CN1326349A - 抗病毒药物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有抗乙型肝炎病毒(HBV)活性的治疗药物组合,它包含(2R,顺)－4－氨基－1－(2－羟基甲基－1,3－oxathiolan－5－基)－嘧啶－2－酮(拉米夫定)以及第二种治疗剂,其选自:(9－[(R)－2－(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA或adefovir)和二(新戊酰氧基甲基)(9－[(R)－2－(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA的口服前药、adefovir dipivoxil)。本发明还涉及含有该药物组合的药用组合物以及在治疗HBV感染,包括对核苷和/或非核苷抑制剂具有抗药性的HBV突变型感染上的应用。

Description

抗病毒药物组合
本发明涉及治疗的药物组合(combinations)，它包含(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮(拉米夫定)以及第二种治疗剂，其选自：(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA或adefovir)和二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA的口服前药、adefovir dipivoxil)。本发明还涉及含有所述药物组合的药用组合物及其在治疗HBV感染，包括对抑制乙型肝炎病毒复制的核苷和/或非核苷抑制剂具有抗药性的HBV突变型感染上的应用。
乙型肝炎是一种病毒性疾病，其通过污染物(如血液或血液制品)和污染的针头经口腔或非肠道传播，通过性接触传递，以及由感染或携带该病毒的母亲经垂直传播给后代。在该病常见的世界某些地区，幼年的垂直传播导致高比例的感染人群变为乙肝病毒慢性携带者。全世界估计有3.5亿人患有慢性乙肝病毒感染，在未经治疗的情况下可能有多达1.5亿人死于肝病。
目前唯一确立的治疗乙型肝炎的方法是重复注射干扰素，但干扰素可引起不良的副作用，这种方法仅对其治疗的不足三分之一的患者有长期持续的应答效果。干扰素是一种设计为强化免疫系统抵御疾病的免疫调节剂。
在近两年的研究中，已报道拉米夫定对抑制HBV有效，其显示大多数患者表现出大幅度降低病毒复制水平，至第二年研究结束，有52％患者保持未能检测出的病毒水平。
据报道Adefovir具有体外抗-HBV活性，adefovir的口服前药，adefovir dipivoxil已显示出体内抑制HBV复制的活性，目前正在对慢性乙型肝炎病毒感染患者进行II期临床研究。
有报道称PMEA对表达拉米夫定密码子的人体乙型肝炎DNA聚合酶缺乏交叉抗性，X.Xiong等(Hepatology 26卷，第4期，第2页，文摘号1211)。
联合使用本发明的药物组合可在降低毒性的同时产生相同的抗病毒作用，或者由于药物之间发生的协同作用而增加药效。药物总剂量的降低还可能降低HBV药物抗性变体的发生频率。
现已发现当拉米夫定与adefovir组合使用时，其显示出出乎意料的优点。尤其是该药物组合显示出统计学上显著的协同抗HBV作用。早期结果表明拉米夫定与adefovir dipivoxil组合也显示出协同抗HBV作用。本发明的特征即是应用这些药物组合将提供协同抗病毒作用、更完全的病毒抑制作用、长期的病毒抑制作用、限制药物抗性HBV突变体的出现以及更好得控制与药物有关的毒性。这些药物组合的应用还可降低1日给药次数(如片剂)，因此可增加患者的依从性。
如本领域技术熟练人员了解，本发明所涉及的治疗包括对确定的感染和症状的预防和治疗。
拉米夫定、adefovir或adefovir dipivoxil的药学上可接受的盐包括那些源于药学上可接受的无机和有机酸的盐。适当的酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸，如草酸，虽然其盐不是药学上可接受的盐，但可用作中间体用于制备本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐。
源于适当碱的盐包括碱金属(如钠)、碱土金属(如镁)、铵和NR4+(其中R是C1-4烷基)盐。
