NO321779B1

NO321779B1 - Metoder for isolering og rensing av taxananaloger respektive taxaner fra en kilde inneholdende taxaner

Info

Publication number: NO321779B1
Application number: NO20000070A
Authority: NO
Inventors: Jian Liu
Original assignee: Ivax Research Inc
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 2000-01-06
Publication date: 2006-07-03
Also published as: KR20000062437A; BR0000884A; IL133956A0; AU768026B2; RU2201788C2; NZ502204A; PT1018510E; JP2000204090A; EP1018510B1; PL337764A1; DE69915241T2; ATE260908T1; CN1266059A; NO20000070D0; IL133956A; DK1018510T3; US5969165A; SG87072A1; EP1018510A1; NO20000070L

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse angår generelt en separasjons-teknikk og mer spesielt metoder for isolering og rensing av taxananaloger, respektive taxaner, fra en kilde inneholdende taxaner. Herunder omfattes teknikker for å separere paklitaksel og beslektede taxaner.

Oppfinnelsens bakgrunn

Paklitaksel er et velkjent kjemoterapeutisk legemiddel for behandling av forskjellige metastatiske cancerformer. Det har blitt godkjent av FDA og HPB for behandling av ovarial og brystcancer.

Forbindelsen er et naturprodukt som ekstraheres fra barken på Pacific barlindtre, Taxus brevifolia og forekommer også i T. bacatta, T. walichiana, T. vunnanensis og T. canadensis.

Konsentrasjonen av paklitaksel i forskjellige råmaterialer er vanligvis lav f.eks. i området mellom 0,0004 og 0,01 vekt% i barken på Pacific barlindtre. En slik lav konsentra-sjon gjør ekstraksjonen og rensingen av forbindelsen til en farmasøytisk grad fra råmaterialene meget vanskelig og hittil upraktisk i en kommersiell skala. Forskjellige metoder av normal fasekromatografi og revers fasekromatografi samt kromatografi i kolonner med lavt og høyt trykk har blitt utviklet for å rense paklitaksel fra et urent ekstrakt av råmaterialet.

Suksessen med lavtrykkskromatografi avhenger til stor del av kolonnens natur. Forskjellige problemer assosieres med bruken av kiselsyregele og aluminiumtrioksid hvilke alle er klassiske bærere i den stasjonære fase i avskillingssystemer. De danner en stabil stasjonær fase med de fleste løsnings-middelsystemene men det er et sterkt absorpsjonsmiddel og kan delta i separasjonsprosessen i en slik grad at det kromatografiske forløpet og oppsamlingen av prøvene påvirkes.

Kromatografiske metoder har blitt utviklet for å detek-tere og isolere paklitaksel fra forskjellige Taxus species på analytisk og preparativ basis. Disse isolasjonsprosessene utføres hovedsakelig i en liten laboratorieskala og de har lav selektivitet, lavt utbytte og høye produksjonskostnader og de gir derfor opphav til et alvorlig og ikke oppfylt behov for en økonomisk praktiserbar metode for separering av den verdifulle anti-tumør forbindelsen paklitaksel fra dens nærliggende analoge cefalomanin samt andre nære relaterte taksaner.

Tidligere metoder beskriver anvendelse av forskjellige typer av kromatografiske teknikker for å separere paklitaksel og relaterte taksaner inkluderende normal fase og reversfase kromatografi i en kiselsyregele eller bundet kiselsyregelekolonne. De tidligere metodene gir lavt utbytte, høy produk-sjonskostnad eller involverer flere separasjonssteg som det skulle være vanskelig å forstørre opp til produksjon i en stor industriell skala.

Det som karakteriserer den kjente teknikken er US Patent nr. 5 620 875 utstedt 15.april, 1997 til Hoffman et al. Dokumentet foreskriver separasjon av paklitaksel og andre taksaner ved hjelp av ekstraksjoner i flere steg i heksan og væskekromatografi og kvalitet (HPLC). Prosessen involverer intensivt arbeide i laboratoriet og gir bare moderate ut-bytter av de ønskede forbindelsene.

