杆菌的概念，不仅是指微生物细胞自身，而且还包括如包含微生物细胞的培养物或微生物细胞除外的培养物等上述菌体的培养物、上述培养物的干燥物、破碎物、分馏物等。
在本说明书中，“代谢性疾病”是指选自由肥胖、糖尿病、糖尿病并发症、脂肪肝、高血压、外周血管疾病、血脂障碍、胰岛素抵抗、心血管疾病、动脉硬化症、代谢综合征、高血糖症、高血脂症及碳水化合物代谢异常等组成的组中的疾病。
作为上述代谢性疾病的一例，有肥胖。在本发明中使用的“肥胖(obesity)”为被定义为脂肪细胞数的增加及细胞体积的扩张的疾病，可成为糖尿病、血脂障碍、高血压、心血管疾病、血液凝固异常肾病、眼病及足部感染等代谢性疾病的主要原因。
并且，作为代谢性疾病
Figure BDA0001316924090000061
的另一例，“糖尿病(diabetes)”是指因缺乏胰岛素或对胰岛素的感受性下降而导致碳水化合物代谢异常的疾病，可分为因胰脏中的胰岛素的分泌量少而引起的1型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病(Insuline-dependent diabetesmellitus，IDDS))和因对胰岛素的组织的排异反应而引起的2型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病(Non-insulin-dependent mellitus，NIDDM))。整个糖尿病中90％以上为2型糖尿病。2型糖尿病与遗传及肥胖有关，其中，尤其与腹部肥胖(腰围：臀围的比率为85：100以上的状态)有很大关系。因此，在本发明中，优选地，糖尿病是指2型糖尿病。上述代谢性疾病可包括糖尿病的并发症。可在不适当调节糖尿病的情况下，引起糖尿病的急性并发症(低血糖症、酮症酸中毒或非酮症性高渗性昏迷状态)。长时间严重的并发症包括心血管疾病(危险度为二级)、慢性肾功能障碍、可发展到失明的视网膜损伤、各种神经损伤及微血管损伤，这些可导致阳萎及愈合不良(poor healing)。伤口(尤其，脚)的愈合不良可引发坏疽(gangrene)，从而可导致截断。
在本说明书中，脂肪肝是指在正常细胞内不存在的中性脂肪异常地沉着在肝细胞内而出现的现象。
在本说明书中，高血压是指动脉的血压慢性地变高的状态，指18岁以上的成人的收缩期血压为140mmHg以上或扩张期血压为90mmHg以上的情况，也由肥胖等产生。
术语外周血管疾病(peripheral vascular disease，PVD)是指末梢动脉和静脉的损伤、功能障碍等。
本发明的血脂障碍是指低的高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoproteincholesterol，HDLc)、高的中性脂肪浓度及略高或正常的低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDLc)浓度的组合。
并且，本发明的胰岛素抵抗是是指作为在生理性胰岛素浓度中整体调节糖质、脂质及蛋白质等能量代谢的最重要的活体激素的胰岛素的作用比正常下降的代谢性状态。
本发明的动脉硬化症是指因含有胆固醇、磷脂质、钙等的脂肪性物质(血小板(plaque))堆积在血管内膜而使动脉变硬，从而失去弹性并变窄，导致血液供给下降或压力变高，引起动脉破裂、剥离等的状态。
本发明的高血糖症是指血液中的血糖値异常地上升的状态，可由胰岛素生产的异常或胰岛素功能异常引起。
本发明的高血脂症随着血液中如胆固醇等脂质成分增加而血液的流动不畅通，且在动脉壁上附着脂质成分并产生慢性炎症反应，引起动脉内壁变窄的同时血管变硬的动脉硬化，长期由此生成的血栓堵塞心脏冠状动脉或脑血管等，从而成为引起心肌梗塞、脑卒中或脑梗塞等的原因。
高胰岛素血症是指血液中胰岛素数值比正常高的状态，有基质性高胰岛素血症及功能性高胰岛素血症。基质性高胰岛素血症因郎格罕氏岛的增殖(腺瘤、肥大)而在胰脏中胰岛素分泌过剩而导致且成为自发性低血糖症。功能性高胰岛素血症是指在没有郎格罕氏岛腺瘤等的情况下，由自律神经、消化系统的功能障碍引起，胃切除后，因脑卒中、肝炎等原因主要在饭后的胰岛素值变高且在饭后2～4小时后引起低血糖。
本发明的碳水化合物代谢异常是指在从丙酮酸产生葡萄糖的葡萄糖生物合成过程中产生问题或在从丙酮酸产生二氧化碳和水的三羧酸循环及氧化性磷氧化过程中产生问题而发病的代谢异常疾病，作为碳水化合物代谢异常，可举例糖原贮积病Ⅰ型、果糖-1,6二磷酸酶缺乏症、丙酮酸脱氢酶复合体缺乏症、丙酮酸羧化酶缺乏症、糖原病、半乳糖血症等，但不局限于此。
并且，作为代谢性疾病的一例，有代谢综合征。对于本领域普通技术人员而言，代谢综合征由包括如下的一群代谢性危险因素(metabolic risk factors)特征化：腹部配方(腹部内及周围的过度脂肪组织)；动脉粥样硬化性血脂障碍(血液脂肪疾病-高甘油三酯、低高密度脂蛋白胆固醇及高低密度脂蛋白胆固醇-使在动脉血管壁增加齿菌斑)；增加的血压；胰岛素抵抗或葡萄糖过敏症；血栓前状态(prothrombotic state；例如，血液中存在高的纤维蛋白原或Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子(PAI-1，plasminogen activatorinhibitor-1))；以及促炎性状态(例如，在血液中C-反应蛋白的增加)。患有代谢综合征的人的与冠状动脉心脏疾病及在动脉血管壁中齿菌斑的形成增加(plaque buildups)相关的其他疾病(例如，脑卒中及外周血管疾病)以及II型糖尿病的危险度增加。
作为代谢性疾病的另一例，有心血管疾病或心脏疾病。
心脏疾病(cardiac disorder)为可与称为心脏病(heart disease)及心血管疾病(cardiovascular disease)的术语相互混用来利用的普通术语。在本说明书中，心脏疾病是指抑制心脏的正常功能的所有类型疾病。更特殊地，在本说明书中，包括在心脏疾病的疾病包括冠心病、心肌病、心血管疾病、缺血性心脏病、心脏麻痹、高血压性心脏病、炎症性心脏病及瓣膜性心脏病(valvular heart disease)，但不局限于此。
并且，本发明的一实施方式提供包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于脂肪氧化的组合物或用于预防或治疗与其相关的疾病的组合物。再一实施方式提供包括向需要促进脂肪氧化或预防或治疗与其相关的疾病的对象给药生酸拟杆菌的促进脂肪氧化或预防或治疗与其相关的疾病的方法。在给药步骤之前，上述方法还可包括确认需要促进脂肪氧化或预防或治疗与其相关的疾病的对象的步骤。另一实施方式提供使用于促进脂肪氧化或预防或治疗与其相关的疾病或者使用于制备用于促进脂肪氧化或预防或治疗与其相关的疾病药学组合物中的生酸拟杆菌的用途。
上述用于脂肪氧化的组合物可以为用于预防或治疗由氧化应激诱导的生理学或病理学状态的组合物。并且，上述组合物可以为用于预防或治疗物理或精神压力的药学组合物。上述组合物可以为用于预防或治疗选自由老化、癌症、复合性动脉硬化、关节炎、帕金森病、脑卒中、脑震荡、阿尔察默病、血管障碍、高血脂症、心肌梗塞及脑梗塞组成的组中的一种以上疾病的药学组合物。
