CN1501922A

CN1501922A - 治疗剂

Info

Publication number: CN1501922A
Application number: CNA028081145A
Authority: CN
Inventors: ��Ұľ��; 大野木宏; 白发正宏; 佐川裕章; ֮; 加滕郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2004-06-02
Anticipated expiration: 2022-03-28
Also published as: JPWO2002083660A1; KR100715927B1; US20060199774A1; US7078386B2; WO2002083660A1; US20040122082A1; KR20060092291A; KR100768024B1; EP1386919A1; JP4358515B2; KR20040025914A; CN100516059C; EP1386919A4

Abstract

本发明涉及一种药物、食品、饮料或饲料，其对于需要增强NGF产生的疾病的治疗、症状改善、预防等有效，且以具有NGF产生增强作用的具备香豆素和/或苯并二氢吡喃骨架的化合物为有效成分。特别是确认本发明的有效成分没有毒性，也不用担心发生副作用，因此可以安全且适当地进行上述疾病的治疗等。

Description

治疗剂

技术领域

本发明涉及利用具有香豆素或苯并二氢吡喃骨架的化合物的神经生长因子产生增强作用的药物、食品、饮料或饲料。

背景技术

神经细胞对于维持人的智能、记忆、感情、行动等精神活动承担着主要的作用。认为在作为这些精神活动基础的神经细胞的分化、生存、功能表达中，对各种神经细胞特异的神经营养因子是必需的。神经营养因子中最初明确了其存在和功能的是神经生长因子(NerveGrowth Factor，以下简称为NGF)，现在发现了来源于脑的神经营养因子(Brain-derived-neurotrophic Factor)、神经营养蛋白(Neurotrophin)-3、神经营养蛋白-4/5等。

由于NGF是前脑基底部的巨细胞型胆碱能神经细胞的神经营养因子，因而与阿耳茨海默型痴呆症之间的关连受到瞩目〔Pharmacia，Vol.22，No.2，147～151(1986)、老年精神医学，Vol.3，No.6，751～758(1986)〕。

阿耳茨海默型痴呆症是指伴有发育障碍、病灶症状、下肢强直痉挛、癫痫样发作等临床症状，可见老年斑、阿耳茨海默原纤维变化等病理学表象的疾病，是老年性痴呆的一种疾病类型。在近年来的高龄化社会中可见增加的趋势，得到了社会的极大关心，但是尚未找到这种症状的改善方法、治疗方法。另外，对于少年性阿耳茨海默病也没有找到症状的改善方法、治疗方法。

确认在阿耳茨海默型痴呆症患者的脑中，以迈内特基底核为中心的前脑基底部显著变性，胆碱乙酰基转移酶(CAT)活性显著降低〔Annu.Rev.Neurosci.，Vol.3，77(1980)〕。1985年使用大鼠脑的研究表明NGF是脑的这一部位的神经营养因子〔EMBO J.，Vol.4，1389(1985)〕，NGF与该疾病的关连受到注目。另外，亨廷顿氏舞蹈病患者的脑的纹状体中，GABA能神经细胞的脱落以及胆碱能神经细胞的脱落显著，表明NGF也作用于纹状体的内在性胆碱能神经细胞〔Science，Vol.234，1341(1986)〕，指出该疾病可能与NGF有关。有报道指出用能够成为各种神经疾病模型的大鼠等动物研究了NGF的效果，如果大鼠神经细胞显著变性以前在脑内给予NGF，则可以抑制变性，防止CAT活性降低〔J.Neurosci.，Vol.6，2155(1986)、Brain Res.，Vol.293，305(1985)、Science，Vol.235，214(1986)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.83，9231(1986)〕。已经证明在末梢的交感神经支配组织和脑中生物合成NGF，该NGF的生物合成中末梢组织或脑组织的间质细胞即成纤维细胞或星形神经胶质细胞分别发挥重要作用〔J.Biol.Chem.，Vol.259，1259(1984)、Biochem.Biophys.Res.Commun.，Vol.136，57(1986)〕。另外，已经明确该成纤维细胞或星形神经胶质细胞产生的NGF的抗原性、分子量、等电点、生物活性与以前进行了充分研究的颚下腺NGF相同，而且通过在成纤维细胞(L-M细胞)以及星形神经胶质细胞的培养液中加入各种神经传导物质的实验，发现儿茶酚胺类(去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺)显示出NGF合成促进效果〔J.Biol.Chem.，Vol.201，6039(1986)〕。

这样，期待NGF在NGF作为神经营养因子发挥作用的部位发生变性的神经疾病中能够用作抑制变性的治疗药。另外，如脑血管障碍、脑肿瘤、脑栓塞(脑尖)、头部外伤变性疾病、麻醉药物中毒等脑神经细胞一旦发生变性，则一生也不能恢复，结果不仅智力低下、记忆缺陷，还会引起感情障碍、行动异常等各种障碍，但是神经纤维具有可塑性，如果受到损伤，则由其附近的健康正常纤维发芽，形成新的突触代替受伤的突触，因此这时期待能够使用NGF作为促进神经机能修复再生的治疗剂。

但是，将NGF应用于各种神经疾病的治疗时，NGF必须到达需要NGF的神经细胞非常近的地方，中枢神经疾病的场合也必须将NGF送到脑细胞的患处，但是通过血管系统不能将NGF送入脑内。这是由于脑内的血管内皮细胞相互紧密结合(称为血脑屏障)，水、气体、脂溶性物质以外的物质由血液向脑组织的移动受到限制，作为高分子物质的蛋白质(也包括NGF)完全不能通过血脑屏障。即使拥有现在的技术，采用外科方法将该NGF直接给予脑内，危险也过大。

另一方面，也不断开发了增强NGF产生的物质，而不直接给予NGF，但是其中多数是具有很强毒性或出现毒性的浓度与有效浓度非常接近的物质，或者是产生神经兴奋作用等对神经系统有非常严重的副作用的物质等，存在多种问题，至今尚未达到实用化。

发明公开

本发明的目的在于提供一种药物、食品、饮料或饲料，其对需要增强NGF产生的疾病的治疗、症状改善、预防等有效，且以具有NGF产生增强作用的化合物为有效成分。

本发明人经过悉心研究，结果发现具有香豆素和/或苯并二氢吡喃骨架的化合物具有NGF产生增强活性，从而完成了本发明。

也就是说，概述本发明的话，本发明的第1项发明涉及一种需要增强NGF产生的疾病的治疗剂或预防剂(本说明书中有时称为药物)，其特征在于，含有从(A)具有香豆素骨架的化合物、(B)具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物及它们的可药用盐中选择的至少一种化合物作为有效成分。

在本发明的第1项发明中，作为具有香豆素骨架的化合物，可以例举通式(I)或通式(II)表示的化合物。

(式中，R₁、R₂、R₃为氢原子、羟基、脂肪族基团、芳香族基团、芳香脂肪族基团或糖残基，各自可以相同，也可以不同)

(式中，R₄、R₅为氢原子、羟基、R_iO基、R_iiCOO基或糖残基，各自可以相同，也可以不同)

另外，作为通式(I)表示的化合物，特别合适的例如7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素(7-O-β-D-glucopyranosyloxy-8-prenyl coumarin)或者7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenylcoumarin)，作为通式(II)表示的化合物，特别合适的例如3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone(3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone)或者4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)。

在本发明的第1项发明中，作为具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物，可以例举通式(III)表示的化合物。

