KR20070045219A - 파클리탁셀과 세팔로마닌의 분리 방법 - Google Patents

파클리탁셀과 세팔로마닌의 분리 방법 Download PDF

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KR20070045219A
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마틴 부크타
라디슬라브 크바크
로만 소보티크
파벨 스트베르카
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아이박스 파마슈티컬스 에스.알.오.
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07D305/00—Heterocyclic compounds containing four-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atoms
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Abstract

파클리탁셀은 이동상으로서 메틸 이소부틸 케톤과 보다 낮은 극성의 다른 용매를 포함하는 용매 혼합물을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 세팔로마닌을 함유하는 혼합물로부터 분리될 수 있다. 보다 낮은 극성의 용매는 (C5-C8) 지방족 탄화수소, (C6-C8) 방향족 탄화수소, (C1-C4) 디알킬 에테르 또는 그들의 혼합물일 수 있다.

Description

파클리탁셀과 세팔로마닌의 분리 방법{PROCESS FOR THE SEPARATION OF PACLITAXEL AND CEPHALOMANNIN}
본 발명은 파클리탁셀(paclitaxel)을 그의 천연 유사물인 세팔로마닌(cephalomannin)으로부터 분리하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 실리카 겔 크로마토그래피에 의한 세팔로마닌으로부터의 파클리탁셀 분리에 관한 것이다.
“탁솔(taxol)”로 알려져 있는, 파클리탁셀은 인간의 자궁암, 유방암 및 폐암의 치료에 유용한 중요한 화학요법제이다. 탁솔은 다수의 인간의 암에 대한 가능성을 보여 왔고, 그의 의학적 용도는 문헌[Rowinsky,E.K., Ann.Rev.Med. 48:353(1997)]; 문헌[Van Hoff,D.D., Semin.Oncol. 24:3(1997)]; 문헌[DeFuria, M.D., Phytomedicine 4:273(1997)]; 및 문헌[Eisenhauer,E.A., Vermorken,J.B., Drugs 55:5(1998)]과 같은 여러 리뷰 논문에서 보고되어 왔다.
파클리탁셀은 천연 화합물이고 태평양 주목(Taxus Brevifolia)의 수피로부터 Wani,et al.에 의하여 처음으로 분리되었다(문헌[J.Am.Chem.Soc. 93:2325(1971)]). 그 후로, 연구원들은 유럽 주목(Taxus baccata), 히말라야 주목(Taxus Wallichiana), 중국 주목(Taxus celebita), 일본 주목(Taxus cuspidata), 캐나다 주목(Taxus canadensis), 멕시코 주목(Taxus globosa), 플로리다 주목(Taxus floridana) 및 관상용 주목(Taxus media) 및 그들의 잡종과 재배종 모두를 포함하여, 탁수스 속(Taxus genus)의 다른 모든 종에도 파클리탁셀이 존재한다는 것을 인식하게 되었다.
식물원으로부터 파클리탁셀의 분리는 복잡하고 어려운데, 부분적으로는 매우 낮은 바이오매스(biomass) 농도 때문이고, 부분적으로는 파클리탁셀과 유사한 구조와 특성을 가진 다른 탁산(taxanes)의 존재 때문이다. 탁산 중, 세팔로마닌은 파클리탁셀로부터 분리하는 것이 특히 어렵다. 세팔로마닌은 파클리탁셀을 함유하는 모든 알려진 원료에 실제로 존재하고 파클리탁셀/세팔로마닌의 비율이 탁수스 식물(Taxus plant)의 유형에 따라서 약 1:10 에서 높게는 약 1:1까지 농도가 변화한다.
다른 탁산 불순물들은 결정화(crystallization)를 통해 파클리탁셀로부터 분리될 수 있지만, 세팔로마닌은 파클리탁셀과 함께 결정화되는 경향이 있다. 세팔로마닌과 파클리탁셀은 구조에 있어서 단 한 측쇄 그룹만이 다르다. 그들의 구조는 비교를 위하여 이하에 명시한다.