I US Patent nr. 5 670 673, utstedt 23.september 1997 til Rao, beskrives isoleringen og rensingen av Taxol og dens analoger. Prosessen inkluderer bruken av reversfase væske-kromatograf i i et C18 absorpsjonsmiddel med utdrivning av de absorberende analogene. Selv om det er en fortjenestefull prosedyre forekommer begrensninger med denne teknikken i termer av produktivitet og renhet av de forbindelser som erholdes.

Den foreliggende oppfinnelsen innebærer en enkel separasjonsmetode basert blant annet på en kolonne med polymerharts som ikke har de begrensninger som forefinnes ved de metoder som i dag eksisterer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er derfor et mål med denne oppfinnelse å frembringe en enkel og mer kosteffektiv metode for økonomisk isolasjon og rensing av de viktige taksanene, f.eks. 13-acetyl-9-dihydrobakkatin III, 10-deacetylbakkatin II, bakkatin III, cefalomanin og paklitaksel.

Konvensjonelle metoder for isolering av taksaner inkluderende paklitaksel, 13-acetyl-9-dihydrobakkatin III og bakkatin III omfatter allment slike trinn som ekstrahering av taksaner fra råmaterialer ved alkoholisk løsningsmiddel, avsetning av. ekstraktet og separering og rensing av den individuelle taksanen ved hjelp av kromatografi.

Et første aspekt av den foreliggende oppfinnelsen går ut på en metode for isolering og rensing av taksananaloger fra en kilde inneholdende taksaner, omfattende: ekstrahering av en kilde for taksaner i et organisk ekstraherende middel;

belegging av et arbeidsabsorberende medium med det ekstraherende middelet og ladning av mediet i en kolonne, hvilken kolonne inneholder et absorberende middel;

utdrivning i et første trinn med en organisk løsnings-middelblanding ved et trykk av mellom 10 og 20 psi for å frembringe fraksjoner inneholdende taksanforbindelser;

krystallisering av fraksjonene for å frembringe en fast taksanforbindelse og en moderlut;

konsentrering av moderluten og utdrivning i et andre trinn med en polær løsningsmiddelblanding av moderluten gjennom et polymerharts for å frembringe minst en andre taksanforbindelse.

Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen går ut på en metode for isolering og rensing av taksaner fra en kilde inneholdende taksaner omfattende: frembringelse av en kilde for taksaner;

ekstrahering av taksanene fra kilden i et organisk ekstraksjonsmedium for å frembringe et organisk sjikt inneho1dende taksanforbindeIser;

behandling av et underlagsmateriale med det organiske sj iktet;

frembringelse av en lavtrykkskolonne inneholdende et absorberende middel;

utdrivning i et første trinn av et organisk løsnings-middel gjennom kolonnen for utdrivning av rensede taksanfraksjoner;

krystallisering av taksanfraksjonene for frembringelse av en første taksananalog og en moderlut;

utdrivning i et andre trinn av moderluten gjennom et polymerharts i en kxomatografisk kolonne for rensing og utdrivelse av minst en andre taksananalog og en tredje taksananalog; og

oppsamling av separerte taksananaloger.

Et tredje aspekt av foreliggende oppfinnelse går ut på en metode for isolering og rensning av taksaner fra en kilde inneholdende taksaner omfattende: frembringelse av en kilde for taksaner;

ekstrahering av taksanene fra kilden i et organisk ekstraksjonsmedium for å frembringe et organisk sjikt inneholdende taksanforbindelser;

behandling av et underlagsateriale med det organiske sjiktet;

frembringelse av en lavtrykkskolonne inneholdende et absorberende middel;

utdrivning i et første trinn ved et trykk av mellom 10 og 20 psi av et organisk løsningsmiddel gjennom kolonnen for å utdrive rensede taksanfraksjoner og fjerne flavonoid og lignan forurensninger;

krystallisering av taksanfraksjoner for å frembringe en første taksananalog og en moderlut;

utdrivning i et andre trinn ved et trykk av 3 0 psi av moderluten gjennom et polystyren DVB harts i en kromatografisk kolonne for rensing og utdrivning av minst en andre taksananalog og en tredje taksananalog;

utdrivning i et tredje steg av den andre taksananalogen og den tredje taksananalogen gjennom en normal fase kiselsyregelekolonne for å rense den andre taksananalogen og den tredje taksananalogen; og

oppsamling av de separerte taksananalogene.