(式中，R₆为氢原子、羟基、羧基、脂肪族基团、芳香族基团、芳香脂肪族基团或糖残基。)

另外，作为通式(III)表示的化合物，特别合适的例如8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)或者3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)。

本发明的第2项、第3项发明涉及NGF产生增强剂、NGF产生增强用食品、饮料或饲料，其特征在于，含有与本发明的第1项发明相同的有效成分。

附图说明

图1是表示来源于当归根部的级分10的FAB-MS波谱的图。

图2是表示来源于当归根部的级分10的¹H-NMR波谱的图。

图3是表示来源于当归根部的级分13-2的FAB-MS波谱的图。

图4是表示来源于当归根部的级分13-2的¹H-NMR波谱的图。

图5是表示来源于当归根部的级分13-2的¹³C-NMR波谱的图。

图6是表示来源于当归根部的级分18-4的FAB-MS波谱的图。

图7是表示来源于当归根部的级分18-4的¹H-NMR波谱的图。

图8是表示来源于当归根部的级分18-4的¹³C-NMR波谱的图。

图9是表示来源于当归根部的级分19/20-5的FAB-MS波谱的图。

图10是表示来源于当归根部的级分19/20-5的¹H-NMR波谱的图。

图11是表示来源于当归根部的级分19/20-5的¹³C-NMR波谱的图。

图12是表示来源于当归根部的级分19/20-6的FAB-MS波谱的图。

图13是表示来源于当归根部的级分19/20-6的¹H-NMR波谱的图。

图14是表示来源于当归根部的级分19/20-6的¹³C-NMR波谱的图。

发明的最佳实施方式

在本说明书中，“NGF产生增强作用”以及“NGF产生增强活性”分别是指导致NGF产生增强以及增强NGF产生的功能，在其含义上并没有特别严格的区别。“增强”包括与本发明的有效成分作用前相比，在作用后目的物质的量增加的方式，以及通过使本发明的有效成分发挥作用产生目的物质的方式(诱导)。另外，本说明书中作为有效成分列举的任意一种物质可以单独或者2种以上混合用于本发明。

本发明中作为有效成分使用的化合物是选自(A)具有香豆素骨架的化合物、(B)具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物及它们的可药用盐中的至少一种化合物(以下有时称为本发明中使用的化合物)，只要具有NGF产生增强活性即可，没有特别的限定。另外，如下所述，也可以是能够作为前药发挥功能的该化合物的衍生物。因此，作为本发明的有效成分，包括上述(A)、(B)的化合物，和能够得到本发明所需效果的上述(A)、(B)化合物的衍生物以及它们的可药用盐。另外，本说明书中，“可药用”是指对生物体实质上无毒。另外，上述(A)、(B)化合物的光学异构体、酮-醇互变异构体、几何异构体等各种异构体、各种异构体的的混合物或单一体，只要具有NGF产生增强活性，均可以在本发明中使用。

本发明中，作为具有香豆素骨架的化合物没有特别的限定，例如上述通式(I)或(II)表示的化合物。

另一方面，作为具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物，没有特别的限定，例如上述通式(III)表示的化合物。

本说明书中，作为脂肪族基团，例如甲基、乙基、正丙基等碳原子数1～30的直链状烷基，异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、新戊基、叔戊基等支链状烷基，乙烯基、烯丙基、反-1-丙烯基、顺-1-丙烯基、顺-8-十七碳烯基、顺-8-顺-11-十七碳二烯基、顺-8-顺-11-顺-1 4-十七碳三烯基、顺-5-顺-8-顺-11-十七碳三烯基、顺-4-顺-7-顺-10-十九碳三烯基、顺-4-顺-7-顺-10-顺-13-十九碳四烯基、顺-4-顺-7-顺-10-顺-13-顺-16-十九碳七烯基、顺-12-二十一碳烯基、顺-3-顺-6-顺-9-顺-12-顺-15-顺-18-二十一碳六烯基等直链状烯基，异戊烯基、异丙烯基、顺-1-甲基-1-丙烯基、反-1-甲基-1-丙烯基、反-1-甲基-1-丙烯基、反-1-乙基-1-丙烯基等支链状烯基。从表现出本发明所需的效果的观点来看，作为所述脂肪族基团的优选实例，例如异戊烯基。

另外，作为芳香族基团，除苯基、萘基、联苯基以外，例如吡咯基、吡啶基、吲哚基、咪唑基、甲苯基、二甲苯基等。

作为芳香脂肪族基团的优选实例，可以例举碳原子数1～20的饱和或不饱和芳香脂肪族基团，特别合适的例如3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基。此外，可以例举烷基的碳原子数为1～20的苯基烷基(如苯甲基、苯乙基)、苯乙烯基、肉桂酰基等。

作为构成糖残基的糖，例如葡萄糖、苏阿糖、核糖、芹菜糖、阿洛糖、鼠李糖、吡喃阿拉伯糖、核酮糖、木糖、半乳糖、甘露糖、塔罗糖、岩藻糖、果糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等单糖，龙胆双糖、新橙皮糖(neohesperidose)、芸香糖、琼脂二糖、异麦芽糖、蔗糖、木二糖(xylobiose)、黑曲霉二糖、麦芽糖、乳糖等二糖，来源于琼脂糖、岩藻依聚糖等多糖的低聚糖，以及琼脂糖、岩藻依聚糖等多糖等。从表现出本发明所需效果的观点来看，作为所述糖的优选实例，可以例举葡萄糖、龙胆二糖。另外，作为糖残基，除了糖通过O-、N-、S-或C-糖苷键结合的化合物以外，还包括与糖的还原末端以外的碳通过C-C键结合的化合物。

作为R_iO基的R_i，可以例举上述例举的脂肪族基团、芳香族基团。

另外，作为R_iiCOO基的R_ii，可以例举上述例举的脂肪族基团、芳香族基团。从表现出本发明所需效果的观点来看，作为R_iiCOO基的优选实例，可以例举当归酰基。

而且，由本发明中使用的上述通式(I)、(II)和(III)表示的化合物，分别可以形成在体内容易水解，能够发挥所需效果的衍生物(前药)，例如成酯等。所述前药的制备可以采用公知方法(例如参照医药品的开发，第7卷，分子设计，163～198页，广川书店(Pharmaceutical Research and Development，Vol 7，Drug Designp163-198，HIROKAWA Publishing Co.))。另外，所述衍生物也可以是它们的盐。

作为上述通式(I)表示的化合物的特别合适的例子，例如7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素(7-O-β-D-glucopyranosyloxy-8-prenyl coumarin)或者7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenylcoumarin)。另外，作为上述通式(II)表示的化合物的合适例子，例如3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone(3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone)或者4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)。对于它们的结构式，分别按顺序如下述式(IV)～(VII)所示。

另外，作为上述通式(III)表示的化合物的合适例子，例如8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)或者3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)。例如，前者的结构式如下述式(VIII)所示。

如上所述，上述本发明的有效成分均具有NGF产生增强作用。该作用的表现例如可以通过后述实施例1-(2)所示的方法进行评价。

本发明中用作有效成分的化合物作为天然物存在时，例如可以由植物(如当归等伞形科植物)按照常规方法提取、精制得到。提取可以按照公知的方法，例如将原料粉碎或切碎后，使用溶剂，采用间歇式或连续式进行。作为提取溶剂，可以单独或作为混和液使用例如水、氯仿、乙醇、甲醇、异丙醇等醇类，丙酮、甲乙酮等酮类，乙酸甲酯、乙酸乙酯等亲水性或亲油性溶剂。提取温度可以根据需要适当设定，提取操作可以根据需要反复进行数次。作为精制方法，例如可以通过各种色谱法等进行分级、精制。

