ES2216431T3 - Aislamiento y purificacion de paclitaxel y otros taxanos relacionados mediante cromatografia preparativa industrial de baja presion sobre una columna de resina polimerica. - Google Patents
Aislamiento y purificacion de paclitaxel y otros taxanos relacionados mediante cromatografia preparativa industrial de baja presion sobre una columna de resina polimerica.Info
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Abstract
Un procedimiento de aislamiento y purificación de análogos de taxano a partir de una fuente que contiene taxanos, que comprende: extracción de una fuente de taxanos en un extractante orgánico: recubrimiento de un medio absorbente de trabajo con dicho extractante y carga de dicho medio en una columna, conteniendo dicha columna un agente absorbente; elución, en una primera etapa, con una mezcla de disolvente orgánico a una presión de entre 10 y 20 psi para generar fracciones que contengan compuestos de taxano; cristalización de dichas fracciones para proporcionar un compuesto de taxano sólido y un licor madre; concentración del licor madre; y elución, en una segunda etapa, con una mezcla de disolvente polar de dicho licor madre a través de una resina polimérica para proporcionar al menos un segundo compuesto de taxano.
Description
Aislamiento y purificación de paclitaxel y otros
taxanos relacionados mediante cromatografía preparativa industrial
de baja presión sobre una columna de resina polimérica.
La presente invención se refiere a una técnica de
separación y más particularmente, la presente invención se refiere a
técnicas para separar el paclitaxel y taxanos relacionados.
El paclitaxel es un fármaco quimioterapéutico
bien conocido para el tratamiento de distintos cánceres
metastáticos. Ha sido aprobado por la FDA y HPB para el tratamiento
de cánceres de ovarios y mama.
El compuesto es un producto natural, extraído
principalmente de la corteza del árbol tejo del Pacífico, Taxus
brevifolia, y que también se encuentra en T. baccata,
T. walichiana, T. yunnanensis y T.
canadensis.
La concentración de paclitaxel en diferentes
materiales de partida es típicamente baja, por ejemplo, del orden de
entre 0,0004 y 0,01% (en relación peso/peso) en la corteza del tejo
del Pacífico. Esta baja concentración hace que la extracción y
purificación del compuesto hasta la calidad farmacéutica desde los
materiales de partida sea muy dificultosa, y hasta ahora no práctica
a escala comercial. Se han desarrollado varias técnicas de
cromatografía de fase normal y de cromatografía de fase inversa así
como también cromatografía en columna de baja y alta presión para
purificar el paclitaxel a partir de un extracto bruto del material
de partida.
El éxito de la cromatografía de baja presión
depende en gran medida de la naturaleza de la columna. Hay asociados
varios problemas al uso del gel de sílice y trióxido de alúmina,
todos ellos son soportes clásicos de la fase estacionaria en los
sistemas de reparto. Estos forman una fase estacionaria estable con
la mayoría de los sistemas disolventes, pero se trata de un fuerte
absorbente y puede participar en el proceso de separación hasta el
punto que se ven afectados el comportamiento cromatográfico y la
recuperación de muestras.
Se han desarrollado procedimientos
cromatográficos para detectar y aislar el paclitaxel a partir de
distintas especies de Taxus en base analítica y preparativa. Estos
procesos de aislamiento se llevan a cabo principalmente a escala de
laboratorio y sufren de baja sensibilidad, recuperación y alto coste
de producción, por lo que muestran una necesidad seria y no cubierta
de un procedimiento económicamente viable para la separación del
compuesto anti-tumor valioso paclitaxel de su
análogo próximo cefalomanina así como también de otros taxanos
estrechamente relacionados.
Los procedimientos de la técnica anterior
describen el uso de distintos tipos de técnicas cromatográficas para
separar el paclitaxel y taxanos relacionados, incluyendo la
cromatografía de fase normal y fase inversa sobre una columna de gel
de sílice o gel de sílice unida. Los procedimientos de la técnica
anterior son de bajo rendimiento, altos costes de producción o
involucran múltiples etapas de separación, los cuales son difíciles
de llevar a producción a escala industrial.