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelsesfonnene

Den første kilden for taksaner var plantematerialet Taxus canadensis, som er rikelig forekommende i østre Canada. Kvister og nåler eller blandinger av disse fra Taxus canadensis ble brukt. Materialet kan være nytt eller tørket.

Råmaterialet ble malt og ekstrahert med metanol ved 60 °C under 5 timer og filtrert. Metanolekstraktet ble blandet med trekull og fikk stå ved romtemperatur under 1 time. Dette ble deretter filtrert. Filtratet ble konsentrert til ca. 15% av det opprinnelige volumet ved hjelp av inndunsting. En blanding av 1:1 vann:diklormetan ble tilsatt til konsentratet for fremstilling av en anriket del av paklitaksel (organisk sjikt) .

Det organiske sjiktet ble konsentrert til et redusert volum og ble lagt på et underlagsmateriale, i dette tilfellet var underlagsmaterialet Celite 545.

Det belagte materialet ble ladet på toppen av en industriell preparativ kolonne til f.eks. en 150 mm x 1500 mm kolonne og pakket med det absorberende middelet Al203. Kolonnen ble utdrevet med en blanding av heksan:aceton (start 100:0 ved slutten 45:55) under et trykk av mellom 10 psi og 20 psi. De fraksjoner som inneholdt taksaner ble oppsamlet og analysert ved hjelp av tynnsjiktskromatografi (TLC) og deretter forenet i henhold til TLC resultat.

De fraksjoner som ble sammenført ble konsentrert under vakuum, det resulterende materialet ble løst i metanol og holdt ved romtemperatur over natten. De krystaller som ble dannet ble filtrert ut og vasket med metanol, deretter rekrystallisert fra aceton. 13-acetyl-9-dihydrobakkatin III ble erholdt som hvite krystaller.

Moderluten ble konsentrert til tørrhet og resten ble løst i aceton. Acetonløsningen ble blandet med et polymerharts (Dowex™ resin, polystyren-DVB). Blandingen ble inndunstet til vakuum for å fjerne acetonet. Det resulterende pulveret ble underkastet lavtrykkskromatografi. Den kromatografiske kolonnen av industriell skala (150 mm x 1500 mm) ble pakket med Dowex™ resin og utdrevet med aceton:vann (45:55) med en hastighet av 150 ml/min under et trykk av 30 psi. Fraksjoner på ca. 2 1 hver og en ble oppsamlet og disse ble observert av TLC og HPLC. De fraksjoner som inneholdt bakkatin III og 10-deacetylbakkatin III ble kombinert og inndunstet under vakuum for å fjerne i hovedsak alt organisk løsningsmiddel, deretter fortynnet med vann og ekstrahert med CH2C12. Ekstraktet ble deretter konsentrert til tørrhet og den resulterende resten ble deretter løst i EtOAcog renset ved hjelp av normal fase kisel syr ege lekolonne med heksan ^tOA,, som løsningsmiddelsystem (start 5:5 ved slutten 35:65). Bakkatin III og 10-deacetylbakkatin III ble til slutt erholdt som hvitt pulver med en renhet som var større enn 98%.

De fraksjoner som inneholder paklitaksel og cefalomanin ble kombinert og inndunstet under vakuum for å fj erne i hovedsak all aceton, deretter oppdelt mellom vann og CH2C12. Det organiske sjiktet ble separert og inndunstet til tørrhet under vakuum. Resten ble løst i metanol. Til metanolløsningen ble ca. 30 vekt% vann tilsatt og blandingen ble oppvarmet til 60 °C under 5 minutter og fikk deretter stå i romtemperatur over natten. Det urene krystalline faste stoffet fra metanol-løsningen ble filtrert ut og tørket under vakuum mellom 70 og 75 °C. Det faste stoffet ble analysert gjennom HPLC. Det bestod av ca. 70% paklitaksel og 25% cefalomanin og noen andre taksaner.

