ES2320471T3 - Procedimiento para la separacion de paclitaxel y cefalomanina. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para la separación de paclitaxel y cefalomanina, comprendiendo el procedimiento las etapas siguientes: a) colocar la composición de paclitaxel y cefalomanina en un contenedor que contiene gel de sílice; b) aplicar a dicho contenedor una mezcla de solvente que comprende metil isobutil cetona mezclada con un solvente menos polar; c) eluir la mezcla de solvente y paclitaxel del contenedor; y d) recoger una o más fracciones de la mezcla de solvente de elución que contiene paclitaxel.
Description
Procedimiento para la separación de paclitaxel y
cefalomanina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la separación de paclitaxel de su análogo
natural, la cefalomanina. En particular, la presente invención se
refiere a la separación de la cefalomanina mediante cromatografía
en gel de sílice.
Paclitaxel, anteriormente conocido como
"taxol", es un importante agente quimioterapéutico útil para el
tratamiento de tumores de ovario, mama y pulmón humanos. Se ha
demostrado como un agente eficaz en varios cánceres humanos y sus
usos clínicos de han descrito en varios artículos de reseña, tales
como Rowinsky, E. K., Ann. Rev. Med. 48: 353 1997; Van Hoff, D.D.,
Semin. Oncol. 24:3 (1997); DeFuria, M. D., Phytomedicine 4:273
(1997) y Eisenhauer, E. A., Vermoken, J. B., Drugs 55:5 (1998).
Paclitaxel es un compuesto natural y fue aislado
por primera vez por Wani et al. de la corteza del tejo del
pacífico (Taxus bravifolia). J. Am. Chem. Soc. 93: 2325
(1971). Desde entonces, los investigadores han reconocido que
paclitaxel existe en todas las especies del género Taxus, que
incluye el tejo europeo (Taxus baccata); el tejo del
Himalaya (Taxus Wallichiana), el tejo chino (Taxus
celebita), el tejo japonés (Taxus cuspidata), el tejo
canadiense (Taxus canadensis), el tejo mejicano (Taxus
globosa), el tejo de Florida (Taxus floridana) y el tejo
ornamental (Taxus media) y todos los híbridos y cultivos.
El aislamiento de paclitaxel de las fuentes
vegetales es complejo y difícil, parcialmente debido a su
concentración muy baja de biomasa y en parte debido a la presencia
de otros taxanos que presentan una estructura y propiedades
similares a la del paclitaxel. El taxano, cefalomanina resulta
particularmente difícil de separar de paclitaxel. Está presente
virtualmente en todas las fuentes conocidas que contienen paclitaxel
y se encuentra en un intervalo de concentración de la proporción de
paclitaxel/cefalomanin desde 1:10 hasta un valor tan elevado como
aproximadamente 1:1, en función del tipo de planta de
Taxus.
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Un método utilizado para separar estos
compuestos aprovecha la diferencia en su reactividad química para
formar unos derivados de la cefalomanina más reactiva. Por ejemplo,
el grupo de olefina que se extiende desde la cefalomanina se oxida
o se broma más fácilmente que cualquier otra parte de paclitaxel y
se puede utilizar para formar un derivado de la cefalomanina que es
más fácil de separar de paclitaxel. Ver, por ejemplo, Kingston, D.
G. I., et al., J. Nat. Prod. 55:259 (1992)); Beckvermit, J.
T., et al., J. Org. Chem, 61: 9038 (1996); patente US nº
5.654.448.
Otro enfoque de la separación de la cefalomanina
de paclitaxel implica varios tipos de cromatografías. En la
bibliografía, se pueden encontrar varios ejemplos que incluyen por
ejemplo, Dauh-Rurng Wu, et al., J. Chrom. A,
702:233 (1995); Koppaka V. Rao, et al., Pharm. Res. 12:1003
(1995); and Xuefeng Yang, et al., J. Chrom. A, 813: 201
(1998). La cromatografía de fase inversa se describe también para la
purificación final de paclitaxel en varias patentes, como: patente
US nº 5.279.949; patente US nº 5.380.916 y patente US nº 5.969.165.