也就是说，例如，由当归精制本发明使用的化合物时，对当归根部进行以水为溶剂的提取操作，接着将得到的提取液通过反相色谱法进行分级、精制，可以得到本发明使用的化合物。

上述7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenyl coumarin)、4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyr8nosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)以及8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)是本发明首次由当归分离得到的化合物，并且首次确认了其NGF产生增强作用。本发明也包含这些化合物。

另外，作为本发明中可以用作有效成分的化合物，只要具有NGF产生增强活性，除了能够利用市售化合物以外，也能够以原香豆酸为原料，按照公知方法适当进行合成(参照Bull.Soc.，p2929(1971))。另外，也可以由双烯酮和苯酚的反应适当进行合成(参照J.Chem.Soc.，p854(1954))

作为本发明中使用的各种上述化合物的盐，例如碱金属盐、碱土金属盐、与有机碱形成的盐等。作为该盐，可以例举与钠、钾、钙、镁、铵或质子化的苄星(N，N’-二苯甲基乙二胺)、胆碱、乙醇胺、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄糖胺)、苯乙苄胺(N-苯甲基苯乙胺)、哌嗪或氨丁三醇(2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇)形成的盐。

NGF是维持神经细胞的生存和功能，或随着NGF的浓度梯度使神经细胞伸长的内因性生长因子，因此认为通过增强NGF的产生，可以治疗或预防阿耳茨海默病等老年性痴呆症、末梢神经障碍、脑血管障碍、脑肿瘤、脑栓塞(脑尖)、头部外伤变性疾病、麻醉药物中毒等需要修复或再生神经功能的疾病。另外，认为对于治疗或预防肌肉萎缩性侧索硬化症、药物障碍性末梢神经障碍、糖尿病性末梢神经障碍、帕金森氏病、感觉神经障碍、色素性视网膜症、黄斑变性症等也有用。由于本发明的有效成分具有NGF产生增强作用，因此，含有该有效成分的本发明的药物、食品、饮料或饲料所能够治疗或预防的疾病并没有特别限定，只要是通过进行NGP的产生增强就可以治疗或预防的疾病即可，但是对于这里具体例举的需要增强NGF产生的疾病的治疗、症状改善、预防等特别有效。另外，本发明的有效成分如下所述确认没有特别的毒性，也不必担心产生副作用。因而，可以安全且适当地进行NGF的产生增强。这是本发明的药物、食品、饮料或饲料的重要优点。

作为本发明的必须NGF产生增强的疾病的治疗剂或预防剂，可以例举将本发明的上述有效成分与公知的药用载体组合进行制剂得到的物质。在本发明的实施方式中，作为有效成分的盐使用药学上允许的盐。

本发明的治疗剂或预防剂的制备通常可以通过将上述有效成分与药学上允许的液状或固体状载体配合进行。此时，根据需要加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，可以制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂、常规溶液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂。另外，也可以制成使用前添加适当液体载体能够形成液状的干燥品以及其它外用制剂。

药用载体可以根据治疗剂或预防剂的给药方式和剂型进行选择。制成由固体组合物构成的口服制剂的场合，可以制成片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂等，可以利用例如淀粉、乳糖、白糖、甘露醇、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，配制口服制剂时，也可以进一步配合粘结剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂、香料等。例如，制成片剂或丸剂时，可以根据需要用蔗糖、明胶、羟丙基纤维素等糖衣或者胃溶性或肠溶性物质的膜包覆。制成由液体组合物构成的口服制剂的场合，可以制成药理学上允许的乳浊剂、溶液剂、悬浊剂、糖浆剂等，可以利用例如蒸馏水、乙醇等作为载体。另外，也可以根据需要进一步添加润湿剂、悬浮剂等助剂、甜味剂、风味剂、防腐剂等。

另一方面，制成非口服制剂的场合，可以按照常规方法使本发明的上述有效成分溶解或悬浊于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根据需要加入杀菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等进行配制。另外，也可以制备固体组合物，在使用前溶解于无菌水或无菌的注射用溶剂中后进行使用。

作为外用制剂，包括经皮给药用或经粘膜(口腔内、鼻腔内)给药用的固体、半固体状或液体状的制剂。另外，也包括栓剂等。例如，可以制成乳剂、洗剂等乳浊剂、外用酊剂、经粘膜给药用液体制剂等液体状制剂、油性软膏、亲水性软膏等软膏剂、膜剂、硬膏剂(带剂)、巴布剂等经皮给药用或经粘膜给药用的贴剂等。

以上各种制剂，可以分别利用公知的药用载体等，适当采用常规方法进行制备。另外，所述制剂中有效成分的含量考虑其给药形态、给药方法等，只要是能够以下述给药量范围给予该有效成分的量即可，并没有特别的限定。

本发明的治疗剂和预防剂可以根据制剂形态采用适当的给药途径给药。给药方法也没有特别的限定，可以内用、外用和注射。注射剂可以在如静脉内、肌肉内、皮下、皮内等给药，关于外用制剂，例如可以采用其适当的给药方法给予栓剂。

本发明的治疗剂或预防剂的给药量并不是一定的，可以根据其制剂形态、给药方法、使用目的以及该治疗剂或预防剂的给药对象即患者的年龄、体重、症状适当设定。一般，制剂中含有的上述有效成分的给药量，优选成人每天为0.1μg～200mg/kg体重。当然给药量根据种种条件变化，因此有时采用低于上述给药量的量就足够，或者有时必须超过上述范围。在所需的给药量范围内，可以1日内单次给药，或者分成数次给药。另外，本发明的治疗剂或预防剂除了直接口服给药之外，也可以添加到任意的饮食品中使之日常摄取。给与期间也可以根据出现所希望的效果适当确定。

另外，本发明还提供含有上述有效成分的NGF产生增强剂。作为该增强剂，可以是上述有效成分本身，另外也可以是含有上述有效成分的组合物。在本发明的方式中，作为有效成分的盐优选药理学上允许的盐。NGF产生增强剂例如可以将上述有效成分以及能够用于与该有效成分相同用途的其它成分等配合，按照上述治疗剂或预防剂的制备方法制成通常使用的试剂形态。所述增强剂中上述有效成分的含量考虑该增强剂的使用目的、使用方法等，只要是能够得到本发明所需效果的量即可，没有特别的限定。另外，该增强剂的用量也是只要能够得到本发明所需的效果即可，没有特别的限定。特别是给予生物体使用时，根据任意的给药方法，优选以能够在上述治疗剂或预防剂中有效成分的给药量范围内给予有效成分的量进行使用。NGF产生增强剂对于必须NGF产生增强的疾病中该生长因子的增强有用。另外，该增强剂对于有关NGF的疾病用药物的筛选也有用。而且，该增强剂对于有关NGF或神经细胞的物理变化的功能研究也有用。