上述用于脂肪氧化的组合物不仅可利用于上述代谢性疾病，而且还可利用于如肌肉疾病、肌肉减少症、恶液质、肌肉损伤、肌肉萎缩症及肌肉疲劳等相关疾病的治疗、肌肉功能及持久力改善、身体执行力提高、持久力能力增大、肌肉量增加、肌肉损失防止、肌肉恢复增大、肌肉疲劳减少、能量平衡增加、肌肉执行力和/或肌肉强度和/或肌肉量和/或肌肉功能维持、体型改善或肌肉：脂肪之比改善等。
并且，本发明的一实施方式提供包含生酸拟杆菌作为有效成分的用于抑制二肽基肽酶-4的组合物或用于降低血糖的组合物。再一实施方式提供包括向需要抑制二肽基肽酶-4的组合物或降低血糖的对象给药生酸拟杆菌的步骤的抑制二肽基肽酶-4或降低血糖的方法。在给药步骤之前，上述方法还可包括确认需要抑制二肽基肽酶-4的组合物或降低血糖的对象的步骤。另一实施方式提供使用于抑制二肽基肽酶-4的组合物或降低血糖或者使用于制备用于抑制二肽基肽酶-4的组合物或降低血糖的药学组合物中的生酸拟杆菌的用途。
二肽基肽酶-4(DPP-4，Dipeptidylpeptidase-4)抑制剂为用于调节血糖的新机制药剂。当摄取食物时，在胃肠道中分泌胰高血糖素样肽-1(GLP-1，glucagon-like peptide-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP，glucose-dependent insulinotropicpolypeptide)。称之为肠促胰岛素，在肠道的K、L细胞中分泌后，由血液中的称为二肽基肽酶-4的酶非常短时间内被分解。二肽基肽酶-4抑制剂抑负责分解肠促胰岛素的二肽基肽酶-4酶，从而使肠促胰岛素在血液中的浓度增加。此外，在使用二肽基肽酶-4抑制剂时，通过促进胰岛素合成和分泌、抑制胰高血糖素(glucagon)及抑制肝中的葡萄糖合成来调节血糖。
在将上述组合物制备成用于预防或治疗代谢性疾病或脂肪氧化相关疾病的药学组合物的情况下，上述组合物可包含药学上可接受的载体。通常在制备制剂时利用包含在上述组合物的药学上可接受的载体，包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯聚吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、羟苯丙酯、滑石、硬脂酸镁及矿物油等，但不局限于此。除了上述成分之外，上述药学组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、香味剂、乳化剂、悬浮剂、保鲜剂等。
能够以口服给药或非口服给药方式给药预防或治疗上述代谢性疾病或脂肪氧化相关疾病的药学组合物。非口服给药方式可为静脉内注入、皮下注入、肌肉注入、腹腔注入、内皮给药、局部给药、鼻腔给药、肺部给药及直肠给药等。当进行口服给药时，由于蛋白质或肽被消化，因此需要对口服用组合物进行涂敷或者以从如上所述的分解保护活性药剂的方式进行剂型化。并且，可利用可使活性物质向靶细胞移动的任意装置来给药上述组合物。
上述药学组合物的给药对象可以为如人类等哺乳类动物或从它们分离的细胞、组织或它们的培养物。
根据如制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应感应性等因素，能够以多种方式对用于预防或治疗上述代谢性疾病或脂肪氧化相关疾病的药学组合物的适合给药量开处方。优选地，以成人基准，上述组合物的给药量在100～100000000(102～108)cell/kg范围内。属于“药学有效量”是指充分预防或治疗代谢性疾病或脂肪氧化相关疾病的量。
根据本领域普通技术人员可容易实施的方法，利用药学上可接受的载体和/或赋形剂来进行制剂，从而能够以单位容量形态制备或通过装入大容量容器内来制备上述组合物。此时，剂型可以为油或水性介质中的溶液、悬浮液、糖浆剂或乳化液形态或者还可以为提取剂、散剂、粉剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂形态，还可包括分散剂或稳定剂。并且，可单独给药上述组合物或者可与其他治疗剂并用来给药上述组合物，可与以往的治疗剂依次或同时给药上述组合物。并且，可以给药一次，或者必要时可以增加给药次数。
本发明的生酸拟杆菌可用作食品组合物。本发明的食品组合物可易于用作有效预防及改善代谢性疾病的症状或脂肪氧化的食品，例如，食品的主原料、副原料、食品添加剂、功能性食品或饮料。
在本发明中，上述“食品”是指包含一种或一种以上营养素的天然物或加工品，优选地，是指经过某种程度的加工工序而可直接饮用的状态，通常是指均包括食品、食品添加剂、功能性食品及饮料。
作为可添加用于预防及改善本发明的代谢性疾病症状的用于脂肪氧化的组合物的食品，例如，有各种食品类、饮料、口香糖、茶、维生素复合剂、功能性食品等。而且，在本发明中，食品还包括特殊营养食品(例如，配方奶粉、婴幼儿食品等)、食肉加工品、鱼肉制品、豆腐类、凉粉类、面类(例如，方便面、面条类等)、面包类、健康辅助食品、调味食品(例如，酱油、大酱、辣椒酱、混合酱等)、酱汁类、饼干类(例如，零食类)、糖果类、巧克力类、口香糖类、冰淇淋类、乳加工品(例如，发酵乳、奶酪等)、其他加工食品、泡菜、腌制食品(各种泡菜类、酱菜类等)、饮料(例如，果实饮料、蔬菜类饮料、豆乳类、发酵饮料类等)、天然调味料(例如，方便面料等)，但不局限于此。可通过常规的制备方法来制备上述食品、饮料或食品添加剂。
并且，上述“功能性食品”是指利用物理、生物化学、生物工程手段等来以使该食品的功能作用并表达特定目的方式给食品赋予附加价值的食品种类或以使与食品组成所具有的生物防御节律调节、疾病防治和恢复等有关的体内调节功能对活体充分表达的方式设计的食品，具体地，上述“功能性食品”可以为健康功能性食品。上述功能性食品可包含食品学上可接受的食品补助添加剂，还可包含通常使用于制备功能性食品中的适合的载体、赋形剂及稀释剂。
并且，在本发明中，上述“饮料”是指为了解渴或品尝而引用的总称，包括功能性饮料。上述饮料除了以指示的比率包含作为必须成分的用于预防及改善上述代谢性疾病的组合物之外，对其他成分没有特别限制，可包含作为如普通饮料等各种香味剂或天然碳水化合物等的附加成分。
并且，除了如上所述的成分，包含本发明的用于预防及改善代谢性疾病症状或用于脂肪氧化的组合物的食品可包含多种营养剂、维生素、矿物(电解质)、合成风味剂及天然风味剂等风味剂、着色剂及填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶质增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、乙醇、使用于碳酸饮料的碳酸化剂等，可单独或组合使用上述成分。
在包含本发明的用于预防及改善代谢性疾病症状或用于脂肪氧化的组合物的食品中，相对于食品总重量，可包含0.001重量百分比至90重量百分比的上述本发明的组合物的量，在饮料的情况下，能够以100ml基准，能够以0.001g至2g的比率包含，优选地，以0.01g至0.1g的比率包含，在以健康及卫生为目的或以健康调节为目的而长时间摄取的情况下，可以为上述范围以下，由于有效成分在安全性方面没有任何问题，可使用上述范围以上的量，因此不局限于上述范围。