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이러한 화합물들의 분리에 사용되는 한 가지 방법은 그들의 화학적 반응성에 있어서의 차이점을 이용하여 더 반응성이 큰 세팔로마닌 유도체를 형성하는 것이다. 예를 들어, 세팔로마닌에서 뻗어 나간 올레핀 그룹은 파클리탁셀의 어느 부분보다 더 쉽게 산화되거나 또는 브롬화되어 파클리탁셀로부터 보다 분리하기 쉬운 세팔로마닌 유도체를 형성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어 문헌[Kingston,D.G.I., et al., J.Nat.Prod. 55:259(1992)]; 문헌[Beckvermit,J.T., et al., J.Org.Chem. 61:9038(1996)]; 미국특허 제5,654,448호 참조.
파클리탁셀로부터 세팔로마닌을 분리하는 또 다른 접근은 다양한 종류의 크로마토그래피를 필요로 한다. 많은 예를 문헌에서 찾아볼 수 있는데, 예를 들어, 문헌[Dauh-Rurng Wu, et al.,J.Chrom.A, 702:233(1995)]; 문헌[Koppaka V.Rao, et al., Pharm.Res. 12:1003(1995)]; 및 문헌[Xuefeng Yang, et al., J.Chrom.A, 813:201(1998)]을 포함한다. 역상 크로마토그래피 또한 미국특허 제5,279,949호; 미국특허 제5,380,916호; 및 미국특허 제5,969,165호와 같은 일부 특허에서 파클리탁셀의 마지막 정제로서 기술되고 있다. 시뮬레이티드 무빙-베드(simulated moving-bed) 역상 크로마토그래피 공정에 기초한 연속 공정도 개발되고 있다(문헌[Dauh-Rurng Wu, et al., J.Chrom.A, 855:71(1999)]). 그러나, 역상 크로마토그래피 사용시의 단점은 물을 함유하는 용매를 필요로 한다는 것인데, 이는 불리하게도 파클리탁셀의 원치 않는 7-에피-파클리탁셀로의 이성질체화를 야기할 수 있다.
파클리탁셀의 정제에 사용되는 추가적인 방법들은 복잡한 기울기 용출(gradient elution) 공정에 기초하거나 또는 다른 이동상 조성물을 이용한 여러 연속 크로마토그래피 공정들에 기초한 것이다(문헌[Young Kwang Park, et al., J.Liq.Chrom. & Rel.Technol. 22(18):2755(1999)]). 또 다른 접근은 흡착제로서 알루미나를 사용하는 순상 크로마토그래피를 사용하는 것이다. 공교롭게도, 염소화 유기 용매들이 알루미나와 함께 이동상으로서 자주 사용된다. 또한, 용출 시간에 따라서 이러한 시스템에서는 파클리탁셀의 에피머화 및 화학 분해 두 가지 모두가 일어난다(문헌[Zhiqiang Z., Zhiguo S.J., Liq.Chrom. & Rel.Technol. 23(17): 2683(2000)]).
최근, 유기 에스테르를 사용하여 실리카에서 파클리탁셀의 크로마토그래피 정제가 미국특허 제6,333,419호에서 기술되었다. 상기 특허에 기재된 방법은 세팔 로마닌으로부터 파클리탁셀을 분리하기 위해 고안된 것이다.
파클리탁셀과 세팔로마닌의 분리를 위한 효과적이고 간단한 방법이 여전히 계속해서 요구된다.
[발명의 요약]
본 발명의 이점은, 세팔로마닌으로부터 파클리탁셀을 분리하는 간단하고 저렴하고 효과적인 방법이라는 것이다.
이러한 이점과 다른 이점들이, 적어도 부분적으로는, 실리카 겔 크로마토그래피를 사용하여 세팔로마닌으로부터 파클리탁셀을 분리하는 방법에 의하여 만족된다. 상기 방법은 유리하게도 파클리탁셀의 대규모 정제에 적용될 수 있다.