拉米夫定、adefovir或adefovir dipivoxil的优选的酯独立选自下列：(1)羧酸酯，其中该酯基的羧酸部分的非羰基部分选自直或支链的烷基(如甲基、正丙基、叔丁基或正丁基)、环烷基、烷氧基烷基(如甲氧基甲基)、芳烷基(如苄基)、芳氧基烷基(如苯氧基甲基)、芳基(如任选由如卤素、C1-4烷基或C1-4烷氧基取代的苯基)或者氨基；(2)磺酸酯，如烷基或芳烷基磺酰基(如甲磺酰基)；(3)氨基酸酯(如L-缬氨酰或L-异亮氨酰)；以及(4)膦酸酯。除另有说明，在这些酯中，任何存在的烷基优选含有1-18个碳原子，尤其是1-6个碳原子，更优选1-4个碳原子。在这些酯中存在的任何环烷基优选含有3-6个碳原子。在这些酯中存在的任何芳基优选含有苯基。任何有关的任何以上化合物还包括其有关的药学上可接受的盐。
特别优选的酯是拉米夫定的一、二和三磷酸酯(可任选被保护)，或者是在给予人体时能够提供(直接或间接)所述一、二和三磷酸酯的任何其它化合物。
因此，本发明提供包括(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮或其药学上可接受的衍生物以及第二种治疗剂的组合，所述治疗剂选自：(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物和二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物。
优选的第二种治疗剂是二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物。
以上说明的药物组合以下称为本发明的药物组合。
本发明所用“药学上可接受的衍生物”包括拉米夫定、adefovir或adefovir dipivoxil或者在给予接受者时能够提供(直接或间接)该化合物或其抗病毒活性代谢物或残基的任何其它化合物的任何药学上可接受的盐、酯或这些酯的盐。
本发明还提供用于治疗，尤其是用于治疗HBV感染，包括针对乙型肝炎病毒复制的核苷和/或非核苷抑制剂具有抗药性的感染的本发明药物组合。
另一方面，本发明提供治疗HBV感染的哺乳动物(包括人)的方法，它包括给予治疗有效量的本发明的药物组合。
应该理解，可同时或顺次给予本发明组合的化合物，这些组合化合物可以为同一或不同的药用组合物。如果顺次给药，第二种活性组分的延迟给药不应降低该活性成分组合之间的协同治疗作用。还应该理解，无论同时或顺次给药，拉米夫定和adefovir dipivoxil或其药学上可接受的衍生物或者adefovir或其药学上可接受的衍生物都可以以单独或任何组合形式给药。优选将拉米夫定和adefovir dipivoxil或adefovir同时给药或以单独药剂形式顺次给药，最优选同时给药。
优选以单一组合制剂形式给予本发明的药物组合。
本发明还提供应用拉米夫定制备与adefovir或adefovir dipivoxil同时或顺次给药用于治疗HBV感染的药物。应该理解，拉米夫定、adefovir dipivoxil或adefovir或其任何组合(不包括adefovir和adefovirdipivoxil)都可用于制备以上药物。
本发明另一方面提供其中拉米夫定、adefovir dipivoxil或adefovir以协同比率存在的本发明组合。
拉米夫定、adefovir dipivoxil或adefovir或其药学上可接受的衍生物组合的协同作用比率为，如40∶1至1∶1(重量比)，优选25∶1至15∶1(重量比)。
组合中每个化合物的用量一般可采用其单独使用时显示抗-HBV活性的量较有利。
当然，所需作为抗-HBV剂有效的拉米夫定、adefovir或adefovirdipivoxil组合的量是可以变化的，最终由医务工作者决定。需考虑的因素包括给药途径、制剂的性质、动物体重、年龄及身体状况以及所治疗疾病的严重程度。
拉米夫定口服适用剂量一般约为每日每kg接受者体重0.1-50mg范围，优选每日每kg体重0.5-20mg范围，最优选每日每kg体重0.5-2mg范围。
一般以每日约100mg水平给予该化合物。
Adefovir dipivoxil口服适用剂量一般约为每日每kg接受者体重0.01-10mg范围，优选每日每kg体重0.01-1mg范围，最优选每日每kg体重0.01-0.05mg范围。
一般以每日约10mg水平给予adefovir dipivoxil。
