CN1266059A - 通过在聚合树脂柱上的工业制备低压色谱分离和纯化紫杉醇和其它相关的紫杉烷类化合物 - Google Patents

通过在聚合树脂柱上的工业制备低压色谱分离和纯化紫杉醇和其它相关的紫杉烷类化合物 Download PDF

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Abstract

一种从含有紫杉烷类化合物的原料中高收率和高纯度地获得紫杉烷类似物的方法。该方法使用聚合树脂膜用于在低压下分离类似物并且不使用现有技术中常用的复杂和昂贵分离/纯化步骤。

Description

通过在聚合树脂柱上的工业制备低压色谱分离 和纯化紫杉醇和其它相关的紫杉烷类化合物
本发明涉及分离技术，本发明更具体地涉及分离紫杉醇和相关的紫杉烷类化合物的技术。
紫杉醇是已知的用于治疗各种转移癌的化学治疗药物。它已经被FDA和HPB批准用于治疗卵巢癌和乳腺癌。
该化合物最初是从太平洋紫杉树，短叶红豆杉的树皮中提取的天然产物，并且发现它也存在于欧洲红豆杉，喜马拉雅红豆杉，云南红豆杉和加拿大红豆杉中。
紫杉醇在各种原材料中的浓度典型地都很低，例如在太平洋紫杉树皮中的含量在0.0004和0.01％(w/w)之间。如此低的浓度使从原材料中提取和纯化该化合物以达到药品纯度是非常困难的，因此难以实现商业规模的生产。已经开发了多种从原材料的粗提物中纯化紫杉醇的正相和反相色谱以及低压和高压柱色谱技术。
低压色谱的成功主要取决于柱的特性。很多问题均与硅胶和三氧化铝的使用有关，而它们均是分离系统中固定相的传统载体。它们与大多数溶剂系统形成一个稳定的固定相，但它们是强吸收剂并且会在一定程度上参与分离过程而影响色谱性能和样品的回收。
已经开发了多种在分析和制备的基础上从多种红豆杉植物中检测和分离紫杉醇的色谱方法。这些分离方法主要是在小的实验室规模下进行的并且由于低选择性，回收和产品成本高等问题，因此迫切需要开发一种经济实用的方法从相似的三尖杉宁碱和其它近似的相关紫杉烷类化合物中分离有价值的抗癌化合物紫杉醇。
现有技术中公开了使用各种色谱技术分离紫杉醇和相关紫杉烷类化合物的方法，包括在硅胶或键合硅胶柱上的正相和反相色谱。现有技术的方法由于收率低，产品成本高或包括多步难以大规模工业化生产的分离步骤而被放弃。
现有技术主要有1997年4月15日发行的Hoffman等的美国专利5,620,875。该文献指出了通过多步己烷萃取和高效液相色谱(HPLC)分离紫杉醇和其它紫杉烷类化合物的方法。该方法包括，劳动强度的增加但却只能提供中等收率的所需化合物。
在1997年9月23日出版的Rao等的美国专利5,670,673中，描述了紫杉醇和其类似物的分离和纯化。该方法包括在C18吸附剂上的反相液相色谱并用吸附的类似物洗脱。虽然这些方法有可取的地方，但鉴于其生产力和所得到化合物的纯度该技术存在其局限性。
本发明提供基于聚合树脂柱的简单分离方法而没有上述方法的局限性。
因此本发明的目的是提供简单和更经济有效的方法分离和纯化重要的紫杉烷类化合物，如13-乙酰基-9-二氢浆果赤霉素III，10-去乙酰基浆果赤霉素III，浆果赤霉素III，三尖杉宁碱和紫杉醇。
分离包括紫杉醇，13-乙酰基-9-二氢浆果赤霉素III和浆果赤霉素III的紫杉烷类化合物的常规方法通常含有用醇溶剂从原材料中提取紫杉烷类化合物，将提取物脱脂，用色谱法分离和纯化单一的紫杉烷类化合物的步骤。