본 발명의 구체예는 세팔로마닌과 파클리탁셀 혼합물을 실리카를 포함하는 용기, 예를 들면 컬럼에 공급하는 단계, 그 후 용기에 메틸 이소부틸 케톤과 보다 낮은 극성의 용매를 포함하는 용매 혼합물을 공급하는 단계를 포함한다. 용매 혼합물은 용기에 첨가되어, 용매 혼합물 및 적어도 파클리탁셀과 세팔로마닌이 용기로부터 분리되어 용출될 수 있도록 해준다. 파클리탁셀을 함유하는 용출 용매 혼합물의 하나 이상의 분획은 그 후 수집된다. 필요하다면, 세팔로마닌을 함유하는 분획 역시 별도로 수집될 수 있다. 순수한 파클리탁셀은 그 후 필요하다면, 용매 혼합물의 증발과 잔류물의 결정화를 통하여 파클리탁셀 최고농도를 함유하는 적정 분획으로부터 분리될 수 있다.
이하의 상세한 설명으로부터 본 발명의 또 다른 이점은 당업자에게 쉽게 명백해 질 것이고, 본 명세서에서는 단지 본 발명의 바람직한 구체예만이 본 발명의 실행에 고려된 최상의 모드를 설명하는 방법으로 도시 및 기재되었다. 인식하게 되겠지만, 본 발명은 다른 구체예가 가능하고, 그의 여러 세목들은 본 발명에서 완전히 벗어나지 않는다면 다양한 관점에서 변형가능하다. 본 발명은 이러한 일부 또는 모든 구체적인 세목 없이 실시될 수 있다. 다른 예로, 본 발명이 불필요하게 불명확해지는 것을 막기 위해, 잘 알려진 방법 시행은 상세하게 설명하지 않았다. 따라서, 도면과 상세한 설명은 사실상 설명을 위한 것이지, 한정을 위한 것이 아니라고 생각되어야 한다.
[도면의 간단한 설명]
자료는 하기와 같은 첨부 도면으로 작성하였다:
도 1은 HPLC 분석으로 측정된, 실시예 1,3, 및 4에 사용된 출발 물질의 조성을 나타내고, 여기서 가로 좌표는 용출 시간을 분으로 나타낸 것이고, 세로 좌표는 흡광도 단위를 나타낸다.
도 2는 HPLC 분석으로 측정된, 실시예 1의 주 분획의 조성을 나타내고, 여기서 가로 좌표는 용출 시간을 분으로 나타낸 것이고, 세로 좌표는 흡광도 단위를 나타낸다.
도 3은 HPLC 분석으로 측정된, 실시예 1의 최종 결정 생성물의 조성을 나타내고, 여기서 가로 좌표는 용출 시간을 분으로 나타낸 것이고, 세로 좌표는 흡광도 단위를 나타낸다.
도 4는 HPLC 분석으로 측정된, 실시예 2에 사용된 출발 물질의 조성을 나타내고, 여기서 가로 좌표는 용출 시간을 분으로 나타낸 것이고, 세로 좌표는 흡광도 단위를 나타낸다.
도 5는 HPLC 분석으로 측정된, 실시예 2의 최종 결정 생성물의 조성을 나타내고, 여기서 가로 좌표는 용출 시간을 분으로 나타낸 것이고, 세로 좌표는 흡광도 단위를 나타낸다.
도 6은 HPLC 분석으로 측정된, 실시예 3의 주 분획의 조성을 나타내고, 여기서 가로 좌표는 용출 시간을 분으로 나타낸 것이고, 세로 좌표는 흡광도 단위를 나타낸다.
도 7은 HPLC 분석으로 측정된, 실시예 4의 주 분획의 조성을 나타내고, 여기서 가로 좌표는 용출 시간을 분으로 나타낸 것이고, 세로 좌표는 흡광도 단위를 나타낸다.
본 발명은 이동상으로서 메틸 이소부틸 케톤과 보다 낮은 극성의 다른 용매를 포함하는 용매 혼합물을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피를 통해 세팔로마닌으로부터 파클리탁셀이 효과적으로 분리될 수 있다는 발견에서 비롯되었다. 상기 과정은 고순도의 파클리탁셀, 예를 들어, 약 0.5% 이하의 세팔로마닌을 함유하는 고순도의 파클리탁셀 생성물을 생산할 수 있는 간단하고 저렴하고 효과적인 방법을 제공하며, 이는 산업적 규모의 생산에도 적용할 수 있다.