并且，本发明的又一实施方式提供树突状细胞中的Atg7基因缺失的表现瘦表型的转化体。并且，本发明的还有一实施方式提供包括使树突状细胞中的Atg7基因缺失的步骤的表现瘦表型的转化体的制备方法。
并且，还有一实施方式提供包含Atg7或编码Atg7的基因的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物。
编码上述Atg7的基因的表达抑制剂可以为对上述基因具有特异性的小干扰核糖核酸(siRNA，small interference RNA)、短发夹核糖核酸(shRNA，short hairpin RNA)、微核糖核酸(miRNA，microRNA)、核酶(ribozyme)、脱氧核酶(DNAzyme)、肽核酸(PNA，peptidenucleic acids)、反义寡核苷酸等。
上述Atg7的活性抑制剂可以为对Atg7具有特异性的抗体、适体、天然提取物及化学物质。上述抗体可以为单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明中，术语“转基因”是指生物由从外部提供的脱氧核糖核酸(DNA)发生遗传性质，即，将作为从生物的某个体系的细胞提取的核酸的一种的脱氧核糖核酸提供到其他体系的活细胞中时脱氧核糖核酸进入其细胞而产生遗传性质变化的现象。
在本发明中，术语“转化体”是指因转基因而生成的个体，对其个体没有限制，但优选地，是指转基因动物。
并且，本发明的还有一实施方式可提供包含Atg7或编码Atg7的基因的表达抑制剂或活性抑制剂作为有效成分的用于改善或预防代谢性疾病的食品组合物。
并且，本发明一实施方式提供包括将上述转化体与肥胖表型或普通表型的个体的肠道微生物进行比较的步骤的有效肠道微生物的筛选方法。在上述进行比较步骤之后，上述筛选方法还可包括通过与肥胖表型或普通表型的个体的肠道微生物进行比较来选择(确定)个体数多的微生物作为有效肠道微生物的步骤。
上述有效肠道微生物可以为对代谢性疾病或脂肪氧化有效的微生物，优选地，可以为对脂质代谢性疾病有效的微生物。
发明的效果
本发明的生酸拟杆菌引起脂肪组织内通过胆汁酸-G蛋白偶联受体5-过氧化物酶体增殖物激活受体α轴的脂肪氧化的活性，这引起高能量消耗。同时，生酸拟杆菌使内脏的二肽基肽酶-4活化，接着使胰高血糖素样肽-1增加，由此参与葡萄糖稳态。胆汁酸、胆酸酯及牛磺酸也通过G蛋白偶联受体5来参与胰高血糖素样肽-1的活性，从而改善胰岛素感受性。因此，本发明的生酸拟杆菌可用作代谢疾病的非常有效的治疗剂预防剂。
附图说明
图1为在Atg7ΔCD11c中确认瘦表型的图。
图1a示出监测Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠中的体重变化23周的情况(左侧图)。示出进行正常饮食(NCD)的24周龄的雄性Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的体重及脂肪量(右侧图)。(n＝8)
图1b为24周龄的Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠照片。
图1c为进行正常饮食的24周龄的雄性Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的腹部脂肪组织的核磁共振成像(MRI)。
图1d示出Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的脂肪组织的组织学变化(左侧图)及脂肪细胞的大小(右侧图)。比例尺(Scale bars)＝50μm。
图1e示出在非禁食条件下的进行正常饮食的Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的血清中的葡萄糖及胰岛素的水平。
图1f示出雄性Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠葡萄糖耐量试验(GTT，Glucose tolerancetest)及胰岛素耐量试验(ITT，insulin tolerance test)结果。
所有的数据显示为平均±s.e.m。*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001。
图2为示出瘦表型起源于内脏共生细菌的图。
图2a为共生(CH；中间)及分离(左右端)的24周龄雄性Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的照片。
图2b示出共及分离的笼子中的24周龄雄性Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠中的体重及脂肪量(n＝3或4)。
图2c示出在共生后对各只小鼠的体重进行监测10周的结果(n＝3～9)。
图2d示出移动Atg7f/f或Atg7ΔCD11c小鼠的粪便18周后未处理的B6小鼠的体重及脂肪量(n＝5)。
图2e示出在非禁食条件下移动Atg7f/f或Atg7ΔCD11c小鼠的粪便提取物后血清中的胰岛素及葡萄糖水平(n＝5)。
所有的数据为平均±s.e.m值。*P<0.05、**P<0.01以及***P<0.001；不显著(ns，not significant)。
图3为示出在内脏共生细菌中生酸拟杆菌在Atg7ΔCD11c小鼠的粪便中扩张的图。
门(phylum)水平(图3a)及从纲到属的(图3b)焦磷酸测序数据(n＝6)。
图3c为示出通过焦磷酸测序检测出的粪便内的生酸拟杆菌的分布的种类(species)的代表性饼图。红色箭头＝生酸拟杆菌。
图3d示出通过对生酸拟杆菌具有特异性的荧光原位杂交(FISH，fluorescence insitu hybridization)探针来确定的Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠小肠上皮细胞(IECs，intestinal epithelial cells)及结肠官腔中所增加的生酸拟杆菌数(n＝3)。比例尺100μm。所有的数据为平均±s.e.m值。*P<0.05；不显著。
图4为示出生酸拟杆菌调节被饮食诱导的B6小鼠肥胖的体重及脂肪量的图。
图4a为进行高脂饮食(HFD；左侧图)及磷酸盐缓冲液(PBS)-及生酸拟杆菌-饮食的小鼠的照片。监测各组的体重10周(右侧图)。每天给药生酸拟杆菌(5×109CFU/100μl)(n＝5)。
图4b示出与磷酸盐缓冲液或生酸拟杆菌(n＝5)一同进行口服食物摄取。
图4c示出进行酸盐缓冲液-及生酸拟杆菌-饮食的小鼠的核磁共振成像
]图4d示出进行高脂饮食中的酸盐缓冲液-及生酸拟杆菌-饮食的小鼠脂肪组织(左侧图)及脂肪细胞的大小(右侧图)的组织性变化。
所有数据显示为≥2独立实验的平均±s.e.m。
图4e示出利用向腹腔内注射葡萄糖或胰岛素后在规定时点测定的进行酸盐缓冲液-及生酸拟杆菌-饮食的小鼠的血性的葡萄糖耐量试验(左侧图，n＝8或9)及胰岛素耐量试验(右侧图，n＝7～12)结果。