本发明的一个目的是提供从含有紫杉烷类化合物的原料中分离和纯化紫杉烷类似物的方法，包括：
用有机萃取剂萃取紫杉烷原料；
用萃取剂覆盖吸附介质并将介质填充到柱中，该柱中含有吸附剂；
第一步，在10和20psi之间的压力下用有机溶剂混合物洗脱得到含有紫杉烷化合物的洗脱部分；
使该部分结晶以得到固体紫杉烷类化合物和母液；将母液浓缩，并且
第二步，将母液通过聚合树脂并用极性溶剂混合物洗脱得到至少第二个紫杉烷化合物。
本发明的进一步目的是提供从含有紫杉烷类化合物的原料中分离和纯化紫杉烷类化合物的方法，包括：
提供紫杉烷类化合物原料；
将紫杉烷类化合物从原料中萃取至有机萃取剂介质以制备含有紫杉烷类化合物的有机层；
用有机层处理载体材料；
制备含有吸附剂的低压柱；
第一步，通过色谱柱洗脱有机溶剂至洗提到纯化的紫杉烷洗脱部分；
使紫杉烷洗脱部分结晶得到第一个紫杉烷类似物和母液；
第二步，通过在色谱柱上的聚合树脂洗脱母液以纯化并洗脱至至少第二个紫杉烷类似物和第三个紫杉烷类似物；和
收集分离的紫杉烷类似物。
本发明的进一步目的是提供从含有紫杉烷类化合物的原料中分离和纯化紫杉烷类化合物的方法，包括：
提供紫杉烷类化合物原料；
将紫杉烷类化合物从原料中萃取至有机萃取介质中以制备含有紫杉烷类化合物的有机层；
用有机层处理载体材料；
制备含有吸附剂的低压柱；
第一步，在10至20psi的压力下通过色谱柱洗脱有机溶剂至洗提到纯化的紫杉烷部分并除去黄酮和木酚素杂质；
使紫杉烷洗脱部分结晶得到第一个紫杉烷类似物和母液；
第二步，在30psi的压力下通过在色谱柱上的聚乙烯DVB树脂洗脱母液以纯化并洗脱至至少第二个紫杉烷类似物和第三个紫杉烷类似物；和
第三步，将第二个紫杉烷类似物和第三个紫杉烷类似物通过正相硅胶柱洗脱以纯化第二个紫杉烷类似物和第三个紫杉烷类似物；和
收集分离的紫杉烷类似物。
起始的紫杉烷类化合物原料可以是植物原料，盛产于加拿大东部的加拿大红豆杉，使用加拿大红豆杉的树枝或针叶或其混合物。原料可以是新采集的或干燥的。
将原料粉碎并用甲醇在60℃萃取5小时并过滤。将甲醇萃取液与活性炭混合并室温静置1小时。然后过滤。将滤液蒸发浓缩至最初体积的约15％。在浓缩物中加入1∶1的水∶二氯甲烷混合物(v/v)得到富含紫杉醇的部分(有机层)。
将有机层浓缩至小体积并将其覆盖在载体材料上，此时，载体材料是硅藻土545。
将覆盖的材料装载在工业制备柱(例如150mm×1500mm并填充了吸附剂Al2O3的柱子)顶部。将该柱用己烷∶丙酮混合物(开始为100∶0最后为45∶55)在10psi至20psi的压力下洗脱。收集含有紫杉烷类混合物的洗脱部分并通过薄层色谱(TLC)分析并随后根据TLC结果合并。
将收集的洗脱部分真空浓缩，将所得材料溶解在甲醇中并在室温过夜。将所形成的晶体过滤并用甲醇洗涤，然后用丙酮重结晶。得到13-乙酰基-9-二氢浆果赤霉素III的白色结晶。
将母液浓缩至干并将残余物溶解在丙酮中。将丙酮溶液与聚合树脂(DowexTM树脂，聚乙烯DVB)混合。将混合物减压蒸发除去丙酮。将所得粉末进行低压色谱层析。将工业规模的色谱柱(150mm×1500mm)填充以DowexTM树脂并用丙酮：水(45∶55，v/v)以流速150ml/min在30psi的操作压下洗脱。以约每份2L收集洗脱部分并将其用TLC和HPLC监控。将含有浆果赤霉素III和10-去乙酰基浆果赤霉素III的洗脱部分合并并减压蒸发除去几乎所有有机溶剂，然后用水洗脱并用CH2Cl2萃取。将萃取液浓缩至干并将所得残余物溶解在EtOAc中并用正相硅胶柱以己烷∶EtOAc作溶剂系统(开始为5∶5最终为35∶65)进行色谱纯化。最后得到浆果赤霉素III和10-去乙酰基浆果赤霉素III的白色粉末且纯度高于98％。
