TW555559B - Combinations for the treatment of an HBV infection - Google Patents

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555559 w «λι 、丄； ----— f^ ^)-4- 圆b -基）—嘧啶—2 —酮（拉美芙定 (1 am i vud i ne ))及 S — v 一一 乙基m 口票呤，（二EA—，療劑選自（9 —[⑴一2一（膦基甲氧） 氧甲基）（9_[(R) 或亞迪佛維（adefovir))及貳（特戊醯 服前驅藥，亞迪佛唯膦基甲氧)乙基]腺嘌°令’ [PMEA的口 種組合之醫藥組!^皮佛西]。本發明亦係關於含有此 對β型肝炎病毒複m用;感染之用途，包括 之HBV突變感染。 乂苷及/或非核苷抑制劑帶有抗藥性 B型肝炎係一種、忘生α 血液製品、污染的斜母f疾病>，經由污染物質例如血液或 由感染或帶原者母親 而經口或經腸外傳播，以及 行區，早期垂世界上”肝炎流 β型肝炎的慢性帶廣 /目、田问比例的感染個體變成 炎慢性感染’且若，估什全球有3億5千萬人帶有β型肝 病。 以億5千萬人可能死於肝 目前，唯—建立的治療β型 素，但可能引起令人不適的副作人用之道^重複注射干擾 病人可產生長期持久反應。 f僅1/3或以下治療 用來增強免疫系統對抗疾 =士、疋一種免疫調節劑設計 為期兩年的研究右 毒，大半病人之病毒”；：：：有效對抗B型肝炎病 亞迪佛維曾的^毒濃度。 &兩年結束時仍 — 式官試驗具有抗㉔肝炎病毒活性 五、發明說明（2) 一~~一 " — , — ，亞迪佛維之口服前驅藥亦即亞迪佛維〜 型肝炎病毒於活體内的複製具有活性， 、顯示對β Β型肝炎病毒感染病人的第丨丨期臨床研办。刚正在進行慢性 冒報告ΡΜΕΑ對可表現拉美芙定字 ，合酶缺交叉抗藥性，χ· XlQng等;:的人舰 期，第2頁’ 1 99 7年，摘要1211號）。f“26卷’第4 使用本發明的組合可產生主 ，或藥物效果增高，原因為化合：：效果而毒性較低 低總藥物劑量也可減少出現B型肝/广主現協同效果故。較 的頻率。 X病母之抗藥性變異株 杂月人今日發現拉美芙盘 乎意外的優點。特別，組合用;;佛維合併使用時具有出 同抗B型肝炎病毒效果。早期研；；龜不_統計學上有意義的協 維—力皮佛西的組合也具有 、、不拉美芙定與亞迪佛 明之特點為使用此等藥物組人"几型肝炎病毒效果。本發 為完整抑制病毒，更長時間;制3協同抗病毒效果，更 炎病毒突變株的出現，以 帑，限制抗藥性Β型肝 理。使用此等藥物組合也可二如：物關聯毒性係更佳管 少，因此可提高病人的遵從性。母日投藥的藥錠數減 如，界人士了解，此處所述仏 已經確立的感染及症狀的、Λ志療擴展至預防以及擴展至 如盖# w /口療。 拉杲失定、亞迪佛維、 接受性鹽包括衍生自醫可 ^佛維〜力皮佛西之醫藥可 當酸之例包括氫氯酸，^文性無機及有機酸之鹽。適 ^臭酸’崎酸，瑞酸，過氣酸，反