Den urene paklitakselen kan bearbeides i henhold til en av tre alternative prosedyrer. I en første mulighet ble det løst i aceton og renset gjennom reversfase kolonnekromatografi. Kolonnen ble pakket med polymerharts (Diaion resin, HP2MG) og utdrevet med acetonitril:vann (45,55). Paklitaksel ble erholdt som hvit krystall med en renhet større enn 99%. Cefalomanin ble erholdt som et hvitt pulver med en renhet større enn 98%.

Alternativt, som en andre prosessmetode ble rensingen av paklitaksel og cefalomanin utført gjennom en kjemisk reak-sjonsprosess og deretter renset med bundet kiselsyregele i reversfase kolonnekromatografi. Den råe paklitaksel, cefalomaninblandingen ble løst i CH2C12eller CHC13(1:10 w/v), og reagert med 10 ekvivalenter brom i en rund flaske som ble plassert i et isbad (mellom 0 °C og 5 °C) under ca. 40 minutter. Den resulterende blandingen av paklitaksel og 2 " ,3 1'-bromcefalomanin ble lett separert gjennom en reversfase kromatografkolonne (C18eller fenyl) med utdrivningsløsningsmiddelet CH3CN:H20 (45:55). Paklitaksel ble erholdt som en hvit krystall med en renhetsgrad større enn 99%.

2 '',3 " -bromcefalomanin ble erholdt som en blanding av di-astereomerer som ble reagert med aktivert sink i eddiksyre ved romtemperatur og deretter renset ved hjelp av flash- kolonnekromatografi for å erholde ren cefalomanin med en renhet større enn 95%.

I et tredje alternativ ble paklitaksel og bromcefalomanin renset gjennom en normal fase kiselsyregelekolonne. Utdrivningsløsningssystemet kan inneholde heksan:EtOA,. (start 6:4 ved slutten 4:6) eller CH2Cl2:Me2CO (start 8:2 ved slutten 65:35) eller CHCl2:EtOAc(start 75:25, og ved slutten 6:4). Fra denne metoden ble paklitaksel erholdt som hvit krystall med en renhet som var større enn 99% med cefalomanin. nærværende i en mengde som var mindre enn 0,2%.

Vi har nå diskutert oppfinnelsen og mer presis for-klaring vil nå gjøres av oppfinnelsen ved hjelp av eksemplene.

Eksempel 1

Ca. 200 kg tørkede nåler og kvister av Taxus canadensis ble ekstrahert med 1000 1 metanol ved 60 °C i en industriell multifunksjonell ekstraktor under 5 timer og deretter filtrert. De råe materialene ble ekstrahert med 700 1 metanol ved en temperatur av mellom 55 °C og 60 °C under ytterligere 4 timer og filtrert. Filtratet ble kombinert og blandet med 10 kg av aktivert karbon (5 vekt%) og blandingen ble holdt ved romtemperatur under 1 time og deretter filtrert for fjerning av det aktiverte karbonet. Filtratet ble deretter konsentrert til ca. 100 1 under vakuum hvoretter 300 1 vann:diklormetan (1:1) ble tilsatt. Det organiske sjiktet ble ivaretatt og vannløsningen ble ekstrahert to ganger til med 2 00 1 diklormetan. Diklormetanløsningen ble kombinert og inndunstet under vakuum til det ble et slam og deretter fortynnet med 20 liter aceton.

Acetonløsningen ble belagt på 20 kg av Celite 545. Det belagte materialet ble lufttørket og deretter ladet på toppen av tre industrielle lavtrykkskromatografiske kolonner (dimen-sjon 150 x 15 cm) . Hver kolonne ble pakket .med 15 kg aluminiumoksid (Al203) som absorpsjonsmiddel. Det bør forstås at den eksakte dimensjonen av kolonnene ikke er kritisk så lenge som kolonnene er tilstrekkelig store for å holde den mengden av Al203som behøves for preparasjonen. Bruk av aluminiumoksid er effektiv for å absorbere flavonoider og lignaner som er samekstraherte fra kildematerialet. Disse er også vanskelige å fjerne og blir et problem for den endelige renheten av produktet paklitaksel.