图4f示出进行酸盐缓冲液-或生酸拟杆菌-饮食的小鼠的能量消耗、总活性及换气比值(RER，respiratory exchange ratio)(n＝5)。所有数据显示为平均±s.e.m。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；不显著。
图5为示出生酸拟杆菌通过过氧化物酶体增殖物激活受体α活性来诱导脂肪组织内的脂肪氧化的图。
在各实验的最后时点利用Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠(图5的A部分；n＝5)、移植粪便微生物的小鼠(图5的B部分；n＝5)以及进行生酸拟杆菌饮食的小鼠(图5的C部分；n＝5)的附睾脂肪组织并通过实时聚合酶链式反应(PCR)来确定与脂肪酸合成(脂肪酸合成酶基因(FasN)、激素敏感性脂肪酶(HSL)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)、硬脂酰辅酶a去饱和酶1(SCD1)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ))、β-氧化(过氧化物酶体增殖物激活受体α)、产热(PR结构域蛋白16(PRDM16)、共激活因子1α(PGC1α)、Cidea及葡萄糖转运蛋白4(GLUT4))有关的基因的信使核糖核酸(mRNA)的表达水平。
每天给药生酸拟杆菌1、7及14天后通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)来分析脂肪组织中的过氧化物酶体增殖物激活受体α(图5的D部分)及G蛋白偶联受体5(图5的E部分)表达水平。
所有数据为≥2独立实验的平均±s.e.m。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；不显著。
图6为示出生酸拟杆菌通过调节肠道二肽基肽酶-4分泌来诱导生成胰高血糖素样肽-1的图。
进行酸盐缓冲液-及生酸拟杆菌-饮食的小鼠的血清中的葡萄糖及胰岛素水平(图6的A部分)及活性化胰高血糖素样肽-1(图6的B部分)(正常饮食(normal chow diet，NCD)；高脂饮食；n＝5)
图6的C部分示出向未处理的B6小鼠单独给药生酸拟杆菌或生酸拟杆菌
Figure BDA0001316924090000171
的培养上清液或培养基1小时后，通过发光分析来确认小肠的二肽基肽酶-4水平。
图6的D部分示出利用毛细管电泳质谱(CE-MS，Capillary Electrophoresis MassSpectrometry)的进行酸盐缓冲液-及生酸拟杆菌-饮食的小鼠(n＝5)的粪便中胆酸酯及牛磺酸的定量。
所有数据为≥2独立实验的平均±s.e.m。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；不显著。
图7为示出生酸拟杆菌可预防或治疗胰岛素感受性及肥胖的机制的图。
在瘦表型的Atg7ΔCD11c小鼠中确认了扩增的特异性肠道共生细菌(即，生酸拟杆菌)。生酸拟杆菌的给药引起脂肪组织内通过胆汁酸-G蛋白偶联受体5(TGR5)-过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)轴的脂肪氧化的活性，这引起高能量消耗。同时，生酸拟杆菌使内脏的二肽基肽酶-4活化，接着使胰高血糖素样肽-1(GLP-1)增加，由此参与葡萄糖稳态。胆汁酸、胆酸酯及牛磺酸也通过G蛋白偶联受体5来参与胰高血糖素样肽-1的活性，从而改善胰岛素感受性。
过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα，peroxisome proliferator-activatedreceptorα)；短链脂肪酸(SCFAs，short-chain fatty acids)。
图8为确认与Atg7ΔCD11c小鼠无关地表现瘦表型的图。
进行正常饮食的7周龄至23周龄的雄性(左侧)及雌性雌性(右侧)Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的体重。
图9为示出24周龄的Atg7ΔCD11c小鼠的瘦表型不与验证相关的图。
图9a示出利用流式微球阵列小鼠炎症试剂盒(cytometric bead array mouse-inflammatory kit，BD Biosciences)来测定的Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠(n＝7)的血清中的炎症前细胞活素的水平。
图9b示出通过实时聚合酶链式反应的F4/80(左侧)及肿瘤坏死因子α(TNFα，右侧)信使核糖核酸表达水平。
图9c示出小肠及大肠的木精—伊红染色(hematoxylin eosin staining)结果。比例尺＝100μm。
所有数据为≥2独立实验的平均±s.e.m。*P<0.05；不显著。
图10为示出Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的粪便代谢物的偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA，Orthogonal partial least squares discriminateanalysis)的图。
图10a示出通过对Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠(n＝7)的粪便的核磁共振(1H-NMR，nuclear magnetic resonance)的偏最小二乘法判别分析得到的交叉-验证得分图(Cross-validated score plots)。
图10b示出通过对Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠(n＝7)粪便的核磁共振数据的偏最小二乘法判别分析得到的用于预测结构因素的得分图。
图10c示出利用气相色谱质谱分析法的Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠(n＝5)粪便中短链脂肪酸(例如，醋酸酯、丁酸酯及丙酸酯)及乳酸酯的定量。所有数据为平均±s.e.m。*P<0.05、**P<0.01。
图11为示出共生(co-housing，CH)笼子及粪便微生物的流动中的小鼠的补偿性体重变化的图。
分别以灰色或蓝色圆作为背景并用折线图来表示共生笼子内的Atg7f/f(n＝5)及Atg7ΔCD11c(n＝4)小鼠的体重、分离来饲养的Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠(S)的体重。
图12示出在图3c中示出的Atg7ΔCD11c小鼠的粪便中的种水平的焦磷酸测序数据表示色彩范例。
图13为示出脱氧核糖核酸元基因组内的拟杆菌叠连群的生物学配置的图。
