CN101045718A - 一种分离提纯10－去乙酰基巴卡亭ⅲ的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分离提纯10－DABIII的方法。该方法采用正反相色谱技术相结合，将正相色谱作为第一级处理，去除了大部分杂质，有利于保护成本较高的反相色谱固定相，延长反相色谱固定相的使用寿命；而反相色谱可以处理较大的上样量，并且对正相色谱不易分离掉的一部分杂质有更好的去除效果，溶剂易回收且成本也更低廉。因此，将正反相色谱技术结合不但可以获得纯度大于99.5％的10－去乙酰基巴卡亭III，还能够降低成本。此外，本发明还采用了两级色谱串联分离技术，通过预处理柱分离一部分杂质，再串接分离柱进行细分离，提高了分离效果，增加了色谱柱的负载上样量。

Description

一种分离提纯10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ的方法

技术领域

本发明涉及一种分离提纯10-去乙酰基巴卡亭III的方法，尤其涉及一种结合正反相液相色谱技术分离提纯10-去乙酰基巴卡亭III的方法。

背景技术

10-去乙酰基巴卡亭III(10-DeacetylbaccatinIII，以下简称10-DABIII)的分子结构式如下：

10-DABIII是合成抗癌药物多烯紫杉醇和半合成紫杉醇的主要原料，它主要存在于红豆杉的枝、叶、皮、根内。随着紫杉烷系抗癌药的独特疗效得到证实，该类药物的市场需求量与日俱增，这就迫切的需要更经济更合理的利用现有的红豆杉植物，尽可能多的并且高效的从红豆杉的有效部位中分离提纯所需要的物质，减少对现有红豆杉资源的浪费。

Ramadoss等(USP.6,124,482，2000)用脂肪醇浸提欧洲红豆杉的干燥树叶，提取液部分浓缩后用脂肪酮萃取，取出不溶物，然后把母液旋转蒸发干燥，将得到的固体用水和酮的混合液溶解，除去不溶物，经脱色，再利用有机溶剂进行萃取，有机层结晶得到纯度为93.5～94.1％的10-DABIII。

Margraff等(USP.5,736,366，1998)用水浸提欧洲红豆杉，调节浸提液的PH值至4.6-5.4之间，利用固相萃取分离10-DABIII，结晶，所得产品的纯度为75～90％，收率在75.4～92％之间。

Gaullier等(USP.5,453,521；USP.5,393,895，1998)用脂肪醇提取欧洲红豆杉枝叶，用水稀释溶液，去除不溶物，完全除掉酒精，用有机溶剂萃取水层，结晶，得到产品纯度为75.8～93.8％，收率为69.5～93.8％。

Nair等(USP.5,478,736，1995)用含有50～95％的甲醇、乙醇或丙酮的水溶液浸提红豆杉组织，用活性炭过滤得到的浸提液，并利用真空加压的正相色谱分离，再利用中压色谱柱分离，收集相应馏分，得到10-DABIII。

国际公布号为WO94/07882的专利文献中公开了用甲醇浸提红豆杉组织，得到的浸提液用水稀释，去除不溶物，除尽甲醇后得到的溶液用合适的有机溶剂萃取，结晶得到10-DABIII，纯度95.8％，收率为93.6％。

中国专利申请公开说明书CN1398859A中公开了采用水浸提红豆杉枝叶残渣，提取液喷雾干燥，再利用高压正相色谱柱分离，分段收集淋洗液，得纯度为99.5％以上的10-DABIII。

中国专利申请公开说明书CN1616441A中公开了用连续渗漉提取红豆杉枝叶中的紫杉烷类化合物，经过硅胶柱层析，得到10-DABIII。

中国专利申请公开说明书CN1660827A中公开了采用70～80％乙醇提取红豆杉枝叶，浓缩浸提液，去除沉淀物，用大孔吸附树脂吸附滤液中10-DABIII，乙醇洗脱，得到10-DABIII粗品。

中国专利申请公开说明书CN1473821A中公开了用醇类溶剂从红豆杉超细粉(粒径≤10μm)中快速提取10-DABIII，然后用萃取法获得5～10％粗品原料，经硅胶柱层析，常压色谱柱层析以及水解等提纯、转化、精制步骤，工业化获得纯度大于99.5％以上的10-DABIII。