第6頁 555559 五、發明說明（3) ~~~ —~一~^---~~- 丁φ 酸，j瘡'T* 卜么—· ττΑ 、〗烯二酸，磷酸，乙醇酸，乳酸，水楊酸， 一 本—對-磺酸，酒石酸，乙酸，檸檬酸，甲烷石黃 ^ ^ ^，苯f酸，丙二酸，Μ - 磺酸及苯磺酸。其它 酸如草酸，雖妙、士 ό ^本身並非醫藥可接受性，但可用於製備可 θ物的鹽’用於獲得本發明化合物及其醫藥可接受 性酸加成鹽。 狀又 二生自適田鹼之鹽包括鹼金屬（例如鈉），鹼土金 如銨及此射為U基）鹽。 車父佳拉美莫宏、&m 醋係分別選自下列。佛二或Λ迪佛/甘—：皮佛西之較佳 分之非羰基部八待、H ό古（）羧I 颏/、中酯基之羧酸部 Μ 一 °刀糸k自直鏈或分支鏈烷基（例如甲基，正 甲二）弟厂丁基或正I基），環烷基，烷氧烷基（例如甲氧 ，方院基(例如和，繼基( ]甲* 方基（例如苯基選擇性I以例如函原子、c f广二甲基)/ r m 次胺基，（2)頁欠酯類例如烷基—或芳烷美硭妒甘 (例如甲烧續醯基）；（3)胺基酸g旨類（例如 ^ ^ !白；酿基）；及(4)膦酸酿類。此等醋類中，：=或L; 疋’否則任何存在的烷基部分除非另仃規 特另丨π至6個碳原子，更特別15= 3有1至18個碳原子， 類之環烷基部分較佳含有3至6個碳原子。竹存在於此 酉曰類之芳基部分較佳包含苯基。前述任化人:何存在於 獻也包括其生理可接受性鹽之參考文獻Y 口物的參考文 特佳酯類為拉美芙定之一—、二—二书 經封阻），或任何其它投予朵I s曰（可選擇性 于人版％可（直接或間接）提供— 如此祀:據：;：之:1物。 順）〜“胺基—「（^羚t明提供一種組合包含（2R , '或其醫藥可接受性、生%匕氧=圓-5-基)-㈣—2_ 2;(膦基甲氧）乙基]腺$ ^物及第二#種治療劑選自（9-[(r) 武（特戊酿氧甲基）（9 S藥可接受性衍生物，及 其車醫藥可接受性衍生物。〜—（膦基甲氧）乙基]腺嘌呤或 基種治療劑為戴(特戊醯氧甲基)(9-um w ::)乙基]腺嗓呤或其：二)(9丄⑴-2-(膦 :述組合於後文也稱作本二:：=-生物。 於此處’’醫藥可接受性 、、、a 維或亞迪佛維-力皮佛醫1 包括拉美芙定、亞迪佛 之鹽或任何其它化合…醫/予接J生鹽、_或此等， 提供此種化合物或其抗病：活又：S 可直接或間接) 本發明進一步提供 f代5射產物或殘餘物。 B型肝炎疡主、九’、乂據本奄明之酯類用於治療特別 非核苷抑制劑有抗藥性的感染。丙毋禝衣之核苷及/或 根據一方面，本發明提供」 染之哺乳類包括人類之方法，勹：:…有B型肝炎病毒感 本發明之組合。 G 3投予治療有效量之根據 須了解該組合之化合物可回# k Μ 組合物投藥或循序投藥。若為：：2二於相1或不同醫藥 成分的延遲不可長至喪失活性 έ藥’則投予第二活性 、夫疋及亞連佛維—力皮佛西活性或衣 555559 五 發明說明（5) 其醫藥可接受性衍生铷成 物不論為同時或循序提二比3 :弗維或其醫藥可接受性衍生 。拉美芙定及亞迪佛個別或以其任一種組合投藥 醫藥配方同時或循序投藥，西或士亞迪佛維較佳於分開 較佳根據本發日月之組合I。。同，，樂。 亞迪佛維-力皮佛西同時戋循 ’、i佛、准或 毕。項了組知盖金—才次循序投樂治療β型肝炎病毒感 二/、了解拉吳、亞迪佛維—力皮佛西或亞迪佛維或 其任一種組合（亞迪佛維及 ,, 、、’或 於製造前述藥物。 j j用 本發明之又一方面為根據本發明之組合，其中拉美^ 及亞迪佛維-力皮佛西或亞迪佛維係以協同增效比例存 在〇 拉美芙定與亞迪佛維-力皮佛西或亞迪佛維之組合或其 醫藥可接受性鹽的協同效果出現於例如4 〇 : 1至}:丨（重量 比），及較佳2 5 : 1至1 5 : 1 (重量比）之範圍。 方便地各種化合物可以單獨使用時具有抗B型肝炎病毒 活性數量的組合使用。

可有效用作抗B型肝炎病毒劑的拉美芙定、亞迪佛維或 亞迪佛維-力皮佛西之組合用藥當然將改變，且最終係由 醫事從業人員的裁決決定。考慮因素包括投藥途徑及配方 生黃動物體重、年齡及一般情況及接受治療疾病的性質 及嚴重程度。 、 通常拉美芙定之適當每日劑量係於每日每千克接受者體

