KR101642113B1 - 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법 및 상기 방법으로 법제된 유황 - Google Patents

Abstract

본 발명은 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법 및 상기 방법으로 법제된 유황에 관한 것으로서, 구체적으로는 유황을 녹이는 단계; 유황을 고체화하는 단계; 및 유황을 건조하는 단계를 복수 회 반복 수행한 후, 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계; 및 유황을 생강물로 찌는 단계를 포함하는 유황 법제 방법 및 상기 방법으로 법제한, 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법으로 법제된 유황은 HT22 세포에서 산화적 스트레스를 감소시켜 세포 생존률을 증진하는 효능 및 BV2 세포에서 LPS 첨가로 유도된 염증매개물질인 나이트리트를 감소시키는 효능을 보유하고 있다.

Description

퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법 및 상기 방법으로 법제된 유황{A METHOD FOR DETOXICATE THE SULFUR TREATMENT NEURODEGERATIVE DISEASE AND THE SULFUR DETOXIFICATED BY THE METHOD}

본 발명은 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법 및 상기 방법으로 법제된 유황에 관한 것으로서, 구체적으로는 유황을 녹이는 단계; 유황을 고체화하는 단계; 및 유황을 건조하는 단계를 복수 회 반복 수행한 후, 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계; 및 유황을 생강물로 찌는 단계를 포함하는 유황 법제 방법 및 상기 방법으로 법제한, 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황에 관한 것이다.

본 발명은 상기 유황을 고체화하는 단계에서 정제수를 유황에 주입하며 식힌 후, 3~7분 후 기존의 정제수를 버리고, 호스를 이용하여 새 정제수를 유황에 3~7분간 흘려보내어 유황을 고체화하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

본 발명은 상기 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계에서 토양이 황토인 땅에 묻어 2 ~ 5일간 보관하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

본 발명은 상기 유황을 생강물로 찌는 단계에서 물 50 ~ 150 중량부 및 생강 5 ~ 15 중량부를 사용하는 것을 기술적 특징으로 하고 있다.

본 발명에 따른 방법으로 법제된 유황은 HT22 세포에서 산화적 스트레스를 감소시켜 세포 생존률을 증진하는 효능 및 BV2 세포에서 LPS 첨가로 유도된 염증매개물질인 나이트리트를 감소시키는 효능을 보유하고 있다.

평균 수명이 증가하여 고령화 사회로 진입함에 따라, 노화에 따라 발병하는 퇴행성 질환이 커다란 의료 및 사회적 문제로 대두되고 있으며, 퇴행성 질환 중에서도 특히 퇴행성 뇌질환은 노인 질환의 발병 순위 1위를 차지할 정도로 높은 비중을 차지하고 있다.

퇴행성 뇌질환에는 대표적으로 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 파킨슨병 (Parkinson's disease), 헌팅턴병 (Huntington's disease) 및 루게릭병으로 잘 알려진 근위축성 측삭경화증 (ALS; Amyotrophic Lateral Sclerosis) 등이 있다.

먼저, 알츠하이머병 (Alzheimer's disease)은 대뇌피질의 신경세포가 사멸하여 대뇌의 전두엽과 측두엽의 뇌회가 위축되거나 용적이 감소하는 퇴행성 뇌질환으로서, 치매의 원인 중 하나이기도 하다.

알츠하이머병 초기에는 건망증 증상으로 시작되나 말기에는 인격이 와해되어 정신병 증상 등이 나타난다. 정확한 원인은 아직 밝혀지지 않았으나 유전적 요인, 신경계 구조적 변화, 염증성 매개물, 콜린성 신경계 및 기타 신경전달물질의 이상 등 병리학적 요인 등이 원인으로 추측되고 있다.

파킨슨병 (Parkinson's disease)은 팔, 다리 또는 전신의 근육이 경련 또는 경직되며 중심을 잡지 못하는 퇴행성 신경질환이다. 이와 같은 증상은 뇌신경세포의 문제로 신경전달물질인 도파민 분비에 이상이 생기면서, 뇌의 특정 신경세포가 점차 파괴되어 발생한다.