Kolonnene ble utdrevet med løsningsmiddelsystemet heksan:aceton (start 100:0 ved slutten 45:55) under et trykk av mellom 10 og 15 psi med en hastighet av ca. 150 ml/min.

De fraksjoner som inneholdt taksaner ble oppsamlet og kombinert i henhold til tynnsjiktskromatografi (TLC) resultat og de ble deretter konsentrert under vakuum for fjerning av alle løsningsmidlene. Det resulterende materialet ble løst i metanol og holdt ved romtemperatur over natten hvilket ga nållignende krystaller. Krystallene ble filtrert og rekrystallisert fra aceton og ga ytterligere hvite nållignende krystaller som ble identifisert som 13-acetyl-9dihydrobakka-tin III, med en renhet som var større enn 96% i et utbytte av 149 g hvilket var 0,074% basert på råmaterialet.

Moderluten fra 13-acetyl-9dihydrobakkatin III krystal-liseringen ble konsentrert til tørrhet under vakuum. Resten ble løst i 3 liter aceton. Acetonløsningen ble blandet med 1,5 kg polystyrendivinylbenzen, som er et kopolymerharts. Blandingen ble inndunstet for fjerning av løsningsmiddel og det resulterende pulveret ble ladet på toppen av en industriell lavtrykkskromatografisk kolonne pakket med poly-~styren-divinylbenzenkopolymerharts og utdrevet med 45% aceton i vann med en hastighet av 150 ml/min under et trykk som var lavere enn 30 psi. Fraksjoner på 2 liter av hver og en ble oppsamlet og disse ble undersøkt med TLC og HPLC.

De fraksjoner som inneholdt paklitaksel og cefalomanin ble kombinert og inndunstet under vakuum for fjerning av det meste av acetonet og deretter utspedd med avionisert vann og ekstrahert tre ganger med 2,5 liter diklormetan. Det organiske sjiktet ble konsentrert til tørrhet under vakuum og resten ble løst i 1 liter metanol.

Ca. 3 0 vekt% vann ble tilsatt til metanolløsningen og blandingen ble oppvarmet til 60 °C under noen minutter og deretter holdt ved romtemperatur over natten. Det råe krystalline produktet fra metanolløsningen ble filtrert ut og tørket i en vakuumovn ved en temperatur mellom 70 og 75 °C. Det faste produktet bestod av ca. 70% paklitaksel og 25% cefalomanin og utbyttet var 31 g.

Den urene paklitakselen (30 g) ble løst i 200 ml acetonitril og fortynnet med 250 ml avionisert vann og pumpet inn på toppen av en lavtrykkskromatografikolonne (størrelse: 10x150 cm) og pakket med et polymert karts (Diaion, makro-porøst polymetakrylatharts). Etter at produktet hadde blitt pumpet inn ble kolonnen utdrevet med en trinnvis gradient av 35, 40, 45 og 50% acetonitril i vann. Forandringen av løs-ningsmiddelet ble indikert gjennom resultatene av TLC og HPLC av fraksjonene.

Fraksjoner av ca. 1 liter per hver og en ble oppsamlet og undersøkt gjennom TLC og HPLC analyser. Strømningsnastig-heten var 75 ml per minutt. Kolonnefraksjonene som inneholdt paklitaksel eller cefalomanin ble kombinert individuelt. De to kombinerte løsningene fikk stå ved en temperatur av ca. 5 °C til krystallisering av den individuelle forbindelsen hadde blitt ferdig.

Krystallene ble filtrert separat og begge ble krystal-lisert fra 65 °C metanol i vann.

Paklitaksel ble erholdt som hvite nållignende krystaller med en renhet som var større enn 99% og i et utbytte av 18,5 g (0,009%).