第9頁 555559 五、發明說明（6) ' 重約0.1至50毫克之範圍，較佳每曰每千克體重0.5至20毫 克，及最佳於每日每千克體重0.5至2毫克之範圍。 化合物可方便地於每日約1 0 0毫克投予。 至於亞迪佛維-力皮佛西，適當每日劑量須於每日每千 克接受者體重約0.01至10毫克之範圍，較佳於每日每千克 體重0.01至1毫克，及最佳於每日每千克體重0.01至0.05 毫克之範圍。 方便地亞迪佛維-力皮佛西係以每日約1 0毫克之量投 藥。 用於亞迪佛維，適當每日劑量係於每日每千克接受者體 重約0 . 0 1至約1 0毫克之範圍，較佳於每日每千克體重0 . 0 1 至1毫克，及最佳於每日每千克體重0.01至0.05毫克之範 圍。 方便地亞迪佛維係以每日約1 0毫克之量投藥。 除非另行指示，否則活性成分之重量係以藥物本身重量 計算。於拉美芙定、亞迪佛維-力皮佛西或亞迪佛維之醫 藥可接受性衍生物或其任一種之溶劑合物之例，數據將呈 比例增高。所需劑量較佳於一日以適當間隔分成二、三、 四、五、六或更多小劑投藥。此等小劑可以單位劑型投 藥，例如含有1至1500毫克，較佳5至1000毫克，最佳5至 5 0 0毫克活性成分/單位劑型。另外，若接受者的情況要 求，劑量可以連續輸注投藥。 可稱作活性成分之組合成分可以習知方式投予動物，例 如哺乳動物包括人類供治療用途。

第10頁 555559 五、發明說明（7) 雖然組合之活性成分可呈原化學品形式投藥，但較佳呈 醫藥組合物呈現。根據本發明之醫藥組合物包括根據本發 明之組合結合一或多種醫藥可接受性載劑或賦形劑，以及 選擇性其它治療劑。載劑就與配方其它成分相容且對接受 者無害之意義而言須為可接受性。當組合之個別成分分開 投藥時，通常係個別存在於醫藥組合物。後文所述組合物 除非另行陳述，否則表示含有該組合或其成分的組合物。 拉美芙定及亞迪佛維-力皮佛西或亞迪佛維或其醫藥可 接受性衍生物之組合可方便地與一或多種醫藥可接受性載 劑呈醫藥組合物存在於單位劑型。方便地單位劑量配方含 _ 有活性成分含量為1毫克至2克，例如2毫克至2 0 0毫克如2 5 至150毫克拉美芙定及5至60毫克亞迪佛維或亞迪佛維-力 皮佛西。 醫藥組合物可以π病人包π形式處方給病人，病人包含有 ’ 全部療程於單一包裝，通常為發泡包裝。病人包優於傳統 _ 處方，傳統處方係樂師由散裝樂物分成多包供應病人 ，病人必須經常看病人包的包裝仿單，但傳統處方的仿單 容易遺失。含括包裝仿單顯然可改善病人遵從醫師囑咐的 順從性。 須了解利用單一包裝仿單内部的單一病人包或各組合物 · 之病人包投予本發明的組合，可使病人正確使用本發明作 為本發明之預定額外特點。 根據本發明之又一方面，提供一種病人包包含至少一種 根據本發明之組合之活性成分，及含有使用本發明之組合 '

第11頁 555559 五、發明說明（8) ~~~ ^ ^ 的指示之資訊仿單。 根據另-方面’本發明提供-種雙重包包含 美芙定及亞迪佛雉-力皮佛西或亞迪佛維或其醫 卞拉 性鹽的組合。 /、_彡、可接受 組合物包括適合經口 直腸、鼻、局部（包括纟<τ<由 用及舌下）、陰道或腸外（包括皮下、肌肉、;^皮、頰 投藥之組合物。組合物可方便以單位劑型、皮内） 業界眾所周知的任一種方法势借。此 ，可以醫藥 又-特點，包括將：性成分與組成一或種發明之 劑締合的步驟。通常配方係經由均句緊成分的載 液體載劑或細分固體載劑或—本缺人 山也將活性成分與 物成形而製備。 “、、傻右有所需將產 適合口服投藥之本發明之叙合物係呈分 劑、小膠囊、豆狀膠囊或錠劑各自含有預定：位例如膠囊 分；呈粉末或顆粒；呈於水 =頂足置的活性成 液；或呈油於水液體或水於3 次體之溶液或懸浮 可主大丸樂、舐劑或糊膏形式。 '活性成分也 錠劑可藉壓縮或模製# Χ ° 分一起製造。壓縮錠之製法^且^擇性與—或多種輔助 式例如粉末或顆粒狀的活性】：：：：壓縮自由流動形 晋維隆（povi done)，明膠，、刀V擇性混合黏結劑（例如 劑，惰性稀釋劑，保藏劑，^，基甲基纖維素），潤滑 交聯普維隆，交聯羧甲基纖=政剤（例如乙醇酸澱粉鈉， 劑。模製錠係經由粉狀化合鉍素鈉），界面活性劑或分散 〇物以惰性液體稀釋劑月 555559 五、發明說明（9) 合物於適當機器模壓製造。錠劑可選擇性包衣或加刻痕， 且可配方成提供緩慢或控制釋放其中所含活性成分，例如 使用羥丙基曱基纖維素以不等比例來提供預定釋放側錄 (Pro f i 1 e )情況。錠劑可選擇性包腸衣來提供於胃以外的 腸道部分釋放。 車父佳根據本發明之組合可經口投藥。

