KR20000062437A - 폴리머 수지관에 대한 공업 제조용 저압 크로마토그래피에의한 파크리탁셀 및 기타 관련 택산들의 분리 및 정제방법 - Google Patents

폴리머 수지관에 대한 공업 제조용 저압 크로마토그래피에의한 파크리탁셀 및 기타 관련 택산들의 분리 및 정제방법 Download PDF

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Abstract

택산들을 함유하는 소스로부터 택산 유사물들을 고수율 및 고순도로 얻는 방법을 개시한다. 본 발명의 기술분야에서 현재 제공되는 복잡하고 고비용이 드는 분리/정제단계들을 사용하지 않고, 본 방법은 저압 하에서 택산 유사물들을 분리하는 폴리머 수지막을 채용한다.

Description

폴리머 수지관에 대한 공업 제조용 저압 크로마토그래피에 의한 파크리탁셀 및 기타 관련 택산들의 분리 및 정제방법 {Isolation and purification of paclitaxel and other related taxanes by industrial preparative low pressure chromatography on a polymeric resin column}
본 발명은 분리기술에 관한 것으로, 특히 파크리탁셀(paclitaxel) 및 관련 택산(taxanes)을 분리하는 기술에 관한 것이다.
파크리탁셀은 다양한 전이암의 치료를 위한 잘 알려진 화학요법 약제이다. 이는 난소암과 유방암의 치료제로서 미국 식품의약품국(FDA) 및 캐나다 건강보호국(HPB)의 승인을 받아 왔다. 이 화합물은 자연 생성물로서, 주로 태평양 주목나무, 너트올 태평양 주목나무(Taxus brevifolia)의 껍질로부터 추출되는데, 린네 일반 주목나무(T. baccata), 쥬카리니 히말라야 주목나무(T. wallichiana), 쳉과 엘.케이.푸 윤난 주목나무(T. yunnanensis) 및 마샬 캐나다 주목나무(T. canadensis)에서도 발견된다.
다양한 원료에서의 파크리탁셀 농도는 통상적으로 낮은데, 예를 들어, 태평양 주목나무의 껍질에는 0.0004 내지 0.001%(w/w) 정도로 들어 있다. 원재료로부터 상기 화합물을 추출 및 정제하여 약품등급으로 만드는 것이 이와 같이 낮은 농도에서는 어렵기 때문에, 현재까지 상업적인 규모로 적용되지 못했다. 원재료의 비정제 추출물로부터 파크리탁셀을 정제하기 위해, 저압 및 고압 관 크로마토그래피(column chromatography) 뿐만 아니라 다양한 정상 상(normal phase) 크로마토그래피 및 역상(reverse phase) 크로마토그래피가 개발되어 왔다.
저압 크로마토그래피의 성공여부는 관의 속성에 크게 의존한다. 실리카 겔 및 알루미나 트리옥사이드(alumina trioxide)를 사용함에 있어서 다양한 문제점이 결부되는데, 이는 모두 격리 시스템 내의 정지상(stationary phase)의 전형적인 담체들이다. 이들은 대부분의 용매 시스템과는 안정된 정지상을 이루는데, 이는 강력한 흡수제로서 크로마토그래피 거동 및 샘플들의 복원에 영향을 주는 정도로 분리과정에 관여할 수 있다.
크로마토그래피법들은 다양한 주목나무종으로부터 파크리탁셀을 검출하고 분리하는 데 분석적인 제조용 토대로서 발전해 왔다. 이 분리과정들은 주로 작은 연구실 규모로 행해지며, 낮은 선택비, 복원성 및 고 생산비용을 초래하기 때문에, 파크리탁셀에 밀접 유사한 세파로마닌(cephalomanine) 뿐만 아니라 다른 밀접 관련된 택산으로부터 귀중한 제암 화합물 파크리탁셀을 분리하기 위한 경제적이고 실용적인 방법에 대한 심각하고 불충족된 필요가 생겨나게 되었다.
종래기술의 방법들은 파크리탁셀 및 관련 택산을 분리하기 위해 다양한 유형의 크로마토그래피 기술을 사용하는 것을 개시하고 있는데, 이에는 실리카 겔 또는 접합된 실리카 겔 관에 대한 정상 상 및 역상 크로마토그래피가 포함된다. 이러한 종래기술의 방법들은 낮은 수율, 고 생산비용 또는 복잡한 다중 분리단계를 초래하기 때문에, 이들은 대규모 공업적 양산으로 규모가 커지기는 어려웠다.
종래기술 중에 특징적인 것은 호프만 등에게 1997년 4월 15일 부여된 미국 특허 제5,620,875호이다. 이 문서는 다단계 헥산 추출 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography; HPLC)에 의해 파크리탁셀 및 관련 택산을 분리하는 기술을 개시하고 있다. 이 과정은 복잡하며, 노동집약적이며, 원하는 화합물을 적당한 수율로 제공하기만 한다.