Es característico de la técnica anterior la
patente de Estados Unidos nº 5.620.875, concedida el 15 de Abril de
1997 a Hoffman y col. El documento muestra la separación de
paclitaxel y otros taxanos mediante extracciones con hexano en etapa
múltiple y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). El
procedimiento es complicado, laborioso y solo proporciona
rendimientos moderados de los compuestos deseados.
En la patente de Estados Unidos nº 5.670.673,
concedida el 23 de septiembre de 1997 a Rao, se describe el
aislamiento y purificación de Taxol y sus análogos. El procedimiento
incluye el uso de cromatografía líquida de fase inversa sobre un
adsorbente C18 con elución de los análogos adsorbidos. Si bien se
trata de un procedimiento meritorio, existen limitaciones con esta
técnica en términos de productividad y pureza de los compuestos
obtenidos.
El documento
US-A-5.281.727 describe un
procedimiento para el procesamiento de una primera solución que
contiene taxanos convencionales detectables y otros compuestos de
taxano para generar una segunda solución que contiene un mayor
porcentaje de taxanos convencionales detectables que dicha primera
solución. Esta referencia describe el uso de resinas de intercambio
iónico para la purificación de soluciones que contienen taxano. La
resina de intercambio iónico puede comprender un poliestireno
reticulado. Se emplea disolvente polar (metanol) como eluyente para
las columnas de intercambio iónico empleadas en los ejemplos 4 y 5
de dicha referencia.
La presente invención proporciona un
procedimiento de separación simple basado en una columna de resina
polimérica, el cual está exento de las limitaciones de la
metodología existente.
Es por tanto un objeto de esta invención
proporcionar un procedimiento simple y más efectivo en coste para el
aislamiento y purificación económico de los taxanos de importancia,
tales como la
13-acetil-9-dihidrobaccatina
III, 10-deacetilbaccatina III, baccatina III,
cefalomanina y paclitaxel.
Los procedimientos convencionales para el
aislamiento de taxanos, que incluyen el paclitaxel,
13-acetil-9-dihidrobaccatina
III y baccatina III comprenden por lo general las etapas de
extracción de taxanos a partir de materiales de partida con un
disolvente de alcohol, desengrase del extracto y separación y
purificación del taxano individual mediante cromatografía.
Un objeto de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de aislamiento y purificación de los
análogos de taxano a partir de una fuente que contenga taxanos, que
comprende:
extracción de una fuente de taxanos en un
extractante orgánico;
recubrir un medio absorbente de trabajo con el
extractante y cargar el medio en la columna, conteniendo la columna
un agente absorbente;
elución, en una primera etapa, con una mezcla de
disolvente orgánico a una presión de entre 10 y 20 psi para generar
fracciones que contengan compuestos de taxano;
cristalización de las fracciones para
proporcionar un compuesto de taxano sólido y un licor madre;
concentración del licor madre; y
elución, en una segunda etapa, con una mezcla de
disolvente polar del licor madre a través de una resina polimérica
para proporcionar al menos un segundo compuesto de taxano.
Un objeto adicional de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de aislamiento y purificación de
taxanos a partir de una fuente que contenga taxanos, que
comprende:
proporcionar una fuente de taxanos;
extracción de los taxanos de la fuente en un
medio de extracción orgánico para proporcionar una capa orgánica que
contenga compuestos de taxano;
tratamiento de un material soporte con la capa
orgánica;
proporcionar una columna de baja presión que
contenga un agente absorbente;
elución, en una primera etapa, de un disolvente
orgánico a través de la columna para eluir las fracciones de taxano
purificadas;
cristalización de las fracciones de taxano para
proporcionar un primer análogo de taxano y un licor madre;
elución, en una segunda etapa, del licor madre a
través de una resina polimérica en una columna cromatográfica para
purificar y eluir al menos un segundo análogo de taxano y un tercer
análogo de taxano; y
recogida de los análogos de taxano separados.