파킨슨병의 전형적인 증상은 경련, 근육 경직 및 동작이 느려지는 증상 등을 포함하는 운동장애이다. 파킨슨병은 진행속도가 느리기 때문에 발병 시점을 정확히 알기 어려우며, 증상이 발견되었을 때는 이미 뇌의 흑질 부위의 신경세포가 상당히 변성된 경우가 많다. 이밖에도 얼굴 근육이 경직되고 걸음걸이의 보폭이 짧아지는 증상 등이 발생하며, 우울증 및 배변 장애 등이 발생할 수도 있다.

헌팅턴병 (Huntington's disease)은 뇌의 미상핵 (caudate nucleus)과 조가비핵 (putamen)의 신경세포의 퇴행이 원인이다. 헌팅턴병은 제어가 불가능한 몸의 움직임을 동반하는데, 특히 팔, 다리가 경련하듯 움직이곤 한다. 헌팅턴병은 점점 악화되어 인지장애, 감정장애까지 불러올 수 있으며, 결국에는 증상이 발현된 후 약 10~15년 이내에 사망한다.

헌팅턴병은 4번 염색체에 있는 우성 유전자에 의한 유전병으로, 이 유전자가 변형된 비정상 단백질을 생성하고, 이 단백질이 세포자살 (apoptosis)을 유도해 신경세포를 죽게 한다.

헌팅턴병은 발병 시기가 주로 30~40대로 다른 퇴행성 뇌질환에 비해 이르며, 20대 초반에 나타나는 경우도 있다.

루게릭병으로 더 잘 알려진 근위축성 측삭경화증 (ALS; Amyotrophic Lateral Sclerosis)은 운동신경세포만 선택적으로 사멸하는 질환으로, 대뇌 피질의 상위운동신경세포 (upper motor neuron)와 뇌간 및 척수의 아래운동신경세포 (lower motor neuron) 모두가 점차적으로 파괴되는 특징으로 보인다.

임상 증상은 서서히 진행되는 사지의 쇠약 및 위축으로 시작하고, 병이 진행되면서 결국 호흡근 마비로 수 년 내에 사망에 이르게 된다.

루게릭병의 발병 원인은 아직 밝혀져 있지 않으나, 지금까지 다양한 가설들이 제기되고 있다. 전체 근위축성 측삭경화증 환자의 약 5~10%는 가족력에 의한 것으로 알려져 있고, 이 중 약 20%의 가족에서 21번 염색체에서 원인 유전자의 돌연변이가 확인되고 있다.

그 외에 유전성이 아닌 원인으로는 흥분세포독성 (excitotoxicity)에 의한 세포자살 (apoptosis)이 중요하게 작용하는 것으로 생각되고 있다.

앞서 언급한 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 근위축성 측삭경화증의 발병 원인은 모두 뇌신경세포의 손상이며, 이러한 뇌신경세포의 주 손상 원인은 산화적 스트레스 및 염증으로 알려져 있다.

산화적 스트레스란 세포나 조직이 독성 자유 라디칼 (toxic free radical), 즉 활성산소에 의해 손상되는 것을 의미하는 것이며, 특히 뇌신경세포는 산화적 스트레스에 민감한데 그 이유는 하기와 같다.

뇌가 당을 산화시켜 에너지를 수득하는 과정은 높은 호기성 대사과정 (aerobic metabolism)으로, 뇌는 체중의 약 2% 밖에 되지 않지만 전체 산소 소비량의 20%를 소비할 정도로 다량의 산소를 소비한다. 산소의 소비량과 활성산소의 생성량은 정비례하므로 뇌신경세포에서는 다른 조직에서보다 활성산소의 생성량이 현저히 높다 할 수 있겠다.

또한 뇌신경세포에는 산화되기 쉬운 다가불포화 지방산이 고농도로 존재하고, 라디칼 형성시 촉매로 사용되는 금속이온 (Fe^{2 +}, Cu^{2 +}) 등이 풍부하며, 다른 조직에 비해 카탈라아제(catalase)와 같은 항산화 효소가 부족하여 산화적 스트레스에 대한 방어 기작이 충분하지 못하기 때문에 더욱 산화적 스트레스에 취약하다.

또한 뇌신경세포 손상의 또 다른 원인인 염증반응은 알츠하이머병, 파킨슨병 등 퇴행성 뇌질환 대부분에서 발생하는 병리현상 중 하나로, 면역세포에서 염증반응으로 생산되는 사이토카인(cytokine)이나 산화물질 등의 염증매개물질로 인하여 뇌신경세포 사멸이 촉진된다고 추측되고 있다.