Asimismo se ha desarrollado un procedimiento continuo basado en el
proceso de cromatografía de fase inversa de lecho móvil simulado.
Dauh-Rurng Wu, et al., J. Chrom. A, 855:71
(1999). Sin embargo, un inconveniente de utilizar la cromatografía
de fase inversa es la necesidad de utilizar solventes que contienen
agua, que puede provocar adversamente la isomerización de paclitaxel
en 7-epi-paclitaxel no deseado.
Los métodos adicionales que se utilizan para
purificar paclitaxel se basan en una elución de gradiente complicada
o bien en varias etapas de cromatografía secuenciales que utilizan
las diferentes composiciones de fase móvil. Young Kwang Park, et
al., J. Liq. chrom. & Rel. Technol. 22 (18): 2755 (1999).
Otro enfoque utiliza la cromatografía de fase normal con aluminio
como adsorbente. Desafortunadamente, los solventes orgánicos
clorados se utilizan a menudo como fase móvil con aluminio. Además,
tanto la epimerización como la descomposición química del
paclitaxel tienen lugar en este sistema, en función del tiempo de
elución. Zhiqiang Z., Zhiguo S. J., Liq. Chrom. & Rel. Technol.
23 (17): 2683 (2000).
Recientemente, la purificación por cromatografía
en sílice de paclitaxel que utiliza los ésteres orgánicos se ha
descrito en la patente US nº 6.333.419. El procedimiento descrito en
la presente memoria se ha diseñado para la separación de paclitaxel
de la cefalomanina.
Sigue existiendo una necesidad constante de
encontrar un método eficaz y simple para la separación de paclitaxel
de la cefalomanina.
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Una ventaja de la presente invención es que
proporciona un método sencillo, costoso y eficaz para la separación
de paclitaxel de la cefalomanina.
Estas y otras ventajas se cumplen, por lo menos
en parte, mediante un procedimiento para la separación de
paclitaxel de la cefalomanina que utiliza cromatografía en gel de
sílice. El procedimiento se puede adaptar ventajosamente para una
purificación a gran escala de paclitaxel.
Las formas de realización de la presente
invención incluyen la aplicación de una composición de cefalomanina
y paclitaxel en un contenedor, por ejemplo, una columna, que
comprende sílice y después se aplica una mezcla de solvente que
comprende metil isobutil cetona junto con un solvente menos polar en
el contenedor. La mezcla de solvente se añade al contenedor para
producirla y por lo menos para que paclitaxel y cefalomanina se
eluyan separadamente del contenedor. A continuación, se recogen una
o más fracciones de la mezcla de solventes de elución que contienen
paclitaxel. Si se desea, las fracciones que contienen cefalomanina
también se pueden recoger separadamente. Entonces se puede aislar
paclitaxel puro de las fracciones adecuadas que contienen las
concentraciones más elevadas de paclitaxel mediante la evaporación
de la mezcla de solvente y la cristalización del residuo, si se
desea.
Otras ventajas adicionales de la presente
invención se pondrán más claramente de manifiesto para los expertos
en la materia a partir de la descripción detallada siguiente, en la
que sólo se muestra y se describe la forma de realización
preferida, sencillamente mediante la ilustración de la realización
de la invención. Tal como se puede realizar, se pueden utilizar
otras formas de realización diferentes, y varios detalles son
susceptibles de sufrir modificaciones en varios aspectos obvios,
todos ellos sin alejarse de la invención. La presente invención se
puede realizar sin alguno o sin todos estos detalles específicos. En
otros casos, el funcionamiento de los procedimientos bien conocidos
no se han descrito todavía con detalle, para no complicar
innecesariamente la presente invención. Por consiguiente, las
figuras y la descripción se deben considerar a título ilustrativo
en su naturaleza y no a título limitativo.