適用於口腔内局部投藥之組合物包括舌下鍵包含活性成 +於矯味基劑，通常為蔗糖及阿拉伯糖或西黃蓍膠；糖錠 ^含活性成分於惰性基劑如明膠及甘油或蔗糖及阿拉伯 ^ ’及漱口水包含活性成分於適當惰性載劑。直腸投藥用 、且5物可呈栓劑存在含有適當基劑係如可可脂或水揚酸 骚。 局部投藥也可利用經皮離子張力電泳裝置。 奸^合供陰道投藥之配方可呈子宮托、棉塞、乳膏劑、膠 =劍、糊膏劑、發泡劑或喷霧配方，除活性成分外含有業 界已知之適當載劑。

適:供直腸投藥之醫藥配方其中載劑為固體，最佳呈單 ，f里检劑。適當載劑包括可可脂及其它業界常用材料 心知可方便形成方式係經由混合活性組合與軟化或溶化 勺載劑，接著為於模具内急冷且成形。 液適^ =腸外，藥之配方包括水性及非水性等張無菌注射 挺為其3有抗氧化劑、緩衝劑、制菌劑及可使配方與預期 广又者的血液主等張性的溶質；以及水性及非水性無菌懸 予液其包括懸浮劑及增稠劑；以及脂小體或其它微粒系統

第13頁 555559 五、發明說明（ίο) _____ 其設計成可將化合物鎖定血液八、 標。配方可呈單位劑量或多义或一或多種器官作為目 裝，且可以冷凍乾燥（凍乾） 〗各is，如安瓿及小瓶包 添加無菌液體載劑如注射用μ 仔’而恰於使用前僅需 浮液可由前述該種無菌粉末、 §周製的注射溶液及懸 較佳單位劑量配方為含古^顆粒及錠製備。 7 5頁前文引、+、 或每日次劑量，或其適♦八旦 迷之活性成分每曰劑量 須了解，除前文特心以=。 栝其它業界習知有關該型配方〃外’本發明之配方可包 方進一步含有甜味劑、拇之作用劑，例如口服投藥配 本發明之組合之化合^ 彳及矯味劑。 〜丨匕口物可以習 拉美芙定之製備方法述於 ^獲得。 抑95/ 29 1 74號，併述於+ P示專利申請第W〇9 1/1 Ή 59及 亞迪佛維之製備方法述 >亏。 此以供參考。 义於區人洲專利第2 0 645 9號，併述於 亞迪佛維-力皮佛西之制 啼，從、+、认a ” / 之衣備方法述於歐洲專利第4 8 1 2 1 4 唬，併述於此以供參考。 下列實例僅供舉例#日日 範圍。"活性成分之用，而絕非意圖園限本發明之 变迪佛維或其多者=吳芙定，亞迪佛維-力皮佛西或 物。 a引迷任一種化合物之生理功能性仿生 UU—L錠劑配左

下列配方A、B及r仫級丄 L 粒 ，垃# 1 石 知、，、二由將各成分使用普維隆溶液濕造 接者加入硬脂酸鎂及壓縮製備

第14頁 555559 五、發明說明（11)

配方A 活性成分A 活性成分B 乳糖B. P. 普維隆B. P. 乙醇酸澱粉鈉 硬脂酸鎂

酉己方B 活性成分A 活性成分B 乳糖B. P. 亞維西（Avicel)PH 101 普維隆B. P. 乙醇酸澱粉鈉 硬脂酸鎮

配方C 活性成分A 活性成分B 乳糖B. P. 毫克/錠 100 30 105 7 10 __3 255 毫克/錠 100 30 75 30 7 10 __3 255 毫克/錠 100 5 100

第15頁 555559 五、發明說明（12) 澱粉 25 普維隆 2 硬脂酸鎂 2 234 下列配方D及E係經由直接壓縮混合成分製備。 乳糖屬於直接壓縮型達利 洛斯（Zeparox)」。 -克雷斯（Dairy Crest) 配方D 毫克/旋 活性成分A 100 活性成分B 30 預膠化澱粉N F 1 5 75 205 配方E 毫克/錠 活性成分A 100 活性成分B 5 乳糖B. P. 70 亞維西 50 225 配方F (控制釋放配方） 本配方係經由各成分與普維隆溶液濕造粒，·接 脂酸鎂及壓縮製備。 毫克/錠 配方E之 -「利帕 •接著加入硬