1997년 9월 15일 라오에게 부여된 미국 특허 제5,670,673호에서는, 택솔(Taxol) 및 그 유사물의 분리와 정제가 설명되어 있다. 이 과정은 C18 흡착제에 역상 액체 크로마토그래피를 적용하여 흡착된 유사물이 분리되게 하는 것을 포함한다. 이 기술은 나름대로 장점을 가지지만, 생산성 및 얻어진 화합물의 순도면에서 한계를 갖는다.
본 발명은 폴리머 수지관에 기초한 단순한 분리방법을 제공하는데, 이는 현존하는 방법론의 한계를 제거한 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ, 10-디아세틸바카틴 Ⅲ, 바카틴 Ⅲ, 세파로마닌 및 파크리탁셀 등의 중요한 택산의 경제적인 분리 및 정제를 간단하고 더 저렴하게 하는 방법을 제공하는 것이다.
파크리탁셀, 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 및 바카틴 Ⅲ를 포함한 택산들을 분리하는 종래의 방법들은 일반적으로 알콜 용매로 원재료로부터 택산들을 추출하는 단계와, 상기 추출물에서 지방질을 제거하는 단계와, 크로마토그래피에 의해 개별 택산을 분리하고 정제하는 단계를 구비한다.
본 발명의 목적은:
유기 추출제 내에서 택산들의 소스를 추출하는 단계와;
약한 흡수제 매질을 상기 추출제로 코팅하고, 상기 매질을 흡수 작용제를 포함한 관에 넣는 단계와;
택산 화합물들을 포함하는 프랙션(fraction)들을 생성하기 위해 10 내지 20psi 내의 압력으로 유기 용매 혼합물로 1차 분리시키는 단계와;
상기 프랙션들을 결정화하여 고체상태의 택산 화합물과 모액을 제공하는 단계와;
상기 모액을 농축시키는 단계와;
적어도 제2 택산 화합물을 제공하기 위해 상기 모액을 폴리머 수지를 통해 극성 용매 화합물로 2차 분리시키는 단계를 구비하여,
택산을 포함하는 소스로부터 택산 유사물을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은:
택산들의 소스를 제공하는 단계와;
상기 소스로부터 유기 추출 매질로 택산들을 추출하여 택산 화합물들을 함유하는 유기층을 제공하는 단계와;
상기 유기층으로 담체를 처리하는 단계와;
흡수 작용제를 포함하는 저압 관을 제공하는 단계와;
상기 관에 유기용매를 통과시켜 1차 분리시킴으로써 정제된 택산 프랙션들을 분리시키는 단계와;
상기 택산 프랙션들을 결정화하여 제1 택산 유사물과 모액을 제공하는 단계와;
크로마토그래피 관 내의 폴리머 수지에 상기 모액을 통과시켜 2차 분리시킴으로써 적어도 제2 택산 유사물과 제3 택산 유사물을 정제 및 분리시키는 단계와;
분리된 택산 유사물들을 수집하는 단계를 구비하여,
택산들을 포함하는 소스로부터 택산들을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
택산들의 소스를 제공하는 단계와;
상기 소스로부터 유기 추출 매질로 택산들을 추출하여 택산 화합물들을 함유하는 유기층을 제공하는 단계와;
상기 유기층으로 담체를 처리하는 단계와;
흡수 작용제를 포함하는 저압 관을 제공하는 단계와;
상기 관에, 10 내지 20psi 내의 압력으로, 유기용매를 통과시켜 1차 분리시킴으로써 정제된 택산 프랙션들을 분리시킴과 동시에 플라보노이드 및 리그난 불순물들을 제거하는 단계와;
상기 택산 프랙션들을 결정화하여 제1 택산 유사물과 모액을 제공하는 단계와;
크로마토그래피 관 내의 폴리스티렌 DVB 수지에, 30 psi의 압력으로, 상기 모액을 통과시켜 2차 분리시킴으로써 적어도 제2 택산 유사물과 제3 택산 유사물을 정제 및 분리시키는 단계와;
정상 상 실리카 겔 관에 상기 제2 택산 유사물 및 제3 택산 유사물을 통과시켜 3차 분리시킴으로써 상기 제2 택산 유사물 및 제3 택산 유사물을 정제하는 단계와;
분리된 택산 유사물들을 수집하는 단계를 구비하여,
택산들을 포함하는 소스로부터 택산들을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은:
유기 추출제 내에서 택산들의 소스를 추출하는 단계와;
약한 흡수제 매질을 상기 추출제로 코팅하고, 상기 매질을 흡수 작용제를 포함한 관에 넣는 단계와;
택산 화합물들을 포함하는 프랙션(fraction)들을 생성하기 위해 10 내지 20psi 내의 압력으로 유기 용매 혼합물로 1차 분리시키는 단계와;
