KR102488267B1

KR102488267B1 - 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물

Info

Publication number: KR102488267B1
Application number: KR1020200111221A
Authority: KR
Inventors: 양영목; 강동영; 장경진; 스리칸탄 프리타 니핀; 김일호
Original assignee: 나라바이오 주식회사
Priority date: 2020-09-01
Filing date: 2020-09-01
Publication date: 2023-01-16
Also published as: KR20220029194A

Abstract

본 발명은 제독유황을 스트렙토마이세스균이 주종인 방선균으로 이루어진 유용 미생물군(EM: Effective Microorganism)에 의해 발효시킨 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다. 이에 의하여, 본 발명의 조성물은 Jak2/STAT5b/IGF-1 신호전달 경로의 발현을 상향 조절함으로써 성장호르몬 신호전달 능력을 증진시켜 성장을 촉진할 수 있다.

Description

제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물{COMPOSITION FOR GROWTH PROMOTING COMPRISING NON-TOXIC-SULFUR AN ACTIVE INGREDIENT}

본 발명은 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 동물의 세포 성장에 기여하여 사료 첨가제로 사용할 수 있는 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물에 관한 것이다.

유황은 오래 전부터 자연에 존재하였고, 인체는 물론 동식물의 중요한 구성성분이다. 오랫동안 인간은 이러한 유황의 가치를 알아보고 여러 형태로 가공하여 사용해왔고 오늘날 화장품이나 건강식품에 이르기까지 다양한 산업분야에서 널리 사용되고 있다.

이러한 유황은 독성을 가지고 있어 사람에게는 부작용을 일으키는 경우가 많았으나 기술의 발전으로 독성이 제거된 제독유황을 만들었다. 의학적으로 동식물을 섭취함으로써 간접적으로 황을 섭취했을 때의 유익한 효과가 알려지면서 이에 대한 연구가 활발히 진행되었으나 정작 구체적인 메커니즘이나 인체에서 어떤 역할을 하는지 알 수 없었다. 심지어 세포실험을 위해 어떤 용매가 적절한지에 대한 연구 조차 없는 실정이다.

광물질 유황은 열독성이 매우 강하여 법제과정이 선행되지 않고서는 내복 할 수 없음은 물론 법제하지 않은 유황을 가축류나 가금류에 급여하는 경우 거의 100％ 사멸된다.

따라서, 종래에는 독물의 취급에 사용되는 사기그릇에 유황을 투입하고 밀봉하여 약 48시간 동안 가열하여 구워낸 후, 이를 분말화 하는 공지된 유황의 법제방법에 따라 유황을 법제하여 독성을 감소시켜 이를 사료의 일부로 급여하여 가축류나 가금류를 사육하여 그로부터 유황성분을 함유하는 식용육을 건강식으로 보급하고 있다.

그러나, 이렇게 법제하여 독성을 감소시킨 유황을 가축류나 가금류에 급여하는 경우에도 사멸율이 매우 높기 때문에 급여량에 제한을 두어야 하였다. 종래의 법제된 유황의 급여량은 일반적으로 독성물질에 대해 높은 내성을 갖는 것으로 알려진 오리에 대하여도 1일 최대 10g을 넘지 못하는 것으로 알려져 왔다.

또한, 이러한 종래의 유황의 법제방법 및 법제된 유황을 이용한 사육방법에 따르면, 법제된 유황을 사용하여도 사멸율이 최소 30％이상으로 높게 나타나 법제된 유황의 급여량에 상당한 제한이 따르고, 급여된 유황도 거의 2시간 이내에 배설물과 함께 배설되어 잔류효과가 적어지는 등의 문제점이 있었다.

따라서 가축의 사료에 혼합하여 급여하여도 안전하면서도 가축 성장에 유익한 유황의 제조방법이 필요하다.

한국등록특허 제10-1642113호

본 발명의 목적은 성장호르몬(GH)과 유사한 역할을 수행하여 동물의 성장을 촉진시킬 수 있는 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 발효 제독유황을 유효성분을 포함하는 조성물을 가축 사료 첨가제로 제조하여 가축의 성장을 촉진함으로써 축산업의 효율을 높이는 데 있다.