Adefovir口服适用剂量一般约为每日每kg接受者体重0.01-10mg范围，优选每日每kg体重0.01-1mg范围，最优选每日每kg体重0.01-0.05mg范围。
一般以每日约10mg水平给予adefovir。
除另有说明，所有活性成分的重量以该药物本身计算。当是拉米夫定、adefovir dipivoxil或adefovir的任何其药学上可接受的衍生物或溶剂化物时，按比例增加该数量。优选将所要求的剂量在每日适当间隔内以2、3、4、5、6或更多次的亚剂量给予。可以以单位剂量形式给予这些亚剂量，每单位剂量形式中含有1-1500mg，优选5-1000mg，最优选5-500mg的活性组分。另外，如果接受者的疾病需要，可以以连续输注形式给予该剂量。
可以以常用的方式给予治疗的动物(如包括人的哺乳动物)药物组合的组分(称为活性组分)。
虽然可以以化学原料形式给予药物组合的活性组分，但优选以药用组合物形式给予。本发明药用组合物包括一或多种药学上可接受的载体或赋形剂以及任选其它治疗剂的本发明的药物组合。这些载体必须是可接受的，即可与配方的其它组分相容，并对其接受者无毒。当单独给予该组合的各个组分时，它们一般各自是药用组合物形式。除另有说明，以下所指的组合物是指含有该组合或其组分的组合物。
拉米夫定和adefovir dipivoxil或adefovir或其药学上可接受的衍生物的组合一般可以是单位剂量形式的具有一或多种药学上可接受的载体的药用组合物。常用的单位制剂含有活性组分的量各自为1mg-2g，例如2-200mg，如25-150mg的拉米夫定以及5-60mg的adefovir或adefovir dipivoxil。
还可将药用组合物以作为单一包装形式(通常为泡罩包装)的含有整个疗程用药的“患者药物包(patient packs)”开处方给患者。患者药物包比传统处方具有优点，其中药师将大量药品分为患者需要的药量，患者易于得到患者药物包中的包装插页，而传统处方中较易遗失。已显示出附有包装插页可提高患者对医生嘱咐的依从性。
应该理解，本发明的另一吸引人的方面是通过单一患者药物包或各组合物的多个患者药物包给予本发明的药物组合，其中包装插页指导患者正确使用本发明。
另一方面，本发明提供患者药物包，其含有至少一种本发明组合的活性组分以及含有本发明药物组合使用说明的信息插页。
另一方面，本发明提供双包装，其包含分别给药的拉米夫定、adefovir dipivoxil或adefovir或其任何药学上可接受的衍生物。
组合物包括那些适于口服、直肠、鼻腔、局部(包括经皮、颊内和舌下)、阴道或非肠道(包括皮下、肌内、静脉和皮内)给药的组合物。这些组合物一般为单位剂量形式，可通过制药领域熟知的任何方法制备。这些方法代表本发明的另一特征，包括将活性组分与一或多种附属组分构成的载体相结合的步骤。一般地，这些制剂可通过将活性组分与液体载体或分散均匀的固体载体或者两者均匀和紧密地混合制备，如果必要，然后将产物定型。
适于口服的本发明组合物可以是各自含有预定量活性组分的独立单位形式，如胶囊、caplet、扁囊剂或片剂；粉末剂或颗粒剂形式；水或非水液体中的溶液剂或混悬剂形式；或者是水包油液体乳剂或油包水液体乳剂形式。该活性组分还可以是大丸剂(bolus)、干糖剂或糊剂。
片剂可通过任选与一或多种辅助成分压制或模压制备。压制片可通过在适当的机器中将自由流动形式的活性组分(如粉末或颗粒)，任选与粘合剂(如聚乙烯吡咯烷酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如淀粉乙醇酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂压制制备。模压片可通过在适当的机器中将湿润的粉末状化合物与惰性液体稀释剂的混合物模压制备。可任选将片剂包衣或划痕，并可制成缓释或控释活性组分的制剂，其可采用如不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所要求的释放模式。可任选将片剂制成肠溶衣以使药物在肠内而不是在胃内释放。
优选口服给予本发明的药物组合。
适于口腔内局部给药的组合物包括在矫味基质中含有活性组分的锭剂，基质通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄耆胶；在惰性基质中含有活性组分的锭剂，基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶；以及在适当液体载体中含有活性组分的漱口液。直肠给药的组合物可以是具有适当基质(包括如可可脂或水杨酸酯)的栓剂。