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Se hace referencia a las figuras adjuntas, en
las que:
la Fig. 1 muestra la composición del material de
partida utilizado en los Ejemplo 1, 3 y 4, determinado mediante
análisis de HPLC, en la que la abscisa representa el tiempo de
elución en minutos, y las ordenadas representan las unidades de
absorbancia.
La Fig. 2 muestra la composición de la fracción
principal del Ejemplo 1, determinado mediante análisis de HPLC, en
la que la abscisa representa el tiempo de elución en minutos, y las
ordenadas representan las unidades de absorbancia.
La Fig. 3 muestra la composición del producto
cristalino final del Ejemplo 1, determinado mediante análisis de
HPLC, en la que la abscisa representa el tiempo de elución en
minutos, y las ordenadas representan las unidades de
absorbancia.
La Fig. 4 muestra la composición del material de
partida utilizado en el Ejemplo 2, determinado mediante análisis de
HPLC, en la que la abscisa representa el tiempo de elución en
minutos, y las ordenadas representan las unidades de
absorbancia.
La Fig. 5 muestra la composición del producto
cristalino final del Ejemplo 2, determinado mediante análisis de
HPLC, en la que la abscisa representa el tiempo de elución en
minutos, y las ordenadas representan las unidades de
absorbancia.
La Fig. 6 muestra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 3, determinado mediante análisis
de HPLC, en la que la abscisa representa el tiempo de elución en
minutos, y las ordenadas representan las unidades de
absorbancia.
La Fig. 7 muestra la composición de las
fracciones principales del Ejemplo 4, determinado mediante análisis
de HPLC, en la que la abscisa representa el tiempo de elución en
minutos, y las ordenadas representan las unidades de
absorbancia.
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La presente invención surge del descubrimiento
que el paclitaxel se puede separar eficazmente de la cefalomanina
mediante la cromatografía en gel de sílice que utiliza una mezcla de
solvente que comprende metil isobutil cetona y otro solvente menos
polar como fase móvil. El procedimiento proporciona un método
sencillo, económico y eficaz para la producción de paclitaxel de
gran pureza, por ejemplo, un producto de paclitaxel que presenta
menos de aproximadamente 0,5% de cefalomanina, que se puede adaptar
para la manufacturación a escala industrial.
Las patentes, solicitudes publicadas, y la
bibliografía científica citadas en el documento presente establecen
el conocimiento de los expertos en la materia y se incorporan en el
documento presente como referencia en su totalidad en el mismo
grado que si cada una de ella se hubiera incorporado específica e
individualmente como referencia. Cualquier conflicto entre una
referencia citada en el documento presente y los descubrimientos
específicos de la presente memoria deberá resolverse a favor de esta
última. Del mismo modo, cualquier conflicto entre la definición
técnica de una palabra o frase y una definición de la palabra o
frase como se describe específicamente en la memoria presente se
resolverá a favor de la última.
Como se utilizan en la presente memoria, las
formas de singular "uno", "una", "el" y "la"
engloban también específicamente las formas plurales de los
términos a los cuales se refieren, excepto que el contexto
establezca claramente que sea de otro modo.
El término "aproximadamente" se utiliza en
la memoria presente para significar en la zona de, alrededor de o
más o menos. Si el término "aproximadamente" se utiliza junto
con un intervalo numérico, modifica el intervalo por extensión a
los límites superior e inferior de los valores numéricos
establecidos anteriormente. En general, el término
"aproximadamente" se utiliza en la presente memoria para
modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor
establecido mediante una varianza del 20%.