Rao等(Pharmaceutical Research 12(7)，1995)采用甲醇浸提红豆杉组织，浸提液用氯仿萃取后浓缩蒸干，将所得的提取物溶于乙腈，通过反相色谱进行分离，分段收集含10-DABIII的淋洗液后两次结晶得到10-DABIII。

上述方法主要采用醇类溶剂提取红豆杉枝叶中的10-DABIII，然后分别采用结晶，正相硅胶柱层析或反相色谱分离等方法进行提纯，因此，这些方法存在以下缺陷：收率较低、杂质分离不彻底、处理量小、大量使用有机溶剂导致成本偏高。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种能有效去除杂质，高收率地获得高纯度的10-DABIII的方法。

本发明的分离提纯10-DABIII的方法包括以下步骤：

1)用含有机溶剂50～90体积％的水性提取剂于30-40℃提取红豆杉枝叶，并将提取物吸附在硅胶上，得到硅胶吸附料；

2)将步骤1)所得的硅胶吸附料装入第一正相预处理柱，以洗脱液洗脱，收集含10-DABIII的洗脱液，减压浓缩除去70～80体积％的溶剂，然后在浓缩液中加入硅胶，蒸干溶剂，得到负载了提取物的硅胶吸附料；

3)将步骤2)所得的硅胶吸附料装入第二正相预处理柱，首先以洗脱液洗脱，然后串接装填了硅胶的正相分离柱，继续以上述洗脱液进行梯度洗脱，将含10-DABIII的洗脱液合并，减压浓缩除去50～60体积％的溶剂，得到10-DABIII浓缩液；

4)在步骤3)所得的10-DABIII浓缩液中加入反相固定相，蒸干溶剂，得到反相吸附料，将反相吸附料装入反相预处理柱，然后串接装填了反相固定相的反相分离柱，以含有机溶剂5～60体积％的水性洗脱液梯度洗脱，收集含10-DABIII的洗脱液；

5)将步骤4)所得的含10-DABIII的洗脱液减压浓缩，除去有机溶剂，剩余溶液经萃取、浓缩、结晶后，得到10-DABIII。

在步骤1)中，所述的水性提取剂是指有机溶剂与水的混合溶剂，其中的有机溶剂可选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸丁酯中的一种或多种。步骤1)中将提取物吸附在硅胶上的步骤可以包括：将所得提取液减压浓缩，除去其中的有机溶剂，然后将剩余液静置，过滤，将滤液以萃取剂萃取3次，合并有机相，加入质量为红豆杉枝叶质量的0.5-3％的硅胶，减压除去有机溶剂，得到硅胶吸附料，所述的萃取剂可选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、二氯甲烷、1，1-二氯甲烷、1，2-二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或多种。所得的沉淀物可用于回收其他的紫杉烷类。

步骤1)中所述的红豆杉可以是浆果(欧洲)红豆杉(T.baccata)、太平洋红豆杉(T.brevifolia)、加拿大红豆杉(T.canadensis)、中国红豆杉(T.chinensis)、东北红豆杉(T.cuspidata)、佛罗里达红豆杉(T.floridana)、西藏红豆杉(T.wallichiana)、云南红豆杉(T.yunnanensis)或南方红豆杉(T.media)。

步骤2)中，在作为第一正相预处理柱的未装填硅胶的色谱柱内装入步骤1)所得的硅胶吸附料，经洗脱液洗脱，进行第一次提纯，以去除部分杂质。所述的洗脱液可选自下述混合溶剂中的一种：乙酸乙酯和石油醚、乙酸乙酯和己烷，或乙酸乙酯和环己烷，且混合溶剂中两种溶剂的体积比为1∶1至1∶9；步骤2)中在所述的浓缩液中加入硅胶的量可以为步骤1)中的红豆杉枝叶质量的0.5-3％。

步骤3)中，在作为第二正相预处理柱的未装填硅胶的色谱柱内装入步骤2)所得的硅胶吸附料，经洗脱液洗脱，然后串接装填了硅胶的正相分离柱，进行第二次提纯，以去除大部分的杂质，从而有利于保护成本较高的反相色谱固定相。所述的洗脱液可选自下述混合溶剂中的一种：乙酸乙酯和石油醚、乙酸乙酯和己烷，或乙酸乙酯和环己烷，且混合溶剂中两种溶剂的体积比为1∶1至1∶4，并可以首先以所述的洗脱液洗脱约2倍柱体积，然后串接正相分离柱，继续以所述洗脱液进行梯度洗脱。