본 명세서에서 참조된 특허, 공개 출원, 및 과학적 문헌들은 당업자의 지식을 수립하고 마치 각각이 구체적이고 개별적으로 고문헌으로 통합되어 있음을 나타내는 것과 같을 정도로 그 전체가 고문헌으로 통합된다. 본 명세서에서 인용된 고문헌과 본 명세서의 구체적인 제시 사이의 상충은 후자에 따라 결정되어야 할 것이다. 마찬가지로, 당업자-수준의 단어 또는 어구 정의와 본 명세서에서 구체적으로 제시한 단어 또는 어구 정의 사이의 상충은 후자에 따라 결정되어야 할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 그 문맥이 명확히 다르게 지칭하지 않는 한, 단수형 및 특히“상기”는 그들이 지칭하는 용어의 복수형 역시 포함한다.
“약”이란 용어는 대략, 근처의, 대충, 또는 근방을 의미하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.“약”이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 때에는, 그것은 규정된 수치의 상한 및 하한을 확장시켜 그 범위를 변경시킨다. 일반적으로,“약”이란 용어는 언급된 수치를 20%의 변동률로 위 아래로 변경시키는 것으로 본 명세서에서 사용되었다.
청구항의 본문 또는 연결구 모두, 본 명세서에서 사용된 바와 같이“포함한다”와“포함하는”이란 용어는 개방된(open-ended) 의미를 가진 것으로 해석되어야 한다. 즉, 이러한 용어들은 “적어도 가진” 또는 “적어도 포함하는”의 어구와 동의어로 해석되어야 한다. 공정의 문맥에서 사용될 때,“포함하는”이란 용어는 적어도 상술된 단계를 포함하는 공정을 의미하지만, 추가적인 단계를 포함할 수 있다. 화합물이나 조성물의 문맥에서 사용될 때는,“포함하는”이란 용어는 적어도 상술된 특징이나 성분을 포함하는 화합물 또는 조성물을 의미하지만, 추가적인 특징이나 성분을 역시 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 변수에 있어서 수치 범위의 상술은 본 발명이 그 범위 내의 수치와 동일한 변수로 실시될 수 있음을 나타내기 위한 것이다. 따라서, 본래 이산변수의 경우, 변수는 그 범위의 양쪽 종점을 포함하는 수치 범위 내의 어떠한 정수와 같을 수 있다. 유사하게, 본래 연속변수의 경우, 변수는 그 범위의 양쪽 종점을 포함하는 수치 범위 내의 어떠한 실수와 같을 수 있다. 예를 들어, 0 내지 2 사이의 값을 가지고 있다고 기재된 변수는, 본래 이산변수인 경우 0, 1, 또는 2가 될 수 있고, 본래 연속변수인 경우 0.0, 0.1, 0.01, 0.001, 또는 기타 실수가 될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 구체적으로 다른 것을 지칭하지 않는 한,“또는”이란 용어는 “어느 한쪽의/또는”의 “배타적” 의미가 아니라 “및/또는”의 “포괄적”의미로 사용된다.
이하, 본 발명의 특정 구체예에 대하여 상세하게 언급한다. 본 발명이 이러한 특정 구체예과 함께 기술되는 때에, 그러한 특정 구체예로 본 발명을 한정하고자 한 것이 아니라고 이해되어야 한다. 반대로, 첨부의 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 개념과 범위 내에 포함될 수 있는 한, 대안, 변형, 및 등가물을 포괄하고자 한 것이다. 이하의 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해서 다수의 구체적인 세목들이 규정된다. 본 발명은 일부 또는 모든 이러한 구체적인 세목 없이 실시될 수 있다. 다른 예로, 본 발명이 불필요하게 불명확해 지는 것을 막기 위해, 잘 알려진 방법 시행은 상세하게 설명하지 않았다.
당업자에게 알려진 어떤 적절한 물질 및/또는 방법도 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 그러나, 바람직한 물질과 방법이 기재되어 있다. 아래의 설명과 실시예에서 언급된 물질, 시약 등은, 다른 언급이 없는 한 상업적인 출처로부터 얻을 수 있다.