而且，作为本发明的另一种方式，还提供将本发明的上述有效成分给予动物的NGF产生的增强方法。在本发明的方式中，作为有效成分的盐优选药理学上允许的盐。所述方法可以通过对预测必须增强NGF产生或者必须增强NGF产生的动物，给予上述有效成分进行，优选作为上述NGF产生增强剂给予，通过这种给药可以增强NGF的产生。有效成分的给药方法、给药量等可以与上述NGF产生增强剂的场合同样。另外，在NGF产生增强方法中，也可以使用本发明的治疗剂或预防剂、下述的食品、饮料或饲料。另外，作为“动物”，可以例举哺乳动物的人、狗、猫、牛、猪、马等，其中优选用于人。所述NGF产生增强方法对于例如治疗或预防必须NGF产生增强的疾病的NGF产生增强是有用的。另外，该增强方法对于有关NGF的疾病用药物的筛选有用。另外，该增强方法对于有关NGF或神经细胞的物理变化的功能研究也有用。

另外，本发明还提供含有、添加和/或稀释上述有效成分而成的NGF产生增强用食品、饮料或饲料。本发明的方式中，作为有效成分的盐优选药理学上允许的盐、或具有与其同等安全性的盐。本发明的食品、饮料或饲料由于其NGF产生增强作用，对于必须NGF产生增强的疾病的症状改善、预防非常有用。

另外，本说明书中，“含有”是指食品、饮料或饲料中含有本发明使用的有效成分这种方式，“添加”是指在食品、饮料或饲料的原料中添加本发明使用的有效成分这种方式，“稀释”是指在本发明使用的有效成分中添加食品、饮料或饲料的原料这种方式。

本发明的食品、饮料或饲料的制备方法没有特别的限定。例如可以按照配合、烹调、加工等一般食品、饮料或饲料的制备方法进行，只要可以按照这些制备方法进行制备，且制得的食品、饮料或饲料中含有具有NGF产生增强作用的本发明上述有效成分即可。

作为本发明的食品或饮料，没有特别的限定，例如含有本发明的上述有效成分的谷类加工品(小麦粉加工品、淀粉加工品、预混合加工品、面类、通心粉类、面包类、馅类、荞麦面类、麸子、米粉、粉条、包装饼等)，油脂加工品(增塑性油脂、油炸用油、色拉油、蛋黄酱类、调味汁等)，大豆加工品(豆腐类、豆酱、纳豆等)，肉类加工品(火腿、熏猪肉、压缩火腿、香肠等)，水产品(冷冻碎鱼肉、鱼糕、鱼卷、鱼肉山芋蒸饼、油炸鱼丸子、汆鱼丸子、饭卷、鱼肉火腿、香肠、干狐鲣、鱼子加工品、水产品罐头、煮的鱼贝等)，乳制品(原料乳、乳酪、酸乳、奶油、干酪、炼乳、乳粉、冰淇淋等)，蔬菜·果实加工品(馅类、果酱类、腌菜类、果类饮料、蔬菜饮料、混合饮料等)，糖果类(巧克力、饼干类、甜点类、蛋糕、年糕、米糕类等)，酒精饮料(日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌酒、日本蒸馏酒、伏特加酒、白兰地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清凉醇饮料、果酒、利口酒等)，嗜好饮料(绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)，调料(酱油、辣酱油、醋、料酒等)，罐装、瓶装、袋装食品(牛肉盖饭、小锅什锦饭、红小豆饭、咖哩饭、其它各种烹调好的食品)，半干燥或浓缩食品(肝酱、其它涂抹果酱的食品、荞麦·面条的汁、浓缩的汤类)，干燥食品(速食面类、速食咖哩饭、速溶咖啡、果汁粉、汤粉、速食酱类、烹调好的食品、烹调好的饮料、烹调好的汤等)，冷冻食品(素烧、蒸鸡蛋羹、烤鳗鱼串、汉堡包、烧麦、饺子、各种面条、鸡尾酒等)，固态食品、液态食品(汤等)，香辣料类等农产·林产加工品、畜牧加工品、水产加工品等。

在本发明的食品或饮料中，本发明用作有效成分的上述化合物可以含有、添加和/或稀释1种或数种，只要含有表达其NGF产生增强作用所必需的量即可，对其形状没有特别的限定，包括例如片状、颗粒状、胶囊状等形状的可以口服摄取的形状物。

本发明的食品或饮料中的上述有效成分的含量没有特别的限定，可以从其口感和活性表达的观点出发适当选择。例如食品中，优选0.00001重量％以上，更优选0.0001～10重量％，进一步优选0.0006～6重量％。另外，例如饮料中，优选0.00001重量％以上，更优选0.0001～10重量％，进一步优选0.0006～6重量％。希望摄取本发明的食品或饮料，使其中含有的有效成分的摄取量达到例如成人每天优选0.001～100mg/kg体重，更优选0.1～10mg/kg体重。

另外，本发明还提供一种含有、添加和/或稀释上述有效成分而成的具有NGF产生增强作用的生物用饲料，而且作为另一种方式，还提供一种生物的饲养方法，其特征在于，将上述有效成分给予生物。另外，作为本发明的另一种方式，还提供一种生物饲养用剂，其特征在于，含有上述有效成分。

在这些发明中，生物是指例如养殖动物、宠物等，作为养殖动物，例如家畜、试验动物、家禽、鱼类、甲壳类或贝类。作为饲料，例如身体状况的维持和/或改善用饲料。作为生物饲养用剂，例如浸渍用剂、饲料添加剂、饮料用添加剂。

按照这些发明，对于适用其的以上例举的生物，基于本发明使用的上述有效成分的NGF产生增强作用，可以期待出现与本发明的上述治疗剂或预防剂同样的效果。也就是说，具有治疗或预防该生物的需要NGF产生增强作用的疾病的效果。

本发明中使用的上述有效成分通常是每1kg对象生物的体重，每天优选给予0.01～2000mg。给药优选通过本发明的饲料进行。例如，可以通过将该有效成分添加、混合到供给对象生物的人工配合饲料的原料中，或与人工配合饲料的粉末原料混合后，再添加、混合到其它原料中进行。上述有效成分在饲料中的含量没有特别的限定，可以根据目的适当设定，优选0.001～15重量％的比例。

作为人工配合饲料，例如以鱼粉、酪蛋白、乌贼粉等动物性原料，大豆粕、小麦粉、淀粉等植物性原料，饲料用酵母等微生物原料，鳕鱼肝油、乌贼肝油等动物性油脂，大豆油、菜籽油等植物性油脂，维生素类、矿物类、氨基酸、抗氧化剂等为原料的人工配合饲料。另外，还例如鱼肉绞碎物等鱼类用饲料。

本发明饲料的制备方法没有特别的限定，另外配合只要按照一般饲料进行即可，只要制得的饲料中含有具有NGF产生增强作用的本发明的上述有效成分即可。

另外，也可以通过将具有NGF产生增强作用的本发明的上述有效成分直接添加到池塘、水槽、贮水池或饲养区域的水、海水等中，浸渍对象生物给药。这种浸渍方法在对象生物的饲料摄取量低下时特别有效。水或海水中具有NGF产生增强作用的本发明有效成分的浓度没有特别的限定，可以根据目的使用，优选0.00001～1重量％的比例。

另外，也可以将含有具有NGF产生增强作用的本发明的上述有效成分的饮料作为饲养用饮料使对象生物摄取。该饮料中具有NGF产生增强作用的本发明有效成分的浓度没有特别的限定，可以根据目的使用，优选0.0001～1重量％的比例。含有具有NGF产生增强作用的本发明上述有效成分的生物饲养用剂，例如浸渍用剂、饲料添加剂、饮料用添加剂可以按照其本身公知的配合和制备方法制备。该生物饲养用剂中有效成分的含量只要能够得到本发明所需的效果即可，并没有特别的限定。