局部给药还可通过经皮离子等渗仪器进行。
适于阴道给药的制剂可以是阴道栓、阴道塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，它们除含有活性组分外，还含有适当的本领域已知的载体。
适于直肠给药的其中载体为固体的药用制剂最优选是单位剂量的栓剂。适当的载体包括可可脂和其它本领域常用的物质。该栓剂一般可通过将活性组合物与软化或熔融的载体混合，然后冷却并在铸模中成型制备。
适于非肠道给药的剂型包括水溶性和非水溶性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧剂、缓冲剂、抑菌剂和促使制剂与指定接受者血液等渗的溶质；水溶性和非水溶性无菌混悬液，其可含有悬浮剂和增厚剂；以及设计将化合物靶向作用于血液组分或一或多种器官的脂质体或其它微粒系统。这些制剂可以以单位剂量或多剂量密封容器，如安瓿和小瓶形式存在，可在冷冻干燥条件下储存，临用之前仅需加入无菌液体载体(如注射用水)即可。临时配制型注射溶液和混悬液可由以上说明的各类无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
优选的单位剂量制剂是那些含有如以上所提的日剂量或日亚剂量活性组分或者其适当部分的制剂。
应该理解，除以上所特别提到的组分之外，本发明制剂还可含有本领域涉及所提到制剂类型时常用的其它物质，例如，适于口服给药的制剂可包括甜味剂、增厚剂和矫味剂。
可按常规方法制得本发明的药物组合。
拉米夫定的制备方法描述于结合到本发明中作为参考的国际专利申请序号WO91/17159和WO95/29174中。
Adefovir的制备方法描述于结合到本发明中作为参考的欧洲专利No.206459中。
Adefovir dipivoxil的制备方法描述于结合到本发明中作为参考的欧洲专利No.481214中。
以下实施例仅供说明之用，并不意味着以任何方式限定本发明范围。“活性组分”指拉米夫定、Adefovir dipivoxil或Adefovir或其混合物或者任何以上所提的化合物的生理官能团衍生物。
实施例1：片剂
通过将组分与聚维酮溶液湿法制粒，再加入硬脂酸镁，然后压制来制备以下制剂A、B和C。
剂型A
              mg/片
活性组分A      100
活性组分B      30
乳糖B.P.       105
聚维酮B.P.     7
淀粉乙醇酸钠   10
硬脂酸镁       3
               255剂型B
                   mg/片
活性组分A           100
活性组分B           30
乳糖B.P.            75
微晶纤维素PH10.1    30
聚维酮B.P.          7
淀粉乙醇酸钠        10
硬脂酸镁            3
                    255
剂型C
                   mg/片
活性组分A          100
活性组分B          5
乳糖B.P.           100
淀粉               25
聚维酮             2
硬脂酸镁           2
                   234
以下剂型D和E可通过直接压制混合的组分制备。剂型E中的乳糖为直接压制型(Dairy Crest-“Zeparox”)
剂型D
                 mg/片
活性组分A         100
活性组分B         30
预胶化淀粉NF15    75
                  205
剂型E
                 mg/片
活性组分A         100
活性组分B         5
乳糖B.P.          70
微晶纤维素        50
                  225
剂型F(控释制剂)
该制剂通过将组分与聚维酮溶液湿法制粒，再加入硬脂酸镁，然后压制来制备。
                       mg/片
活性组分A              100
活性组分B              30