실험과 조사 후에, 메틸 이소부틸 케톤이 박층 크로마토그래피의 이동상으로 사용되었을 때에, 파클리탁셀과 세팔로마닌의 만족스런 분리가 이루어진다는 것이 발견되었다. 그러나, 케톤 그 자체는 컬럼 크로마토그래피에서 대량의 파클리탁셀 혼합물을 분리하기 위한 이동상으로 사용되기에는 지나치게 극성이다는 것을 알게 되었다. 그 후 하나 이상의 보다 낮은 극성의 용매의 첨가에 의해 컬럼 크로마토그래피의 이동상의 극성은 감소되었다. 보다 낮은 극성으로서 본 발명의 실시에 적합한 것으로 생각되는 용매는 지방족 탄화수소; 방향족 탄화수소; 디알킬 에테르; 또는 그들의 혼합물을 포함한다.
본 발명에 따른 파클리탁셀과 세팔로마닌을 분리하는 크로마토그래피 공정은 비교적 간단하다. 그것은 순상 실리카 겔을 사용하고 고압 장치가 불필요하다. 그럼에도 불구하고 그러한 장치가 당업계에서 알려진 대로 사용될 수는 있다. 그러나, 단순한 컬럼을 가지고, 심지어 출발물질 각 1부에 대해 실리카 겔 단 20 질량부만이 사용될 때조차도 충분한 분리가 이루어질 수 있다. 출발 물질의 구성과 최종 분리된 파클리탁셀의 원하는 순도에 따라서 더 큰 비율의 실리카 겔이 사용될 수 있다. 어떠한 실리카도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 실리카, 또는 실리카 겔은 다양한 상업적 출처로부터 다량 얻을 수 있고, 약 25 내지 약 200㎛ 범위의 다양한 입자 크기일 수 있다.
본 발명의 일면의 실시에서, 출발 파클리탁셀 혼합물, 즉, 파클리탁셀과 세팔로마닌을 포함하는 혼합물이 실리카가 충진된 용기, 예를 들어 컬럼에 공급된다. 출발 파클리탁셀 혼합물은 파클리탁셀을 함유하는 식물, 예를 들어 탁수스 식물의 신선한 또는 건조된 수피, 뿌리, 잎 및/또는 가지의 추출물 또는 전체 식물과 같은 일반적인 원료로부터 얻을 수 있다. 재배된 탁수스 식물의 세포 배양으로부터 얻어진 비정제 또는 정제 추출물, 탁산 생성 곰팡이를 배양하여 제조된 발효 용액; 파클리탁셀을 생성하도록 유전적으로 변형된 균주를 배양하여 제조된 발효 용액 등을 포함하는, 파클리탁셀의 다른 원료들도 본 발명의 실시에 사용되는 것을 역시 생각해 볼 수 있다.
만약 출발 파클리탁셀 혼합물이 세팔로마닌과 함께 상당량의 성분들을 함유하고 있는 경우에는, 본 발명에 따른 실리카 겔 크로마토그래피에 혼합물을 공급하기에 앞서 불순물의 양을 줄이기 위해서 당업계에서 알려진 대로 혼합물이 정제될 수 있다. 출발 파클리탁셀 혼합물이 당업계에서 알려진 정제 과정, 예를 들어, 크로마토그래피, 결정화 등에 의해 얻어진 파클리탁셀의 일부 정제된 추출물이 되는 것이 바람직하나, 여기서 기술된 방법에 한정되는 것은 아니다.
출발 파클리탁셀 혼합물을 용기에 공급할 때, 분리에 사용되는 용매 혼합물을 포함하는 용매로 1차 희석될 수 있다. 세팔로마닌으로부터 파클리탁셀을 분리하는데 사용될 수 있는 적절한 용매 혼합물은 메틸 이소부틸 케톤과 보다 낮은 극성의 용매를 포함한다. 본 발명의 실시에서, 출발 파클리탁셀 혼합물은, 희석된 것이든 또는 농축된 것이든 간에, 용기에 공급되고 용매 혼합물 역시 용기에 공급되어서, 용기 내의 실리카를 통하여 이동하면서 파클리탁셀과 세팔로마닌 그리고 만약 존재한다면 다른 성분들까지도 각 성분들로 구획화되고 분리되게 된다. 세팔로마닌이 실질적으로 없는 고순도 파클리탁셀은 그 후 용출 용매와 함께 수집되게 된다. 또한, 세팔로마닌 역시 별도로 수집될 수 있다.