본 발명의 하나의 측면에 따르면,

제독유황을 스트렙토마이세스균이 주종인 방선균으로 이루어진 유용 미생물군(EM: Effective Microorganism)에 의해 발효시킨 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물이 제공된다.

상기 제독유황은 소나무 추출물; 쑥 및 상황버섯의 혼합 추출물; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및 침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 의해 제독된 유황일 수 있다.

이때, 상기 혼합 생약추출물은 소나무 추출물 100중량부에 대하여,

쑥 및 상황버섯의 혼합 추출물 40 내지 60중량부; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물 30 내지 50; 및 침향 추출물 5 내지 15중량부;를 포함할 수 있다.

상기 제독유황은 소나무 추출물; 익모초 추출물; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및 침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 의해 제독된 유황일 수 있다.

익모초 추출물 40 내지 60중량부; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물 30 내지 50; 및 침향 추출물 5 내지 15중량부;를 포함할 수 있다.

상기 발효 제독유황은 성장호르몬 수용체(GHR), Jak2(Janus kinase 2), STAT5b, 및 IGF-1(insulin-like growth factor 1)의 발현을 상향 조절할 수 있다.

상기 발효 제독유황은 Jak2, STAT5b, IGF-1로 순차적으로 전달되는 신호전달 경로를 조절할 수 있다.

상기 발효 제독유황은 STAT5b와 IGF-1 유전자의 복합체 형성을 촉진할 수 있다.

상기 발효 제독유황은 STAT5b의 발현에 의존하여 성장호르몬 수용체(GHR)와 IGF-1 발현을 조절할 수 있다.

상기 발효 제독유황은 동물 사료 첨가용일 수 있다.

본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,

상기 성장 촉진용 조성물을 포함하는 성장 촉진용 약학 조성물이 제공된다.

상기 약학 조성물은 성장호르몬 결핍증(growth hormone deficiency) 예방 또는 치료용일 수 있다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

상기 성장 촉진용 조성물을 포함하는 성장 촉진용 식품 조성물이 제공된다.

상기 식품 조성물은 성장호르몬 결핍증(growth hormone deficiency) 예방 또는 개선용일 수 있다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

상기 성장 촉진용 조성물을 포함하는 동물용 사료 첨가제가 제공된다.

본 발명의 다른 또 하나의 측면에 따르면,

제독유황을 스트렙토마이세스균이 주종인 방선균으로 이루어진 유용 미생물군(EM: Effective Microorganism)에 의해 발효시켜 발효 제독 유황을 제조하는 단계를 포함하는 성장 촉진용 조성물의 제조방법이 제공된다.

상기 제독유황은 소나무 추출물; 쑥 및 상황버섯의 혼합 추출물; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및 침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 유황을 넣어 제독 처리한 유황 침전물일 수 있다.

상기 제독유황은 소나무 추출물; 익모초 추출물; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및 침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 유황을 넣어 제독 처리한 유황 침전물일 수 있다.

본 발명의 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 조성물은 동물 근육세포에서 Jak2/STAT5b/IGF-1 신호전달 경로의 발현을 상향 조절함으로써 성장호르몬 신호전달 능력을 증진시킴으로써 결과적으로 동물의 성장을 촉진시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 조성물에 사용된 제독유황(Non-toxic-sulfur, NTS)의 세포성장 유도 매커니즘을 나타낸 개략도이다.
도 2는 실험예 1의 용매에 따른 제독유황의 용해 정도를 나타낸 사진이다.
도 3은 실험예 2에 따른 세포독성 실험 결과이다.
도 4는 실험예 3의 발효 제독유황 조성물 처리에 따른 신호전달 단백질의 발현 분석 결과이다.
도 5는 실험예 3의 발효 제독유황 및 성장호르몬 처리 따른 신호전달 단백질의 발현 분석 비교 결과이다.
도 6은 실험예 4에 따른 IGF-1 mRNA의 발현 정도 분석 결과이다.
도 7은 실험예 5에 따른 STAT5b/IGF-1 복합체 형성 분석 결과이다.
도 8은 실험예 6의 STAT5b 과발현에 따른 세포성장 신호 단백질 발현 분석 결과이다.
도 9는 실험예 7의 STAT5b 억제에 따른 세포성장 신호 단백질 발현 분석 결과이다.