步骤4)中的反相分离柱中所使用的反相固定相可以是以硅胶或氧化铝为基质，键合或包覆十八烷基硅烷、聚乙烯、聚苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯中的一种，或交联聚苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯中的一种。在所述的浓缩液中加入反相固定相的量可以为步骤1)中的红豆杉枝叶质量的0.5-2％。并且使用后的反相预处理柱和反相分离柱可以采用有机溶剂进行在线清洗，并在下一轮的分离中使用，所述的有机溶剂可以选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃或异丙醇中的一种或多种。步骤4)中所述的水性洗脱液中的有机溶剂可选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃或异丙醇中的一种或多种。

步骤3)和步骤4)中所述的色谱柱的串接可采用以下方式：用不锈钢管通过高压接头从预处理柱下端出口连接至分离柱入口。

步骤5)中的萃取、浓缩步骤可以包括：在剩余溶液中加入等体积的萃取剂萃取，然后将萃取液浓缩至原体积的5～15％，所述的萃取剂可选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、二氯甲烷、1，1-二氯甲烷、1，2-二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或多种；步骤5)中的结晶步骤可以包括：在浓缩液中加入6～17倍体积的结晶剂，于-5～5℃下结晶，所述的结晶剂可选自戊烷、己烷、庚烷、环己烷、石油醚或溶剂汽油中的一种或多种。

可重复进行上述的步骤4)和5)，以获得纯度更高的10-DABIII。

上述步骤中的减压浓缩最好在60℃以下进行，以防止紫杉烷类化合物分解转化。

本发明首次采用正反相色谱技术相结合，将正相色谱作为第一级处理，去除了大部分杂质，有利于保护成本较高的反相色谱固定相，延长反相色谱固定相的使用寿命；而反相色谱可以处理较大的上样量，并且对正相色谱不易分离掉的一部分杂质有更好的去除效果，溶剂易回收且成本也更低廉。因此，将正反相色谱技术结合不但可以获得纯度大于99.5％的10-DABIII，还能够降低成本。此外，本发明还首次采用了两级色谱串联分离技术，通过预处理柱分离一部分杂质，再串接分离柱进行细分离，提高了分离效果，增加了色谱柱的负载上样量。

附图说明

图1为本发明的一个优选实施方案的工艺流程图；

图2为本发明的一个优选实施方案中串接预处理柱和分离柱的示意图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例和相关附图，对本发明进行详尽的解释。但是，下面所提供的实施例只是为了说明本发明，并不是对本发明的限制。

                        实施例1

本实施例的工艺流程图参见图1，预处理柱和分离柱的串接方式参见图2。

(1)取1公斤粉碎后的欧洲红豆杉(T.baccata)枝叶，加入7L 50％的甲醇水溶液，恒温水浴40℃，搅拌提取8小时，过滤，得一次浸提液及一次滤渣；

(2)将一次滤渣返回提取容器中，再加入5L 50％甲醇水溶液，恒温水浴40℃，搅拌提取8小时，过滤，得二次浸提液及二次滤渣；

(3)将二次滤渣返回提取容器中，再加入5L 50％甲醇水溶液，恒温水浴40℃，搅拌提取8小时，过滤，得三次浸提液及三次滤渣；

(4)合并上述的三次浸提液，在50℃下减压浓缩至无有机溶剂，浓缩液室温放置12小时以上，过滤去除不溶物，得水溶液4.8L；

(5)在水溶液中加入乙酸乙酯萃取3次，每次加入乙酸乙酯4.8L，合并乙酸乙酯相；

(6)将所得的乙酸乙酯相浓缩至500ml以内，加入30g硅胶，在60℃减压浓缩至干，得硅胶吸附料；

(7)将所得硅胶吸附料装入ф20×200mm的作为预处理柱的玻璃柱，以体积比为1∶4的乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为洗脱液洗脱，收集所得含10-DABIII的洗脱液；

(8)含10-DABIII的洗脱液共计2.4L，浓缩至500ml以内，加入30g硅胶，60℃减压浓缩至干，得吸附料；将吸附料匀浆法装入ф20×200mm的作为预处理柱的玻璃柱中，以体积比为1∶1的乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为洗脱液洗脱2倍柱体积；