羟丙基甲基纤维素       28
(Methocel K4M Premium)
乳糖B.P.               13
聚维酮B.P.             7
硬脂酸镁               2
                       180
药物在约6-8小时期间内释放，12小时后释放完全。
实施例2：胶囊剂
剂型A
通过将上面实施例1中剂型D的组分混合，然后填充于两-节的硬明胶胶囊中制备胶囊剂。剂型B(以下)按类似方法制备。
剂型B
                   mg/胶囊
活性组分A            100
活性组分B            5
乳糖B.P.             70
淀粉乙醇酸钠         10
硬脂酸镁             1
                     186
剂型C
                   mg/胶囊
活性组分A            100
活性组分B            30
大粒凝胶4000 B.P.    170
                     300
剂型C胶囊可通过融化大粒凝胶4000B.P.，再将活性组分分散于熔融物中，然后填充于两-节的硬明胶胶囊中制备。
剂型D
           mg/胶囊
活性组分A    100
活性组分B    5
卵磷脂       50
花生油       50
             205
剂型D胶囊可通过将活性组分分散于卵磷脂和花生油中，然后填充于软、弹性明胶胶囊中制备。
剂型E(控释胶囊)
下面的控释胶囊剂通过将组分a、b和c用挤压剂挤压，再将挤压物团成球状，然后干燥制备。再将干燥的小球用控释膜包衣，填充于两-节的硬明胶胶囊中。
                  mg/胶囊
(a)    活性组分A    100
       活性组分B    30
(b)    微晶纤维素   60
(c)    乳糖B.P.     60
(d)    乙基纤维素   6
                    256实施例3：注射剂
剂型A
                              mg
活性组分A                     100
活性组分B                     5
盐酸溶液0.1M或
氢氧化钠溶液0.1M适量至pH      4.0-7.0
无菌水适量至                  10ml
将活性组分溶于大部分水(35-40℃)中，用适量盐酸或氢氧化钠将pH调节至4.0-7.0之间。然后加水至批体积，通过无菌微孔滤器过滤至无菌10ml安瓿玻璃小瓶中(1型)，用无菌帽塞封口并密封。
剂型B
活性组分A                      125mg
无菌、无热原、pH7磷酸盐缓冲液
适量至                         25ml
实施例4：肌内注射剂
活性组分A                      100mg
活性组分B                      30mg
苯甲醇                         0.067g
Glycofurol 75                  0.94g
注射用水适量至                 3.00ml
将活性组分溶于glycofurol中。然后加入苯甲醇，溶解，加水至3ml。然后将混合液通过无菌微孔滤器过滤并密封于无菌3ml安瓿玻璃小瓶中(1型)。
实施例5：糖浆剂
活性组分A               100mg
活性组分B               5mg
山梨糖醇溶液            0.6g
甘油                    0.85g
苯甲酸钠                0.0025g
矫味剂，桃17.42.3169    0.0125ml
纯化水适量至            5.00ml
将活性组分溶于甘油和大部分纯化水的混合液中。然后加入苯甲酸钠水溶液，接着加入脱水山梨糖醇溶液，最后加入矫味剂。加纯化水至体积，并混匀。
实施例6：栓剂
                           mg/胶囊栓剂
活性组分A                       100
活性组分B                       30
硬脂，B.P.