图13为比较Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的粪便中叠连群数的相对存在度的图。所有数据为平均±s.e.m。*P<0.05；***P<0.001，不显著。
图14为示出口服给药的生酸拟杆菌暂时留在结肠的图。
零时且在口服给药生酸拟杆菌(5×109CFU/100μl)1～5天后获得结肠及粪便，并通过生酸拟杆菌-特异性荧光原位杂交探针进行染色。
图14的A部分为生酸拟杆菌的共聚焦图像(黄色箭头)。
图14的B部分示出在特定时点上粪便中的生酸拟杆菌的定量。每玻璃片≥20部位中被计数。所有数据显示为3个独立实验的平均±s.e.m。***P<0.001；不显著。
图15为示出生酸拟杆菌对提供有生酸拟杆菌或磷酸盐缓冲液的进行正常饮食的B6小鼠中的体重及脂肪量的有效功能的图。
图15a示出10周后照片及体重(分别为左图、右图)。每天口服给药生酸拟杆菌(5×109CFU/100μl)。
图15b示出与磷酸盐缓冲液或生酸拟杆菌一同进行口服食物摄取。
图15c示出核磁共振成像分析。
图15d示出脂肪组织的组织学变化(左侧图)及脂肪细胞的大小变化(右侧图)。
图15e示出向腹腔内注射葡萄糖及胰岛素后在特定时点上的葡萄糖耐量试验左侧图，n＝8～9)及胰岛素耐量试验结果(右侧图，n＝7～12)。
图15f示出进行酸盐缓冲液-或生酸拟杆菌-饮食的小鼠(n＝5)中的能量消耗、总活性及换气比值。
所有数据显示为平均±s.e.m。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001；不显著。
图16为确认进行正常饮食或高脂饮食及B.sartorii(BS)饮食的小鼠具有类似的体重及摄取的图。
图16的A部分示出根据口服给药BS(n＝5)(5×109CFU/100μl)10周的体重。
图16的B部分示出食物摄取。
数据为两次独立实验的平均±s.e.m。不显著。
图17为示出生酸拟杆菌的给药改善肝及末梢胰岛素感受性的图。
图17示出对进行生酸拟杆菌-、被热-非活性的生酸拟杆菌-饮食的小鼠及进行正常饮食6周的对照组小鼠(n＝3)实施高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术(hyperinsulinemic-euglycemic clamp)的结果。
在钳夹实验中，以第一次实验为基础，将胰岛素的输液量确定为3mU。相比于进行被热-非活性的生酸拟杆菌饮食的组，进行生酸拟杆菌-饮食的小鼠的全身葡萄糖吸收(末梢胰岛素感受性，A)胰岛素-介导肝葡萄糖生成率的抑制(肝胰岛素感受性，B)显著增加。所有数据显示为平均±s.e.m。*P<0.05；不显著。
图18为示出口服给药生酸拟杆菌10周后在粪便中的短链脂肪酸水平及乳酸酯的水平的图。通过气相色谱质谱分析仪来对进行正常饮食(图18的A部分n＝5)及高脂饮食(图18的B部分图18的A部分；n＝6)的小鼠的粪便内的醋酸酯、丁酸酯、丙酸酯及乳酸酯的水平进行测定。
所有数据为平均±s.e.m。**P<0.01；不显著。
图19为示出Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠中肝及小肠中的脂质代谢的类似水平平的图。
利用Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠(图19a；n＝5)的肝(图19a)及小肠(图19b)并通过实时聚合酶链式反应来确定与脂肪酸合成(脂肪酸合成酶基因、激素敏感性脂肪酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、硬脂酰辅酶a去饱和酶1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ)、β-氧化(过氧化物酶体增殖物激活受体α)、产热(PR结构域蛋白16、共激活因子1α、Cidea及葡萄糖转运蛋白4)有关的基因的信使核糖核酸的表达水平。
所有数据为平均±s.e.m。
图20为示出生酸拟杆菌不诱导β-细胞的过度刺激的图。
从给药生酸拟杆菌(5×109CFU/100μl)10周的小鼠(n＝5)获得胰脏组织。
图20的A部分示出胰岛(islet)的共聚焦图像(α-细胞为红色，β-细胞为绿色)。比例尺＝50μm。连续切断后与小鼠抗-胰高血糖素免疫球蛋白G(IgG)抗体(Ab)(K79bB10；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)及兔多克隆抗-胰岛素抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)进行反应后，再分别与接合有PE的抗-小鼠免疫球蛋白G(eBioscience，SanDiego，CA)及接合有异硫氰酸荧光素(FITC)的抗-兔免疫球蛋白G(eBioscience，SanDiego，CA)进行反应。
图20的B部分示出利用图像J软件程序(ImageJ software program)来对β-细胞的大小进行定量。以每玻璃片10个部位的方式任意选择胰岛。所有数据为平均±s.e.m。***P<0.001；不显著
图21为示出在Atg7ΔCD11c、粪便微生物移植(fecal microbiota transplantation，FMT)及进行生酸拟杆菌饮食的小鼠的血浆中的甘油三酸酯及胆固醇水平的图。
在Atg7ΔCD11c小鼠(图21a；n＝3)、微生物移植小鼠(图21b；n＝5)及进行生酸拟杆菌-饮食的貂鼠(图21c；n＝5)内利用酶阵列试剂盒来分析血浆甘油三酸酯及胆固醇总浓度。所有数据为平均±s.e.m。不显著。正常饮食；高脂饮食。
图22为示出生酸拟杆菌可移植CD11c+细胞的自身消化的图。
与生酸拟杆菌的共同培养6及24小时后，在琼脂板上确定来源于骨髓的CD11c+细胞内的生酸拟杆菌数(MOI＝10)。从Atg7f/f或Atg7ΔCD11c小鼠获得骨髓。所有数据为三次独立实验的平均±s.e.m。*P<0.05；不显著。
具体实施方式
以下，通过实施例更详细说明本发明。但是，这些实施列仅用于例示性说明本发明，本发明的范围并不限定于这些实施例。
实施例1：动物实验
所有动物实验得到牙山动物实验伦理委员会的许可(许可证编号：PN 2014-13-069)。所有实验在氯胺酮(100mg/kg)及甲苯噻嗪(20mg/kg)的麻醉下实施。
实施例2：小鼠及菌株
分别从查尔斯河实验室(Charles River Laboratories，Orient Bio Inc.，Sungnam，Korea)及美国杰克逊实验室(Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME)购买C57BL/6(B6)及CD11c-Cre、Villine-Cre及LysM-Cre小鼠。由Dr.Masaaki Komatsu(TokyoMetropolitan Institute of Medical Science，Japan)提供ATG7flox/flox小鼠。