(9)采用匀浆法装填ф20×500mm的玻璃柱净硅胶，作为分离柱，将步骤(8)中的预处理柱串接分离柱，以体积比为1∶1至1∶5的乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为洗脱液进行梯度洗脱，洗脱10～13倍柱体积，收集所得含10-DABIII的部分；

(10)60℃减压浓缩含10-DABIII的洗脱液至500ml以内，加入14g键合十八烷基硅烷固定相，继续浓缩至干，将所得吸附料以5％甲醇水溶液匀浆装入ф20×200mm的作为预处理柱的玻璃柱中；

(11)将步骤(10)中的预处理柱串接分离柱(该分离柱已装填满键合十八烷基硅烷固定相，并以5％甲醇水溶液平衡2倍柱体积)，以5～50％甲醇水溶液进行梯度洗脱10倍柱体积，洗脱液流速为10ml/min，以50ml/瓶收集馏出液，收集液通过HPLC检测，分出含10-DABIII段和不含10-DABIII段；不含10-DABIII段回收溶剂，含10-DABIII段进行下一步操作；收集完成后以100％的甲醇洗柱，检测洗柱液中无10-DABIII，然后分别以纯水和5％甲醇水溶液平衡预处理柱和分离柱备用；

(12)步骤(11)共得含10-DABIII段的溶液3.3L，将所得含10-DABIII的洗脱液在50℃下减压浓缩除去有机溶剂，得水溶液1.1L；

(13)分三次加入1.1L乙酸乙酯(第一、二次各加入400ml，第三次加入300.ml)萃取步骤12所得水溶液，合并有机相；

(14)将有机相于50℃下减压浓缩至160ml，冷却至室温，缓慢加入1600ml己烷，并同时进行搅拌，加完后于0℃放置12小时，结晶；

(15)过滤结晶液，得滤饼和母液；母液浓缩回收10-DABIII，重复步骤(10)～(14)进行再次提纯；滤饼以160ml乙酸乙酯溶解，过滤除去杂质；缓慢加入1600ml己烷，并同时进行搅拌，加完后0℃放置12小时，进行重结晶；

(16)过滤结晶液，母液同步骤(15)处理，所得滤饼50℃减压干燥至恒重，称重得0.71g10-DABIII，HPLC检测纯度为99.53％，收率为87％。

                     实施例2

取加拿大红豆杉(T.canadensis)1公斤，具体操作步骤同实施例1，其区别是：步骤(1)中的提取液更换为70％的丙酮，浸提三次；步骤(10)中的固定相更换为包覆聚苯乙烯-二乙烯苯，步骤(11)中的洗脱液更换为5～50％的乙醇水溶液，重复分离两次；步骤(13)中的萃取剂更换为乙酸丁酯，步骤(14)中的结晶剂更换为石油醚；干燥后得纯度为99.61％的10-DABIII0.23g，收率为78％。

                     实施例3

取云南红豆杉(T.yunnanensis)1公斤，具体操作步骤同实施例1，其区别是：步骤(1)中的提取液更换为65％的乙醇，浸提三次；步骤(10)中的固定相更换为交联聚苯乙烯-二乙烯苯，步骤(11)中的洗脱液更换为5～50％的乙腈水溶液，重复分离两次；步骤(13)中的萃取剂更换为乙酸甲酯，步骤(14)中的结晶剂更换为环己烷；干燥后得纯度为99.55％的10-DABIII0.18g，收率为76％。

                     实施例4

取南方红豆杉(T.media)1公斤，具体操作步骤同实施例1，其区别是：步骤(1)中的提取液更换为50％的乙酸乙酯，浸提三次；步骤(10)中的固定相更换为包覆聚甲基丙烯酸酯，步骤(11)中的洗脱液更换为5～55％的丙酮水溶液，重复分离两次；步骤(13)中的萃取剂更换为三氯甲烷，步骤(14)中的结晶剂更换为6#溶剂汽油；干燥后得纯度为99.57％的10-DABIII0.20g，收率为81％。

                     实施例5

取西藏红豆杉(T.wallichiana)1公斤，具体操作步骤同实施例1，其区别是：步骤(1)中的提取液更换为50％的乙酸丁酯，浸提三次；步骤(10)中的固定相更换为交联聚甲基丙烯酸酯，步骤(11)中的洗脱液更换为5～50％的异丙醇水溶液，重复分离两次；步骤(13)中的萃取剂更换为二氯甲烷，步骤(14)中的结晶剂更换为庚烷；干燥后得纯度为99.66％的10-DABIII0.26g，收率为90％。