本发明可以适用的生物没有限定，作为养殖动物，例如马、牛、猪，羊、山羊、骆驼、驼羊等家畜，小鼠、大鼠、土拨鼠、兔等实验动物，鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等家禽，真鲷、石鲷、比目鱼、鲽鱼、

鱼、黄尾笛鲷、黄条

、金枪鱼、大甲参、香鱼、鲑类、河豚、鳗鲡、泥鳅、鲇鱼等鱼类，对虾、黑虎虾、对虾(タィショゥェビ)、青蟹等甲壳类等，鲍、蝾螺、扇贝、牡蛎等贝类，作为宠物，例如狗、猫等，可以广泛适用于陆上、水中动物。

本发明的生物的饲养方法，可以通过使用本发明的上述饲料或生物饲养用剂，按照作为其使用方法具体例举的方法使生物摄取本发明的有效成分进行。

例如，通过使之摄取含有具有NGF产生增强作用的本发明使用的上述有效成分的饲料，或者将对象生物浸渍在含有具有NGF产生增强作用的本发明使用的上述有效成分的液体中，能够良好地维持或改善家畜、实验动物、家禽、鱼类、甲壳类、贝类、宠物等的身体状况。

而且，作为本发明的另一种方式，提供本发明的上述有效成分在制备必须NGF产生增强的疾病的治疗剂或预防剂、NGF产生增强剂或者NGF产生增强用食品、饮料或饲料中的用途。作为所述用途的方式，可以例举上述有效成分在制备本发明的上述治疗剂或预防剂、NGF产生增强剂或者NGF产生增强用食品、饮料或饲料中的用途的方式。例如，作为上述有效成分在制备必须NGF产生增强的疾病的治疗剂或预防剂或者NGF产生增强剂中的用途，可以例举在制备上述片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂、常规溶液剂、悬浊剂、乳剂等液体制剂，或使用前添加适当载体能够形成液状的干燥品中的用途。

本发明中使用的上述有效成分即使供于表达其作用的有效量，也确认没有毒性。例如口服给药的场合，即使将3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone、7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素、7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素、4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone、8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃、3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃或其光学活性体或它们的盐中任意一种对小鼠以1g/kg单次给药，也确认没有死亡例。另外，也确认没有发生副作用。

实施例

以下结合实施例更具体地说明本发明，但是本发明并不受这些记载的任何限定。另外，只要没有特殊情况，实施例中的％表示重量％。

制备例1来源于当归根部级分的分级

(1)向干燥当归根部粉末5.8kg中加入24L的乙酸乙酯，室温下提取3小时。向抽滤后的残渣中加入18L的乙醇，室温下提取一夜。接着，向抽滤后的残渣中加入52L的蒸馏水，在60℃下提取3小时。将除去固态残渣的液体部分用旋转式汽化器浓缩，向得到的物质中加入2.5倍量的乙醇，4℃下静置一夜。然后，通过抽滤分级成沉淀物和液体部分。将液体部分用旋转式汽化器浓缩干燥固化，得到当归根部水提取低分子级分。接着，将当归根部水提取低分子级分供于Amberlite XAD-2(Organo公司制：树脂量2L)，用蒸馏水30L充分冲洗非吸附物，接着用16L的甲醇洗脱吸附物。将甲醇洗脱液用旋转式汽化器浓缩干燥固化，得到当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物。

(2)使用反相色谱对制备例1-(1)记载的当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物进行分级。其条件如下所述。树脂使用Cosmosil140 C18-OPN(Nakalaitesque公司制：树脂量400ml)。将当归根部水提取低分子级分XAD-2处理物供于填充有上述树脂的柱，作为展开溶剂按照蒸馏水、20％乙腈水溶液、25％乙腈水溶液、40％乙腈水溶液、甲醇各1L的顺序进行洗脱，减压浓缩各洗脱级分，制得各Cosmosil分级物。

(3)使用反相色谱对制备例1-(2)得到的来自Cosmosil 140的25％乙腈水溶液洗脱级分进行分级。其条件如下所述。柱使用TSKgel ODS-80Ts(21.5mm×30cm：Tosoh公司制)。溶剂A(蒸馏水)和溶剂B(将蒸馏水和乙腈按体积比1比1混合得到的溶剂)的洗脱比为0分钟到120分钟将溶剂B比直线地从25％上升至100％，接着将溶剂B比在100％保持20分钟，最后使溶剂B比为25％，保持20分钟。洗脱速度为5ml/分钟，检测在235nm进行。以紫外线吸收为指标收集级分1～30。

实施例1 3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone(3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone)的NGF产生增强活性

(1)通过质量分析仪(DX302：日本电子社制)，采用FAB-MS方法，测定制备例1-(3)得到的来源于当归根部的级分10(含有保留时间62.2分钟的检测峰的级分)的质谱(MS)。使用甘油作为基质。结果检测出m/z 245(M-OGlc)⁺的峰。图1表示来源于当归根部的级分10的FAB-MS波谱。在图1中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。

使用核磁共振(NMR)波谱装置(JNM-A500：日本电子社制)，测定各种NMR波谱，对来源于当归根部的级分10进行结构解析。NMR的归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ1.36(3H，s，2’-CH₃)，1.37(3H，s，2’-CH₃)，3.08(2H，m，2”-Hおよび4”-H)，3.12(1H，m，3”-H)，3.41(1H，m，5”-H)，3.81(1H，d，J＝4.5Hz，3’-H)，4.11(1H，dd，J＝7.0，11.5Hz，6”-H)，4.35，(1H，brd，J＝11.5Hz，6’’-H)，4.53(1H，d，J＝7.5Hz，1”-H)，5.14(1H，d，J＝4.5Hz，4’-H)，6.28(1H，d，J＝9.5Hz，3-H)，6.78(1H，d，J＝8.5Hz，6-H)，7.54(1H，d，J＝8.5Hz，5-H)，7.98(1H，d，J＝9.5Hz，4-H)

其中，在¹H-NMR中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将残留二甲基亚砜的化学位移值表示为2.49ppm。图2表示来源于当归根部的级分10的¹H-NMR波谱。图2中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

对来源于当归根部的级分10进行MS波谱、NMR波谱解析的结果，确认是3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone(分子量424)。

(2)测定实施例1-(1)中确定了结构的来源于当归根部的级分10的NGF产生增强活性。将小鼠成纤维细胞L-M细胞(ATCC CCL-1.2)以1.5×10⁵细胞/ml悬浊于含有0.5％细胞培养用蛋白胨(Gibco公司制)的M199培养基(ICN公司制)中，在96孔板中分别接种0.1ml，进行无菌培养。培养3天后，除去培养基，更换为含有0.5％牛血清白蛋白(Sigma公司制)的M199培养基。向其中添加来源于当归根部的级分10作为试样，培养20小时。培养结束后，通过酶免疫测定法(NGFEmax Immuno Assay System：Promega公司制)测定培养液中的NGF浓度。以未添加试样的细胞培养液中的NGF浓度(对照的NGF产生量)为100％，表示添加试样时的NGF浓度(试样添加时的NGF产生量)，对试样的NGF产生增强活性进行评价。试样添加至最终浓度达到表1所示浓度。实验进行2次，取其平均值。结果确认来源于当归根部的级分10，即3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone具有NGF产生增强活性。其结果如表1所示。