퇴행성 뇌질환의 경우 일반적인 감염성 질환과 달리 다양한 요인이 기여해 병이 발생하고 진행되는 것으로 알려져 있다.

퇴행성 뇌질환의 치료법은 현재 연구 진행 중이며, 타크린(tarcrien), 도네페질(donepezil), 리바스티그민(rivastigmine) 및 갈란타민(galanthamine) 등의 약물을 투여하는 약물 요법과, 자극 장치를 뇌에 이식하는 뇌심부자극술 등의 수술적 요법 등 대증 요법을 사용하여 증상을 완화하는 정도에 그치고 있다.

또한 약물 요법에 사용되는 약물은 구토, 불면증, 실신, 간염, 대뇌발작, 얼굴홍조 및 오심 등 다양한 부작용이 있으며, 약물 복용을 중단하면 증세가 바로 악화된다는 단점이 있다.

뇌심부자극술은 뇌출혈 및 알러지 반응 등의 부작용이 있으며, 자극 장치의 수명이 약 5년이므로 주기적으로 자극 장치를 교체해줘야 한다는 단점이 있다.

한편, 유황은 원자량 32, 녹는점 115.21℃, 끓는점 444.6℃의 원소로, 상온에서는 주로 노란색의 고체 상태로 존재하며 연소할 때 이산화황(SO₂)을 생성하는 물질이다.

유황은 간 보호 작용, 항종양작용, 골다공증 예방 및 피로 회복 등의 효능을 보유한 것으로 알려져 있어, 오래 전부터 약으로서 사용되어 왔으나, 독성을 보유하고 있어 통상적인 경우 법제(法製)를 수행한 후 사용되어 왔다.

법제란 약의 성질을 사용하는 경우에 맞게 변경하기 위하여 가공 처리하는 공정으로서, 부피가 큰 약재의 부피는 작게 하고, 재질이 단단한 약재의 재질은 무르게 하며, 독성이 있는 약재는 독성을 제거하는 등 다양한 공정이 법제의 범주에 포함된다.

법제는 주로 물 또는 불을 단독 또는 복합 사용하여, 약재를 분할하기 용이하게 하거나 흙 등 이물질을 제거하고, 성분을 변화시키는 등의 공정으로 수행된다.

법제 중 독성을 제거하기 위해 주로 사용되는 방법은 하단에 생강을 배치한 후 생강 위에 법제하고자 하는 약재를 배치하여 생강이 반 정도 연소될 때까지 볶는 방법 및 찌고 건조하는 것을 복수 회 반복하는 다증다포 방법이 있으나, 상기 방법들은 약재를 장시간 100℃ 이상의 고온에 노출시키는 것이므로, 약재 고유의 독성은 제거될지 모르나 또다른 독성인 벤조피렌이 생성되는 결과를 초래하는 부작용이 있다.

이에 본 출원인은 유황을 녹이는 단계; 유황을 고체화하는 단계; 및 유황을 건조하는 단계를 복수 회 반복 수행한 후, 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계; 및 유황을 생강물로 찌는 단계를 포함하는 유황 법제 방법과, 상기 방법으로 법제함으로서 벤조피렌의 생성 없이 유황이 보유한 독성을 제거함과 동시에 퇴행성 뇌질환을 부작용 없이 근본적으로 예방, 개선 또는 치료하는 유황을 제공할 수 있다고 판단하여 본 발명을 안출하였다.

본 발명과 관련된 선행 문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-0795663호(이하 선행문헌 A)에는 독성이 제거된 유황 및 그 제조방법과 이를 이용한 건강보조식품에 대하여 기재되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-0589714호(이하 선행문헌 B)에는 유황의 법제 방법 및 이를 이용한 유황닭사료에 대하여 기재되어 있다.

또한 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0038372호(이하 선행문헌 C)에는 당귀 추출물, 은행엽 추출물 단독; 또는 당귀 추출물 및 은행엽 추출물의 혼합물을 포함하는 치매 치료보조용 또는 치매치료용 약학적 조성물에 관하여 기재되어 있으며, 대한민국 특허공보 제10-2004-0017326호(이하 선행문헌 D)에는 인지 기능의 저하 및/또는 손상을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 대하여 기재되어 있다.