(Witepsol H15-Dynamit Nobel)    1770
                                1900
在最高温度为45℃的蒸汽套盘中，将1/5的Witepsol H15融化。将活性组分通过200μM筛过筛，并加入到熔融的基质中，用装有切头的Silverson混合直至形成均匀的分散液。将混合液保持在45℃下，向该混悬液中加入剩余的Witepsol H15，搅拌以确保均相混合。将全部混悬液通过250μM不锈钢筛，继续搅拌下，冷却至40℃。在38-40℃下，将2.02g混合液填充于适当的、2ml塑料模型中。将该栓剂冷却至室温。
实施例7：阴道栓剂
           mg/阴道栓
活性组分A    100
活性组分B    5
无水葡萄糖   160
马铃薯淀粉   150
硬脂酸镁     3
             418
将以上组分直接混合，然后通过直接压制得到的混合物制备阴道栓剂。药理数据
实施例8
以 5×103细胞/孔的密度，将主要产生感染性HBV的人肝胚细胞瘤细胞系(Hep-G2-2.2.15)植种于96孔微量滴定板中。在一式三份的滴定板中，将这些细胞用拉米夫定和PMEA混合物处理。每隔一天补充含有药物的培养基，共计9日，收集上清液，进行HBV含量分析。
将拉米夫定/PMEA混合物以基质方式一式三份试验2次。实验1所用拉米夫定的浓度范围为100nM至0.14nM(纵列3倍稀释)，PMEA，(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(adefovir)的浓度范围为1μM至10nM(横行3.16倍稀释)。进行实验2所用拉米夫定的稀释浓度范围为100nM至.045nM(纵列3倍稀释)，PMEA的浓度范围为5μM至0.16nM(横行3.16倍稀释)。将两种药物分别在96孔微量滴定板中稀释，然后顺次转移至含有单层细胞的滴定板中。在补充有2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的150μl RPMI 1640培养基中培养细胞。转移药物之前，从细胞中移出120μl培养基，在单层细胞中剩余30μl培养基以防止干燥。加入90μl无药物的新制培养基，然后加入30μl5X药物稀释液。分别测定各自滴定板中相同浓度的拉米夫定和PMEA。将数据归一化为非药物处理的细胞得到的数值，分析采用百分抑制率表示。
测定HBV所用的方法已公开(Jansen RW，Johnson LC，Averett，DR.特异性毒粒(virion)聚合酶链反应测定法体外高效测定抗乙肝病毒化合物选择性，Antimicrob Agents Chem 1993；37(3)：441-447)。简言之，通过从抗-HbsAg包被板的上清液中“获取”病毒、冲洗、变性释放HBV DNA、用生物素酰化引物进行PCR、用伴随探针杂交法链霉亲和素扑获生物素酰化的PCR产物、加入底物、然后读取比色反应的光密度进行HBV测定。每个滴定板中都包括标准化的含有HBV上清液的稀释液，从该HBV标准曲线中计算实验孔中的HBVDNA浓度。测定所用的范围至少是.045-45fg的HBV DNA，其中可很容易检测出基因组的30个模板。用阳性(.448fg/ul质粒DNA)和阴性(补充有2mM L-谷氨酰胺和10％胎牛血清的RPMI培养基)对照测定样本。
通过采用SAS非线性回归拟合适于每个浓度响应曲线的希尔方程的数据计算一式三份滴定板的IC50平均值和IC50标准误差。当对某特定剂量组合的IC50值仅进行单次测定时，可利用相近浓度的平均标准差估算其标准差。计算每种组合的分级抑制浓度(FIC50)，并采用等热辐射测量图(isobologram)表示法画图(Berenbaum，M.C.(1985)，药物组合的期望效果：通用溶液.J.Theor.Bio1.114，413-431)。为测定协同作用或拮抗作用的统计学意义，可利用不配对t-检验对每个配对FIC50值的总和与1的理论值进行比较。P值小于0.05，认为具有统计学意义。必须十分谨慎地说明试验间P值的差异，原因是每个实验采用不同的实验浓度范围(或者用等热辐射测量图方法可适用的范围)。在某些情况下，不是所有的试验浓度都可计算出IC50值，因为所有剂量的大于对照组50％的范围，其响应均被抑制。
图1所示的是从两个试验数据合并得到的单一等热辐射测量图，其表明在统计学上有明显的协同作用。
实施例9
按以下说明测定抑制野生型(WT)和瞬时表达在细胞培养基系统内拉米夫定抗性HBV的PMEA的IC50值。HepG2细胞可被含有HBV基因组的质粒瞬时转染，该基因组具有野生型序列或在逆转录酶基因中含有以下拉米夫定抗性突变体：M552I、M552V、L528M、L528MM552V。先前已确定：虽然个别M552V和L528M突变体体外可降低拉米夫定抑制HBV复制的灵敏度，但在可对拉米夫定疗法产生抗性的HBV感染患者中仅发现M552I和L528MM552V突变体Allen MI，Deslauriers M，Andrews CW，Tipples GA，Walters KA，TyrrellDLJ，Brown N和Condreay LD.(拉米夫定临床调查组)，拉米夫定抗性乙肝病毒突变体的鉴别与特性HEPATOLOGY 1998；27：1670-1677)。