도 1은 본 발명의 조성물에 적용되는 제독유황(Non-toxic-sulfur, NTS)의 세포성장 유도 매커니즘을 나타낸 개략도이다. 이하, 도 1을 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 성장 촉진용 조성물은 제독유황을 스트렙토마이세스균이 주종인 방선균으로 이루어진 유용 미생물군(EM: Effective Microorganism)에 의해 발효시킨 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 한다.

한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 제독유황의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 제독유황은 10 내지 1500 ㎍/㎖, 바람직하게는 100 내지 1000 ㎍/㎖의 농도로 사용된다. 본 발명의 조성물 내에 포함되는 제독유황의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.

일 구현예로서, 상기 제독유황은 소나무 추출물; 쑥 및 상황버섯의 혼합 추출물; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및 침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 의해 제독된 유황일 수 있다.

바람직하게는, 상기 혼합 생약추출물은 소나무 추출물 100중량부에 대하여, 쑥 및 상황버섯의 혼합 추출물 40 내지 60중량부; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물 30 내지 50; 및 침향 추출물 5 내지 15중량부;를 포함할 수 있다.

다른 일 구현예로서, 상기 제독유황은 상기 제독유황은 소나무 추출물; 익모초 추출물; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및 침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 의해 제독된 유황일 수 있다.

바람직하게는, 상기 혼합 생약추출물은 상기 혼합 생약추출물은 소나무 추출물 100중량부에 대하여, 익모초 추출물 40 내지 60중량부; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물 30 내지 50; 및 침향 추출물 5 내지 15중량부;를 포함할 수 있다.

더욱 바람직하게는 상기 혼합 생약추출물은 익모초 추출물 보다 쑥 및 상황버섯의 혼합 추출물을 포함할 수 있다. 이와 같은 제독유황을 사용하는 경우 최종 제조된 성장 촉진용 조성물의 성장 촉진 효과가 더욱 향상될 수 있다.

상기 발효 제독유황은 성장호르몬 수용체(GHR), Jak2, STAT5b, 및 IGF-1의 발현을 상향 조절하는 것을 특징으로 한다.

상기 발효 제독유황은 Jak2, STAT5b, IGF-1로 전달되는 신호전달 경로를 조절할 수 있다.

상기 발효 제독유황은 STAT5b와 IGF-1 유전자의 복합체 형성을 촉진함으로써 IGF-1의 발현을 증가시킬 수 있다.

상기 발효 제독유황은 STAT5b의 발현에 의존하여 성장호르몬 수용체(GHR)와 IGF-1 발현이 조절되는 것을 특징으로 한다.

상기 발효 제독유황은 동물 사료 첨가용으로 사용할 수 있다.

구체적으로, 도 1을 참조하여 제독유황의 성장 유도에 대한 매커니즘을 살펴보면, 먼저 제독유황(NTS)이 세포막을 통과하면 Jak2(Janus kinase 2) 효소가 활성을 띠며 인산화되고 리쿠르트(recruit)를 하게 된다. 즉, 세포 신호전달 및 유전자의 전사 활성이라는 두 가지의 기능을 가진 STAT5b 단백질을 세포질에서 다수 모집을 하고 인산화 시키는 것이다. 이와 같이 인산화된 STAT5b 단백질(pSTAT5)은 세포질에서 세포 핵막을 통과하여 모든 유전자(Gene)가 위치하는 핵 속으로 이동한다. 세포핵으로 들어온 pSTAT5 단백질은 핵 속에 있는 염색체에 위치한 타겟(target) 유전자인 IGF-1 유전자와 결합(binding)한다. IGF-1 유전자의 프로모터(promotor) 부위의 GAS 요소(TTCNNNGAA 라는 염기로 구성됨)에 결합한 pSTAT5 단백질은 IGF-1 유전자의 전사(transcription) 활성을 유도하게 된다. 이와 같은 IGF-1 유전자의 발현은 성장호르몬(GH)의 신호전달을 유도하여 결과적으로 세포성장을 촉진하게 된다.

또한, 본 발명은 상술한 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물을 포함하는 성장 촉진용 약학 조성물을 제공한다.