在首尔牙山医院动物室交配CD11ccre小鼠及ATG7f/f小鼠来得到Atg7ΔCD11c小鼠。在无病原菌的条件下向所有小鼠提供已灭菌的饲料及食用水。从日本理化学研究所生物资源中心(RIKEN BioResource Center)的Japan Collection of Microorganisms(JCM)购买生酸拟杆菌(JCM10556)及B.sartorii(JCM17136)。
实施例3：454焦磷酸测序分析
利用粪便脱氧核糖核酸基因组提取试剂盒(QIAamp DNA stool mini kits，Qiagen，Valencia，CA)从粪便提取互补脱氧核糖核酸(cDNA)。利用靶向16S rRNA基因的第V1至V3部位的引物实气相施聚合酶链式反应扩增。为了细菌的扩增，利用附着有条形码的引物9F(5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC-TCAG-AC-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'；打下划线的序列是指靶部位的引物)及541R(5'-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC-TCAG-X-AC-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'；'X'是指各对象的特异性条形码)(http://oklbb.ezbiocloud.net/content/1001)。
在如下的条件下实施扩增：在95℃的温度下开始进行改性5分钟，在95℃的温度下进行改性30秒钟并循环30次，在55℃的温度下进行引物退火30秒钟，在72℃的温度下进行扩增30秒钟，在72℃的温度下进行最终延伸5分钟。将前述的产物以相同的浓度收集在一起，利用AMPure bead kit(Agencourt Bioscience，Beverly，MA)去除短片(非靶产物)。在利用DNA 75001芯片的Bioanalyzer 2100(Agilent，Palo Alto，CA)上对产物的质量及大小进行测定。通过乳液聚合酶链式反应对所混合的扩增物进行测序后，放置于picotiter板上。在GS Junior测序系统(GS Junior Sequencing System，Roche，Branford，CT)利用Chunlab(Seoul，Korea)进行测序。按照以往的技术分析焦磷酸测序数据(Lim Y.W.etal.)。
实施例4：毛细管电泳-飞行时间质谱(CE-TOF-MS，Capillary electrophoresis(CE)time-of-flight mass spectrometry)测定
以如下方式进行利用毛细管电泳-飞行时间质谱法的带电代谢物质的数量分析：利用3-mm的氧化锆-二氧化硅微珠(BioSpec Products，Bartlesville，OK)粉碎10mg的冷冻干燥的粪便样品，作为内部标准，利用分别包含20μM的对作为阳离子的蛋氨酸砜(Wako，Osaka，Japan)、作为阴离子的2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物(MES，Dojindo，Kumamoto，Japan)以及CSA(D-Camphol-10-sulfonic acid；Wako)的400μl的MeOH来进行均质化。接着，添加200μl的去离子水及500μl的氯仿。利用Shakemaster neo(Bio Medical Science，Tokyo，Japan)在1500r.p.m.下搅拌10分钟，在4℃的温度下离心分离4600g的溶液，利用Millipore5000-Da截止滤光片(Millipore，Billerica，MA)进行过滤来去除蛋白质。冷冻干燥过滤液，并溶解于分别包含200μM的作为参照化合物的3-氨基吡咯烷(Sigma-Aldrich)及苯三甲酸(trimesate)(Wako)的25μl的水中。利用Agilent Technologies equipment：CE毛细管电泳系统、G3250AA LC/MSD TOF系统、1100系列binary HPLC泵、G1603A(MasterHands)CE-MS适配器及G1607A CE-ESI-MS sprayer试剂盒来实施所有毛细管电泳-飞行时间质谱实验。为了确定峰值注释(annotation)及定量而利用内部软件(Sugimoto M et al.)来MasterHands处理数据。
实施例5：气相色谱-质谱(GC-MS，Gas chromatography mass spectrometry)测定
利用气相色谱质谱分析仪确定粪便的有机物浓度。将粪便的乙醚提取物的部分样品(80ml)与N-叔丁基二甲基硅基–N-甲基三氟乙酰胺相混合。密封小瓶，在80℃的温度下沸水中加热20分钟，在室温方式48小时并进行衍生化(derivatization)。利用HP-5MS色谱柱(0.25mm×30m×0.25mm)及具有5973Network Mass Selective Detector(AgilentTechnologies)的6890N Network GC System(Agilent Technologies)处理经衍生化的样品。
将纯氦(99.9999％)用作载体气体，以1.2ml min-1的速度进行搬运。
以20：1分割出口压力并设定于97kPa。主入口及移动线温度分别为250℃及260℃。以如下方式使用温度程序：：60℃(3分钟)、60～120℃(5℃/分钟)，120～300℃(20℃/分钟)。接着，分别将1μl的样品注入30分钟的反应时间。将有机酸浓度峰值区域与标准进行比较来进行定量。
实施例6：胰高血糖素样肽-1的测定
从对照组及进行生酸拟杆菌-饮食的小鼠获得血液样品，在4℃的温度下离心分离1800g的血液样品30分钟。添加二肽基肽酶-4抑制剂，利用胰高血糖素样肽-1酶联免疫试剂盒(GLP-1ELISA kit，Shibayagi)确定胰高血糖素样肽-1浓度。
实施例7：二肽基肽酶-4的测定
测定二肽基肽酶-4水平，使野生型B6小鼠禁食6小时后，给药生酸拟杆菌(5×109CFU/100μl)或其培养上清液(100μl/head)或将培养基单独与二肽基肽酶-4抑制剂西他列汀(40mg/mouse；Merck Sharp Dohme and Chibret Laboratories，Rahway，NJ)一同给药，接着，30分钟后提供葡萄糖。15分钟后，从预处理小鼠回收回肠的肠道上皮细胞，利用磷酸盐缓冲液清洗并去除鲁米那物质。刮除黏液，以1～2mm的长度切割上皮，并固定于1ml的磷酸盐缓冲液中。通过离心分离(6000g，4℃，5min)缩颈旋压所切割的组织，在37℃的温度下利用DPP-4Glo protease assay(Promega,Madison,WI)与试剂盒试剂一同培养50μl的上清液2小时。利用不存在西他列汀的对照组样品的值来计算二肽基肽酶-4活性。
实施例8：统计