Como se utiliza en la presente memoria, ya sea
en una frase de transición o bien en el cuerpo de una
reivindicación, las expresiones "comprende(n)" y "que
comprende" debe interpretarse con un significado abierto, Es
decir, los términos deben interpretarse de forma sinónima con las
frase "que presente por lo menos" o "que incluye por lo
menos". Si se utiliza en el contexto de un procedimiento, el
término "que comprende" significa que el procedimiento incluye
por lo menos las etapas descritas pero puede incluir unas etapas
adicionales. Si se utiliza en el contexto de un compuesto o
composición, el término "que comprende" significa que el
compuesto o composición incluye por lo menos las características o
compuestos descritos, pero también puede incluir unas
características o componentes adicionales.
Como se utiliza en la presente memoria, la cita
de un intervalo numérico para una variable se pretende que exprese
que la invención se puede realizar con la variable igual a uno de
los valores que se encuentran dentro de este intervalo. De este
modo, para una variable que es intrínsecamente discreta, la variable
puede ser igual a un número entero del intervalo numérico, que
incluye los puntos finales del intervalo. De modo similar, para una
variable que es intrínsecamente continua, la variable puede ser
igual a un valor real del intervalo numérico, que incluye los
puntos finales del intervalo. Como ejemplo, una variable que se
describe que tiene unos valores comprendidos entre 0 y 2, puede ser
0; 1 ó 2 para variables que son intrínsecamente discretas, y puede
ser 0,0; 0,1; 0,01; 0,001 u otro valor real para variables que son
intrínsecamente continuas.
Como se utiliza en la presente memoria, excepto
que se indica específicamente de otro modo, la palabra "o" se
utiliza en el sentido "inclusivo" de "y/o" y no en el
sentido "exclusivo" de "o bien/o".
Se hace referencia a continuación en la presente
memoria con más detalle a las formas de realización específicas de
la invención. Aunque la invención se describirá conjuntamente con
estas formas de realización específicas, se entenderá que no se
pretende limitar la invención a dichas formas de realización
específicas. Al contrario, se pretende cubrir alternativas,
modificaciones y se pueden incluir equivalentes dentro del espíritu
y el alcance de la invención como se define en las reivindicaciones
adjuntas. En la descripción siguiente, se describen varios detalles
específicos con el fin de proporcionar un entendimiento riguroso de
la presente invención. La presente invención se puede realizar sin
alguno o todos estos detalles específicos. En otros casos, los
funcionamientos de procedimientos bien conocidos no se han descrito
con detalle, para no ocultar innecesariamente la presente
invención.
Para llevar a cabo la presente invención, se
pueden utilizar los materiales adecuados y/o métodos conocidos por
los expertos en la materia. Sin embargo, se describen los materiales
y métodos preferidos. Los materiales, reactivos y similares a los
que se hace referencia en la descripción siguiente y los ejemplos
son obtenibles a partir de fuentes comerciales, excepto que se
indique de otro modo.
Tras llevar a cabo experimentos e
investigaciones, se ha descubierto que cuando se prueba la metil
isobutil cetona como fase móvil en la cromatografía de capa fina,
se consigue una separación satisfactoria de paclitaxel y
cefalomanina. Sin embargo, se ha encontrado que la cetona por sí
misma es demasiado polar para ser utilizada como fase móvil para la
separación de una cantidad mayor de una mezcla de paclitaxel, como
cuando se utiliza cromatografía de columna. La polaridad de la fase
móvil para la cromatografía de columna se disminuye entonces
añadiendo uno o más solventes menos polares. Los solventes que se
consideran menos polares y adecuados para la realización de la
presente invención incluyen un hidrocarburo alifático; un
hidrocarburo aromático; un dialquiléter; o sus mezclas.
El procedimiento de cromatografía para la
separación de paclitaxel y cefalomanina según la invención es
relativamente sencillo. Utiliza una fase de gel de sílice normal y
no necesito de un equipo de alta presión. Pero dicho equipo se
puede utilizar como es conocido en la técnica. Sin embargo, con una
columna simple se puede conseguir una buena separación aunque sólo
se utilicen 20 partes en peso de gel de sílice para cada una de las
partes del material de partida. Se puede utilizar una proporción
superior de gel de sílice en función de la composición del material
de partida y de la pureza deseada del paclitaxel aislado resultante.