상기 약학 조성물은 성장호르몬 결핍증(growth hormone deficiency) 예방 또는 치료용도로 사용될 수 있다. 상기 성장 장애는 성장호르몬 결핍증(growth hormone deficiency)에 의한 성장 장애일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/㎏이다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명은 상술한 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물 식품 조성물을 제공한다.

상기 발효 제독유황은 동물의 성장을 촉진하므로 성장 장애의 예방 또는 개선 용도로 사용될 수 있다. 상기 성장 장애는 성장호르몬 결핍증(growth hormone deficiency)에 의한 성장 장애일 수 있다.

본 발명에 따른 식품 조성물은 하기 약학 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 제독유황뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 제독유황 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명은 상술한 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 성장 촉진용 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 상기 발효 제독유황을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 발효 제독유황의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.

또한, 본 발명은 상술한 발효 제독유황을 유효성분으로 포함하는 조성물을 포함하는 동물용 사료 첨가제를 제공한다. 상기 동물은 포유류, 어류, 파충류, 조류 등일 수 있으나, 바람직하게는 포유류일 수 있다.

또한, 본 발명은 성장 촉진용 의약 또는 식품의 제조를 위한 상기 발효 제독유황의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 발효 제독유황은 성장 촉진과 성장 저하와 관련된 질환의 치료 또는 개선을 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 발효 제독유황을 투여하는 것을 포함하는 성장호르몬 결핍증(growth hormone deficiency)의 치료 방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 추출물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 발효 제독유황을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명은 제독유황을 스트렙토마이세스균이 주종인 방선균으로 이루어진 유용 미생물군(EM: Effective Microorganism)에 의해 발효시켜 발효 제독 유황을 제조하는 단계를 포함하는 성장 촉진용 조성물의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

[실시예]

제조예 1: 제독유황(NTS)의 제조

(1) 생약 추출물 혼합액 준비

물 1ℓ에 소나무 껍질 15g을 넣고 1시간 동안 삶아서 식혀 소나무 추출액을 준비하였다.

쑥 건조분말 3g과 상황버섯 건조분말 2g을 물 1ℓ에 넣어 혼합한 다음 50시간 방치시켜 침전물을 가라앉히고 상부에 뜬 맑은 액체만을 분리한 쑥+상황버섯 혼합 추출액을 준비하였다.

검정콩 건조분말 3g, 생녹두 건조분말 5g, 삼백탕 건조분말 5g을 물 1ℓ에 넣어 혼합한 다음 30시간 방치시켜 침전물을 가라앉히고 상부에 뜬 맑은 액체만을 분리한 검정콩+생녹두+삼백탕 혼합 추출액을 준비하였다.

침향 건조분말 5g을 물 1ℓ에 넣어 12시간 방치하고 침전물을 가라앉힌 침향 추출물을 준비하였다.

준비된 소나무 추출액 : 쑥+상황버섯 혼합 추출액 : 검정콩+생녹두+삼백탕 혼합 추출액 : 침향 추출액 = 50:25:20:5의 중량비로 혼합하여 생약 추출물 혼합액을 제조하였다.

(2) 유황 침전물 제조

상기 생약 추출물 혼합액 100중량부에 대하여 유황 40중량부, 디메틸설폭사이드(DMSO) 20중량부를 혼합하여 20℃의 맑은 물에서 6시간 침전시켜 유황 침전물을 제조하였다.

(3) 숙성단계

상기 유황 침전물을 6시간 동안 끓이고 탕제포대에 넣어 3시간 동안 20℃의 맑은 물에서 6시간 침전시켜 숙성된 유황 침전물을 수득하였다.

(4) 건조단계

상기 숙성된 유황 침전물을 원심분리기를 이용하여 건조시켰다.

제조예 2: 제독유황(NTS)의 제조

쑥+상황버섯 혼합 추출액 대신에 익모초 건조분말 5g을 이용한 익모초 추출액을 사용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 조건으로 제독유황을 제조하였다.

실시예 1: 제독유황(NTS)을 포함하는 사료 첨가용 조성물(NTS-C1)의 제조

게르마늄, 스트렙토마이세스균이 주종인 방선균으로 이루어진 유용 미생물군(EM: Effective Microorganism), 황설탕 9.9925kg, 천일염 0.0030 kg, 0.0045kg의 유황을 저장조에 투입하여 72시간 동안 발효시켰다.