본 발명의 구체예에서, 바람직하게는 생성물이 증발에 의해 크로마토그래피 분획으로부터 회수되기 때문에, 이동상으로 사용되는 용매의 끓는점은 약 130℃ 이하여야 한다. 그러나 용매의 끓는점이 너무 낮으면, 용매의 증발이 환경적 영향을 높인다. 따라서, 본 발명의 실시 구체예에서 사용되는 바람직한 보다 낮은 극성의 용매는 헥산 또는 헵탄과 같은 (C5-C8) 지방족 탄화수소; 톨루엔과 같은 (C6-C8) 방향족 탄화수소; 디부틸 에테르, 디이소부틸 에테르 또는 tert-부틸 메틸 에테르와 같은 (C1-C4) 디알킬 에테르; 또는 그들의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 실시에 있어 메틸 이소부틸 케톤과 함께 많은 용매의 조합이 만들어질 수 있다. 이러한 용매 혼합물의 다수는 상업적으로 구입 가능하고 저렴하고 독성이 없어서, 쉽게 산업적-규모의 사용에 적용될 수 있다. 본 발명의 실시에 있어 어떠한 양의 하나 이상의 보다 낮은 극성의 용매도 메틸 이소부틸 케톤에 첨가될 수 있다. 용매의 비율은 출발 파클리탁셀 혼합물내의 조성 및 성분들의 양, 정제될 물질의 양 등을 포함한 여러 요인에 의존할 것이다. 본 명세서에서 지침이 제공되었으므로, 당업자들은 일상적인 실험만으로도 파클리탁셀의 분리를 위하여 케톤에 혼합되는 하나 이상의 보다 낮은 극성의 용매의 적절한 양을 쉽게 결정할 수 있다. 본 발명의 실시의 한 구체예로, 메틸 이소부틸 케톤과 보다 낮은 극성의 용매는 약 3:1(V/V) 내지 약 1:4(V/V)의 부피비로 용매 혼합물을 구성한다.
산업적 적용을 위해 바람직한 이동상은 메틸 이소부틸 케톤과 톨루엔의 혼합물이다. 파클리탁셀과 세팔로마닌의 우수한 분리를 제공하는 것에 더하여, 이러한 용매 혼합물은 유리하게도 쉽게 회수될 수 있는 끓는점을 가진다.
실리카 겔과 파클리탁셀 혼합물을 함유하고 있는 용기 내에 용매 혼합물을 첨가한 후, 용매가 용기로부터 용출되고 세팔로마닌을 실질적으로 함유하지 않는 고농도의 파클리탁셀을 함유하는 용출 분획이 수집된다. 고농도의 세팔로마닌을 함유하는 분획뿐만 아니라, 만약 존재한다면, 다른 성분들도 역시 별도의 분획으로 수집될 수 있다. 파클리탁셀 분획뿐만 아니라 세팔로마닌 분획도 그 후 용매의 진공 증발에 의해서 더욱 분리될 수 있다. 건조된 정도는 최종 생성물이 점착 잔류물인지 또는 고체 덩어리가 될지를 알려준다. 필요하다면, 최종 파클리탁셀 생성물이 고순도이고 파클리탁셀을 결정형으로 얻기 위해서, 적절한 용매로 결정화함으로써 더욱 정제될 수 있다. 용매의 급속 증발과 함께 완전한 유기 용매 시스템의 사용은 유리하게도 파클리탁셀의 원치 않는 7-에피-파클리탁셀로의 이성질체화를 감소시키거나 또는 제거해 준다. 이것은 역상 크로마토그래피에 기초한 공지의 정제 방법 이상의 다른 이점을 제공한다.
하기 실시예는 본 발명의 어떠한 바람직한 구체예를 더욱 설명하기 위한 것이지 이를 제한하기 위한 것은 전혀 아니다. 당업자는, 일상적인 실험만으로도, 본 명세서에서 기술된 특정 물질과 공정의 다양한 등가물을 인식하고, 또는 확인할 수 있을 것이다.