将绘制医学图表软件(GraphPad Prism software，GraphPad，La Jolla，CA)利用于统计分析。利用two-tailed paired t-test或Mann-Whitney t-test分析两组之间的显著性差异。在多组的情况下，利用two-way ANOVA及随后的Bonferroni post-hoc test分析(*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001)。
实施例9：确认Atg7ΔCD11c小鼠中减少的体重和脂肪量
为了代谢疾病的发病中的免疫细胞的自身消化作用的作用，在Atg7条件性基因敲除小鼠的树突状细胞(Atg7ΔCD11c)、消化道上皮细胞(Atg7Δvillin)及巨噬细胞(Atg7ΔLysM)中观察体重及行为。使小鼠进行正常饮食(normal chow diet)，之后，确认Atg7ΔCD11c小鼠与其一窝崽子对照组小鼠(Atg7flox/flox(f/f))之间的体重差异的增加(图1a)
重要地，确认了相比于Atg7f/f小鼠，24-周龄Atg7ΔCD11c小鼠具有非常低的体重及脂肪量(图1a及图1b)。雌性及雄性均表现瘦表型(Atg7ΔCD11c；图8)。
在核磁共振成像(MRI，Magnetic resonance imaging)分析中，相比于一窝崽子Atg7f/f小鼠，在Atg7ΔCD11c轴方向及冠状方向均可以确认到显著减少的腹部脂肪组织(图1c)。并且，相比于Atg7f/f小鼠，从Atg7ΔCD11c小鼠获得的内脏脂肪组织的单脂肪细胞大小显著小(图1d)。
为了确认瘦表型的Atg7ΔCD11c小鼠中的全身性或粘膜性炎症的参与，确认了血清中的炎症前细胞因子(proinflammatory cytokine)水平及内脏脂肪组织内的F4/80及肿瘤坏死因子α的信使核糖核酸表达，分析了小肠及大肠的组织。在Atg7ΔCD11c小鼠中确认了全身性及粘膜性炎症的多数标识类似或减少的水平，这表示Atg7ΔCD11c小鼠的瘦表型不与炎症有关系(图9)。
重要地，在非禁食条件下，确认了比Atg7f/f小鼠更高的胰岛素且随后在Atg7ΔCD11c小鼠的血清中确认了低的葡萄糖水平(图1e)。确认了相比于一窝崽子Atg7f/f小鼠，由葡萄糖耐量试验及胰岛素耐量试验确定的胰岛素抵抗在Atg7ΔCD11c小鼠中得到提高(图1f)。综上所述，这种数据表示Atg7ΔCD11c小鼠的脂肪量减少且葡萄糖稳态得到提高。
实施例10：Atg7ΔCD11c小鼠的粪便确认到低的短链脂肪酸水平
由于老龄的Atg7ΔCD11c小鼠具有低的体重及脂肪量，因此利用实施例4的CE-TOF-MS(capillary electrophoresis time-of-flight mass spectrometry)及实施例5的GC-MS(gas chromatography mass spectrometry)确认粪便中瘦表型和能量利用间的关联性。
偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA，orthogonal partial least squaresdiscriminate analysis)中的Atg7ΔCD11c小鼠的个别得分图与Atg7f/f小鼠明显不同(图10a)。
进而，部分短链脂肪酸，例如醋酸酯、丁酸酯、丙酸酯及乳酸位于离轴远的位置(图10b)，这表示这些因子参与Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的区分。实际上，与Atg7f/f小鼠相比，Atg7ΔCD11c小鼠的醋酸酯、丁酸酯及丙酸酯的量显著减少，相反，乳酸的量更高(图10C)。
实施例11：确认到共生细菌与老龄的Atg7ΔCD11c小鼠瘦表型有关
为了确认Atg7ΔCD11c小鼠的瘦表型是否与共生细菌有关，实施了共生(co-housing，CH)及FMT(fecal microbiota transplantation)试验。Atg7ΔCD11c及Atg7f/f小鼠从出生开始共享笼子并暴露于粪便。
其结果，与Atg7ΔCD11c共享笼子的Atg7f/f小鼠与Atg7f/f小鼠相比，更多的体重及脂肪减少(图2a及图2b，图11)。并且，与Atg7f/f小鼠共享笼子的Atg7ΔCD11c小鼠与Atg7ΔCD11c小鼠相比，体重和脂肪增加(图2a及图2b，图11)。为了确认CH小鼠的表型是否是因共生微生物引起的，在共生试验后，将小鼠移到各自的笼子。如图2c所示，Atg7ΔCD11c小鼠在独自饲养的情况下减少了体重，Atg7f/f小鼠不是。并且，对野生型B6小鼠口服给药Atg7ΔCD11c小鼠的粪便提取物12周的结果，与野生型B6或Atg7f/f小鼠的粪便相比，表示显著低的体重及脂肪(图2d)。并且，重要的是，给药Atg7ΔCD11c小鼠的粪便提取物的野生型B6小鼠与给药Atg7f/f小鼠的提取物的小鼠相比，表示高的胰岛素水平及低的血清葡萄糖水平(图2e)。
综上，这种结果表示对Atg7ΔCD11c小鼠的瘦表型起到必须的作用。
实施例12：Atg7ΔCD11c小鼠的粪便中的生酸拟杆菌(bacteroides acidifaciens，生酸拟杆菌)的扩增
为了确认肠道共生细菌的多样性及组成，利用宏基因组分析(MetagenomicAnalysis)。在焦磷酸测序分析中，生酸拟杆菌、硬壁菌及蛋白菌比例，门(Phylum)水平的肠道微生物的一次分布，确认到Atg7f/f及Atg7ΔCD11c小鼠的粪便相互类似(图3a)。Bacteroidia(纲)，bacteroidales(目)，bacteroidaceae(科)以及bacteroides(属)的分别也类似或无显著的差异(图3b)。然而，在种的水平，确认到生酸拟杆菌的比例与Atg7f/f小鼠相比，在Atg7ΔCD11c小鼠的粪便显著扩增了(5.48±1.76％vs.0.77±0.18％)(图3C，红箭；图12及图13)。
另一方面，Atg7ΔCD11c或Atg7f/f小鼠的粪便，包含B.Sartorii的其他bacteroides种的比例无差异(图13)。
在阿尔法多样性，Atg7ΔCD11c小鼠的粪便微生物的种分布(Chao 1 index)显著减少，相反，群落多样性(Shannon/Simpson index)与
Atg7f/f小鼠的粪便微生物类似(以下表1)。
表1
Figure BDA0001316924090000281
为了确认瘦表型的Atg7ΔCD11c小鼠的生酸拟杆菌的扩增，实施了荧光原位杂交(FISH，fluorescence in situ hybridization)分析。如图3d所示，在结肠官腔检测到增加的生酸拟杆菌的数量，确认到少的生酸拟杆菌内在化成Atg7ΔCD11c小鼠的结肠官腔上皮细胞。
综上，这种结果表示在共生细菌中生酸拟杆菌扩增在瘦表型内脏。
实施例13：确认到高脂饮食(high fat diet，HFD)-提供B6小鼠的生酸拟杆菌的口服给药诱导瘦表型。
为了确认扩增的生酸拟杆菌是否调节脂质代谢，获取生酸拟杆菌(JCM10556)，为了确保多量的微生物而进行培养，将其提供给非处理B6小鼠。
为了确定给药的最佳条件，生酸拟杆菌(5×109CFU/100μl)，利用荧光原位杂交分析定量饮食调节的小鼠的大肠组织及内的生酸拟杆菌。口服给药一天后，在大肠上皮细胞的官腔确认到多数的生酸拟杆菌(14的A部分)。