表1

分级级分(检测峰：分) 浓度(mg/ml) NGF产生量(％)

级分10(62.2) 2.00 565.5

其中，对照的NGF产生量为0.382ng/ml

实施例2 7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素(7-O-β-D-glucopyranosyloxy-8-prenyl coumarin)的NGF产生增强活性

(1)使用反相色谱将制备例1-(3)得到的级分13(含有保留时间66.9分钟的检测峰的级分)进一步分级。其条件如下所述。柱使用TSK gel ODS-80TsQA(4.6mm×25cm：Tosoh公司制)。溶剂A(含有0.1％三氟醋酸的蒸馏水)和溶剂B(将蒸馏水和乙腈按体积比1比1混合得到的溶剂，含有0.1％的三氟醋酸)的洗脱比为将溶剂B比在50％保持20分钟。洗脱速度为1ml/分钟，检测在235nm进行，以紫外线吸收为指标收集级分13-1～13-8。

(2)按照与实施例1-(1)同样的方法测定实施例2-(1)得到的来源于当归根部的级分13-2(含有保留时间8.7分钟的峰的级分)的MS波谱、NMR波谱。

通过质量分析，检测出m/z 393(M+H)⁺的峰。图3表示来源于当归根部的级分13-2的MS波谱。在图3中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。

来源于当归根部的级分13-2的NMR归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ1.61(3H，s，3’-CH₃)，1.78(3H，s，3’-CH₃)，3.17(1H，t，J＝9.5Hz，4”-H)，3.28(1H，m，3”-H)，3.29(1H，m，2”-H)，3.38(1H，m，5”-H)，3.40(1H，m，1’-H)，3.46(1H，m，6”-H)，3.58(1H， m，1’-H)，3.69(1H，m，6”-H)，4.94(1H，d，J＝7.5Hz，1”-H)，5.20(1H，m，2’-H)，6.30(1H， d，J＝9.5Hz，3-H)，7.11(1H，d，J＝8.5Hz，6-H)，7.51(1H，d，J＝8.5Hz，5-H)，7.98(1H，d，J＝9.5Hz，4-H)

图4表示来源于当归根部的级分13-2的¹H-NMR波谱。在图4中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号的强度。

¹³C-NMR：δ17.8(3’-CH₃)，21.6(1’-c)，25.5(3’-CH₃)，60.6(6”-c)，69.7(4”-c)，73.4(2”-c)，76.7(3”-c)，77.1(5”-c)，100.8(1”-c)，111.5(6-c)，112.8(3-c)，113.4(10-c)，117.4(8-c)，121.3(2’-c)，126.8(5-c)，131.5(3’-c)，144.5(4-c)，152.1(9-c)，157.8(7-c)，160.2(2-c)

其中，在¹³C-NMR中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将重二甲基亚砜的化学位移值表示为39.5ppm。图5表示来源于当归根部的级分13-2的¹³C-NMR波谱。图5中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

对来源于当归根部的级分13-2进行MS波谱、NMR波谱解析的结果，确认是7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素(分子量392)。

(3)使用实施例2-(2)中确定了结构的来源于当归根部的级分13-2作为试样，采用与实施例1-(2)同样的方法测定其NGF产生增强活性。试样添加至最终浓度达到表2所示浓度。结果确认来源于当归根部的级分13-2，即7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素具有NGF产生增强活性。其结果如表2所示。

表2

分级级分(检测峰：分) 浓度(mg/ml) NGF产生量(％)

级分13-2(8.7) 1.00 792.1

其中，对照的NGF产生量为0.053ng/ml

实施例3 8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)的NGF产生增强活性

(1)按照与实施例2-(1)同样的方法，使用反相色谱将制备例1-(3)得到的级分18(含有保留时间73.0、73.8、74.97分钟的检测峰的级分)进一步分级成级分18-1～18-12。

(2)按照与实施例2-(2)同样的方法测定实施例3-(1)得到的来源于当归根部的级分18-4(含有保留时间10.9分钟的峰的级分)的MS波谱、NMR波谱。

通过质量分析，检测出m/z 253(M+H)⁺的峰。图6表示来源于当归根部的级分18-4的MS波谱。在图6中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。

NMR的归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ1.15(3H，s，2-CH₃)，1.27(3H，s，2-CH₃)，2.39(1H，dd，J＝8.0，17.0Hz，4-H)，2.76(1H，dd，J＝5.0，17.0Hz，4-H)，3.62(1H，m，3-H)，3.81(3H，s，5-OCH₃)，5.16(1H，d，J＝4.5Hz，3-OH)，6.56(1H，d，J＝9.0Hz，6-H)，7.59(1H，d，J＝9.0Hz，10-H)，11.86(1H，brs，8-COOH)

图7表示来源于当归根部的级分18-4的¹H-NMR波谱。在图7中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

¹³C-NMR：δ20.4(2-CH₃)，25.4(2-CH₃)，26.2(4-C)，55.7(5-OCH₃)，67.0(3-C)，77.6(2-C)，101.8(6-C)，109.4(10-C)，112.5(8-C)，130.7(7-C)，153.3(9-C)，160.4(5-C)，166.6(8-COOH)

图8表示来源于当归根部的级分18-4的¹³C-NMR波谱。图8中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

对来源于当归根部的级分18-4进行MS波谱、NMR波谱解析的结果，确认是8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(分子量252)。

(3)使用实施例3-(2)中确定了结构的来源于当归根部的级分18-4作为试样，采用与实施例1-(2)同样的方法测定其NGF产生增强活性。试样添加至最终浓度达到表3所示浓度。结果确认来源于当归根部的级分18-4，即8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃具有NGF产生增强活性。其结果如表3所示。

表3

分级级分(检测峰：分) 浓度(mg/ml) NGF产生量(％)

级分18-4(10.9) 0.0375 2510.4

其中，对照的NGF产生量为0.027ng/ml

实施例4 7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenyl coumarin)的NGF产生增强活性

(1)将制备例1-(3)得到的级分19(含有保留时间75.4分钟的检测峰的级分)、级分20(含有76.5分钟的检测峰的级分)混合，按照与实施例2-(1)同样的方法，使用反相色谱进一步分级成级分19/20-1～19/20-7。

(2)按照与实施例2-(2)同样的方法测定实施例4-(1)得到的来源于当归根部的级分19/20-5(含有保留时间16.4分钟的检测峰的级分)的MS波谱、NMR波谱。

通过质量分析，检测出m/z 393(M+H)⁺的峰。图9表示来源于当归根部的级分19/20-5的MS波谱。在图9中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。

NMR的归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ1.67(3H，s，3’-CH₃)，1.69(3H，s，3’-CH₃)，3.15(1H，m，4”-H)，3.29(3H，m，1’-H，2”-Hおよび3”-H)，3.37(1H，dd，J＝7.5，15.5Hz，1’-H)，3.45(2H，m，5”-Hおよび6”-H)，3.72(1H，dd，J＝10.5，6”-H)，4.97(1H，d，J＝7.5Hz，1”-H)，5.31(1H，t，J＝7.5Hz，2’-H)，6.28(1H，d，J＝9.0Hz，3-H)，7.07(1H，s，5-H)，7.41(1H，s，8-H)，7.98(1H，d，J＝9.0Hz，4-H)