Se puede utilizar cualquier sílice en la realización de la presente
invención. El sílice o gel de sílice se puede obtener en unas
cantidades mayores a partir de varias fuentes comerciales y se
presenta en varios tamaños de partícula de varían desde
aproximadamente 25 hasta aproximadamente 200 \mum.
Al poner en práctica un aspecto de la presente
invención, una composición de paclitaxel de partida, es decir, una
mezcla que contiene paclitaxel y cefalomanina, se aplica en un
contenedor, por ejemplo, una columna que contiene sílice. La mezcla
inicial de paclitaxel se puede obtener a partir de unas fuentes
habituales como a partir de un extracto de corteza fresca o seca,
de raíces, de hojas y/o ramas o de la planta entera de una planta
que contiene paclitaxel, por ejemplo una planta de Taxus.
También se pueden contemplar otras fuentes de paclitaxel para la
utilización en la realización de la presente invención, que incluye
un extracto crudo o purificado obtenido a partir de cultivos
celulares de una planta de Taxus, de un caldo de fermentación
preparado mediante el cultivo de un hongo productor de taxanos; un
caldo de fermentación preparado por cultivo de unas cepas
bacterianas genéticamente modificadas para la producción de
paclitaxel, etc..
Si la mezcla de paclitaxel de partida contiene
una cantidad sustancial de componentes además de la cefalomanina,
la mezcla se puede someter a la purificación como es sabido en la
técnica para reducir la cantidad de impurezas antes de realizar la
cromatografía de gel de sílice de la mezcla según la presente
invención. Resulta preferible que la mezcla de partida de
paclitaxel sea un extracto parcialmente purificado de paclitaxel que
se ha obtenido mediante las etapas de purificación conocidas en la
técnica, por ejemplo, cromatografía, cristalización etc.. pero el
procedimiento descrito en la presente memoria no se limita a
ello.
Cuando se coloca la composición de partida de
paclitaxel se puede diluir en primer lugar con un solvente que
incluye la mezcla de solvente utilizada para su separación. La
mezcla de solventes adecuada que se puede utilizar para separar
paclitaxel de cefalomanina incluyen metil isobutil cetona junto con
un solvente menos polar. En la realización de la presente
invención, la mezcla de paclitaxel de partida ya sea eluida o
concentrada se coloca en el contenedor y la mezcla de solvente
también se coloca en un contenedor para provocar la partición del
paclitaxel y de la cefalomanina y posiblemente otros componentes, si
están presentes, y que se separen de modo que los componentes se
muevan a través del sílice en el contenedor. A continuación, se
puede recoger paclitaxel de alta pureza sustancialmente libre de
cefalomanina con el solvente de elución. Además, la cefalomanina
también se puede recoger separadamente.
En una forma de realización de la presente
invención, los puntos de ebullición de los solventes utilizados en
la fase móvil deben ser inferiores a aproximadamente 130ºC, de modo
que el producto se recupera preferentemente de las fracciones de
cromatografía por evaporación. Sin embargo, si los puntos de
ebullición de los solventes son demasiado bajos, la evaporación de
los solventes puede originar un peligro medioambiental. Por lo
tanto, los solventes menos polares preferidos utilizados en las
formas de realización de la presente invención incluyen
hidrocarburos alifáticos (C_{5}-C_{8}), como
hexano o heptano; hidrocarburos aromáticos
(C_{6}-C_{8}), como tolueno; dialquiléteres
(C_{1}-C_{4}), como dibutiléter, diisobutiléter
o terc-butil metil éter o sus mezclas.