Otro objeto más de la presente invención es
proporcionar un procedimiento de aislamiento y purificación de
taxanos a partir de una fuente que contenga taxanos, que
comprende:
proporcionar una fuente de taxanos;
extracción de los taxanos de la fuente en un
medio de extracción orgánico para proporcionar una capa orgánica que
contenga compuestos de taxano;
tratamiento de un material soporte con la capa
orgánica;
proporcionar una columna de baja presión que
contenga un agente absorbente;
elución, en una primera etapa, a una presión de
entre 10 y 20 psi, de un disolvente orgánico a través de la columna
para eluir las fracciones de taxano purificadas y eliminar las
impurezas de flavonoides y lignano;
cristalización de las fracciones de taxano para
proporcionar un primer análogo de taxano y un licor madre;
elución, en una segunda etapa, a una presión de
30 psi, del licor madre a través de una resina de poliestireno DVB
en una columna cromatográfica para purificar y eluir al menos un
segundo análogo de taxano y un tercer análogo de taxano;
elución, en una tercera etapa, del segundo
análogo de taxano y del tercer análogo de taxano a través de una
columna de gel de sílice de fase normal para purificar el segundo
análogo de taxano y el tercer análogo de taxano; y
recogida de los análogos de taxano separados.
La fuente inicial de taxanos fue el material de
la planta, Taxus canadensis, la cual abunda en el este de
Canadá. Se emplearon gajos y hojas o mezcla de estos del Taxus
canadensis. El material puede ser fresco o estar secado.
Se muele el material de partida y se extrae con
metanol a 60º C durante cinco horas y se filtra. Se mezcla el
extracto de metanol con carbón vegetal y se deja reposar a
temperatura ambiente durante una hora. Esto se filtra luego. Se
concentra el filtrado hasta aproximadamente el 15% del volumen
inicial mediante evaporación. Se añade una mezcla de
agua:diclorometano 1:1 (en relación volumen/volumen) al concentrado
para obtener un porción enriquecida en paclitaxel (capa
orgánica).
La capa orgánica se concentra hasta un volumen
reducido y se recubre sobre un material soporte, en este caso, el
material soporte es el Celite 545.
El material recubierto se carga a la parte
superior de una columna preparativa industrial, por ejemplo, una
columna de 150 mm x 1500 mm y se empaqueta con el agente absorbente
Al_{2}O_{3}. Se eluye la columna con una mezcla de
hexano:acetona (comienzo a 100:0, final a 45:55) bajo una presión de
entre 10 psi y 20 psi. Se recogen las fracciones que contienen
taxanos y se analizaron mediante cromatografía en capa fina (TLC) y
a continuación se combinaron de acuerdo con los resultados de la
TLC.
Se concentran luego las fracciones recogidas a
vacío, se disuelve el material resultante en metanol y se mantiene a
temperatura ambiente durante la noche. Se separa por filtración el
cristal formado y se lava con metanol, luego se recristaliza a
partir de acetona. Se obtiene
13-acetil-9-dihidrobaccatina
III como un cristal blanco.
Se concentra el licor madre hasta sequedad y se
disuelve el residuo en acetona. Se mezcla la solución de acetona con
una resina polimérica (resina Dowex™ , poliestireno - DVB). Se
evapora la mezcla a vacío para eliminar la acetona. Se somete el
polvo resultante a cromatografía a baja presión. Se empaqueta la
columna cromatográfica a escala industrial (150 mm x 1500 mm) con
resina Dowex™ y se eluye con acetona:agua (45:55, en relación
volumen/volumen) a una velocidad de flujo de 150 ml/min bajo una
presión de operación de 30 psi. Se recogen fracciones de
aproximadamente 2 l/cada una y éstas se controlan mediante TLC y
HPLC. Las fracciones con baccatina III y
10-deacetilbaccatina III se combinan y evaporan a
vacío para eliminar sustancialmente todo el disolvente orgánico,
luego se diluyen con agua y se extraen con CH_{2}Cl_{2}. Se
concentra luego el extracto hasta sequedad y se disuelve luego el
residuo resultante en EtOAc y se purifica mediante columna de gel de
sílice de fase normal con hexano:EtOAc como el sistema disolvente
(comienzo a 5:5, final a 35:65). Se obtienen finalmente la baccatina
III y 10-deacetilbaccatina-III como
polvo blanco con una pureza superior al 98%.