口服给药两天后，粪便内的生酸拟杆菌的数量达到高峰并接着迅速消失而恢复(图14的B部分)。确认到生酸拟杆菌的口服给药与饮食无关地使提供正常饮食及高脂饮食的野生型B6小鼠的体重及脂肪量。(图4a-图4c，图15a-图15c)。对比地，用作对比组的B.sartorii-提供小鼠未确认到体重减少(图16)。并且，与磷酸盐缓冲液-提供及高脂饮食-提供小鼠相比，生酸拟杆菌-提供及高脂饮食-提供B6小鼠中附睾(epididymal)的脂肪组织的单一脂肪细胞的大小显著更小(图4d)。并且，基于GTT及ITT确定的胰岛素抵抗与磷酸盐缓冲液-提供及高脂饮食-提供的小鼠相比，在生酸拟杆菌-提供及高脂饮食-提供的小鼠种得到了显著改善(图4e)。
为了确认基于生酸拟杆菌饮食的肝及末梢胰岛素感受性的效果，利用了将被热-非活性的生酸拟杆菌作为对比组的高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术。
值得注意的是，生酸拟杆菌饮食改善了肝及末梢胰岛素感受性(图17)。生酸拟杆菌的口服给药时，确认到在正常饮食小鼠的粪便减少了丁草特(butylate)，但是确认是醋酸酯、丙酸酯以及乳酸的水平没变(图18A)。在高脂饮食组里确认到类似倾向(图18B)。为了确认能量消耗、活性及基质利用，在综合实验动物监测系统(CLAMS，comprehensivelaboratory animal monitoring system)笼子分别饲养五天后，对供给生酸拟杆菌的小鼠进行监测。供给磷酸盐缓冲液或生酸拟杆菌的小鼠组表示类似的运动活性(locomotoractivity)及呼吸交换率(respiratory exchange ratio)，生酸拟杆菌-提供及高脂饮食-提供小鼠与磷酸盐缓冲液-提供及高脂饮食-提供小鼠相比消耗更多的能量(图4f)。口服给药生酸拟杆菌的正常饮食小鼠也表示类似的效果(图15)。
综上，生酸拟杆菌的长期给药诱导能量消耗，因此，饮食-诱导的肥胖小鼠中诱导显性的瘦表型。
实施例14：确认到瘦表型的小鼠在脂肪组织增加过氧化物酶体增殖物激活受体α表达
基于在Atg7ΔCD11c、FMT B6及生酸拟杆菌饮食的B6小鼠检测到体重及脂肪量的减少，对在肝及小肠中的脂质代谢有关的基因的表达水平进行分析。重要的是，脂质β-氧化，尤其与过氧化物酶体增殖物激活受体α有关的基因的表达在Atg7ΔCD11c小鼠的附睾的脂肪组织中增加(图5A)。小肠及肝中未确认到显著的差异(图19a及图19b)。与这种结果一贯地，过氧化物酶体增殖物激活受体α的表达在Atg7ΔCD11c的排便提取物饮食B6小鼠、高脂饮食及生酸拟杆菌饮食10周的小鼠的附睾的脂肪组织中确认到显著上向调节(图5的B部分及C部分)。
为了确认提高β-氧化水平是因单独的细菌活化的还是因瘦表型得产物活化的，根据时间依赖性方法的生酸拟杆菌给药B6小鼠中测定了过氧化物酶体增殖物激活受体α表达水平。
值得注意的是，B6小鼠的附睾脂肪组织中的过氧化物酶体增殖物激活受体α的信使核糖核酸水平在生酸拟杆菌给药2周后显著增加(图5的D部分)。
并且，测定了能够刺激通过过氧化物酶体增殖物激活受体α火星的能量消耗的G蛋白偶联受体5、GP生酸拟杆菌R1(G-protein-coupled bile acid receptor)的表达水平。
其结果，确认到生酸拟杆菌的给药使脂肪组织中的G蛋白偶联受体5表达水平增加(图5的E部分)。这种结果表示基于生酸拟杆菌的瘦表型使基于G蛋白偶联受体5-过氧化物酶体增殖物激活受体α活性的脂肪组织内的脂肪氧化开始。
实施例15：确认到生酸拟杆菌根据DPP4(dipeptidyl peptidase-4)的调节及胆汁酸的生成来介导胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1)的生成
葡萄糖稳态调节中确认到生酸拟杆菌的作用。如预测，进行生酸拟杆菌饮食的B6小鼠与磷酸盐缓冲液-饮食B6小鼠相比，在血清表示更高的胰岛素及更低的葡萄糖水平(图6的A部分)。
为了确认这种血浆胰岛素水平的增加是否由β-细胞的过度刺激引起的，生酸拟杆菌饮食10周后执行胰腺组织内的α-细胞及β-细胞的染色。
其结果，确认到生酸拟杆菌饮食部诱发β-细胞的过度刺激(图20)。
为了确认生酸拟杆菌-饮食瘦小鼠的胰岛素分泌的高水平的机制，对刺激向血液的胰岛素放出的胰高血糖素样肽-1水平进行测定。
确认到血清的胰高血糖素样肽-1水平在正常饮食-提供及高脂饮食-提供小鼠中显著增加(图6的B部分)。
确认到在生酸拟杆菌或其培养上清液的口服给药后，小肠回肠中减少作为具有胰高血糖素样肽-1的下降活性周知的酶的二肽基肽酶-4的水平(图6的C部分)。
进而，测定了反应蛋白质量的二肽基肽酶-4活性。以往的研究中，胆汁液通过G蛋白偶联受体5活性的胰高血糖素样肽-1分泌刺激来对葡萄糖稳态起到核心作用。
结果，确认到从进行10周的生酸拟杆菌饮食的B6小鼠的粪便内一次胆汁酸分离(deconjugated)的胆酸酯、胆酸(CA，cholic acid)的盐及牛磺酸的水平显著增加，但未确认到胆固醇的显著损失(图6的D部分，图21)。这种结果表示生酸拟杆菌或其代谢产物降低二肽基肽酶-4酶的活性，由此引起胰高血糖素样肽-1活性，从而改善胰岛素感受性及葡萄糖抵抗性。
综上，本发明人确认到特异性肠道内共生细菌(即，生酸拟杆菌)在作为瘦表型的Atg7ΔCD11c小鼠扩增。生酸拟杆菌的给药导致通过胆汁酸-G蛋白偶联受体5-过氧化物酶体增殖物激活受体α轴的脂肪氧化的活性，这引起高能量消耗。
同时，生酸拟杆菌使内脏的二肽基肽酶-4活化，接着使胰高血糖素样肽-1(GLP-1)增加，由此参与葡萄糖稳态。胆汁酸、胆酸酯及牛磺酸也通过G蛋白偶联受体5来参与胰高血糖素样肽-1的活性，从而改善胰岛素感受性。
因此，可知生酸拟杆菌对如糖尿病、肥胖的代谢疾病的预防或治疗起到重要的作用(图7)。

Claims (6)

1.一种生酸拟杆菌在制备用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物中的用途，其特征在于，其中所述代谢性疾病为选自由肥胖、糖尿病、糖尿病并发症、脂肪肝、血脂障碍、胰岛素抵抗、代谢综合征及高血糖症组成的组中的一种以上。
2.根据权利要求1所述的生酸拟杆菌在制备用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物中的用途，其特征在于，与肥胖表型或普通表型相比，在瘦表型中，上述生酸拟杆菌在肠道总菌中占的比率更高。
3.根据权利要求1所述的生酸拟杆菌在制备用于预防或治疗代谢性疾病的药学组合物中的用途，其特征在于，上述生酸拟杆菌使脂肪组织内脂肪氧化活化，抑制肠道二肽基肽酶-4的活性，增加胰高血糖素样肽-1。
4.一种生酸拟杆菌在制备用于脂肪氧化的组合物中的用途。
5.一种生酸拟杆菌在制备用于抑制二肽基肽酶-4的组合物中的用途。
6.一种生酸拟杆菌在制备用于改善或预防代谢性疾病的食品组合物中的用途。
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