第16頁 555559 五、發明說明（13) 活性成分A 100 活性成分B 30 羥丙基甲基纖維素 28 (Methocel K4M Permium) 乳糖Β. Ρ· 13 普維隆Β. Ρ. 7 硬脂酸鎂 __2 180 藥物釋放經歷約6 - 8小時，而於1 2小時後完成。 實例2 :膠囊劑配方 ·

配方A 膠囊劑配方係經由混合如上實例1配方D之成分，以及填 裝入二份式硬明膠膠囊製備。配方B (參見下文）係以類似 方式製備。

第17頁 配方B 毫克/膠囊 活性成分A 100 活性成分B 5 乳糖Β. P. 70 乙醇酸澱粉鈉 10 硬脂酸鎂 1 186 配方C 毫克/膠囊 555559

五、發明說明（14) 活性成分A 活性成分B 梅可傑（Macrogel) 4000 B.P 100 30 170 300 配方C膠囊劑係經由熔化美可傑4 0 0 0 B. P ·，分散活性成 分於熔體，以及將熔體填裝入二份式硬明膠膠囊製備。 配方D 毫克/膠囊 活性成分A 活性成分B 卵麟脂 花生油 100 5 50 50 205 配方D之膠囊劑係經由分散活性成分於卵磷脂及花生 油，以及將分散液填裝入軟彈性明膠膠囊製備。 配方E (控制釋放膠囊劑） 如下控制釋放膠囊劑配方係經由使用擠壓機擠壓成分 a、b及c，接著將擠壓產物球化及乾燥製備。然後，乾燥 後的丸粒塗布以控制釋放膜（d )，並填裝入二片式硬明膠 膠囊製備。 毫克/膠囊劑 (a )活性成分A 活性成分B (b )微晶纖維素 00 30 60

第18頁 555559 五、發明說明（15) 60 6 256 (c)乳糖Β· P. (d )乙基纖維素

實例3 :注射劑配方 i己方A 毫克 100 5 活性成分A 活性成分B 鹽酸溶液0 · 1 Μ產 氫氧化鈉溶液0.1Μ適量加至pH 4.0至7.0 無菌水適量加至 10毫升

活性成分溶解於大半水（35 ° -40 °C )及pH以鹽酸或氫氧 化鈉視何者適宜而定調整至4. 0至7. 0。然後批料以水調整 至定容，且經無菌微孔過濾膜過濾至無菌1 0毫升琥珀色玻 璃小瓶（第1型）内，及以無菌封閉件以及外封密封。 i己方B 125毫克 25毫升 100毫克 30毫克 0· 0 6 7 克 0· 94 克 3. 00毫升

活性成分A

無S無熱原p Η 7填酸鹽緩衝液適量加至 實例4 :肌肉注射劑 活性成分A 活性成分B 萆醇 格來芙洛（Glycofurol)75 注射用水適量加至

第19頁 555559 五、發明說明（16) 活>性成分溶解於格來芙洛。然後加入：^醇及溶解，加水 至3笔升。混合物經無菌微孔過濾膜過濾，及密封於無菌3 毫升琥珀色玻璃小瓶内（第1型）。 ψ ^'J 5 ： 活性成分A 活性成分B 山梨糖醇溶液 100毫克 5毫克 0. 6 克 甘油 苯〒酸鈉 橋味劑，桃1 7 · 4 2 · 3 1 6 9 純水適量加至 0.85 克 0· 0 0 2 5 克 0. 0 125毫升 5. 00毫升

如述成分溶解於甘油及大半純水混合物。然後苯甲酸鈉 K /谷液加至/谷液’接著加入山梨糖醇溶液及最終加入矯味 劑。容積以純水調成及徹底混合。 實例6丄座^劑 活性成分A 活性成分B 更月曰 Β·Ρ·(威特索（witepsol)H15~ 待納密諾伯（D y n a m i t N 〇 b e 1 )) 毫克/膠囊栓劑 100 30 1770

姊ϋ ^ f特索H 1 5於最高4 5 °C之水蒸氣罩盤熔化。活性成分 、= 微米篩過篩，及添加至熔融基劑伴以使用配備有切 、、席維森（S 1 1 v e r s 〇 n )混合直到獲得滑順分散液為