상기 프랙션들을 결정화하여 고체상태의 택산 화합물과 모액을 제공하는 단계와;
상기 모액을 농축시키는 단계와;
적어도 제2 택산 화합물을 제공하기 위해 상기 모액을 폴리머 수지를 통해 극성 용매 화합물로 2차 분리시키는 단계를 구비하여,
택산을 포함하는 소스로부터 택산 유사물을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은:
택산들의 소스를 제공하는 단계와;
상기 소스로부터 유기 추출 매질로 택산들을 추출하여 택산 화합물들을 함유하는 유기층을 제공하는 단계와;
상기 유기층으로 담체를 처리하는 단계와;
흡수 작용제를 포함하는 저압 관을 제공하는 단계와;
상기 관에 유기용매를 통과시켜 1차 분리시킴으로써 정제된 택산 프랙션들을 분리시키는 단계와;
상기 택산 프랙션들을 결정화하여 제1 택산 유사물과 모액을 제공하는 단계와;
크로마토그래피 관 내의 폴리머 수지에 상기 모액을 통과시켜 2차 분리시킴으로써 적어도 제2 택산 유사물과 제3 택산 유사물을 정제 및 분리시키는 단계와;
분리된 택산 유사물들을 수집하는 단계를 구비하여,
택산들을 포함하는 소스로부터 택산들을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은:
택산들의 소스를 제공하는 단계와;
상기 소스로부터 유기 추출 매질로 택산들을 추출하여 택산 화합물들을 함유하는 유기층을 제공하는 단계와;
상기 유기층으로 담체를 처리하는 단계와;
흡수 작용제를 포함하는 저압 관을 제공하는 단계와;
상기 관에, 10 내지 20psi 내의 압력으로, 유기용매를 통과시켜 1차 분리시킴으로써 정제된 택산 프랙션들을 분리시킴과 동시에 플라보노이드 및 리그닌 불순물들을 제거하는 단계와;
상기 택산 프랙션들을 결정화하여 제1 택산 유사물과 모액을 제공하는 단계와;
크로마토그래피 관 내의 폴리스티렌 DVB 수지에, 30 psi의 압력으로, 상기 모액을 통과시켜 2차 분리시킴으로써 적어도 제2 택산 유사물과 제3 택산 유사물을 정제 및 분리시키는 단계와;
정상 상 실리카 겔 관에 상기 제2 택산 유사물 및 제3 택산 유사물을 통과시켜 3차 분리시킴으로써 상기 제2 택산 유사물 및 제3 택산 유사물을 정제하는 단계와;
분리된 택산 유사물들을 수집하는 단계를 구비하여,
택산들을 포함하는 소스로부터 택산들을 분리 및 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하기로 한다.
택산들의 최초 소스는 식물인, 마샬 캐나다 주목나무(Taxus canadensis)였는데, 이는 동부 캐나다에 풍부한 것이다. 마샬 캐나다 주목나무에서 나온 지맥(枝脈) 및 침엽 또는 그들의 혼합물이 이용되었다. 이 재료는 싱싱한 것이거나 마른 것일 수 있다.
이 원재료는 분쇄된 후 60℃에서 5시간 동안 메탄올을 이용해 추출되고 여과되었다. 이 메탄올 추출제는 숯과 혼합되었으며, 실온에서 1시간 동안 방치되었다. 그 다음 이는 여과되었다. 이 여과액은 증발건조에 의해 원래 부피의 15%로 농축되었다. 물과 디클로로메탄을 부피비(v/v) 1:1로 혼합한 것을 농축액에 첨가하여 파크리탁셀이 풍부한 부분(유기층)을 얻었다.
이 유기층은 농축되어 부피가 감소하였으며, 담체에 코팅되었는데, 본 경우에서는 담체가 셀라이트(Celite) 545이다. 이 코팅된 물질은 공업용 제조 관의 꼭대기에 넣어졌는데, 제조 관은 예컨대 흡수 작용제 Al2O3로 채워진 150㎜×1500㎜ 크기의 관이다. 이 관은 10psi 내지 20psi 내의 압력 하에서 헥산:아세톤의 혼합물(100:0에서 시작하여 45:55로 끝남)을 이용하여 분리되었다. 택산들을 함유하는 프랙션들은 수집된 후 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography; TLC)에 의해 분석되었으며, 이어서 TLC결과에 따라 결합되었다.
수집된 프랙션들은 이후에 진공에서 농축되었으며, 결과물은 메탄올에서 용해되고 밤새도록 상온으로 유지되었다. 형성된 결정은 여과된 후 메탄올로 세정되었으며, 아세톤으로부터 재결정화되었다. 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ는 흰색 결정상태로 얻어졌다.