제조된 발효물을 가열탱크 내에서 90℃로 5분 동안 가열하여 발효물 내 유용 미생물군을 살균시키고, 3℃로 급속 냉각시켰다.

냉각된 발효물 10kg에 제조예 1의 제독유황 2kg을 혼합하고, 나노 가공기계를 이용해 평균 입도 4,000메쉬인 사료 첨가용 조성물을 제조하였다.

실시예 2: 제독유황을 포함하는 사료 첨가용 조성물(NTS-C2)의 제조

제조예 1의 제독유황 대신에 제조예 2의 제독유황을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 사료 첨가용 조성물을 제조하였다.

비교예 1: 유황을 포함하는 사료 첨가용 조성물(C3)의 제조

제독 과정을 거치지 않은 유황을 그대로 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 조건으로 사료 첨가용 조성물을 제조하였다.

[실험예]

실험예 1: 제독유황(NTS)의 용매 선택

세포 내 실험을 위해서는 제독유황을 용해하는 것이 필수적이다.

아래의 표 1 및 표 2는 NTS (Non-toxic sulfur; 제독유황)의 용매를 찾기 위한 실험결과로 상온의 증류수, 뜨거운 증류수, 에탄올 및 DMSO를 각각 사용하였다. 다른 용매에서는 반응이 일어나지 않거나 응고되는 형태를 보였으며 DMSO에서는 24시간이 지난 후 1 mg/㎖ 이하의 농도에서 용해되는 것을 확인했다. 용해 실험 결과에서 Х는 전혀 용해되지 않은 것, β는 불완전 용해된 것, ○는 완전히 용해된 것을 의미한다.

도 2의 (a)는 하기 표 2의 DMSO 용매에서 제독유황(NTS) 농도에 따른 용해 결과를 나타낸 사진을 나타낸 것으로, 좌측으로부터 제독유황(NTS)의 농도가 0.5, 1, 5, 10, 50. 100mg/㎖인 것이다. 또한 (b)는 증류수를 용매로 사용한 경우 제독유황(NTS)의 농도를 1, 2, 5, 10 mg/㎖ 로 달리한 경우의 사진이다. 물을 반응시킨 경우 뿌옇게 변하며 용해가 제대로 이루어지지 않음을 알 수 있다.

Solvent

D.W

Hot D.W

DMSO

Ethanol

NTS (mg/㎖)

1

2

5

1

2

5

1

2

5

1

2

5

Result

x

o

β

x

β

x

Solvent	DMSO
NTS (mg/㎖)	0.5	1	5	10	50	100
Result	o	o	x	x	x	x

이와 같은 결과에 따르면, 제독유황을 용해시키는 용매는 디메틸설폭사이드(DMSO)가 적합하며, 적정농도는 1 mg/㎖ 이며, 24시간 동안 충분히 반응시켜야 함을 알 수 있었고, DMSO의 순도는 높을수록 용해가 잘 이루어짐을 알 수 있었다.

실험예 2: 세포독성 실험

실험에 사용될 마우스 근육 세포인 C2C12 세포(ATCC CRL-1772)를 10% FBS, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신이 추가된 DMEM에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하고 70~80%의 세포 밀집도에 이르면 PBS로 부드럽게 세척하였다. 분화 연구를 위하여 85% 밀집도가 된 경우 2%의 말 혈청(분화 배지)으로 옮기고 신선한 배지에 실시예 1에 따라 제조된 사료 첨가용 조성물(NTS-C1)을 처리하였다.

달리 명시하지 않는 한 세포는 37℃에서 24시간 동안 99.9% DMSO (SigmaAldrich; MerckKGaA)에서 처리된 것이며, 이하 다른 실험예에서도 동일한 방식으로 실험을 수행하였다.