선행문헌 A는 마늘, 생강, 구연산과 합하여 분말로 가공한 후 숙성시키며, 상기 숙성된 혼합물과 분말로 가공된 당귀, 오가피, 유근피, 옥발, 백강잠, 미역 등의 약제 혼합물을 혼합한 유황 및 그 제조방법과 이를 이용한 건강보조식품에 관한 것이나, 선행문헌 A에는 상기 발명의 제조방법에 따른 유황 및 이를 이용한 건강보조식품의 적응증이 구체적으로 명시되어 있지 않다.

또한 선행문헌 A에 기재된, 동물에 유황을 투여한 후의 독성 실험은 단순히 동물을 관찰한 후 동물의 행동양태 및 외관이 정상적으로 보인다는 결론을 도출한 것에 불과하므로, 선행 문헌 A에서 유황이 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유할 것으로 예측할 수 없다 하겠다.

선행문헌 B는 유황을 용융한 후 냉수와 목질점토(고령토) 또는 점토의 혼합액에 넣어 냉각제독하고 혼합액에서 분리하여 건조하는 단계를 포함하는 유황의 법제 방법 및 이를 이용한 유황닭사료에 관한 것이나, 선행문헌 B는 상기 발명의 제조방법에 따른 유황의 효능을 닭의 건강 증진에 한정하였다.

또한 선행문헌 B에 기재된, 법제 유황 급여 후의 폐사 양상 실험은 폐사율이 감소되었다는 결론만을 도출하였으며, 유황 함유 사료로 사육한 유황닭의 상태 변화 실험은 선행문헌 A와 같이 단순히 동물을 관찰한 후 동물의 행동양태 및 외관이 정상적으로 보인다는 결론을 도출한 것에 불과하므로, 선행 문헌 B에서 유황이 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유할 것으로 예측할 수 없다.

선행문헌 C는 당귀 추출물, 은행엽 추출물 단독; 또는 당귀 추출물 및 은행엽 추출물의 혼합물을 포함하는 치매 치료 보조용 또는 치매 치료용 약학 조성물에 관한 것이나, 선행문헌 C의 소재는 당귀 추출물, 은행엽 추출물 또는 당귀 추출물 및 은행엽 추출물의 혼합물로서 본 발명의 유황 및 생강과는 상이하다.

또한 선행문헌 C의 당귀 추출물, 은행엽 추출물 또는 당귀 추출물 및 은행엽 추출물의 혼합물을 단독 투여할 시의 효능을 실험한 결과는 없으며, 도네페질 등의 기존 약물과 복합하여 사용한 결과만 기재되어 있으므로, 단독 투여할시의 효능을 충분히 알 수 없다.

따라서 선행 문헌 C에서 본 발명의 소재를 도출해 내어 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효능은 예측될 수 없다.

선행문헌 D는 (1R,2S,4R)-(-)-2-(2-디메틸아미노에톡시)-2-페닐-1,7,7-트리메틸-비시클로[2.2.1] 헵탄-푸마레이트를 포함하는 인지 기능의 저하 및/또는 손상을 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이나, 선행문헌 D의 소재는 천연물이 전혀 첨가되지 않은 화합물로 본 발명의 유황 및 생강과는 상이하다.

또한 선행문헌 D에 기재된, (1R,2S,4R)-(-)-2-(2-디메틸아미노에톡시)-2-페닐-1,7,7-트리메틸-비시클로[2.2.1] 헵탄-푸마레이트를 투여한 쥐가 수동 회피 기구 암실로 향하는 시간이 지연된 실험 결과는 항불안 효능만을 입증한 것에 불과하다.

따라서 선행 문헌 D에서도 본 발명의 소재를 도출해 낼 수 없으며, 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효능 역시 예측할 수 없다.

대한민국 등록특허공보 제10-0795663호 (2008, 01, 10) 대한민국 등록특허공보 제10-0589714호 (2006, 06, 07) 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0038372호 (2012, 04, 23) 대한민국 공개특허공보 제10-2004-0017326호 (2004, 02, 26)

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 항산화 작용 및 항염 작용을 통해 뇌신경 세포의 사멸을 억제하는 법제 유황을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 유황을 녹이는 단계; 유황을 고체화하는 단계; 및 유황을 건조하는 단계를 복수 회 반복 수행한 후, 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계; 및 유황을 생강물로 찌는 단계를 포함하는 유황 법제 방법 및 상기 방법으로 법제한 유황을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명에 따른 방법으로 법제된 유황은 HT22 세포에서 산화적 스트레스를 감소시켜 세포 생존률을 증진하는 효능 및 BV2 세포에서 LPS 첨가로 유도된 염증매개물질인 나이트리트를 감소시켜 퇴행성 뇌질환을 부작용 없이 근본적으로 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하고 있다.