Para la realización de la presente invención, se
pueden crear varias combinaciones con la metil isobutil cetona. La
mayoría de estas mezclas de solvente están comercialmente
disponibles, no resultan caras y no son tóxicas y por ello
fácilmente adaptables para la utilización a escala industrial. Para
la realización de la presente invención, se puede añadir una
cantidad variables de uno o más solventes menos polares a la metil
isobutil cetona. La proporción se los solventes dependerá de varios
factores que incluyen los contenidos y la cantidad de componentes
en la composición de partida de paclitaxel, la cantidad de material
a purificar, etc. Gracias a las indicaciones proporcionadas en la
memoria presente, los expertos en la materia podrán determinar
fácilmente la cantidad adecuada de uno o más solventes menos
polares que se mezclan con la cetona para aislar paclitaxel
utilizando la experimentación habitual. En una forma de realización
de la presente invención, la metil isobutil cetona al solvente
menos polar comprende la mezcla de solvente en una proporción de
volumen de aproximadamente 3:1 (V/V) hasta aproximadamente 1:4
(V/V).
Una fase móvil preferida para las aplicaciones
industriales es una mezcla de metil isobutil cetona y tolueno.
Además de proporcionar una separación excelente del paclitaxel y la
cefalomanina, esta mezcla de solvente presenta ventajosamente una
temperatura de ebullición fácilmente recuperable.
Después de la adición de la mezcla de solvente a
un contenedor que contiene el gel de sílice y la composición de
paclitaxel, el solvente se eluye del contenedor y se recogen las
fracciones eluidas que contienen una alta concentración de
paclitaxel sustancialmente libre de cefalomanina. Las fracciones que
contienen una elevada concentración de cefalomanina, así como otros
componentes, si están presentes, se pueden recoger también como
unas fracciones separadas. Las fracciones de paclitaxel, así como
las fracciones de cefalomanina, se pueden después aislar más
mediante evaporación al vacío del solvente. La extensión del secado
dictará si el producto da como resultado un residuo viscoso o una
masa cristalina sólida. Si se desea, el producto de paclitaxel
resultante se puede purificar más por cristalización de los
solventes adecuados para obtener paclitaxel de gran pureza y en
forma cristalina. La utilización de un sistema de solvente
completamente orgánico con una rápida evaporación de los solventes
reduce o elimina ventajosamente la isomerización no deseable de
paclitaxel en 7-epi-paclitaxel. Esto proporciona otra
ventaja frente a los métodos de aislamiento a base de cromatografía
de fase inversa.
Los ejemplos siguientes se proporciona para
ilustrar determinadas formas de realización preferidas de la
invención y no para limitarlas en su naturaleza. Los expertos en la
materia reconocerán, o serán capaces de establecer, utilizando
únicamente los experimentos habituales, varios equivalentes a las
sustancias específicas y los procedimientos descritos en la
presente memoria.
Ejemplo
1
Aproximadamente 99,6 g de la composición de
paclitaxel cristalino crudo que contienen aproximadamente 55% de
paclitaxel y aproximadamente 19% de cefalomanina (como se muestra en
la Fig. 1) se disuelven en aproximadamente 1.000 ml de la mezcla de
metil isobutil cetona y tolueno (40:60 V/V). La solución se carga en
una columna llenada con aproximadamente 18 kg de sílice (gel de
sílice, Merck 60, tamaño de partícula de aproximadamente
25-40 \mum). Después la columna se eluye con una
mezcla de solvente de metil isobutil cetona y tolueno (40:60 V/V).
Las fracciones de solvente eluidas se toman cada 20 l o más y se
analizan por HPLC. Las fracciones que contienen paclitaxel puro se
evaporan hasta la sequedad, produciendo aproximadamente 59,04 g de
producto seco que contiene aproximadamente 84,035% y
aproximadamente 0,145% de cefalomanina. La proporción relativa entre
paclitaxel y cefalomanina es de 100/0,173 (el análisis de HPLC se
muestra en la Fig. 2). La cristalización de este material de la
cetona y hexano (1:1 V/V) produce un producto cristalino (45,80 g)
que contiene aproximadamente 96,272% de paclitaxel y
aproximadamente 0,131% de cefalomanina (análisis HPLC que se muestra
en la Fig. 3).