세포독성 실험은 MTT 분석에 의해 수행되었다. 실험 전날, 세포는 24well 배양 플레이트에 1x10⁴ cells/well의 밀도로 DMEM에 다시 현탁하였다. 다음날, 배지를 신선한 DMEM만으로 대체시키거나(vehicle control), 또는 제조예 1의 제독유황(NTS)을 0.1 내지 10 ㎍/㎖의 다른 농도로 처리하였다 다음으로 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, MTT(5 mg/㎖)를 추가하고 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 포르마잔(formazan) 생성물은 DMSO 에 용해시켰다. 또한 Ultra Multifunctional Microplate Reader (Tecan US, Inc.)를 사용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였다. 모든 측정은 3 회 반복 수행하였다.

실시예 1에 따라 제조된 사료 첨가용 조성물(NTS-C1)의 농도에 따른 세포 생존율을 아래의 표 3과 도 3에 나타내었다.

NTS (㎍/㎖)	DMSO (%)	NTS (%)
-	100.0	100.0
0.1	98.9	92.4
0.2	99.1	88.7
0.5	98.3	83.1
1	98.5	81.2
2	94.4	79.1
5	87.1	73.4
10	80.2	70.2

이에 따르면, 실시예 1에 따라 제조된 사료 첨가용 조성물(NTS-C1) 농도 0.1 내지 0.5 ㎍/㎖에서 24시간 처리하였을 때 C2C12 세포에서 세포독성이 8 내지 17%를 나타내었다(***P<0.001).

실험예 3: 신호전달 단백질의 발현 분석

웨스턴 블로팅 분석은 아래와 같은 방법으로 수행되었으며, 이하 다른 실험예에서도 동일한 방법으로 수행되었다.

먼저, 얼음상에서 포스파타제 및 프로테아제 억제제를 함유하는 Radioimmunoprecipitation assay buffer (EMD Millipore)에서 미처리 또는 실시예 1에 따라 제조된 사료 첨가용 조성물(NTS-C1) 처리된 마우스 근육 세포로부터 Whole cell lysates를 제조하였다.

바늘과 세포 용해물(lysate)을 18,300 x g에서 4℃로 10분간 원심분리하여 세포 파편을 제거하였다. 단백질 농도는 Bradford method (Thermo Fisher Scientific, Inc.)으로 측정하였다. 동일한 양의 단백질 (100 ㎍ / 레인)을 10 % SDS-PAGE로 분리하고 니트로 셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 TBST buffer (20 mM TrisHCl, pH 7.6, 137 mM NaCl, 0.1X Tween20)에서 5% skimmed milk (BD Biosciences)로 블록(blocked) 하였다. 멤브레인을 5 % bovine serum albumin (EMD Millipore) 또는 탈지유에 희석된 관련 1차 항체로 4℃에서 밤새 프로브하고, TBS-T로 세척하고, horseradish peroxidase-결합된 2차 항체와 함께 1 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 시각화는 Enhanced Chemiluminescence Plus detection kit (Amersham; GE Healthcare)와 ImageQuant LAS4000 imaging device (Fujifilm)를 이용하여 수행하고, 블롯은 Restore Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 사용하여 스트리핑되었다.

실험예 2의 결과에 근거하여 실시예 1에 따라 제조된 사료 첨가용 조성물(NTS-C1)을 0.05 - 0.5 ㎍/㎖로 24시간 동안 처리한 C2C12 세포의 세포질 단백질 발현을 분석하기 위해 웨스턴 블로팅(western blotting)을 수행하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 여기서 NTS-C1은 실시예 1에 따라 제조된 사료 첨가용 조성물, GHR는 성장호르몬 수용체(growth hormone receptor), IGF-1는 인슐린유사성장요소-1(insulin-like growth factor-1), IGF-1Rβ는 인슐린유사성장요소-1 수용체 β(insulin-like growth factor-1 receptor β), Jak2 는 야누스 키나아제 2(Janus kinase 2), p는 인산화된(phosphorylated) 것을 의미한다.

이에 따르면, 실시예 1의 NTS-C1 농도가 증가할수록 C2C12 세포에서 GHR, IGF-1 및 pSTAT5 발현 수준이 증가하였다^(***P<0.001). 0.2 ㎍/㎖ NTS-C1 처리군에서 성장호르몬 수용체(GHR), pSTAT5 및 IGF-1의 발현이 가장 높은 것으로 나타났다. 0.2 ㎍/㎖ 농도에서 대조군 대비 GHR은 약 3배 증가하고, IGF-1은 2.5배 증가하였으며, pSTAT5는 4.5배 증가한 것으로 나타났다.