将含有紫杉醇和三尖杉宁碱的洗脱部分合并并真空蒸发除去几乎所有丙酮，然后将其在水和CH2Cl2之间分配，分离有机层并真空蒸发至干。将残余物溶解在甲醇中。在该甲醇溶液中加入大约30％(w/v)的水并将混合物在60℃加热5分钟，然后室温过夜。将甲醇溶液中的粗结晶固体过滤并在70℃至75℃真空干燥。将固体用HPLC分析。其中含有约70％的紫杉醇和25％的三尖杉宁碱，及一些其它紫杉烷类化合物。
紫杉醇粗品可以用三种不同方法中的一种处理。第一，可以将其溶解在丙酮中并用反相柱色谱纯化。将色谱柱用聚合树脂填充(Diaion树脂，HP2MG)并用乙腈∶水(45∶55)洗脱。所得紫杉醇为白色结晶且纯度高于99％。所得三尖杉宁碱为白色粉末且纯度高于98％。
另外，第二种方法，紫杉醇和三尖杉宁碱可以通过化学反应然后再通过键合硅胶反相柱色谱纯化。将紫杉醇，三尖杉宁碱混合物粗品溶解在CH2Cl2或CHCl3(1∶10，w/v)中，使其在置于冰浴(在0℃至5℃之间)中的圆底烧瓶中与10当量溴反应约40分钟。将所得紫杉醇和2”，3”-溴代三尖杉宁碱的混合物容易地通过反相色谱柱(C18或苯基)，以CH3CN∶H2O(45∶55)洗脱而分离。所得紫杉醇为白色结晶且纯度高于99％。所得2”，3”-溴代三尖杉宁碱为非对映异构体混合物，将其与在乙酸中活化的锌于室温下反应，然后用闪式色谱柱纯化得到纯度高于95％的纯三尖杉宁碱。
另外第三种方法，将紫杉醇和溴代三尖杉宁碱用正相硅胶柱纯化。洗脱的溶剂系统包括己烷∶EtOAc(开始为6∶4最后为4∶6)，或CH2Cl2∶Me2CO(开始为8∶2最后为65∶35)或CH2Cl2∶EtOAc(开始为75∶25最后为6∶4)。从该方法中得到的紫杉醇为白色结晶，纯度高于99％，且三尖杉宁碱的含量低于0.2％。
为了说明本发明，下列实施例对本发明提供了更准确的参考。
实施例1
在60℃的温度下，将约200千克加拿大红豆杉的干燥针叶和树枝用1000升甲醇在工业多功能萃取器中萃取5小时然后过滤。将原材料用700升甲醇在55℃和60℃之间的温度下再萃取4小时并过滤。将滤液合并并与10千克活性炭(5％w/w)混合并室温静置1小时，然后过滤除去活性碳。将滤液真空浓缩至约100升，然后在其中加入300升水∶二氯甲烷(1∶1)。收集有机层，然后将水溶液用200升二氯甲烷萃取两遍以上。合并二氯甲烷溶液并真空蒸发至成淤将形式，然后用20升丙酮稀释。
将丙酮溶液覆盖在20千克硅藻土545上。将表层材料用空气干燥然后装载到三个低压工业色谱柱上(直径150×15cm)。将每个色谱柱填充1 5千克氧化铝(Al2O3)吸附剂。应该理解色谱柱的准确直径并不是关键的只要该柱足够大以便足以填充用于分离的Al2O3便可。使用氧化铝可以有效地吸附从原料中一起被萃取出来的黄酮和木酚素。它们难以除去而且也是影响最终的紫杉醇产品纯度的问题。
将色谱柱在10至15psi的压力下用溶剂系统己烷∶丙酮(开始为100∶0最后为45∶55)以约150ml/min的流速洗脱。