图10表示来源于当归根部的级分19/20-5的¹H-NMR波谱。在图10中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

¹³C-NMR：δ17.6(3’-CH₃)，25.5(3’-CH₃)，27.4(1’-C)，60.6(6”-C)，69.6(4’’-C)，73.1(2”-C)，76.3(3”-C)，77.0(5”-C)，100.4(1”-C)，102.0(8-C)，112.8(10-C)，112.9(3-C)，121.8(2’-C)，127.4(6-C)，128.0(5-C)，132.4(3’-C)，144.4(4-C)，153.4(9-C)，157.9(7-C)，160.6(2-C)

图11表示来源于当归根部的级分19/20-5的¹³C-NMR波谱。图11中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

对来源于当归根部的级分19/20-5进行MS波谱、NMR波谱解析的结果，确认是7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(分子量392)。

(3)使用实施例4-(2)中确定了结构的来源于当归根部的级分19/20-5作为试样，采用与实施例1-(2)同样的方法测定其NGF产生增强活性。试样添加至最终浓度达到表4所示浓度。结果确认来源于当归根部的级分19/20-5，即7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素具有NGF产生增强活性。其结果如表4所示。

表4

分级级分(检测峰：分) 浓度(mg/ml) NGF产生量(％)

级分19、20-5(16.4) 1.00 487.9

其中，对照的NGF产生量为0.063ng/ml

实施例5 4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)的NGF产生增强活性

(1)按照与实施例2-(2)同样的方法测定实施例4-(1)得到的来源于当归根部的级分19/20-6(含有保留时间18.8分钟的检测峰的级分)的MS波谱、NMR波谱。

通过质量分析，检测出m/z 245(M-2Glc-Angel)⁺、669(M+H)⁺、691(M+Na)⁺、707(M+K)⁺的峰。图12表示来源于当归根部的级分19/20-6的MS波谱。在图12中，横轴表示m/z值，纵轴表示相对强度。

NMR的归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ1.36(3H，s，2’-CH₃)，1.43(3H，s，2’-CH₃)，1.79(3H，brs，2”-CH₃)，1.86(3H，brd，J＝7.0Hz，3”-CH₃)，2.90(1H，t，J＝8.0Hz，2b-H)，2.99(1H，m，2a-H)，3.01(1H，m，4a-H)，3.02(1H，m，4b-H)，3.05(1H，m，3b-H)，3.13(1H，t，J＝9.5Hz，3a-H)，3.35(1H，m，5a-H)，3.39(1H，m，5b-H)，3.39(1H，m，6b-H)，3.49(1H，dd，J＝8.0，11.0Hz，6a-H)，3.64(1H，d，J＝11.5Hz，6b-H)，4.02(1H，d，J＝11.0Hz，6a-H)，4.21(1H，d，J＝8.0Hz，1b-H)，4.37(1H，d，J＝4.5Hz，3’-H)，4.46(1H，brs，6b-OH)，4.48(1H，d，J＝7.5Hz，1a-H)，4.51(1H，brs，2a-OH)，4.72(1H，brs，3b-OH)，4.83(1H，brs，2b-OH)，4.86(1H，brs，4a-OH)，5.03(2H，brs，4b-OH，3a-OH)，5.96(1H，brq，J＝7.0Hz，3”-H)，6.26(1H，d，J＝9.5Hz，3-H)，6.61(1H，d，J＝4.5Hz，4’-H)，6.83(1H，d，J＝8.5Hz，6-H)，7.59(1H，d，J＝8.5Hz，5-H)，7.96(1H，d，J＝9.5Hz，4-H)

图13表示来源于当归根部的级分19/20-6的¹H-NMR波谱。在图13中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

¹³C-NMR：δ15.2(3”-CH₃)，20.0(2”-CH₃)，21.3(2’-CH₃)，26.4(2’-CH₃)，59.1(4’-C)，61.0(6b-C)，69.2(6a-C)，70.0(glucose-C)，70.4(glucose-C)，73.4(glucose-C)，73.7(3’-C)，73.9(glucose-C)，76.1(glucose-C)，76.55(glucose-C)，76.59(glucose-C)，76.8(glucose-C)，77.8(2’-C)，100.5(1a-C)，103.8(1b-C)，107.7(8-C)，112.1(3-C)，112.1(10-C)，114.2(6-C)，128.0(2”-C)，129.8(5-C)，136.1(3”-C)，144.5(4-C)，153.6(9-C)，156.2(7-C)，159.4(2-C)，166.3(1”-C)

图14表示来源于当归根部的级分19/20-6的¹³C-NMR波谱。图14中，横轴表示化学位移值(ppm)，纵轴表示信号强度。

对来源于当归根部的级分19/20-6进行MS波谱、NMR波谱解析的结果，确认是4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(分子量668)。

(2)使用实施例5-(1)中确定了结构的来源于当归根部的级分19/20-6作为试样，采用与实施例1-(2)同样的方法测定其NGF产生增强活性。试样添加至最终浓度达到表5所示浓度。结果确认来源于当归根部的级分19/20-6，即4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone具有NGF产生增强活性。其结果如表5所示。

表5

分级级分(检测峰：分) 浓度(mg/ml) NGF产生量(％)

级分19/20-6(18.8) 1.00 337.7

其中，对照的NGF产生量为0.063ng/ml

实施例6 3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)的NGF产生增强活性

(1)将制备例1-(1)得到的乙酸乙酯提取液用旋转式汽化器减压浓缩后，溶解于氯仿，使其全部吸附在硅胶BW-300SP(富士Silysia化学公司生产，750ml)上。接着，用己烷∶氯仿＝2∶5(750ml)、氯仿(1000ml)、氯仿∶甲醇＝10∶1(1100ml)对吸附物进行阶段性洗脱，将各洗脱级分减压浓缩，制得各硅胶分级物。

(2)将实施例6-(1)记载的氯仿∶甲醇＝10∶1洗脱级分溶解于氯仿30ml中，使用硅胶色谱对其中15ml进行分级。其条件如下所述。硅胶使用BW-300SP(300ml)。使用氯仿(1800ml)、氯仿∶甲醇＝500∶7(300ml)作为展开溶剂，按照这一顺序进行洗脱。接着，用乙酸乙酯(300ml)洗脱后，将各洗脱液减压浓缩，制得各硅胶柱分级物。

(3)将实施例6-(2)记载的乙酸乙酯洗脱级分溶解于氯仿∶甲醇＝50∶1(20ml)中，使用硅胶色谱进行分级。其条件如下所述。硅胶使用BW-300SP(300ml)。使用氯仿∶甲醇＝500∶10(1200ml)、氯仿∶甲醇＝500∶13(500ml)、氯仿∶甲醇＝500∶19(500ml)、氯仿∶甲醇＝500∶22(800ml)、乙酸乙酯(500ml)作为展开溶剂，按照这一顺序进行阶段性洗脱，按照每一级分18ml进行收集。将所得级分中级分号68～83合并，减压浓缩，溶解于10％乙醇水溶液中，得到级分68～83的10％乙醇水溶液。

(4)使用反相色谱对实施例6-(3)记载的10％乙醇水溶液进行分级。树脂使用Cosmosil 140 C18-OPN(Nakalaitesque公司制：树脂量50ml)。使用蒸馏水、10％乙醇水溶液、20％乙醇水溶液、30％乙醇水溶液、50％乙醇水溶液、乙醇各200ml作为展开溶剂，按照这一顺序进行洗脱，减压浓缩各洗脱级分，制得各Cosmosil分级物。