한편, 상기 결과와 같이 NTS-C1이 GHR, pSTAT5 및 IGF-1의 수준을 증가시킴을 확인하였고, 따라서 NTS-C1이 성장호르몬(GH) 신호 전달과 유사한 효과를 가질 수 있다고 추측하였다.

따라서 0.2 ㎍/㎖ NTS-C1, 0.1 ㎍/㎖ 성장호르몬(GH) 처리로 세포를 분석하는 웨스턴 블로팅을 수행하여 그 결과를 도 5에 나타내었다. 이에 따르면, 성장호르몬(GH) 처리군과 실시예 1의 NTS-C1 처리군 모두 성장호르몬 수용체(GHR), IGF-1 및 pSTAT5 단백질을 증가시키는 것으로 나타나 NTS-C1이 성장호르몬 수용체와 유사한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고, NTS-C1 처리군의 경우 대조군 대비 주요 단백질 발현량이 4~15배 증가한 것으로 나타났다(^***P<0.001 among all groups; ^#P<0.001 vs. control).

실험예 4: IGF-1 mRNA의 발현 정도 분석

RTPCR(Reverse transcription-polymerase chain reaction)은 아래와 같은 방법으로 수행하였으며, 구체적으로, 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy Mini 키트 (Qiagen GmbH)를 사용하여 세포로부터 총 RNA를 추출하고 260nm에서 분광 광도계로 정량화하였다. IGF-1 및 GAPDH RNA 발현을 검출하기 위해 RT-PCR 분석을 수행하였다. 요약하면, cDNA는 제1 가닥 cDNA 합성 키트(카탈로그 번호 K-2041; Bioeer Corporation) 및 올리고 d (T) 프라이머를 사용하여 42℃에서 1시간 동안, 및 95℃에서 5분 동안 총 RNA로부터 합성되었다. RTPCR Premix kit (cat. no. K2016; Bioneer Corporation) 다음의 프라이머를 사용하여 IGF1 및 GAPDH를 증폭하는데 사용하였다.

IGF1 forward, 5'CTACGCCAATGTGGTGCTAT3', reverse, 5'TCT GCCATTTGCCTG AAGTT3' (409 bp);

GAPDH forward, 5'AAGGCCATCACCATCTTCCA3' , reverse, 5'ACGATGCCAAAG TGGTCATG3' (320 bp).

PCR 조건은 다음과 같다: 10분 동안 95℃; 95℃에서 45초 동안, 58℃에서 60초 동안, 72℃에서 60초 동안 32회 사이클; 10분 동안 72℃. PCR 생성물을 2 % 아가로스겔상에서 전기영동에 의해 분석하고 에티디움 브로마이드(Sigma-Aldrich; Merck KGaA)를 사용하여 시각화하였다. 밀도계 분석에는 DavinchK Gel Imaging System (DavinchK Co., Ltd.) 및 Multi Gauge V3.1 (Fujifilm)을 사용하였다.

0.2 ㎍/㎖ 실시예 1의 NTS-C1, 0.2 ㎍/㎖ 실시예 2의 NTS-C2, 0.2 ㎍/㎖ 비교예 1의 사료조성물(C3)을 24시간 동안 처리된 상태에서 IGF-1 mRNA를 추출하고 상기 방법에 따라 IGF-1 mRNA 발현량을 측정하여 그 결과를 도 6에 나타내었다.

이에 따르면, 실시예 1의 NTS-C1, 실시예 2의 NTS-C2 처리군에서 IGF-1 발현이 증가하였으며, 실시예 1의 NTS-C1 처리군이 실시예 2의 NTS-C2 처리군에 비하여 IGF-1 발현량이 더 큰 것으로 나타났다. NTS-C1 처리군은 IGF-1 유전자의 발현량이 대조군 대비 3배 정도 증가하였고, NTS-C2 처리군은 2.5배 가량 증가함을 확인하였다(^***P<0.001 among all groups; ^#P<0.001 vs. control).

실험예 5: STAT5b/IGF-1 복합체 형성 분석

실시예 1의 NTS-C1, 실시예 2의 NTS-C2에 대하여 IGF-1 프로모터 영역에 대한 STAT5b의 결합에 대한 효과를 평가하였다.