Se combinan las fracciones que contienen
paclitaxel y cefalomanina y se evaporaron a presión reducida para
eliminar sustancialmente toda la acetona, luego se reparte entre
agua y CH_{2}Cl_{2}. Se separa la capa orgánica y se evapora
hasta sequedad a presión reducida. Se disuelve el residuo en
metanol. Se añade a la solución de metanol aproximadamente 30% (en
relación peso/volumen) de agua y se calienta la mezcla hasta 60ºC
durante cinco minutos, luego se mantuvo a temperatura ambiente
durante la noche. Se separa por filtración el sólido cristalino
bruto de la solución de metanol y se seca a vacío entre 70ºC y 75ºC.
Se analiza el sólido mediante HPLC. Este consiste aproximadamente en
70% de paclitaxel y 25% de cefalomanina, y algo de otros
taxanos.
El paclitaxel bruto se puede procesar de acuerdo
con uno de los tres procedimientos alternativos. En una primera
posibilidad, se disuelve en acetona y se purifica mediante
cromatografía en columna de fase inversa. Se empaqueta la columna
con resina polimérica (resina Diaion, HP2MG) y se eluye con
acetonitrilo:agua (45,55). Se obtiene paclitaxel como cristal blanco
con una pureza superior al 98%. Se obtiene cefalomanina como un
polvo blanco en una pureza superior al 98%.
De forma alternativa, como un segundo enfoque de
procesamiento, se lleva a cabo la purificación de paclitaxel y
cefalomanina mediante un procedimiento de reacción química y se
purifica luego mediante cromatografía en columna en fase inversa
sobre gel de sílice unida. Se disuelve la mezcla de paclitaxel
bruto, cefalomanina en CH_{2}Cl_{2} o CHCl_{3} (1:10, en
relación peso/volumen), y reacciona con 10 equivalentes de bromo en
un matraz de fondo redondo que se coloca en un baño de hielo (entre
0ºC y 5ºC) durante aproximadamente 40 minutos. Se separa fácilmente
la mezcla resultante de paclitaxel y
2'',3''-bromocefalomanina mediante una columna
cromatográfica de fase inversa (C_{18} o fenilo), disolvente de
elución CH_{3}CN:H_{2}O (45,55). Se obtiene paclitaxel como un
cristal blanco con una pureza superior al 99%. Se obtiene
2'',3''-bromocefalomanina como una mezcla de
diastereómeros, la cual se hace reaccionar con zinc activado en
ácido acético a temperatura ambiente, y luego se purifica mediante
cromatografía en columna ultrarrápida para obtener cefalomanina pura
que presenta una pureza superior al 95%.
En una tercera alternativa, se purifican el
paclitaxel y la bromocefalomanina mediante una columna de gel de
sílice de fase normal. Los sistemas disolventes de elución pueden
comprender hexano:EtOAc (comienzo a 6:4, final a 4:6), o
CH_{2}Cl_{2}:Me_{2}CO (comienzo a 8:2, final a 65:35) o
CHCl_{2}:EtOAc (comienzo a 75:25, final a 6:4). A partir de este
procedimiento se obtiene paclitaxel como un cristal blanco con una
pureza que supera el 99%, con cefalomanina presente en una cantidad
inferior al 0,2%.
Habiendo descrito la invención, se hará ahora
referencia más precisa a la misma por medio de los ejemplos.
Se extraen aproximadamente 200 kilogramos de
gajos y hojas secas de Taxus canadensis con 1.000 litros de
metanol a 60º C en un extractor multi-funcional
industrial durante cinco horas y luego se filtra. Se extraen los
materiales de partida con 700 litros de metanol a una temperatura de
entre 55ºC y 60ºC durante otras cuatro horas y se filtra. Se combina
y se mezcla el filtrado con 10 kilogramos de carbono activado (5% en
relación peso/peso) y se mantiene a temperatura ambiente durante una
hora, luego se filtra para eliminar el carbono activado. Se
concentra luego el filtrado hasta aproximadamente 100 litros a
vacío, luego se añaden 300 litros de agua:diclorometano (1:1). Se
recoge la capa orgánica y se extrae la solución acuosa dos veces más
con 200 litros de diclorometano. Se combina la solución de
diclorometano y se evapora a vacío para dar lugar a una forma de
suspensión, luego se diluye con 20 litros de acetona.