상기 모액은 건조될 때까지 농축되었으며, 잔류물은 아세톤에서 용해되었다. 이 아세톤 용액은 폴리머 수지(상표명 다우엑스(Dowex) 수지, 폴리스티렌-DVB)와 혼합되었다. 이 혼합물은 아세톤을 제거하기 위해 진공상태에서 증발건조되었다. 그 결과인 분말에 대해 저압 크로마토그래피를 거치게 하였다. 공업적 규모(150㎜×1500㎜)의 크로마토그래피 관은 다우엑스 수지로 채워졌으며, 30psi의 작동압 하에서 유동속도 150㎖/분의 아세톤:물(45:55, v/v)로 분리되었다. 각각이 대략 2리터인 프랙션들이 수집되었으며, 이들은 TLC 및 HPLC에 의해 모니터링되었다.
바카틴 Ⅲ 및 10-디아세틸바카틴 Ⅲ를 함유한 프랙션들은 합쳐진 후 거의 모든 유기 용매를 제거하기 위해 진공 하에서 증발건조되었으며, 물로 희석되고 CH2Cl2로 추출되었다. 추출물은 이어서 건조상태로 농축되고 그 결과 잔류물은 EtOAc 내에서 용해되고 용매 시스템으로서 헥산:EtOAc를 사용한 정상 상 실리카 겔 관에 의해 정제되었다(5:5에서 시작하여 35:65로 끝남). 최종적으로, 98% 이상의 순도를 가진 흰색 분말로서 바카틴 Ⅲ 및 10-디아세틸바카틴 Ⅲ가 얻어졌다.
파크리탁셀 및 세파로마닌을 함유한 프랙션들은 합쳐진 후 거의 모든 아세톤을 제거하기 위해 진공 하에서 증발건조되었으며, 그 후 물과 CH2Cl2사이에 격리되었다. 이 유기층은 격리되고 진공 하에서 건조상태가 되도록 증발건조되었다. 이 잔류물은 메탄올 내에서 용해되었다. 이 메탄올 용액에 대략 30%(w/v)의 물이 첨가되었으며, 이 혼합물은 5분간 60℃로 가열된 후, 밤새도록 상온으로 유지되었다. 이 메탄올 용액에서 나온 비정제 결정 고체는 여과된 후, 70℃ 내지 75℃ 사이의 온도 및 진공 하에서 건조되었다. 이 고체는 HPLC에 의해 분석되었다. 이는 대략 70%의 파크리탁셀과 25%의 세파로마닌, 그리고 기타 택산들로 구성되어 있었다.
비정제 파크리탁셀은 세가지 선택적인 절차 중의 하나에 따라 처리될 수 있다. 첫째 가능한 절차에서는, 비정제 파크리탁셀이 아세톤 내에서 용해되고, 역상 관 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 이 관은 폴리머 수지(디아이온 수지, HP2MG)로 채워졌으며, 아세토니트릴(45:55)로 분리되었다. 파크리탁셀이 99% 이상의 순도를 가진 흰색 결정으로서 얻어졌다. 세파로마닌은 98% 이상의 순도를 가진 흰색 분말로서 얻어졌다.
이와 달리, 둘째 처리방식으로서, 파크리탁셀과 세파로마닌의 정제는 화학반응 공정을 통해 수행되었으며, 그 후 접합된 실리카 겔 역상 관 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 비정제 파크리탁셀, 세파로마닌 혼합물은 CH2Cl2또는 CHCl3(1:10. w/v) 내에서 용해되었으며, 얼음조(0℃ 내지 5℃ 사이) 내에 위치한 원형 바닥 플라스크 내에서 대략 40분간 브롬 10 당량과 반응하였다. 그 결과물인 파크리탁셀과 2",3"-브로모세파로마닌의 혼합물은 역상 크로마토그래피 관(C18또는 페닐), 분리 용매 CH3CN:H2O (45:55)에 의해 쉽게 분리되었다. 파크리탁셀이 99% 이상의 순도를 가진 흰색 결정으로서 얻어졌다. 2",3"-브로모세파로마닌은 부분입체이성질체들의 혼합물로서 얻어졌는데, 이들은 상온에서 아세트산 내에서 활성화된 아연과 반응한 후, 플래시 관 크로마토그래피(flash column chromatography)에 의해 정제되어 95% 이상의 순도를 가진 순수한 세파로마닌을 얻었다.
셋째 방법에서는, 파크리탁셀과 브로모세파로마닌이 정상 상 실리카 겔 관을 통해 정제되었다. 분리 용매 시스템은 헥산:EtOAc(6:4에서 시작하여 4:6으로 끝남), 또는 CH2Cl2:Me2CO(8:2에서 시작하여 65:35로 끝남) 또는 CHCl2:EtOAc(75:25에서 시작하여 6:4로 끝남)로 이루어질 수 있다. 이 방법으로부터, 세파로마닌이 0.2% 이하의 양으로 존재하는 상태에서, 파크리탁셀이 99% 가 넘는 순도를 가진 흰색 결정으로서 얻어졌다.