本领域普通技术人员可知，对上述实施例所进行的许多变化和改进都不偏离本发明的广义的发明实质。因此可以认为，本发明不限于上述优选的实施例，而意在包括任何在本发明的权利要求书所确定的保护范围内的所有改进。

Claims (10)

1.一种分离提纯10-去乙酰基巴卡亭III的方法，包括以下步骤：

1)用含有机溶剂50～90体积％的水性提取剂于30-40℃提取红豆杉枝叶，并将提取物吸附在硅胶上，得到硅胶吸附料；

2)将步骤1)所得的硅胶吸附料装入第一正相预处理柱，以洗脱液洗脱，收集含10-去乙酰基巴卡亭III的洗脱液，减压浓缩除去70～80体积％的溶剂，然后在浓缩液中加入硅胶，蒸干溶剂，得到负载了提取物的硅胶吸附料；

3)将步骤2)所得的硅胶吸附料装入第二正相预处理柱，首先以洗脱液洗脱，然后串接装填了硅胶的正相分离柱，继续以上述洗脱液进行梯度洗脱，将含10-去乙酰基巴卡亭III的洗脱液合并，减压浓缩除去50～60体积％的溶剂，得到10-去乙酰基巴卡亭III浓缩液；

4)在步骤3)所得的10-去乙酰基巴卡亭III浓缩液中加入反相固定相，蒸干溶剂，得到反相吸附料，将反相吸附料装入反相预处理柱，然后串接装填了反相固定相的反相分离柱，以含有机溶剂5～60体积％的水性洗脱液梯度洗脱，收集含10-去乙酰基巴卡亭III的洗脱液；

5)将步骤4)所得的含10-去乙酰基巴卡亭III的洗脱液减压浓缩，除去有机溶剂，剩余溶液经萃取、浓缩、结晶后，得到10-去乙酰基巴卡亭III。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的水性提取剂中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙酸丁酯中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的洗脱液选自下述混合溶剂中的一种：乙酸乙酯和石油醚、乙酸乙酯和己烷，或乙酸乙酯和环己烷，且混合溶剂中两种溶剂的体积比为1∶1至1∶9；步骤3)中，所述的洗脱液选自下述混合溶剂中的一种：乙酸乙酯和石油醚、乙酸乙酯和己烷，或乙酸乙酯和环己烷，且混合溶剂中两种溶剂的体积比为1∶1至1∶4，并首先以所述的洗脱液洗脱2倍柱体积，然后串接正相分离柱，继续以所述洗脱液进行梯度洗脱。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的反相固定相是以硅胶或氧化铝为基质，键合或包覆十八烷基硅烷、聚乙烯、聚苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯中的一种，或交联聚苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯中的一种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的水性洗脱液中的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃或异丙醇中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述的萃取中所用的萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、二氯甲烷、1，1-二氯甲烷、1，2-二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或多种；步骤5)中所述的结晶中所用的结晶剂选自戊烷、己烷、庚烷、环己烷、石油醚或溶剂汽油中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中在所述的浓缩液中加入硅胶的量为步骤1)中的红豆杉枝叶质量的0.5-3％；步骤4)中在所述的浓缩液中加入反相固定相的量为步骤1)中的红豆杉枝叶质量的0.5-2％。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中将提取物吸附在硅胶上的步骤包括：将所得提取液减压浓缩，除去其中的有机溶剂，然后将剩余液静置，过滤，将滤液以萃取剂萃取3次，合并有机相，加入质量为红豆杉枝叶质量的0.5-3％的硅胶，减压除去有机溶剂，得到硅胶吸附料，所述的萃取剂选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丁酯、乙酸丙酯、二氯甲烷、1，1-二氯甲烷、1，2-二氯甲烷或三氯甲烷中的一种或多种。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤5)中的萃取、浓缩步骤包括：在剩余溶液中加入等体积的萃取剂萃取，然后将萃取液浓缩至原体积的5～15％；步骤5)中的结晶步骤包括：在浓缩液中加入6～17倍体积的结晶剂，于-5～5℃下结晶。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，在步骤4)中，使用后的反相预处理柱和反相分离柱采用有机溶剂进行在线清洗，并在下一轮的分离中使用，所述的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃或异丙醇中的一种或多种。

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