Se recubre la solución de acetona sobre 20
kilogramos de Celite 545. Se seca con aire el material recubierto y
se carga luego sobre la parte superior de las tres columnas
cromatográficas industriales de baja presión (dimensión: 150 x 15
cm). Se empaqueta cada columna con 15 kilogramos de absorbente de
óxido de alúmina (Al_{2}O_{3}). Se apreciará que la dimensión
exacta de las columnas no es crucial en tanto las columnas sean
suficientemente grandes para alojar la cantidad de Al_{2}O_{3}
requerida para la separación. El uso de óxido de alúmina es efectivo
para absorber los flavonoides y lignanos que se extraen
conjuntamente del material fuente. Estos son también difíciles de
eliminar y llega a ser un problema para la pureza final del
paclitaxel producto.
Las columnas se eluyen con el sistema disolvente
hexano:acetona (comienzo a 100:0, final a 45:55) a una presión entre
10 y 15 psi con una velocidad de flujo a aproximadamente 150
ml/min.
Las fracciones que contienen taxanos se recogen y
se combinan de acuerdo con los resultados de la cromatografía en
capa fina (TLC), y se concentran luego a presión reducida para
eliminar todos los disolventes. Se disuelve el material resultante
en metanol y se mantiene a temperatura ambiente durante la noche
para dar cristales en forma de agujas. Se filtran los cristales y se
recristalizan a partir de acetona para dar adicionalmente cristales
en forma de agujas blancas identificadas como
13-acetil-9-dihidrobaccatina
III, que presenta una pureza superior al 96% (148 gramos) (0,074% en
base al material de partida).
El líquido madre de la cristalización del
13-acetil-9-dihidrobaccatina
III se concentra hasta sequedad a presión reducida. Se disuelve el
residuo en tres litros de acetona. Se mezcla la solución de acetona
con 1,5 kilogramos de una resina de copolímero de poliestireno -
divinilbenceno. Se evapora la mezcla para eliminar el disolvente y
se carga el polvo resultante a la parte superior de una columna
cromatográfica industrial de baja presión empaquetada con resina de
copolímero de poliestireno - divinilbenceno, y se eluye con acetona
al 45% en agua a una velocidad de flujo de 150 ml/min, bajo una
presión de operación por debajo de 30 psi. Se recogen fracciones de
2 l/cada una y se controlan estas mediante TLC y HPLC.
Se combinan las fracciones que contenían
paclitaxel y cefalomanina y se evaporan a presión reducida para
eliminar la mayor parte de la acetona, luego se diluye con agua
desionizada y se extrae tres veces con 2,5 litros de diclorometano.
Se concentra la capa orgánica hasta sequedad a presión reducida, se
disuelve el residuo en un litro de metanol.
Se añade a la solución de metanol agua
aproximadamente al 30% (en relación peso/volumen) y se calienta la
mezcla hasta 60ºC durante unos pocos minutos, se mantiene luego a
temperatura ambiente durante la noche. Se separa por filtración el
sólido cristalino bruto de la solución de metanol y se seca en una
estufa a presión reducida a una temperatura de entre 70ºC y 75ºC. El
sólido consistía aproximadamente en paclitaxel al 70% y cefalomanina
al 25% con un rendimiento de 31 gramos.
Se disuelve el paclitaxel bruto (30 g) en 200 ml
de acetonitrilo y se diluye con 250 ml de agua desionizada y se
bombea a la parte superior de una columna cromatográfica de baja
presión (tamaño: 10 x 150 cm) y empaquetada con una resina
polimérica (resina de polimetacrilato macroporosa, Diaion). Una vez
bombeada la muestra se eluye la columna con un gradiente escalón de
35, 40, 45 y 50% de acetonitrilo en agua. Se indicó el cambio de
disolvente mediante los resultados de TLC y HPLC de las
fracciones.