Cefalomanin ble erholdt som hvite nåler med en renhet som var større enn 98% og i et utbytte av 6,5 g (0,003%).

De fraksjoner som inneholdt bakkatin III og 10-deacetylbakkatin III fra det tidligere trinnet ble kombinert og inndunstet under vakuum for fjerning av i hovedsak aceton og deretter delt mellom 3 liter av vann og diklormetan (1:1).

Det organiske sjiktet ble konsentrert til tørrhet og

resten ble underkastet normalfasekromatografi. Dimensjonen på kolonnen som ble brukt var 4'<1>x 4 •, pakket med kiselsyregele (200-300 mesh). Det utdrivende løsningsmiddelet var en trinnvis gradient av heksan:etylacetat (start 50:50 ved. slutten

35:65). Fraksjoner på ca. 1000 ml av hver og en ble oppsamlet og de ble undersøkt gjennom TLC.

De fraksjoner som inneholdt bakkatin III eller 10-deacetylbakkatin III ble oppsamlet separat og kombinert i henhold til TLC resultater og deretter konsentrert til tørr-het .

Bakkatin III delen ble rørt i 200 ml metanol og holdt i et kjøleskap over natten. De hvite krystallene som ble dannet ble filtrert ut og rekrystallisert fra metanol hvilket ga bakkatin III som hvite krystaller i et utbytte av 7,5 g (0,003%).

Det råe 10-deacetylbakkatin III ble løst i 150 ml aceton og deretter fortynnet med 150 ml heksan. Blandingen fikk stå ved romtemperatur over natten. De hvite krystallene som ble dannet ble filtrert og rekrystallisert fra samme løsnings-middel hvilket ga 10-deacetylbakkatin III som hvite krystaller. Utbyttet var 15 g (0,007%).

Eksempel 2

Samme apparat og metode som de i eksempel 1 ble brukt og rå paklitaksel ble erholdt. Den råe paklitakselen ble løst i 300 ml diklormetan som ble tilsatt til en 1000 ml rund tre-halset flaske. Flasken ble plassert i et isbad og løsningen ble omrørt med en magnetisk omrører. Da temperaturen hadde kommet ned til ca. 5 °C tilsattes sakte en løsning av brom (10 ekvivalenter) i diklormetan (1:1) under omrøring. For-holdet mellom cefalomanin og brom var 1:10 moler.

Bromeringen ble undersøkt ved hjelp av TLC analyse mellom 5 og 10 minutter. Reaksjonsblåndingen ble deretter fortynnet med 300 ml diklormetan og overført til en separa-sjons trakt etter at reaksjonen var fullført (tiden for full-førelsen av reaksjonen var mellom 40 og 50 minutter). 350 ml av en 10%-ig vannløsning av natriumtiosulfat (Na3Sa03) ble tilsatt til reaksjonsblåndingen for absorbering av eventuelt overskudd av brom. Diklormetansjiktet ble separert og vasket med vann og saltløsning' og deretter konsentrert til tørrhet under vakuum. Et lysebrunt pulver ble erholdt.

Eksempel 3

Det råe materialet (10 g fra eksempel 2) ble løst i 120 ml acetonitril som ble fortynnet med 150 ml avionisert vann. Løsningen ble pumpet inn på toppen av en reversfase kromato- grafikolonne (5 x 100 cm) som var pakket med C1Bbundet kiselsyregele.

Kolonnen ble utdrevet med acetonitril:vann (45:55) under et trykk av mellom 30 og 40 psi. Strømningshastigheten var 30 ml per minutt. Fraksjonene ble oppsamlet (250 ml hver og en) og undersøkt gjennom TLC og kombinert.

Den del som inneholdt paklitaksel fikk stå i kjøleskap over natten; de krystaller som ble dannet ble filtrert og rekrystallisert fra 70% metanol. Paklitaksel ble erholdt som hvite nållignende krystaller med en renhet som var større enn 99% i et utbytte av 6:1 g.