Ejemplo
2
Aproximadamente 1.395 g de paclitaxel cristalino
crudo que contienen aproximadamente 72,7% de paclitaxel y
aproximadamente 11,2% de cefalomanina (como se muestra en la Fig. 4)
se disuelven en aproximadamente 20 l de la mezcla de metil isobutil
cetona y tolueno (40:60 V/V). La solución se carga en una columna
llenada con aproximadamente 185 kg de sílice (gel de sílice, Merck
60, tamaño de partícula de aproximadamente 25-40
\mum). Después la columna se eluye con una mezcla de metil
isobutil cetona y tolueno (40:60 V/V). Las fracciones de solvente
eluidas se toman cada 100 l y se analizan por HPLC. Las fracciones
que contienen paclitaxel puro se evaporan hasta la sequedad. El
producto seco contiene aproximadamente 840 g de producto seco de
paclitaxel y aproximadamente 1,62 g de cefalomanina. La proporción
relativa entre paclitaxel y cefalomanina es de 100/0,193 La
cristalización de este material a partir de una mezcla de cetona y
hexano (1:1 V/V) produce un producto cristalino (635 g) que
contiene aproximadamente 96,225% de paclitaxel . El contenido de
cefalomanina es inferior al límite de cuantificación del detector
de HPLC (análisis HPLC que se muestra en la Fig. 5).
Ejemplo
3
Aproximadamente 4,1 g de paclitaxel cristalino
crudo que contienen aproximadamente 55% de paclitaxel y
aproximadamente 19% de cefalomanina (como se muestra en la Fig. 1)
se disuelven en aproximadamente 40 ml de la mezcla de metil
isobutil cetona y tolueno (70:30 V/V). La solución se carga en una
columna llenada con aproximadamente 150 g de sílice (gel de sílice,
Merck 100, tamaño de partícula de aproximadamente
63-200 \mum). Después la columna se eluye con una
mezcla de metil isobutil cetona y tolueno (70:30 V/V). Las
fracciones de solvente eluidas se toman cada 200 ml y se analizan
por HPLC. Las fracciones que contienen paclitaxel puro se evaporan
hasta la sequedad. El residuo (2,4 g) contiene aproximadamente
99,88% de paclitaxel y aproximadamente 0,12% de cefalomanina. La
proporción relativa entre paclitaxel y cefalomanina es de 100/0,119
(análisis HPLC que se muestra en la Fig. 6).
Ejemplo
4
Aproximadamente 4,1 g de paclitaxel cristalino
crudo que contienen aproximadamente 55% de paclitaxel y
aproximadamente 19% de cefalomanina (análisis HPLC en la Fig. 3) se
disuelven en 40 ml de la mezcla de metil isobutil cetona y tolueno
(40:60 V/V). La solución se carga en una columna llenada con
aproximadamente 150 g de sílice (gel de sílice, Merck 100, tamaño
de partícula de aproximadamente 63-200 \mum).
Después la columna se eluye con una mezcla de solvente metil
isobutil cetona y terc-butil metil éter (40:60 V/V). Las
fracciones de solvente eluidas se toman cada 200 ml y se analizan
por HPLC. Las fracciones que contienen paclitaxel puro se evaporan
hasta la sequedad. El residuo (2,6 g) contiene aproximadamente
99,41% de paclitaxel y aproximadamente 0,36% de cefalomanina. La
proporción relativa entre paclitaxel y cefalomanina es de 100/0,458
(análisis HPLC que se muestra en la Fig. 7).