도 1은 본 발명에 따른 유황을 법제하는 방법을 시계열적으로 나타낸 플로우 차트이다.
도 2는 본 발명에 따른 법제 유황을 농도별로 HT22 세포에 처리하였을 때, 글루타메이트에 의한 산화적 스트레스가 세포의 생존능에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따른 법제 유황을 BV2 세포에 농도별로 처리하였을 때, LPS 첨가로 유도된 염증매개물질인 나이트리트에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 제조예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 유황의 법제 방법

도 1은 본 발명에 따른 유황의 법제 방법을 시계열적으로 나타낸 플로우 차트이다.

(1) 유황을 녹이는 단계

유황을 가열용기에 넣고 120~140℃의 온도로 가열하여 40~80분 동안 끓여 녹인다.

이때 사용되는 유황은 가루형태의 유황일 수도 있고, 덩어리 형태의 유황일 수도 있다.

유황을 녹이는 시간 및 온도 등의 조건은 설계 조건에 따라 변경될 수 있다.

(2) 유황을 고체화하는 단계

가열하여 녹인 유황을 고체화한다.

유황이 담긴 용기에 정제수를 주입하여 유황을 식힌다. 3~7분 후 기존의 정제수를 버리고, 새 정제수를 다시 주입하여 유황을 고체화한다.

정제수를 주입하는 시간은 설계 조건에 따라 다양하게 설정될 수 있다.

또한 유황을 식히는 방법 역시 조건에 따라 다양하게 설정될 수 있으며, 유황을 냉풍에 노출시키는 방법 등에서 선택될 수 있다.

(3) 유황을 건조하는 단계

고체화된 유황은 정제수를 제거하고 건조한다.

유황의 건조는 건조기에서 수행되며, 조건에 따라 병류식 건조기, 향류식 건조기, 터널 건조기, 컨베이어 벨트 건조기, 혼합류식 건조기 및 기송식 건조기 등에서 건조기를 다양하게 선택할 수 있다.

유황은 20~30시간 동안 건조되며, 조건에 따라 건조 시간이 다양하게 설정될 수 있다.

유황의 건조 방법 역시 열풍 건조, 동결 건조, 냉풍 건조, 양건조, 음건조 및 진공 건조 등에서 다양하게 선택될 수 있다.

상기 유황을 녹이는 단계, 유황을 고체화하는 단계 및 유황을 건조하는 단계를 복수 회 반복함으로써 독성을 제거하고 약성을 증진할 수 있다.

반복 횟수는 5~10회 반복될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 설계조건에 따라 변경될 수 있다.

(4) 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계

녹이고 고체화를 반복한 유황을 용기에 담아 땅에 묻어 2~5일간 보관한다.

유황을 땅에 묻어 보관하는 단계는 황토 성분이 유황의 화독(火毒)을 제거하고 유황 내의 열기를 식히기 위하여 수행된다.

화독은 독의 종류 중에서도 해독이 가장 어려운 독의 종류로 알려져 있으나, 황토는 화독을 포함하는 모든 종류의 독을 해독하므로, 유황의 독성을 황토가 제거하여 섭취 시 독성이 일어나지 않게 한다.

조건에 따라, 유황을 땅에 묻어 보관하는 기간이 다양하게 설정될 수 있음은 물론이다.

(5) 유황을 생강물로 찌는 단계

유황을 가열용기에 넣고 생강물로 1~3시간 찐다.

이때 가열용기는 시루를 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 증기를 이용하여 찔 수 있는 가열용기이면 충분하다.

유황을 생강물로 찌는 단계는 생강 내의 성분인 진저롤(gingerol) 및 쇼가올(shogaol)이 유황을 해독함과 동시에 유황의 항산화 활성이 증진되도록 하기 위하여 수행된다.