De fraksjoner som inneholdt 2 ", 3 "-bromcef alomanin ble kombinert og oppdelt mellom vann og diklormetan. Det organiske sjiktet ble oppsamlet og inndunstet til tørrhet under vakuum. Resten ble løst i 150 ml metanol som ble fortynnet med 50 ml vann hvilket ga nållignende krystaller. De nesten hvite krystallene ble rekrystallisert fra metanol:vann hvilket ga 2 1' , 3 " -bromcefalomanin som hvite krystaller. 2 g av 2 13 " -bromcef alomanin ble løst i 30 ml AcOH og nylig aktivert sink (2 g) ble tilsatt. Blandingen ble omrørt under 3 timer ved romtemperatur og reaksjonen ble styrt av TLC. Etter at TLC analysen viste at reaksjonen var ferdig ble blandingen oppdelt mellom diklormetan og 10% NaHC03(300 ml, 2:1). Det organiske sjiktet ble vasket med vann og konsentrert til tørrhet. Det råe produktet ble renset ved hjelp av flash kromatografi hvilket ga cefolamanin som et hvitt pulver.

Eksempel 4

Det råe materialet (10 g fra eksempel 2) ble løst i 120 ml diklormetan. Det organiske sjiktet ble konsentrert til tørrhet og resten ble underkastet normal fase kromatografi. Dimensjonen på kolonnen som ble brukt var 4"x4' som var pakket med kiselsyregele (mellom 200 og 300 mesh). Det utdrivende løsningsmiddelet var en trinnvis gradient av diklormetan:etylacetat (ved starten 75:25 og ved slutten 6:4). For separeringen av paklitaksel og 2 '1,3 "-bromcefalomanin kan løsningsmiddelsystemene heksan:etylacetat (i begynnelsen 6:4 ved slutten 4:6) og diklormetan:aceton (ved begynnelsen 8:2 og ved slutten 65:35) også anvendes. Fraksjoner av ca. 500 ml hver og en ble oppsamlet og de ble hver og en undersøkt gjennom TLC.

De fraksjoner som inneholdt paklitaksel og 2<I>,,3,,-bromcefalomanin ble oppsamlet separat og kombinert i henhold til TLC resultatene og deretter konsentrert til tørrhet.

Paklitakseldelen ble løst i 100 ml metanol og fortynnet med 35 ml vann og deretter holdt ved lav temperatur. De hvite krystallene som ble dannet ble filtrert og rekrystallisert fra metanol:vann hvilket ga paklitaksel (5,5 g) som hvite krystaller.

Den råe 2 " , 3 "-bromcef alomaninen ble løst i 50 ml aceton og deretter fortynnet med 50 ml heksan. Blandingen fikk stå ved romtemperatur over natten. De hvite krystallene som ble dannet ble filtrert og rekrystallisert fra samme løsningsmiddel hvilket ga 2 11,3 " -bromcef alomanin som hvite krystaller.

Følgende eksempler illustrerer forbindelsene i struktur-form.

Claims

1. Metode for isolering og rensing av taksananaloger fra en kilde inneholdende taksaner omfattende: ekstrahering av en kilde for taksaner i et organisk ekstraherende middel; belegging av et arbeidsabsorberende medium med det ekstraherende middelet og ladning av mediet i en kolonne, hvilken kolonne inneholder et absorberende middel; utdrivning i et første trinn med en organisk løsnings-middelblandning ved et trykk mellom 10 og 20 psi for å frembringe fraksjoner inneholdende taksanforbindelser; krystallisering av fraksjonene for å frembringe en fast taksanforbindelse og en moderlut; konsentrering av moderluten og utdrivning i et andre trinn med en polar løsningsmiddelblanding av moderluten gjennom et polymerharts for å frembringe minst en andre taksanforbindelse.

2. Metode ifølge krav 1, inkluderende ytterligere trinnet å fjerne lignan og flavonoid forurensninger i det første trinnet.

3. Metode ifølge krav 1 i hvilken kilden for taksanene omfatter en plantekilde.

4. Metode ifølge krav 3 i hvilken plantekilden er valgt fra gruppen omfattende Taxus brevifolia, Taxus baccata, Taxus walichiana, Taxus yunnanensis og Taxus canadensis.