555559 五、發明說明（17) 止。混合物維持於45 °C，加入其餘威特索H15至懸浮液， 及攪拌而確保均勻混 合。整個懸浮液通過2 5 0微米不鏽鋼 篩過篩伴以連續攪動 ，許可其冷卻至40 °C。於38 °C至40 °ι 溫度，2. 0 2克混合物填裝入適當2毫升塑膠模具内。許可 栓劑冷卻至室溫。 實例7 :子宮托 毫克/子宮托 活性成分A 100 活性成分B 5 脫水葡萄糖 160 馬鈴薯澱粉 150 硬脂酸鎂 3 418 前述各成分直接混合，並將所得混合物直接壓縮製備子 宮托。 生物資料 實例8 人類肝母細胞瘤細胞系（H e p - G 2 - 2 . 2 . 1 5 )產生的具傳染 性的B型肝炎病毒播種於9 6孔微力價平板，密度為5 X 1 03 細胞/孔。細胞使用拉美芙定與PMEA之組合處理，重複三 板。每隔一日補充含藥培養基經歷9日，此時收集上清液 並分析β型肝炎病毒含量。 拉美芙定/ ΡΜΕ Α組合以矩陣方式以重複三板試驗兩次。 實驗例1使用拉美芙定濃度1 00 nM至0. 14 nM(成行稀釋3

第21頁 555559 五、發明說明（18) 倍），及PMEA，（9-[(R)-2-（膦基甲氧） & 佛維）濃度為1 至10 nM(成列稀釋3 16土 (亞迪 以1〇〇 nM至0.04 5㈣之拉美芙定稀釋（成㈣釋霄立驗例2係 “至0.16 nM PMEA之稀釋（成列稀釋3 16 /) ’及5 藥物皆稀釋於分開96孔微力價平板，隨㈣轉至仃含::種 層的平板。細胞於150微升RPMI 164〇生長，其 、匕早 L-麩胺及10%胎牛血清。移轉藥物前，由細胞取出 =養基，留下3 0微升於單層上以防乾燥。加入9 〇微升不含 藥物的新鮮培養基，接著加入3〇微升5χ藥物稀釋液。拉美 芙定及PMEj分別於相等濃度於各別平板測試。資料規度化 至使用非藥物處理細胞所得數值，並以占分析用對照組的 百分比表示。 前文說明用於偵測B型肝炎病毒之方法（Jansen RW， Johnson LC’ Averett博士，藉病毒粒子特異性聚合酶連 鎖反應檢定分析於高容量試管試驗評估抗β型肝炎病毒化 合物之選擇性。抗微生物劑化學1 9 9 3 ; 3 7 ( 3 ): 441 -44 7 )。簡言之，Β型肝炎病毒的檢測係經由,，捕捉，，得 自上清液之病毒於抗Β型肝炎表面抗原塗布平板，洗滌，

變^而釋放出Β型肝炎病毒DNA，使用生物素化引子進行聚 合酶連鎖反應，鏈絲菌抗生物素捕捉生物素化聚合酶連鎖 反應產物同時進行探針雜交，加入酶基質，及 應的光密度。標準含B型肝炎病毒上清液之稀.釋液含括於 各平板，試驗孔之HBV DNA濃度係由此β型肝炎病毒標準曲 線計算而得。有用的檢測範圍至少為〇· 〇45至45 ^之hbv

第22頁 555559 五、發明說明（19) ! DNA，此處可可靠地偵測3 0套基因組複本。樣本經試驗， j同時進行陽性（.448 ig/微升質體DNA)及陰性（RPMI培養基 |補充2 mM L-鼓胺及1 0%胎牛血清）對照。 j 重複二板的平均IC5Q及IC5G的標準差係使用s A S非線性回 I歸計算，而將資料配合各濃度—反應曲線的喜爾（H i丨丨）方 |程式。當僅可對特定劑量組合作單次ic5G測定時，臨近濃 I度的標準差平均用來估計標準差。對各組合計算部分抑制 |濃度（FIC50)，且使用測同位素轄射熱代表圖作圖 丨（Berenbaum， M· C· (1985))合併用藥的預期效果：一般解 j 決之道。J· Theor· Biol. 114， 413-431)。為了 評估協 同作用或拮抗作用的統計學意義，使用非成對t試驗來比 丨較成對F I C 5 0值之和與理論值1。小於〇 · 〇 5之P值視為具有 ；統計學意義。比較各實驗的P值須審慎解讀，原因為實驗 中使用不同試驗濃度範圍（或在同位素輻射熱方法有用的 I範圍）°若干例中並非全部試驗濃度皆證實IC5G的計算，原 !因為對全部劑量之反應皆受抑制至高於對照組的50%的程 I度。 圖1顯示單張測同位素輻射熱圖，係將得自兩實驗資料 :合併產生且顯示統計學上有意義的協同效果。 :實例9 PME A之1 係對野生型（WT )測定，拉美芙定抗藥性β型肝 丨炎病毒一過性表現於細胞培養系統如下。HepG2細胞使用 :含B型肝炎病毒基因組的質體一過性轉移感染，該基因組 具有野生型列序，且含有下列拉美芙定抗藥性突變於反錄