收集含有紫杉烷类化合物的洗脱部分并根据薄层色谱(TLC)结果合并，然后真空浓缩除去溶剂。将所得材料溶解在甲醇中并在室温静置过夜，得到针状结晶。将晶体过滤并用丙酮重结晶进一步得到白色针状结晶确定为13-乙酰-9-二氢浆果赤霉素III且纯度高于96％(148克)(基于原料为0.074％)。
将从13-乙酰-9-二氢浆果赤霉素III结晶的母液真空浓缩至干。将残余物溶解在3升丙酮中。将丙酮溶液与1.5千克聚苯乙烯-二乙烯基苯共聚物树脂混合。将混合物蒸发除去溶剂并将所得粉末装载在填充聚苯乙烯-二乙烯苯共聚物树脂的低压工业色谱柱的顶部，并用45％的丙酮水溶液以150ml/min的流速在30psi的操作压力下洗脱。以每份2L收集洗脱部分并将它们用TLC和HPLC监控。
将含有紫杉醇和三尖杉宁碱的洗脱部分合并并真空蒸发除去大部分丙酮，然后用去离子水稀释并用2.5升二氯甲烷萃取三次。将有机层真空浓缩至干，将残余物溶解在1升甲醇中。
在该甲醇溶液中加入30％(w/v)水并将混合物在60℃加热几分钟然后室温过夜。将从甲醇溶液析出的粗结晶固体过滤并在70℃至75℃的温度下真空干燥。得到31克由约70％的紫杉醇和约25％的三尖杉宁碱组成的固体。
将紫杉醇粗品(30g)溶解在200ml乙腈中并用250ml去离子水稀释并将其抽入低压色谱柱(尺寸：10×150cm)中并填充聚合树脂(Diaion，大孔聚甲基丙烯酸酯)。将样品抽入后将色谱柱用35，40，45和50％的乙腈/水梯度洗脱。溶剂的变化由洗脱部分的TLC和HPLC结果指示。
以每份约1升收集洗脱部分并用TLC和HPLC分析监控。流速为75ml/min。将含有紫杉醇或三尖杉宁碱的柱洗脱部分分别合并。将两个合并的溶液在约5℃静置直至各化合物分别完全结晶。
将结晶分别过滤并将它们在65℃的甲醇水中重结晶。
得到18.5g(0.009％)紫杉醇的白色针状结晶且纯度高于99％。
得到6.5g(0.003％)三尖杉宁碱的白色针晶且纯度高于98％。
将从上一步骤得到的含有浆果赤霉素III和10-去乙酰基浆果赤霉素III的洗脱部分合并并真空蒸发除去几乎所有丙酮，然后将它们在3升水和二氯甲烷(1∶1v/v)之间分配。将有机层浓缩至干并将残余物进行正相色谱。色谱柱的尺寸为4”×4’，并填充硅胶(200-300目)。洗脱溶剂是梯度的己烷∶乙酸乙酯(开始为50∶50最后为35∶65)。以约每份1,000ml收集洗脱部分并将各份用TLC监控。
将含有浆果赤霉素III或10-去乙酰基浆果赤霉素III的洗脱部分分别收集并根据TLC结果合并，然后浓缩至干。
将浆果赤霉素III部分溶解在200ml甲醇中并在冰箱中过夜。将所形成的白色结晶过滤并将其在甲醇中重结晶得到7.5g(0.003％)浆果赤霉素III的白色结晶。
将10-去乙酰基浆果赤霉素III粗品溶解在150ml丙酮中然后用150ml己烷稀释。将混合物室温过夜。将所形成的白色结晶过滤并用相同的溶剂重结晶得到10-去乙酰基浆果赤霉素III白色结晶。得到15g(0.007％)。
实施例2
用与实施例1相同的仪器和方法，得到紫杉醇粗品。将紫杉醇粗品溶解在300ml加在1,000ml三颈圆底烧瓶中的二氯甲烷中。将烧瓶置于冰浴中并将溶液用磁力搅拌器搅拌。当温度达到5℃时，搅拌下缓缓加入溴(10当量)在二氯甲烷中的溶液(1∶1v/v)。三尖杉宁碱的溴代率为1至10摩尔。