5. Metode ifølge krav 3 i hvilken taksanene inkluderer minst 13-acetyl-9-dihydrobakkatin III, 10 deacetylbakkatin III, bakkatin III, cefalomanin, paklitaksel.

6. Metode ifølge krav 1 i hvilken det organiske ekstrak-sjonsmiddelet omfatter diklormetan.

7. Metode ifølge krav 1 i hvilken det svake absorberende mediet omfatter Celite 545.

8. Metode ifølge krav 1 i hvilken det absorberende middelet omfatter aluminiumoksid.

9. Metode ifølge krav 1 i hvilken den organiske løsnings-middelblåndingen i det første steget omfatter heksan og aceton.

10. Metode for isolering og rensing av taksaner fra en kilde inneholdende taksaner omfattende: frembringelse av en kilde for taksaner; ekstrahering av taksanene fra kilden i et organisk ekstraksjonsmedium for å frembringe et organisk sjikt inneholdende taksanforbindelser; behandling av et underlagsmateriale med det organiske sj iktet; frembringelse av en lavtrykkskolonne inneholdende et absorberende middel; utdrivning i et første trinn av et organisk løsnings-middel gjennom kolonnen for utdrivning av rensede taksanfraksjoner; krystallisering av taksanfraksjonene for frembringelse av en første taksananalog og en moderlut; utdrivning i et andre trinn av moderluten gjennom et polymerharts i en kromatografisk kolonne for rensing og utdrivelse av minst en andre taksananalog og en tredje taksananalog; og oppsamling av separerte taksananaloger.

11. Metode ifølge krav 10 ytterligere inkluderende trinnet å fjerne lignan og flavonoid forurensninger i det første trinnet.

12. Metode ifølge krav 10 ytterligere inkluderende trinnet å male taksankilden og ekstrahere med metanol.

13. Metode ifølge krav 13 ytterligere inkluderende trinnet å blande ekstrakt med trekull, filtrere og inndunste for å danne et konsentrat.

14. Metode ifølge krav 13 i hvilken underlagsmaterialet omfatter Celite 545.

15. Metode ifølge krav 1 i hvilken det organiske løsnings-middelet omfatter en blanding av aceton og heksan.

16. Metode ifølge krav 15 i hvilken det organiske løsnings-middelet får gå gjennom kolonnen ved et trykk av mellom 10 og 20 psi.

17. Metode ifølge krav 1 ytterligere inkluderende trinnet å oppsamle og analysere taksanfraksjonene gjennom tynnsjiktskromatografi.

18. Metode for isolering og rensing av taksaner fra en kilde inneholdende taksaner, omfattende: frembringelse av en kilde for taksaner; ekstrahering av taksanene fra kilden i et organisk ekstraksjonsmedium for å frembringe et organisk sjikt inneholdende taksanforbindelser; behandling av et underlagsmateriale med det organiske sjiktet; frembringelse av en lavtrykkskolonne inneholdende et absorberende middel; utdrivning i et første trinn ved et trykk av mellom 10 og 20 psi av et organisk løsningsmiddel gjennom kolonnen for å utdrive rensede taksanfraksjoner og fjerne flavonoid og lignan forurensninger; krystallisering av taksanfraksjoner for å frembringe en første taksananalog og en moderlut; utdrivning i et andre trinn ved et trykk av 30 psi av moderluten gjennom et polystyren DVB harts i en kromatografisk kolonne for rensing og utdrivning av minst en andre taksananalog og en tredje taksananalog; utdrivning i et tredje steg av den andre taksananalogen og den tredje taksananalogen gjennom en normal fase kiselsyregelekolonne for å rense den andre taksananalogen og den tredje taksananalogen; og oppsamling av de separerte taksananalogene.

19. Metode ifølge krav 18 i hvilken den andre taksananalogen omfatter bakkatin III og den tredje taksananalogen omfatter 10-deacetylbakkatin III.

20. Metode ifølge krav 18 i hvilken analogene har en renhet av minst 98%.