본 발명에 대해 검토하였으므로, 예를 통해 본 발명을 더 정확히 언급하기로 한다.
예 1
대략 200킬로그램의 건조된 마샬 캐나다 주목나무의 침엽 및 지맥이 공업용 다기능 추출기 내에서 1000리터의 메탄올에 의해 60℃에서 5시간 동안 추출된 후, 여과되었다. 원재료들은 추가로 4시간 동안 55℃ 내지 60℃ 사이의 온도에서 700리터의 메탄올에 의해 추출되고 여과되었다. 이 여과액은 합쳐지고 10킬로그램의 활성화된 탄소(5% w/w)와 혼합되고, 1시간 동안 상온에서 유지된 다음, 활성화된 탄소를 제거하기 위해 여과되었다. 그 후, 이 여과액은 진공 하에서 대략 100리터로 농축된 다음, 300리터의 물:디클로로메탄 (1:1)이 첨가되었다. 유기층은 수집되었으며, 수용액은 200리터의 디클로로메탄에 의해 2번 이상 추출되었다. 디클로로메탄 용액이 합쳐지고, 진공 하에서 증발건조되어 슬러리(slurry) 형태가 된 후, 20리터의 아세톤에 의해 희석되었다.
아세톤 용액은 20킬로그램의 셀라이트 545 위에 코팅되었다. 코팅된 물질은 공기건조된 후, 3개의 저압 공업용 크로마토그래피 관(치수:150×15㎝)들의 위에 넣어졌다. 각각의 관은 15킬로그램의 알루미나 옥사이드(Al2O3) 흡수제로 채워졌다. 분리에 필요한 양의 Al2O3를 담아두기에 충분하도록 관들이 크다면, 관들의 정확한 치수가 결정적인 것이 아니라는 것을 알 수 있을 것이다. 알루미나 옥사이드를 사용하는 것은 상기 소스 물질로부터 공동추출된 플라보노이드들 및 리그난들을 흡수하는 데 효과적이다. 또한 이들은 제거하기 어려우며, 파크리탁셀 제품의 최종 순도에 대해 문제가 된다.
관들은 10 내지 15psi 사이의 압력 하에서 대략 150㎖/분의 유동속도로 흘린 용매 시스템 헥산:아세톤(100:0에서 시작하여 45:55로 끝남)에 의해 분리되었다.
택산들을 함유한 프랙션들은 박층 크로마토그래피(TLC) 결과에 따라 수집되고 합쳐진 다음, 모든 용매를 제거하기 위해 진공 하에서 농축되었다. 그 결과물은 메탄올 내에서 용해되고 밤새도록 상온으로 유지되어 바늘형태의 결정들을 산출하였다. 이 결정들은 여과되고 아세톤으로부터 재결정화되어 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ으로 확인된 바늘형태의 백색 결정들을 더 산출하였는데, 이는 96% 수율 (148그램)(원재료를 바탕으로 한 0.074%) 이상의 순도를 가지는 것이었다.
13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ 결정화로부터 나오는 모액은 진공 하에서 건조상태로 농축되었다. 그 잔류물은 3리터의 아세톤 내에서 용해되었다. 이 아세톤 용액은 1.5킬로그램의 폴리스티렌-디비닐벤젠, 공중합체 수지와 혼합되었다. 이 혼합물은 용매를 제거하기 위해 증발건조되었으며, 그 결과의 분말은 폴리스티렌-디비닐벤젠 공중합체 수지로 채워진 저압 공업용 크로마토그래피 관의 위에 넣어졌고, 30psi 이하의 작동압 하에서 물에 대해 45% 혼합된 아세톤을 150㎖/분의 유동속도로 흘림으로써 분리되었다. 각각이 2리터인 프랙션들이 수집되었으며, 이들은 TLC 및 HPLC에 의해 모니터링되었다.
파크리탁셀 및 세파로마닌을 함유한 프랙션들은 합쳐진 후 대부분의 아세톤을 제거하기 위해 진공 하에서 증발건조되었으며, 그 후 탈이온수로 희석되고, 2.5리터의 디클로로메탄으로 3번 추출되었다. 이 유기층은 진공 하에서 건조상태가 되도록 농축되었으며, 그 잔류물은 1리터의 메탄올 내에서 용해되었다.
이 메탄올 용액에, 대략 30%(w/v)의 물이 첨가되었으며, 이 혼합물은 수 분간 60℃로 가열된 후, 밤새도록 상온으로 유지되었다. 이 메탄올 용액에서 나온 비정제 결정 고체는 여과된 후, 70℃ 내지 75℃ 사이의 온도에서 진공 오븐 내에서 건조되었다. 31그램의 수율 내에서 이 고체는 대략 70%의 파크리탁셀과 25%의 세파로마닌으로 구성되어 있었다.