第23頁 555559 五、發明說明（20) 酶基因；M552I ，M552V ，L528M ，L528MM552V 。先前決定 唯有M5 52 I及L52 8MM552V突變才出現於對拉美芙定治療出 現抗藥性的B型肝炎病毒感染病人，但個別M5 5 2 V及L52 8M 突變也部分促成於試管試驗中拉美芙定對B型肝炎病毒複 製敏感性的喪失（Allen MI， Deslauriers Μ，Andrews CW， Tipples GA， Walters KA， Tyrrell DLJ, Brown N屬 於拉美芙定臨床研究小組，以及Condreay LD.對拉美芙定 具抗藥性之B型肝炎病毒突變之鑑別與特徵化。肝病學 1998 ; 27 : 1670-1677)。HepG2細胞播種於96孔柯斯達 (Costar)平板，密度為每孔63 0 0細胞於150微升HepG2培養 基（杜別可改質鷹氏培養基（DMEM)，含10%胎牛血清）及於 37 C培養隔夜。對各轉移感染孔，75毫微克質體DNA與0.5 微升利晋菲明（1 i ρ 〇 f e c t a m i n e )吉伯寇（G i b c 〇 )於室溫於 12· 5微升歐地曼（〇ptiMem)(吉伯寇）共同培育3〇分鐘，隨 後將D N A /利普菲明混合物添加至細胞。各孔以1 5 〇微升未 經補充的DME Μ清洗。DNA /利普菲明混合物於總容積丨5 〇微 升歐地曼培養基添加至各孔。細胞於3 7 °C與D N A /利普菲明 溶液共同培育5小時。培育後，1 50微升含20%血清之DMEM 添加至各孔，及平板於3 7 °C培育隔夜。培養基僅以丨5〇微 升HepG2培養基或含PMEA培養基替代。 2.2· 15細胞於150微升完全培養基（rpmi培養基含有 月□牛血β )以母孔2 2 5 0細胞播種於9 6孔柯斯達平板，及於 3 7 C培育隔夜。培養基以僅含1 5 0微升完全培養基或含預 定濃度之ΡΜΕ Α之培養基替代。

— 第24頁 555559 五、發明說明（21) 轉移感染細胞以及2 · 2 · 1 5穩定B型肝炎病毒產生之細胞 每隔一曰使用不含藥物的對照培養基或含PMEA的培養基處 理（第1、3及5日）。用於細胞處理之PMEA終濃度為25、5、 1、0.2、0.04从Μ(用於WT質體轉移感染培養基對照 2·2·15細胞）或125、25、5、1，〇·2 //Μ(用於全部突變質 體轉移感染培養）。 於第7日由細胞收穫培養基使用jansen rw，Johnson LC，Averett博士，藉病毒粒子特異性聚合酶連鎖反應檢 定分析於高容量試管試驗評估抗B型肝炎病毒化合物之選 擇性。抗微生物劑化學1 9 9 3 ; 3 7 ( 3 ) : 4 41 - 4 4 7所述方法 _ 定量Η B V D N A濃度。進一步細節如實例8所述。 因藥物治療造成的細胞毒性係使用DNA染色劑貳苯醯亞 胺（Bisbenzimide)測定（H33342 3HC1 4H20 ;卡百坎 (Calbi ochem)公司，加州，拉荷拉）。收穫培養基後，細 _ 胞使用7 0 %乙醇固定3 0分鐘。細胞以不含血清的培養基清 _ 洗一次，及與DNA染色劑貳苯醯胺（H33342 3HC1 4H20 ;卡 百坎公司，加州，拉荷拉）於3 3微克/毫升於不含血清的培 養基於37 °C培育1小時。每孔的螢光值係使用米利玻 (Mi llipore)塞托弗（Cy t〇fl uor ) 23 5 0螢光平板閱讀機測定 (激光，3 55毫微米；發光，460毫微米；任意單位）。各化鲁 合物之CC5。值（對5 0 %細胞具有細胞毒性的化合物濃度）係由 各種濃度化合物之百分毒性測定，且使用下述方法與未經 治療（不含藥）細胞比較。 於一過性轉移感染實驗由各種建構體產生的濃度—反應 ·