진저롤 및 쇼가올은 항균 및 해독 작용을 하고 중추신경계를 안정시키는 성분으로 알려져 있으며, 쇼가올은 활성산소를 제거하고 활성산소에 의한 유전자 손상을 억제하는 성분으로 알려져 있다.

유황을 찌기 위한 생강물은 추출 또는 농축 등 다양한 방법으로 제조될 수 있으며, 생강물 구성 성분의 조성비는 물 10 L에 생강 0.5 ~ 1.5 kg으로 설정한다.

조건에 따라 생강물 구성 성분의 조성비는 다양하게 설정될 수 있으며, 생강물을 사용하여 유황을 찌는 시간 역시 다양하게 설정될 수 있다.

이 후 유황은 조건에 따라 다양하게 가공될 수 있는데, 건조 후 가루형태로 사용될 수 있으며, 찹쌀풀을 사용하여 유황 환으로 제조될 수도 있다.

실험예 1. 법제 유황의 항산화 활성

(1) 실험 준비

여기에서, 실험예 1을 비롯한 이하 모든 실험예는 아래의 실험 준비 과정과 동일하게 수행되었음을 밝혀둔다.

1) 법제 유황 준비

실시예 1의 과정에 따라 제조된 법제 유황을 실험에 이용하였다.

2) 약물 준비

글루타메이트 (Glutamate), LPS, TNF-γ 및 코르디페틴 (cordycepin)을 Sigma Chemical Co.에서 구입하여 사용하였으며, 트로록스 (Trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)를 Santa Cruz Biotech에서 구입하여 사용하였다. 기타 구입 가능한 시약 및 용매를 구입하여 사용하였다.

3) 세포 배양

HT22 세포는 10% FBS와 항생제가 첨가된 DMEM 컨테이닝 하이 글루코스 (containing high glucose) 배지에서 배양되었으며, 온도 27℃, 5% CO₂ 조건 하에 습식배양기 (humidified incubator)에서 일분자층으로 계대 배양하였다.

(2) 실험 과정

본 발명에 따른 법제 유황이 글루타메이트 (glutamate)로 유도된 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호 활성, 즉 생존능 (cell viability)이 존재하는지 측정하기 위하여 MTT 분석법으로 이를 조사하였다.

실험 방법은 다음과 같다.

1) HT22 세포를 96-well 배양 접시에 분주하여 12시간 안정화시켰다.

2) 법제 유황을 5, 20, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 2시간 전처리하였다. 이 때 양성대조군으로 트로록스 (Trolox) 50 uM을 사용하였다.

이 때 트로록스는 비타민E 유사체로, 항산화 활성을 측정할 때 기준으로 사용되는 화합물이다.

3) 글루타메이트를 HT22 세포주에 5 mM의 농도로 처리하여 12시간 동안 반응시켰다.

4) 글루타메이트 약물처리 후에는 배양액과 동일한 양의 MTT (dimethythiaxol diphenytetrazolium bromide) 용액을 첨가한 후 37℃에서 2시간 반응시켰다.

5) 이후 메틸설폭사이드 (dimethy sulfoxide)를 첨가하여 포마잔 프로덕트 (formazan product)를 완전히 용해시켜 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 이용하여 570 nm의 파장에서 흡광도를 특정하였다 (Model 550, Bio-Rad, USA).

(3) 실험 결과

도 2는 본 발명에 따른 법제 유황을 농도별로 HT22 세포에 처리하였을 때, 글루타메이트에 의한 산화적 스트레스가 세포의 생존능에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

실험 결과, HT22 세포에 글루타메이트 약물만을 처리한 군의 세포 생존률은 약 35%였으나, 법제 유황을 투여한 군의 세포 생존률은 농도의존적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

법제 유황 5 ㎍/㎖를 처리하였을시 세포 생존률은 약 35%였고, 법제 유황 20 ㎍/㎖를 처리하였을시에는 세포 생존률이 약 40%였으며, 법제 유황 50 ㎍/㎖를 처리하였을시에는 세포 생존률이 약 50%였고 법제 유황 100 ㎍/㎖를 처리하였을시에는 세포 생존률이 약 60%였다.

이로써 본 발명에 따른 법제 유황은 산화적 스트레스로 인한 HT22 세포의 사멸을 막고, 보호하는 효능을 보유한 것을 알 수 있으며, 특히 법제 유황을 50 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖ 처리하였을 때 항산화 효과가 더욱 뛰어남을 알 수 있다.