비정제 파크리탁셀(30그램)은 200㎖의 아세토니트릴 내에서 용해되고 250㎖의 탈이온수로 희석된 다음, 저압 크로마토그래피 관(치수:10×150㎝)의 위로 펌핑되고, 폴리머 수지(디아이온, 큰 세공의 폴리메타크릴레이트 수지)로 채워졌다. 샘플이 펌핑된 다음, 이 관은 물에 대해 35, 40, 45 및 50%로 혼합된 아세토니트릴의 스텝 그래디언트(step gradient)로 분리되었다. TLC 및 HPLC 결과는 용매의 변화를 나타내었다.
각각이 대략 1리터인 프랙션들이 수집되었으며, 이들은 TLC 및 HPLC 분석에 의해 모니터링되었다. 유동속도는 75㎖/분이었다. 파크리탁셀 또는 세파로마닌을 함유한 관 프랙션들은 개별적으로 합쳐졌다. 이 두 개의 용액들은, 그 개별 화합물의 결정화가 완료될 때까지, 대략 5℃의 온도에서 방치될 수 있게 되었다.
이 결정들은 따로따로 여과되었으며, 둘 다 물에 대해 혼합된 65℃ 메탄올로부터 재결정화되었다.
파크리탁셀이 99% 이상의 순도를 가진 바늘형태의 흰색 결정으로서 얻어졌는데, 그 수율은 18.5그램(0.009%)이었다.
세파로마닌은 98% 이상의 순도를 가진 흰색 바늘형태로서 얻어졌는데, 그 수율은 6.5그램(0.003%)이었다.
이전 단계에서 얻어진 바카틴 Ⅲ 및 10-디아세틸바카틴 Ⅲ를 함유한 프랙션들은 합쳐지고 실질적으로 아세톤을 제거하기 위해 진공 하에서 증발건조되었으며, 3리터의 물과 디클로로메탄 (1:1 v/v) 사이에 격리되었다. 이 유기층은 건조상태로 농축되었으며, 그 잔류물은 정상 상 크로마토그래피를 거쳤다. 사용된 관의 치수는 4"×4'이었는데, 실리카 겔(200-300 메쉬)로 채워졌다. 분리 용매는 헥산:에틸 아세테이트의 스텝 그래디언트(50:50에서 시작하여 35:65로 끝남)이었다. 각각이 대략 1000㎖인 프랙션들이 수집되었으며, 이들 각각은 TLC에 의해 모니터링되었다.
바카틴 Ⅲ 또는 10-디아세틸바카틴 Ⅲ를 함유한 프랙션들은 따로따로 수집되고 TLC 결과에 따라 합쳐진 다음, 건조상태로 농축되었다.
바카틴 Ⅲ 부분은 200㎖의 메탄올 내에서 용해되어 밤새도록 냉장고 속에서 유지되었다. 형성된 흰색 결정들은 여과되었으며, 메탄올로부터 재결정화되어 7.5그램(0.003%)의 수율에서 흰색 결정들로서 바카틴 Ⅲ를 산출하였다.
비정제의 10-디아세틸바카틴 Ⅲ는 150㎖의 아세톤 내에서 용해된 후 150㎖의 헥산으로 희석되었다. 이 혼합물은 밤새도록 상온으로 유지되었다. 형성된 흰색 결정들은 여과되었으며, 같은 용매로부터 재결정화되어 흰색 결정들로서 10-디아세틸바카틴 Ⅲ를 산출하였다. 수율은 15그램(0.007%)이었다.
예 2
예 1에서 사용된 것과 유사한 장치 및 방법론을 사용하여, 비정제 파크리탁셀이 얻어졌다. 비정제 파크리탁셀은 300㎖의 디클로로메탄 내에서 용해되었고, 이는 1000㎖의 삼구 원형 바닥 플라스크에 첨가되었다. 이 플라스크는 얼음조 내에 도로 위치시켜졌으며, 그 용액은 자석교반기에 의해 교반되었다. 온도가 대략 5℃에 이르렀을 때, 디클로로메탄 내의 브롬(10 당량) 용액(1:1 v/v)을 저어주면서 서서히 첨가하였다. 브롬에 대한 세파로마닌의 비는 1 대 10 몰이었다.
이러한 브롬처리는 5 내지 10분 사이의 TLC 분석에 의해 모니터링되었다. 그 다음, 이 반응 혼합물은 300㎖의 디클로로메탄으로 희석되었으며, 반응이 완료되고 난 (완료시간은 40 내지 50분이 소요되었다) 후에 분별깔대기로 옮겨졌다. 이 반응 혼합물에, 잉여 브롬이 있다면 이를 흡수하기 위해 350㎖의 10% 수성 티오황산나트륨(Na2S2O3)이 첨가되었다. 이 디클로로메탄층은 분리되어 물과 소금물로 세정되었으며, 그 후에 진공 하에서 건조상태로 농축되었다. 연한 갈색의 분말이 얻어졌다.