Se recogen fracciones de aproximadamente 1 l/cada
una y se controlan mediante análisis por TLC y HPLC. La velocidad de
flujo fue de 75 ml/min. Se combinan individualmente las fracciones
de la columna que contenían paclitaxel o cefalomanina. Se dejan
reposar las dos soluciones combinadas a una temperatura de
aproximadamente 5ºC hasta que se completó la cristalización del
compuesto individual.
Se filtran los cristales por separado y se
recristalizan ambos a partir de metanol a 65ºC en agua.
Se obtiene paclitaxel como cristales en forma de
aguja con una pureza superior a un 99% y un rendimiento de 18,5 g
(0,009%).
Se obtiene cefalomanina en forma de agujas
blancas con una pureza de más del 98% y un rendimiento de 6,5 g
(0,003%).
Se combinan las fracciones que contenían
baccatina III y 10-deacetilbaccatina III de la etapa
previa y se evapora a presión reducida para eliminar sustancialmente
la acetona, luego se reparte entre tres litros de agua y
diclorometano (1:1 en relación volumen/volumen). Se concentra la
capa orgánica hasta sequedad y se somete el residuo a cromatografía
de fase normal. La dimensión de la columna empleada fue de 4'' x 4',
empaquetada con gel de sílice (malla 200 - 300). El disolvente de
elución fue un gradiente escalón de hexano:acetato de etilo
(comienzo a 50:50, final a 35:65). Se recogen fracciones de
aproximadamente 1.000 ml/cada una y se controla cada una mediante
TLC.
Se recogen de forma separada las fracciones que
contenían baccatina III o 10-deacetilbaccatina III y
se combinan de acuerdo con los resultados de TLC, luego se
concentran hasta sequedad.
Se disuelve la parte de baccatina III en 200 ml
de metanol y se mantiene en un refrigerador durante la noche. Se
filtraron los cristales blancos formados y se recristalizaron a
partir de metanol para dar baccatina III como cristales blancos en
un rendimiento de 7,5 g (0,003%).
Se disuelve la
10-deacetilbaccatina bruta en 150 ml de acetona y
luego se diluye con 150 ml de hexano. Se mantiene la mezcla a
temperatura ambiente durante la noche. Se filtran los cristales
formados y se recristalizan a partir del mismo disolvente para dar
10-deactilbaccatina III como cristales blancos. El
rendimiento fue de 15 g (0,007%).
Empleando un aparato y metodología similares a lo
empleado en el ejemplo 1, se obtiene paclitaxel bruto. Se disuelve
el paclitaxel bruto en 300 ml de diclorometano el cual se añade a un
matraz de fondo redondo de tres bocas de 1.000 ml. Se coloca el
matraz en un baño de hielo y se agita la solución con un agitador
magnético. Cuando la temperatura alcanzaba aproximadamente los 5ºC
se añade una solución de bromo (10 equivalentes) en diclorometano
(1:1 en relación volumen/volumen) lentamente con agitación. La
proporción de cefalomanina a bromo era de 1 a 10 moles.
Se controla la brominación mediante análisis por
TLC entre cinco y diez minutos. Se diluye luego la mezcla de
reacción con 300 ml de diclorometano y se transfiere a un embudo de
separación una vez completada la reacción (tiempo para se complete
requerido entre 40 y 50 minutos). Se añade a la mezcla de reacción
350 ml de tiosulfato de sodio acuoso al 10% (Na_{2}S_{2}O_{3})
para absorber cualquier exceso de bromo. La capa de diclorometano se
separa y lava con agua y salmuera, y luego se concentra hasta
sequedad a presión reducida. Se obtiene un polvo marrón claro.
Se disuelve el material bruto (10 g) del ejemplo
2 en 120 ml de acetonitrilo el cual se diluye con 150 ml de agua
desionizada. Se bombea la solución a la parte superior de una
columna cromatográfica de fase inversa (5 x 100 cm) empaquetada con
gel de sílice unida C_{18}.
Se eluye la columna con acetonitrilo:agua (45:55)
a una presión de operación de entre 30 y 40 psi. La velocidad de
flujo fue de 30 ml/min. Se recogen las fracciones (250 ml/cada una),
se controlan mediante TLC y se combinan.