실험예 2. 법제 유황의 항염 활성

(1) 실험 준비

세포 배양을 제외하고, 실험예 1의 실험 준비와 동일하게 수행되었다.

1) 세포 배양

마우스 BV2 세포주는 10% FBS, 100 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 보강한 DMEM 배양 배지를 이용하여 습식배양기 (humidified incubator)에서 37℃, 5% CO₂ 조건하에 보관 유지되었으며 트립신 처리 (trysinization)하여 계대 배양하였다.

실험에 사용된 세포는 LPS (0.5 ㎍/㎖)를 첨가하기 전에 정해진 시간에 코르디세핀 (cordycepin)을 처리하였다.

(2) 실험 과정

실험에 사용한 마우스 BV2 세포주는 미세아교세포 (microglia)로, 뇌에 존재하는 염증 세포이다.

활성화된 미세아교세포는 염증매개물질을 분비하여 신경세포의 사멸을 유도하므로, 염증반응을 억제하는 것이 신경세포의 손상을 막고 나아가 퇴행성 뇌질환의 발병과 진행을 막는 것이라 하겠다.

본 실험예에서는 유황의 항염 활성을 측정하기 위해 나이트리트 (nitrite)의 생성량을 측정하였다.

나이트리트는 염증매개물질 중 하나인 일산화질소(NO)의 주요한 안정한 생성물로, 그리스(Griess) 시약을 이용하여 측정되었다.

1) 세포를 24-웰 플레이트 (well plate)에 5×10⁵ 세포/㎖로 배양하였다.

2) 다양한 농도의 법제 유황 (5, 20, 50, 100 ㎍/㎖)을 처리한 후, LPS (0.5 ㎍/㎖) 존재 또는 부존재 하에서 24시간 동안 반응시켰다.

3) 이후 각 배양 배지 100 ㎖를 동일 부피의 Griess 시약 (1% sulfanilamide/0.1% N-(1-maphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄) 과 혼합하였다.

4) 나이트리트의 수준은 540 nm에서 ELISA plate reader (Dynatech MR-700; Dynateck Laboratories)를 이용하여 측정하였고, 나이트리트 농도는 기지 농도의 소듐 나이트리트 (sodium nitrite)를 이용하여 생성한 표준곡선을 참조하여 계산하였다.

(3) 실험 결과

도 3은 본 발명에 따른 법제 유황을 BV2 세포에 농도별로 처리하였을 때, LPS 첨가로 유도된 염증매개물질인 나이트리트에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

실험 결과, BV2 세포에 LPS만을 처리한 군에서 나이트리트는 약 22 uM 생성되었으나, 법제 유황을 투여한 군에서 나이트리트는 농도의존적으로 생성 수치가 감소되는 것을 관찰할 수 있었다.

법제 유황 5 ㎍/㎖를 처리하였을시 나이트리트는 약 22uM 생성되었고, 법제 유황 20 ㎍/㎖를 처리하였을시에는 나이트리트가 약 18uM 생성되었으며, 법제 유황 50 ㎍/㎖를 처리하였을시에는 나이트리트가 약 12uM 생성되었고 법제 유황 100 ㎍/㎖를 처리하였을시에는 나이트리트가 약 10uM 생성되었다.

이로써 본 발명에 따른 법제 유황은 BV2 세포에서 염증반응으로 분비되는 나이트리트의 농도를 감소시키는 효능을 보유한 것을 알 수 있으며, 특히 법제 유황을 50 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖ 처리하였을 때 항염 효과가 더욱 뛰어남을 알 수 있다.

Claims (5)

1. 유황을 녹이는 단계; 유황을 고체화하는 단계; 및 유황을 건조하는 단계를 복수 회 반복 수행한 후, 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계; 및 유황을 생강물로 찌는 단계를 포함하는, 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 유황을 고체화하는 단계는 정제수를 이용하여 유황을 고체화하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 유황을 땅에 묻어 보관하는 단계는 토양이 황토인 땅에 묻어 2 ~ 5일간 보관하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 생강물은 물 10 L 기준으로 생강 0.5 ~ 1.5 kg을 이용하여 제조한 것을 특징으로 하는, 퇴행성 뇌질환을 예방, 개선 또는 치료하는 유황의 법제 방법.
   
5. 삭제

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