第25頁 555559 五、發明說明（22) 曲線配合喜爾方程式（y二Vmax*(l〜（χ，η/(}Γη + χ.η)))使 用非線性回歸來估計ΡΜΕΑ的ICSG (抑制Ηβν DNA的產生達50% 之藥物濃度’且與平行不含藥培養比較）及以⑼。計算得各 種建構體的I 顯示為對η次重複的幾何平均具有9 5 %可信 度限度。程式JMP (S AS公司，北卡羅來納州，卡里市）用 來進行資料的學生t試驗評估用來決定各處理組間具有統 计學上有意義的差異。對2.2.15細胞（〇·43 μΜ)產生的WT HBV所得PMEA之I Cm也比較使用相同細胞系產生的IC5G值（

0·7 //M) 0(Heijtink RA，De Wilde GA，Kruining J， Berk L，Balzarini J· De Clercq E，Holy A，Schalam SW。9-(膦基甲氧乙基）腺嘌呤（PMEA)對人及鴨B型肝炎病 毒感染的抑制效果。抗病毒研究1 9 9 3 ; 2 1 ( 2 ): 14 卜 153)。

表1 ·於試管試驗中WT HBV與含拉美芙定抗藥性關聯突變 之HBV間之PMEA IC5D的比較 B型肝炎結構體 ICs〇 PMEA(95%CI) χ倍改變IC5〇 2.2.15 0.43 μΜ (0.3-0.7 μΜ) 一 WT 0.53 μΜ (0.34-0.8 μΜ) L528M/M552V 1.3 μΜ (0.4-4.3 μΜ) + 2·5 M5 52I 7.5 μΜ (1.8-32 μΜ)* 14 M5 52V 9.8 μΜ (3.1-31 μΜ)* + 18 L528M 0.87 μΜ (0.4-2.0 μΜ) 1.6

第26頁 555559 五、發明說明（23) *突變HBV與WT HBV間化合物之IC5Q具有統計學差異 ρ < 0 · 0 5 〇 *IC5{)彼此具有統計學差異，p<0. 05。 對HepG2細胞而言，PMPA之細胞毒性IC50大於1 2 5 PMEA之細胞毒性IC5Q為25至40 //Μ。

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Claims (1)

1. 555559 ;分: 修正丨 案號 88117512 六、申請專利範圍 1 · 一種用於治療HBV感染之組合，包含（2R，順）-4 -胺基 - 1 -（2 -羥甲基-1,3-氧硫伍圜-5 -基）-嘧啶-2 -酮或其醫藥 可接受性衍生物，以及第二種治療劑選自（9-[ (R)-2-(膦 基甲氧）乙基]腺嘌呤或其醫藥可接受性衍生物，及貳（特 戊醯氧甲基）（9-[(R)-2-(膦基曱氧）乙基]腺嘌呤或其醫藥 可接受性衍生物，其中（2R，順）-4 -胺基-1-(2 -羥甲基-1， 3 -氧硫伍圜-5 -基）_嘧啶-2 -酮及第二治療劑係以4 0 : 1至1 : 1重量比之範圍存在。 2 ·如申請專利範圍第1項之組合，其中該比例係於2 5 : 1 至1 5 : 1活性成分重量比之範圍。 3. 如申請專利範圍第1或2項之組合，其中該第二治療劑 為貳（特戊醯氧甲基）（9-[(R)_2-（膦基甲氧）乙基]腺嘌呤 或其醫藥可接受性衍生物。 4. 如申請專利範圍第1或2項之組合，其係用於藥物。 5. —種用於治療H BV感染之醫藥組合物，包含如申請專 利範圍第1至3項中任一項之組合締合一或多種醫藥可接受 性載劑。 6 ·如申請專利範圍第5項之組合物，其係呈單位劑型。 7.如申請專利範圍第5或6項之組合物，其適合經口投 藥。 8 .如申請專利範圍第5或6項之組合物，其包含2 5至1 5 0 毫克拉美芙定（lamivudine)及5至60毫克亞迪佛維-力皮佛 西（adefovir dipivoxil) ° 9.如申請專利範圍第8項之組合物，其包含1 0 0毫克拉美

   O:\60\60367-920520.ptc 第29頁 555559 _案號88117512_Y工年J：月/日 修正_ 六、申請專利範圍 芙定及10毫克亞迪佛維-力皮佛西。 1 0 .如申請專利範圍第1項之組合，其中活性成份係為同 時投藥。 1 1 .如申請專利範圍第1項之組合，其中活性成份係為循 序投藥。 1 2.如申請專利範圍第1項之組合，其中活性成份係呈單 一組合物投藥。 1 3.如申請專利範圍第1項之組合，其係用於治療對Β型 肝炎病毒複製的核苷及/或非核苷抑制劑具有抗性之Β型肝 炎病毒感染。

   O:\60\60367-920520.ptc 第30頁