在5至10分钟间用TLC分析监控溴代反应。然后在反应完全后(反应完成的时间需要40至50分钟)将反应混合物用300ml二氯甲烷稀释并将其转移至分离的漏斗中。在该反应混合物中，加入350ml10％的硫代硫酸钠(Na2S2O3)水溶液以吸收过量的溴。分离二氯甲烷层并用水和盐水洗涤。然后真空浓缩至干，得到浅灰色粉末。
实施例3
将实施例2得到的粗材料(10g)溶解在120ml用150ml去离子水稀释的乙腈中。将溶液抽入反相色谱柱(5×100cm)的顶部并填充C18键合硅胶。
将色谱柱在30至40psi的操作压下用乙腈∶水(45∶55)洗脱。流速30ml/min。收集洗脱部分(每份250ml)，用TLC监控并合并。
将含有紫杉醇的部分冰冻过夜；将所形成的结晶过滤并用70％的甲醇重结晶。得到6.1g纯度高于99％的紫杉醇针状结晶。
将含有2”，3”-溴代三尖杉宁碱的洗脱部分合并，并在水和二氯甲烷之间分配。收集有机层并真空蒸发至干。将残余物溶解在150ml甲醇中，用50ml水稀释得到针状结晶。将白色结晶在甲醇∶水中重结晶得到2”，3”-溴代三尖杉宁碱的白色结晶。
将2克2”，3”-溴代三尖杉宁碱溶解在30mlAcOH中并加入新活化的锌(2g)。将混合物室温搅拌3小时并将反应通过TLC监控。TLC分析显示反应完全后，将混合物在二氯甲烷和10％NaHCO3(300ml，2∶1)之间分配。将有机层用水洗涤并浓缩至干。将粗品用闪式色谱纯化得到三尖杉宁碱的白色粉末。
实施例4
将实施例2得到的原料粗品(10g)溶解在120ml二氯甲烷中。将有机层浓缩至干并将残余物进行正相色谱。色谱柱的尺寸为4”×4’并填充硅胶(200至300目之间)。洗脱溶剂为梯度的二氯甲烷∶乙酸乙酯(开始75∶25最后6∶4)，分离紫杉醇和2”，3”-溴代三尖杉宁碱的溶剂系统为己烷∶乙酸乙酯(开始6∶4最后4∶6)且二氯甲烷∶丙酮(开始8∶2最后65∶35)也可使用。以每份约500ml收集洗脱部分，并将每份用TLC监控。
分别收集含有紫杉醇和2”，3”-溴代三尖杉宁碱的洗脱部分并根据TLC结果合并，然后浓缩至干。
将紫杉醇部分溶解在100ml甲醇中并用35ml水是、稀释，然后冰冻。将形成的白色结晶过滤并用甲醇∶水重结晶得到紫杉醇(5.5g)白色结晶。
将2”，3”-溴代三尖杉宁碱粗品溶解在50ml丙酮中然后用50ml己烷稀释。将混合物室温过夜。将所形成的白色结晶过滤并用相同的溶剂系统重结晶得到2”，3”-溴代三尖杉宁碱白色结晶。
下列实施例以结构式的形式说明化合物。紫杉醇
Figure A0010211800142
三尖杉宁碱
Figure A0010211800151
10-去乙酰基浆果赤霉素IV＝R＝H
Figure A0010211800152
13-乙酰基-9-二氢浆果赤霉素III
虽然本发明方案如上所述，但并不因此限制本发明而且不背离权利要求和所述发明的精神，特性和范围，对本发明所作的各种改变对本领域普通技术人员而言是显而易见的。

Claims (20)

1.从含有紫杉烷类化合物的原料中分离和纯化紫杉烷类似物的方法，包括：
用有机萃取剂从紫杉烷原料中萃取；
用所述萃取剂覆盖吸附介质并将所述介质填充到柱中，该柱含有吸附剂；
第一步，在10至20psi的压力下用有机溶剂混合物洗脱得到含有紫杉烷类化合物的洗脱部分；
使该部分结晶以得到固体紫杉烷类化合物和母液；将所述母液浓缩，并且