(5)使用乙酸乙酯和己烷，由实施例6-(4)的30％乙醇水溶液洗脱级分进行重结晶，得到化合物A 36mg。

(6)按照与实施例2-(2)同样的方法测定实施例6-(5)得到的化合物A的MS波谱、NMR波谱。另外，基质使用间硝基苯甲醇。通过质量分析，检测出m/z 355(M+H)⁺的峰。

NMR的归属信号如下所示。

¹H-NMR：δ1.25(3H，s，2-CH3)，1.32(3H，s，2-CH3)，2.47(1H，dd，J＝7.4，17.2Hz，4-H)，2.83(1H，dd，J＝5.4，17.2Hz，4-H)，3.70(1H，m，3-H)，3.85(3H，s，5-OCH3)，5.22(1H，d，J＝4.9Hz，3-OH)，6.65(1H，d，J＝8.7Hz，6-H)，6.84(2H，d，J＝8.6Hz，3”-Hおよび5”-H)，7.42(1H，d，J＝15.7Hz，2’-H)，7.46(1H，d，J＝15.7Hz，3’-H)，7.50(1H，d，J＝8.7Hz，7-H)，7.53(2H，d，J＝8.6Hz，2”-Hおよび6”-H)，10.02(1H，s，4”-OH)

¹³C-NMR：δ21.6(2-CH3)，26.3(2-CH3)，27.2(4-C)，56.6(5-OCH3)，67.8(3-C)，78.5(2-C)，103.4(6-C)，110.0(10-C)，116.8(3”-Cおよび5”-C)，122.4(8-C)，125.0(2’-C)，126.9(1”-C)，130.3(7-C)，130.8(2”-Cおよび6”-C)，141.9(3’-C)，153.8(9-C)，160.5(4”-C)，161.5(5-C)，190.4(1’-C)

其中，在¹³C-NMR中，试样溶解于重二甲基亚砜中，将重二甲基亚砜的化学位移值表示为2.50ppm。

(7)对化合物A进行MS波谱、NMR波谱解析的结果，确认是3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)(分子量354)。

(8)使用实施例6-(7)中确定了结构的3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)作为试样，采用与实施例1-(2)同样的方法测定其NGF产生增强活性。试样添加至最终浓度达到表6所示浓度。结果确认3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)具有NGF产生增强活性。其结果如表6所示。

表6

浓度(μM) NGF产生量(％)

200 457.7

其中，对照的NGF产生量为0.668ng/ml

工业实用性

本发明提供一种对于必须增强NGF产生的疾病的治疗等有效的药物、食品、饮料或饲料，其中含有具备香豆素和/或苯并二氢吡喃骨架的化合物。

该药物作为痴呆症或神经障碍等必须增强NGF产生的疾病的治疗剂或预防剂有用。另外，本发明也提供含有具备香豆素和/或苯并二氢吡喃骨架的化合物的NGF产生增强剂，该增强剂对于NGF的功能研究、与NGF相关的疾病用药物的筛选有用。

另外，该食品或饮料通过作为日常的饮食品进行摄取，对于改善必须增强NGF产生的疾病症状等有效。因此，以具备香豆素和/或苯并二氢吡喃骨架的化合物为有效成分的本发明饮食品是对于维持生物体的体内平衡有效的功能性饮食品。

本发明的饲料有助于通过其有效成分的NGF产生增强作用维持动物体的体内平衡。

Claims

1.一种需要增强神经生长因子产生的疾病的治疗剂或预防剂，其特征在于，含有选自(A)具有香豆素骨架的化合物、(B)具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物及它们的可药用盐中的至少一种化合物作为有效成分。

2.权利要求1所述的治疗剂或预防剂，具有香豆素骨架的化合物是通式(I)或通式(II)表示的化合物。

(式中，R₄、R₅为氢原子、羟基、R_iO基、R_iiCOO基(其中，R_i和R_ii为脂肪族基团或芳香族基团)或糖残基，各自可以相同，也可以不同)

3.权利要求2所述的治疗剂或预防剂，通式(I)表示的化合物为7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素(7-O-β-D-glucopyranosyloxy-8-prenyl coumarin)或者7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenylcoumarin)，通式(II)表示的化合物为3’-O-β-D-glucopyranoylkhellactone(3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone)或者4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)。

4.权利要求1所述的治疗剂或预防剂，具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物为通式(III)表示的化合物。

5.权利要求4所述的治疗剂或预防剂，通式(III)表示的化合物为8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)或者3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)。

6.一种神经生长因子产生增强剂，其特征在于，含有选自(A)具有香豆素骨架的化合物、(B)具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物及它们的可药用盐中的至少一种化合物作为有效成分。

7.权利要求6所述的神经生长因子产生增强剂，具有香豆素骨架的化合物是权利要求2所述的通式(I)或通式(II)表示的化合物。

8.权利要求7所述的神经生长因子产生增强剂，通式(I)表示的化合物为7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素(7-O-β-D-glucopyranosyloxy-8-prenyl coumarin)或者7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenyl coumarin)，通式(II)表示的化合物为3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone(3’-O-β-D-glucopyranoylkhellactone)或者4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)。

9.权利要求6所述的神经生长因子产生增强剂，具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物为权利要求4所述的通式(III)表示的化合物。

10.权利要求9所述的神经生长因子产生增强剂，通式(III)表示的化合物为8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)或者3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)。

11.一种神经生长因子产生增强用食品、饮料或饲料，其特征在于，含有选自(A)具有香豆素骨架的化合物、(B)具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物及它们的盐中的至少一种化合物作为有效成分。

12.权利要求11所述的神经生长因子产生增强用食品、饮料或饲料，具有香豆素骨架的化合物是权利要求2所述的通式(I)或通式(II)表示的化合物。

13.权利要求12所述的神经生长因子产生增强用食品、饮料或饲料，通式(I)表示的化合物为7-O-β-D-吡喃葡萄糖氧基-8-异戊烯基香豆素(7-O-β-D-glucopyranosyloxy-8-prenyl coumarin)或者7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenyl coumarin)，通式(II)表示的化合物为3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone(3’-O-β-D-glucopyranoyl khellactone)或者4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)。

14.权利要求11所述的神经生长因子产生增强用食品、饮料或饲料，具有2-二甲基苯并二氢吡喃骨架的化合物为权利要求4所述的通式(III)表示的化合物。

15.权利要求14所述的神经生长因子产生增强用食品、饮料或饲料，通式(III)表示的化合物为8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)或者3-羟基-8-[3-(4-羟基苯基)-丙烯酰基]-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(3-hydroxy-8-[3-(4-hydroxyphenyl)-acryloyl]-5-methoxy-2-dimethyl chroman)。

16. 7-β-D-吡喃葡萄糖氧基-6-异戊烯基香豆素(7-β-D-glucopyranosyloxy-6-prenyl coumarin)或其盐。

17. 4’-O-当归酰基-3’-O-[6-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-β-D-吡喃葡萄糖基]-khellactone(4’-O-angeloyl-3’-O-[6-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]-khellactone)或其盐。

18. 8-羧基-3-羟基-5-甲氧基-2-二甲基苯并二氢吡喃(8-carboxyl-3-hydroxy-5-methoxy-2-dimethyl chroman)或其盐。