以6300细胞/孔的密度，将HepG2细胞植种于96孔Costar板中的150μl HepG2培养基(含有10％胎牛血清的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM))中，在37℃下孵育过夜。室温下，对每个转染的滴定板孔，在12.5μl OptiMem(Gibco)中，将75 ng质粒DNA和0.5μl脂质转染胺试剂(Gibco)一起孵育30分钟，然后向细胞中加入DNA/脂质转染胺试剂混合物。将每个孔用150μl未补料的DMEM漂洗。以150μl OptiMem培养基的总体积，向每孔中加入DNA/脂质转染胺试剂混合物。在37℃下，将细胞与DNA/脂质转染胺试剂溶液孵育5小时。孵育后，向每孔中加入150μl含有20％血清的DMEM，在37℃下，将滴定板孵育过夜。将培养基用150μl HepG2培养基或含有PMEA的培养基替换。
以2250细胞/孔的密度，将2.2.15细胞植种于96孔Costar板中的150μl完全培养基(含有10％胎牛血清的RPMI培养基)中，在37℃下孵育过夜。将培养基用150μl完全培养基或含有所要求浓度的PMEA的培养基替换。
每隔一天(第1、3和5日)，将转染细胞以及2.2.15稳定的HBV-生产细胞用对照的无药物培养基或含有PMEA的培养基处理。用于细胞处理的PMEA的终浓度为25、5、1、0.2、0.04μM(对于WT质粒转染培养和对照2.2.15细胞)或125、25、5、1、0.2μM(对于所有突变体质粒转染培养基)。
第7日，对从培养基收集的细胞的HBV DNA水平进行定量，采用Jansen RW，Johnson LC，Averett，DR(特异性毒粒聚合酶链反应测定法体外高效测定抗乙肝病毒化合物选择性，Antimicrob AgentsChem 1993；37(3)：441-447)中说明的方法。详细内容见实施例8。
采用DNA染色剂二苄基亚胺(Bisbenzimide)(H333423HCl4H20；Calbiochem Company，La Jolla CA)测定药物治疗引起的的细胞毒性。收集培养基后，将细胞用70％乙醇固定30分钟。将细胞用无血清培养基漂洗一次，然后在37℃下，在无血清培养基中，与浓度为33μg/ml的DNA染色剂二苄基亚胺(H333423HCl4H2O；Calbiochem corporation，La Jolla CA)孵育1小时。用Millipore Cytofluor2350荧光板计数器(激发波长，355nm；发射波长，460nm；任意单位)测定每孔的荧光值。用以下说明的方法，从与未处理(无药物)细胞相比每个浓度化合物的百分比毒性确定各个化合物的CC50值(对50％细胞产生细胞毒性的化合物的浓度)。通过采用非线性回归，将瞬时转染实验中每个组成中产生的浓度响应曲线拟合于希尔方程(y＝Vmax*(1-(x∧n/(k∧n＋x∧n)))估算出IC50值(与平行无药物培养基相比，抑制50％HBV DNA产生的药物浓度)和PMEA的CC50值。显示出计算的每个组成的IC50值具有95％的可信区间，其为n次测定的几何平均值。采用JMP程序(SAS，Cary NC)进行数据的t-检验评估研究以确定治疗组间统计学上的显著性差异。还可将2.2.15细胞(0.43μM)产生的拮抗WT HBV得到的PMEA的IC50值与相同细胞系的IC50值(0.7μM)进行比较。(HeijtinkRA，De Wilde GA，Kruining J.BerkL，BalzariniJ.De Clercq E，Holy A.Schalam SW.(9-(膦酰基甲氧基乙基)腺嘌呤(PMEA)对人体和鸭乙型肝炎病毒感染的抑制作用.AntiviralResearch 1993；21(2)：141-153)。表1.体外WT HBV和含有与拉米夫定抗性突变体有关的HBV之间的PMEA的IC50的比较
HBV构成  IC50 PMEA(95％CI)  x-倍的IC50变化
2.2.15  0.43μM(0.3-0.7μM)        -
WT  0.53μM(0.34-0.8μM)        -
L528M/M552V  1.3μM(0.4-4.3μM)+        2.5
M552I  7.5μM(1.8-32μM)*        14
M552V  9.8μM(3.1-31μM)*+        18
L528M  0.87μM(0.4-2.0μM)        1.6
*突变体HBV和WT HBV之间化合物的IC50有统计学差异，p＜0.05。+彼此的IC50有统计学差异，p＜0.05。对于HepG2细胞，对PMPA的细胞毒性IC50大于125uM，对PMEA的细胞毒性IC50在25-40uM之间变化。

Claims (22)