실시예 1
파클리탁셀 약 55%와 세팔로마닌 약 19%를 함유하는 비정제 결정 파클리탁셀 혼합물(도 1에 도시) 약 99.6g을 메틸 이소부틸 케톤과 톨루엔(40:60 V/V) 혼합물 약 1000mL에 용해시켰다. 상기 용액은 실리카(실리카 겔, Merck 60, 입자 크기 약 25-40㎛) 약 18kg으로 충진된 컬럼에 공급되었다. 그 후 상기 컬럼을 메틸 이소부틸 케톤과 톨루엔(40:60 V/V) 용매 혼합물로 용출시켰다. 용출 용매의 분획은 각각 20L 가량씩 취해지고 HPLC에 의해 분석되었다. 순수한 파클리탁셀을 함유하는 분획은 증발 건조 되어 파클리탁셀 약 84.035%와 세팔로마닌 약 0.145%를 함유하는 건조 생성물 약 59.04g을 산출하였다. 파클리탁셀과 세팔로마닌의 비율은 100/0.173이었다(도 2의 HPLC 분석). 아세톤과 헥산(1:1 V/V)을 통한 이 물질의 결정화는 파클리탁셀 약 96.272%와 세팔로마닌 약 0.131%를 함유하는 결정 생성물(45.80g)을 산출하였다(도 3의 HPLC 분석).
실시예 2
파클리탁셀 약 72.7%와 세팔로마닌 약 11.2%를 함유하는 비정제 결정 파클리탁셀(도 4에 도시) 약 1395g을 메틸 이소부틸 케톤과 톨루엔(40:60 V/V) 용매 혼합물 20L에 용해시켰다. 상기 용액은 실리카(실리카 겔, Merck 60, 입자 크기 약 25-40㎛) 약 185kg을 가진 컬럼에 공급되었다. 그 후 상기 컬럼을 메틸 이소부틸 케톤과 톨루엔(40:60 V/V) 혼합물로 용출시켰다. 용매의 분획은 각각 100L씩 취해지고 HPLC에 의해 분석되었다. 순수한 파클리탁셀을 함유하는 분획은 증발 건조 되었다. 건조 생성물은 파클리탁셀 약 840g과 세팔로마닌 약 1.62g을 함유하였다. 파클리탁 셀과 세팔로마닌의 비율은 100/0.193이었다. 아세톤과 헥산(1:1 V/V) 혼합물을 통한 이 물질의 결정화는 파클리탁셀 약 96.225%를 함유하는 결정 생성물(635g)을 산출하였다. 세팔로마닌의 양은 HPLC분석기의 정량 한도보다 더 낮았다(도 5의 HPLC 분석).
실시예 3
파클리탁셀 약 55%와 세팔로마닌 약 19%를 함유하는 비정제 결정 파클리탁셀(도 1에 도시) 약 4.1g을 메틸 이소부틸 케톤과 헥산(70:30 V/V) 혼합물 40mL에 용해시켰다. 상기 용액은 실리카(실리카 겔, Merck 100, 입자 크기 약 63-200㎛) 약 150g으로 충진된 컬럼에 공급되었다. 그 후 상기 컬럼을 메틸 이소부틸 케톤과 헥산 70:30(V/V) 혼합물로 용출시켰다. 용출 용매의 분획은 각각 200mL씩 취해지고 HPLC에 의해 분석되었다. 순수한 파클리탁셀을 함유하는 분획은 증발 건조 되었다. 잔류물(2.4g)은 파클리탁셀 약 99.88%와 세팔로마닌 약 0.12%를 함유하였다. 파클리탁셀과 세팔로마닌의 비율은 100/0.119였다(도 6의 HPLC 분석).
실시예 4
파클리탁셀 약 55%와 세팔로마닌 약 19%를 함유하는 비정제 결정 파클리탁셀(도 3의 HPLC 분석) 약 4.1g을 메틸 이소부틸 케톤과 tert-부틸 메틸 에테르(40:60 V/V) 혼합물 40 mL에 용해시켰다. 상기 용액은 실리카(실리카 겔, Merck 100, 입자경 약 63-200㎛) 약 150g으로 충진된 컬럼에 공급되었다. 그 후 상기 컬럼을 메틸 이소부틸 케톤과 tert-부틸 메틸 에테르(40:60 V/V)를 함유하는 용매 혼합물로 용출시켰다. 용출 용매의 분획은 각각 200mL씩 취해지고 HPLC에 의해 분석 되었다. 순수한 파클리탁셀을 함유하는 분획은 증발 건조 되었다. 잔류물(2.6g)은 파클리탁셀 약 99.41%와 세팔로마닌 약 0.36%를 함유하였다. 파클리탁셀과 세팔로마닌의 비율은 100/0.458이었다(도 7의 HPLC분석).