예 3
예 2로부터의 비정제 물질(10그램)이 120㎖의 아세토니트릴 내에서 용해되고 이는 150㎖의 탈이온수로 희석되었다. 이 용액은 C18이 접합된 실리카 겔로 채워진 역상 크로마토그래피 관(5×100㎝)의 위로 펌핑되었다.
이 관은 30 내지 40psi의 작동압 하에서 아세토니트릴:물(45:55)로 분리되었다. 유동속도는 30㎖/분이었다. 프랙션들이 수집되고(각각 250㎖), TLC에 의해 모니터링되고 합쳐졌다.
파크리탁셀을 함유하는 부분은 밤새도록 냉장되었고, 형성된 결정들은 여과되고 70% 메탄올로부터 재결정화되었다. 파크리탁셀은 6.1그램의 수율에서 99% 이상의 순도를 갖는 바늘형태의 결정들로서 얻어졌다.
2",3"-브로모세파로마닌을 함유한 프랙션들은 합쳐져서, 물과 디클로로메탄 사이에서 격리되었다. 이 유기층은 수집되어 진공 하에서 건조상태가 되도록 증발되었다. 그 잔류물은 150㎖의 메탄올 내에서 용해되었고, 이는 바늘형태의 결정들을 얻기 위해 50㎖의 물로 희석되었다. 황색이 도는 흰색 결정은 메탄올:물로부터 재결정되어 흰색 결정들로서 2",3"-브로모세파로마닌을 산출하였다.
2그램의 2",3"-브로모세파로마닌이 30㎖의 AcOH 내에서 용해되고, 새로이 활성화된 아연(2그램)이 첨가되었다. 이 혼합물은 상온에서 3시간 동안 교반되었으며, 반응은 TLC에 의해 모니터링되었다. TLC 분석이 반응완료를 나타낸 후에, 이 혼합물은 디클로로메탄과 10% NaHCO3(300㎖, 2:1) 사이에서 격리되었다. 이 유기층은 물로 세정되었으며 건조상태로 농축되었다. 비정제 제품은 플래시 크로마토그래피에 의해 정제되어 흰색 분말로서 세파로마닌을 제공하였다.
예 4
예 2로부터의 비정제 물질(10그램)이 120㎖의 디클로로메탄 내에서 용해되었다. 이 유기층은 건조상태로 농축되었고, 그 잔류물은 정상 상 크로마토그래피를 거쳤다. 사용된 관의 치수는 4"×4'이었는데, 실리카 겔(200 내지 300 메쉬 사이)로 채워졌다. 분리 용매는 디클로로메탄:에틸 아세테이트의 스텝 그래디언트(75:25에서 시작하여 6:4로 끝남)였으며, 파크리탁셀과 2",3"-브로모세파로마닌의 분리를 위해 헥산:에틸 아세테이트(6:4에서 시작하여 4:6으로 끝남)와 디클로로메탄:아세톤(8:2에서 시작하여 65:35로 끝남)의 용매 시스템도 사용할 수 있다. 각각이 대략 500㎖인 프랙션들이 수집되었으며, 이들 각각은 TLC에 의해 모니터링되었다.
파크리탁셀과 2",3"-브로모세파로마닌을 함유한 프랙션들은 따로따로 수집되고 TLC 결과에 따라 합쳐진 다음, 건조상태로 농축되었다.
파크리탁셀 부분은 100㎖의 메탄올 내에서 용해되고 35㎖의 물로 희석된 후 냉장상태로 유지되었다. 형성된 흰색 결정들은 여과되었으며, 메탄올:물로부터 재결정화되어 흰색 결정들로서 파크리탁셀(5.5그램)을 산출하였다.
비정제 2",3"-브로모세파로마닌은 50㎖의 아세톤 내에서 용해된 후 50㎖의 헥산으로 희석되었다. 이 혼합물은 밤새도록 상온으로 유지되었다. 형성된 흰색 결정들은 여과되었으며, 같은 용매로부터 재결정화되어 흰색 결정들로서 2",3"-브로모세파로마닌을 산출하였다.
다음의 예들은 구조식으로 화합물을 나타낸 것이다.
본 발명에 따르면, 택산들을 함유하는 소스로부터 택산 유사물들을 고수율 및 고순도로 얻을 수 있다.
상기한 바와 같이 본 발명의 실시예들이 설명되었지만, 본 발명은 여기에 한정되지 않으며, 청구되고 설명된 발명의 사상, 속성 및 범위를 벗어나지 않는 한도에서 본 발명의 기술분야의 숙련자에게 가능한 본 발명의 다양한 변형이 있음은 명백하다.