1.一种药物组合(combination)，它包含(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮或其药学上可接受的衍生物以及第二种治疗剂，其选自：(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物和二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物，其中(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮和第二种治疗剂的重量比的范围为40∶1至1∶1。
2.根据权利要求1的药物组合，其中活性组分的重量比率的范围为25∶1至15∶1。
3.根据权利要求1或2的药物组合，其中第二种治疗剂是二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物。
4.用作药物的根据权利要求1-3中任一项的药物组合。
5.药用制剂，其包含根据权利要求1-3中任一项的药物组合和一或多种药学上可接受的载体。
6.单位剂量形式的根据权利要求5的制剂。
7.适于口服给药的根据权利要求5-6中任一项的制剂。
8.根据权利要求5-7中任一项的制剂，其包含25-150mg的拉米夫定和5-60mg的adefovir dipivoxil。
9.根据权利要求8的制剂，其包含100mg的拉米夫定和10mg的adefovir dipivoxil。
10.治疗HBV感染的哺乳动物(包括人)的方法，它包括给予治疗有效量的药物组合，所述药物组合包含(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮或其药学上可接受的衍生物以及第二种治疗剂，其选自：(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物和二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物。
11.根据权利要求10的方法，其中所述药物组合如权利要求1-3中任一项所定义。
12.根据权利要求10或11的方法，其中所述药物组合同时给予。
13.根据权利要求10或11的方法，其中所述药物组合顺次给予。
14.根据权利要求10或11的方法，其中所述药物组合作为单一组合制剂形式给予。
15.根据权利要求10-14中任一项的方法，该方法用于治疗对抑制乙型肝炎病毒复制的核苷和/或非核苷抑制剂具有抗药性的HBV感染。
16.(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮在制备治疗HBV感染的药物中的用途，该药物与二(新戊酰氧基甲基)(9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤同时或顺次给药。
17.二(新戊酰氧基甲基)(9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基)腺嘌呤在制备治疗HBV感染的药物中的用途，该药物与(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮同时或顺次给药。
18.药物组合治疗HBV感染的用途，所述药物组合包括(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮或其药学上可接受的衍生物以及第二种治疗剂，其选自：(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物和二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物。
19.权利要求1-3中任一项的药物组合治疗HBV感染的用途。
20.药物组合治疗对核苷和/或非核苷抑制剂具有抗药性的HBV感染的用途，所述药物组合包括(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮或其药学上可接受的衍生物以及第二种治疗剂，其选自：(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物或二(新戊酰氧基甲基)(9-[(R)-2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤或其药学上可接受的衍生物。
21.权利要求1-3中任一项的药物组合治疗对抑制乙型肝炎病毒复制的核苷和/或非核苷抑制剂具有抗药性的HBV感染的用途。
22.患者药物包(patient pack)，其含有至少一种选自(2R，顺)-4-氨基-1-(2-羟基甲基-1，3-oxathiolan-5-基)-嘧啶-2-酮和二(新戊酰氧基甲基)(9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤的活性组分以及包括与药物组合一起的关于两种活性组分使用说明的信息插页。
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