본 명세서에서는 단지 본 발명의 바람직한 구체예와 다양한 것들 중의 몇몇 실시예만을 기술하였다. 본 발명은 다양한 다른 조합과 조건에서 사용될 수 있고, 본 명세서에서 표현된 발명 개념의 범위 내에서 변화와 변형이 가능하다고 이해되어야 한다. 따라서, 예를 들어, 당업자들은 일상적인 실험만으로도, 본 명세서에서 기술된 특정 물질과 공정의 다양한 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명의 범위 내로 고려되고, 이하의 청구항에 의해서 포괄된다.

Claims (16)

  1. a) 실리카 겔을 함유하는 용기에 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물을 공급하는 단계;
    b) 보다 낮은 극성의 용매와 혼합된 메틸 이소부틸 케톤을 포함하는 용매 혼합물을 상기 용기에 공급하는 단계;
    c) 상기 용기로부터 용매 혼합물과 파클리탁셀을 용출시키는 단계; 및
    d) 파클리탁셀을 함유하는 용출 용매 혼합물의 하나 이상의 분획을 수집하는 단계
    를 포함하는 파클리탁셀과 세팔로마닌의 분리 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물이 탁수스 식물(Taxus plant) 전체, 또는 그의 신선한 또는 건조된 수피, 뿌리, 잎 또는 가지의 추출물로 구성된 군으로부터 얻어지는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물이 탁수스 식물의 세포 배양액을 추출함으로써 얻어지는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물이 탁산 생성 곰팡이의 배양에 의해 제조된 발효 용액을 추출함으로써 얻어지는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물이 파클리탁셀 생성을 위해 유전적으로 변형된 균주의 배양에 의해 제조된 발효 용액을 추출함으로써 얻어지는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물이 파클리탁셀과 세팔로마닌의 결정 혼합물인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 보다 낮은 극성의 용매가 C5-C8 지방족 탄화수소, C6-C8 방향족 탄화수소, C1-C4 디알킬 에테르 또는 그들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 C5-C8 지방족 탄화수소가 헥산 또는 헵탄인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 C6-C8 방향족 탄화수소가 톨루엔인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 C1-C4 디알킬 에테르가 디부틸 에테르, 디이소부틸 에테르 또는 tert-부틸 메틸 에테르인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물 약 1질량부가 실리카 겔 약 20질량부 이상을 포함하는 용기에 공급되는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 메틸 이소부틸 케톤과 보다 낮은 극성의 용매가 약 3:1(V/V) 내지 약 1:4(V/V)의 부피비로 용매 혼합물을 구성하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 보다 낮은 극성의 용매가 톨루엔, 헥산, 또는 tert-부틸 메틸 에테르 중에서 선택되는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 파클리탁셀을 함유하는 용매 혼합물의 하나 이상의 수집된 분획이 세팔로마닌을 약 0.5% 이하로 함유하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 결정 파클리탁셀을 회수하기 위해 파클리탁셀을 함유하는 용매 혼합물의 하나 이상의 용출된 분획을 건조하는 단계를 더 포함하는 방법.
  16. a) 실리카 겔을 함유하는 용기에 파클리탁셀과 세팔로마닌 혼합물을 공급하는 단계;
    b) 보다 낮은 극성의 용매와 혼합된 메틸 이소부틸 케톤을 포함하는 용매 혼합물을 상기 용기에 공급하는 단계;
    c) 상기 용기로부터 용매 혼합물, 파클리탁셀, 및 세팔로마닌을 용출시키는 단계;
    d) 고농도의 파클리탁셀을 함유하는 용출 용매 혼합물의 하나 이상의 분획을 수집하는 단계: 및
    e) 고농도의 세팔로마닌을 함유하는 용출 용매 혼합물의 하나 이상의 분획을 수집하는 단계
    를 포함하는 파클리탁셀과 세팔로마닌의 분리 방법.
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