La porción que contiene paclitaxel se refrigera
durante la noche; se filtran los cristales formados y se
recristaliza a partir de metanol al 70%. Se obtiene paclitaxel como
cristales en forma de agujas blancos que presentan una pureza
superior al 99% en un rendimiento de 6:1 g.
Se combinan las fracciones que contienen
2'',3''-bromocefalomanina, las cuales se reparten
entre agua y diclorometano. Se recoge la capa orgánica y se evapora
hasta sequedad a presión reducida. Se disuelve el residuo en 150 ml
de metanol, el cual se diluye con 50 ml de agua para obtener
cristales en forma de agujas. Se recristaliza el cristal blanquecino
a partir de metanol:agua para dar
2'',3''-bromocefalomanina en forma de cristales
blancos.
Se disuelven dos gramos de
2'',3''-bromocefalomanina en 30 ml de AcOH y se
añade zinc activado fresco (2 g). Se agita la mezcla durante tres
horas a temperatura ambiente y se controla la reacción mediante TLC.
Se muestra que la reacción se completa por análisis mediante TLC, se
reparte la mezcla entre diclorometano y NaHCO_{3} al 10% (300 ml,
2:1). La capa orgánica se lava con agua y se concentra hasta
sequedad. Se purifica el producto bruto mediante cromatografía
ultrarrápida para dar cefalomanina como un polvo blanco.
Se disuelve el material bruto (10 g) del ejemplo
2 en 120 ml de diclorometano. Se concentra la capa orgánica hasta
sequedad y se somete el residuo a cromatografía de fase normal. La
dimensión de la columna empleada fue de 4'' x 4' empaquetada con gel
de sílice (malla entre 200 y 300). El disolvente de elución fue de
un gradiente escalón de diclorometano:acetato de etilo (comienzo a
75:25, final a 6:4), para la separación de paclitaxel y
2'',3''-bromocefalomanina también se puede emplear
el sistema de disolventes de hexano:acetato de etilo (comienzo a
6:4, final a 4:6) y diclorometano:acetona (comienzo a 8:2, final a
65:35). Se recogen fracciones de aproximadamente 500 ml/cada una, y
se controla cada una mediante TLC.
Se recogen por separado las fracciones que
contenían paclitaxel y 2'',3''-bromocefalomanina y
se combinan de acuerdo con los resultados de TLC, luego se concentra
hasta sequedad.
La porción de paclitaxel se disuelve en 100 ml de
metanol y se diluye con 35 ml de agua, luego se mantiene
refrigerado. Se filtraron los cristales blancos formados y se
recristalizan a partir de metanol:agua para dar paclitaxel (5,5 g)
en forma de cristales blancos.
Se disuelve
2'',3''-bromocefalomanina bruta en 50 ml de acetona
y luego se diluye con 50 ml de hexano. Se mantiene la mezcla a
temperatura ambiente durante la noche. Se filtran los cristales
blancos formados y se recristalizan a partir del mismo disolvente
para dar 2'',3''-bromocefalomanina en forma de
cristales blancos.
Los siguientes ejemplos ilustran los compuestos
en forma estructural.
Claims (20)
1.Un procedimiento de aislamiento y purificación
de análogos de taxano a partir de una fuente que contiene taxanos,
que comprende:
extracción de una fuente de taxanos en un
extractante orgánico:
recubrimiento de un medio absorbente de trabajo
con dicho extractante y carga de dicho medio en una columna,
conteniendo dicha columna un agente absorbente;
elución, en una primera etapa, con una mezcla de
disolvente orgánico a una presión de entre 10 y 20 psi para generar
fracciones que contengan compuestos de taxano;
cristalización de dichas fracciones para
proporcionar un compuesto de taxano sólido y un licor madre;
concentración del licor madre; y
elución, en una segunda etapa, con una mezcla de
disolvente polar de dicho licor madre a través de una resina
polimérica para proporcionar al menos un segundo compuesto de
taxano.
2. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, que incluye además la etapa de eliminación de
impurezas de lignano y flavonoides en dicha primera etapa.
3. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, en el que dicha fuente de dichos taxanos comprende
una fuente de planta.
4. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 3, en el que dicha fuente de planta se selecciona
entre un miembro del grupo constituido por Taxus brevifolia,
Taxus baccata, Taxus walichiana, Taxus
yunnanensis, y Taxus canadensis.
5. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 3, en el que dichos taxanos incluyen al menos
13-acetil-9-dihidrobaccatina
III, 10-deacetilbaccatina III, baccatina III,
cefalomanina, paclitaxel.
6. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, en el que dicho extractante orgánico comprende
diclorometano.
7. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, en el que el mencionado medio absorbente débil
comprende Celite 545.
8. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, en el que el mencionado agente absorbente
comprende óxido de aluminio.
9. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, en el que dicha mezcla de disolvente orgánico de
la primera etapa comprende hexano y acetona.
10. Un procedimiento de aislamiento y
purificación de taxanos a partir de una fuente que contiene taxanos,
que comprende:
proporcionar una fuente de dichos taxanos;
extracción de dichos taxanos a partir de dicha
fuente en un medio de extracción orgánico para proporcionar una capa
orgánica que contiene compuestos de taxano;
tratamiento de un material soporte con dicha capa
orgánica;
proporcionar una columna de baja presión que
contenga un agente absorbente;
elución, en una primera etapa, de un disolvente
orgánico a través de dicha columna para eluir las fracciones de
hexano purificadas;
cristalización de dichas fracciones de taxano
para proporcionar un primer análogo de taxano y un licor madre;
elución, en una segunda etapa, de dicho licor
madre a través de una resina polimérica en una columna
cromatográfica para purificar y eluir al menos un segundo análogo de
taxano y un tercer análogo de taxano; y
recogida de los análogos de taxano separados.
11. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 10, que incluye además la etapa de eliminación de
impurezas de lignano y flavonoides en dicha primera etapa.
12. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 10, que incluye además la etapa de molienda de dicha
fuente de taxanos y extracción con metanol.
13. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 12, que incluye además la etapa de mezclar el
extracto con carbón vegetal, filtrar y evaporar para formar un
concentrado.
14. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 13, en el que el mencionado material soporte
comprende Celite 545.
15. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, en el que el mencionado disolvente orgánico
comprende una mezcla de acetona y hexano.
16. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 15, en el que el mencionado disolvente orgánico se
pasa a través de dicha columna a una presión de entre 10 y 20
psi.
17. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 1, que incluye además la etapa de recogida y análisis
de dichas fracciones de taxano mediante cromatografía en capa
fina.
18. Un procedimiento de aislamiento y
purificación de taxanos a partir de una fuente que contiene taxanos,
que comprende:
proporcionar una fuente de dichos taxanos;
extracción de dichos taxanos a partir de dicha
fuente en un medio de extracción orgánico para proporcionar una capa
orgánica que contenga compuestos de taxano;
tratamiento de un material soporte con la
mencionada capa orgánica;
proporcionar una columna de baja presión que
contenga un agente absorbente;
elución, en una primera etapa, a una presión de
entre 10 y 20 psi, de un disolvente orgánico a través de dicha
columna para eluir las fracciones de taxano purificadas y eliminar
las impurezas de flavonoides y lignano;
cristalización de dichas fracciones de taxano
para proporcionar un primer análogo de taxano y un licor madre;
elución, en una segunda etapa, a una presión de
30 psi, de dicho licor madre a través de una resina de poliestireno
DVB en una columna cromatográfica para purificar y eluir al menos un
segundo análogo de taxano y un tercer análogo de taxano;
elución, en una tercera etapa, de dicho segundo
análogo de taxano y dicho tercer análogo de taxano a través de una
columna de gel de sílice de fase normal para purificar dicho segundo
análogo de taxano y dicho tercer análogo de taxano; y
recogida de los análogos de taxano separados.
19. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 18, en el que dicho segundo análogo de taxano
comprende baccatina III y dicho tercer análogo de taxano comprende
10-deacetilbaccatina III.
20. El procedimiento como se describe en la
reivindicación 18, en el que dichos análogos presentan una pureza de
al menos 98%.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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