第二步，将母液通过聚合树脂并用极性溶剂混合物洗脱得到至少第二个紫杉烷类化合物。
2.根据权利要求1的方法，在所述第一步进一步包括除去木酚素和黄酮杂质的步骤。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的紫杉烷类化合物原料包括植物原料。
4.根据权利要求3的方法，其中所述植物原料选自一种下列植物：短叶红豆杉，欧洲红豆杉，喜马拉雅红豆杉，云南红豆杉和加拿大红豆杉。
5.根据权利要求3的方法，其中所述紫杉烷类化合物至少包括13-乙酰基-9-二氢浆果赤霉素III，10-去乙酰基浆果赤霉素III，浆果赤霉素III，三尖杉宁碱，紫杉醇。
6.根据权利要求1的方法，其中所述有机萃取剂包括二氯甲烷。
7.根据权利要求1的方法，其中弱吸收介质包括硅藻土545。
8.根据权利要求1的方法，其中吸收剂包括氧化铝。
9.根据权利要求1的方法，其中第一步有机溶剂混合物包括己烷和丙酮。
10.从含有紫杉烷类化合物的原料中分离纯化紫杉烷类化合物的方法，包括：
提供紫杉烷类化合物原料；
将紫杉烷类化合物从所述原料中萃取至有机萃取介质中以制备含有紫杉烷类化合物的有机层；
用有机层处理载体材料；
制备含有吸附剂的低压柱；
第一步，通过色谱柱洗脱有机溶剂至洗提到纯化的紫杉烷部分；
使所述紫杉烷部分结晶得到第一个紫杉烷类似物和母液；
第二步，通过在色谱柱上的聚合树脂洗脱所述母液以纯化并洗脱至少第二个紫杉烷类似物和第三个紫杉烷类似物；和
收集分离的紫杉烷类似物。
11.根据权利要求10的方法，在所述第一步中进一步包括除去木酚素和黄酮杂质的步骤。
12.根据权利要求10的方法，进一步包括粉碎所述紫杉烷类化合物原料和用甲醇萃取的步骤。
13.根据权利要求12的方法，进一步包括将萃取物与活性炭混合，过滤和蒸发以形成浓缩物的步骤。
14.根据权利要求13的方法，其中所述载体材料包括硅藻土545。
15.根据权利要求1的方法，其中所述有机溶剂包括丙酮与己烷的混合物。
16.根据权利要求15的方法，其中将所述有机溶剂在10至20psi的压力下通过所述色谱柱。
17.根据权利要求1的方法，进一步包括收集和用薄层色谱分析所述紫杉烷洗脱部分的步骤。
18.从含有紫杉烷类化合物的原料中分离纯化紫杉烷类化合物的方法，包括：
提供紫杉烷类化合物原料；
将所述紫杉烷类化合物从所述原料中萃取至有机萃取剂介质中以制备含有紫杉烷类化合物的有机层；
用所述有机层处理载体材料；
制备含有吸附剂的低压柱；
第一步，在10至20psi的压力下通过所述色谱柱洗脱有机溶剂至洗提到纯化的紫杉烷部分并除去黄酮和木酚素杂质；
使紫杉烷部分结晶得到第一个紫杉烷类似物和母液；
第二步，在30psi的压力下通过在色谱柱中的聚乙烯DVB树脂洗脱母液以纯化并洗脱至少第二个紫杉烷类似物和第三个紫杉烷类似物；和
第三步，将所述第二个紫杉烷类似物和所述第三个紫杉烷类似物通过正相硅胶柱以纯化所述第二个紫杉烷类似物和所述第三个紫杉烷类似物；和
收集分离的紫杉烷类似物。
19.根据权利要求18的方法，其中所述第二个紫杉烷类似物包括浆果赤霉素III和所述第三个紫杉烷类似物包括10-去乙酰基浆果赤霉素III。
20.根据权利要求18的方法，其中所述类似物的纯度至少为98％。
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