Claims (20)

  1. 유기 추출제 내에서 택산들의 소스를 추출하는 단계와;
    약한 흡수제 매질을 상기 추출제로 코팅하고, 상기 매질을 흡수 작용제를 포함한 관에 넣는 단계와;
    택산 화합물들을 포함하는 프랙션들을 생성하기 위해 10 내지 20psi 내의 압력으로 유기 용매 혼합물로 1차 분리시키는 단계와;
    상기 프랙션들을 결정화하여 고체상태의 택산 화합물과 모액을 제공하는 단계와;
    상기 모액을 농축시키는 단계와;
    적어도 제2 택산 화합물을 제공하기 위해 상기 모액을 폴리머 수지를 통해 극성 용매 화합물로 2차 분리시키는 단계를 구비하여,
    택산을 포함하는 소스로부터 택산 유사물들을 분리 및 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 1차 분리단계가 리그난 및 플라보노이드 불순물들을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 택산들의 상기 소스가 식물 소스로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 식물 소스가 너트올 태평양 주목나무(Taxus brevifolia), 린네 일반 주목나무(Taxus baccata), 쥬카리니 히말라야 주목나무(Taxus wallichiana), 쳉과 엘.케이.푸 윤난 주목나무(Taxus yunnanensis) 및 마샬 캐나다 주목나무(Taxus canadensis)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 택산들이 적어도 13-아세틸-9-디히드로바카틴 Ⅲ, 10-디아세틸바카틴 Ⅲ, 바카틴 Ⅲ, 세파로마닌 및 파크리탁셀을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유기 추출제가 디클로로메탄으로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 약한 흡수제 매질이 셀라이트 545인 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 흡수 작용제가 알루미늄 옥사이드로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 1차 분리단계에서의 유기 용매 혼합물이 헥산 및 아세톤으로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  10. 택산들의 소스를 제공하는 단계와;
    상기 소스로부터 유기 추출 매질로 상기 택산들을 추출하여 택산 화합물들을 함유하는 유기층을 제공하는 단계와;
    상기 유기층으로 담체를 처리하는 단계와;
    흡수 작용제를 함유하는 저압 관을 제공하는 단계와;
    상기 관에 유기 용매를 통과시켜 1차 분리시킴으로써 정제된 택산 프랙션들을 분리시키는 단계와;
    상기 택산 프랙션들을 결정화하여 제1 택산 유사물과 모액을 제공하는 단계와;
    크로마토그래피 관 내의 폴리머 수지에 상기 모액을 통과시켜 2차 분리시킴으로써 적어도 제2 택산 유사물과 제3 택산 유사물을 정제 및 분리시키는 단계와;
    분리된 택산 유사물들을 수집하는 단계를 구비하여,
    택산들을 포함하는 소스로부터 택산들을 분리 및 정제하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 1차 분리단계에서 리그난 및 플라보노이드 불순물들을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  12. 제10항에 있어서, 택산들의 상기 소스를 분쇄하고 메탄올로 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  13. 제12항에 있어서, 농축액을 형성하기 위해 추출제를 숯과 혼합하고, 여과 및 증발건조시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 담체가 셀라이트 545로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 유기 용매가 아세톤과 헥산의 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 유기 용매가 상기 관을 10 내지 20 psi 내의 압력으로 통과하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 택산 프랙션들을 수집하고 이를 박층 크로마토그래피에 의해 분석하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  18. 택산들의 소스를 제공하는 단계와;
    상기 소스로부터 유기 추출 매질로 택산들을 추출하여 택산 화합물들을 함유하는 유기층을 제공하는 단계와;
    상기 유기층으로 담체를 처리하는 단계와;
    흡수 작용제를 포함하는 저압 관을 제공하는 단계와;
    상기 관에, 10 내지 20psi 내의 압력으로, 유기용매를 통과시켜 1차 분리시킴으로써 정제된 택산 프랙션들을 분리시킴과 동시에 플라보노이드 및 리그난 불순물들을 제거하는 단계와;
    상기 택산 프랙션들을 결정화하여 제1 택산 유사물과 모액을 제공하는 단계와;
    크로마토그래피 관 내의 폴리스티렌 DVB 수지에, 30 psi의 압력으로, 상기 모액을 통과시켜 2차 분리시킴으로써 적어도 제2 택산 유사물과 제3 택산 유사물을 정제 및 분리시키는 단계와;
    정상 상 실리카 겔 관에 상기 제2 택산 유사물 및 제3 택산 유사물을 통과시켜 3차 분리시킴으로써 상기 제2 택산 유사물 및 제3 택산 유사물을 정제하는 단계와;
    분리된 택산 유사물들을 수집하는 단계를 구비하여,
    택산들을 포함하는 소스로부터 택산들을 분리 및 정제하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 제2 택산 유사물이 바카틴 Ⅲ로 이루어지고, 상기 제3 택산 유사물이 10-디아세틸바카틴 Ⅲ로 이루어진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 유사물들이 적어도 98% 이상의 순도를 가진 것을 특징으로 하는 분리 및 정제방법.
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