C2C12 세포에서의 STAT5b/IGF-1 복합체(DNA/단백질 복합체) 형성을 분석하기 위하여 24시간 동안 0.2 ㎍/㎖ 실시예 1의 NTS-C1, 0.2 ㎍/㎖ 실시예 2의 NTS-C2, 0.2 ㎍/㎖ 비교예 1의 사료조성물(C3)을 처리한 후, quantitative PCR로 정량하고, 대조군에 대하여 STAT5b/IGF-1 복합체의 상대적 양을 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다.

IGF-1 프로모터 영역과 결합시키기 위한 프라이머를 디자인했고, STAT5b 항체로 ChIP을 통해, 실시예 1의 NTS-C1, 실시예 2의 NTS-C2 처리군이 IGF-1 프로모터에 대한 STAT5b의 결합 활성을 증가시켜서 전사를 개시할 수 있음을 확인하였다. 또한, STAT5b/IGF-1 복합체의 형성 증가는 실시예 2의 NTS-C2 처리군 보다 실시예 1의 NTS-C1에서 더 증가폭이 큰 것으로 나타났다(^***P<0.001 among all groups; ^#P<0.001 vs. control).

실험예 6: STAT5b 과발현에 따른 세포성장 신호 단백질 발현 분석

NTS-C1 활성도와 GH 신호 전달의 유사성을 감안할 때, STAT5b를 과발현 시킴으로써 STAT5b와 NTS-C1의 역할을 비교했다. 즉, STAT5b가 과발현된 C2C12 세포와 실시예 1의 NTS-C1가 처리된 세포에서 GHR, IGF-1 및 pSTAT5 단백질의 발현 정도 웨스턴 블롯을 수행하여 비교하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

이에 따르면, NTS-C1 처리 및 STAT5b 과발현 세포에서 GHR, IGF-1 및 pSTAT5의 발현 수준은 유사한 증가를 나타내었다(^***P<0.001 among all groups; ^#P<0.001 vs. control). 또한 NTS-C1는 pJak2를 상향 조절하여 Jak2/STAT5b/IGF-1 신호 전달을 조절함으로써 GH 신호 전달을 유도한다고 보인다. NTS-C1의 경우 대조군 대비 4~12배 증가를 나타내었다.

다시 말해, NTS-C1는 STAT5b에 의존적으로 GHR 및 IGF-1의 발현을 증가시킴을 알 수 있다.

실험예 7: STAT5b 억제에 따른 세포성장 신호 단백질 발현 분석

한편, NTS-C1가 매개하는 IGF-1의 조절에서 STAT5b의 역할을 증명하기 위해 siRNA(Small interfering RNA)를 사용하여 STAT5b 발현을 억제했다. STAT5b 자체의 저해에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 도 9에 나타내었다.

이에 따르면, NTS-C1 처리시 pSTAT5와 IGF-1가 비슷한 수준의 증가를 나타냈다 pSTAT5와 IGF-1의 상대적인 수준은 C2C12 세포에서 STAT5b가 NTS-C1의 영향을 받기 때문인 것으로 확인된다.

NTS-C1는 STAT5b 억제에 의존적으로 GHR 및 IGF-1의 발현을 억제시킴을 알 수 있다. 다시 말해, NTS-C1는 STAT5b의 발현에 의존적으로 GHR 및 IGF-1의 발현을 증가시키거나 또는 억제시킴을 알 수 있다

이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

Claims

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제독유황을 스트렙토마이세스균이 주종인 방선균으로 이루어진 유용 미생물군(EM: Effective Microorganism)에 의해 발효시켜 발효 제독 유황을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 제독유황은,
소나무 추출물; 쑥 및 상황버섯의 혼합 추출물; 검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및 침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 유황을 넣어 제독 처리한 유황 침전물이거나, 또는
소나무 추출물;
익모초 추출물;
검정콩, 생녹두 및 삼백탕의 혼합 추출물; 및
침향 추출물;을 포함하는 혼합 생약추출물에 유황을 넣어 제독 처리한 유황 침전물인 것을 특징으로 하는 성장 촉진용 조성물의 제조방법.
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