En la presente descripción sólo se describen las
formas de realización preferidas de la invención y algunos ejemplos
de su versatilidad. Debe entenderse que la invención se puede
utilizar en otras varias combinaciones y entornos y se pueden
realizar cambios o modificaciones dentro del alcance del concepto
inventivo como se expresa en la presente memoria. De este modo, por
ejemplo, los expertos en la materia reconocen, o son capaces de
establecer, utilizando únicamente los experimentos habituales,
varios equivalentes a las sustancias específicas y los
procedimientos descritos en la memoria presente. Dichos equivalentes
se consideran dentro del alcance de la invención, y están
comprendidos en las reivindicaciones siguientes.
Claims (16)
1. Procedimiento para la separación de
paclitaxel y cefalomanina, comprendiendo el procedimiento las etapas
siguientes:
- a)
- colocar la composición de paclitaxel y cefalomanina en un contenedor que contiene gel de sílice;
- b)
- aplicar a dicho contenedor una mezcla de solvente que comprende metil isobutil cetona mezclada con un solvente menos polar;
- c)
- eluir la mezcla de solvente y paclitaxel del contenedor; y
- d)
- recoger una o más fracciones de la mezcla de solvente de elución que contiene paclitaxel.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la composición de paclitaxel y cefalomanina se obtiene del
grupo constituido por un extracto de planta entera de Taxus,
o corteza seca o fresca, su raíz, su hoja o su rama.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la composición de paclitaxel y cefalomanina se obtiene por
extracción de los cultivos celulares de una planta de
Taxus.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la composición de paclitaxel y cefalomanina se obtiene por
extracción de un caldo de fermentación preparado por cultivo de un
hongo productor de taxanos.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la composición de paclitaxel y cefalomanina se obtiene por
extracción de un caldo de fermentación preparado por cultivo de unas
cepas bacterianas genéticamente modificadas para la producción de
paclitaxel.
6. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la composición de paclitaxel y cefalomanina es una mezcla
cristalina de paclitaxel y cefalomanina.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el solvente menos polar se selecciona de entre el grupo
constituido por hidrocarburo alifático
C_{5}-C_{8}, hidrocarburo aromático
C_{6}-C_{8}, dialquiléter
C_{1}-C_{4} o sus mezclas.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el hidrocarburo alifático
C_{5}-C_{8} es hexano o heptano.
9. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el hidrocarburo aromático C_{6}-C_{8} es
tolueno.
10. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el dialquiléter C_{1}-C_{4} es dibutil
éter, diisobutil éter o terc-butil metil éter.
11. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que aproximadamente una parte en peso de la composición de
paclitaxel y cefalomanina se aplica a un contenedor que contiene más
de aproximadamente 20 partes en peso de gel de sílice.
12. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la metil isobutil cetona y el solvente menos polar
comprenden la mezcla de solvente en una proporción de volumen
comprendida entre aproximadamente 3:1 (V/V) y aproximadamente 1:4
(V/V).
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que el solvente menos polar se selecciona de entre tolueno,
hexano o terc-butil metil éter.
14. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que una o más de las fracciones recogidas de la mezcla de
solvente que contiene paclitaxel contiene menos de aproximadamente
0,5% de cefalomanina.
15. Procedimiento según la reivindicación 1, que
comprende asimismo el secado de una o más fracciones eluidas de la
mezcla de solvente que contiene paclitaxel para recuperar paclitaxel
cristalino.
16. Procedimiento para la separación de
paclitaxel y cefalomanina, comprendiendo el procedimiento las etapas
siguientes:
- a)
- aplicar la composición de paclitaxel y cefalomanina a un contenedor que contiene gel de sílice;
- b)
- aplicar a dicho contenedor una mezcla de solvente que comprende metil isobutil cetona mezclada con un solvente menos polar;
- c)
- eluir la mezcla de solvente, paclitaxel, y cefalomanina del contenedor;
- d)
- recoger una o más fracciones de la mezcla de solvente de elución que contiene una concentración elevada de paclitaxel; y
- e)
- recoger una o más fracciones de la mezcla de solvente de elución que contiene una elevada concentración de cefalomanina.
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